JPH0742307B2 - 蛋白質の復元法 - Google Patents

蛋白質の復元法

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JPH0742307B2
JPH0742307B2 JP62083132A JP8313287A JPH0742307B2 JP H0742307 B2 JPH0742307 B2 JP H0742307B2 JP 62083132 A JP62083132 A JP 62083132A JP 8313287 A JP8313287 A JP 8313287A JP H0742307 B2 JPH0742307 B2 JP H0742307B2
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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は蛋白質の復元法に関する。
従来の技術 蛋白質の復元法とは、本発明の範囲では、蛋白質の正常
の機能の形成又は再形成であり、この際、ここでは、天
然の二次、三次及び場合によっては四次構造が再形成さ
れることが想定される。
蛋白質の復元の問題は重要である。それというのも、生
物学的に活性の蛋白質は、それに対して予め行われた処
置例えば付随物質の分離の際に変性され、その際に重要
な生物学的活性を完全に又は部分的に損失するからであ
る。復元は、合成により又は遺伝子工学により製造され
た蛋白質でも重要である。それというのも、この際は多
くの場合に正確な一次構造即ちアミノ酸配列のみが得ら
れるが、生物学的活性の所望の利用は、天然の二次、三
次及び場合によっては四次構造の形成下に復元が成功す
ることを前提としているからである。
米国特許第4530787号明細書から、還元されたシステイ
ンを有する合成蛋白質は、ヨードソベンゾエートでその
生物学的活性の再取得下に酸化できることは公知であ
る。この方法を一般に使用可能であるべき場合でも、蛋
白質の復元の部分的問題のみを解決するにすぎない。
G.ツエツトルマイスル（Zettlmeissl）、R.ルドルフ（R
udolph）及びR.イエニツケ（Jaenicke）は、ビオケミス
トリイ（Biochemistry）第18巻（1979年）5567〜5575頁
の記載によればオリゴマー酵素即ちラクテート−デヒド
ロゲナーゼの復元をその三次構造の再取得のもとに調査
しており、その際、このような復元で２つの競合性の反
応即ち一方で復元、他方で不活性集合体の形成が進行す
ることが確認されている。この際、良好な復元収率を得
るために、溶液中の酵素の限界濃度を越えないように注
意すべきである。しかしながら、これから、蛋白質を復
元する一般的な方法は、引き出すことはできない。
発明が解決しようとする問題点 従って、本発明の課題は、一般に、蛋白質の復元を改良
することを可能とする方法を得ることである。
問題点を解決するための手段 この課題は、本発明により、復元用緩衝液中への溶解に
より、変性された蛋白質（以後これを変性蛋白質と称す
る）を復元する方法により解決され、この方法は変性蛋
白質の溶液を、選択された緩衝液中の臨界濃度で製造
し、復元中間体（Faltungsintermediat）の形成後に、
更に変性蛋白質を臨界濃度を得るために必要な量で添加
することよりなる。復元中間体とは、変性蛋白質が復元
の途中でシスティンの間の正しいジサルファイド橋の結
合が可能である空間構造に変わる中間状態である。
この方法は、溶液中で、変性され、変性蛋白質の特定の
臨界濃度（選択された緩衝液中で復元された生の蛋白質
の最高収率が得られる濃度：この値はその都度の蛋白質
の種類及び復元を実施する条件に依り決まる）を越えな
い場合に、復元の最大速度と同時にできるだけ高い復元
された蛋白質の収率を得ることができることの発見に基
づく。この際、２種の相互に競合性の反応の状態即ち一
方での不所望の不活性蛋白質（例えば集合体:aggregat
e）の形成及び他方での復元中間体（これは最後には生
の復元された蛋白質に移行する）の形成の状態をできる
だけ少ない不活性蛋白質が現われるようにすることが重
要である。このために、復元すべき蛋白質の蛋白質特異
性及び条件特異性の臨界濃度、復元技術及び復元中間体
の形成までの時間を考慮することが必要である。
この方法にとって重要なこの３要因は、それぞれ、直ち
に決めることができる。臨界濃度は、その都度選択され
る復元用緩衝液中で、種々の濃度の変性蛋白質を使用
し、その際に所定の時間内で得られた復元された蛋白質
の最終収率を測定することにより得られる検量曲線で測
定することができる。この臨界濃度は、生の復元された
蛋白質の最高収率を得る値に相当する。ここで、本発明
の範囲では、最大濃度の約10％の濃度を臨界濃度として
考慮する。
復元技術は同様に公知方法で決定することができる。こ
の際、最大可能な濃度で復元された蛋白質への変換のた
めに必要な時間が決定される。
復元中間体が形成するまでの時間は、最後に一連の種々
の方法で測定できる。第１の測定法は、円偏光二色性
（CD）の測定よりなる。ここで、大きい信号を得る波長
を選択し、次いで相応する曲線を測定するのが有利であ
り、その際、一般に相対的に短い時間内での急な上昇が
得られ、次いでこの曲線は平坦になり、直ちに復元中間
体が生じる。もう１つの可能性は、分子内ジサルファイ
ド橋の形成によるSH−基の消失を追跡することよりな
る。しかしながら、この場合は、分子間ジサルファイド
橋（これは上昇する分子量の検査により認めることがで
きる）を形成してはならないことに注意すべきである。
もう１つの可能性は、蛍光測定よりなる。これは、芳香
族基が復元蛋白質の疎水性領域内に移行する際に変わる
トリプトファン−もしくはチロシン蛍光に基づく。他の
可能性は、制限された蛋白質分解である。それというの
も、復元中間体の形成の増加に伴い、蛋白質分解も減少
されるからである。同様に、この測定は流体力学的測定
により実施することができる。例えば、ここでは、固有
粘度数（これは、復元中間体は低い粘度の溶液を形成す
るので低下する）が測定される。
実際には、臨界濃度及び不活性蛋白質になる副反応に対
して保護された復元中間体が形成するまでの時間を測定
し、それぞれこの臨界濃度で開始し、復元中間体の形成
の経過後に、改めて、中間的にこの溶液から変換により
消費された変性蛋白質を添加すれば充分である。これは
段階的に行うことができ、この際、時間と臨界濃度を予
め与え、次いで、それぞれ中間体形成の経過の後に、こ
の際に変換された変性蛋白質の既知量を補充する。この
方法を連続的に行うこともでき、この際、復元中間体の
新形成により消失する多量の変性蛋白質を新たに添加す
る。こうして、この復元を循環法で実施することがで
き、この方法では、例えば変性蛋白質をそのために好適
な溶剤例えば著しく稀釈された塩酸中に溶かすか、又は
凍結乾燥した形で、それぞれ最適復元濃度が得られるよ
うな量で連続的に復元反応器中に装入する。復元用緩衝
液を、同時に、pH値、物質濃度等に関する条件が一定に
残るような組成で連続的に装入する。例えば管状に構成
されていてよい反応器の適当な形状、蛋白質及び緩衝液
の添加速度及び添加量により規定される流速により、復
元中間体が形成するまでの時間に相応する滞留時間を決
めることができる。その後、反応した蛋白質を連続的
に、例えば限外濾過、逆浸透等を用いての分離により取
り出し、保留物として、場合により、不活性の集合体と
活性蛋白質とに分離する。この連続的方法を、分離され
た緩衝液を反応器に再び連続的に装入するように実施す
るのが有利である。
本発明方法の連続的実施の際には、まず、非連続的方法
におけるように、変性蛋白質を前記の方法で、復元され
た生の蛋白質の最適濃度が現われるまで供給するのが有
利である。これが達成されたら直ちに、再活性化された
蛋白質の相対的に濃縮された溶液の連続的取り出しを開
始し、次いで、はじめて、実際にまったく連続的な方法
に移行する。従って、再活性化された蛋白質の濃度がな
お上昇する開始相に、特有の連続的実施を前接続する。
ここで、復元された蛋白質の最適濃度とは、この反応系
の成分が不溶になる問題が現われない可能な最高濃度で
ある。
本発明方法では、凍結乾燥された変性蛋白質を使用する
のが有利である。しかしながら、徐々にかつ困難に溶解
する蛋白質に関しては、本発明の方法の時間特性をきち
んと保守するために溶解形での添加を行う。
本発明によれば、不所望のかつ復元と競合性の集合体形
成は減少されるが完全には抑制できない。しかしなが
ら、生じる不活性集合体は、著しく高い分子量を有し、
従って、復元された蛋白質から容易に、その分子量差を
利用する分離法で、例えば分子篩分別、場合により適当
な排除率範囲での限外濾過、勾配遠心分離等により除去
することができる。このように分離された集合体は、そ
の溶解化の後に再びこの復元法で使用することができ
る。
復元用緩衝液としては、このために公知の組成物を使用
する。そのpH−値は、当該蛋白質が良好な安定性を有す
るpH値の範囲に、有利に最大安定性のpH値付近に存在す
べきである。不純物例えば重金属の変性的影響を排除す
るために、錯形成剤例えばEDTA及び類似化合物の存在で
操作するのが有利である。例えば、ラクテートデヒドロ
ゲナーゼに対しては、燐酸塩緩衝液（pH6〜８、これはE
DTA約1mM及びDTE1mMを含有する）が使用できる。リゾチ
ームに対しては、弱アルカリ性のトリス/HCl−緩衝液
（これはEDTAと共にSH基含有物質及び少量の相当するジ
サルファイドを含有する）が有効である。tPAの復元の
ために、例えば西ドイツ特許第P3537708号明細書に記載
の再活性化緩衝液が好適である。多くの他の蛋白質にと
って好適な復元用緩衝液は公知であるか又は、蛋白質の
公知特性例えばpH−安定性、SH−基含分、重金属敏感性
等に基づき当業者により僅かな予備実験で見つけること
ができる。
復元のための特定の濃度を越えてならないことは公知で
あった。多量の変性蛋白質は、多量の復元された蛋白質
を得るためにおそらく多量の溶液量を必要とせず、同じ
溶液中で、平成蛋白質の継続的新装入又は間欠的新装入
により更に操作することができ、従って、従来の技術水
準で可能であったよりも著しく高い濃度の復元された蛋
白質を得ることができることの認識は新規のことであ
る。
実施例 次の実施例につき本発明を詳述する。
例１ リゾチームの脈動的再活性化（Pulsreaktivierung） ａ）酵素溶液の準備 濃度測定（Ａ＝208nmにおける１％溶液の吸光度） 生のリゾチーム:A＝26.3 還元されたリゾチーム:A＝23.7 特異活性の測定： −リゾチーム2mgを燐酸カリウム0.066モル/l（pH6.2）1
ml中に溶解;UV吸光度により濃度測定、 −試験溶液：マイクロコツカス・リソデイクテイクス
（Micrococcus lysodeiktics）の細胞壁2.5mgを燐酸K
0.066モル/l（pH6.2）10ml中に懸濁、 −25℃で試験：細胞壁懸濁液1ml＋リゾチーム溶液（1:4
0稀釈）0.03ml;450nmでの濁りの減少を追跡：特異活性
＝60000IU/mg、 還元／変性： −リゾチーム500mgを25℃でトリス/HCl 0.1モル/l（pH
8.6）＋Gdn HCl6モル/l＋DTE150mモル/l中で３時間イン
キュベート（前記Gdnはグアニジンであり、DTEは1,4−
ジチオエリスリットである）、 −pH3に調整し、試料を分ける Ａ部 −セファデックスG25F（カラム容量＝270ml）を通すゲ
ル濾過（HCl0.01モル/l中）、 −ピークフラクションを集め、凍結乾燥、 Ｂ部 −HCl0.01モル/l 3×１に対し、４℃で透析、 −凍結乾燥、 この脱塩の双方の方法（Ａ部及びＢ部）は、再活性化特
性に関して異ならない還元されたリゾチームを生じる。
−凍結乾燥され還元された酵素を、−40℃、N2下に保持
する。
再酸化／再活性化 −還元されたリゾチーム12mgをHCl0.01モル/l 1ml中に
溶解 −ミリ孔濾過（Milliporefiltration）、 −UV吸収による濃度測定、 −25℃でトリス/HCl 0.1モル/l（pH8.2）＋EDTA 1mモル
/l＋GSH 3mモル/l＋GSSG 0.3mモル/l中での稀釈による
再酸化（前記GSHは還元型グルタチオンであり、GSSGは
酸化型グルタチオンである）。
ｂ）復元の臨界濃度の測定 −前記のような還元／再酸化を、再活性化バッチ中での
蛋白質濃度の変動により行う。結果を第１図に示す。こ
こには、25℃で20時間の再酸化の後の還元されたリゾチ
ームの再活性化と濃度との関係が示されている。
ｃ）復元中間体の形成までの時間 −前記のような還元／再酸化により、蛋白質濃度0.03mg
/mlでの還元されたリゾチームの再活性化の反応速度を2
5℃で測定する。結果を第２図に示す。
ｄ）還元されたリゾチームの脈動的再活性化 −トリス/HCl 0.125モル/l（pH8.2）1.6mlもしくは2.4m
l＋EDTA 1.25mモル/lGSH 3.75mモル/l＋GSSG0.375mモル
/lを準備、 第１実験 −ｔ＝10分の間隔で、HCl 0.01モル/l中の還元されたリ
ゾチーム各20μｌ×20添加、１回毎の濃度上昇:0.11〜
0.13mg/ml、20回後の最終濃度:2.15mg/ml、 −比較の直接再活性化：同じ最終濃度までの１回添加。
緩衝液条件は、希釈後の前記の再酸化緩衝液に一致、 −25℃で２時間再活性化の後 脈動的再活性化:2200 IU/mg 比較の直接再活性化:470 IU/mg 第２実験 −ｔ＝10分の間隔で、HCl0.01モル/l中の還元されたリ
ゾチーム各30μｌ×20添加。１回毎の濃度上昇:0.034〜
0.042mg/ml、20回後の最終濃度:0.68mg/ml、 −比較活性：同じ最終濃度までの１回での添加、 −25℃で0.5時間再活性化後： 脈動的再活性化:7660 IU/mg 比較の直接再活性化:1400 IU/mg 第３実験 −ｔ＝20分の間隔でのHCl 0.01モル/l中の還元されたリ
ゾチーム各20μｌ×20添加、 １回毎の濃度上昇:0.035〜0.044mg/ml、 20回後の最終濃度:0.71mg/ml −25℃で24時間再活性化後： 脈動的再活性化:10100 IU/mg 比較の直接再活性化:1400 IU/mg これらの結果から、次のことが明らかである： −蛋白質濃度＞0.1mg/mlでの再活性化収率は連続的に低
下する。
−25℃では、所定の再酸化条件下での再活性化は、15分
後に殆ど完全に終わっている（第２図参照）。
−本発明による脈動的再活性化により、直接再活性化と
比べて５〜７倍高い収率に達することができる。
例２ LDH-M4の再活性化 ａ）酵素溶液の準備 −(NH4)2SO4中のLDH-M4（豚筋肉から）懸濁液（製造者:
Boehringer Mannheim GmbH、整理番号107077）を遠心
し、当初量の1/6のペレットを燐酸−K 0.1モル/l（pH7.
6）＋EDTA 1mモル/l＋DTE 1mモル/l中に入れる。
−４℃で同じ緩衝液１／×２に対して透析する。
−濃度測定 Ａ＝14以上 （Ａ＝280nmでの１％溶液の吸光度） −25℃での活性試験（R.Hermann,R.Jaenicke ＆ R.Rudo
lph.Biochemistry）20（1981）、5195〜5201による） 特異活性＝300IU/mg 変性／再活性化 −変性：H3PO4 0.1モル/lで1:5稀釈、０℃で６分キンキ
ュベーション、 −再活性化：燐酸−K 0.1モル/l（pH12.65）＋EDTA 1m
モル/l＋DTE 1mモル/lで、20℃で1:3稀釈；混合の後に
溶液のpH値は7.6であった。
ｂ）復元の臨界濃度の測定 −変性／再活性化を、前記のように、変性バッチ中の蛋
白質濃度の変動下に行う。
第３図は、酸変性後のLDH-M4の再活性化と濃度との関係
を示しており、ここでは、25℃で20時間再活性化の後の
活性を濃度に対比させている。
ｃ）復元中間体が形成するまでの時間の測定 −前記のような変性／復元により、酸変性されたLDH-M4
の再活性化の反応の速度を蛋白質濃度0.01mg/ml、25℃
で測定する。結果を第４図に示す。
ｄ）酸変性されたLDH-M4の連続的再活性化 閉じられた反応器中に、連続的に酸変性されたLDH-M4及
び再活性化緩衝液を供給した。
使用再活性化反応器を第５図に示す。
貯蔵容器Ａ及びＢから連続的に酵素及び変性溶液がポン
プP1及びP2を経て案内され、混合区分VI中で変性され
る。この変性された酵素溶液は復元反応器V2内に連続的
に導入される。同時に、貯蔵容器Ｃからの復元溶液がポ
ンプP3を経て同様に反応器V2に連続的に供給される。復
元された溶液を連続的に取り出しフラクション収集容器
中に集める。この溶液の組成及び反応器中に存在する条
件は次のとおりであった： A:0℃で、燐酸K 0.1モル/l（pH7.6）＋DTE 1mモル/l＋E
DTA 1mモル/l中のLDH-M4 7.43mg/ml B:変性用緩衝液:0℃でのH3PO4 0.1モル/l C:復元用緩衝液：燐酸K 0.1モル/l（pH12.6）＋DTE 1m
モル/l＋EDTA 1mモル/l（Ｂと混合の後のpH値:7.6） V1:変性容量V1＝0.25ml ０℃での変性時間３分 V2:復元容量V2＝58ml;25℃ ポンプ速度：P1: 1ml/h P2: 4ml/h P3:10ml/h 所定の反応器の大きさ／ポンプ率で、反応器内の分子の
平均滞留時間は2.9時間である。
この工程で試料a2.5mlが集められ、25℃で24時間後に最
終再活性化を測定した。
第６図は、反応器の装荷時の活性上昇と時間の関係を示
している。
約４時間後に一定の再活性化収率が得られる。
−再活性化の最終濃度:0.5 mg/ml −収率：連続的再活性化:10.2 IU/mg −比較の直接再活性化:1.9 IU/mg 前記の結果は、本発明によれば、同じ最終濃度での直接
再活性化の際よりも約5.4倍も高い収率に達することを
示している。
例３ rec-tPAの脈動的再活性化 ａ）レフラクテイル・ボデイス（RB）（refractile bod
ies）の準備細胞溶解及び逆遠心−／洗浄工程によるRB −調製をEP-A1-0114506号明細書例７に記載の方法と同
様に行った。tPAは「RB」中で異種蛋白質で汚染されて
おり、不活性かつ不溶性である。
還元／変性による可溶化： −細胞2.5gからの「RB」を25℃で３時間、トリス/HCl0.
1モル/l（pH8.6）10ml＋Gdn−HCl6モル/l＋EDTA 1mモル
/l＋DTE 150mモル/l中でインキュベートする。
−還元後の「RB」中の全蛋白質:41.5mg。
濃HClでpH値を３に調節し、HCl0.01モル/l中のセファデ
ックスG25F（カラム量270ml）を通すゲル濾過。
ｂ）再活性化の濃度依存性の測定 還元された蛋白質の酸性フラクションは最大再活性化能
（Ｃ＝0.83mg/ml）で、トリス/HCl 0.1モル/l（pH10.
4）＋EDTA 1mモル/l＋Ｌ−アルギニン0.5モル/l＋BSA 1
mg/ml＋GHS 1mモル/l＋GSSG 0.2モル/l中での1:3〜1:50
0稀釈により再酸化される。
種々の希釈度での再酸化条件を一定に調整する。25℃で
25〜27時間の再酸化の後に、その活性を測定する。活性
測定の前に、再酸化緩衝液で同じ最終濃度まで調節す
る。結果を第１表及び第７図に示す。
ｃ）再活性化の速度の測定 −還元／再酸化を前記にように実施する。
材料の汚れに基づき、復元中間体が形成するまでの時間
は、直接には測定できなかったので、再活性化の反応速
度及び約40から60分までの脈動速度の変動により間接的
に測定した。
第８図は、20℃、全蛋白質濃度15μg/mlにおけるrec-tP
Aの再活性化の反応速度関係を示している。再活性化は3
0時間後の最終収率に対して計算する。
ｄ）rec-tPAの脈動的再活性化 ２分〜45分の間隔で、HCl 0.01モル/l中の還元されたre
c-tPA各10μｌ×15を再活性化用緩衝液300μｌに加える
（25℃）。
−脈動的再活性化の前の再活性化用緩衝液： トリス/HCl 0.15モル/l（pH10.5）＋EDTA 1.5mモル/l＋
Ｌ−アルギニン 0.5モル/l＋GSSG 0.3mモル/l＋GSH 1.5
mモル/l −還元された蛋白質の添加後の再活性化用緩衝液： トリス/HCl 0.1モル/l（pH10.4）＋EDTA 1mモル/l＋Ｌ
−アルギニン 0.33モル/l＋GSSG 0.2mモル/l＋GSH 1mモ
ル/l −１回毎の濃度上昇:18〜27μg/ml −15回後の最終濃度:227μg/ml 20℃で24時間再酸化の後に活性測定を行う。結果を第２
表に示す： 注解 −使用出発物質では、再活性化収率（使用蛋白質量に対
する）は、＞20μg/mlの濃度で低下する（第７図）。CN
Br-FSPによる刺激可能性は、測定正確性の範囲内 で再
活性化濃度とは無関係であることを立証している（第１
表）。
−20℃で、所定の実験条件下における再活性化の半減時
間は７±２時間である。
−再活性化収率は、再活性化脈動の間の滞留時間の増加
に伴い上昇する（第２表）。
【図面の簡単な説明】
第１図は、例１における還元されたリゾチームの再活性
化と濃度との関係を示す図、第２図は、例１における還
元されたリゾチームの再活性化の反応速度関係を示す
図、第３図は、例２における酸変性後のLDH-M4の再活性
化と濃度との関係を示す図、第４図は、例２における酸
変性されたLDH-M4の再活性化の反応速度関係を示す図、
第５図は、再活性化反応器を示す図、第６図は、反応器
の装荷時の活性上昇と時間の関係を示す図、第７図は、
例３におけるrec-tPAの再活性化と濃度との関係を示す
図、第８図は、rec-tPAの再活性化の反応速度関係を示
す図である。
フロントページの続き (72)発明者 シユテフアン・フイツシヤー ドイツ連邦共和国ヴアイルハイム・モース シユトラーセ 27 (56)参考文献 米国特許4216141（ＵＳ，Ａ) 国際公開84103711（ＷＯ，Ａ) 欧州公開1563541（ＥＰ，Ａ)

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】変性蛋白質を、復元用緩衝液中に溶かすこ
    とにより復元する場合に、変性蛋白質の溶液を、選択さ
    れた緩衝液中で復元された生の蛋白質の最高収率が得ら
    れる濃度（臨界濃度）で作り、復元中間体の形成のため
    に必要な時間の経過の後に、その都度、臨界濃度を得る
    ために必要な量の変性蛋白質を反応器に添加することを
    特徴とする、変性蛋白質を復元する方法。
  2. 【請求項２】変性蛋白質を、復元用緩衝液中に溶かすこ
    とにより連続的に復元する場合に、反応器に、臨界濃度
    を得るために必要な量の変性蛋白質及び相応する量の復
    元用緩衝液を連続的に供給し、反応器中の混合物の滞留
    時間を復元中間体の形成に必要な時間に調節することを
    特徴とする、変性蛋白質を連続的に復元する方法。
  3. 【請求項３】変性蛋白質を、反応器に、一定の再活性収
    率に達するまで添加し、次いで、こうして得られた溶液
    を連続的に取りだし、最適濃度に相応して、変性蛋白質
    の溶液で交換する、特許請求の範囲第２項記載の方法。
JP62083132A 1986-04-08 1987-04-06 蛋白質の復元法 Expired - Lifetime JPH0742307B2 (ja)

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