JPH074252B2 - ヒトパラインフルエンザ４ａ型ウイルス同定用検査薬に用いるｄｎａ断片 - Google Patents
ヒトパラインフルエンザ４ａ型ウイルス同定用検査薬に用いるｄｎａ断片Info
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- JPH074252B2 JPH074252B2 JP1154745A JP15474589A JPH074252B2 JP H074252 B2 JPH074252 B2 JP H074252B2 JP 1154745 A JP1154745 A JP 1154745A JP 15474589 A JP15474589 A JP 15474589A JP H074252 B2 JPH074252 B2 JP H074252B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒトパラインフルエンザ4A型ウイルス同定用
検査薬に用いるDNA断片に関し、より詳しくは、ヒトパ
ラインフルエンザ4A型ウイルス（以下、PIV−4Aと略称
する）ヘムアグルチニンノイラミニダーゼ（以下、HNと
略称する）の遺伝子RNAに相補性を示すDNA断片に関す
る。
検査薬に用いるDNA断片に関し、より詳しくは、ヒトパ
ラインフルエンザ4A型ウイルス（以下、PIV−4Aと略称
する）ヘムアグルチニンノイラミニダーゼ（以下、HNと
略称する）の遺伝子RNAに相補性を示すDNA断片に関す
る。
従来、ウイルスは、血清学的性状に基づいて同定されて
いる。その主な方法としてエンザイムリンクドイムノソ
ルベントアッセイ法（以下、ELISA法と略称する）、中
和反応法、補体結合反応法、血球凝集抑制反応法、蛍光
抗体法、寒天内沈降反応法等があるが、これらいずれの
方法も検体中のウイルスに対する抗体を測定することに
より判定を行うものであって、確度の高い判定を行うた
めには、一般的に感染１週間後のウイルス抗体価が上昇
し始める段階で行わなければならず、場合によっては、
さらに数週間後に再測定を行って確認することが必要で
あり、従って、発症前及び早期診断が難しいという問題
点がある。
いる。その主な方法としてエンザイムリンクドイムノソ
ルベントアッセイ法（以下、ELISA法と略称する）、中
和反応法、補体結合反応法、血球凝集抑制反応法、蛍光
抗体法、寒天内沈降反応法等があるが、これらいずれの
方法も検体中のウイルスに対する抗体を測定することに
より判定を行うものであって、確度の高い判定を行うた
めには、一般的に感染１週間後のウイルス抗体価が上昇
し始める段階で行わなければならず、場合によっては、
さらに数週間後に再測定を行って確認することが必要で
あり、従って、発症前及び早期診断が難しいという問題
点がある。
通常、PIV−4Aの測定にはELISA法が用いられており、こ
の方法は、検体中のPIV−4Aに対する抗体を測定するも
ので、例えば、PIV−4Aを固定化したプレートに、被検
体を加え反応させた後洗浄し、さらに抗PIV−4A抗体を
加え同様にして反応させ、次いで酵素標識抗体を加えて
反応後、発色させることにより測定するものであるが、
この方法も上記同様発症前及び早期診断が難しいという
問題点を有している。
の方法は、検体中のPIV−4Aに対する抗体を測定するも
ので、例えば、PIV−4Aを固定化したプレートに、被検
体を加え反応させた後洗浄し、さらに抗PIV−4A抗体を
加え同様にして反応させ、次いで酵素標識抗体を加えて
反応後、発色させることにより測定するものであるが、
この方法も上記同様発症前及び早期診断が難しいという
問題点を有している。
本発明は、上記のような問題点の解決を目的とするもの
で、PIV−4A感染症の早期診断を可能にする検査薬に有
用なDNA断片を提供するものである。
で、PIV−4A感染症の早期診断を可能にする検査薬に有
用なDNA断片を提供するものである。
本発明は、下記［式］、 ［式］:GGGGAACACACTTCTCAGCCCTGATTGCTCAAGG CCCTTGCATGTGCAACCGAGACACCCCCCACAAGCACCGGAA TAAGACCTGACAACAAAGTAGCAGCCACCACGACCCAAAAAC AAAATTAAAAGGATCCGGTAACAGCCCATCAACCAGCAATCA TAGAATCCAACAATCCAGAGAGACGTCACATCAACTCATCCA CGAATCTTCGAAGGGAACATCCCAGACAAAATCACAGCCCAT TCCCTGATCACGGATAAACTGAGAAAGATCACAAGAATGCAA GACTCACATGGTAATACACAAATACTCAACCAGGCAAATTCA ATGGTGAAAAGAACATGGAGATTACTATTTCGAATTGCAACC TTAATATTACTTGTTTCAATATTTGTGTTATCGCTCATAATT GTATTACAGTCAACACCGGGGAATTTGCAAAACGATATCAAT ATAATTAGAAAGGAGCTCAATACAATTATGGAGAATTTTGAA ACTACATCTAAGTCACTGTTAAGTGTATCAAATCAAATCACT TACGATGTATCAGTACTTACTCCTATAAGACAAGAAGCTATT GAAACAAACATCATTTCAAAAATAAAAGATCATTGCAAAGAT AGAGTAATTAAAGAAGGAAGCACTTGCACATTGAATCGCAGC CCTTTGCATGATGTCTCTTTTTTAAATGGGTTCAATAAATTC TATTTCACATATAAAGATAATATGCAAATTAAGTTTAAATCA TTATTAGATTACCCCAATTTTATTCCAACTGCTACAACTCCC CACGGATGCATTCGAATTCCATCATTCTCCTTAGGTCAAACC CATTGGTGTTATACCCATAATATAAACCTACTAGGATGTGCA GACCCTGCATCTAGCAATCAATATGTATCACTAGGAACCTTA CAAGTCTTAAAAATGGGTGACCCTTATTTTAAAGTCGAGCAT AGTCATTATTTAAATGACGGGAGGAATCGAAAGAGTTGTTCA GTGGTTGCTGTCCCCGACGGATGCCTGCGGAATTGTGTGACC ATGACAAAAAATGAGACAGAGAATTTCAAAGACCTCAATTGG CAACACAATTACTTACATACATATCATATAATGGTACCATTA AAGACTCGTATAATAAATCCACCAGGATCATCCAGAGATTGG GTTCATATCGCACCAGGGGTAGGCTCGGGCCTTTTGTATGCC AAATTACTTATATTTCCTTTGTATGGGGGTCTCACGGAAAAA TCAGTGATACATAATAATCAATCAGGGAAATATTTTTTCCCT AATTCAACTAAATTGCAATGCCGTAACAGCACTATGGAAAAA ATAAAAGGAGCAAAAGATTCATACACAATAACTTACTTCTCA GGGAGACTTATACAGAGTGCATTTCTGGTTTGTGATCTAAGA CAATTTCTTTCTGAAGATTGTGAAATCTTAATTCCTAGTAAT GATTACATGATGGTCGGTGCAGAGGGTCGATTATATAACATT GAGAACAACATATTTTATTATCAGAGAGGATCCAGCTGGTGG CCTTATCCGAGCCTCTATAGAATCAGGTTAAACCTTAGTAAG AAATATCCTAGAATAACTGAAATTAAATTTACAAAAATTGAA ATCGCCCCAAGACCAGGCAACAAAGATTGTCCAGGAAATAAG GCTTGCCCAAAAGAATGTATAACGGGAGTCTACCAAGATATA TTGCCACTAAGTTATCCCAATACTGCATTTCCACACTTAAAA CAAGCGTATTATACAGGTTTTTATCTTAATAACTCGCTCGAG AGACGCAATCCAACATTTTATACTGCTGACAATCTAGATTAC CATCAACAGGAAAGATTAGGTAAATTCAATCTTACTGCTGGA TACTCTACTACAACTTGTTTTAAACAGACCACTACTGCGAGG TTATACTGTCTCTACATAATTGAAGTGGGTGACTCAGTCATT GGGGACTTTCAGATCACCCTTTTTTTAGCAGCTTAATAGACC AGACTGTTAATTAATCAACAAAGTTATTCTGTAATATAAACT GATCTTATAAGTGAAAAGATGCCTATCCAAGGAGGTTGATAG ACAAATAGTAAAAGTAGCAATTGTAACAAAACTCTAAGGAAA AAGTAATTCGAGAAATATTATAGACTGACTTCAGAGCAAACA CAACATCGATCCATAATAGTCAATATAATCAATAATACTCTA TGAGACCTTACCTATCAACAGCAAAAAACACAGTCCATCAAG CGGAACCCAACTCGCTCCATCCTTAATCATCCACTGAAAGAA AAAATATACGAAGGACCATCGGCCACCGGGTCCAAACAATCT AGCACAAAAATTCAAACAACCGCCAAACTCTGTTCGGCCTCA ACAAACAATCCGCCAAGCCATCTGTCATTCCTATACCAACAC ACAACCATCCCATTCCTCAAAAGCAATTCAATCCGCGACCCA AAGAAGACTCTCCACATATCCAGCTAATCCGTCGATCCGACA CATCATCGTATCTTTTAAGAAAAAAA で表されるDNA断片を提供することによって、PIV−4A感
染症の発症前及び早期診断が難しいという問題点の解決
を図ったものである。
染症の発症前及び早期診断が難しいという問題点の解決
を図ったものである。
本発明によって提供されるDNA断片は、PIV−4A・HNの遺
伝子RNAに相補性を示すので、これをPIV−4A同定用検査
薬に用いた場合、PIV−4Aの同定を直接行うことがで
き、従来の間接的同定法による問題点の解決を可能にし
たものである。
伝子RNAに相補性を示すので、これをPIV−4A同定用検査
薬に用いた場合、PIV−4Aの同定を直接行うことがで
き、従来の間接的同定法による問題点の解決を可能にし
たものである。
本発明における上記［式］で表されるDNA断片の製造方
法は、特に制限はなく、常法に従うことができ、例え
ば、 （ａ）PIV−4A感染細胞から得られるmRNAより調製され
たcDNAを大腸菌のプラスミドベクター等の適当なベクタ
ーに導入し大腸菌にクローン化させ、 プローブとしてヌクレオカプシドRNAを用いてスクリ
ーニングを行う方法、 プローブとして上記式で表される塩基配列に基づいて
合成されたオリゴヌクレオチドを用いてスクリーニング
を行う方法、 PIV−4Aに対する抗体を用いてスクリーニングを行う
方法、 等でPIV−4A・HN遺伝子をコードするクローンを単離
し、この単離されたクローンのプラスミドからインサー
トDNAを分離する方法、 （ｂ）上記［式］で表されるPIV−4A・HNの遺伝子RNAに
相補性を示す塩基配列に基づいて、ホスホアミダイト法
（Nature、310巻、105頁、1984）に従って、合成ヌクレ
オチドを作成する方法、 （ｃ）上記（ａ）及び（ｂ）を併用する方法、 等によって製造することができる。
法は、特に制限はなく、常法に従うことができ、例え
ば、 （ａ）PIV−4A感染細胞から得られるmRNAより調製され
たcDNAを大腸菌のプラスミドベクター等の適当なベクタ
ーに導入し大腸菌にクローン化させ、 プローブとしてヌクレオカプシドRNAを用いてスクリ
ーニングを行う方法、 プローブとして上記式で表される塩基配列に基づいて
合成されたオリゴヌクレオチドを用いてスクリーニング
を行う方法、 PIV−4Aに対する抗体を用いてスクリーニングを行う
方法、 等でPIV−4A・HN遺伝子をコードするクローンを単離
し、この単離されたクローンのプラスミドからインサー
トDNAを分離する方法、 （ｂ）上記［式］で表されるPIV−4A・HNの遺伝子RNAに
相補性を示す塩基配列に基づいて、ホスホアミダイト法
（Nature、310巻、105頁、1984）に従って、合成ヌクレ
オチドを作成する方法、 （ｃ）上記（ａ）及び（ｂ）を併用する方法、 等によって製造することができる。
上記方法によって得られた本発明のDNA断片は、以下の
ようにして用いることができる。
ようにして用いることができる。
例えば、上記方法で得られたDNA断片は、必要ならば適
当な制限酵素（例えば、BamHI、XbaI等）で十数塩基以
上にさらに切断後、放射性同位元素等で標識して検査薬
とし、この検査薬を、検体（咽頭液等）から抽出したRN
Aを固定化したナイロン膜等と反応後、オートラジオグ
ラフィー等で判定するノーザンハイブリダイゼーション
法（以下、ノーザン法と略称する）等でPIV−4Aの同定
を行うことができる。
当な制限酵素（例えば、BamHI、XbaI等）で十数塩基以
上にさらに切断後、放射性同位元素等で標識して検査薬
とし、この検査薬を、検体（咽頭液等）から抽出したRN
Aを固定化したナイロン膜等と反応後、オートラジオグ
ラフィー等で判定するノーザンハイブリダイゼーション
法（以下、ノーザン法と略称する）等でPIV−4Aの同定
を行うことができる。
以下、実施例に基づいて本発明をさらに詳細に説明す
る。
る。
（１）RNAの調製 牛胎児血清５％を含むイーグル必須培養液中で初代サル
腎細胞を増殖させた後、この培養液を新たに調整したア
クチノマイシンＤ（２μg/ml）を含むイーグル必須培養
液と交換した。次いでPIV−4A（東芝株）を接種し、同
培養液中で24時間培養を行なった。ウイルス感染培養細
胞をトリプシン/EDTA混合液で剥した後、8000rpmで10分
間遠心することにより細胞を集め、グアニジンイソチオ
シアネート液（6Mグアニジンイソチオシアネート、5mM
クエン酸ナトリウム、0.1M2−メルカプトエタノール、
0.5％ラウロイルザルコシン酸ナトリウム）を加え、ホ
モゲナイザー中で素早く溶解し、21G注射針をつけた注
射筒に５回通すことで染色体DNAをせん断した。得られ
た細胞溶解液を、再度8000rpmで遠心し、得られた上澄
液9mlを、5.7M塩化セシウム水溶液3mlの入った別の遠心
チューブに重層し、ベックマンローター（Beckman SW4
0Ti rotor）にで、37000rpmで18時間18℃で超遠心を行
い、遠心後RNAペレットを回収した。
腎細胞を増殖させた後、この培養液を新たに調整したア
クチノマイシンＤ（２μg/ml）を含むイーグル必須培養
液と交換した。次いでPIV−4A（東芝株）を接種し、同
培養液中で24時間培養を行なった。ウイルス感染培養細
胞をトリプシン/EDTA混合液で剥した後、8000rpmで10分
間遠心することにより細胞を集め、グアニジンイソチオ
シアネート液（6Mグアニジンイソチオシアネート、5mM
クエン酸ナトリウム、0.1M2−メルカプトエタノール、
0.5％ラウロイルザルコシン酸ナトリウム）を加え、ホ
モゲナイザー中で素早く溶解し、21G注射針をつけた注
射筒に５回通すことで染色体DNAをせん断した。得られ
た細胞溶解液を、再度8000rpmで遠心し、得られた上澄
液9mlを、5.7M塩化セシウム水溶液3mlの入った別の遠心
チューブに重層し、ベックマンローター（Beckman SW4
0Ti rotor）にで、37000rpmで18時間18℃で超遠心を行
い、遠心後RNAペレットを回収した。
上記のようにして得られるRNAから、オリゴdTセルロー
ズType7〔フアルマシア（Pharmacia）社製〕を用いてポ
リＡ鎖を含むmRNA〔以下、poly（Ａ＋）RNAと略称す
る〕を分離、精製した。
ズType7〔フアルマシア（Pharmacia）社製〕を用いてポ
リＡ鎖を含むmRNA〔以下、poly（Ａ＋）RNAと略称す
る〕を分離、精製した。
（２）cDNAライブラリーの作成 cDNAライブラリーは、岡山・バーグ法に従い合成した。
すなわち、上記poly（Ａ＋）RNA4μｇに蒸留水５μｌを
加え、65℃で10分間加温した後急冷し、次にオリゴdTプ
ライムドベクター〔pUC118ベクターのKpnIサイトにオリ
ゴdTを付加した（0.8〜1.2μg/μｌ）〕10μｌ、合成反
応液（500mM Tris-塩酸緩衝液pH8.3、300mM塩化カリウ
ム、80mM塩化マグネシウム、3mMジチオスレイトール）
３μｌ、及び、20mMdATP、20mMdCTP、20mMdGTP、20mMdT
TPを各々１μｌづつ加え、さらに20unitsRNasin、40uni
tsリバーストランスクリプターゼを加えた後、蒸留水で
全量を30μｌとし、42℃30分間反応を行い第一鎖cDNAを
合成した。第一鎖cDNA合成終了後、dGTP存在下ターミナ
ルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて
10〜30個のdG塩基を付加した。次に制限酵素HindIIIに
よる消化を行い、さらにdC塩基鎖を持つリンカーとアニ
ール後、大腸菌ライゲースにより閉環状とした。最後に
RNaseH存在下、DNAボリメラーゼにより第二鎖の合成を
行い、完全なプラスミドDNAを作成した。次に塩化カル
シウム処理を施すことにより得られるコンペテント細胞
（DH1）100〜200μｌに、0.4M塩化マグネシウム/0.1M塩
化カルシウム混合液10μｌ、及び、上記DNA0.02μｇを
加え、０℃で40分間次いで42℃で90秒間放置し、次に培
養液（バクトトリプトン10g、イーストイクストラクト5
g、塩化ナトリウム5gを1000mlの蒸留水に溶解した溶
液）1.5mlを加え、37℃で40分間放置することにより形
質転換細胞を得た。
すなわち、上記poly（Ａ＋）RNA4μｇに蒸留水５μｌを
加え、65℃で10分間加温した後急冷し、次にオリゴdTプ
ライムドベクター〔pUC118ベクターのKpnIサイトにオリ
ゴdTを付加した（0.8〜1.2μg/μｌ）〕10μｌ、合成反
応液（500mM Tris-塩酸緩衝液pH8.3、300mM塩化カリウ
ム、80mM塩化マグネシウム、3mMジチオスレイトール）
３μｌ、及び、20mMdATP、20mMdCTP、20mMdGTP、20mMdT
TPを各々１μｌづつ加え、さらに20unitsRNasin、40uni
tsリバーストランスクリプターゼを加えた後、蒸留水で
全量を30μｌとし、42℃30分間反応を行い第一鎖cDNAを
合成した。第一鎖cDNA合成終了後、dGTP存在下ターミナ
ルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて
10〜30個のdG塩基を付加した。次に制限酵素HindIIIに
よる消化を行い、さらにdC塩基鎖を持つリンカーとアニ
ール後、大腸菌ライゲースにより閉環状とした。最後に
RNaseH存在下、DNAボリメラーゼにより第二鎖の合成を
行い、完全なプラスミドDNAを作成した。次に塩化カル
シウム処理を施すことにより得られるコンペテント細胞
（DH1）100〜200μｌに、0.4M塩化マグネシウム/0.1M塩
化カルシウム混合液10μｌ、及び、上記DNA0.02μｇを
加え、０℃で40分間次いで42℃で90秒間放置し、次に培
養液（バクトトリプトン10g、イーストイクストラクト5
g、塩化ナトリウム5gを1000mlの蒸留水に溶解した溶
液）1.5mlを加え、37℃で40分間放置することにより形
質転換細胞を得た。
上記により200μｌのコンペテント細胞（DH1）に、0.02
μｇのプラスミドDNAを導入することにより、アンピシ
リン存在下で1500個の独立したクローンを得た。
μｇのプラスミドDNAを導入することにより、アンピシ
リン存在下で1500個の独立したクローンを得た。
（３）ヌクレオカプシドRNAプローブの調製 PIV-4A感染初代サル腎細胞に、0.6％ノニデットＰ−4
0、10mMバナジルリボヌクレオチド複合体を含む溶液
（0.15M塩化ナトリウム、0.05MTris-塩酸緩衝液）を加
え、氷中で１時間ピペティングによる可溶化を行い、80
00rpmで10分間遠心した。次いで塩化セシウムの40％水
溶液、30％水溶液、25％水溶液の各々1ml、2.5ml、1ml
をこの順に重層した遠心チューブに、上記遠心で得られ
た上澄液9mlをさらに重層し、ベックマンローターSW40T
iにて、37000rpm、18時間16℃で平衡密度勾配遠心を行
った。遠心後、30％の塩化セシウム水溶液層に生じたウ
イルスのヌクレオカプシドバンドを回収した。次に0.1
％SDS及びプロテイナーゼＫ（2.5mg/ml）を加え、56℃1
5分間蛋白分解を行った後、フェノール及びフェノール
／クロロホルム混液で処理を行い、ヌクレオカプシドRN
Aを得た。得られたヌクレオカプシドRNAに50mMTris−塩
酸緩衝液pH9.7を加え、95℃10分間加温した後、室温ま
で徐々に冷やした。次にこのRNA溶液20μｌに緩衝液（2
50mMTris-塩酸、50mM塩化マグネシウム、25mMDTT、7.5m
Mスペルミン、500mM塩化カリウム）10μｌ、及び32PATP
（100μCi/600pM）３μｌ、T4−DNAカイネース2unitsを
加えた後、蒸留水で全量を50μｌとし、37℃で１時間反
応させヌクレオカプシドRNAプローブを得た。
0、10mMバナジルリボヌクレオチド複合体を含む溶液
（0.15M塩化ナトリウム、0.05MTris-塩酸緩衝液）を加
え、氷中で１時間ピペティングによる可溶化を行い、80
00rpmで10分間遠心した。次いで塩化セシウムの40％水
溶液、30％水溶液、25％水溶液の各々1ml、2.5ml、1ml
をこの順に重層した遠心チューブに、上記遠心で得られ
た上澄液9mlをさらに重層し、ベックマンローターSW40T
iにて、37000rpm、18時間16℃で平衡密度勾配遠心を行
った。遠心後、30％の塩化セシウム水溶液層に生じたウ
イルスのヌクレオカプシドバンドを回収した。次に0.1
％SDS及びプロテイナーゼＫ（2.5mg/ml）を加え、56℃1
5分間蛋白分解を行った後、フェノール及びフェノール
／クロロホルム混液で処理を行い、ヌクレオカプシドRN
Aを得た。得られたヌクレオカプシドRNAに50mMTris−塩
酸緩衝液pH9.7を加え、95℃10分間加温した後、室温ま
で徐々に冷やした。次にこのRNA溶液20μｌに緩衝液（2
50mMTris-塩酸、50mM塩化マグネシウム、25mMDTT、7.5m
Mスペルミン、500mM塩化カリウム）10μｌ、及び32PATP
（100μCi/600pM）３μｌ、T4−DNAカイネース2unitsを
加えた後、蒸留水で全量を50μｌとし、37℃で１時間反
応させヌクレオカプシドRNAプローブを得た。
（４）コロニーハイブリダイゼーション 上記の形質転換細胞100〜200μｌを、アンピシリン（12
0μg/ml）を含む15cmの寒天プレート（10gバクトトリプ
トン、5gイーストイクストラクト、5g塩化ナトリウム、
15gアガーを加え蒸留水で全量を1000mlとした）に蒔
き、12時間37℃で培養した。ニトロセルロース膜に生じ
たコロニーを写し取り、37℃で６時間培養した。次にこ
の膜を、0.5N水酸化ナトリウム/1.5M塩化ナトリウム混
合液で10分間処理し、さらに1.5M塩化ナトリウムを含む
0.5MTris−塩酸緩衝液pH8.0に10分間置いた後、0.3M塩
化ナトリウム/0.03Mクエン酸ナトリウム混合液中で５分
間リンスした。リンス後、膜を風乾し、80℃で１時間吸
引しながらベーキングを行うことによりDNAを膜に固定
した。
0μg/ml）を含む15cmの寒天プレート（10gバクトトリプ
トン、5gイーストイクストラクト、5g塩化ナトリウム、
15gアガーを加え蒸留水で全量を1000mlとした）に蒔
き、12時間37℃で培養した。ニトロセルロース膜に生じ
たコロニーを写し取り、37℃で６時間培養した。次にこ
の膜を、0.5N水酸化ナトリウム/1.5M塩化ナトリウム混
合液で10分間処理し、さらに1.5M塩化ナトリウムを含む
0.5MTris−塩酸緩衝液pH8.0に10分間置いた後、0.3M塩
化ナトリウム/0.03Mクエン酸ナトリウム混合液中で５分
間リンスした。リンス後、膜を風乾し、80℃で１時間吸
引しながらベーキングを行うことによりDNAを膜に固定
した。
このようにして得られた膜５枚当りに、変性鮭RNA（1mg
/ml）1ml、SSPE液（3.6M塩化ナトリウム、200mM第一り
ん酸ナトリウム、20mMEDTA）7.5ml、デンハード液（２
％BSA、２％Ficoll、２％ポリビニルピロリドン）1.25m
l、10％SDS1.25mlからなるプレハイブリダイゼーション
液を加え、42℃12時間反応させ、次に新たに調製した上
記プレハイブリダイゼーション液に上記ヌクレオカプシ
ドRNAプローブを、500万Ci/mlとなるように加え、42℃
で18時間反応を行った。反応終了後、0.1％SDSを含む20
倍希釈のSSPE液中で42℃５分間２回洗浄し、次に0.1％S
DSを含む200倍希釈のSSPE液中で42℃15分間２回洗浄を
行った。洗浄終了後、膜を風乾し、Ｘ線フィルム（RX
5、コッダク社製）を用いて、−80℃12時間オートラヂ
オグラフィーを行い、数個の陽性クローンを得た。
/ml）1ml、SSPE液（3.6M塩化ナトリウム、200mM第一り
ん酸ナトリウム、20mMEDTA）7.5ml、デンハード液（２
％BSA、２％Ficoll、２％ポリビニルピロリドン）1.25m
l、10％SDS1.25mlからなるプレハイブリダイゼーション
液を加え、42℃12時間反応させ、次に新たに調製した上
記プレハイブリダイゼーション液に上記ヌクレオカプシ
ドRNAプローブを、500万Ci/mlとなるように加え、42℃
で18時間反応を行った。反応終了後、0.1％SDSを含む20
倍希釈のSSPE液中で42℃５分間２回洗浄し、次に0.1％S
DSを含む200倍希釈のSSPE液中で42℃15分間２回洗浄を
行った。洗浄終了後、膜を風乾し、Ｘ線フィルム（RX
5、コッダク社製）を用いて、−80℃12時間オートラヂ
オグラフィーを行い、数個の陽性クローンを得た。
（５）ノーザン法 上記の陽性クローンを用いてノーザン法を行った。すな
わち、前記（１）の方法で得られたPIV-4A感染細胞由来
poly（Ａ＋）RNA、ウイルス非感染細胞由来poly（Ａ
＋）RNA及びrRNAマーカーを、各々1.5％アガロースゲル
中で電気泳動後、ナイロン膜（Hybond−Ｎ、アマシャム
社製）に転写し、風乾後UV照射をすることによりRNAを
ナイロン膜に共有結合させ、次に上記の各陽性クローン
をプローブとして各々ハイブリダイゼーションを行っ
た。
わち、前記（１）の方法で得られたPIV-4A感染細胞由来
poly（Ａ＋）RNA、ウイルス非感染細胞由来poly（Ａ
＋）RNA及びrRNAマーカーを、各々1.5％アガロースゲル
中で電気泳動後、ナイロン膜（Hybond−Ｎ、アマシャム
社製）に転写し、風乾後UV照射をすることによりRNAを
ナイロン膜に共有結合させ、次に上記の各陽性クローン
をプローブとして各々ハイブリダイゼーションを行っ
た。
即ち、ナイロン膜を上記プレハイブリダイゼーション液
中で42℃12時間反応させ、次に各陽性クローンから作ら
れた32Pでラベルされたプローブを100万Ci/mlとなるよ
うにプレハイブリダイゼーション液に加え、42℃18時間
反応させた。反応終了後、上記（４）と同様に洗浄を行
い、Ｘ線フィルムを用いてオートラジオグラフィーを行
い、その結果2600baseの位置にハイブリダイズするクロ
ーンを１個得た。このクローンをpM4Hと命名した。
中で42℃12時間反応させ、次に各陽性クローンから作ら
れた32Pでラベルされたプローブを100万Ci/mlとなるよ
うにプレハイブリダイゼーション液に加え、42℃18時間
反応させた。反応終了後、上記（４）と同様に洗浄を行
い、Ｘ線フィルムを用いてオートラジオグラフィーを行
い、その結果2600baseの位置にハイブリダイズするクロ
ーンを１個得た。このクローンをpM4Hと命名した。
なお、各陽性クローンのプローブは、各クローンをHind
III及びEcoRIで消化後、低融点アガロースを用いた電気
泳動によりインサートDNAを分離し、抽出後、32PdCTPを
用いたランダムプライムラベルにより得た。
III及びEcoRIで消化後、低融点アガロースを用いた電気
泳動によりインサートDNAを分離し、抽出後、32PdCTPを
用いたランダムプライムラベルにより得た。
（６）PIV−4A・HN遺伝子に相補性を示すDNAの制限酵素
地図の作成及び塩基配列の決定 上記（５）で得られたクローンpM4Hを種々の制限酵素で
切断して、その制限酵素地図を作成し、第１図にその結
果を示した。図面において１及び３はベクターDNAであ
り、２はインサートDNAで本発明のDNA断片である。
地図の作成及び塩基配列の決定 上記（５）で得られたクローンpM4Hを種々の制限酵素で
切断して、その制限酵素地図を作成し、第１図にその結
果を示した。図面において１及び３はベクターDNAであ
り、２はインサートDNAで本発明のDNA断片である。
第１図にしたがって各制限酵素で切断後、得られたフラ
グメントをプラスミドpUC118のマルチクローニングサイ
トに各々導入し、SEQUENASETMキット（東洋紡社製）を
用いてシークエンスを行った。又、一部は、キロシーク
エンス用デレーションキット（宝酒造社製）を用いてデ
レーションミュータントを作成し、シークエンスを行い
塩基配列を決定した。
グメントをプラスミドpUC118のマルチクローニングサイ
トに各々導入し、SEQUENASETMキット（東洋紡社製）を
用いてシークエンスを行った。又、一部は、キロシーク
エンス用デレーションキット（宝酒造社製）を用いてデ
レーションミュータントを作成し、シークエンスを行い
塩基配列を決定した。
その結果は、前記［式］に示す通りであった。
（７）検査薬への応用（PIV−4Aの同定） 上記（４）で得られたpM4Hクローンを、BamHIで切断
後、低融点アガロースを用いた電気泳動によりインサー
トDNAの一部を分離、抽出し、32Pを用いたランダムプラ
イムラベリングによりプローベを作成した。次に、前記
（１）の方法で得られたPIV−4A感染細胞由来RNA、ウイ
ルス非感染細胞由来RNAを0.35μｇづつナイロン膜にプ
ロットした後、風乾、UV照射、以降の処理は上記（５）
のノーザン法と全く同様にして反応させオートラジオグ
ラフィーを行った。その結果、PIV−4A感染細胞由来RNA
をプロットした部分には、試料中のPIV−4AウィルスRNA
とハイブリッドを形成した同プローブにより生じる陽性
シグナルが認められ、PIV−4Aに感染していることが確
認された。これに対して、ウイルス非感染細胞由来RNA
をプロットした部分には反応が全く認められなかった。
後、低融点アガロースを用いた電気泳動によりインサー
トDNAの一部を分離、抽出し、32Pを用いたランダムプラ
イムラベリングによりプローベを作成した。次に、前記
（１）の方法で得られたPIV−4A感染細胞由来RNA、ウイ
ルス非感染細胞由来RNAを0.35μｇづつナイロン膜にプ
ロットした後、風乾、UV照射、以降の処理は上記（５）
のノーザン法と全く同様にして反応させオートラジオグ
ラフィーを行った。その結果、PIV−4A感染細胞由来RNA
をプロットした部分には、試料中のPIV−4AウィルスRNA
とハイブリッドを形成した同プローブにより生じる陽性
シグナルが認められ、PIV−4Aに感染していることが確
認された。これに対して、ウイルス非感染細胞由来RNA
をプロットした部分には反応が全く認められなかった。
本発明によって提供される、前記［式］で表されるDNA
断片は、PIV−4A・HNの遺伝子RNAに特異的に相補性を示
すので、PIV−4A感染症の早期診断の検査薬に極めて有
用に用いることができる。
断片は、PIV−4A・HNの遺伝子RNAに特異的に相補性を示
すので、PIV−4A感染症の早期診断の検査薬に極めて有
用に用いることができる。
第１図は、上記［式］で表されるPIV−4A・HN遺伝子に
相補性を示すDNA（pM4H）のcDNA領域の制限酵素地図、 １及び３……ベクターDNA、 ２……インサートDNA、
相補性を示すDNA（pM4H）のcDNA領域の制限酵素地図、 １及び３……ベクターDNA、 ２……インサートDNA、
Claims (1)
- 【請求項１】下記［式］で表されるヒトパラインフルエ
ンザ4A型ウイルス同定用検査薬に用いるDNA断片。 ［式］;GGGGAACACACTTCTCAGCCCTGATTGCTCAAGG CCCTTGCATGTGCAACCGAGACACCCCCCACAAGCACCGGAA TAAGACCTGACAACAAAGTAGCAGCCACCACGACCCAAAAAC AAAATTAAAAGGATCCGGTAACAGCCCATCAACCAGCAATCA TAGAATCCAACAATCCAGAGAGACGTCACATCAACTCATCCA CGAATCTTCGAAGGGAACATCCCAGACAAAATCACAGCCCAT TCCCTGATCACGGATAAACTGAGAAAGATCACAAGAATGCAA GACTCACATGGTAATACACAAATACTCAACCAGGCAAATTCA ATGGTGAAAAGAACATGGAGATTACTATTTCGAATTGCAACC TTAATATTACTTGTTTCAATATTTGTGTTATCGCTCATAATT GTATTACAGTCAACACCGGGGAATTTGCAAAACGATATCAAT ATAATTAGAAAGGAGCTCAATACAATTATGGAGAATTTTGAA ACTACATCTAAGTCACTGTTAAGTGTATCAAATCAAATCACT TACGATGTATCAGTACTTACTCCTATAAGACAAGAAGCTATT GAAACAAACATCATTTCAAAAATAAAAGATCATTGCAAAGAT AGAGTAATTAAAGAAGGAAGCACTTGCACATTGAATCGCAGC CCTTTGCATGATGTCTCTTTTTTAAATGGGTTCAATAAATTC TATTTCACATATAAAGATAATATGCAAATTAAGTTTAAATCA TTATTAGATTACCCCAATTTTATTCCAACTGCTACAACTCCC CACGGATGCATTCGAATTCCATCATTCTCCTTAGGTCAAACC CATTGGTGTTATACCCATAATATAAACCTACTAGGATGTGCA GACCCTGCATCTAGCAATCAATATGTATCACTAGGAACCTTA CAAGTCTTAAAAATGGGTGACCCTTATTTTAAAGTCGAGCAT AGTCATTATTTAAATGACGGGAGGAATCGAAAGAGTTGTTCA GTGGTTGCTGTCCCCGACGGATGCCTGCGGAATTGTGTGACC ATGACAAAAAATGAGACAGAGAATTTCAAAGACCTCAATTGG CAACACAATTACTTACATACATATCATATAATGGTACCATTA AAGACTCGTATAATAAATCCACCAGGATCATCCAGAGATTGG GTTCATATCGCACCAGGGGTAGGCTCGGGCCTTTTGTATGCC AAATTACTTATATTTCCTTTGTATGGGGGTCTCACGGAAAAA TCAGTGATACATAATAATCAATCAGGGAAATATTTTTTCCCT AATTCAACTAAATTGCAATGCCGTAACAGCACTATGGAAAAA ATAAAAGGAGCAAAAGATTCATACACAATAACTTACTTCTCA GGGAGACTTATACAGAGTGCATTTCTGGTTTGTGATCTAAGA CAATTTCTTTCTGAAGATTGTGAAATCTTAATTCCTAGTAAT GATTACATGATGGTCGGTGCAGAGGGTCGATTATATAACATT GAGAACAACATATTTTATTATCAGAGAGGATCCAGCTGGTGG CCTTATCCGAGCCTCTATAGAATCAGGTTAAACCTTAGTAAG AAATATCCTAGAATAACTGAAATTAAATTTACAAAAATTGAA ATCGCCCCAAGACCAGGCAACAAAGATTGTCCAGGAAATAAG GCTTGCCCAAAAGAATGTATAACGGGAGTCTACCAAGATATA TTGCCACTAAGTTATCCCAATACTGCATTTCCACACTTAAAA CAAGCGTATTATACAGGTTTTTATCTTAATAACTCGCTCGAG AGACGCAATCCAACATTTTATACTGCTGACAATCTAGATTAC CATCAACAGGAAAGATTAGGTAAATTCAATCTTACTGCTGGA TACTCTACTACAACTTGTTTTAAACAGACCACTACTGCGAGG TTATACTGTCTCTACATAATTGAAGTGGGTGACTCAGTCATT GGGGACTTTCAGATCACCCTTTTTTTAGCAGCTTAATAGACC AGACTGTTAATTAATCAACAAAGTTATTCTGTAATATAAACT GATCTTATAAGTGAAAAGATGCCTATCCAAGGAGGTTGATAG ACAAATAGTAAAAGTAGCAATTGTAACAAAACTCTAAGGAAA AAGTAATTCGAGAAATATTATAGACTGACTTCAGAGCAAACA CAACATCGATCCATAATAGTCAATATAATCAATAATACTCTA TGAGACCTTACCTATCAACAGCAAAAAACACAGTCCATCAAG CGGAACCCAACTCGCTCCATCCTTAATCATCCACTGAAAGAA AAAATATACGAAGGACCATCGGCCACCGGGTCCAAACAATCT AGCACAAAAATTCAAACAACCGCCAAACTCTGTTCGGCCTCA ACAAACAATCCGCCAAGCCATCTGTCATTCCTATACCAACAC ACAACCATCCCATTCCTCAAAAGCAATTCAATCCGCGACCCA AAGAAGACTCTCCACATATCCAGCTAATCCGTCGATCCGACA CATCATCGTATCTTTTAAGAAAAAAA
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1154745A JPH074252B2 (ja) | 1989-06-19 | 1989-06-19 | ヒトパラインフルエンザ４ａ型ウイルス同定用検査薬に用いるｄｎａ断片 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1154745A JPH074252B2 (ja) | 1989-06-19 | 1989-06-19 | ヒトパラインフルエンザ４ａ型ウイルス同定用検査薬に用いるｄｎａ断片 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0322999A JPH0322999A (ja) | 1991-01-31 |
| JPH074252B2 true JPH074252B2 (ja) | 1995-01-25 |
Family
ID=15590985
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1154745A Expired - Lifetime JPH074252B2 (ja) | 1989-06-19 | 1989-06-19 | ヒトパラインフルエンザ４ａ型ウイルス同定用検査薬に用いるｄｎａ断片 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH074252B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4840030B2 (ja) * | 2006-08-31 | 2011-12-21 | パナソニック株式会社 | 風力・太陽光発電装置 |
| IT1395110B1 (it) * | 2009-07-28 | 2012-09-05 | Noce S R L | Aerostato autostabile perfezionato e relativo sistema di involo e di recupero |
| CN118531159A (zh) * | 2023-02-22 | 2024-08-23 | 天津华大医学检验所有限公司 | 一种用于呼吸道病毒富集测序的建库试剂盒及其使用方法 |
-
1989
- 1989-06-19 JP JP1154745A patent/JPH074252B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0322999A (ja) | 1991-01-31 |
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