JPH054076B2 - - Google Patents
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- JPH054076B2 JPH054076B2 JP61277825A JP27782586A JPH054076B2 JP H054076 B2 JPH054076 B2 JP H054076B2 JP 61277825 A JP61277825 A JP 61277825A JP 27782586 A JP27782586 A JP 27782586A JP H054076 B2 JPH054076 B2 JP H054076B2
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Description
［技術分野］
本発明は、医学的分野、生理化学的分野におい
て極めて有用なコラゲナーゼインヒビターモノク
ローナル抗体に関するものである。 ［背景技術］ コラゲナーゼインヒビター（テイシユ・インヒ
ビター・オブ・メタロプロテアーゼ：TIMP）は
ヒト及びその他の動物の骨、皮膚、歯髄、羊水、
血液、関節液中及び関節軟骨細胞、滑液細胞、各
種組織由来線維芽細胞、線維肉腫細胞培養外液中
にその存在が認められており、分子量約30KD
（キロダルトン）の糖たん白質といわれている。
（Murphyら、Biochem.J.195、167〜170、1981；
Welgusら、J.Biol.Chem.258、12259〜12264、
1983；Kishiら、J.Biochem.96、395〜404、1984
ら参照）。一方、角膜腫瘍、歯周疾患、３度熱傷
肉芽、先天性表皮水疱症、慢性関節リウマチ、難
治性皮膚腫瘍らでコラゲナーゼ活性の上昇が認め
られており、（Kishiら、Biomedical Res.5、149
〜156、1984参照）、コラゲナーゼ活性の上昇がそ
れらの疾患の治癒を遅延させていることが知られ
ている。したがつて、このコラゲナーゼ活性の上
昇に関連して、コラゲナーゼインヒビターの活性
を測定することにより、前記の如き、種々の疾病
の病状の診断およびその治療法における応用が可
能となる。また、一方、本発明者らは、ウシ未萌
出知歯根部歯髄をイーグルMEM培地中で培養す
ると大量のコラゲナーゼインヒビターを産生する
ことを見い出したが、このコラゲナーゼインヒビ
ターの精製については、従来のカラムクロマトグ
ラフイーを用いる方法ではその精製が容易に行い
得ず、また充分な精製品が得られなかつた。 酵素あるいはたん白質を簡便、高収率に精製す
る場合に、抗体を用いて行うアフイニテイ精製法
が報告されているが、特異性の点からして、モノ
クローナル抗体を用いることがより有利である。
従来技術においては、抗体産生Ｂ細胞またはその
前駆細胞と連続的分裂増殖可能な骨髄細胞（ミエ
ローマ細胞）を融合させ、これら両方の細胞の特
性を有している均質な融合細胞（ハイブリドー
マ）を得ようとする試みがなされ、そのクローン
が得られることが明らかにされている（Ko¨hler
ら、Nature、256、495〜497、1975）が、ウシコ
ラゲナーゼインヒビターに対する均一で特異性の
高いモノクローナル抗体を連続的にかつ大量に製
造する方法、及びそれら抗体を用いてのコラゲナ
ーゼインヒビターのアフイニテイ精製法は従来報
告されていない。 本発明者らは、コラゲナーゼインヒビターモノ
クローナル抗体に関し、種々研究の結果、前述の
コラゲナーゼインヒビターの活性の測定、あるい
は、コラゲナーゼインヒビターの精製に極めて有
用な新規なコラゲナーゼインヒビターモノクロー
ナル抗体を提供することに成功した。 ［発明の開示］ 本発明は、ウシコラゲナーゼインヒビターに免
疫交差反応性を有し、ヒトコラゲナーゼインヒビ
ターとの免疫交差反応性を有するIgG1タイプの
モノクローナル抗体を提供するものである。本発
明に係る新規なコラゲナーゼインヒビターは、以
下の如き方法により得られる。まず、動物を、ウ
シコラゲナーゼインヒビターで免疫し、諸動物か
らの抗ウシコラゲナーゼインヒビター産生細胞と
ミエローマ細胞によりハイブリドーマを形成さ
せ、該ハイブリドーマをクローン化する。次いで
抗ウシコラゲナーゼインヒビター抗体を産生する
クローンを選択し培養する。次いで目的とする
IgG1タイプのモノクローナル抗体を取得する。 本発明に係る新規なモノクロナール抗体は、コ
ラゲナーゼインヒビター活性の測定あるいは、コ
ラゲナーゼインヒビターの精製その他に極めて有
用な役割を果たすものであり、医学的あるいは生
理化学的用途に重要なものである。 以下、実施例及び参考例により本発明を具体的
に説明する。ただし、本発明はこれらに限定され
るものではない。 実施例 １ 抗ウシコラゲナーゼインヒビターモノクローナ
ル抗体の作製 (a) 抗原−ウシコラゲナーゼインヒビターの調製 J.Biochem、96、395〜404（1984）に記載の
本発明者らの方法に従いウシ未萌出知歯の根部
歯髄をイーグルMEM培地（日水製薬製）で培
養した培養外液からCon Ａ−セフアロース、
ウルトロゲルAcA44およびDE−52セルロース
の各カラムを用いてコラゲナーゼインヒビター
を精製した。精製コラゲナーゼインヒビターは
J.Mol.Biol.80、579〜599（1973）に記載の
Laemmliらの方法に従いドデシル硫酸ナトリ
ウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS
−PAGE）で調べたところ分子量約32000ダル
トン(D)の単一バンドを示した。 (b) 抗体産生細胞の調製 ６週令のBelb／ｃ雌マウス２匹をまずフロ
インド完全アジユバンド中で、前記(a)で記述し
た精製ウシコラゲナーゼインヒビターで初回免
疫する。マウスにそれぞれ48μｇのウシコラゲ
ナーゼインヒビターを0.4mlの溶液として腹腔
内投与する。さらに30日目に生理食塩水に溶解
した84μｇのウシコラゲナーゼインヒビターを
追加免疫する。最終免疫として58日目に腹腔内
投与（95μｇ／500μｇ生理食塩水）により補助
免疫し、３日後にマウス脾臓を取り出し、脾細
胞を調製する。 (c) 細胞融合 (1) 以下の材料および方法を用いる。 RPMI1640培地：RPMINo.1640（Difco
Laboratories）に重炭酸ナトリウム（12ｍ
Ｍ）、ピルピン酸ナトリウム（１ｍＭ）、Ｌ−
グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリンＧカリウ
ム（50U／ml）、硫酸ストレプトマイシン
（50μｇ／ml）、および硫酸アミカシン（100μ
ｇ／ml）を加え、ドライアイスでPHを7.2に
し、0.2μｍ東洋メンブレンフイルターで除菌
過する。 NS−１培地：上記PRMI1640培地に除菌
過した仔牛胎児血清（M.A.Bioproducts）
を15％（ｖ／ｖ）の濃度に加える。 PEG4000溶液：RPMI1640培地のポリエチ
レングリコール4000（PEG4000、Merck＆
CO.、Inc.）50％（ｗ／ｗ）無血清溶液を調
製する。 ８−アザグアニン耐性ミエローマ細胞NS
−１（P3−NS−１）との融合はSelected
Method in Cellular Immunology（ed.B.B.
Mishell and S.M.Shiigi）、W.H.Freeman
and Company（1980）、351〜372に記載のOi
らの方法を若干改変して行つた。 (2) 前記(b)で調製した有核脾臓細胞（生細胞率
100％）とミエローマ細胞（生細胞率100％）
とを５：１の割合で融合する。脾臓細胞とミ
エローマ細胞とを別に前記のRPMI1640培地
で洗滌する。次に同じ培地にけん濁し、融合
させるため上記の割合で混合する。容量50ml
の円錐形スチロール樹脂製試験管（Iwaki
Glass）を用い、40mlのRPMI1640培地中400
×ｇ、10分間遠心し、上清を完全に吸出す
る。沈殿細胞に37℃加温PEG4000溶液1.3ml
を穏やかに撹拌しながら１分間で滴下し、さ
らに１分間撹拌し細胞を再けん濁、分散させ
る。次に37℃加温RPMI1640培地1.3mlを１
分間で滴下する。この操作をさらに１回繰返
した後、同培地９mlを２〜３分間で常に撹拌
しながら滴下し細胞を分散させる。これを
400×ｇ、10分間遠心分離し、上清を完全に
吸引除去する。次にこの沈殿細胞に37℃加温
NS−１培地12.9mlをすみやかに加え、細胞
の大きい塊りを10mlのピペツトを用いて注意
深くピペツテイングして分散する。さらに同
培地26mlを加えて希釈し、ポリスチレン製96
穴マイクロウエル（Iwaki Glass）にウエル
当り6.0×105個／0.1mlの細胞を加える。な
お、この時使用する96穴マイクロウエルは前
処理として0.2mlのNS−１培地を加え、炭酸
ガス培養器中（37℃）で一晩保温し、使用時
に培地を吸引除去しておく。細胞を加えた上
記のマイクロウエルを７％炭酸ガス／93％空
気中で温度37℃、湿度100下に培養に付する。 (d) 選択培地によるハイブリドーマの選択的増殖 (1) 使用する培地は以下のとおりである。 HAT培地：前記(c)で述べたNS−１培地
にさらにヒポキサンチン（100μM）、アミノ
プテリン（0.4μM）、およびチミジン
（16μM）を加える。 HT培地：アミノプテリンを除去した以外
は上記HAT培地と同一組成のものである。 (2) 前記(c)の培養開始後翌日（１日目）、細胞
にパスツールピペツトでHAT培地２滴（約
0.1ml）を加える。２、３、５、８、11日目
に培地の半分（0.1ml）を新しいHAT培地で
置き換え、14日目に培地の半分を新しいHT
培地で置き換える。以降３〜４日毎に培地の
半分を新しいHT培地で置き換える。通常２
〜３週間で充分なハイブリドーマの生育が観
察される。ハイブリドーマ生育全ウエルにつ
いて次項(e)記載の固相−抗体結合テスト法
（ELISA）により陽性ウエルをチエツクす
る。次にフイーダーとして107個のマウス胸
線細胞を含むHT培地１mlをポリスチレン製
24穴セルウエル（Iwaki Glass）に加えたも
のを用い、上記で検出された各陽性ハイブリ
ドーマの全内容物を移す。これを前記(c)にお
けると同様に７％炭酸ガス存在下、37℃で約
１週間培養に付する。その間１〜２回各ウエ
ルの上清0.5mlを新しいHT培地0.5mlと交換
する。ハイブリドーマの充分生育した時点で
ELISA法により陽性を再確認し、それぞれ
について次項(f)記載の限界希釈法によるクロ
ーニングを行う。なお、クローニングに使用
後の残液をポリスチレン製25cm2組織培養フラ
スコ（Iwaki Glass）に移し、凍結保存用試
料を調製する。 (e) 固相−抗体結合テスト（ELISA）による抗
ウシコラゲナーゼインヒビター抗体産生ハイブ
リドーマの検索 Anal.Biochem.104、205〜214（1980）に記載
のRennardらの方法を若干改変した方法を用い
る。この方法は、ハイブリドーマ抗体の検出に
適している。96穴ミクロタイトレーシヨンプレ
ート（Flow Laboratories、Inc.）を0.5〜1.0μ
ｇのウシコラゲナーゼインヒビターでコート
し、次に、未コート部分を１％牛血清アルブミ
ン（BSA）でブロツクする。これに前記(d)で
得られたハイブリドーマ生育ウエルの上清の一
部を加える室温で約１時間インキユベートす
る。２次抗体として西洋わさびペルオキシダー
ゼ標識ヤギ抗マウスイムノグロブリン（cappel
Lab.）を加え、さらに室温で約１時間インキ
ユベートする。次に過酸化水素と基質である。
−フエニレンジアミンを加え生成した褐色の程
度を肉眼で定性的に判定するか、あるいはコロ
ナ２波長マイクロプレート光度計（MTP−22、
コロナ電気社）を用いて500nｍの吸光度を測
定する。 (f) クローニング 前記(d)の操作後、各ウエル中には２種以上の
ハイブリドーマが生育している可能性があるの
で、限界希釈法によりクローニングを行い、モ
ノクローナル抗体産生ハイブリドーマを取得す
る。NS−１培地１ml当りフイーダーとして107
個のマウス胸線細胞を含むクローニング培地を
調製し、96穴マイクロウエルの36ウエル、36ウ
エルおよび24ウエルにウエル当り５個、１個お
よび0.5個のハイブリドーマを加える。５日目、
12日目に全ウエルに各約0.1mlのNS−１培地を
追加する。クローニング開始後14〜15日で充分
なハイブリドーマの生育が認められ、コロニー
形成陰性ウエルが50％以上である群について
ELISA法を行う。テストした全ウエルが陽性
でない場合、抗体陽性ウエル中のコロニー数を
確認し、ウエル中に１コロニーが確認されたウ
エルを４〜６個選び再クローニングする。最終
的にウシコラゲナーゼインヒビターに対するモ
ノクローナル抗体産生ハイブリドーマ17株が得
られた。 (g) モノクローナル抗体の生体外増殖および生体
内増殖 モノクローナル抗体の増殖は常法による。す
なわち、モノクローナル抗体は、得られた各ハ
イブリドーマをNS−１培地などの適当な培養
液で培養（生体外増殖）し、その培養上清から
得ることができる（モノクローナル抗体の濃度
は10〜100μｇ／mlである）。一方、大量に抗体
を得るためには脾細胞とミエローマ細胞の由来
動物と同系の動物（Balb／ｃ、マウス）に腫
瘍形成促進剤プリスタン（２，６，10，14−テ
トラメチルペンタデカン、Aldrich Chemical
社）をマウス一匹当り0.5ml腹腔内投与し、１
〜３週間後に、各ハイブリドーマ１×107個を
同じく腹腔内投与することにより生体内で、さ
らに、１〜２週間後、モノクローナル抗体の濃
度４〜７mg／mlの腹水を得ることができる。 (h) モノクローナル抗体のアイソタイプ 前記(g)で得られた各々の腹水を先ずウシコラ
ゲナーゼインヒビターをコートしたミクロタイ
トレーシヨンプレートに前述したELISA法に
従つて結合させる。PBSによる洗滌後次に、
アイソタイプ特異性ウサギ光マウスIg抗体
（Zymed Laboratories）を加える。PBSによ
る洗滌後、西洋わさびペルオキシダーゼ標識ヤ
ギ抗ウサギIgG（Ｈ＋Ｌ）抗体を加え、基質と
して２，2′−アジノージ（３−エチルベンゾチ
アゾリン硫酸−６）および過酸化水素を用いて
検出した。その結果をまとめて後掲の第１表に
示した。得られたウシコラゲナーゼインヒビタ
ーに対するモノクローナル抗体の内15個が免疫
グロブリン鎖γ1／κを、１個がγ2a／κを、そ
して、１個がγ2b／κを有していた。 (i) モノクローナル抗体の精製 前記(g)で得られた各腹水を硫安分画（40％飽
和）後、塩化ナトリウム0.06Mを含む40ｍＭリ
ン酸緩衝液、PH8.0で平衡化したDEAE−
Sephacel（pharmacia社）の非吸着画分を分取
し、このIgG画分を更に0.42M塩化ナトリウム
を含む50ｍＭリン酸緩衝液、PH7.4で平衡化し
たSephacryl Ｓ−300 Superfine（Pharmacia
社）カラムでゲル過し、培地中のFCSおよび
マウス由来のたん白質を分離、除去した。 (j) ヒトコラゲナーゼインヒビターとの交差反応
性 (1) ヒトコラゲナーゼインヒビターの調製 ヒトコラゲナーゼインヒビターはヒト歯肉
線維芽細胞、Gin−１（ATCC製）を10％ウ
シ胎児血清（FCS）含有ダルベツコ変法イー
グル培地（日水製薬製）中でコンフルエント
まで培養した後、FCSを含まない同培養液で
培養した培養外液からウルトロゲルAcA54
カラムを用いて部分精製した。 (2) 交差反応性のテスト 前記(i)項で得られた17株の精製各モノクロ
ーナル抗体と上記(1)で得られたヒトコラゲナ
ーゼインヒビターとの交差反応性を調べた。
その結果を後掲の第２表に示す。第２表で明
らかな如くクローン７−6C1、７−19F6及び
７−21B12がヒトコラゲナーゼインヒビター
と交差した。これらの結果よりウシコラゲナ
ーゼインヒビターとヒトコラゲナーゼインヒ
ビターの抗原認識部位の一部類似性の可能性
が推察される。 実施例 ２ ウシコラゲナーゼインヒビターの免疫組織化学
染色 ウシ歯髄及びウシ大動脈平滑筋細胞をエタノー
ル、ドライアイスで凍結しクリオスタツトを用い
て5μの切片を作成した。次に冷アセトン固定を
５分間行い実施例１(i)で得られた精製モノクロー
ナル抗体（クローン７−15E8）を加え、更にフ
ナコシABCキツト（Vector Lab.製）を用いて
染色した。ウシ歯髄（第５図参照）及び大動脈平
滑筋細胞（第６図参照）共に明らかな陽性所見を
示した。 実施例 ３ ウシコラゲナーゼインヒビターのアフイニテイ
精製 (a) アフイニテイカラムの調製 Nature214、1302〜1304（1967）に記載の
Axenら及びProc.Matl.Acad.Sci.USA、61、
636〜643（1968）に記載のCuatrecasasらの方
法に従つて臭化シアンを介して担体のセフアロ
ース4Bにリガンドとして実施例１(i)で得られ
た精製モノクローナル抗体を固定化した。次に
抗体結合セフアロース4Bゲル0.3mlをガラス管
に充填し、0.1M塩化ナトリウム及び５ｍＭ塩
化カルシウム含有30ｍＭトリス−塩酸緩衝液で
平衡化し使用した。 (b) コラゲナーゼ活性測定法 炎症４、123〜130（1984）に記載の永井らの
方法を改変して行つた。すなわち、1.0mg／ml
の濃度のイソチオシアン酸フルオレセイン
（FITC）−コラーゲン（コラーゲン技術研修会
製）0.05mlに１ｍMp−アミノフエニル酢酸第
二水銀（APMA）で活性化処理した0.1M塩化
ナトリウム及び５ｍＭ塩化カルシウム含有50ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（PH7.5）溶解コラゲナ
ーゼ溶液0.15mlを加える35℃で一定時間反応し
た。次に80ｍMo−フエナントロリン又は200
ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウム
（EDTA）0.01mlを加え反応を停止させ、更に
0.4mlの70％エタノール、30ｍＭ塩化ナトリウ
ム含有10ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH7.5）を
加え撹拌した。その後、3000r.p.m、10分間遠
心分離し、分解コラーゲン断片を抽出した。コ
ラーゲン分解量（コラーゲン断片生成量）は上
記コラゲナーゼ含有溶液の代わりに上記緩衝液
のみを加えた場合の抽出液の蛍光強度を０％と
し、一方、反応混液を80℃、10分間加熱処理し
てFITC−コラーゲンを変性させ、全FITC−
コラーゲンを抽出した場合の蛍光強度を100％
とした時の蛍光強度から求めた。すなわち、 コラゲナーゼ活性(U)＝ 試料全容量（ml）×試料蛍光強度×50μｇ／反応時間
（分）×試料添加量 なお、コラゲナーゼ活性１ユニツト(U)はコラ
ーゲン1μｇを35℃、１分間で分解するのに要
する酸素量として表示した。 (c) コラゲナーゼインヒビター活性測定法 １ｍＭ APMA活性化コラゲナーゼ溶液に
コラゲナーゼインヒビター含有試料を加え35
℃、10分間プレインキユベーシヨン後、上記(b)
項の方法により、コラゲナーゼ活性を測定し、
コラゲナーゼインヒビター非存在下のコラゲナ
ーゼ活性を対照とすることにより求めた。すな
わち、コラゲナーゼインヒビター活性1Uはコ
ラゲナーゼ活性1Uを阻害するのに要する酸素
量として表示した。 (d) 最適モノクローナル抗体結合アフイニテイカ
ラムの選択 前項(a)で調製した各種抗体結合カラムにウシ
歯髄培養外液（たん白量1.4mg）を通し、0.1M
塩化ナトリウム及び５ｍＭ塩化カルシウム含有
30ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH8.0）2.5mlで洗
浄し、上記培養外液と洗浄液を合わせて非吸着
画分とした。次に8M尿素含有トリス−塩酸緩
衝液（PH7.5）で溶出（溶出画分）し、0.1M塩
化ナトリウム及び５ｍＭ塩化カルシウム含有ト
リス−塩酸緩衝液（PH8.0）に対し透析した。
後掲の第３表に示した如く両画分のコラゲナー
ゼ活性はいずれのカラムにおいても非吸着画分
に認められた。一方、コラゲナーゼインヒビタ
ー活性はクローン７−3F1、７−4F2、７−
20C2及び７−21B12からの抗体結合カラムにお
いては溶出画分に認められた（回収率60〜70
％）。又、それらの非吸着画分のコラゲナーゼ
活性は培養外液中のそれに比べて約10倍に増加
するのに対し、コラゲナーゼインヒビター活性
は消失した。クローン７−6C1及び７−15E8か
らの抗体結合カラムの場合、非吸着画分のコラ
ゲナーゼ活性及びコラゲナーゼインヒビター活
性の割合は、培養外液中のそれらの活性の割合
とほぼ同じであり、これらのカラムにコラゲナ
ーゼインヒビターは吸着されないことが明らか
となつた。 (e) コラゲナーゼインヒビターの安定性 抗体結合アフイニテイカラムからコラゲナー
ゼインヒビターを溶出する場合の種々の溶出剤
中でのコラゲナーゼインヒビターの安定性を検
討した。すなわち、ウシ歯髄培養液を(A)０〜
8M尿素含有30ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH
7.5）、(B)０〜4Mロダンカリ含有30ｍＭトリス
−塩酸緩衝液（PH7.5）、(C)０〜6M塩酸グアニ
ジン含有トリス−塩酸緩衝液（PH7.5）及び０
〜6M塩酸グアニジン含有0.2Mグリシン−塩酸
緩衝液（PH2.0）中でそれぞれ35℃、30分間イ
ンキユベーシヨンした後、0.1M塩化ナトリウ
ム及び５ｍＭ塩化カルシウム含有30ｍＭトリス
−塩酸緩衝液（PH8.0）に対して透析し、残存
コラゲナーゼインヒビター活性を調べた。添付
図面、第１図で明らかな如くコラゲナーゼイン
ヒビター活性は(A)〜(D)のいずれの条件下でも全
く失活は認められなかつた。 (f) コラゲナーゼインヒビターの溶出条件の検討 ウシ歯髄培養外液を前記(a)項で回収率の高か
つたクローン７−20C2及び７−21B12からの抗
体結合アフイニテイカラムに供し、種々の溶出
剤を用いてコラゲナーゼインヒビターを溶出し
た。第４表で明らかな如くコラゲナーゼインヒ
ビター活性の回収率はクローン７−20C2ある
いは７−21B12のどちらかのカラムを用いた場
合も60〜70％であり、また溶出剤の種類の影響
も受けなかつた。また、各種溶出剤で溶出した
画分のSDS−PAGEパターンをみると、主成分
は分子量32KDのコラゲナーゼインヒビターに
一致するバンドと、分子量20KD及び60〜
70KDのバンドが認められた（添付図面第２図
参照）。第２図中Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄは、それぞれ
以下の意味を有する。 (A) 8M尿素含有30ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（PH7.5） (B) 3Mダンカリ含有30ｍＭトリス−塩酸緩衝
液（PH7.5） (C) 1M塩酸グアニジン含有30ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（PH7.5） (D) 0.2Mグリシン−塩酸緩衝液（PH2.0） (g) 抗体結合アフイニテイカラム再使用の検討 ウシ歯髄培養外液をクローン７−20C2及び
７−21B12からの抗体結合アフイニテイカラム
に供し、0.2Mグリシン−塩酸緩衝液（PH2.0）
でコラゲナーゼインヒビターを溶出させた後、
それぞれのカラムを0.1M塩化ナトリウム及び
５ｍＭ塩化カルシウム含有30ｍＭトリス−塩酸
緩衝液（PH8.0）で充分洗浄した。これらのカ
ラムに再度ウシ歯髄培養外液を添加し、初めの
操作と同様にコラゲナーゼインヒビターを溶出
させた。後掲の第５表に示した如くクローン７
−20C2のカラムの場合、非吸着画分に培養外
液中のコラゲナーゼインヒビター活性の19％が
認められた。一方、クローン７−21B12のカラ
ムの場合、非吸着画分中には活性は認められ
ず、溶出画分に61％の活性が回収され、一回目
の回収率58％（後掲第４表参照）とほぼ同結果
が得られた。したがつて、本発明においてはク
ローン７−21B12からの抗体がアフイニテイカ
ラムのリガンドとして最適であることが明らか
となつた。 (h) 抗体結合アフイニテイカラムの洗浄効果 コラゲナーゼインヒビターの精製度を上昇さ
せる目的でウシ歯髄培養外液をクローン７−
21B12からの抗体結合カラムに供し、種々の溶
液で洗浄した後、コラゲナーゼインヒビターを
溶出させた。後掲の第６表に示した如く2M
塩化ナトリウム含有30ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（PH7.5）及び0.5M塩化ナトリウム含有0.2M
グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（PH11.0）
による洗浄画分はコラゲナーゼインヒビターを
含まず、不純たん白質をある程度含んでおり、
洗浄効果が認められた。一方、0.5％トリン
Ｘ−100及び0.1M塩化ナトリウム含有30ｍＭト
リス−塩酸緩衝液（PH7.5）による洗浄ではコ
ラゲナーゼインヒビターは溶出されなかつた
が、不純たん白質も溶出されず、その効果は認
められなかつた。なお、0.5M塩化ナトリウ
ム含有酢酸緩衝液（PH4.0）及び1M塩酸グア
ニジン含有30ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH7.5）
で洗浄した場合はコラゲナーゼインヒビターが
各々29％、21％溶出され洗浄剤としては不適で
あることが明らかとなつた。 (i) DE−52カラムクロマトグラフイーによる精
製 前記(f)項でクローン７−21B12からの抗体結
合アフイニテイカラムから得られたコラゲナー
ゼインヒビターは分子量20KD及び60〜70KD
の不純たん白質を含んでいるため、更にDE−
52カラムで精製した。添付図面、第３図に示し
た如くコラゲナーゼインヒビターは(B)50ｍＭ塩
化ナトリウム含有10ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（PH8.0）で大部分溶出され、不純たん白質も除
去された。又、2M塩化ナトリウム含有10ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（PH8.0）でもコラゲナー
ゼインヒビターは溶出されたが、同時に不純た
ん白質も大部分溶出された。なお、抗体結合ア
フイニテイカラムより得られた不純たん白質含
有コラゲナーゼインヒビターはウルトロゲル
AcA54カラムによるゲル過法によつても単
一バンドに精製することができた。 実施例 ４ ヒトコラゲナーゼインヒビターのアフイニテイ
精製 実施例１(j)項(1)に記載したヒト歯肉線維芽細胞
（Gin−１）培養外液750mlを東洋ウルトラフイル
ター、UK−10を用いて加圧過し25mlに濃縮
し、0.1M塩化ナトリウム及び５ｍＭ塩化カルシ
ウム含有30ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH8.0）に
対して透析した。それを上記緩衝液で平衡化した
クローン７−21B12からの抗体結合カラム（５
ml）に供し、上記緩衝液10mlで洗浄し（非吸着画
分）、次にカラムを実施例３(h)項記載の2M塩化
ナトリウム含有30ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH
7.5）及び0.5M塩化ナトリウム含有0.2Mグリシ
ン−水酸化ナトリウム緩衝液（PH11.0）各10mlで
順次洗浄し（洗浄画分）、最後に0.2Mグリシン−
塩酸緩衝液（PH2.0）10mlでコラゲナーゼインヒ
ビターをカラムから溶出した（溶出画分）。後掲
の第７表に示した如く溶出画分に42μｇのたん白
質が溶出された。なお、両画分のSDS−PAGEに
おいてウシコラゲナーゼインヒビターと同じ分子
量32Kのバンドと60〜70KDおよび２万以下の不
純たん白質が認められた。次にこれら２種類の試
料の各画分をSDS−PAGEに供した後、細胞工学
１＆２、1061〜1068（1983）に記載の田部の方法
に従つてFab′（７−21B12）−西洋ワサビペルオキ
シダーゼ複合体を用いてウエスタンブロツテイン
グ行つた。なお、上記複合体はJ.
Immunoassay4、209〜327（1983）に記載の石川
らの方法に従つてクローン７−21B12からの抗体
IgG1及び西洋ワサビペルオキシダーゼを用いて
調製した。添付図面、第４図に示したウエスタン
ブロツテイングのパターンで明らかな如くヒト歯
肉線維芽細胞培養外液中にウシ歯髄コラゲナーゼ
インヒビターに対するモノクローナル抗体と反応
するヒトコラゲナーゼインヒビターが存在し、そ
の分子量はウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターの
32KDと同一であつた。
て極めて有用なコラゲナーゼインヒビターモノク
ローナル抗体に関するものである。 ［背景技術］ コラゲナーゼインヒビター（テイシユ・インヒ
ビター・オブ・メタロプロテアーゼ：TIMP）は
ヒト及びその他の動物の骨、皮膚、歯髄、羊水、
血液、関節液中及び関節軟骨細胞、滑液細胞、各
種組織由来線維芽細胞、線維肉腫細胞培養外液中
にその存在が認められており、分子量約30KD
（キロダルトン）の糖たん白質といわれている。
（Murphyら、Biochem.J.195、167〜170、1981；
Welgusら、J.Biol.Chem.258、12259〜12264、
1983；Kishiら、J.Biochem.96、395〜404、1984
ら参照）。一方、角膜腫瘍、歯周疾患、３度熱傷
肉芽、先天性表皮水疱症、慢性関節リウマチ、難
治性皮膚腫瘍らでコラゲナーゼ活性の上昇が認め
られており、（Kishiら、Biomedical Res.5、149
〜156、1984参照）、コラゲナーゼ活性の上昇がそ
れらの疾患の治癒を遅延させていることが知られ
ている。したがつて、このコラゲナーゼ活性の上
昇に関連して、コラゲナーゼインヒビターの活性
を測定することにより、前記の如き、種々の疾病
の病状の診断およびその治療法における応用が可
能となる。また、一方、本発明者らは、ウシ未萌
出知歯根部歯髄をイーグルMEM培地中で培養す
ると大量のコラゲナーゼインヒビターを産生する
ことを見い出したが、このコラゲナーゼインヒビ
ターの精製については、従来のカラムクロマトグ
ラフイーを用いる方法ではその精製が容易に行い
得ず、また充分な精製品が得られなかつた。 酵素あるいはたん白質を簡便、高収率に精製す
る場合に、抗体を用いて行うアフイニテイ精製法
が報告されているが、特異性の点からして、モノ
クローナル抗体を用いることがより有利である。
従来技術においては、抗体産生Ｂ細胞またはその
前駆細胞と連続的分裂増殖可能な骨髄細胞（ミエ
ローマ細胞）を融合させ、これら両方の細胞の特
性を有している均質な融合細胞（ハイブリドー
マ）を得ようとする試みがなされ、そのクローン
が得られることが明らかにされている（Ko¨hler
ら、Nature、256、495〜497、1975）が、ウシコ
ラゲナーゼインヒビターに対する均一で特異性の
高いモノクローナル抗体を連続的にかつ大量に製
造する方法、及びそれら抗体を用いてのコラゲナ
ーゼインヒビターのアフイニテイ精製法は従来報
告されていない。 本発明者らは、コラゲナーゼインヒビターモノ
クローナル抗体に関し、種々研究の結果、前述の
コラゲナーゼインヒビターの活性の測定、あるい
は、コラゲナーゼインヒビターの精製に極めて有
用な新規なコラゲナーゼインヒビターモノクロー
ナル抗体を提供することに成功した。 ［発明の開示］ 本発明は、ウシコラゲナーゼインヒビターに免
疫交差反応性を有し、ヒトコラゲナーゼインヒビ
ターとの免疫交差反応性を有するIgG1タイプの
モノクローナル抗体を提供するものである。本発
明に係る新規なコラゲナーゼインヒビターは、以
下の如き方法により得られる。まず、動物を、ウ
シコラゲナーゼインヒビターで免疫し、諸動物か
らの抗ウシコラゲナーゼインヒビター産生細胞と
ミエローマ細胞によりハイブリドーマを形成さ
せ、該ハイブリドーマをクローン化する。次いで
抗ウシコラゲナーゼインヒビター抗体を産生する
クローンを選択し培養する。次いで目的とする
IgG1タイプのモノクローナル抗体を取得する。 本発明に係る新規なモノクロナール抗体は、コ
ラゲナーゼインヒビター活性の測定あるいは、コ
ラゲナーゼインヒビターの精製その他に極めて有
用な役割を果たすものであり、医学的あるいは生
理化学的用途に重要なものである。 以下、実施例及び参考例により本発明を具体的
に説明する。ただし、本発明はこれらに限定され
るものではない。 実施例 １ 抗ウシコラゲナーゼインヒビターモノクローナ
ル抗体の作製 (a) 抗原−ウシコラゲナーゼインヒビターの調製 J.Biochem、96、395〜404（1984）に記載の
本発明者らの方法に従いウシ未萌出知歯の根部
歯髄をイーグルMEM培地（日水製薬製）で培
養した培養外液からCon Ａ−セフアロース、
ウルトロゲルAcA44およびDE−52セルロース
の各カラムを用いてコラゲナーゼインヒビター
を精製した。精製コラゲナーゼインヒビターは
J.Mol.Biol.80、579〜599（1973）に記載の
Laemmliらの方法に従いドデシル硫酸ナトリ
ウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS
−PAGE）で調べたところ分子量約32000ダル
トン(D)の単一バンドを示した。 (b) 抗体産生細胞の調製 ６週令のBelb／ｃ雌マウス２匹をまずフロ
インド完全アジユバンド中で、前記(a)で記述し
た精製ウシコラゲナーゼインヒビターで初回免
疫する。マウスにそれぞれ48μｇのウシコラゲ
ナーゼインヒビターを0.4mlの溶液として腹腔
内投与する。さらに30日目に生理食塩水に溶解
した84μｇのウシコラゲナーゼインヒビターを
追加免疫する。最終免疫として58日目に腹腔内
投与（95μｇ／500μｇ生理食塩水）により補助
免疫し、３日後にマウス脾臓を取り出し、脾細
胞を調製する。 (c) 細胞融合 (1) 以下の材料および方法を用いる。 RPMI1640培地：RPMINo.1640（Difco
Laboratories）に重炭酸ナトリウム（12ｍ
Ｍ）、ピルピン酸ナトリウム（１ｍＭ）、Ｌ−
グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリンＧカリウ
ム（50U／ml）、硫酸ストレプトマイシン
（50μｇ／ml）、および硫酸アミカシン（100μ
ｇ／ml）を加え、ドライアイスでPHを7.2に
し、0.2μｍ東洋メンブレンフイルターで除菌
過する。 NS−１培地：上記PRMI1640培地に除菌
過した仔牛胎児血清（M.A.Bioproducts）
を15％（ｖ／ｖ）の濃度に加える。 PEG4000溶液：RPMI1640培地のポリエチ
レングリコール4000（PEG4000、Merck＆
CO.、Inc.）50％（ｗ／ｗ）無血清溶液を調
製する。 ８−アザグアニン耐性ミエローマ細胞NS
−１（P3−NS−１）との融合はSelected
Method in Cellular Immunology（ed.B.B.
Mishell and S.M.Shiigi）、W.H.Freeman
and Company（1980）、351〜372に記載のOi
らの方法を若干改変して行つた。 (2) 前記(b)で調製した有核脾臓細胞（生細胞率
100％）とミエローマ細胞（生細胞率100％）
とを５：１の割合で融合する。脾臓細胞とミ
エローマ細胞とを別に前記のRPMI1640培地
で洗滌する。次に同じ培地にけん濁し、融合
させるため上記の割合で混合する。容量50ml
の円錐形スチロール樹脂製試験管（Iwaki
Glass）を用い、40mlのRPMI1640培地中400
×ｇ、10分間遠心し、上清を完全に吸出す
る。沈殿細胞に37℃加温PEG4000溶液1.3ml
を穏やかに撹拌しながら１分間で滴下し、さ
らに１分間撹拌し細胞を再けん濁、分散させ
る。次に37℃加温RPMI1640培地1.3mlを１
分間で滴下する。この操作をさらに１回繰返
した後、同培地９mlを２〜３分間で常に撹拌
しながら滴下し細胞を分散させる。これを
400×ｇ、10分間遠心分離し、上清を完全に
吸引除去する。次にこの沈殿細胞に37℃加温
NS−１培地12.9mlをすみやかに加え、細胞
の大きい塊りを10mlのピペツトを用いて注意
深くピペツテイングして分散する。さらに同
培地26mlを加えて希釈し、ポリスチレン製96
穴マイクロウエル（Iwaki Glass）にウエル
当り6.0×105個／0.1mlの細胞を加える。な
お、この時使用する96穴マイクロウエルは前
処理として0.2mlのNS−１培地を加え、炭酸
ガス培養器中（37℃）で一晩保温し、使用時
に培地を吸引除去しておく。細胞を加えた上
記のマイクロウエルを７％炭酸ガス／93％空
気中で温度37℃、湿度100下に培養に付する。 (d) 選択培地によるハイブリドーマの選択的増殖 (1) 使用する培地は以下のとおりである。 HAT培地：前記(c)で述べたNS−１培地
にさらにヒポキサンチン（100μM）、アミノ
プテリン（0.4μM）、およびチミジン
（16μM）を加える。 HT培地：アミノプテリンを除去した以外
は上記HAT培地と同一組成のものである。 (2) 前記(c)の培養開始後翌日（１日目）、細胞
にパスツールピペツトでHAT培地２滴（約
0.1ml）を加える。２、３、５、８、11日目
に培地の半分（0.1ml）を新しいHAT培地で
置き換え、14日目に培地の半分を新しいHT
培地で置き換える。以降３〜４日毎に培地の
半分を新しいHT培地で置き換える。通常２
〜３週間で充分なハイブリドーマの生育が観
察される。ハイブリドーマ生育全ウエルにつ
いて次項(e)記載の固相−抗体結合テスト法
（ELISA）により陽性ウエルをチエツクす
る。次にフイーダーとして107個のマウス胸
線細胞を含むHT培地１mlをポリスチレン製
24穴セルウエル（Iwaki Glass）に加えたも
のを用い、上記で検出された各陽性ハイブリ
ドーマの全内容物を移す。これを前記(c)にお
けると同様に７％炭酸ガス存在下、37℃で約
１週間培養に付する。その間１〜２回各ウエ
ルの上清0.5mlを新しいHT培地0.5mlと交換
する。ハイブリドーマの充分生育した時点で
ELISA法により陽性を再確認し、それぞれ
について次項(f)記載の限界希釈法によるクロ
ーニングを行う。なお、クローニングに使用
後の残液をポリスチレン製25cm2組織培養フラ
スコ（Iwaki Glass）に移し、凍結保存用試
料を調製する。 (e) 固相−抗体結合テスト（ELISA）による抗
ウシコラゲナーゼインヒビター抗体産生ハイブ
リドーマの検索 Anal.Biochem.104、205〜214（1980）に記載
のRennardらの方法を若干改変した方法を用い
る。この方法は、ハイブリドーマ抗体の検出に
適している。96穴ミクロタイトレーシヨンプレ
ート（Flow Laboratories、Inc.）を0.5〜1.0μ
ｇのウシコラゲナーゼインヒビターでコート
し、次に、未コート部分を１％牛血清アルブミ
ン（BSA）でブロツクする。これに前記(d)で
得られたハイブリドーマ生育ウエルの上清の一
部を加える室温で約１時間インキユベートす
る。２次抗体として西洋わさびペルオキシダー
ゼ標識ヤギ抗マウスイムノグロブリン（cappel
Lab.）を加え、さらに室温で約１時間インキ
ユベートする。次に過酸化水素と基質である。
−フエニレンジアミンを加え生成した褐色の程
度を肉眼で定性的に判定するか、あるいはコロ
ナ２波長マイクロプレート光度計（MTP−22、
コロナ電気社）を用いて500nｍの吸光度を測
定する。 (f) クローニング 前記(d)の操作後、各ウエル中には２種以上の
ハイブリドーマが生育している可能性があるの
で、限界希釈法によりクローニングを行い、モ
ノクローナル抗体産生ハイブリドーマを取得す
る。NS−１培地１ml当りフイーダーとして107
個のマウス胸線細胞を含むクローニング培地を
調製し、96穴マイクロウエルの36ウエル、36ウ
エルおよび24ウエルにウエル当り５個、１個お
よび0.5個のハイブリドーマを加える。５日目、
12日目に全ウエルに各約0.1mlのNS−１培地を
追加する。クローニング開始後14〜15日で充分
なハイブリドーマの生育が認められ、コロニー
形成陰性ウエルが50％以上である群について
ELISA法を行う。テストした全ウエルが陽性
でない場合、抗体陽性ウエル中のコロニー数を
確認し、ウエル中に１コロニーが確認されたウ
エルを４〜６個選び再クローニングする。最終
的にウシコラゲナーゼインヒビターに対するモ
ノクローナル抗体産生ハイブリドーマ17株が得
られた。 (g) モノクローナル抗体の生体外増殖および生体
内増殖 モノクローナル抗体の増殖は常法による。す
なわち、モノクローナル抗体は、得られた各ハ
イブリドーマをNS−１培地などの適当な培養
液で培養（生体外増殖）し、その培養上清から
得ることができる（モノクローナル抗体の濃度
は10〜100μｇ／mlである）。一方、大量に抗体
を得るためには脾細胞とミエローマ細胞の由来
動物と同系の動物（Balb／ｃ、マウス）に腫
瘍形成促進剤プリスタン（２，６，10，14−テ
トラメチルペンタデカン、Aldrich Chemical
社）をマウス一匹当り0.5ml腹腔内投与し、１
〜３週間後に、各ハイブリドーマ１×107個を
同じく腹腔内投与することにより生体内で、さ
らに、１〜２週間後、モノクローナル抗体の濃
度４〜７mg／mlの腹水を得ることができる。 (h) モノクローナル抗体のアイソタイプ 前記(g)で得られた各々の腹水を先ずウシコラ
ゲナーゼインヒビターをコートしたミクロタイ
トレーシヨンプレートに前述したELISA法に
従つて結合させる。PBSによる洗滌後次に、
アイソタイプ特異性ウサギ光マウスIg抗体
（Zymed Laboratories）を加える。PBSによ
る洗滌後、西洋わさびペルオキシダーゼ標識ヤ
ギ抗ウサギIgG（Ｈ＋Ｌ）抗体を加え、基質と
して２，2′−アジノージ（３−エチルベンゾチ
アゾリン硫酸−６）および過酸化水素を用いて
検出した。その結果をまとめて後掲の第１表に
示した。得られたウシコラゲナーゼインヒビタ
ーに対するモノクローナル抗体の内15個が免疫
グロブリン鎖γ1／κを、１個がγ2a／κを、そ
して、１個がγ2b／κを有していた。 (i) モノクローナル抗体の精製 前記(g)で得られた各腹水を硫安分画（40％飽
和）後、塩化ナトリウム0.06Mを含む40ｍＭリ
ン酸緩衝液、PH8.0で平衡化したDEAE−
Sephacel（pharmacia社）の非吸着画分を分取
し、このIgG画分を更に0.42M塩化ナトリウム
を含む50ｍＭリン酸緩衝液、PH7.4で平衡化し
たSephacryl Ｓ−300 Superfine（Pharmacia
社）カラムでゲル過し、培地中のFCSおよび
マウス由来のたん白質を分離、除去した。 (j) ヒトコラゲナーゼインヒビターとの交差反応
性 (1) ヒトコラゲナーゼインヒビターの調製 ヒトコラゲナーゼインヒビターはヒト歯肉
線維芽細胞、Gin−１（ATCC製）を10％ウ
シ胎児血清（FCS）含有ダルベツコ変法イー
グル培地（日水製薬製）中でコンフルエント
まで培養した後、FCSを含まない同培養液で
培養した培養外液からウルトロゲルAcA54
カラムを用いて部分精製した。 (2) 交差反応性のテスト 前記(i)項で得られた17株の精製各モノクロ
ーナル抗体と上記(1)で得られたヒトコラゲナ
ーゼインヒビターとの交差反応性を調べた。
その結果を後掲の第２表に示す。第２表で明
らかな如くクローン７−6C1、７−19F6及び
７−21B12がヒトコラゲナーゼインヒビター
と交差した。これらの結果よりウシコラゲナ
ーゼインヒビターとヒトコラゲナーゼインヒ
ビターの抗原認識部位の一部類似性の可能性
が推察される。 実施例 ２ ウシコラゲナーゼインヒビターの免疫組織化学
染色 ウシ歯髄及びウシ大動脈平滑筋細胞をエタノー
ル、ドライアイスで凍結しクリオスタツトを用い
て5μの切片を作成した。次に冷アセトン固定を
５分間行い実施例１(i)で得られた精製モノクロー
ナル抗体（クローン７−15E8）を加え、更にフ
ナコシABCキツト（Vector Lab.製）を用いて
染色した。ウシ歯髄（第５図参照）及び大動脈平
滑筋細胞（第６図参照）共に明らかな陽性所見を
示した。 実施例 ３ ウシコラゲナーゼインヒビターのアフイニテイ
精製 (a) アフイニテイカラムの調製 Nature214、1302〜1304（1967）に記載の
Axenら及びProc.Matl.Acad.Sci.USA、61、
636〜643（1968）に記載のCuatrecasasらの方
法に従つて臭化シアンを介して担体のセフアロ
ース4Bにリガンドとして実施例１(i)で得られ
た精製モノクローナル抗体を固定化した。次に
抗体結合セフアロース4Bゲル0.3mlをガラス管
に充填し、0.1M塩化ナトリウム及び５ｍＭ塩
化カルシウム含有30ｍＭトリス−塩酸緩衝液で
平衡化し使用した。 (b) コラゲナーゼ活性測定法 炎症４、123〜130（1984）に記載の永井らの
方法を改変して行つた。すなわち、1.0mg／ml
の濃度のイソチオシアン酸フルオレセイン
（FITC）−コラーゲン（コラーゲン技術研修会
製）0.05mlに１ｍMp−アミノフエニル酢酸第
二水銀（APMA）で活性化処理した0.1M塩化
ナトリウム及び５ｍＭ塩化カルシウム含有50ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（PH7.5）溶解コラゲナ
ーゼ溶液0.15mlを加える35℃で一定時間反応し
た。次に80ｍMo−フエナントロリン又は200
ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウム
（EDTA）0.01mlを加え反応を停止させ、更に
0.4mlの70％エタノール、30ｍＭ塩化ナトリウ
ム含有10ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH7.5）を
加え撹拌した。その後、3000r.p.m、10分間遠
心分離し、分解コラーゲン断片を抽出した。コ
ラーゲン分解量（コラーゲン断片生成量）は上
記コラゲナーゼ含有溶液の代わりに上記緩衝液
のみを加えた場合の抽出液の蛍光強度を０％と
し、一方、反応混液を80℃、10分間加熱処理し
てFITC−コラーゲンを変性させ、全FITC−
コラーゲンを抽出した場合の蛍光強度を100％
とした時の蛍光強度から求めた。すなわち、 コラゲナーゼ活性(U)＝ 試料全容量（ml）×試料蛍光強度×50μｇ／反応時間
（分）×試料添加量 なお、コラゲナーゼ活性１ユニツト(U)はコラ
ーゲン1μｇを35℃、１分間で分解するのに要
する酸素量として表示した。 (c) コラゲナーゼインヒビター活性測定法 １ｍＭ APMA活性化コラゲナーゼ溶液に
コラゲナーゼインヒビター含有試料を加え35
℃、10分間プレインキユベーシヨン後、上記(b)
項の方法により、コラゲナーゼ活性を測定し、
コラゲナーゼインヒビター非存在下のコラゲナ
ーゼ活性を対照とすることにより求めた。すな
わち、コラゲナーゼインヒビター活性1Uはコ
ラゲナーゼ活性1Uを阻害するのに要する酸素
量として表示した。 (d) 最適モノクローナル抗体結合アフイニテイカ
ラムの選択 前項(a)で調製した各種抗体結合カラムにウシ
歯髄培養外液（たん白量1.4mg）を通し、0.1M
塩化ナトリウム及び５ｍＭ塩化カルシウム含有
30ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH8.0）2.5mlで洗
浄し、上記培養外液と洗浄液を合わせて非吸着
画分とした。次に8M尿素含有トリス−塩酸緩
衝液（PH7.5）で溶出（溶出画分）し、0.1M塩
化ナトリウム及び５ｍＭ塩化カルシウム含有ト
リス−塩酸緩衝液（PH8.0）に対し透析した。
後掲の第３表に示した如く両画分のコラゲナー
ゼ活性はいずれのカラムにおいても非吸着画分
に認められた。一方、コラゲナーゼインヒビタ
ー活性はクローン７−3F1、７−4F2、７−
20C2及び７−21B12からの抗体結合カラムにお
いては溶出画分に認められた（回収率60〜70
％）。又、それらの非吸着画分のコラゲナーゼ
活性は培養外液中のそれに比べて約10倍に増加
するのに対し、コラゲナーゼインヒビター活性
は消失した。クローン７−6C1及び７−15E8か
らの抗体結合カラムの場合、非吸着画分のコラ
ゲナーゼ活性及びコラゲナーゼインヒビター活
性の割合は、培養外液中のそれらの活性の割合
とほぼ同じであり、これらのカラムにコラゲナ
ーゼインヒビターは吸着されないことが明らか
となつた。 (e) コラゲナーゼインヒビターの安定性 抗体結合アフイニテイカラムからコラゲナー
ゼインヒビターを溶出する場合の種々の溶出剤
中でのコラゲナーゼインヒビターの安定性を検
討した。すなわち、ウシ歯髄培養液を(A)０〜
8M尿素含有30ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH
7.5）、(B)０〜4Mロダンカリ含有30ｍＭトリス
−塩酸緩衝液（PH7.5）、(C)０〜6M塩酸グアニ
ジン含有トリス−塩酸緩衝液（PH7.5）及び０
〜6M塩酸グアニジン含有0.2Mグリシン−塩酸
緩衝液（PH2.0）中でそれぞれ35℃、30分間イ
ンキユベーシヨンした後、0.1M塩化ナトリウ
ム及び５ｍＭ塩化カルシウム含有30ｍＭトリス
−塩酸緩衝液（PH8.0）に対して透析し、残存
コラゲナーゼインヒビター活性を調べた。添付
図面、第１図で明らかな如くコラゲナーゼイン
ヒビター活性は(A)〜(D)のいずれの条件下でも全
く失活は認められなかつた。 (f) コラゲナーゼインヒビターの溶出条件の検討 ウシ歯髄培養外液を前記(a)項で回収率の高か
つたクローン７−20C2及び７−21B12からの抗
体結合アフイニテイカラムに供し、種々の溶出
剤を用いてコラゲナーゼインヒビターを溶出し
た。第４表で明らかな如くコラゲナーゼインヒ
ビター活性の回収率はクローン７−20C2ある
いは７−21B12のどちらかのカラムを用いた場
合も60〜70％であり、また溶出剤の種類の影響
も受けなかつた。また、各種溶出剤で溶出した
画分のSDS−PAGEパターンをみると、主成分
は分子量32KDのコラゲナーゼインヒビターに
一致するバンドと、分子量20KD及び60〜
70KDのバンドが認められた（添付図面第２図
参照）。第２図中Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄは、それぞれ
以下の意味を有する。 (A) 8M尿素含有30ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（PH7.5） (B) 3Mダンカリ含有30ｍＭトリス−塩酸緩衝
液（PH7.5） (C) 1M塩酸グアニジン含有30ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（PH7.5） (D) 0.2Mグリシン−塩酸緩衝液（PH2.0） (g) 抗体結合アフイニテイカラム再使用の検討 ウシ歯髄培養外液をクローン７−20C2及び
７−21B12からの抗体結合アフイニテイカラム
に供し、0.2Mグリシン−塩酸緩衝液（PH2.0）
でコラゲナーゼインヒビターを溶出させた後、
それぞれのカラムを0.1M塩化ナトリウム及び
５ｍＭ塩化カルシウム含有30ｍＭトリス−塩酸
緩衝液（PH8.0）で充分洗浄した。これらのカ
ラムに再度ウシ歯髄培養外液を添加し、初めの
操作と同様にコラゲナーゼインヒビターを溶出
させた。後掲の第５表に示した如くクローン７
−20C2のカラムの場合、非吸着画分に培養外
液中のコラゲナーゼインヒビター活性の19％が
認められた。一方、クローン７−21B12のカラ
ムの場合、非吸着画分中には活性は認められ
ず、溶出画分に61％の活性が回収され、一回目
の回収率58％（後掲第４表参照）とほぼ同結果
が得られた。したがつて、本発明においてはク
ローン７−21B12からの抗体がアフイニテイカ
ラムのリガンドとして最適であることが明らか
となつた。 (h) 抗体結合アフイニテイカラムの洗浄効果 コラゲナーゼインヒビターの精製度を上昇さ
せる目的でウシ歯髄培養外液をクローン７−
21B12からの抗体結合カラムに供し、種々の溶
液で洗浄した後、コラゲナーゼインヒビターを
溶出させた。後掲の第６表に示した如く2M
塩化ナトリウム含有30ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（PH7.5）及び0.5M塩化ナトリウム含有0.2M
グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（PH11.0）
による洗浄画分はコラゲナーゼインヒビターを
含まず、不純たん白質をある程度含んでおり、
洗浄効果が認められた。一方、0.5％トリン
Ｘ−100及び0.1M塩化ナトリウム含有30ｍＭト
リス−塩酸緩衝液（PH7.5）による洗浄ではコ
ラゲナーゼインヒビターは溶出されなかつた
が、不純たん白質も溶出されず、その効果は認
められなかつた。なお、0.5M塩化ナトリウ
ム含有酢酸緩衝液（PH4.0）及び1M塩酸グア
ニジン含有30ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH7.5）
で洗浄した場合はコラゲナーゼインヒビターが
各々29％、21％溶出され洗浄剤としては不適で
あることが明らかとなつた。 (i) DE−52カラムクロマトグラフイーによる精
製 前記(f)項でクローン７−21B12からの抗体結
合アフイニテイカラムから得られたコラゲナー
ゼインヒビターは分子量20KD及び60〜70KD
の不純たん白質を含んでいるため、更にDE−
52カラムで精製した。添付図面、第３図に示し
た如くコラゲナーゼインヒビターは(B)50ｍＭ塩
化ナトリウム含有10ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（PH8.0）で大部分溶出され、不純たん白質も除
去された。又、2M塩化ナトリウム含有10ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（PH8.0）でもコラゲナー
ゼインヒビターは溶出されたが、同時に不純た
ん白質も大部分溶出された。なお、抗体結合ア
フイニテイカラムより得られた不純たん白質含
有コラゲナーゼインヒビターはウルトロゲル
AcA54カラムによるゲル過法によつても単
一バンドに精製することができた。 実施例 ４ ヒトコラゲナーゼインヒビターのアフイニテイ
精製 実施例１(j)項(1)に記載したヒト歯肉線維芽細胞
（Gin−１）培養外液750mlを東洋ウルトラフイル
ター、UK−10を用いて加圧過し25mlに濃縮
し、0.1M塩化ナトリウム及び５ｍＭ塩化カルシ
ウム含有30ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH8.0）に
対して透析した。それを上記緩衝液で平衡化した
クローン７−21B12からの抗体結合カラム（５
ml）に供し、上記緩衝液10mlで洗浄し（非吸着画
分）、次にカラムを実施例３(h)項記載の2M塩化
ナトリウム含有30ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH
7.5）及び0.5M塩化ナトリウム含有0.2Mグリシ
ン−水酸化ナトリウム緩衝液（PH11.0）各10mlで
順次洗浄し（洗浄画分）、最後に0.2Mグリシン−
塩酸緩衝液（PH2.0）10mlでコラゲナーゼインヒ
ビターをカラムから溶出した（溶出画分）。後掲
の第７表に示した如く溶出画分に42μｇのたん白
質が溶出された。なお、両画分のSDS−PAGEに
おいてウシコラゲナーゼインヒビターと同じ分子
量32Kのバンドと60〜70KDおよび２万以下の不
純たん白質が認められた。次にこれら２種類の試
料の各画分をSDS−PAGEに供した後、細胞工学
１＆２、1061〜1068（1983）に記載の田部の方法
に従つてFab′（７−21B12）−西洋ワサビペルオキ
シダーゼ複合体を用いてウエスタンブロツテイン
グ行つた。なお、上記複合体はJ.
Immunoassay4、209〜327（1983）に記載の石川
らの方法に従つてクローン７−21B12からの抗体
IgG1及び西洋ワサビペルオキシダーゼを用いて
調製した。添付図面、第４図に示したウエスタン
ブロツテイングのパターンで明らかな如くヒト歯
肉線維芽細胞培養外液中にウシ歯髄コラゲナーゼ
インヒビターに対するモノクローナル抗体と反応
するヒトコラゲナーゼインヒビターが存在し、そ
の分子量はウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターの
32KDと同一であつた。
【表】
【表】
【表】
【表】
ウエルあたり0.5μｇヒトコラゲナーゼインヒビ
ターをコートし1.0μｇの各精製マウス抗ウシコラ
ゲナーゼインヒビター抗体を加えインキユベーシ
ヨンした。
ターをコートし1.0μｇの各精製マウス抗ウシコラ
ゲナーゼインヒビター抗体を加えインキユベーシ
ヨンした。
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
第１図はウシコラゲナーゼインヒビターの各種
溶出剤溶液中での安定性を示すグラフであり、第
２図はモノクローナル抗体結合アフイニテイカラ
ムより各種溶出剤でウシコラゲナーゼインヒビタ
ーを溶出した時のSDS−PAGEパターンを示す図
であり、第３図は、ウシコラゲナーゼインヒビタ
ーを抗体（クローン７−21B12）結合アフイニテ
イカラムで精製後、DE−52カラムクロマトグラ
フイーを行つた時の各画分のSDS−PAGEパター
ンを示す図であり、(A)抗体結合アフイニテイカラ
ムからの溶出画分、(B)DE−52カラム非吸着画分、
(C)０〜50ｍＭ塩化ナトリウム溶液溶出画分、(D)50
〜100ｍＭ塩化ナトリウム溶液溶出画分、(E)100〜
2000ｍＭ塩化ナトリウム溶液溶出画分を示してお
り、第４図は(A)ヒト歯肉線維芽細胞培養外液、(B)
ウシ歯髄培養外液のそれぞれ抗体（クローン７−
21B12）結合アフイニテイカラムからの溶出画分
のウエスタンブロツテイング図を示し、第５図
は、ウシ歯髄の細胞の染色した顕微鏡下の写真を
図面に代えて添付したものであり、第６図は、ウ
シ大動脈平滑筋の細胞の染色した顕微鏡下の写真
を図面に代えて添付したものである。
溶出剤溶液中での安定性を示すグラフであり、第
２図はモノクローナル抗体結合アフイニテイカラ
ムより各種溶出剤でウシコラゲナーゼインヒビタ
ーを溶出した時のSDS−PAGEパターンを示す図
であり、第３図は、ウシコラゲナーゼインヒビタ
ーを抗体（クローン７−21B12）結合アフイニテ
イカラムで精製後、DE−52カラムクロマトグラ
フイーを行つた時の各画分のSDS−PAGEパター
ンを示す図であり、(A)抗体結合アフイニテイカラ
ムからの溶出画分、(B)DE−52カラム非吸着画分、
(C)０〜50ｍＭ塩化ナトリウム溶液溶出画分、(D)50
〜100ｍＭ塩化ナトリウム溶液溶出画分、(E)100〜
2000ｍＭ塩化ナトリウム溶液溶出画分を示してお
り、第４図は(A)ヒト歯肉線維芽細胞培養外液、(B)
ウシ歯髄培養外液のそれぞれ抗体（クローン７−
21B12）結合アフイニテイカラムからの溶出画分
のウエスタンブロツテイング図を示し、第５図
は、ウシ歯髄の細胞の染色した顕微鏡下の写真を
図面に代えて添付したものであり、第６図は、ウ
シ大動脈平滑筋の細胞の染色した顕微鏡下の写真
を図面に代えて添付したものである。
Claims (1)
- １ ウシコラゲナーゼインヒビターに免疫交差反
応性を有し、ヒトコラゲナーゼインヒビターとの
免疫交差反応性を有するIgG1タイプのモノクロ
ーナル抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61277825A JPS63219392A (ja) | 1986-11-22 | 1986-11-22 | 抗ウシコラゲナーゼインヒビター抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61277825A JPS63219392A (ja) | 1986-11-22 | 1986-11-22 | 抗ウシコラゲナーゼインヒビター抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63219392A JPS63219392A (ja) | 1988-09-13 |
| JPH054076B2 true JPH054076B2 (ja) | 1993-01-19 |
Family
ID=17588786
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61277825A Granted JPS63219392A (ja) | 1986-11-22 | 1986-11-22 | 抗ウシコラゲナーゼインヒビター抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS63219392A (ja) |
-
1986
- 1986-11-22 JP JP61277825A patent/JPS63219392A/ja active Granted
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J.BIOCHEM.(TOKYO)=1984 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63219392A (ja) | 1988-09-13 |
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