JPH0743375B2 - 生物学的液体中における遊離の活性化合物を測定するための方法およびテストキット - Google Patents
生物学的液体中における遊離の活性化合物を測定するための方法およびテストキットInfo
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- JPH0743375B2 JPH0743375B2 JP62193870A JP19387087A JPH0743375B2 JP H0743375 B2 JPH0743375 B2 JP H0743375B2 JP 62193870 A JP62193870 A JP 62193870A JP 19387087 A JP19387087 A JP 19387087A JP H0743375 B2 JPH0743375 B2 JP H0743375B2
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、タンパク質のような天然の結合剤の存在下に
生物学的液体中に存在し、遊離フラクションおよび結合
フラクションが相互に平衡状態にある活性化合物の遊離
フラクション濃度を測定するための方法およびテストキ
ツトに関する。
生物学的液体中に存在し、遊離フラクションおよび結合
フラクションが相互に平衡状態にある活性化合物の遊離
フラクション濃度を測定するための方法およびテストキ
ツトに関する。
大抵の生理学的に活性な化合物は血液のような生物学的
液体中において一部は遊離の形態でそして一部はグロブ
リンまたはアルブミンのようなタンパク質に結合して存
在することは知られている。その際、活性化合物の遊離
形態と結合された形態とは相互に平衡状態にある。
液体中において一部は遊離の形態でそして一部はグロブ
リンまたはアルブミンのようなタンパク質に結合して存
在することは知られている。その際、活性化合物の遊離
形態と結合された形態とは相互に平衡状態にある。
目下のところ、タンパク質に結合していない活性化合物
フラクシヨンのみが生理活性を示すと考えられている。
何故なら、タンパク質に結合することにより、その活性
化合物の活性にとつての前提条件であるその特異的な受
容体との反応能力が活性化合物から失われるからであ
る。ある種の医薬はそれらが血清中のアルブミンと結合
した場合はその活性を失うが、一方それらをアルブミン
結合から脱離される物質を添加することによりそれらの
活性が高められることもすでに示すことができた。それ
ゆえタンパク質に結合していない活性化合物フラクシヨ
ンのみを測定できる多数の診断法がすでに開発されてい
る。
フラクシヨンのみが生理活性を示すと考えられている。
何故なら、タンパク質に結合することにより、その活性
化合物の活性にとつての前提条件であるその特異的な受
容体との反応能力が活性化合物から失われるからであ
る。ある種の医薬はそれらが血清中のアルブミンと結合
した場合はその活性を失うが、一方それらをアルブミン
結合から脱離される物質を添加することによりそれらの
活性が高められることもすでに示すことができた。それ
ゆえタンパク質に結合していない活性化合物フラクシヨ
ンのみを測定できる多数の診断法がすでに開発されてい
る。
すなわち、ヨーロツパ特許第26103号の記載から生物学
的液体中に存在する活性化合物の遊離フラクシヨン濃度
を測定する方法が知られている。その方法によれば、検
査すべき試料を活性化号物の標識された誘導体および活
性化合物にとつて特異的な結合剤と混合し、そしてこれ
ら試薬の反応後特異的な結合剤に結合するかまたは結合
しなかつた活性化合物の標識された誘導体の量を測定し
ている。これから生物学的液体中における遊離の活性化
合物濃度が計算されうる。しかしながら実際上特異的な
結合剤とのみ結合するが、生物学的液体中に存在する天
然の結合タンパク質とは結合しない標識された活性化合
物誘導体を選択した場合にのみこの方法で信頼しうる測
定結果が得られうる。しかし実施にあたり多くの場合に
この要件が満たされ得ない。
的液体中に存在する活性化合物の遊離フラクシヨン濃度
を測定する方法が知られている。その方法によれば、検
査すべき試料を活性化号物の標識された誘導体および活
性化合物にとつて特異的な結合剤と混合し、そしてこれ
ら試薬の反応後特異的な結合剤に結合するかまたは結合
しなかつた活性化合物の標識された誘導体の量を測定し
ている。これから生物学的液体中における遊離の活性化
合物濃度が計算されうる。しかしながら実際上特異的な
結合剤とのみ結合するが、生物学的液体中に存在する天
然の結合タンパク質とは結合しない標識された活性化合
物誘導体を選択した場合にのみこの方法で信頼しうる測
定結果が得られうる。しかし実施にあたり多くの場合に
この要件が満たされ得ない。
それゆえヨーロツパ特許出願第155,104号には、検査す
べき生物学的液体の試料に活性化合物の標識された誘導
体および特異的な結合剤の他に、タンパク質の結合部位
を占拠することにより活性化合物の標識された誘導体が
天然のタンパク質に結合するのを遮断することが意図さ
れるもう一つの物質を添加することもすでに提案されて
いる。この方法は西ドイツ特許第3,415,818号にも記載
されている。
べき生物学的液体の試料に活性化合物の標識された誘導
体および特異的な結合剤の他に、タンパク質の結合部位
を占拠することにより活性化合物の標識された誘導体が
天然のタンパク質に結合するのを遮断することが意図さ
れるもう一つの物質を添加することもすでに提案されて
いる。この方法は西ドイツ特許第3,415,818号にも記載
されている。
国際特許出願WO 85/00226号も標識された活性化合物誘
導体が天然のタンパク質に結合しそれにより惹起される
過誤を測定する問題を解決することを試みている。そこ
では、遊離の活性化合物を含有する生物学的液体に遊離
の活性化合物にとつて特異的な結合剤、標識された活性
化合物誘導体およびその他にさらにこの標識された活性
化合物誘導体にとつて特異的な結合剤を添加することが
提案されている。標識された活性化合物誘導体（トレー
サー）は次に活性化合物自体に対する特異的な結合剤と
のみならず活性化合物誘導体に対する結合剤とを反応す
るが、結合タンパク質とは反応しない、何故ならこのも
のはトレーサーに対し、トレーサーに対する特異的な結
合剤よりもはるかに低い親和性しか有していないからで
ある。
導体が天然のタンパク質に結合しそれにより惹起される
過誤を測定する問題を解決することを試みている。そこ
では、遊離の活性化合物を含有する生物学的液体に遊離
の活性化合物にとつて特異的な結合剤、標識された活性
化合物誘導体およびその他にさらにこの標識された活性
化合物誘導体にとつて特異的な結合剤を添加することが
提案されている。標識された活性化合物誘導体（トレー
サー）は次に活性化合物自体に対する特異的な結合剤と
のみならず活性化合物誘導体に対する結合剤とを反応す
るが、結合タンパク質とは反応しない、何故ならこのも
のはトレーサーに対し、トレーサーに対する特異的な結
合剤よりもはるかに低い親和性しか有していないからで
ある。
前記した刊行物には、天然のタンパク質へのトレーサー
の望ましからぬ結合は生物学的液体中における活性化合
物の遊離フラクションの測定において測定精度の重大な
妨害を招来すること、およびこの問題をできるだけ簡単
な方法で解決する必要が存在することが示されている。
それゆえ本発明は天然のタンパク質の結合部位を遮断す
る薬剤を付加的に使用することなくそしてまたトレーサ
ーに対する特異的な結合剤も添加することなくこの問題
を解決することを目的とする。
の望ましからぬ結合は生物学的液体中における活性化合
物の遊離フラクションの測定において測定精度の重大な
妨害を招来すること、およびこの問題をできるだけ簡単
な方法で解決する必要が存在することが示されている。
それゆえ本発明は天然のタンパク質の結合部位を遮断す
る薬剤を付加的に使用することなくそしてまたトレーサ
ーに対する特異的な結合剤も添加することなくこの問題
を解決することを目的とする。
今、 ａ） 液体試料を未標識抗体と接触させ、 ｂ） その試料を未標識抗体から分離し、 ｃ） 未標識抗体を、標識された物質（トレーサー）と
インキユベーシヨンしてその抗体と交叉反応させ、そし
て ｄ） 抗体に結合するかまたは結合しなかったトレーサ
ーの量を測定して、その値から活性化合物の遊離フラク
シヨン濃度を計算する、 ことにより天然の結合剤の存在下に生物学的液体中に存
在し、遊離フラクシヨンと結合フラクシヨンが相互に平
衡状態にある活性化合物の遊離フラクシヨン濃度を測定
するにあたり、 もし未標識抗体の量および／または活性化合物に対する
その親和性が活性化合物の遊離フラクシヨンと結合フラ
クシヨンとの間の平衡に実質的に影響しない程度に小さ
くかつトレーサーの抗体に対する親和性が活性化合物そ
れ自体の親和性より相当に高いかまたは相当に低いなら
ば精密な測定が行われうることが見出された。
インキユベーシヨンしてその抗体と交叉反応させ、そし
て ｄ） 抗体に結合するかまたは結合しなかったトレーサ
ーの量を測定して、その値から活性化合物の遊離フラク
シヨン濃度を計算する、 ことにより天然の結合剤の存在下に生物学的液体中に存
在し、遊離フラクシヨンと結合フラクシヨンが相互に平
衡状態にある活性化合物の遊離フラクシヨン濃度を測定
するにあたり、 もし未標識抗体の量および／または活性化合物に対する
その親和性が活性化合物の遊離フラクシヨンと結合フラ
クシヨンとの間の平衡に実質的に影響しない程度に小さ
くかつトレーサーの抗体に対する親和性が活性化合物そ
れ自体の親和性より相当に高いかまたは相当に低いなら
ば精密な測定が行われうることが見出された。
この方法は生物学的液体中におけるチロキシン、トリヨ
ードチロニンおよびステロイドホルモンの遊離フラクシ
ヨンの測定に特に適する。
ードチロニンおよびステロイドホルモンの遊離フラクシ
ヨンの測定に特に適する。
本発明による方法は、検査すべき生物学的液体の試料を
未標識抗体との反応後に分離する点でまず第１に前記刊
行物に記載の測定法とは相異する。このようにして、妨
害性の天然の結合タンパク質が除去されて、それ以後の
測定経過を最早を妨げることはなくまた何ら測定過誤を
惹起することもない。
未標識抗体との反応後に分離する点でまず第１に前記刊
行物に記載の測定法とは相異する。このようにして、妨
害性の天然の結合タンパク質が除去されて、それ以後の
測定経過を最早を妨げることはなくまた何ら測定過誤を
惹起することもない。
かかる二段階法は西ドイツ特許公開公報第2,936,307号
公報から知られている。そこには同様に、検査すべき液
体試料を未標識受容体と接触させてそれに遊離の活性化
合物を結合させることによる活性化合物の遊離フラクシ
ヨンの測定法が記載されている。次に液体試料を除去し
そして未標識受容体を標識された活性化合物誘導体とイ
ンキュベーシヨンし、次に受容体に結合するかまたは結
合しなかつた標識試薬量を測定する。しかしながら、こ
の方法は第一段階で大量の未標識受容体が使用されるの
で、事実上すべての遊離の活性化合物が結合されるとい
う大きな欠点を有する。しかし遊離の活性化合物および
タンパク質に結合した活性化合物は相互に平衡状態にあ
るので、遊離の活性化合物が受容体に結合することによ
りその平衡が乱されそして活性化合物がタンパク質に結
合した形態から慣例により遊離される。その結果、この
方法により測定される遊離の活性化合物濃度が過度に高
くなる。
公報から知られている。そこには同様に、検査すべき液
体試料を未標識受容体と接触させてそれに遊離の活性化
合物を結合させることによる活性化合物の遊離フラクシ
ヨンの測定法が記載されている。次に液体試料を除去し
そして未標識受容体を標識された活性化合物誘導体とイ
ンキュベーシヨンし、次に受容体に結合するかまたは結
合しなかつた標識試薬量を測定する。しかしながら、こ
の方法は第一段階で大量の未標識受容体が使用されるの
で、事実上すべての遊離の活性化合物が結合されるとい
う大きな欠点を有する。しかし遊離の活性化合物および
タンパク質に結合した活性化合物は相互に平衡状態にあ
るので、遊離の活性化合物が受容体に結合することによ
りその平衡が乱されそして活性化合物がタンパク質に結
合した形態から慣例により遊離される。その結果、この
方法により測定される遊離の活性化合物濃度が過度に高
くなる。
それゆえ、未標識抗体が少量しか使用されず従つてそれ
が遊離の活性化合物とタンパク質に結合した活性化合物
との間の平衡に顕著には影響し得ないことが本発明の特
徴である。同じ理由で活性化合物に対する未標識抗体の
親和性はほんの少しであればよい。遊離の活性化合物す
べてが未標識抗体に結合する必要も、未標識抗体のすべ
ての遊離の結合部位が占拠される必要もない。
が遊離の活性化合物とタンパク質に結合した活性化合物
との間の平衡に顕著には影響し得ないことが本発明の特
徴である。同じ理由で活性化合物に対する未標識抗体の
親和性はほんの少しであればよい。遊離の活性化合物す
べてが未標識抗体に結合する必要も、未標識抗体のすべ
ての遊離の結合部位が占拠される必要もない。
この測定法に適当な未標識抗体は好都合にはポリクロー
ナル抗体およびモノクローナル抗体からなる群から選択
され、そして活性化合物に対するその親和性は少数のル
ーチン予備試験により測定される。検査すべき液体試料
を未標識抗体から分離したのち、この抗体と交叉結合す
る標識された物質（トレーサー）とインキユベーシヨン
する。トレーサーは放射性原子例えばＩ−125を用いて
または蛍光性または化学ルミネセンス化合物を用いて標
識される。酵素または光発色団を用いる標識化も可能で
ある。
ナル抗体およびモノクローナル抗体からなる群から選択
され、そして活性化合物に対するその親和性は少数のル
ーチン予備試験により測定される。検査すべき液体試料
を未標識抗体から分離したのち、この抗体と交叉結合す
る標識された物質（トレーサー）とインキユベーシヨン
する。トレーサーは放射性原子例えばＩ−125を用いて
または蛍光性または化学ルミネセンス化合物を用いて標
識される。酵素または光発色団を用いる標識化も可能で
ある。
トレーサーが測定すべき活性化合物とは異なる分子構造
を有することが重要である。もし、例えば本発明方法に
従いチロキシンを測定するのにトレーサーとしてＩ−12
5で標識されたチロキシンを用いる場合は、第１図に示
される非常に平坦な標準曲線が得られ、このものからは
明白な測定結果を読みとることができないであろう。こ
の曲線は漸増量の遊離チロキシンを含有する血清試料を
チロキシン抗体と１時間インキユベーシヨンし、血清試
料を分離しそしてトレーサーとしてＩ−125−チロキシ
ンの存在下に１時間第２回目のインキユベーシヨンを行
うことにより得られる測定値を示す。
を有することが重要である。もし、例えば本発明方法に
従いチロキシンを測定するのにトレーサーとしてＩ−12
5で標識されたチロキシンを用いる場合は、第１図に示
される非常に平坦な標準曲線が得られ、このものからは
明白な測定結果を読みとることができないであろう。こ
の曲線は漸増量の遊離チロキシンを含有する血清試料を
チロキシン抗体と１時間インキユベーシヨンし、血清試
料を分離しそしてトレーサーとしてＩ−125−チロキシ
ンの存在下に１時間第２回目のインキユベーシヨンを行
うことにより得られる測定値を示す。
第２図に示されるように、標準曲線のこの不満足な形状
は同じ測定条件の下に試料量を変えることによつては改
良できない。50μ,100μおよび200μを用いて得
られる標準曲線は測定にとつて重要な範囲において不当
な平坦な計上しか示さない。
は同じ測定条件の下に試料量を変えることによつては改
良できない。50μ,100μおよび200μを用いて得
られる標準曲線は測定にとつて重要な範囲において不当
な平坦な計上しか示さない。
第２図に示される測定においては20nの抗体量が小試
験管の内部表面に適用されたが、第３図は１試験当り抗
体量を80nに高めて同じ試験を行つたものを示す。こ
れも測定上重要な範囲において傾斜のある形状をした曲
線が生成されない。
験管の内部表面に適用されたが、第３図は１試験当り抗
体量を80nに高めて同じ試験を行つたものを示す。こ
れも測定上重要な範囲において傾斜のある形状をした曲
線が生成されない。
第４図は異なる放射能を有するトレーサーを使用して第
１図に示される測定を反復した場合に得られる測定曲線
を示す。トレーサー活性は0.04μCiおよび0.02μCiであ
つた。この場合もより意味のある標準曲線は得られなか
つた。
１図に示される測定を反復した場合に得られる測定曲線
を示す。トレーサー活性は0.04μCiおよび0.02μCiであ
つた。この場合もより意味のある標準曲線は得られなか
つた。
しかしながらもし本発明によるチロキシンの測定法にお
いて分子のアミノ基が、カルボキシル基か、または他の
部位で修飾されたチロキシン誘導体を使用するならば第
５〜８図に示されるように、抗体に結合した各トレーサ
ー量に対し特定のチロキシン濃度が明瞭に割当てられう
る標準曲線が得られる。本発明による方法に使用されう
る、チロキシンおよびトリヨードチロニン測定用の適当
なトレーサーは西ドイツ特許出願P3600365.4号に記載さ
れている。
いて分子のアミノ基が、カルボキシル基か、または他の
部位で修飾されたチロキシン誘導体を使用するならば第
５〜８図に示されるように、抗体に結合した各トレーサ
ー量に対し特定のチロキシン濃度が明瞭に割当てられう
る標準曲線が得られる。本発明による方法に使用されう
る、チロキシンおよびトリヨードチロニン測定用の適当
なトレーサーは西ドイツ特許出願P3600365.4号に記載さ
れている。
トレーサーは化学構造が変化されているので抗体に対す
るその親和性は活性化合物それ自体の親和性よりも高い
かまたは低い。一般に、抗体に対し活性化合物それ自体
より大きい親和性を有するトレーサーを選択するのが好
都合である。しかしながらもし測定すべき遊離の活性化
合物の濃度が非常に低い場合は、抗体に対する親和性が
活性化合物のそれよりかなり少ないトレーサーを選択す
るのが好ましい。というのは活性化合物が非常に低濃度
でしか存在しない場合は抗体の結合部位が少ししか占拠
されず、これは次に親和性の高いトレーサーが添加され
るとほとんど識別できない。従つてこれは遊離の活性化
合物が何ら存在しないかの如き印象を与える。これに対
し親和性の低いトレーサーを用いる場合は満足できる測
定結果が常に得られる。
るその親和性は活性化合物それ自体の親和性よりも高い
かまたは低い。一般に、抗体に対し活性化合物それ自体
より大きい親和性を有するトレーサーを選択するのが好
都合である。しかしながらもし測定すべき遊離の活性化
合物の濃度が非常に低い場合は、抗体に対する親和性が
活性化合物のそれよりかなり少ないトレーサーを選択す
るのが好ましい。というのは活性化合物が非常に低濃度
でしか存在しない場合は抗体の結合部位が少ししか占拠
されず、これは次に親和性の高いトレーサーが添加され
るとほとんど識別できない。従つてこれは遊離の活性化
合物が何ら存在しないかの如き印象を与える。これに対
し親和性の低いトレーサーを用いる場合は満足できる測
定結果が常に得られる。
原則的には抗体に対し測定すべき活性化合物のそれとは
異なる親和性を有するが、交叉反応において抗体の遊離
の結合部位に対し活性化合物と競合するすべての物質が
トレーサーとして用いられうる。それゆえに本発明によ
る方法に用いられる抗体に結合する抗イデイオタイプ抗
体も抗体として使用されうる。この原理に基づく検定法
はヨーロツパ特許出願第106,615号に記載されている。
異なる親和性を有するが、交叉反応において抗体の遊離
の結合部位に対し活性化合物と競合するすべての物質が
トレーサーとして用いられうる。それゆえに本発明によ
る方法に用いられる抗体に結合する抗イデイオタイプ抗
体も抗体として使用されうる。この原理に基づく検定法
はヨーロツパ特許出願第106,615号に記載されている。
本発明による二段階方法では、測定すべき活性化合物の
抗体に対する親和性とトレーサーの抗体に対する親和性
とが相異することが明白な特徴である。これに対し、例
えばローロツパ特許第26103号から知られるように、一
段階測定法では測定すべき活性化合物とトレーサーとの
結合タンパク質に対する親和性が相異することが明らか
な特徴である。
抗体に対する親和性とトレーサーの抗体に対する親和性
とが相異することが明白な特徴である。これに対し、例
えばローロツパ特許第26103号から知られるように、一
段階測定法では測定すべき活性化合物とトレーサーとの
結合タンパク質に対する親和性が相異することが明らか
な特徴である。
従つて、天然の結合タンパク質が存在するゆえに生物学
的液体中における活性化合物の遊離フラクシヨンのすべ
ての一段階測定法において固有の過誤の可能性が回避さ
れうる測定法が得られる。それゆえこの方法は非常に正
確な測定値が得られかつ２種の試薬しか必要としないこ
とを特徴とする。
的液体中における活性化合物の遊離フラクシヨンのすべ
ての一段階測定法において固有の過誤の可能性が回避さ
れうる測定法が得られる。それゆえこの方法は非常に正
確な測定値が得られかつ２種の試薬しか必要としないこ
とを特徴とする。
本発明による測定法を実施するのに適したテストキツト
は、 測定すべき活性化合物と反応する未標識抗体であつて、
その未標識抗体の量および／または活性化合物に対する
その親和性が非常に小さいので、それが活性化合物の遊
離フラクシヨンと結合フラクシヨンとの間の平衡に実質
的に影響しない未標識抗体，およびその他に 抗体に対し活性化合物自体の親和性より相当に高いかま
たは低い親和性を有するトレーサーを含有する。かかる
テストキツトは、任意の所望のホルモン、ステロイド、
医薬、医薬代謝産物、ポリペプチド、ビタミン、腫瘍抗
原、毒素またはアルカロイドの遊離フラクシヨンの測定
ができるように組み立てられうる。チロキシン、トリヨ
ードチロニンおよびステロイドホルモンの遊離フラクシ
ヨンの測定が特に好ましい。
は、 測定すべき活性化合物と反応する未標識抗体であつて、
その未標識抗体の量および／または活性化合物に対する
その親和性が非常に小さいので、それが活性化合物の遊
離フラクシヨンと結合フラクシヨンとの間の平衡に実質
的に影響しない未標識抗体，およびその他に 抗体に対し活性化合物自体の親和性より相当に高いかま
たは低い親和性を有するトレーサーを含有する。かかる
テストキツトは、任意の所望のホルモン、ステロイド、
医薬、医薬代謝産物、ポリペプチド、ビタミン、腫瘍抗
原、毒素またはアルカロイドの遊離フラクシヨンの測定
ができるように組み立てられうる。チロキシン、トリヨ
ードチロニンおよびステロイドホルモンの遊離フラクシ
ヨンの測定が特に好ましい。
本発明方法による生物学的液体中のチロキシンの定量的
検出には以下のものがトレーサー化合物として特に適当
であることが判つた。
検出には以下のものがトレーサー化合物として特に適当
であることが判つた。
（１） 3,3′5,5′−テトラヨードチロ酢酸（第５
図）、 （２） 3,5−ジヨード−４−（3,5−ジヨード−４−オ
キシソフエニル）−ベンゼンスルホン酸（第６図）、 （３） Ｎ−（メチルホスフイノアセチル）−3,3′,5,
5′−テトラヨードチロシン（第７図）および （４） Ｎ−（ε−アミノカプロイル）−3,3′5,5′−
テトラヨードチロシン（第８図）。
図）、 （２） 3,5−ジヨード−４−（3,5−ジヨード−４−オ
キシソフエニル）−ベンゼンスルホン酸（第６図）、 （３） Ｎ−（メチルホスフイノアセチル）−3,3′,5,
5′−テトラヨードチロシン（第７図）および （４） Ｎ−（ε−アミノカプロイル）−3,3′5,5′−
テトラヨードチロシン（第８図）。
本発明方法による遊離チロキシン測定のための一般的操
作法 Ｔ−４抗体で被覆した小試験管（試験管１個当り抗体20
ng）中で標準系列物（漸増量の遊離チロキシンを含有す
るヒト血清）200μと緩衝液1000μとの振盪下に30
分間接触させる。
作法 Ｔ−４抗体で被覆した小試験管（試験管１個当り抗体20
ng）中で標準系列物（漸増量の遊離チロキシンを含有す
るヒト血清）200μと緩衝液1000μとの振盪下に30
分間接触させる。
反応溶液を注ぎ出したのち、トレーサー（活性度、毎分
約60,000パルス）1000μを予備インキユベーシヨンし
た試験管に加える。この混合物を１時間インキユベーシ
ヨンし、結合しなかつたトレーサーを分離しそしてγ−
計数器で測定する。
約60,000パルス）1000μを予備インキユベーシヨンし
た試験管に加える。この混合物を１時間インキユベーシ
ヨンし、結合しなかつたトレーサーを分離しそしてγ−
計数器で測定する。
その結果を第５〜８図に示す。
第１図はＩ−125で標識されたチロキシンをトレーサー
として用いてチロキシンを測定した場合に得られる標準
曲線を示す。 第２図は試料量を変動させて第１図におけると同じ測定
をした場合の標準曲線を示す。 第２図に示される測定においては20nの抗体量が小試
験管の内部表面に適用されたが、第３図は１試験当り抗
体量を80nに高めて同じ試験を行つたものを示す。 第４図は異なる放射能を有するトレーサーを使用して第
１図に示される測定を行つた場合に得られる測定値を示
す。 ヒト血清中の種々の濃度の遊離チロキシンを測定する場
合に修飾されたチロキシン誘導体をトレーサーとして用
いて本発明方法により得られる曲線を第５〜８図に示
す。
として用いてチロキシンを測定した場合に得られる標準
曲線を示す。 第２図は試料量を変動させて第１図におけると同じ測定
をした場合の標準曲線を示す。 第２図に示される測定においては20nの抗体量が小試
験管の内部表面に適用されたが、第３図は１試験当り抗
体量を80nに高めて同じ試験を行つたものを示す。 第４図は異なる放射能を有するトレーサーを使用して第
１図に示される測定を行つた場合に得られる測定値を示
す。 ヒト血清中の種々の濃度の遊離チロキシンを測定する場
合に修飾されたチロキシン誘導体をトレーサーとして用
いて本発明方法により得られる曲線を第５〜８図に示
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ペーター・モルツ ドイツ連邦共和国デー−6500マインツ．カ イザー−ヴイルヘルム−リング44 (72)発明者 ゲルト・シユノル ドイツ連邦共和国デー−6208バートヴイル ベル．アウフデムラテイヒコプフ23 (72)発明者 ハンス−ユルゲン・スクルツイプツイーク ドイツ連邦共和国デー−6232バートゾーデ ン・アム・タウヌス．アム・シエルベルク 16 (72)発明者 ハンス・ヴイスマン ドイツ連邦共和国デー−6232バートゾーデ ン・アム・タウヌス．フアルケンシユトラ ーセ12 (56)参考文献 特開 昭55−39089（ＪＰ，Ａ) 特表 昭56−501583（ＪＰ，Ａ) 特表 昭60−501674（ＪＰ，Ａ)
Claims (7)
- 【請求項１】ａ） 液体試料を未標識抗体と接触させ、 ｂ） その試料を未標識抗体から分離し、 ｃ） 未標識抗体を、標識された物質（トレーサー）と
インキュベーションしてその抗体と交叉反応させ、そし
て ｄ） 抗体に結合するかまたは結合しなかったトレーサ
ーの量を測定して、その値から活性化合物の遊離フラク
ションの濃度を計算する ことからなる、天然の結合剤の存在下での、生物学的液
体中に存在する活性化合物の遊離フラクションの濃度の
測定法であって、活性化合物の遊離フラクションと結合
フラクションが相互に平衡状態にあり、そして未標識抗
体の量および／または活性化合物に対するその親和性が
活性化合物の遊離フラクションと結合フラクションとの
間の平衡に実質的に影響しない程度に小さく且つトレー
サーの抗体に対する親和性が活性化合物それ自体の親和
性より相当に高いかまたは相当に低いものであり、且つ
前記トレーサーは測定されるべき活性化合物の分子構造
とは異なりそして標識化によって形成されたものではな
い分子構造を有し、前記活性化合物がチロキシンまたは
トリヨードチロニンであり、前記トレーサーがチロキシ
ンまたはトリヨードチロニンのアラニンが結合した位置
が修飾されている誘導体であることを特徴とする方法。 - 【請求項２】前記トレーサーがチロキシンまたはトリヨ
ードチロニンのアミノ基またはカルボキシ基が修飾され
ている誘導体である特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項３】未標識抗体がポリクローナル抗体またはモ
ノクローナル抗体であることからなる特許請求の範囲第
１項記載の方法。 - 【請求項４】トレーサーが放射性原子、蛍光性または化
学ルミネセンス基、酵素または光発色団で標識されてい
ることからなる特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項５】トレーサーがＩ−125で標識されているこ
とからなる特許請求の範囲第４項記載の方法。 - 【請求項６】ａ） 測定すべき活性化合物と反応する未
標識抗体であって、その未標識抗体の量および／または
活性化合物に対するその親和性が非常に小さいので、そ
れが活性化合物の遊離フラクションと結合フラクション
との間の平衡に実質的に影響しない未標識抗体、および ｂ） 測定されるべき活性化合物の分子構造とは異なり
且つ標識化によって形成されたものではない分子構造を
有し、そして抗体に対して活性化合物自身の親和性より
相当に高いかまたは相当に低い親和性を有するトレーサ
ーであり、前記活性化合物がチロキシンまたはトリヨー
ドチロニンであり、前記トレーサーがチロキシンまたは
トリヨードチロニンのアラニンが結合した位置が修飾さ
れている誘導体であるトレーサー を含有することからなる、特許請求の範囲第１項記載の
生物学的液体中に存在する活性化合物の遊離フラクショ
ン濃度を測定するためのテストキット。 - 【請求項７】未標識抗体を小試験管の内部表面上に適用
することからなる特許請求の範囲第６項記載のテストキ
ット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19863626468 DE3626468A1 (de) | 1986-08-05 | 1986-08-05 | Verfahren und testkit zur bestimmung freier wirkstoffe in biologischen fluessigkeiten |
| DE3626468.7 | 1986-08-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6344168A JPS6344168A (ja) | 1988-02-25 |
| JPH0743375B2 true JPH0743375B2 (ja) | 1995-05-15 |
Family
ID=6306719
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62193870A Expired - Lifetime JPH0743375B2 (ja) | 1986-08-05 | 1987-08-04 | 生物学的液体中における遊離の活性化合物を測定するための方法およびテストキット |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5714336A (ja) |
| EP (1) | EP0257352B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0743375B2 (ja) |
| AT (1) | ATE77149T1 (ja) |
| CA (1) | CA1304680C (ja) |
| DE (2) | DE3626468A1 (ja) |
| DK (1) | DK172582B1 (ja) |
| ES (1) | ES2033266T3 (ja) |
| NO (1) | NO169979C (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3624464A1 (de) * | 1986-07-19 | 1988-01-28 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum nachweis eines analyten sowie hierfuer geeignetes mittel |
| ATE364689T1 (de) | 1999-11-18 | 2007-07-15 | Dendreon Corp | Nukleinsäuren, welche für endotheliasen kodieren, endotheliasen, sowie deren verwendung |
| US6638977B1 (en) * | 1999-11-19 | 2003-10-28 | Corvas International, Inc. | Plasminogen activator inhibitor antagonists |
| WO2001036351A2 (en) | 1999-11-19 | 2001-05-25 | Corvas International, Inc. | Plasminogen activator inhibitor antagonists related applications |
| US7700341B2 (en) | 2000-02-03 | 2010-04-20 | Dendreon Corporation | Nucleic acid molecules encoding transmembrane serine proteases, the encoded proteins and methods based thereon |
| AU2002305052A1 (en) | 2001-03-13 | 2002-09-24 | Corvas International, Inc. | Nucleic acid molecules encoding a transmembrane serine protease 7, the encoded polypeptides and methods based thereon |
| US7172892B2 (en) | 2001-03-22 | 2007-02-06 | Dendreon Corporation | Nucleic acid molecules encoding serine protease CVSP14, the encoded polypeptides and methods based thereon |
| EP1379637A4 (en) | 2001-03-27 | 2005-04-06 | Dendreon Corp | TRANSMEMBRANE SERINE PROTEASE 9 CODING NUCLEIC ACID MOLECULES, THE POLYPEPTIDE CODED, AND METHODS FORMING THEREOF |
| US7112430B2 (en) | 2001-05-14 | 2006-09-26 | Dendreon Corporation | Nucleic acid molecules encoding a transmembrane serine protease 10, the encoded polypeptides and methods based thereon |
| US7589029B2 (en) | 2002-05-02 | 2009-09-15 | Micron Technology, Inc. | Atomic layer deposition and conversion |
| US7160577B2 (en) * | 2002-05-02 | 2007-01-09 | Micron Technology, Inc. | Methods for atomic-layer deposition of aluminum oxides in integrated circuits |
| US7084078B2 (en) * | 2002-08-29 | 2006-08-01 | Micron Technology, Inc. | Atomic layer deposited lanthanide doped TiOx dielectric films |
| US7192892B2 (en) | 2003-03-04 | 2007-03-20 | Micron Technology, Inc. | Atomic layer deposited dielectric layers |
| US7588988B2 (en) | 2004-08-31 | 2009-09-15 | Micron Technology, Inc. | Method of forming apparatus having oxide films formed using atomic layer deposition |
| US7662729B2 (en) * | 2005-04-28 | 2010-02-16 | Micron Technology, Inc. | Atomic layer deposition of a ruthenium layer to a lanthanide oxide dielectric layer |
| US7572695B2 (en) * | 2005-05-27 | 2009-08-11 | Micron Technology, Inc. | Hafnium titanium oxide films |
| US7927948B2 (en) | 2005-07-20 | 2011-04-19 | Micron Technology, Inc. | Devices with nanocrystals and methods of formation |
| US7575978B2 (en) * | 2005-08-04 | 2009-08-18 | Micron Technology, Inc. | Method for making conductive nanoparticle charge storage element |
| US7410910B2 (en) | 2005-08-31 | 2008-08-12 | Micron Technology, Inc. | Lanthanum aluminum oxynitride dielectric films |
| US7763511B2 (en) * | 2006-12-29 | 2010-07-27 | Intel Corporation | Dielectric barrier for nanocrystals |
| US8367506B2 (en) | 2007-06-04 | 2013-02-05 | Micron Technology, Inc. | High-k dielectrics with gold nano-particles |
| DE102023108022A1 (de) | 2023-03-29 | 2024-10-02 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Neuer L-Thyroxin-Radioiodmarker und Verfahren zu seiner Herstellung |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3928553A (en) * | 1972-03-23 | 1975-12-23 | Univ New York | Radioimmunoassay method for triiodothyronine and thyroxine |
| US4292296A (en) * | 1978-09-12 | 1981-09-29 | Baxter Travenol Laboratories, Inc. | Diagnostic method |
| US4366143A (en) * | 1979-09-24 | 1982-12-28 | Amersham International Public Limited Company | Assay for the free portion of substances in biological fluids |
| JPS56501583A (ja) * | 1979-11-19 | 1981-10-29 | ||
| US4391795A (en) * | 1980-03-21 | 1983-07-05 | Becton Dickinson And Company | Assay for free thyroid hormone |
| US4426453A (en) * | 1980-09-18 | 1984-01-17 | Amersham International Limited | Derivatives of iodothyronine compounds and their use in an assay for the free iodothyronine compounds |
| DE3122019C2 (de) * | 1981-06-03 | 1983-11-10 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und Vorrichtung zur Durchführung eines automatisierten kontinuierlichen Enzymimmunotestes |
| US5304498A (en) * | 1982-03-19 | 1994-04-19 | Ekins Roger Philip | Method and composition for free ligand assay |
| EP0089806B1 (en) * | 1982-03-22 | 1989-06-28 | AMERSHAM INTERNATIONAL plc | Assay for the free portion of substances in biological fluids |
| DE3380777D1 (en) * | 1982-08-27 | 1989-11-30 | Roger Philip Ekins | Measurement of analyte concentration |
| ZA837119B (en) * | 1982-10-07 | 1984-12-24 | Amersham Int Plc | Assay for the free portion of substances in biological fluids |
| GB8317124D0 (en) * | 1983-06-23 | 1983-07-27 | Ekins R P | Free ligand assay |
| GB8404843D0 (en) * | 1984-02-24 | 1984-03-28 | Amersham Int Plc | Free analyte assay |
| US4711855A (en) * | 1985-02-05 | 1987-12-08 | Ciba Corning Diagnostics Corp. | Derivatives of 3,5,3-triiodothyronine |
| DE3600365A1 (de) * | 1986-01-09 | 1987-07-16 | Hoechst Ag | Neue thyroninderivate |
| GB8800419D0 (en) * | 1988-01-08 | 1988-02-10 | Amersham Int Plc | Method for measuring free fraction of ligands in biological fluids |
-
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-
1987
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- 1987-08-01 ES ES198787111139T patent/ES2033266T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-08-01 AT AT87111139T patent/ATE77149T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-08-01 EP EP87111139A patent/EP0257352B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-08-04 NO NO873258A patent/NO169979C/no not_active IP Right Cessation
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- 1987-08-04 DK DK198704060A patent/DK172582B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-08-04 JP JP62193870A patent/JPH0743375B2/ja not_active Expired - Lifetime
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- 1992-05-18 US US07/884,874 patent/US5714336A/en not_active Expired - Lifetime
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- 1993-06-14 US US08/075,832 patent/US6103486A/en not_active Expired - Lifetime
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