JPH0411889A - ヒトパラインフルエンザ４ａ型ウイルスホスフォプロテイン遺伝子及び該遺伝子を含む物質 - Google Patents
ヒトパラインフルエンザ４ａ型ウイルスホスフォプロテイン遺伝子及び該遺伝子を含む物質Info
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、ヒトパラインフルエンザ４Ａ型ウイルス（以
下、ＰＩＶ−４Ａと略称する）ホスフォプロティン（以
下、Ｐ蛋白と略称する）遺伝子及び該遺伝子を含む物質
に間し、より詳しくは、ＰｉＶ−４Ａ−Ｐ蛋白遺伝子Ｒ
ＮＡに相補性を示し、さらに、Ｐ Ｉ Ｖ−４ＡＯｖＷ
＆白の全コード領域と、Ｐ蛋白のアミノ末端側（以下、
Ｎ末端側と略称する）及びカルボキシル末端側（以下、
Ｃ末端側と略称する）をコードする領域とを含み、ＰＩ
Ｖ−４Ａ感染症の検査薬として、あるいは、治療薬とし
て有用な遺伝子に間する。
下、ＰＩＶ−４Ａと略称する）ホスフォプロティン（以
下、Ｐ蛋白と略称する）遺伝子及び該遺伝子を含む物質
に間し、より詳しくは、ＰｉＶ−４Ａ−Ｐ蛋白遺伝子Ｒ
ＮＡに相補性を示し、さらに、Ｐ Ｉ Ｖ−４ＡＯｖＷ
＆白の全コード領域と、Ｐ蛋白のアミノ末端側（以下、
Ｎ末端側と略称する）及びカルボキシル末端側（以下、
Ｃ末端側と略称する）をコードする領域とを含み、ＰＩ
Ｖ−４Ａ感染症の検査薬として、あるいは、治療薬とし
て有用な遺伝子に間する。
ウィルス感染症の治療効果を高めるためには、感染ウィ
ルスを同定し、その同定結果に基づいて適切な治療をお
こなうことが必要である。
ルスを同定し、その同定結果に基づいて適切な治療をお
こなうことが必要である。
従来、ウィルスは、血清学的性状に基づいて同定されて
おり、その主な方法としてはエンザイムリンクドイムノ
ソルベントアッセイ法（以下、ＥＬＩＳＡ法と略称する
）、中和反応法、補体結合反応法、血球凝集抑制反応法
、蛍光抗体法、寒天内沈降反応法等が知られている。し
かしながら、これらいずれの方法も検体中のウィルスに
対する抗体を測定することにより判定を行うものであっ
て、確度の高い判定を行うには、−船釣に感染１週問後
のウィルス抗体価が上昇し始める段階で行わなければな
らず、場合によっては、さらに数週閏後に再測定を行っ
て確認することが必要となるため、発症前および早期診
断が難しいという問題点がある。
おり、その主な方法としてはエンザイムリンクドイムノ
ソルベントアッセイ法（以下、ＥＬＩＳＡ法と略称する
）、中和反応法、補体結合反応法、血球凝集抑制反応法
、蛍光抗体法、寒天内沈降反応法等が知られている。し
かしながら、これらいずれの方法も検体中のウィルスに
対する抗体を測定することにより判定を行うものであっ
て、確度の高い判定を行うには、−船釣に感染１週問後
のウィルス抗体価が上昇し始める段階で行わなければな
らず、場合によっては、さらに数週閏後に再測定を行っ
て確認することが必要となるため、発症前および早期診
断が難しいという問題点がある。
通常、Ｐ Ｉ Ｖ−４Ａ（Ｄ測定！、：ハＥＬ Ｉ Ｓ
Ａ法が用いられており、この方法は、検体中のＰＩＶ−
４Ａに対する抗体を測定するもので、例えば、ＰＩ Ｖ
−４Ａを固定化したプレートに被検体を加えて反応させ
た後洗浄し、さらに抗Ｐ Ｉ Ｖ−４Ａ抗体を加え同様
にして反応させ、次いで酵素標識抗体を加えて反応後、
発色させることにより測定するものであるが、この方法
も上記同様発症前及び早期診断が難しく、必然的に治療
の開始時期を遅らせる結果となり、治療効果を高めるの
が難しいという問題点を有している。
Ａ法が用いられており、この方法は、検体中のＰＩＶ−
４Ａに対する抗体を測定するもので、例えば、ＰＩ Ｖ
−４Ａを固定化したプレートに被検体を加えて反応させ
た後洗浄し、さらに抗Ｐ Ｉ Ｖ−４Ａ抗体を加え同様
にして反応させ、次いで酵素標識抗体を加えて反応後、
発色させることにより測定するものであるが、この方法
も上記同様発症前及び早期診断が難しく、必然的に治療
の開始時期を遅らせる結果となり、治療効果を高めるの
が難しいという問題点を有している。
本発明は、上記のような問題点の解決を可能とするもの
で、特に、Ｐ Ｉ Ｖ−４Ａ感染症の早期診断のための
検査薬として有用な遺伝子を提供するものである。
で、特に、Ｐ Ｉ Ｖ−４Ａ感染症の早期診断のための
検査薬として有用な遺伝子を提供するものである。
本発明は、遺伝子を構成する塩基配列の全部または一部
が、下記［式］ ［式］ ； ＡＧＧＴＣＡＣＴＣＡＡＴＣＧＴＴＣＡ
ＧＧＣＴＡＣＴＡＴＡＡＴＴＴＣＴＡＡＴＴＣＣＧＧＡ
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ＴＡＡＴＴＴＡＡＧの全部または一部で表される単位で
ある遺伝子（以下、ＤＮＡ断片と略称することもある）
を提供することによって、Ｐ Ｉ Ｖ−４Ａ感染症の発
症前および早期診断が難しいという問題点の解決を図フ
たものである。
が、下記［式］ ［式］ ； ＡＧＧＴＣＡＣＴＣＡＡＴＣＧＴＴＣＡ
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ＴＡＧＧＴＴＡＴＴＴＣＣＧＴＧＡＣＡＡＴＡＴＡＡＡ
ＴＡＡＴＴＴＡＡＧの全部または一部で表される単位で
ある遺伝子（以下、ＤＮＡ断片と略称することもある）
を提供することによって、Ｐ Ｉ Ｖ−４Ａ感染症の発
症前および早期診断が難しいという問題点の解決を図フ
たものである。
本発明によって提供されるＤＮＡ断片は、ＰＩＶ−４Ａ
−Ｐ蛋白遺伝子ＲＮＡに相補性を示すので、これをＰ
Ｉ Ｖ−４Ａ同定用検査薬に用いた場合、Ｐ Ｉ Ｖ−
４Ａの同定を直接行うことができ、従来の抗体測定によ
る間接的同定法における問題点の解決が可能である。
−Ｐ蛋白遺伝子ＲＮＡに相補性を示すので、これをＰ
Ｉ Ｖ−４Ａ同定用検査薬に用いた場合、Ｐ Ｉ Ｖ−
４Ａの同定を直接行うことができ、従来の抗体測定によ
る間接的同定法における問題点の解決が可能である。
また、前記［式］で表される塩基配列の５１１番目から
５１６１０００個のＧ塩基の数は、ｍＲＮＡに転写され
た段階で同じ位置にさらに２個のＧ塩基が付加されて合
計８個のＧ塩基を持つもの、及び、３個のＧ塩基が付加
されて合計９個のＧ塩基を持つものなとがあり、前記［
式］て表される６個のＧ塩基及び９個のＧ塩基からなる
ｍ ＲＮ Ａは、■蛋白をコードし、８個のＧ塩基から
なるｍＲＮＡはＰ蛋白をコードし、このＰ蛋白及びＶ蛋
白はＮ末端側アミノ酸配列を共有する。したがって、前
記［式］で表される本発明のＤＮＡ断片は、Ｐ Ｉ Ｖ
−４Ａ−Ｖ蛋白の全コード領域とＰ蛋白のＮ末端側及び
Ｃ末端側をコードする領域とを含むので、発現されたＶ
蛋白及びＰ蛋白のＮ末端側を抗体作成の際の抗原として
、あるいは、ワクチンの原料として用いることがてきる
のて、ＰＩＶ−４Ａ感染症の治療薬用途への利用が可能
である。
５１６１０００個のＧ塩基の数は、ｍＲＮＡに転写され
た段階で同じ位置にさらに２個のＧ塩基が付加されて合
計８個のＧ塩基を持つもの、及び、３個のＧ塩基が付加
されて合計９個のＧ塩基を持つものなとがあり、前記［
式］て表される６個のＧ塩基及び９個のＧ塩基からなる
ｍ ＲＮ Ａは、■蛋白をコードし、８個のＧ塩基から
なるｍＲＮＡはＰ蛋白をコードし、このＰ蛋白及びＶ蛋
白はＮ末端側アミノ酸配列を共有する。したがって、前
記［式］で表される本発明のＤＮＡ断片は、Ｐ Ｉ Ｖ
−４Ａ−Ｖ蛋白の全コード領域とＰ蛋白のＮ末端側及び
Ｃ末端側をコードする領域とを含むので、発現されたＶ
蛋白及びＰ蛋白のＮ末端側を抗体作成の際の抗原として
、あるいは、ワクチンの原料として用いることがてきる
のて、ＰＩＶ−４Ａ感染症の治療薬用途への利用が可能
である。
本発明においては、前記［式］の全部または一部で表さ
れる単位それ自体でも検査薬、治療薬用途に用いられ得
ることは勿論であるが、該全部または一部単位を、他の
適宜なりＮＡベクターに組み込んだ遺伝子も上記同様に
使用可能であり（ＩＦ請求項）、さらには、該ベクター
が必ずしもＤＮＡベクターである必要はなく、それ以外
の適宜な物質、例えば、ポリマー セルロース、ガラス
、セラミック、医薬品等に組み込んで、あるいは、これ
らと混合するなどによって得られる遺伝子を含む物質も
使用可能であり（請求項２）、これら遺伝子もしくは遺
伝子を含む物質も、本発明に含まれるものである。
れる単位それ自体でも検査薬、治療薬用途に用いられ得
ることは勿論であるが、該全部または一部単位を、他の
適宜なりＮＡベクターに組み込んだ遺伝子も上記同様に
使用可能であり（ＩＦ請求項）、さらには、該ベクター
が必ずしもＤＮＡベクターである必要はなく、それ以外
の適宜な物質、例えば、ポリマー セルロース、ガラス
、セラミック、医薬品等に組み込んで、あるいは、これ
らと混合するなどによって得られる遺伝子を含む物質も
使用可能であり（請求項２）、これら遺伝子もしくは遺
伝子を含む物質も、本発明に含まれるものである。
本発明における前記［式］で表されるＤＮＡ断片の製造
方法は、特に制限はなく、常法に従うことができ、例え
ば、 （ａ）ＰＩＶ−４Ａ感染細胞から得られるｍＲＮＡより
調製されたｃＤＮＡを大腸菌のプラスミドベクター等の
適当なベクターに導入し大腸菌にクローン化させ、 ■ プローブとしてヌクレオカプシドＲＮＡを用いてス
クリーニングを行う方法、 ■ プローブとして前記ｃ式］で表される塩基配列に基
づいて合成されたオリゴヌクレオチドを用いてスクリー
ニングを行う方法、■ Ｐ Ｉ Ｖ−４Ａに対する抗体
を用いてスクリーニングを行う方法、 等でＰＩＶ−４Ａ−Ｐ蛋白遺伝子をコードするクローン
を単離し、この単離されたクローンのプラスミドからイ
ンサートＤＮＡを分離する方法、 （ｂ） 前記［式］で表１ｔＬ’５ＰＩＶ−４Ａ−Ｐ
蛋白の遺伝子ＲＮＡに相補性を示す塩基配列に基づいて
、ホスホアミダイト法（Ｎａｔｕｒｅ。
方法は、特に制限はなく、常法に従うことができ、例え
ば、 （ａ）ＰＩＶ−４Ａ感染細胞から得られるｍＲＮＡより
調製されたｃＤＮＡを大腸菌のプラスミドベクター等の
適当なベクターに導入し大腸菌にクローン化させ、 ■ プローブとしてヌクレオカプシドＲＮＡを用いてス
クリーニングを行う方法、 ■ プローブとして前記ｃ式］で表される塩基配列に基
づいて合成されたオリゴヌクレオチドを用いてスクリー
ニングを行う方法、■ Ｐ Ｉ Ｖ−４Ａに対する抗体
を用いてスクリーニングを行う方法、 等でＰＩＶ−４Ａ−Ｐ蛋白遺伝子をコードするクローン
を単離し、この単離されたクローンのプラスミドからイ
ンサートＤＮＡを分離する方法、 （ｂ） 前記［式］で表１ｔＬ’５ＰＩＶ−４Ａ−Ｐ
蛋白の遺伝子ＲＮＡに相補性を示す塩基配列に基づいて
、ホスホアミダイト法（Ｎａｔｕｒｅ。
第３１０巻、第１０５頁、 １９Ｂ４）に従って合成ヌ
クレオチドを作成する方法、 （ｃ） 上記（ａ）及び（ｂ）を併用する方法、等に
よって製造することができる。
クレオチドを作成する方法、 （ｃ） 上記（ａ）及び（ｂ）を併用する方法、等に
よって製造することができる。
上記方法によフて得られた本発明のＤＮＡ断片は、以下
のようにして用いることができる。
のようにして用いることができる。
例えば、検査薬として用いる場合、上記方法で得られた
ＤＮＡ断片は、必要ならば適当な制限酵素（例えば、Ｅ
ｃｏＴ２２１等）で十数塩基以上（好ましくは１７塩基
以上、さらに好ましくは２０塩基以上）にさらに切断後
、放射性同位元禦等で標識して検査薬とし、この検査薬
を、検体（咽頭液等）から抽出したＲＮＡを固定化した
ナイロン膜等と反応後、オートラジオグラフィー等で判
定するノーサンハイブリダイゼーション法（以下、ノー
サン法と略称する）等でＰ Ｉ Ｖ−４Ａの同定を行う
ことができる。
ＤＮＡ断片は、必要ならば適当な制限酵素（例えば、Ｅ
ｃｏＴ２２１等）で十数塩基以上（好ましくは１７塩基
以上、さらに好ましくは２０塩基以上）にさらに切断後
、放射性同位元禦等で標識して検査薬とし、この検査薬
を、検体（咽頭液等）から抽出したＲＮＡを固定化した
ナイロン膜等と反応後、オートラジオグラフィー等で判
定するノーサンハイブリダイゼーション法（以下、ノー
サン法と略称する）等でＰ Ｉ Ｖ−４Ａの同定を行う
ことができる。
また、治療薬として用いる場合は、ＤＮＡ断片を、必要
に応じて適宜なベクターに組み込み、蛋白質発現のため
の種々の方法、例えば、兎赤血球ライセイト等を用いた
ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成系、大腸菌や枯草菌等の微生物
を用いた系、酵母、昆虫、哺乳動物等の細胞を用いた系
等により、その遺伝子中にコードされている蛋白質を発
現させ、発現した蛋白質は、抗体を作る場合の抗原とし
て、あるいは、ワクチンの原料等として利用することが
できる。
に応じて適宜なベクターに組み込み、蛋白質発現のため
の種々の方法、例えば、兎赤血球ライセイト等を用いた
ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成系、大腸菌や枯草菌等の微生物
を用いた系、酵母、昆虫、哺乳動物等の細胞を用いた系
等により、その遺伝子中にコードされている蛋白質を発
現させ、発現した蛋白質は、抗体を作る場合の抗原とし
て、あるいは、ワクチンの原料等として利用することが
できる。
以下、実施例に基づいて本発明をさらに詳細に説明する
。
。
牛胎児血清６％を含むイーグル必須培養液中で初代サル
腎細胞を増殖させた後、この培養液を新たに調整したア
クチノマイシンＤ（２μｇ／ｍｌ）を含むイーグル必順
培養液と交換した０次いでＰＩ Ｖ−４Ａ （東芝株）
を接種し、同培養液中で２４時間培養を行なった。ウィ
ルス感染培養細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ混合液で剥し
た後、８０００ｒｐｍで１０分間遠心することにより細
胞を集め、グアニジンイソチオシアネート液（６Ｍグア
ニジンイソチオシアネート、５ｍＭクエン酸ナトリウム
、０．１Ｍ ２・メルカプトエタノール、０゜６％ラウ
ロイルザルコシン酸ナトリウム）ｔｔ加え、ホモゲナイ
ザー中で素早く溶解し、２１Ｇ注射針をつけた注射筒に
６回通すことで染色体ＤＮＡをせん断した。得られた細
胞溶解液を、再度８０００ｒｐｍで遠心し、得られた上
澄液９ｍｌを６゜７Ｍ塩化セシウム水溶液３ｍｆの入っ
た別の遠心チューブに重層し、ベックマンローター（Ｂ
ｅｅｋｍａｎ ５Ｗ４０Ｔｉ ｒｏｔｏｒ）
にて、 ３７０００ｒｐｍで１８時間、１８℃で超遠
心を行い、遠心後ＲＮＡペレットを回収した。
腎細胞を増殖させた後、この培養液を新たに調整したア
クチノマイシンＤ（２μｇ／ｍｌ）を含むイーグル必順
培養液と交換した０次いでＰＩ Ｖ−４Ａ （東芝株）
を接種し、同培養液中で２４時間培養を行なった。ウィ
ルス感染培養細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ混合液で剥し
た後、８０００ｒｐｍで１０分間遠心することにより細
胞を集め、グアニジンイソチオシアネート液（６Ｍグア
ニジンイソチオシアネート、５ｍＭクエン酸ナトリウム
、０．１Ｍ ２・メルカプトエタノール、０゜６％ラウ
ロイルザルコシン酸ナトリウム）ｔｔ加え、ホモゲナイ
ザー中で素早く溶解し、２１Ｇ注射針をつけた注射筒に
６回通すことで染色体ＤＮＡをせん断した。得られた細
胞溶解液を、再度８０００ｒｐｍで遠心し、得られた上
澄液９ｍｌを６゜７Ｍ塩化セシウム水溶液３ｍｆの入っ
た別の遠心チューブに重層し、ベックマンローター（Ｂ
ｅｅｋｍａｎ ５Ｗ４０Ｔｉ ｒｏｔｏｒ）
にて、 ３７０００ｒｐｍで１８時間、１８℃で超遠
心を行い、遠心後ＲＮＡペレットを回収した。
以上のようにして得られたＲＮＡから、オリゴｄＴセル
ローズＴｙｐｅ？ （ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）社製〕を用いてポリＡ鎖を含むｍＲＮＡ （以下、
ｐ ｏ ｌ ｙ （Ａ＋） ＲＮＡと略称する〕を分離
、精製した。
ローズＴｙｐｅ？ （ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）社製〕を用いてポリＡ鎖を含むｍＲＮＡ （以下、
ｐ ｏ ｌ ｙ （Ａ＋） ＲＮＡと略称する〕を分離
、精製した。
２ ｃＤＮＡ−−１−の ；
ｃＤＮＡライブラリーは、岡山・バーブ法に従い合成し
た。
た。
すなわち、上記ｐｏ Ｉｙ （Ａ＋）ＲＮＡ４ｇｇに蒸
留水６μｌを加え、６５℃で１０分間加温した後急冷し
、次にオリゴｄＴプライムドベクター（ｐＵｃ１１Ｂベ
クターのＫｐｎｌサイトにオリゴｄＴを付加したく０．
８〜１．２μｇ／μｍ）〕１０μｍ、 合成反応液（
５００ｍＭ Ｔ ｒ ｉ ｓ−塩酸緩衝液ｐＨ８，３，
３００ｍＭ塩化カリウム、８０ｍＭ塩化マグネシウム、
３ｍＭジチオスレイトール）３μｌ、 及び、２０ｍ
Ｍ ｄＡＴＰ、２０ｍＭ ｄＣＴＰ、２０ｍＭ ｄＧＴ
Ｐ、２０ｍＭｄＴＴＰを各々１ｕ１づつ加え、さらに２
０ｕｎｉｔｓ ＲＮａｓｉｎ、４０ｕｎｉｔｓ リ
バーストランスクリブターゼを加えた後、蒸留水で全量
を３０μｍとし、４２℃で３０分間反応をおこない第−
鎖ｃＤＮＡを合成した。
留水６μｌを加え、６５℃で１０分間加温した後急冷し
、次にオリゴｄＴプライムドベクター（ｐＵｃ１１Ｂベ
クターのＫｐｎｌサイトにオリゴｄＴを付加したく０．
８〜１．２μｇ／μｍ）〕１０μｍ、 合成反応液（
５００ｍＭ Ｔ ｒ ｉ ｓ−塩酸緩衝液ｐＨ８，３，
３００ｍＭ塩化カリウム、８０ｍＭ塩化マグネシウム、
３ｍＭジチオスレイトール）３μｌ、 及び、２０ｍ
Ｍ ｄＡＴＰ、２０ｍＭ ｄＣＴＰ、２０ｍＭ ｄＧＴ
Ｐ、２０ｍＭｄＴＴＰを各々１ｕ１づつ加え、さらに２
０ｕｎｉｔｓ ＲＮａｓｉｎ、４０ｕｎｉｔｓ リ
バーストランスクリブターゼを加えた後、蒸留水で全量
を３０μｍとし、４２℃で３０分間反応をおこない第−
鎖ｃＤＮＡを合成した。
第−鎖ｃＤＮＡ合成終了後、ｄＧＴＰ存在下存在下ター
ミナルデオキシヌクレオチラルトランスフェラーゼて１
０〜３０個のｄＧ塩基を付加し、次いで制限酵素（Ｈｔ
ｎｄｌ［Ｉ）による消化を行い、さらにｄＣ塩基鎖を持
つリンカ−とアニール後、大腸菌ライゲースにより閉環
状とした。最後にＲＮａｓｅＨ存在下、ＤＮＡポリメラ
ーゼにより第二鎖の合成を行い、完全なプラスミドＤＮ
Ａを作成した０次に塩化カルシウム処理を施すことによ
り得られるコンペテント細胞（ＤＨＩ）１００〜２００
μ五に、０．４Ｍ塩化マグネシウム１０．１Ｍ塩化カル
シウムの混合液１０μｌ、及び、上記ＤＮＡ ０．０２
℃ｇを加え、０℃で４０分間、次いで４２℃で９０秒閉
放置し、次に培養液（バクトドリブトン１０ｇ、イース
トイクストラクト５ｇ５ 塩化ナトリウム５ｇを１０
００ ｍ ｌの蒸留水に溶解した溶液）１．５ｍ ｌを
加え、８７℃で４０分間放置することにより形質転換細
胞を得た。
ミナルデオキシヌクレオチラルトランスフェラーゼて１
０〜３０個のｄＧ塩基を付加し、次いで制限酵素（Ｈｔ
ｎｄｌ［Ｉ）による消化を行い、さらにｄＣ塩基鎖を持
つリンカ−とアニール後、大腸菌ライゲースにより閉環
状とした。最後にＲＮａｓｅＨ存在下、ＤＮＡポリメラ
ーゼにより第二鎖の合成を行い、完全なプラスミドＤＮ
Ａを作成した０次に塩化カルシウム処理を施すことによ
り得られるコンペテント細胞（ＤＨＩ）１００〜２００
μ五に、０．４Ｍ塩化マグネシウム１０．１Ｍ塩化カル
シウムの混合液１０μｌ、及び、上記ＤＮＡ ０．０２
℃ｇを加え、０℃で４０分間、次いで４２℃で９０秒閉
放置し、次に培養液（バクトドリブトン１０ｇ、イース
トイクストラクト５ｇ５ 塩化ナトリウム５ｇを１０
００ ｍ ｌの蒸留水に溶解した溶液）１．５ｍ ｌを
加え、８７℃で４０分間放置することにより形質転換細
胞を得た。
上記により２００μ！のコンベテント細胞（ＤＨｌ）に
、０．０２℃ｇのプラスミドＤＮＡを導入することによ
り、アンピシリン存在下で１５００個の独立したクロー
ンを得た。
、０．０２℃ｇのプラスミドＤＮＡを導入することによ
り、アンピシリン存在下で１５００個の独立したクロー
ンを得た。
３ レオ シ ＲＮＡ ロー の ；ＰＩ
Ｖ−４Ａ感染初代サル腎細胞に、０．６％ノニデッ）Ｐ
−４０，１０ｍＭバナジルリボヌクレオチド複合体を含
む溶液（０，１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０５ＭＴｒｉ
ｓ−塩酸緩衝液）を加え、水中で１時間ピペティングに
よる可溶化を行い、８０００ｒｐｍで１０分間遠心した
０次いで塩化セシウムの４０％水溶液、３０％水溶液、
２５％水溶液の各々１ｍｌ、２．５ｍｌ、１ｍｌ を
この順に重層した遠心チューブに、上記遠心で得られた
上澄液９ｍｌをさらに重層し、ベックマンローター５Ｗ
４０Ｔｉにて、３７０００ｒｐｍ、１８時間、１６℃で
平衡密度勾配遠心を行った。遠心後、３０％の塩化セシ
ウム水溶液層に生じたウィルスのヌクレオカプシドバン
ドを回収した。次に０．１％ＳＤＳ及びブロテイナーゼ
Ｋ（２，５ｍｇ／ｍｌ）を加え、５６℃で１５分間蛋白
分解を行った後、フェノールおよびフェノール／クロロ
ホルム温液で処理を行い、ヌクレオカプシドＲＮＡを得
た。得られたヌクレオカプシドＲＮＡに５０ｍＭＴｒｉ
ｓ−塩酸緩衝液ｐＨ９，７を加え、９５℃で１０分間加
温した後、室温まで徐々に冷やした０次にこのＲＮＡ溶
液２０μｍに緩衝液（２５０ｍＭＴｒｉｓ−塩酸、５０
ｍＭ塩化マグネシウム、２５ｍＭ ＤＴＴ、７．５ｍＭ
スペルミン、５００ｍＭ塩化カリウム）１０ｕｌ、
及び、３２ｐＡＴＰ（１００μＣム／６００ｐＭ）３μ
ｍ、 Ｔ４− Ｄ Ｎ Ａカイネース ２ｕｎｉｔｓ
ＪＥ加えた後、蒸留水で全量を５０μｌとし、３７℃で
１時間反応させヌクレオカプシドＲＮＡプローブを得た
。
Ｖ−４Ａ感染初代サル腎細胞に、０．６％ノニデッ）Ｐ
−４０，１０ｍＭバナジルリボヌクレオチド複合体を含
む溶液（０，１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０５ＭＴｒｉ
ｓ−塩酸緩衝液）を加え、水中で１時間ピペティングに
よる可溶化を行い、８０００ｒｐｍで１０分間遠心した
０次いで塩化セシウムの４０％水溶液、３０％水溶液、
２５％水溶液の各々１ｍｌ、２．５ｍｌ、１ｍｌ を
この順に重層した遠心チューブに、上記遠心で得られた
上澄液９ｍｌをさらに重層し、ベックマンローター５Ｗ
４０Ｔｉにて、３７０００ｒｐｍ、１８時間、１６℃で
平衡密度勾配遠心を行った。遠心後、３０％の塩化セシ
ウム水溶液層に生じたウィルスのヌクレオカプシドバン
ドを回収した。次に０．１％ＳＤＳ及びブロテイナーゼ
Ｋ（２，５ｍｇ／ｍｌ）を加え、５６℃で１５分間蛋白
分解を行った後、フェノールおよびフェノール／クロロ
ホルム温液で処理を行い、ヌクレオカプシドＲＮＡを得
た。得られたヌクレオカプシドＲＮＡに５０ｍＭＴｒｉ
ｓ−塩酸緩衝液ｐＨ９，７を加え、９５℃で１０分間加
温した後、室温まで徐々に冷やした０次にこのＲＮＡ溶
液２０μｍに緩衝液（２５０ｍＭＴｒｉｓ−塩酸、５０
ｍＭ塩化マグネシウム、２５ｍＭ ＤＴＴ、７．５ｍＭ
スペルミン、５００ｍＭ塩化カリウム）１０ｕｌ、
及び、３２ｐＡＴＰ（１００μＣム／６００ｐＭ）３μ
ｍ、 Ｔ４− Ｄ Ｎ Ａカイネース ２ｕｎｉｔｓ
ＪＥ加えた後、蒸留水で全量を５０μｌとし、３７℃で
１時間反応させヌクレオカプシドＲＮＡプローブを得た
。
４ コロニーハ リ ゼーション；前記（２）の
形質転換細胞１００〜２００μｍを、アンピシリン（１
２０ｕ ｇ ／ ｍ ｌ ）を含む１５ｃｍの寒天プレ
ート（１０ｇバクトドリブトン、５ｇイーストイクスト
ラクト、５ｇ塩化ナトリウム、１５ｇアガーを加え蒸留
水で全量を１０１００Ｏとした）に蒔き、１２時間、３
７℃で培養した。
形質転換細胞１００〜２００μｍを、アンピシリン（１
２０ｕ ｇ ／ ｍ ｌ ）を含む１５ｃｍの寒天プレ
ート（１０ｇバクトドリブトン、５ｇイーストイクスト
ラクト、５ｇ塩化ナトリウム、１５ｇアガーを加え蒸留
水で全量を１０１００Ｏとした）に蒔き、１２時間、３
７℃で培養した。
ニトロセルロース膜に生じたコロニーを写し取り、３７
℃で６時間培養した。次にこの膜を０．５Ｎ水酸化ナト
リウム／１．５Ｍ塩化ナトリウム混合液で１０分ｍｍ理
し、さらに１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５ＭＴｒ
ｉｓ−塩酸緩衝液ｐＨ８゜０にｌＯ分間装いた後、０．
３Ｍ塩化ナトリウム１０．０３Ｍクエン酸ナトリウム混
合液中で５分間リンスした。リンス後、膜を風乾し、８
０℃で１時間吸引しなからベーキングを行うことにより
ＤＮＡを膜に固定した。
℃で６時間培養した。次にこの膜を０．５Ｎ水酸化ナト
リウム／１．５Ｍ塩化ナトリウム混合液で１０分ｍｍ理
し、さらに１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５ＭＴｒ
ｉｓ−塩酸緩衝液ｐＨ８゜０にｌＯ分間装いた後、０．
３Ｍ塩化ナトリウム１０．０３Ｍクエン酸ナトリウム混
合液中で５分間リンスした。リンス後、膜を風乾し、８
０℃で１時間吸引しなからベーキングを行うことにより
ＤＮＡを膜に固定した。
このようにして得られた膜５枚当りに、変性鮭ＲＮＡ
（１ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌ、５ＳＰＥ液（３゜６Ｍ塩化ナ
トリウム、２００ｍＭ 第一りん酸ナトリウム、２０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ）７．５ｍ ｌ、デンハード液（２％Ｂ
ＳＡ、２％Ｆｉｃｏｌｌ、２％ポリビニルピロリドン）
１．２５ｍ１，１０％５ＤＳ１．２５ｍ１からなるブレ
ハイブリダイゼーション液を加え、４２℃で１２時間反
応させ、次に新たにＩＩＩ！Ｌ、た上記プレハイブリダ
イゼーション液に、前記（３）のヌクレオカプシドＲＮ
Ａプローブを５００万Ｃｉ／ｍｌとなるように加え、４
２℃で１８時間反応を行った。
（１ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌ、５ＳＰＥ液（３゜６Ｍ塩化ナ
トリウム、２００ｍＭ 第一りん酸ナトリウム、２０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ）７．５ｍ ｌ、デンハード液（２％Ｂ
ＳＡ、２％Ｆｉｃｏｌｌ、２％ポリビニルピロリドン）
１．２５ｍ１，１０％５ＤＳ１．２５ｍ１からなるブレ
ハイブリダイゼーション液を加え、４２℃で１２時間反
応させ、次に新たにＩＩＩ！Ｌ、た上記プレハイブリダ
イゼーション液に、前記（３）のヌクレオカプシドＲＮ
Ａプローブを５００万Ｃｉ／ｍｌとなるように加え、４
２℃で１８時間反応を行った。
反応終了後０．１％ ＳＤＳを含む２０倍希釈の５ＳＰ
Ｅ液中で４２、℃で５分間、２回洗浄し、次に０．１％
ＳＤＳを含む２００倍希釈の５ＳＰＥ液中で４２℃で１
５分間、２回洗浄を行った。洗浄終了後膜を風乾し、Ｘ
線フィルム（コダック社製、ＲＸ５）を用いて、−８０
℃で１２時間オートラジオグラフィーを行い、数個の陽
性クローンを得た。
Ｅ液中で４２、℃で５分間、２回洗浄し、次に０．１％
ＳＤＳを含む２００倍希釈の５ＳＰＥ液中で４２℃で１
５分間、２回洗浄を行った。洗浄終了後膜を風乾し、Ｘ
線フィルム（コダック社製、ＲＸ５）を用いて、−８０
℃で１２時間オートラジオグラフィーを行い、数個の陽
性クローンを得た。
５ − ン゛；
上記の陽性クローンを用いてノーサン法を行った。
すなわち、前記（１）の方法で得られたＰ Ｉ Ｖ−４
Ａ感染細胞由来ｐｏｌｙ （Ａ＋）ＲＮＡ、ウィルス非
感染細胞由来ｐ ｏ ｌ Ｖ （Ａ＋） ＲＮＡ及びｒ
ＲＮＡマーカーを、各々１．５％アガロースゲル中で
電気泳動後、ナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ、アマジャ
ム社製）に転写し、風乾後、ＵＶ照射をすることにより
ＲＮＡをナイロン膜に共有結合させ、次に上記の各陽性
クローンをプローブとして各々ハイブリダイゼーション
を行った。
Ａ感染細胞由来ｐｏｌｙ （Ａ＋）ＲＮＡ、ウィルス非
感染細胞由来ｐ ｏ ｌ Ｖ （Ａ＋） ＲＮＡ及びｒ
ＲＮＡマーカーを、各々１．５％アガロースゲル中で
電気泳動後、ナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ、アマジャ
ム社製）に転写し、風乾後、ＵＶ照射をすることにより
ＲＮＡをナイロン膜に共有結合させ、次に上記の各陽性
クローンをプローブとして各々ハイブリダイゼーション
を行った。
すなわち、ナイロン膜を上記（４）のプレハイブリダイ
ゼーション液中で４２℃で１２時間反応させ、次に各陽
性クローンから作られた３２ｐでラベルされたプローブ
を１００万Ｃｉ／ｍｌとなるようにブレハイブリダイゼ
ーション液に加え、４２℃で１８時間反応させた０反応
終了後上記（４）と同様に洗浄を行い、Ｘ線フィルムを
用いてオートラジオグラフィーを行い、その結果的１５
００ｂａｓｅの位置にハイブリダイズするクローンを６
個得、この中から最も大きなインサー）ＤＮＡを含むク
ローンをｐ４ＡＰと命名した。
ゼーション液中で４２℃で１２時間反応させ、次に各陽
性クローンから作られた３２ｐでラベルされたプローブ
を１００万Ｃｉ／ｍｌとなるようにブレハイブリダイゼ
ーション液に加え、４２℃で１８時間反応させた０反応
終了後上記（４）と同様に洗浄を行い、Ｘ線フィルムを
用いてオートラジオグラフィーを行い、その結果的１５
００ｂａｓｅの位置にハイブリダイズするクローンを６
個得、この中から最も大きなインサー）ＤＮＡを含むク
ローンをｐ４ＡＰと命名した。
なお、各陽性クローンのプローブは、各クローンをＨｉ
ｎｄ ｍ及びＥｃｏＲＩで消化後、低融点アガロース
を用いた電気泳動によりインサートＤＮＡを分離し、抽
出後、３２ＰｄＣＴＰを用いたランダムプライムラベル
により得た。
ｎｄ ｍ及びＥｃｏＲＩで消化後、低融点アガロース
を用いた電気泳動によりインサートＤＮＡを分離し、抽
出後、３２ＰｄＣＴＰを用いたランダムプライムラベル
により得た。
烈ぷＬｌ定；
上記（５）で得られたクローンＩ）４ＡＰを種々の制限
酵素で切断して、その制限酵緊地図を作成し、第１図に
その結果を示した。
酵素で切断して、その制限酵緊地図を作成し、第１図に
その結果を示した。
すなわち、第１図はクローンｐ４ＡＰをＨｉｎｄｌＩ［
、Ｘｂａ Ｌ Ｈｐａ Ｉ、ＥｃｏＴ２２ Ｉ
、Ｂａｍ１（Ｉ・ ＥｃｏＲＩ等の各制限酵素で切断後
、得られたフラグメントをプラスミドｐｔｒｃ １１８
のマルチクローニングサイトに各々導入し、ＳＥＱＵＥ
ＮＡＳＥＴＭキット（東洋紡社製）を用いてシーフェン
スを行堕 また、一部はキロシーフェンス用デレージョ
ンキット（宝酒造社製）を用いてデレーションミュータ
ントを作成し、シーフェンスを行い塩基配列を決定しす
ることによ）で作成した制限酵素地図であり、図面にお
いてｌ及び３はベクターＤＮＡであり、２はインサート
ＤＮＡで本発明のＤＮＡ断片である。
、Ｘｂａ Ｌ Ｈｐａ Ｉ、ＥｃｏＴ２２ Ｉ
、Ｂａｍ１（Ｉ・ ＥｃｏＲＩ等の各制限酵素で切断後
、得られたフラグメントをプラスミドｐｔｒｃ １１８
のマルチクローニングサイトに各々導入し、ＳＥＱＵＥ
ＮＡＳＥＴＭキット（東洋紡社製）を用いてシーフェン
スを行堕 また、一部はキロシーフェンス用デレージョ
ンキット（宝酒造社製）を用いてデレーションミュータ
ントを作成し、シーフェンスを行い塩基配列を決定しす
ることによ）で作成した制限酵素地図であり、図面にお
いてｌ及び３はベクターＤＮＡであり、２はインサート
ＤＮＡで本発明のＤＮＡ断片である。
その結果は、前記ｃ式コに示す通りであった。
７ Ｖ−４Ａの ；
（７−１） 前記［式コの最初の塩基１番目から１１
７１番目で表されるインサー）ＤＮＡの一部を用いる場
合： 前記（５）で得られたｐ４ＡＰクローンを、ＨｉｎｄＤ
Ｉで切断後、低融点アガロースを用いた電気泳動により
インサー）ＤＮＡの一部を分離、抽出し、３ａｐを用い
たランダムプライムラベリングによりブローベを作成し
た。次に前記（１）の方法で得られたＰＩＶ−４Ａ感染
細胞由来ＲＮＡ、ウィルス非感染細胞由来ＲＮＡを０．
３５Ｍｇづつナイロン膜にプロットした後、風乾、ＵＶ
照射、以降の処理は前記（５）のノーサン法と全く同様
にして反応させオートラジオグラフィーを行った。
７１番目で表されるインサー）ＤＮＡの一部を用いる場
合： 前記（５）で得られたｐ４ＡＰクローンを、ＨｉｎｄＤ
Ｉで切断後、低融点アガロースを用いた電気泳動により
インサー）ＤＮＡの一部を分離、抽出し、３ａｐを用い
たランダムプライムラベリングによりブローベを作成し
た。次に前記（１）の方法で得られたＰＩＶ−４Ａ感染
細胞由来ＲＮＡ、ウィルス非感染細胞由来ＲＮＡを０．
３５Ｍｇづつナイロン膜にプロットした後、風乾、ＵＶ
照射、以降の処理は前記（５）のノーサン法と全く同様
にして反応させオートラジオグラフィーを行った。
その結果、ＰＩＶ−４Ａ感染細胞由来ＲＮＡをプロット
した部分には、試料中のＰ Ｉ Ｖ−４ＡウイルスＲＮ
Ａとハイブリッドを形成した同プローブにより生じる陽
性シグナルが認められ、ＰＩＶ−４Ａに感染しているこ
とが確認された。これに対して、ウィルス非感染細胞由
来ＲＮＡをプロットした部分には反応が全く認められな
かった。
した部分には、試料中のＰ Ｉ Ｖ−４ＡウイルスＲＮ
Ａとハイブリッドを形成した同プローブにより生じる陽
性シグナルが認められ、ＰＩＶ−４Ａに感染しているこ
とが確認された。これに対して、ウィルス非感染細胞由
来ＲＮＡをプロットした部分には反応が全く認められな
かった。
（７−２） 前記［式］の１番から１５０２番で表さ
れるインサートＤＮＡの全体を用いる場合；前記（５）
のｐ４ＡＰクローンを、Ｐｓｔ Ｉ 及びＥｃｏＲ
Ｉ て切断後、低融点アガロースを用いた電気泳動に
より約１６００塩基対の位置に泳動されるバンドを切り
出し、抽出し、エタノール沈澱によりインサー）ＤＮＡ
を回収した。得られたインサートＤＮＡＩ μｌ （１
０ｐｍｏ １ ｅ ｓ／μｌ）当り、緩衝液（０，５Ｍ
Ｔ ｒ ｉ ｓ−塩酸ｐＨ７，６，０，１Ｍ ＭｇＣ
！２．５０ｍＭ ヂチオスレイトール、１ｍＭスペル
ミジン塩酸、１ｍＭＥＤＴＡ）２μｍ、蒸留水１１．４
μｍ、（γ３２Ｐ）ＡＴＰ５μｌ （２Ｍｍｏ Ｉ ｅ
ｓ／ｕ り、バクテリオファージＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼ８ｕｎｉｔを加えた後、３７℃で４５分間反応
した。
れるインサートＤＮＡの全体を用いる場合；前記（５）
のｐ４ＡＰクローンを、Ｐｓｔ Ｉ 及びＥｃｏＲ
Ｉ て切断後、低融点アガロースを用いた電気泳動に
より約１６００塩基対の位置に泳動されるバンドを切り
出し、抽出し、エタノール沈澱によりインサー）ＤＮＡ
を回収した。得られたインサートＤＮＡＩ μｌ （１
０ｐｍｏ １ ｅ ｓ／μｌ）当り、緩衝液（０，５Ｍ
Ｔ ｒ ｉ ｓ−塩酸ｐＨ７，６，０，１Ｍ ＭｇＣ
！２．５０ｍＭ ヂチオスレイトール、１ｍＭスペル
ミジン塩酸、１ｍＭＥＤＴＡ）２μｍ、蒸留水１１．４
μｍ、（γ３２Ｐ）ＡＴＰ５μｌ （２Ｍｍｏ Ｉ ｅ
ｓ／ｕ り、バクテリオファージＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼ８ｕｎｉｔを加えた後、３７℃で４５分間反応
した。
次に反応液をＢ ｔｏ−ｇｅ Ｉ Ｐ２Ｏ（日本バイ
オ・ラッド ラボラトリーズ株式会社Ｕ）により精製し
、得られた精製品をプローブとして用いた。
オ・ラッド ラボラトリーズ株式会社Ｕ）により精製し
、得られた精製品をプローブとして用いた。
次に、前記（１）の方法で得られたＰＩＶ−４Ａｔ％染
細胞由来ＲＮＡ、ウィルス非感染細胞由来ＲＮＡｔｔ
０．３５Ｍｇずつナイロン膜にプロットした後、風乾、
ＵＶ照射し、前記（４）のブレハイブリダイゼーション
液中で４２℃で１２時間反応させた０次に沸騰水浴中で
２分装置いた後急冷処理を施した先のプローブを１００
万Ｃｊ／ｍｌとなるように加え、さらに４２℃で１８時
間反応させた０反応終了後、０．１％ＳＤＳを含む２０
倍希釈の５ＳＰＥ液中で４２℃で５分間、２回洗浄し、
次に０．１％ＳＤＳを含む２００倍希釈の５ＳＰＥ液中
で４２℃で１６分間、２回洗浄を行った。洗浄終了後、
膜を風乾し、Ｘ線フィルムを用いて、−８０℃１２時間
オートラジオグラフィーを行った。
細胞由来ＲＮＡ、ウィルス非感染細胞由来ＲＮＡｔｔ
０．３５Ｍｇずつナイロン膜にプロットした後、風乾、
ＵＶ照射し、前記（４）のブレハイブリダイゼーション
液中で４２℃で１２時間反応させた０次に沸騰水浴中で
２分装置いた後急冷処理を施した先のプローブを１００
万Ｃｊ／ｍｌとなるように加え、さらに４２℃で１８時
間反応させた０反応終了後、０．１％ＳＤＳを含む２０
倍希釈の５ＳＰＥ液中で４２℃で５分間、２回洗浄し、
次に０．１％ＳＤＳを含む２００倍希釈の５ＳＰＥ液中
で４２℃で１６分間、２回洗浄を行った。洗浄終了後、
膜を風乾し、Ｘ線フィルムを用いて、−８０℃１２時間
オートラジオグラフィーを行った。
その結果、ＰＩＶ−４Ａ感染細胞由来ＲＮＡをプロット
した部分には、試料中のＰ Ｉ Ｖ−４ＡウイルスＲＮ
Ａとハイブリッドを形成した同プローブにより生しる陽
性シグナルが認められ、ＰＩＶ−４Ａに感染しているこ
とが確認された。これに対して、ウィルス非感染細胞由
来ＲＮＡをプロットした部分には反応が全く認められな
かった。
した部分には、試料中のＰ Ｉ Ｖ−４ＡウイルスＲＮ
Ａとハイブリッドを形成した同プローブにより生しる陽
性シグナルが認められ、ＰＩＶ−４Ａに感染しているこ
とが確認された。これに対して、ウィルス非感染細胞由
来ＲＮＡをプロットした部分には反応が全く認められな
かった。
（７−３） 前記［式コの１番から７２８番で表され
るインサートＤＮＡの一部断片を用いる場合；前記（５
）のｐ４ＡＰクローンを、Ｅｃ ｏＴ２２ｒ及びＥｃｏ
ＲＩ で切断後、低融点アガロースを用いた電気泳動
により約７００塩基対の位置に泳動されるバンドを切り
出し、ＤＮＡ断片を抽出した後、エタノール沈澱により
回収し、得られたＤＮＡ断片は、ランダムプライムラベ
リングによりプローブとした。
るインサートＤＮＡの一部断片を用いる場合；前記（５
）のｐ４ＡＰクローンを、Ｅｃ ｏＴ２２ｒ及びＥｃｏ
ＲＩ で切断後、低融点アガロースを用いた電気泳動
により約７００塩基対の位置に泳動されるバンドを切り
出し、ＤＮＡ断片を抽出した後、エタノール沈澱により
回収し、得られたＤＮＡ断片は、ランダムプライムラベ
リングによりプローブとした。
すなはち、ＤＮＡ断片０．１Ｍｇに蒸留水１０μｍを加
え沸騰水中で２分子ｒ装置き急冷し、次に生血溝アルブ
ミン１ ｕ ｌ （１０ｍｇ／ｍ １ ）、ランダム液
（０，４４Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ６，６，１１０ｍＭ
Ｔ ｒ ｉ ｓ−塩酸ｐＨ８，１１ｍＭＭｇＣｌ２．
２２ｍＭ２−メルカプトエタノール、４４ＭＭ ｄＡ
ＴＰ、４４ＭＭ ｄＧＴＰｌ ４４ＭＭｄ ＴＴＰ、
０．１２ｍＭ Ｔ ｒ ｉ ｓ−塩酸ｐＨ７゜５．
０．１２ｍＭ ＥＤＴＡ、 １１ ｕ ｎ ｉ ｔ
ｓ／ｍ１オリゴヌクレオチドｐｄ（Ｎ）ｓ（ファルマシ
ア株式会社１１））１１．４μｌ、 （α３２Ｐ）ｄＣ
ＴＰ６μｌ （１００μＣｉ／６００ｐＭ）、フレノウ
２．５ｕｎｉｔｓを加え室温で６時間反応させ、得ら
れた反応液をＢｉｏ−ｇｅｌ Ｐ２Ｏにより精製しプ
ローブとした。
え沸騰水中で２分子ｒ装置き急冷し、次に生血溝アルブ
ミン１ ｕ ｌ （１０ｍｇ／ｍ １ ）、ランダム液
（０，４４Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ６，６，１１０ｍＭ
Ｔ ｒ ｉ ｓ−塩酸ｐＨ８，１１ｍＭＭｇＣｌ２．
２２ｍＭ２−メルカプトエタノール、４４ＭＭ ｄＡ
ＴＰ、４４ＭＭ ｄＧＴＰｌ ４４ＭＭｄ ＴＴＰ、
０．１２ｍＭ Ｔ ｒ ｉ ｓ−塩酸ｐＨ７゜５．
０．１２ｍＭ ＥＤＴＡ、 １１ ｕ ｎ ｉ ｔ
ｓ／ｍ１オリゴヌクレオチドｐｄ（Ｎ）ｓ（ファルマシ
ア株式会社１１））１１．４μｌ、 （α３２Ｐ）ｄＣ
ＴＰ６μｌ （１００μＣｉ／６００ｐＭ）、フレノウ
２．５ｕｎｉｔｓを加え室温で６時間反応させ、得ら
れた反応液をＢｉｏ−ｇｅｌ Ｐ２Ｏにより精製しプ
ローブとした。
次に、前記（１）の方法で得られたＰ Ｉ Ｖ−４Ａ感
染細胞由来ＲＮＡ、ウィルス非感染細胞由来ＲＮＡを
０．３５Ｍｇずつナイロン膜にプロットした後、風乾、
ＵＶ＝射、及び、以降の処理は前記（７−２）と全く同
様にしてオートラジオグラフィーを行った。
染細胞由来ＲＮＡ、ウィルス非感染細胞由来ＲＮＡを
０．３５Ｍｇずつナイロン膜にプロットした後、風乾、
ＵＶ＝射、及び、以降の処理は前記（７−２）と全く同
様にしてオートラジオグラフィーを行った。
その結果、Ｐ Ｉ Ｖ−４Ａ感染細胞由来ＲＮＡをプロ
ットした部分には、試料中のＰＩＶ−４ＡウイルスＲＮ
Ａとハイブリッドを形成した同プローブにより生じる陽
性シグナルが認められ、ＰＩＶ−４Ａに感染しているこ
とが確認された。これに対して、ウィルス非感染細胞由
来ＲＮＡをプロットした部分には反応が全く認められな
かった。
ットした部分には、試料中のＰＩＶ−４ＡウイルスＲＮ
Ａとハイブリッドを形成した同プローブにより生じる陽
性シグナルが認められ、ＰＩＶ−４Ａに感染しているこ
とが確認された。これに対して、ウィルス非感染細胞由
来ＲＮＡをプロットした部分には反応が全く認められな
かった。
（７−４） 前記［式］の９６番から１１４で表され
る塩基配列に基ずいて合成されたオリゴヌクレオチドを
用いる場合； ＤＮＡ合成機（ＤＮＡシンセサイザー モデル３８１
Ａ； アプライドバイオシステムズジヤパン株式会社製
）を用い合成したオリゴヌクレオチド （５’−ＡＴ
ＴＧＡＧＡＣＴＧＧＣＡＡＴＣＴＣＡ−３’）を、オリ
ゴヌクレオチド精製カートリッジ（アプライドバイオシ
ステムズジャパン株式会社製）を用いて精製し、得られ
た合成オリゴヌクレオチド１ ｕ ｌ （１０ｐｍｏ
１ ｅ ｓ／ｕ ｌ）当り、前記（７−２）の緩衝液２
μｌ、蒸留水１１゜４ｕｌ、（ｒ３２Ｐ）ＡＴＰ ５
μｌ （２ｎｍｏ ｌｅＳ／μｌ）、バクテリオファー
ジ Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ８ｕｎｉｔを加えた
後、３７℃で４５分間反応し、次いで反応液をＢｉｏ−
ｇｅｌ Ｐ２Ｏにより精製し、得られた精製品をプロ
ーブとして用いた。
る塩基配列に基ずいて合成されたオリゴヌクレオチドを
用いる場合； ＤＮＡ合成機（ＤＮＡシンセサイザー モデル３８１
Ａ； アプライドバイオシステムズジヤパン株式会社製
）を用い合成したオリゴヌクレオチド （５’−ＡＴ
ＴＧＡＧＡＣＴＧＧＣＡＡＴＣＴＣＡ−３’）を、オリ
ゴヌクレオチド精製カートリッジ（アプライドバイオシ
ステムズジャパン株式会社製）を用いて精製し、得られ
た合成オリゴヌクレオチド１ ｕ ｌ （１０ｐｍｏ
１ ｅ ｓ／ｕ ｌ）当り、前記（７−２）の緩衝液２
μｌ、蒸留水１１゜４ｕｌ、（ｒ３２Ｐ）ＡＴＰ ５
μｌ （２ｎｍｏ ｌｅＳ／μｌ）、バクテリオファー
ジ Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ８ｕｎｉｔを加えた
後、３７℃で４５分間反応し、次いで反応液をＢｉｏ−
ｇｅｌ Ｐ２Ｏにより精製し、得られた精製品をプロ
ーブとして用いた。
次に、前記（１）の方法で得られたＰ Ｉ Ｖ−４Ａ感
染細胞由来ＲＮＡ、ウィルス非感染細胞由来ＲＮＡを
０．３６Ｍｇずつナイロン膜にプロットした後、風乾、
ＵＶ照射、及び、以降の処理は前記（７−２）と全く同
様にしてオートラジオグラフィーを行った。
染細胞由来ＲＮＡ、ウィルス非感染細胞由来ＲＮＡを
０．３６Ｍｇずつナイロン膜にプロットした後、風乾、
ＵＶ照射、及び、以降の処理は前記（７−２）と全く同
様にしてオートラジオグラフィーを行った。
その結果、Ｐ Ｉ Ｖ−４Ａ感染細胞由来ＲＮＡをプロ
ットした部分には、試料中のＰＩＶ−４ＡウイルスＲＮ
Ａとハイブリッドを形成した同プローブにより生しる陽
性シグナルが認められ、ＰＩＶ−４Ａに感染しているこ
とが確認された。これに対して、ウィルス非感染細胞由
来ＲＮＡをプロットした部分には反応が全く認められな
かった。
ットした部分には、試料中のＰＩＶ−４ＡウイルスＲＮ
Ａとハイブリッドを形成した同プローブにより生しる陽
性シグナルが認められ、ＰＩＶ−４Ａに感染しているこ
とが確認された。これに対して、ウィルス非感染細胞由
来ＲＮＡをプロットした部分には反応が全く認められな
かった。
１）４ＡＰクローンのインサートＤＮＡ中の開始コドン
（ＡＴＧ；前記［式］の５７〜５９番）が、発現ベクタ
ーＰＫＫ ２２３−３ （ファルマシア株式会社１１
）のりボゾーム結合部位から数えてｌＯから１５塩基対
の位置にくるようにする。
（ＡＴＧ；前記［式］の５７〜５９番）が、発現ベクタ
ーＰＫＫ ２２３−３ （ファルマシア株式会社１１
）のりボゾーム結合部位から数えてｌＯから１５塩基対
の位置にくるようにする。
すなわち、前記［式コで示される塩基配列の１番目から
５６番目までを除去したデレージョンインサートＤＮＡ
を作製し、ｐＫＫ ２２３−３ベクターのＳｍａ１部
位に導入し、得られたクローンをＥ、ｃｏｌｉ ＪＭ
１０９に導入し、アンピシリンを１００μｇ／ｍｌ含む
ＹＴ培養液（バクトドリブトン１６ｇ、イーストイクス
トラクト１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇを蒸留水に溶かし
１１とする）中で３７℃で１２時時間上う培養し、次い
でイソプロピルチオガラクトシドを２ｍＭとなるように
加え、３７℃で５時間さらに振どう培養を行い、培養終
了後の培養液を１０００Ｏｒ ｐｍ、１０分間、１５℃
で遠心し、その沈澱物を得た。
５６番目までを除去したデレージョンインサートＤＮＡ
を作製し、ｐＫＫ ２２３−３ベクターのＳｍａ１部
位に導入し、得られたクローンをＥ、ｃｏｌｉ ＪＭ
１０９に導入し、アンピシリンを１００μｇ／ｍｌ含む
ＹＴ培養液（バクトドリブトン１６ｇ、イーストイクス
トラクト１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇを蒸留水に溶かし
１１とする）中で３７℃で１２時時間上う培養し、次い
でイソプロピルチオガラクトシドを２ｍＭとなるように
加え、３７℃で５時間さらに振どう培養を行い、培養終
了後の培養液を１０００Ｏｒ ｐｍ、１０分間、１５℃
で遠心し、その沈澱物を得た。
次に、沈澱物を３０ｍＭ 塩化ナトリウムを含む３０
ｍＭ Ｔ ｒ ｉ ｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）で洗
浄した後、前記緩衝液に懸濁し、懸濁液 １ ｍ １当
り、リゾチーム１ ｍ ｇ及び０．２５Ｍ ＥＤＴＡ２
５μｌを加えて１６分間室温に放置した後、凍結融解を
４回行い、次にこの融解液を１０００Ｏｒｐｍ、６０分
ｍ５４℃で遠心し、その上澄みを得、得られた上澄み液
中に含まれる蛋白を同定したところ、■蛋白及びＰ蛋白
のＮ末端側が含まれていることが確認された。
ｍＭ Ｔ ｒ ｉ ｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）で洗
浄した後、前記緩衝液に懸濁し、懸濁液 １ ｍ １当
り、リゾチーム１ ｍ ｇ及び０．２５Ｍ ＥＤＴＡ２
５μｌを加えて１６分間室温に放置した後、凍結融解を
４回行い、次にこの融解液を１０００Ｏｒｐｍ、６０分
ｍ５４℃で遠心し、その上澄みを得、得られた上澄み液
中に含まれる蛋白を同定したところ、■蛋白及びＰ蛋白
のＮ末端側が含まれていることが確認された。
本発明によって提供される、前記［式］で表される遺伝
子は、Ｐ Ｉ Ｖ−４Ａ−Ｐ蛋白の遺伝子ＲＮＡに特異
的に相補性を示すので、ＰＩＶ−４Ａ感染症の早期診断
のための検査薬として用いることができ、さらに、前記
［式］で表される遺伝子は、Ｐ Ｉ Ｖ−４Ａ−Ｖ蛋白
の全コード領域とＰ蛋白のＮ末端側及びＣ末端側をコー
ドする領域とを含むので、発現されたＶ蛋白及びＰ蛋白
のＮ末端側を抗体作成の際の抗原として、またワクチン
の原料として用いることが可能であるから、ＰＩＶ−４
Ａ感染症の検査及び治療の両方に、同時に応用できる点
できわめて有用性の高いものである。
子は、Ｐ Ｉ Ｖ−４Ａ−Ｐ蛋白の遺伝子ＲＮＡに特異
的に相補性を示すので、ＰＩＶ−４Ａ感染症の早期診断
のための検査薬として用いることができ、さらに、前記
［式］で表される遺伝子は、Ｐ Ｉ Ｖ−４Ａ−Ｖ蛋白
の全コード領域とＰ蛋白のＮ末端側及びＣ末端側をコー
ドする領域とを含むので、発現されたＶ蛋白及びＰ蛋白
のＮ末端側を抗体作成の際の抗原として、またワクチン
の原料として用いることが可能であるから、ＰＩＶ−４
Ａ感染症の検査及び治療の両方に、同時に応用できる点
できわめて有用性の高いものである。
第１図は、前記［式］で表されるＰ Ｉ Ｖ−４Ａ・Ｐ
蛋白遺伝子に相補性を示すＤＮＡ のｃＤＮＡ領域の制限酵素地図。 １および３・・・・・・ベクターＤＮＡ２す・Φ・φイ
ンサートＤＮＡ （ｐ４ＡＰ）
蛋白遺伝子に相補性を示すＤＮＡ のｃＤＮＡ領域の制限酵素地図。 １および３・・・・・・ベクターＤＮＡ２す・Φ・φイ
ンサートＤＮＡ （ｐ４ＡＰ）
Claims (2)
- （１）遺伝子を構成する塩基配列の全部または一部が、
下記［式］の全部または一部で表される単位であるヒト
パラインフルエンザ４Ａ型ウイルスホスフォプロテイン
遺伝子。 ［式］； 【遺伝子の配列があります。】 【遺伝子の配列があります。】 - （２）遺伝子を構成する塩基配列の全部または一部が、
下記［式］の全部または一部で表される単位であるヒト
パラインフルエンザ４Ａ型ウイルスホスフォプロテイン
遺伝子を含む物質。 ［式］； 【遺伝子の配列があります。】
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31793290A JPH0411889A (ja) | 1990-04-26 | 1990-11-26 | ヒトパラインフルエンザ４ａ型ウイルスホスフォプロテイン遺伝子及び該遺伝子を含む物質 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10889890 | 1990-04-26 | ||
| JP2-108898 | 1990-04-26 | ||
| JP31793290A JPH0411889A (ja) | 1990-04-26 | 1990-11-26 | ヒトパラインフルエンザ４ａ型ウイルスホスフォプロテイン遺伝子及び該遺伝子を含む物質 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0411889A true JPH0411889A (ja) | 1992-01-16 |
Family
ID=26448715
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31793290A Pending JPH0411889A (ja) | 1990-04-26 | 1990-11-26 | ヒトパラインフルエンザ４ａ型ウイルスホスフォプロテイン遺伝子及び該遺伝子を含む物質 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0411889A (ja) |
-
1990
- 1990-11-26 JP JP31793290A patent/JPH0411889A/ja active Pending
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