JPH0746992A - ヒアルロン酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ヒアルロン酸産生能を有する微生物を、培養
液中にアルギニン、グルタミン、セリン、グリシン、メ
チオニン、イソロイシン、ロイシン及びリジンの８種の
アミノ酸を添加して培養することを特徴とする発酵法に
よるヒアルロン酸の製造方法。 【効果】 本発明によれば、ヒアルロン酸の収量を低下
させずに天然有機栄養源混合物の添加量を減らすことが
でき、天然栄養源中の成分のばらつきに影響されずに安
定にヒアルロン酸を生成することができ、さらにヒアル
ロン酸の分離、精製工程の負荷を軽減できる

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、発酵法による医薬用ヒ
アルロン酸の製造方法に関する。更に詳しくは、アルギ
ニン、グルタミン、セリン、グリシン、メチオニン、イ
ソロイシン、ロイシン及びリジンの８種のアミノ酸を添
加した培養液中でヒアルロン酸産生能を有する微生物を
培養して、発酵法により医薬用ヒアルロン酸を得る方法
に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】従来、
ヒアルロン酸はニワトリのトサカ、牛の眼の硝子体等よ
り抽出によって得られていた。しかしながら抽出法によ
る生体よりのヒアルロン酸製造は多量のヒアルロン酸と
類似のムコ多糖類とか蛋白質等の多量の夾雑物との分
離、及び組織内に含まれるヒアルロニダーゼなどによっ
て低分子化を生じるなど分離、精製が非常に繁雑等の問
題点を有していた。その問題点を改良するために、ヒア
ルロン酸産生能を有する微生物であるストレプトコッカ
ス属の微生物を培養して、その培養液からヒアルロン酸
を分離、精製する方法が開示されている。（特公平4-12
960 号） さらに、ヒアルロン酸生産性の安定化及び生産収率を向
上させるため、変異株を利用する方法（特公平4-43637
号、特公平4-55675 号）、培養条件を制御する方法（特
開平3-35788 号、特公平4-64679 号）、有効成分を添加
する方法（特開昭62-289198 号、特開平4-18839 号）等
が開示されている。

【０００３】しかし、いずれの方法もヒアルロン酸生産
能を有する微生物の持つ性質である栄養要求性の複雑さ
のため、栄養が豊富でしかも微生物の増殖に対し阻害性
の少ない天然有機栄養源混合物、例えば酵母エキスやポ
リペプトンなどを多量に培地に添加する必要があった。

【０００４】ところが、従来の培養法で用いられている
天然有機栄養源混合物は糖、蛋白、アミノ酸、脂質、核
酸、ビタミン、金属など様々な成分を含んでおり、これ
らの中にはヒアルロン酸生産に必要な成分を含んでいる
反面、不必要な成分も数多く含まれている。特に医薬用
ヒアルロン酸の精製工程はこれら不要成分の除去も考慮
する必要があり、ヒアルロン酸の性質に起因する難しさ
に加え、工程が繁雑化し、その結果、分子量などの品質
の維持と工程の簡略化がより困難となってくる。精製工
程の負荷は天然有機栄養源混合物の添加量を少なくする
ことで軽減可能であるが、反面ヒアルロン酸生産に必要
な成分も減少するためにヒアルロン酸の収率が低下する
などの課題があった。

【０００５】本発明者らは、かかる課題を解決すべく鋭
意検討を行った結果、アルギニン、グルタミン、メチ
オニン、セリン、グリシン、イソロイシン、ロイシン及
びリジンの８種類のアミノ酸を添加することで、ヒアル
ロン酸の収量を低下させずに天然有機栄養源混合物の添
加量を減らすことができる、天然栄養源中の成分のば
らつきに影響されずに安定にヒアルロン酸を生成するこ
とができる、ヒアルロン酸の分離、精製工程の負荷を
軽減できる等を見いだし本発明を完成するに至った。

【０００６】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、
（１）ヒアルロン酸産生能を有する微生物を、培養液中
にアルギニン、グルタミン、セリン、グリシン、メチオ
ニン、イソロイシン、ロイシン及びリジンの８種のアミ
ノ酸を添加して培養することを特徴とする発酵法による
ヒアルロン酸の製造方法、（２）ヒアルロン酸産生能を
有する微生物がストレプトコッカス属細菌である（１）
記載のヒアルロン酸の製造方法、（３）ストレプトコッ
カス属細菌がストレプトコッカス・エキ、ストレプトコ
ッカス・エキの変異株ＦＭ−１００（微工研条寄第９０
２７号）及びストレプトコッカス・エキの変異株ＦＭ−
３００（微工研条寄第２３１９号）から選ばれた１種で
ある（２）記載のヒアルロン酸の製造方法である。

【０００７】以下、本発明について具体的に説明する。
本発明に用いられるヒアルロン酸産生能を有する微生物
としては、ストレプトコッカス・エキ（Streptococcus
equi) 、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス(Strep
tococcus zooepidemicus) 、ストレプトコッカス・エキ
シミリス(Streptococcus equisimilis) 、ストレプトコ
ッカス・デイガラクテイエ(Streptococcusdysgalactia
e)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus p
yogenes)およびこれらの変異株などが挙げられるが、な
かでもストレプトコッカス・エキが好ましく、特にスト
レプトコッカス・エキの変異株ＦＭ−１００（微工研条
寄第９０２７号）又はストレプトコッカス・エキの変異
株ＦＭ−３００（微工研条寄第２３１９号）が好まし
い。

【０００８】本発明に用いる培地はグルコース、フラク
トース、ガラクトース、シュークロース等の糖成分から
なる炭素源、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウ
ム、硝酸マグネシウム、亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナ
トリウム、リン酸アンモニウム等の無機塩類、ポリペプ
トン、カザミノ酸、酵母エキス、コーンスティープリカ
ー、大豆加水分解液等の有機栄養源、他必要に応じて各
種ビタミン類等が好適に用いられる。この際、適量のア
ルギニン、グルタミン、メチオニン、セリン、グリシ
ン、イソロイシン、ロイシン及びリジンの８種類のアミ
ノ酸を添加する。添加量に制限はないが、過量添加では
一定以上の効果はみられないので好ましくは糖成分１％
当り各々０. ００１〜０. １％、更に好ましくは０. ０
０１〜０. ０５％添加すればよい。これらのアミノ酸を
添加することにより、従来用いられていた培地の有機栄
養源量を大幅に減らすことが可能となり、収量を低下さ
せることなく精製工程の負担を軽減することができる。

【０００９】本発明の培養は通気後撹拌培養等の公知の
方法でよく、培養温度は３０〜３５℃が好ましい。培養
液のｐＨは菌の生育と共に低下するため水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウム、アンモニア等のｐＨ調整剤を添加
しｐＨ６. ０〜９. ０にコントロールする。このように
して培養すると、ヒアルロン酸の生成と共に培養液の粘
度が次第に上昇してくる。使用炭素源が培養液中で消費
された時点で培養を停止し、活性炭処理、ろ過による除
菌後アルコール等の有機溶剤による析出、限外濾過によ
る脱塩等の簡単な公知精製法により高純度ヒアルロン酸
が得られる。

【００１０】天然有機栄養源混合物に多量に含まれる成
分としてヒアルロン酸生産に必須であるアミノ酸に着目
し、ストレプトコッカス・エキを培養し、培養液中濃度
の消長とヒアルロン酸生産量の関係について詳細に検討
した。培養中のアミノ酸濃度を経時的に定量したとこ
ろ、グルタミン、アルギニン、セリン、グリシン、メチ
オニン、イソロイシン、ロイシン、リジンは消費され、
バリン、ヒスチジンなどはほとんど変化が無く、そし
て、アスパラギンに加え、ストレプトコッカス・エキNK
-850215 にはヒアルロン酸生産に有効とされていたグル
タミン酸（特開昭626-289198号）などは逆に蓄積されて
いた。結果を表１に示す。

【００１１】

【表１】

【００１２】さらに、この中で消費されるアミノ酸につ
いて更に詳細に検討した。一般に培養における菌体増殖
は誘導期、対数増殖期、静止期、死滅期に分けることが
できる。各々の時期ごとにアミノ酸の比消費速度（菌体
当りの消費速度）及びヒアルロン酸の比生産速度（菌体
当りの生産速度）を算出したところ、ヒアルロン酸の比
生産速度の大きい、すなわちヒアルロン酸生産が最も盛
んな静止期において、ストレプトコッカス・エキNK-850
215 にはヒアルロン酸生産に有効とされていたアルギニ
ン（特開昭62-289198 号）、グループＡに属するストレ
プトコッカスに有効とされていたグルタミン（D.S.WILL
OUGHBY etal.,1964.J.Bacteriol.87.1452-1456) の２種
類のアミノ酸の他に、さらに、セリン、グリシン、メチ
オニン、イソロイシン、ロイシン及びリジンの６種類の
アミノ酸の比消費速度もそれに対応し非常に大きい事よ
り、これら８種類のアミノ酸がヒアルロン酸生産に必須
であることを見いだした。

【００１３】次に、天然有機栄養源混合物に含まれる成
分の中で微量ながらヒアルロン酸生産に必須であるもの
について、天然有機栄養源の最小必要量として詳細に検
討した。アルギニン、グルタミン、セリン、グリシン、
メチオニン、イソロイシン、ロイシン及びリジンの８種
類のアミノ酸は十分量添加し、天然有機栄養源としての
酵母エキス及びポリペプトンは段階的の濃度となるよう
に調整し、その培養液から得られるヒアルロン酸の収量
を比較した。ヒアルロン酸の収量は天然有機栄養源とし
て酵母エキスが０. １７％、ポリペプトンが０. ５％以
上でおよそ７．５ｇ／ｌと変わらなかった。しかし、そ
れより低い濃度では微量な金属やビタミンの影響と考え
られる制限によりヒアルロン酸収量は低下した。酵母エ
キス及びポリペプトン濃度と収量の関係の結果を表２に
示す。

【００１４】

【表２】

【００１５】さらに、アルギニン、グルタミン、セリ
ン、グリシン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン及
びリジンの８種類のいずれか１つのアミノ酸が不足して
もヒアルロン酸収量がおよそ７．５ｇ／ｌから４．５ｇ
／ｌまで低下することがわかり、従来、ヒアルロン酸生
産に有効であるとされているアルギニンやグルタミン単
独では収量の維持は出来なかった。

【００１６】次に精製工程の負荷について天然有機栄養
源に由来する培養液の着色度に着目して詳細に検討し
た。培地の着色は主に天然有機栄養源、例えばポリペプ
トンや酵母エキスに由来し、その量は直接に精製工程の
負荷につながる。（Ａ）天然有機栄養源として酵母エキ
ス０. １７％、ポリペプトン０. ５％、そして、アルギ
ニン、グルタミン、セリン、グリシン、メチオニン、イ
ソロイシン、ロイシン及びリジンの８種類のアミノ酸を
加えた培地と（Ｂ）酵母エキス０. ５％、ポリペプトン
１. ５％を含む培地を例として培養液の着色度を比較し
た。それぞれの培地で培養した培養液を塩酸でｐＨ４に
調整後、活性炭処理し、ろ過により除菌して着色度を５
５０ｎｍの吸光度より求めたところ、（Ａ）の培地は
０．０００と無色透明であり、（Ｂ）の培地は０．０３
５であった。吸光度がおよそ１／３まで低下したことよ
り精製工程の負荷を大幅に軽減できることが示された。

【００１７】

【実施例】以下、本発明を実施例により、更に具体的に
説明するが、本発明はこれらに限定されない。

【００１８】実施例１ グルコース５％、リン酸第２カリウム０. ２％、ポリペ
プトン０. ５％、酵母エキス０. １７％、アルギニン
０. ２％、グルタミン０. ２％、メチオニン０.０５
％、セリン０. ０５％、グリシン０. ０５％、イソロイ
シン０. ０５％、ロイシン０. ０５％、リジン０. ０１
％からなる培地に前培養したストレプトコッカス・エキ
ＦＭ−１００（微工研条寄第９０２７号）を接種し、
通気量１ｖｖｍ、撹拌２００回転／分、温度３３℃で水
酸化ナトリウムでｐＨを８. ５にコントロールしながら
培養した。終了時点での培養時間は１４時間であった。
培養液を塩酸でｐＨ４に調整後、蒸留水で２倍希釈し、
活性炭処理、ろ過により除菌した。得られた除菌液にエ
チルアルコールを加え、ヒアルロン酸ナトリウムを析出
せしめる。これをろ別した後、水に溶解し、セチルピリ
ジニウムクロライドを加え、生じた沈澱をろ取し、２％
食塩水に再溶解後、再びエチルアルコールによる析出を
繰り返す。得られたヒアルロン酸ナトリウムを室温で減
圧乾燥して、培養液１Ｌ当たり白色のヒアルロン酸ナト
リウム７. ５ｇを得た。対糖収率は１５. ０％であっ
た。また、培養液を塩酸でｐＨ４に調整後、活性炭処理
を行なった時点に於ける５５０ｎｍの吸光度は０．００
０で無色であった。結果を表３に示す。

【００１９】実施例２ ヒアルロン酸産生能を有する微生物として、ストレプト
コッカス・エキ ＦＭ−３００（微工研条寄第２３１９
号）を用いる以外は、実施例１と同様の条件で実施し
た。結果を表３に示す。

【００２０】比較例１〜８ グルコース５％、リン酸第２カリウム０. ２％、ポリペ
プトン０. ５％、酵母エキス０. １７％、アルギニン
０. ２％、グルタミン０. ２％、メチオニン０.０５
％、セリン０. ０５％、グリシン０. ０５％、イソロイ
シン０. ０５％、ロイシン０. ０５％、リジン０. ０５
％からなる培地よりアルギニン、グルタミン、メチオニ
ン、セリン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、リジ
ンの１つを欠いた培地に前培養したストレプトコッカス
・エキ ＦＭ−１００（微工研条寄第９０２７号）を接
種し、培養した。培養終了後は実施例と同様な方法で精
製し、結果は表３に示した通り、各アミノ酸を１種でも
欠いた培地では収量が劣っていた。

【００２１】比較例９ グルコース５％、リン酸第２カリウム０. ２％、ポリペ
プトン１. ５％、酵母エキス０. ５％、からなる培地に
前培養したストレプトコッカス・エキ ＦＭ−１００
（微工研条寄第９０２７号）を接種し、通気量１ｖｖ
ｍ、撹拌２００回転／分、温度３３℃で苛性ソーダでｐ
Ｈを８. ５にコントロールしながら培養した。終了時点
での培養時間は１４時間であった。培養液を塩酸でｐＨ
４に調整後、実施例１と同様な活性炭処理を行ない５５
０ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度は０．０３５
で着色していた。結果を表３に示す。

【００２２】

【表３】

【００２３】

【発明の効果】本発明によれば、下記のような効果があ
るのでヒアルロン酸の工業的な製造法として極めて有用
である。 アルギニン、グルタミン、メチオニン、セリン、グリ
シン、イソロイシン、ロイシン及びリジンの８つのアミ
ノ酸を適量添加することで、天然有機栄養源混合物を減
らすことができ、天然有機栄養源混合物を多量に用いた
培養方法と同様に高収量ヒアルロン酸ナトリウムを得る
ことができる。 天然有機栄養源を少なくすることでヒアルロン酸の分
離、精製工程の負荷を大幅に軽減できる。 ヒアルロン酸生産に必要な栄養源を添加することで天
然栄養源中の成分のばらつきに影響されることがなくな
り培養収量が安定化し、管理が容易にできる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 三好 照三 東京都町田市旭町３丁目５番１号 電気化 学工業株式会社総合研究所内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒアルロン酸産生能を有する微生物を、
   培養液中にアルギニン、グルタミン、セリン、グリシ
   ン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン及びリジンの
   ８種のアミノ酸を添加して培養することを特徴とする発
   酵法によるヒアルロン酸の製造方法。
2. 【請求項２】 ヒアルロン酸産生能を有する微生物がス
   トレプトコッカス属細菌である請求項１記載のヒアルロ
   ン酸の製造方法。
3. 【請求項３】 ストレプトコッカス属細菌がストレプト
   コッカス・エキ、ストレプトコッカス・エキの変異株Ｆ
   Ｍ−１００（微工研条寄第９０２７号）及びストレプト
   コッカス・エキの変異株ＦＭ−３００（微工研条寄第２
   ３１９号）から選ばれた１種である請求項２記載のヒア
   ルロン酸の製造方法。