JPH0956394A - 連鎖球菌を用いた発酵によるヒアルロン酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 連鎖球菌を用いた発酵によるヒアルロン酸の
製造方法を提供する。 【構成】 ストレプトコッカスズーエピデミカス属また
はストレプトコッカスイクイ属の微生物の深部培養にお
ける培養と、該微生物の不活性化と、ヒアルロン酸の単
離とからなるヒアルロン酸の製造方法において、培養
を、二価の鉄イオンの存在下に行うことを特徴とする方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、連鎖球菌属の微生物の
深部培養によるヒアルロン酸の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒアルロン酸は、等モル比で存在するＮ
−アセチルグルコサミンとグルクロン酸とからなる巨大
分子であり、その供給源によって、数万から数百万ダル
トン（Ｄ）の分子量を有する。実際、ヒアルロン酸は、
それが、動物の結合組織の細胞外マトリックスの一成分
である限り、自然界、特に高等生物の中に広く分布する
物質である。また、これは、臍帯、眼、哺乳動物の関節
嚢、軟骨や雉類の鳥冠に豊富に存在する。にもかかわら
ず、天然由来の生成物が、非常に多くの場合、蛋白質で
汚染された状態得られると云う事実とともに、これらの
材料の入手の可能性が限られていること、抽出が困難で
あること、並びに収率がむしろ低いことから、プロセス
のより高い収率と、抽出及び精製がはるかに容易である
ことによって、高分子量を有する純度の高い生成物を、
低生産費用で提供し得るような代替の供給源を求めて、
調査が鼓舞されてきた。

【０００３】従来、ヒアルロン酸を製造するバクテリア
種の能力については、記載されている。この性質を有す
る微生物の殆ど全ては、連鎖球菌属（例えば、ストレプ
トコッカスイクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑ
ｕｉ）、ストレプトコッカスイクイシミリス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、スト
レプトコッカスズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）、ストレプト
コッカスジスガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、パス
ツレラ属（例えば、パスツレラムルトシダ（Ｐａｓｔｅ
ｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ））、またはシュー
ドモナス属（例えば、シュードモナスアエルギノーザ
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））
に属している。

【０００４】ストレプトコッカスイクイやヒアルロン酸
の大規模生産に最も頻繁に使用される他の微生物と同様
に、ストレプトコッカスズーエピデミカスは、通常、動
物における感染を伴う菌株を包含するランシフィールド
（Ｌａｎｃｅｆｉｅｌｄ）分類のＣ群に属する。製造プ
ロセスでこれらの菌株を用いることは、化膿連鎖球菌の
ようなランシフィールド分類のＡ群に属する菌株を用い
る場合よりも危険が少ない。

【０００５】連鎖球菌は、多くの病原性微生物に共通な
特徴的な溶血現象を引き起こし得る。

【０００６】この現象は、製造されるヒアルロン酸が、
β−溶血素によって汚染され得ると云う事実を伴ってお
り、かかる汚染は、注意深く精製されなかった生成物の
使用を大変危険なものとする。

【０００７】溶血素の製造と同様に、ヒアルロニダーゼ
の生合成も、有毒の病原性連鎖球菌株の不変の特徴であ
り、これは、更なる問題、即ち、所望の生成物の価値の
低下の原因となる。

【０００８】栄養上の観点からは、病原性連鎖球菌は、
最も要求の厳しい微生物の１つとして考慮すべきもので
ある。この理由のために、菌株は、例えば、牛の脳や心
臓のような臓器のエキスや注液を基にした脳−心臓注液
肉汁寒天培地（ＢＨＩＡ）やトリプチケース大豆肉汁寒
天培地（ＴＳＡ）のような複合培地上に維持される。適
当な炭素源や無機塩に加え、発酵培地は、微生物が、自
主的には合成できないような最適量のアミノ酸、ビタミ
ン、プリン塩基やピリミジン塩基を供給できるような複
合原料を含まねばならないことは明白である。実際、バ
イオマスの豊富な開発は、ヒアルロン酸の確実な製造に
とって、不可欠な前提である。

【０００９】主な炭素供給源は、一般に、１０〜１００
ｇ／ｌの濃度のグルコース、果糖、ラフィノースまたは
マンニトールであり、これらには、１〜２０ｇ／ｌ、好
ましくは５〜１０ｇ／ｌの濃度の酢酸、アスパラギン
酸、グルタミン酸、リンゴ酸、オキサル酢酸のような有
機酸を加えることができる。多量の炭化水素を使用する
場合、発酵期間中、濃厚溶液として徐々に加えることが
できる。炭化水素の補足的添加を何時実施するかは、微
生物の確実な増殖並びにヒアルロン酸の確実な製造にと
って非常に重要なことである。

【００１０】糖類の代謝は、酸性物質（主に、乳酸や酢
酸）の生成を伴い、その蓄積は、微生物の増殖を阻害す
るような値まで、かなり急速にｐＨを低下してしまう。

【００１１】ストレプトコッカスズーエピデミカスを用
いたヒアルロン酸の発酵において、複合原料の演じる役
割の重要性については、既に指摘されている。中でも、
培養に都合よく用いることのできるエキスとして、我々
は、肉エキスや血液の蛋白エキスのような動物由来のエ
キス、又は、酵母エキスのような微生物由来のエキスを
挙げる。また、酵母自己分解物、トウモロコシ浸漬液や
カゼイン水解物ような種々の由来の分解物や水解物、血
液、肉、肝臓、大豆、カゼインや脱脂乳からのペプトン
のようなペプトン類は、非常に良好な結果をもたらす。
これら物質の最適濃度は、使用する菌株によって変わる
が、一般には、５〜５０ｇ／ｌである。不耐熱性の成分
を含む物質の場合、加熱は、培地の栄養特性を、時とし
て急激に減じることがある。このため、完全に無菌のプ
ロセスを実施しできることの保証をはっきりと減じるこ
となしに、培地に移行させる最低熱量を決定するために
は、発酵槽の滅菌プロフィールを注意深く研究する必要
がある。

【００１２】発酵プロセスを改善する意図において、極
めて有用な方法は、基質から所望の最終生成物に至るま
での代謝経路を研究することである。即ち、”培地の改
良”の段階を開始するために、微生物の生活には不可欠
な他の代謝経路を抑制することなしに、生合成プロセス
において、有用な物質の収率の実質的向上を助長し得る
ような基質や栄養要素について評価を実施する。

【００１３】通常、発酵の終わりに、酸を肉汁培養物に
加えることによって、微生物の不活性化を行う。一般的
には、これらの操作には、トリクロロ酢酸が好ましい。
大規模でこの酸を使用する場合、以下に述べるような不
都合があることが判明した。 （１）この酸を含有する廃棄物の生態的分解において、
高塩素含有量に基づく重大な問題。 （２）発酵終了時に測定した値並びに生成物の単離が観
測された後に見られる値からの著しい平均分子量の低
下。時間が長くなる程、又、作業温度が高くなる程、こ
の現象は、顕著である。

【００１４】大規模生産に有効に適用できるヒアルロン
酸の回収及び精製に従来利用されてきた主たる技術は、
次の通りである： （ａ）低分子量の不純物の除去、または分子量を基にし
た生成物の分別を実施するための限外ろ過（例えば、Ｗ
Ｏ９２／１８，５４３号、ＪＰ６３−０９４，９８８号
を参照）。 （ｂ）イオン交換樹脂によるクロマトグラフィー：ここ
では、付随する不純物の除去を可能にするために、通
常、ヒアルロン酸を樹脂に固定し、選択置換を実施する
ために、緩衝液を用いる溶出によって生成物を遊離する
（例えば、ＪＰ６３−２８９，１９８号を参照）。ある
場合には、２，０００，０００Ｄ以上の分子量を有する
部分だけが、樹脂上に残っているようなヒアルロン酸の
精製が記載されている（例えば、ＷＯ８９／０６，２４
３号を参照）。 （ｃ）第４アンモニウム塩としてヒアルロン酸の析出、
ろ過による単離、それに引き続く、Ｎａ^＋イオンの添加
によって再びヒアルロン酸ナトリウムを形成する溶液中
での塩の再溶解（例えば、ＪＰ２−９４７，１０１号、
ＪＰ６３−２７０，７０１号を参照）。

【００１５】イオン交換クロマトグラフィーによってヒ
アルロン酸の最終精製を行う場合、以下のような欠点が
ある。 （１）単離のために試薬を使用し、使用した試薬は、例
えば、溶媒による析出のような更なる精製のために、ヒ
アルロン酸から分離しなければならない。 （２）ヒアルロン酸の単離の期間中、溶出した溶液の粘
度が大幅に変化し、このことによって、流れの減少が起
こり、カラム圧のわづかではない上昇が起こる。 （３）量的関心事のレベルでのヒアルロン酸の溶出が、
ヒアルロン酸の濃度の低下を起こし、析出のために溶媒
を相当量使用することを要求することになる。

【００１６】

【発明が解決しようとする課題】従来技術を総括する
と、微生物学的経路、特に、ストレプトコッカスズーエ
ピデミカス属やストレプトコッカスイクイ属の使用によ
るヒアルロン酸の製造分野における専門家にとっての現
在の課題は、それ故、次の通りである。 （ａ）β−溶血素やヒアルロニダーゼによる汚染。 （ｂ）高分子量を有し、劣化によって誘導される副生成
物のないヒアルロン酸の製造。 （ｃ）ヒアルロン酸の収率の関数としての培地の最適
化。 （ｄ）製薬的に許容される条件下での最終生成物の製
造、あるいは、代わりなるべきものとして、無菌で、非
発熱性の生成物の保証。 （ｅ）依然として困難である精製過程。

【００１７】ストレプトコッカスズーエピデミカス属ま
たはストレプトコッカスイクイ属の微生物の深部培養の
手段によるヒアルロン酸の製造方法を提供する本発明に
よって、これらの課題は、解決された。本発明方法によ
って得られるヒアルロン酸は、β−溶血素を含まず、安
定であり、高い分子量を有しており、高純度である。

【００１８】

【課題を解決するための手段】本発明の主題は、ストレ
プトコッカスズーエピデミカス属またはストレプトコッ
カスイクイ属の微生物の培養と、微生物の不活性化と、
ヒアルロン酸の単離とからなるヒアルロン酸の製造方法
において、微生物の培養を、二価の鉄イオンの存在下に
行うことを特徴とする方法である。

【００１９】さらに、突然変異誘発と選択のサイクルを
反復した後、本出願人が得たものであって、本発明方法
に用いられ、そして、β−溶血素を含まないこととは別
に、高分子量を特徴とするヒアルロン酸を非常に高い収
率で製造することができるストレプトコッカスズーエピ
デミカス株を単離した。

【００２０】ここに、ＵＶ１と呼ぶ突然変異菌株は、Ｃ
ＮＣＭに、１９９４年７月２１日付けで、受け入れ番号
Ｉ−１４４８号で寄託されたものであり、本発明のもう
一つの主題である。

【００２１】本発明のさらにもう一つの主題は、ＵＶ１
菌株の培養を特徴とする上記方法である。

【００２２】

【発明の実施の形態】本発明では、コレクションから獲
得できる微生物、即ち、ストレプトコッカスズーエピデ
ミカスまたはストレプトコッカスイクイ、を培養するこ
とによって、ヒアルロン酸の製造方法を実施する。

【００２３】培養は、この種の微生物に適しており、そ
の組成が、当業者に既知である栄養培地中で、深部培養
の慣用技術に従って行われる。

【００２４】驚くべきことに、第一鉄イオンを培地に添
加することによって、β−溶血素の製造が抑制されるこ
とが判明した。それ故、本発明によれば、発酵培地に対
して、亜硫酸塩、硫酸塩、塩化物、弗化物、硝酸塩、塩
素酸塩やリン酸塩のような鉄の無機塩を、溶液中の第一
鉄（Ｆｅ^＋＋）イオンの濃度が、１〜１００ｍｇ／ｌ、
好ましくは５〜５０ｍｇ／ｌになるような量加える。驚
くべきことに、かかる濃度においては、ストレプトコッ
カスズーエピデミカスの特殊な鉄摂取システムの発現機
構、特にβ−溶血素の合成、を抑制することができる。
この方法では、β−溶血素汚染物を含まない生成物を得
ることが可能となり、このことは、ヒアルロン酸の精製
プロセスと最終特性にとって、大いに有利である。

【００２５】驚くべきことに、過剰量のＦｅ^＋＋イオン
の存在下では、発酵の終了時、溶血素を含まないことと
は別に、肉汁は、鉄を含まないこと以外は、同一の培地
で得られるものよりも高い分子量のヒアルロン酸を含
む。培地中の過剰量の第一鉄イオンの存在、並びに発酵
肉汁の粘度を常にモニターして警戒することによって、
製造されるヒアルロン酸の量と分子量の両者を最適化す
ることが可能となる。

【００２６】第一の好ましい様態においては、本発明方
法は、ストレプトコッカスズーエピデミカスのＵＶ１菌
株を用いて実施される。

【００２７】該菌株は、野生株の突然変異によって、本
出願人が得たものである。

【００２８】ＵＶ１菌株の生化学的特性を、次に挙げ
る。

【表１】

【００２９】

【表２】

【００３０】ストレプトコッカスズーエピデミカスのＵ
Ｖ１菌株は、脳−心臓注液肉汁培地（ＢＨＩＢ）やトリ
プチケース大豆肉汁培地（ＴＳＢ）のような複合液体培
地やこれらに対応する寒天培地（例えば、ＢＨＩＡやＴ
ＳＡ）上で急速に増殖する。これらの固体培地上では、
３０℃の温度で２４〜３６時間増殖した後、菌株は、通
常の突然変異を起こしていない菌株よりも粘稠な稠度の
円形で、半透明のコロニーを示す。それ故、突然変異
は、ヒアルロン酸のより高い生産性の点で立証される。

【００３１】ここに記載する菌株は、固体寒天−血液培
地上で確実な展開を示し（３０℃で２４時間以内）、こ
こでは、連鎖球菌の特徴的なβ−溶血素反応が、非常に
明白な形で示される。

【００３２】第二の様態によれば、本発明の主旨である
方法は、バイオマスの製造を最適化すると云う目的をも
って、炭化水素を、接種の時点、溶解酸素が最低レベル
に到達後、３０分経過の時点、及び２回目の添加後、６
時間経過の時点の３回の分別添加すると云う特殊なサイ
クルを提供する。このサイクルによって、バイオマスの
製造、それ故、ヒアルロン酸の製造を最大にすることが
できる。

【００３３】有利的には、肉汁培養物のｐＨを、６．５
±１．０ユニットの範囲、好ましくは６．５〜７．５ユ
ニットの範囲に維持しながら、連続的に制御する。通
常、補正は、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムのよう
なアルカリの濃厚水溶液の手段で行うが、増殖期間中に
も実施することができる。代わるべき方法としては、粉
末炭酸カルシウムや他の方法を用いることもできる。

【００３４】発酵中のみならず、製造発酵槽への接種に
先んじる増殖培養期間（シード）中にも採用されるこの
手段は、高いバイオマス含有量を持ち、その結果、次の
発酵段階での誘導期を短縮することになる、指数増殖期
での完全な活力の接種材料を手配することを可能ならし
める。

【００３５】バイオマスの増殖において、予期せざる結
果をもたらす更なる処理方法は、発酵槽内の背圧を、
０．１〜３．５バールの値に上昇させることである。如
何なる理論的考慮にも拘束されることを望まずに、この
現象の一つの可能な、しかし、網羅的ではない説明を、
水性培地中のＣＯ_２の溶解度に求めることができる。微
生物の増殖は、ヒアルロン酸の製造プロセス中、深部培
養において起こるので、培地に対して、バクテリアによ
って製造されるＣＯ_２の一定の除去をもたらす強制的な
連続曝気を行う。それによって、背圧が、水性培地中に
溶解したこのガスの量の増加を可能にするものと推定さ
れる。

【００３６】また、接種前の栄養培地の滅菌の問題もあ
る。栄養物質の多くは、不耐熱性であるため、この段階
は、収率の点で重要である。

【００３７】本発明によれば、滅菌サイクルを、１２０
℃を超えない温度で、最大３０分間実施することによ
り、収率の点で、全く予期せざる結果を得る。

【００３８】さらに、本発明は、培地の最適化の問題に
も立ち向かった。

【００３９】この観点から、驚くべきことに、発酵培地
へのウラシルの添加によって達成することができる、細
胞内貯槽中のＵＴＰ濃度の増加が、有用であることが判
った。また、驚くべきことに、同様の好結果が、グルタ
ミンやアスパラギン酸を培地に添加することによっても
得られた。我々は、ヒアルロン酸の製造において、上記
三種類の分子（ウラシル、アスパラギン酸、グルタミ
ン）を、ストレプトコッカスズーエピデミカス、好まし
くはＵＶ１菌株の発酵培地に加えることによって、これ
らを加えない場合のそれよりも２０〜２５％高い収率を
効率よく達成した。かかる結果を達成するため有用なこ
れら３つの物資の濃度は、０．０１〜１０ｇ／ｌ、好ま
しくは０．５〜３ｇ／ｌである。

【００４０】酸を培地に加えることによって、微生物の
不活性化をなし得ることが知られている。

【００４１】前述の如く、トリクロロ酢酸を添加する従
来の方法は、廃棄物処理や最終生成物の保全性において
問題を含んでいる。

【００４２】これらの問題を解消するための試みにおい
て、微生物の不活性化を行うために、硫酸、リン酸、次
亜リン酸、乳酸、酒石酸のような各種の酸が使用され
た。この中で、平均分子量の値を維持する点において
は、ｐＨが、４．８以下に到達するまで加えられる次亜
リン酸が、最も有利であることが判明した。

【００４３】驚くべきことに、発酵肉汁の滅菌の後、ヒ
アルロン酸を含む溶液から微生物の細胞を、精密ろ過膜
上の接線ろ過によって取り除く試みにおいて、所望の生
成物は、膜を透過しないが、ヒアルロン酸ナトリウム溶
液は、細胞によって濃縮されることが確認された。精密
ろ過の操作は、０．０５〜５μｍの多孔率を有する高分
子たはセラミック材料又は焼結金属の膜によって実施し
た。

【００４４】このヒアルロン酸とその塩を保持すると云
う精密ろ過膜の予見できなかった能力は、プロセスの経
済性にとって大変有利である。何故ならば、低い相対操
作費用でヒアルロン酸の極めて純粋な溶液を得ることが
可能となり、これは、かなり控えめな装置で達成できる
からである。

【００４５】この方法によって、単離後、残留蛋白質の
量が０．０３％以下の乾燥物を９５％以上含む生成物が
得られる。

【００４６】もう１つの実験シリーズでは、陽イオン性
のＨ^＋型のイオン交換樹脂の第一床、それに続く陰イオ
ン型の樹脂床の組み合わせを通過させて、蛋白質とその
他の付随物質を除去することによって、ヒアルロン酸が
精製されることが判った。この実験において、予見でき
なかった新規な現象は、如何なる分子量のヒアルロン酸
も床に固定されず、変化することなく両方の床を通過す
ることであり、その一方、Ｈ^＋型の樹脂上に専ら残留す
る蛋白質のような不純物は、固定されて残留することで
ある。この効果は著しく、処理を、カラムではなく、攪
拌バッチ式反応器でも実施できる程である。

【００４７】さらなる様態によれば、固体生成物を、減
圧下の凍結乾燥、噴霧または熱暴露によって行われる乾
燥に至るまで、何等単離することなしに直接肉汁培養溶
液から得ることができる。

【００４８】クロマトグラフィーか精密ろ過の何れかに
よって得た溶液から、凍結乾燥によってナトリウム塩と
して、あるいは噴霧器の作用によって直接ヒアルロン酸
を回収することができる。これらの条件下で得たヒアル
ロン酸ナトリウムは、商業化できる程十分に純粋であ
る。高純度（＜９８％）のヒアルロン酸ナトリウムを所
望する場合には、１〜２％の溶液が得られるまで、溶液
を精密ろ過によって濃縮し、それから、エタノール、イ
ソプロパノール、アセトンのような溶媒を用いて、ヒア
ルロン酸ナトリウムを沈澱する。沈澱物の形成は、塩化
物、硫酸塩、リン酸塩のようなナトリウム塩、好ましく
は酢酸塩や有機酸の他のアニオンを加えることによっ
て、促進することができる。

【００４９】ヒアルロン酸の製造と精製物の回収処理の
間に、溶液の白濁化の増加と共に、平均分子量の著しい
減少（約１，５００，０００Ｄから約６００，０００Ｄ
へ）が起こる。アルコールまたはケトン溶媒、フェノー
ル性官能基を有する物質、あるいはイオン性または非イ
オン性物質を加えることによって、期間中、ヒアルロン
酸溶液を清澄に保ち、バクテリア汚染を防止しながら、
この現象を防ぐことができる。

【００５０】

【実施例】以下の実施例により、本発明をさらに説明す
る。

【００５１】実施例１ ＮａＯＨを添加することにより、デキストロース３０ｇ
／ｌ、ペプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス１０ｇ／ｌ、一
塩基性リン酸カリウム１０ｇ／ｌ、酢酸ナトリウム７ｇ
／ｌ、重炭酸ナトリウム５ｇ／ｌ、硫酸第一鉄１０ｍｇ
／ｌ、硫酸マグネシウム３００ｍｇ／ｌ、硫酸マンガン
８ｍｇ／ｌ、塩化カルシウム８０ｍｇ／ｌ及び泡止剤１
００ｍｇ／ｌから調製した培地をｐＨ７．００に調整
し、次いで、１２１℃で２０分間、滅菌する。接種に
は、コレクションから得たストレプトコッカスズーエピ
デミカスの培養物の２．５％濃度を採用する。発酵は、
ＮａＯＨの連続自動添加によってｐＨを７．００に維持
しながら、３７℃で約２４時間行う。接種時、デキスト
ロースの３３％を加え、残部は、連続的に投与する。Ｈ
ＰＬＣ分析によって決定したプロセスの収率は、０．８
ｇ／ｌであり、平均分子量は、５００，０００Ｄ前後と
推定される。

【００５２】実施例２ ＵＶ１と名付けた突然変異を起こした選択ストレプトコ
ッカスズーエピデミカスを用いて接種を行う以外は、実
施例１と同様の方法で、発酵を行う。上記のように決定
したプロセスの収率は、１．５ｇ／ｌであり、平均分子
量は、８００，０００Ｄである。

【００５３】実施例３ 硫酸第一鉄の量を、８時間後及び１６時間後の２回の添
加によって３倍とする以外は、実施例１と同様の方法
で、発酵を行う。収率は、１．４ｇ／ｌであるが、平均
分子量は、１，５００，０００Ｄ〜２，５００，０００
Ｄである。最終肉汁は、連鎖球菌溶血素を含まないこと
も判明する。

【００５４】実施例４ ＮａＯＨの連続添加によって、接種物をｐＨ７．００に
維持する以外は、実施例１の方法を実施する。これによ
って、接種物のバイオマスは、２倍となる。全発酵を促
進し、発酵後、２０時間経過時の等平均分子量での収率
は、１．８ｇ／ｌである。

【００５５】実施例５ 背圧を、０．６バールに維持する以外は、実施例１の方
法を実施する。等平均分子量での収率は、約１０％増加
する。

【００５６】実施例６ 生殖能力を保つために、培養肉汁の熱処理を、１１０℃
で１０分間に減少する以外は、実施例１と同様な方法
で、発酵を行う。等平均分子量での収率は、２．８ｇ／
ｌである。

【００５７】実施例７ 発酵における代謝プレカーサーの影響を調査する。同一
の接種物を、実施例１で操作した４つの発酵槽に区分け
し、それぞれに、ウラシル２ｇ／ｌ、アスパラギン酸２
ｇ／ｌ、ダルタミン２ｇ／ｌを，さらに、２ｇ／ｌの同
じ濃度の３種類のプレカーサーを同時に初期の培地に加
える。等平均分子量での得られた結果は、次の通りであ
る。 （ａ）初期の培地＋ウラシル ３．３ｇ／ｌ （ｂ）初期の培地＋アスパラギン酸 ３．０ｇ／ｌ （ｃ）初期の培地＋グルタミン ２．９ｇ／ｌ

【００５８】３種類のプレカーサー全部を加えた場合、
小さな向上（２〜３％）が得られる。

【００５９】実施例８ グルコースを、接種時に１／３、培養物の嫌気性条件に
到達後、１時間経過時に１／３、２回目の添加後、５〜
６時間経過時に残りの１／３を加える以外は、実施例７
−（ａ）の方法を実施する。平均分子量が２，０００，
０００Ｄ以上での発酵収率は、３．５ｇ／ｌである。

【００６０】実施例９ 次亜リン酸を加えてｐＨを３．５まで低下することによ
って、実施例８の条件下で得た肉汁培養物のバクテリア
の不活性化を行う。連鎖球菌の活性の消失は、中性ｐＨ
を回復した後、平板試験（ｐｌａｔｅ ｔｅｓｔ）によ
って評価する。

【００６１】この目的のために、種々の有機酸と無機酸
を試験した。不活性化効率及び粘度測定によるポリマー
の崩壊への影響を、下記の表に示す。

【００６２】

【表３】

【００６３】実施例１０ （ａ）次亜リン酸によってｐＨ３．５に酸性化し、フィ
ルターの助けでヒアルロン酸５ｇを含有する発酵肉汁の
一部から、ろ過並びにフィルターの水洗によって不溶解
物を除去する。粗生成物の沈澱を誘起するために、アセ
トンをろ液に加え、母液を除去した後、５％のアセトン
の存在下、完全な溶液が得られるまで、沈澱物を水に再
溶解する。このようにして得た溶液を、Ｈ^＋型の強陽イ
オン樹脂ＩＭＡＣ Ｃ１６Ｐを充填したカラムに通す。
処理溶液を、ＯＨ型の強陰イオン樹脂ＩＲＡ ９００を
充填した第２のカラムに通す。４０℃に温めた溶液に、
酢酸ナトリウム２０ｇを加え、次いで、ヒアルロン酸の
沈澱をナトリウム塩として得るために、エタノールを加
える。沈澱物をろ過し、エタノールで洗浄し、減圧乾燥
して、下記特性プロフィールを有する生成物４ｇを得
る。 乾燥生成物含有量： 約９８％ 残留蛋白質含有量： 約０．１％（溶血素試験： 陰性） 平均分子量： ＞１，５００，０００Ｄ ０．２％溶液の透過率： ９９．８％

【００６４】（ｂ）平均分子量が２００，０００Ｄ未満
の粗ヒアルロン酸５ｇを含有する溶液を、実施例１０−
（ａ）と同様の条件で処理して、下記特性プロフィール
を有するヒアルロン酸４，３ｇを得る。 乾燥生成物含有量： 約９８％ 残留蛋白質含有量： ０．０５％ 平均分子量： １８０，０００Ｄ ０．２％溶液の透過率： ９５％

【００６５】実施例１１ 樹脂の処理前に、５％のアセトンの生成物溶液への添加
を行わない以外は、実施例１０−（ａ）の試験を反復し
て、下記特性プロフィールを有するヒアルロン酸４ｇを
得る。 乾燥生成物含有量： 約９８％ 残留蛋白質含有量： ０．１％ 平均分子量： ６５０，０００Ｄ ０．２％溶液の透過率： ９５％

【００６６】実施例１２ 実施例１０に述べた条件下で粗生成物を沈澱した後、１
０％のアセトンを含む水に再溶解する。このようにして
得た溶液に、精密ろ過膜上の接線ろ過を施す。この間、
ろ過ループ中の高い線速度を維持するように注意を払い
つつ、大きい透過流を得るために、線速度を制御する。
蛋白質と無機塩を含有し、ヒアルロン酸を含まない、膜
を横断する透過物の流出が生じる。透過物が、残留物を
含まなくなるまで、精製すべき混合物に対して、初期の
容量を回復するような割合で、水を連続的に供給する。
その後、実施例２での生成物の単離処理を行う前に、溶
液を、約１％にまで濃縮する。特性は、次の通りであ
る。 乾燥生成物含有量： ＞９６％ 残留蛋白質含有量： 約０．１％ 平均分子量： ＞１，５００，０００Ｄ ０．２％溶液の透過率： ＞９９．５％

【００６７】実施例１３ ろ過前に、溶液への溶媒の添加を行わない以外は、実施
例１２の条件下での試験を反復して、下記特性を有する
生成物を得る。 乾燥生成物含有量： ＞９６％ 残留蛋白質含有量： 約０．１％ 平均分子量： ６００，０００Ｄ ０．２％溶液の透過率： ９１％

【００６８】実施例１４ ２種類の樹脂で処理した溶液に、−４０℃で４時間凍結
し、最大加熱温度が３０℃までの非常にゆっくりとした
凍結乾燥サイクルを用いて、平板上で凍結乾燥を施す以
外は、実施例１０の条件下での試験を反復する。このよ
うな条件下で、下記特性パターンを示す生成物４．５ｇ
を得る。 乾燥生成物含有量： ＞９４％ 残留蛋白質含有量： ＜０．３％ 平均分子量： 約１，５００，０００Ｄ ０．２％溶液の透過率： ９９．８％

【００６９】実施例１５ 実施例１４において、バルクの代わりに、小瓶中で凍結
乾燥を実施する。タイプＩの無彩色ガラスを用い、この
上に、ストッパーを設置する。操作の終了時に、不活性
ガス雰囲気中で、小瓶を密封する。ヒアルロン酸の収率
と特性は、実施例１４の条件に従って得た生成物のそれ
と全く同等である。

【００７０】実施例１６ 実施例１２の条件に従って得たヒアルロン酸溶液に、実
施例１４の条件に従う凍結乾燥を施して、下記特性を有
するヒアルロン酸４．５ｇを得る。 乾燥生成物含有量： ＞９３％ 残留蛋白質含有量： ＜０．３％ 平均分子量： 約１，５００，０００Ｄ ０．２％溶液の透過率： ＞９９．８％

【００７１】実施例１７ 実施例１２の条件に従って得たヒアルロン酸溶液に、ス
プレードライヤーの作用を施して、実施例１６で得た生
成物に等しい特性を有する生成物を、同収率で得る。

【００７２】実施例１８ 樹脂上で精製を行った後、溶液を精密ろ過装置に供給
し、そこで、透過物の乾燥残留物が消失するまで、溶液
を濃縮して、初期の容量を回復すること以外は、実施例
１０の条件下で、試験を実施する。２％の濃度に到達す
るまで、操作を継続し、次いで、実施例１４と実施例１
５の条件下で、溶液に凍結乾燥を施す。処理の終了時
に、下記特性を有するヒアルロン酸４ｇを得る。 乾燥生成物含有量： ＞９８％ 残留蛋白質含有量： 約０．１％ 平均分子量： 約１，５００，０００Ｄ ０．２％溶液の透過率： ＞９９．８％

【００７３】実施例１９ 大豆レシチン１ｇ，コレステロール０．５ｇ、ミリスチ
ン酸イソプロピル３．５ｇ及びトコフェロールアセテー
ト０．０２ｇを、最小量のエタノールに溶解する。この
溶液を、ＥＤＴＡジナトリウム０．１ｇを含む水溶液約
６０ｍｌ中に、攪拌しながら分散する。このようにして
得たリポソーム分散液に、メチルパラベンナトリウム
０．１５ｇ、高純度ヒアルロン酸ナトリウム０．１ｇ、
植物性グリコールエキス２ｇ、プロピレングリコール７
ｇ及び所望の粘度に到達するのに十分な量のカルボワッ
クスを加える。カニューレを備えた単一投与量容器に分
配したゲルは、良好な許容性のおかげで、乾燥に影響さ
れるような、病理学的または代謝異常条件の腟粘膜の処
置に適することが判明している。

【００７４】実施例２０ ヒアルロン酸ナトリウム０．１ｇを、メチルパラベンナ
トリウム０．１５ｇ、プロピルパラベンナトリウム０．
０１５ｇ及びポロキサマーＦ１２７（Ｐｏｌｏｘａｍｅ
ｒ Ｆ１２７）１５ｇを含む水溶液約９０ｍｌ中に、攪
拌しながら溶解する。得られた溶液に、植物性グリコー
ルエキス５ｇ、シリコーン誘導体１ｇ及びＨＰＭＣ１ｇ
を加える。溶液を、適当なデリバリコンテナーに充填す
る。このものは、プロペラントの使用に頼ることなく、
柔軟で、しかも持続性のある泡を発生することができ、
この泡は、良好な許容性のおかげで、皮膚、特に傷つい
た皮膚に対しても使用でき、また、カニューレによって
腟腔内へも移行することができる。

【００７５】実施例２１ ヒアルロン酸ナトリウム０．２ｇを、塩化ナトリウム
０．９ｇ及び必要量のリン酸緩衝液を含む水溶液中に、
撹拌しながら溶解する。溶液を、最終容量の１００ｍｌ
に調整した後、滅菌条件下、点滴注入に適した単一投与
量容器に充填する。

【００７６】

【発明の効果】記述した方法によって得られたヒアルロ
ン酸の純度が高いことは、優れた特性を有する製薬型及
び／又は化粧料型の製品への利用に対して、ヒアルロン
酸を理想的な候補とする。特許請求の範囲に記載した方
法は、すでに確認したように、耐性の問題が全くない生
成物を得ることを可能にする。そして、その使用は、通
常のレベルでも大いに効果的であるが、腟粘膜、鼻粘
膜、眼粘膜等のような過感作性の領域の処置に特に有利
であることが判明している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 カサレト エンリコ イタリア国 ロッツァノ クゥイント デ スタンピ ヴィア ヴォルトゥルノ 48 (72)発明者 レオーニ マッシモ イタリア国 ロッツァノ クゥイント デ スタンピ ヴィア ヴォルトゥルノ 48 (72)発明者 マニ アンブロージョ イタリア国 ロッツァノ クゥイント デ スタンピ ヴィア ヴォルトゥルノ 48 (72)発明者 ロンツィーオ エンリコ イタリア国 ロッツァノ クゥイント デ スタンピ ヴィア ヴォルトゥルノ 48

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ストレプトコッカスズーエピデミカス属
   またはストレプトコッカスイクイ属の微生物の深部培養
   における培養と、該微生物の不活性化と、ヒアルロン酸
   の単離とからなるヒアルロン酸の製造方法において、培
   養を、二価の鉄イオンの存在下に行うことを特徴とする
   方法。
2. 【請求項２】 該二価の鉄イオンの濃度が、１〜１００
   ｍｇ／ｌであることを特徴とする請求項１に記載された
   方法。
3. 【請求項３】 該二価の鉄イオンが、亜硫酸塩、硫酸
   塩、塩化物、弗化物、硝酸塩、塩素酸塩及びリン酸塩か
   らなる群から選ばれた塩の一つであることを特徴とする
   請求項１〜２に記載された方法。
4. 【請求項４】 培養を、ＣＮＣＭに、１９９４年７月２
   １日付けで、受け入れ番号Ｉ−１４４８号で寄託された
   ストレプトコッカスズーエピデミカス株を用いて行うこ
   とを特徴とする請求項１〜３に記載された方法。
5. 【請求項５】 炭素源の添加を、発酵サイクル中、以下
   に述べるように複数回行うことを特徴とする請求項１〜
   ４に記載された方法： イ）接種時、全体の２０％〜４０％を添加、 ロ）溶解酸素の最低レベルに到達後、１時間以内に、全
   体の２０％〜４０％を添加、および ハ）２回目の添加後、５〜６時間以内に、残部を添加。
6. 【請求項６】 培養肉汁のｐＨを、アルカリ塩基を加え
   ることによって６．５±１．０のｐＨ範囲に維持し、増
   殖期間中にも、これらの添加を行うことを特徴とする請
   求項１〜５に記載された方法。
7. 【請求項７】 微生物の全増殖期間中、発酵槽内のゲー
   ジ圧を０．１〜３．５バールに維持することを特徴とす
   る請求項１〜６に記載された方法。
8. 【請求項８】 増殖培地の複合原料の滅菌を、１２０℃
   未満の温度で、３０分以内行うことを特徴とする請求項
   １〜７に記載された方法。
9. 【請求項９】 以下の物質を、個別または２つ又は３つ
   組み合わせて発酵培地に加えることを特徴とする請求項
   １〜８に記載された方法： イ）０．０１〜１０ｇ／ｌの濃度のウラシル、 ロ）０．０１〜１０ｇ／ｌの濃度のアスパラギン酸、お
   よび ハ）０．０１〜１０ｇ／ｌの濃度のグルタミン。
10. 【請求項１０】 発酵サイクルの終わりに、ｐＨが４．
    ８より低くなるまで次亜リン酸を加えることによって微
    生物を不活性化することを特徴とする請求項１〜９に記
    載された方法。
11. 【請求項１１】 発酵培地中に含まれる栄養物質と複合
    体ならびに微生物の不活性化による可溶性残渣の除去
    を、セラミックまたは高分子材料又は焼結金属の膜、繊
    維またはカートリッジにおける垂直圧または接線流によ
    る１回または複数回の精密ろ過工程によって行うことを
    特徴とする請求項１〜１０に記載された方法。
12. 【請求項１２】 精密ろ過を、ヒアルロン酸またはその
    塩の溶液を濃縮する手段としても用いることができるこ
    とを特徴とする請求項１〜１１に記載された方法。
13. 【請求項１３】 精密ろ過構造の多孔率が、０．０５〜
    ５μｍ、好ましくは０．０５〜０．８μｍであることを
    特徴とする請求項１〜１２に記載された方法。
14. 【請求項１４】 ヒアルロン酸またはその塩の溶液を、
    イオン交換樹脂の床に通すことを特徴とする請求項１〜
    １３に記載された方法。
15. 【請求項１５】 イオン交換を、強陽イオン樹脂、それ
    に続く陰イオン樹脂を通して行うことを特徴とする請求
    項１４に記載された方法。
16. 【請求項１６】 樹脂による処理を、カラムまたは懸濁
    液中で行うことを特徴とする請求項１５に記載された方
    法。
17. 【請求項１７】 抽出プロセスまたはその一部を、被処
    理水溶液に直接加えた防腐物質の存在下に行うことを特
    徴とする請求項１〜１６に記載された方法。
18. 【請求項１８】 防腐作用を有する物質が、陰イオン
    性、陽イオン性または非イオン性の洗剤、アルコール、
    アルデヒド、ケトン、フェノール及びフェノール誘導体
    からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１７に
    記載された方法。
19. 【請求項１９】 固体生成物の回収を、減圧下の凍結乾
    燥、噴霧または熱暴露によって行われる乾燥後、単離す
    ることなしに直接肉汁培養溶液から行うことを特徴とす
    る請求項１〜１８に記載された方法。
20. 【請求項２０】 請求項１〜１９に記載された方法によ
    って得られる、β−溶血素を含まない高純度ヒアルロン
    酸。
21. 【請求項２１】 ＣＮＣＭに、１９９４年７月２１日付
    けで、受け入れ番号Ｉ−１４４８号で寄託されたストレ
    プトコッカスズーエピデミカス。