JPH0749440B2 - インターフェロン アルファー２結晶の製造方法 - Google Patents
インターフェロン アルファー２結晶の製造方法Info
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- JPH0749440B2 JPH0749440B2 JP3510285A JP51028591A JPH0749440B2 JP H0749440 B2 JPH0749440 B2 JP H0749440B2 JP 3510285 A JP3510285 A JP 3510285A JP 51028591 A JP51028591 A JP 51028591A JP H0749440 B2 JPH0749440 B2 JP H0749440B2
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- interferon
- alpha
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/56—IFN-alpha
-
- A—HUMAN NECESSITIES
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- Medicinal Preparation (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 ヒト インターフェロン アルファは少くとも24の亜種
を含む蛋白質の一群である、Zoon K.C.,Interferon 9,
1−12（1987）,Gresser I.,編、Academic Press,New Yo
rk。これらは初め、細胞において抗ウイルス性状態を誘
導する薬剤として記載されていたが、今は免疫系の多く
の機能に影響を及ぼす多面的リンホカインとして知られ
ている。Opdenakker et al.,Experimentia 45,513−52
0（1989）。それらのインビトロ生物活性は別として、
ヒト インターフェロン アルファは現在いくつかの重
要な徴候（例えばヘアリーセル白血病、カポジ肉腫、鼠
径リンパ節腫）に対して使用されており、いくつかの別
の徴候に対しても調べられている，イントロンＡ（イン
ターフェロン アルファ2b）の臨床応用状態（1989）、
臨床腫瘍学第５回欧州会議 サテライト シンポジウ
ム,London,U.K.1989年９月、抄録集。インターフェロン
アルファ，特に組換え型アルファ−2bを高度に精製され
た結晶の形で得ることが構造決定並びに種々の剤形の処
方のために第一に重要であると要望されている。
を含む蛋白質の一群である、Zoon K.C.,Interferon 9,
1−12（1987）,Gresser I.,編、Academic Press,New Yo
rk。これらは初め、細胞において抗ウイルス性状態を誘
導する薬剤として記載されていたが、今は免疫系の多く
の機能に影響を及ぼす多面的リンホカインとして知られ
ている。Opdenakker et al.,Experimentia 45,513−52
0（1989）。それらのインビトロ生物活性は別として、
ヒト インターフェロン アルファは現在いくつかの重
要な徴候（例えばヘアリーセル白血病、カポジ肉腫、鼠
径リンパ節腫）に対して使用されており、いくつかの別
の徴候に対しても調べられている，イントロンＡ（イン
ターフェロン アルファ2b）の臨床応用状態（1989）、
臨床腫瘍学第５回欧州会議 サテライト シンポジウ
ム,London,U.K.1989年９月、抄録集。インターフェロン
アルファ，特に組換え型アルファ−2bを高度に精製され
た結晶の形で得ることが構造決定並びに種々の剤形の処
方のために第一に重要であると要望されている。
ヒト インターフェロン アルファ−２は２つの結晶形
が報告されている。Miller et al.,Science,215,689−6
90（1982）;Kung et al.,米国特許第4,672,108号;Weiss
mann,T.インターフェロンのクローニングおよびその他
の誤り:Interferon 1981,Ion Gresser編,Academic Pre
ss,New York,101−134;Weissmann,Phil.Trans,R.Soc.Lo
nd.,B299.7−28（1982）；およびNagabhusban,etal.,遺
伝子工学によるアルファ−２ インターフェロンの特徴
付け：インターフェロン：研究、臨床応用および調節面
での考察、Zoon,et al.,Elsevier,New York 79−88（1
982）。これらの報告は低温でのポリエチレングリコー
ルからの、またはpHまたは温度を調整することによるリ
ン酸緩衝液からのインターフェロンアルファ−２の結晶
化法を記述している。これらの方法は通常Ｘ腺回折技術
ではよく特徴付けできない針状結晶を提供する。Miller
et al.,の論文はまた結晶インターフェロン アルファ
−２が“プリズム状形”であると述べている。
が報告されている。Miller et al.,Science,215,689−6
90（1982）;Kung et al.,米国特許第4,672,108号;Weiss
mann,T.インターフェロンのクローニングおよびその他
の誤り:Interferon 1981,Ion Gresser編,Academic Pre
ss,New York,101−134;Weissmann,Phil.Trans,R.Soc.Lo
nd.,B299.7−28（1982）；およびNagabhusban,etal.,遺
伝子工学によるアルファ−２ インターフェロンの特徴
付け：インターフェロン：研究、臨床応用および調節面
での考察、Zoon,et al.,Elsevier,New York 79−88（1
982）。これらの報告は低温でのポリエチレングリコー
ルからの、またはpHまたは温度を調整することによるリ
ン酸緩衝液からのインターフェロンアルファ−２の結晶
化法を記述している。これらの方法は通常Ｘ腺回折技術
ではよく特徴付けできない針状結晶を提供する。Miller
et al.,の論文はまた結晶インターフェロン アルファ
−２が“プリズム状形”であると述べている。
一般的にインターフェロンのような蛋白質を結晶化する
方法は予測できないことが知られている。例えばKung e
t al.,は米国特許第4,672,108（1987）、一段 行52−6
4において： “蛋白質の結晶化に対し多くの技術が開発されてきた
が、一般化された方法は発見されていない。それ故、蛋
白質の結晶化は多くの可能な別個の方法論を試行錯誤し
て用いる予測不可能な技術である。
方法は予測できないことが知られている。例えばKung e
t al.,は米国特許第4,672,108（1987）、一段 行52−6
4において： “蛋白質の結晶化に対し多くの技術が開発されてきた
が、一般化された方法は発見されていない。それ故、蛋
白質の結晶化は多くの可能な別個の方法論を試行錯誤し
て用いる予測不可能な技術である。
最も広く使用されている方法の１つは蛋白質溶液に結晶
化剤を加えることであり、それは通常硫酸アンモニウム
またはクエン酸アンモニウムのような塩またはエタノー
ルまたは２−エチル−2,4−ペンタンジオールのような
有機溶媒である。しかしながらそのような方法は結晶ヒ
ト白血球インターフェロンを産生するための適した手段
とはなりえなかった。” （強調が加えられている） と特に記載している。
化剤を加えることであり、それは通常硫酸アンモニウム
またはクエン酸アンモニウムのような塩またはエタノー
ルまたは２−エチル−2,4−ペンタンジオールのような
有機溶媒である。しかしながらそのような方法は結晶ヒ
ト白血球インターフェロンを産生するための適した手段
とはなりえなかった。” （強調が加えられている） と特に記載している。
発明の概要 驚くべきことに、インターフェロン アルファ−２の溶
液を硫酸塩溶液と平衡化させることによりインターフェ
ロン アルファ−２の溶液をより濃厚化させインターフ
ェロン アルファ−２の結晶を形成させることからなる
方法により室温でも高品質の結晶性インターフェロン
アルファ−２が産生できることが発見された。好適に
は、平衡化は限外濾過または透析によりまたはドロップ
を用いて（例えばハンギングまたはサンドイッチドロッ
プ）達成される。
液を硫酸塩溶液と平衡化させることによりインターフェ
ロン アルファ−２の溶液をより濃厚化させインターフ
ェロン アルファ−２の結晶を形成させることからなる
方法により室温でも高品質の結晶性インターフェロン
アルファ−２が産生できることが発見された。好適に
は、平衡化は限外濾過または透析によりまたはドロップ
を用いて（例えばハンギングまたはサンドイッチドロッ
プ）達成される。
インターフェロン アルファ−２の溶液は好適には硫酸
塩を含んでおり、この溶液が好適にはより濃度の高い硫
酸塩溶液に対して平衡化される。硫酸塩は好適にはアン
モニウム、カルシウム、カドミウム、カリウム、リチウ
ム、マグネシウムまたはナトリウム塩から選択され、よ
り好適であるのは硫酸アンモニウムである。結晶が形成
され始める時点での結晶インターフェロン アルファ−
２溶液中に存在する硫酸塩は好適には約12％から約30％
飽和濃度、より好適には約15％から約25％飽和硫酸アン
モニウムの濃度である。以下に示されるであろうが、平
衡化の開始時点での硫酸塩の濃度はより低い濃度であろ
う（即ち、約２％から約18％飽和）。
塩を含んでおり、この溶液が好適にはより濃度の高い硫
酸塩溶液に対して平衡化される。硫酸塩は好適にはアン
モニウム、カルシウム、カドミウム、カリウム、リチウ
ム、マグネシウムまたはナトリウム塩から選択され、よ
り好適であるのは硫酸アンモニウムである。結晶が形成
され始める時点での結晶インターフェロン アルファ−
２溶液中に存在する硫酸塩は好適には約12％から約30％
飽和濃度、より好適には約15％から約25％飽和硫酸アン
モニウムの濃度である。以下に示されるであろうが、平
衡化の開始時点での硫酸塩の濃度はより低い濃度であろ
う（即ち、約２％から約18％飽和）。
好適であるのはインターフェロン アルファ−２はイン
ターフェロン アルファ−2bであり、より好適であるの
は、ヒト、組換え結晶性インターフェロン アルファ−
2bである。１つの実施態様において、結晶物質は以下の
アミノ酸配列を持つインターフェロン アルファ−2bで
ある： インターフェロン アルファ−2aもまた使用してもよ
い。インターフェロン アルファ−2aの一次アミノ酸配
列は上記のインターフェロン アルファ−2bの配列の23
位のアルギニンをリジンに置き換えたところだけ異なっ
ている。
ターフェロン アルファ−2bであり、より好適であるの
は、ヒト、組換え結晶性インターフェロン アルファ−
2bである。１つの実施態様において、結晶物質は以下の
アミノ酸配列を持つインターフェロン アルファ−2bで
ある： インターフェロン アルファ−2aもまた使用してもよ
い。インターフェロン アルファ−2aの一次アミノ酸配
列は上記のインターフェロン アルファ−2bの配列の23
位のアルギニンをリジンに置き換えたところだけ異なっ
ている。
インターフェロン アルファ−２の硫酸塩溶液は6.5か
ら8.5、より好適には7.3から8.0のpHを持つ、リン酸ナ
トリウム緩衝液のような緩衝液を含んでいる。
ら8.5、より好適には7.3から8.0のpHを持つ、リン酸ナ
トリウム緩衝液のような緩衝液を含んでいる。
前記のような方法で調製された結晶性インターフェロン
アルファ−２はさらなる結晶性インターフェロン ア
ルファ−２の製造のための結晶種として使用されるであ
ろう。
アルファ−２はさらなる結晶性インターフェロン ア
ルファ−２の製造のための結晶種として使用されるであ
ろう。
発明の詳細な説明 前に示したごとく、本発明の方法はインターフェロン
アルファ−２の硫酸塩溶液を硫酸塩溶液に対して平衡化
させ、それにより結晶性インターフェロン アルファ−
２溶液をより濃厚化し、インターフェロン アルファ−
２結晶を形成させることを含んでいる。任意の適したイ
ンターフェロン アルファ−２を用いることができる、
例えばインターフェロン アルファ−2aおよびインター
フェロン アルファ−2b、より好適には組換えインター
フェロン アルファ−2a（ｒ−ｈ−インターフェロン
アルファ−2a）またはインターフェロン アルファ−2b
（ｒ−ｈ−インターフェロン アルファ−2b）。市販品
として入手可能なアルファ−２インターフェロン調製試
料はホフマン・ラロシェ（Roferon ）およびシェリン
グ・プラウ（Intron Ａ）から入手できる。アルファ−
２ インターフェロン含有の純粋なインターフェロンを
含む混合物はバロー・ウェルカムコーポレーション（We
llferon ）から入手可能である。ヒト インターフェ
ロン アルファにおける配列相同性の程度が高いことか
ら、本発明の方法は各々の亜種に応用可能であるのは当
然である。
アルファ−２の硫酸塩溶液を硫酸塩溶液に対して平衡化
させ、それにより結晶性インターフェロン アルファ−
２溶液をより濃厚化し、インターフェロン アルファ−
２結晶を形成させることを含んでいる。任意の適したイ
ンターフェロン アルファ−２を用いることができる、
例えばインターフェロン アルファ−2aおよびインター
フェロン アルファ−2b、より好適には組換えインター
フェロン アルファ−2a（ｒ−ｈ−インターフェロン
アルファ−2a）またはインターフェロン アルファ−2b
（ｒ−ｈ−インターフェロン アルファ−2b）。市販品
として入手可能なアルファ−２インターフェロン調製試
料はホフマン・ラロシェ（Roferon ）およびシェリン
グ・プラウ（Intron Ａ）から入手できる。アルファ−
２ インターフェロン含有の純粋なインターフェロンを
含む混合物はバロー・ウェルカムコーポレーション（We
llferon ）から入手可能である。ヒト インターフェ
ロン アルファにおける配列相同性の程度が高いことか
ら、本発明の方法は各々の亜種に応用可能であるのは当
然である。
ヒト インターフェロン アルファ−２亜種は組換えDN
A技術により得てもよいし、または天然の供給源（例え
ばヒト末梢血リンパ球、ヒトリンパ芽球様細胞株）から
精製してもよい（例えば、Pestka et al.,Ann Rev.Bioc
hem.,56,727−777（1987）により記載されているよう
に）。好適なインターフェロン アルファ−２は前に示
したようなアミノ酸配列を持つｒ−ｈ−インターフェロ
ン アルファ−2bである。
A技術により得てもよいし、または天然の供給源（例え
ばヒト末梢血リンパ球、ヒトリンパ芽球様細胞株）から
精製してもよい（例えば、Pestka et al.,Ann Rev.Bioc
hem.,56,727−777（1987）により記載されているよう
に）。好適なインターフェロン アルファ−２は前に示
したようなアミノ酸配列を持つｒ−ｈ−インターフェロ
ン アルファ−2bである。
天然ヒト インターフェロン アルファは全血から単離
された白血球新生児線維芽細胞、リンパ芽球様細胞およ
び種々の白血病細胞株を含むいくつかの細胞源から精製
された。ヒト白血球インターフェロンの最初の臨床的に
入手可能な試料はフィンランドにおいてK.Cantellおよ
びその同僚により開発され、正常ドナーからの遠心分離
血がインターフェロンで満たされ（センダイウイルスの
添加により誘導された）遠心分離された。得られた上澄
液はチオシアン酸カリウムにより沈殿され、エタノール
で抽出され、pHで沈殿され、リン酸緩衝化塩溶液に対し
て透析された（K.E.Morgensen,L.Cantell（1977）Phama
col.Ther.1,369−381）。
された白血球新生児線維芽細胞、リンパ芽球様細胞およ
び種々の白血病細胞株を含むいくつかの細胞源から精製
された。ヒト白血球インターフェロンの最初の臨床的に
入手可能な試料はフィンランドにおいてK.Cantellおよ
びその同僚により開発され、正常ドナーからの遠心分離
血がインターフェロンで満たされ（センダイウイルスの
添加により誘導された）遠心分離された。得られた上澄
液はチオシアン酸カリウムにより沈殿され、エタノール
で抽出され、pHで沈殿され、リン酸緩衝化塩溶液に対し
て透析された（K.E.Morgensen,L.Cantell（1977）Phama
col.Ther.1,369−381）。
組換えインターフェロン アルファはいくつかのグルー
プにより大腸菌中でクローン化され発現された、例えば
C.Weissmann et al.,Science209（1980）1343−1349。
組換えアルファ−２ インターフェロンの精製は例えば
Weissmann.C.,Phil.R.Soc.（Lond）（1982）b299 ７−
28、により記載されているように、硫酸アンモニウム沈
殿、色素アフィニティークロマトグラフィー、イオン交
換およびゲル濾過のようなクロマトグラフィー工程の組
合わせを用いていくつかのグループにより記載されてい
る。組換えインターフェロン アルファを精製する別の
方法は固定化抗体を持つ免疫アフィニティークロマトグ
ラフィーを用いている（P.P.Trotta et al.,Developmen
ts in Industrial Microbiology 72,Elsevier,Amsterd
am（1987）53−64）。組換えアルファ インターフェロ
ンに使用された利用可能な精製スキームの総説はT.L.Na
gabhushanおよびP.P.Trotta,Ullmann′s Encyclopedia
of Industrial Chemistry,A14,VCH,Weinheim,ドイツ連
邦共和国（1989）372−374、を参照されたい。好適に
は、使用されたインターフェロン アルファ−2bはUllm
ann′s Encyclopedia of Industrial Chemistry,A14,VC
H,Weinheim,ドイツ連邦共和国（1989）372−374に記載
されているような通常の精製過程、続いての逆相高速液
体クロマトグラフィーにより精製された。
プにより大腸菌中でクローン化され発現された、例えば
C.Weissmann et al.,Science209（1980）1343−1349。
組換えアルファ−２ インターフェロンの精製は例えば
Weissmann.C.,Phil.R.Soc.（Lond）（1982）b299 ７−
28、により記載されているように、硫酸アンモニウム沈
殿、色素アフィニティークロマトグラフィー、イオン交
換およびゲル濾過のようなクロマトグラフィー工程の組
合わせを用いていくつかのグループにより記載されてい
る。組換えインターフェロン アルファを精製する別の
方法は固定化抗体を持つ免疫アフィニティークロマトグ
ラフィーを用いている（P.P.Trotta et al.,Developmen
ts in Industrial Microbiology 72,Elsevier,Amsterd
am（1987）53−64）。組換えアルファ インターフェロ
ンに使用された利用可能な精製スキームの総説はT.L.Na
gabhushanおよびP.P.Trotta,Ullmann′s Encyclopedia
of Industrial Chemistry,A14,VCH,Weinheim,ドイツ連
邦共和国（1989）372−374、を参照されたい。好適に
は、使用されたインターフェロン アルファ−2bはUllm
ann′s Encyclopedia of Industrial Chemistry,A14,VC
H,Weinheim,ドイツ連邦共和国（1989）372−374に記載
されているような通常の精製過程、続いての逆相高速液
体クロマトグラフィーにより精製された。
平衡化に適した方法には、透析、限外濾過（例えばダイ
アフィルトレーション）またはドロップの使用（例えば
ハンギングまたはサンドイッチドロップ）が含まれる。
インターフェロン アルファ−２の硫酸塩溶液より以上
に濃度が高い第２の硫酸塩溶液に対することにより平衡
化が達成される。特に好適な方法はｒ−ｈ−インターフ
ェロン アルファ−２の溶液をリン酸緩衝溶液を用いた
硫酸塩溶液に対して平衡化させることである。好適には
平衡化は徐々に起こる（例えば２から30日以上）。
アフィルトレーション）またはドロップの使用（例えば
ハンギングまたはサンドイッチドロップ）が含まれる。
インターフェロン アルファ−２の硫酸塩溶液より以上
に濃度が高い第２の硫酸塩溶液に対することにより平衡
化が達成される。特に好適な方法はｒ−ｈ−インターフ
ェロン アルファ−２の溶液をリン酸緩衝溶液を用いた
硫酸塩溶液に対して平衡化させることである。好適には
平衡化は徐々に起こる（例えば２から30日以上）。
大規模な結晶化は蒸気拡散と等価な方法により達成され
る：すなわち、透析および限外濾過。臨床用の製造にお
いては大規模結晶化は精製または濃縮工程として使用で
きる。さらに、そのような操作においては硫酸アンモニ
ウムを他の普通の硫酸塩に置き換えることができる。
る：すなわち、透析および限外濾過。臨床用の製造にお
いては大規模結晶化は精製または濃縮工程として使用で
きる。さらに、そのような操作においては硫酸アンモニ
ウムを他の普通の硫酸塩に置き換えることができる。
結晶化時点、即ち最初の結晶形成時点での硫酸塩溶液中
でのインターフェロン アルファ−２の最終濃度は約10
から約80mg/mlであろう。より好適であるのは、インタ
ーフェロン アルファ−２の濃度は約30から約50mg/ml
である。好適にはインターフェロン アルファ−２出発
濃度は約20mg/mlである。
でのインターフェロン アルファ−２の最終濃度は約10
から約80mg/mlであろう。より好適であるのは、インタ
ーフェロン アルファ−２の濃度は約30から約50mg/ml
である。好適にはインターフェロン アルファ−２出発
濃度は約20mg/mlである。
結晶化過程の始まる前の最初の段階でのインターフェロ
ン アルファ−２溶液中の硫酸塩の濃度は約２％から約
18％飽和の範囲であろう。すなわち、もし溶液が100％
飽和された場合に存在するであろう濃度の２から18％の
濃度で硫酸塩が存在する。より好適には、硫酸塩の濃度
はインターフェロン アルファ−２溶液中、約７％から
約15％飽和濃度である。結晶化過程の開始時での相対す
る溶液においての硫酸塩濃度は約12％から約30％飽和で
あり、より好適には約15％から約25％飽和濃度である。
ン アルファ−２溶液中の硫酸塩の濃度は約２％から約
18％飽和の範囲であろう。すなわち、もし溶液が100％
飽和された場合に存在するであろう濃度の２から18％の
濃度で硫酸塩が存在する。より好適には、硫酸塩の濃度
はインターフェロン アルファ−２溶液中、約７％から
約15％飽和濃度である。結晶化過程の開始時での相対す
る溶液においての硫酸塩濃度は約12％から約30％飽和で
あり、より好適には約15％から約25％飽和濃度である。
インターフェロン アルファ−２溶液および相対する硫
酸塩溶液のpHは好適には約6.5から8.5、より好適には約
7.3から約8.0に調整されている。この目的には任意の緩
衝液が使用できる。例えば、リン酸ナトリウム、トリス
〔ヒドロキシメチル〕−アミノメタン塩酸塩、またはＮ
−〔２−ヒドロキシエチル〕ピペラジン−Ｎ′−〔２−
エタンスルホン酸〕緩衝液が使用できる。
酸塩溶液のpHは好適には約6.5から8.5、より好適には約
7.3から約8.0に調整されている。この目的には任意の緩
衝液が使用できる。例えば、リン酸ナトリウム、トリス
〔ヒドロキシメチル〕−アミノメタン塩酸塩、またはＮ
−〔２−ヒドロキシエチル〕ピペラジン−Ｎ′−〔２−
エタンスルホン酸〕緩衝液が使用できる。
結晶化は好適には調節された温度条件下で実施される。
温度は好適には約15゜から約37℃、より好適には約18゜
から約25℃の範囲である。
温度は好適には約15゜から約37℃、より好適には約18゜
から約25℃の範囲である。
本発明は、驚くべきことに室温で結晶性インターフェロ
ン アルファ−２を産生するので、４℃でポリエチレン
グリコールから得られる結晶よりも明白な利点を持って
いる。ヒト インターフェロン アルファ−２結晶の貯
蔵および処方が可能になった。結晶の溶解は0.15M塩化
ナトリウムを加えた20mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.
5）に対して透析することにより達成できる。さらに、
硫酸塩溶液はポリエチレングリコールよりも簡単に除去
でき（例えば透析）より純粋なインターフェロン アル
ファ−２結晶が本発明の方法で再溶解することにより得
ることができる。
ン アルファ−２を産生するので、４℃でポリエチレン
グリコールから得られる結晶よりも明白な利点を持って
いる。ヒト インターフェロン アルファ−２結晶の貯
蔵および処方が可能になった。結晶の溶解は0.15M塩化
ナトリウムを加えた20mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.
5）に対して透析することにより達成できる。さらに、
硫酸塩溶液はポリエチレングリコールよりも簡単に除去
でき（例えば透析）より純粋なインターフェロン アル
ファ−２結晶が本発明の方法で再溶解することにより得
ることができる。
本発明の方法により製造された結晶性インターフェロン
アルファ−２は種々の医薬処方の基剤として使用され
るであろう。例えば、結晶性インターフェロンは徐放性
製剤に用いることができる、例えば体重kg当り0.1−1.0
μｇの日用量に等しい量を放出できるデポ製剤。本発明
の方法により製造された結晶を用いるデポ製剤は４℃で
製造された結晶を含む製剤よりもはるかに遅い溶解速度
を示すであろう。特に、室温（22℃）結晶は、その形成
により低い温度を必要とする結晶よりも温度感受性が小
さいにちがいない。
アルファ−２は種々の医薬処方の基剤として使用され
るであろう。例えば、結晶性インターフェロンは徐放性
製剤に用いることができる、例えば体重kg当り0.1−1.0
μｇの日用量に等しい量を放出できるデポ製剤。本発明
の方法により製造された結晶を用いるデポ製剤は４℃で
製造された結晶を含む製剤よりもはるかに遅い溶解速度
を示すであろう。特に、室温（22℃）結晶は、その形成
により低い温度を必要とする結晶よりも温度感受性が小
さいにちがいない。
さらに、金属およびヒト インターフェロン アルファ
−２の複合体が形成でき続いて本発明の方法により結晶
化できる。そのような複合体の結晶は同様に徐放性製剤
に使用できる。徐放性製剤に使用される金属イオン−蛋
白質の例は従来の技術に記載されている。塩化亜鉛を無
菌インシュリン溶液に添加することにより製造される亜
鉛とインシュリンの複合体がNovo Terapeutisk Loborat
oriumA/Sに譲渡された米国特許第2,882,203号に記載さ
れている。そのような複合体の結晶懸濁液は非結晶製剤
よりも４から６倍長く作用した（Remington Pharmaceut
ical Sciences 17,Gennaro,A.R. 編、Mack Publishig
Co.,Easton,Penn.（1985）975−976）。亜鉛−インシ
ュリン複合体はいくつかの製造元から異なった形で市販
品として入手可能である、例えば:Lente Insulin（Squi
bb）,Ultra−Lente Iletin（Lilly）およびUltralente
Insulin/Ultralard（Squibb−Novo）,Remington Pharma
ceutical Science 17,Gennaro,A.R.編、Mack Publishi
g Co.,Easton,Penn.（1985）975−976。イソファン イ
ンシュリンはインシュリン（亜鉛−インシュリン）およ
びアルカリ性蛋白質（サルミリジン）の結晶性生成物で
ある。この生成物はいくつかの商標名で製造されてい
る;NPH−Iletin（Lilly）,Insulated（Lea）およびNovo
lin N（Squibb−Novo）（Pharmaceutical Manufacturin
g Encyclopedia 1,Sittig M.編（1988）820−822）。
亜鉛−インターフェロン アルファ−２複合体は米国特
許2,882,203号に記載されている方法により形成でき
る。インターフェロン アルファ−２−亜鉛複合体は本
発明の方法を用いて結晶化できる。得られる結晶性懸濁
液（単一の大きさの結晶を含む）は適当な添加剤（例え
ばメチルパラベン、塩化ナトリウムおよび酢酸ナトリウ
ム）を加えて皮下注射に使用できる。
−２の複合体が形成でき続いて本発明の方法により結晶
化できる。そのような複合体の結晶は同様に徐放性製剤
に使用できる。徐放性製剤に使用される金属イオン−蛋
白質の例は従来の技術に記載されている。塩化亜鉛を無
菌インシュリン溶液に添加することにより製造される亜
鉛とインシュリンの複合体がNovo Terapeutisk Loborat
oriumA/Sに譲渡された米国特許第2,882,203号に記載さ
れている。そのような複合体の結晶懸濁液は非結晶製剤
よりも４から６倍長く作用した（Remington Pharmaceut
ical Sciences 17,Gennaro,A.R. 編、Mack Publishig
Co.,Easton,Penn.（1985）975−976）。亜鉛−インシ
ュリン複合体はいくつかの製造元から異なった形で市販
品として入手可能である、例えば:Lente Insulin（Squi
bb）,Ultra−Lente Iletin（Lilly）およびUltralente
Insulin/Ultralard（Squibb−Novo）,Remington Pharma
ceutical Science 17,Gennaro,A.R.編、Mack Publishi
g Co.,Easton,Penn.（1985）975−976。イソファン イ
ンシュリンはインシュリン（亜鉛−インシュリン）およ
びアルカリ性蛋白質（サルミリジン）の結晶性生成物で
ある。この生成物はいくつかの商標名で製造されてい
る;NPH−Iletin（Lilly）,Insulated（Lea）およびNovo
lin N（Squibb−Novo）（Pharmaceutical Manufacturin
g Encyclopedia 1,Sittig M.編（1988）820−822）。
亜鉛−インターフェロン アルファ−２複合体は米国特
許2,882,203号に記載されている方法により形成でき
る。インターフェロン アルファ−２−亜鉛複合体は本
発明の方法を用いて結晶化できる。得られる結晶性懸濁
液（単一の大きさの結晶を含む）は適当な添加剤（例え
ばメチルパラベン、塩化ナトリウムおよび酢酸ナトリウ
ム）を加えて皮下注射に使用できる。
本発明の方法により製造された結晶性インターフェロン
アルファ−２は医薬製剤として使用されてきた従来の
インターフェロン アルファ−２物質と基本的に同じ様
式で使用できる、例えば結晶性インターフェロン アル
ファ−２を約0.1μg/kgから約1.0μg/kgの日用量で投与
するように計画できるインターフェロン アルファ−２
のデポ製剤。そのような製剤は生理学的に有効量の結晶
性インターフェロン アルファ−２を通常の薬学的に受
容可能な担体とともに含んでいる。
アルファ−２は医薬製剤として使用されてきた従来の
インターフェロン アルファ−２物質と基本的に同じ様
式で使用できる、例えば結晶性インターフェロン アル
ファ−２を約0.1μg/kgから約1.0μg/kgの日用量で投与
するように計画できるインターフェロン アルファ−２
のデポ製剤。そのような製剤は生理学的に有効量の結晶
性インターフェロン アルファ−２を通常の薬学的に受
容可能な担体とともに含んでいる。
本明細書に記載されている発明は以下の実際の実施例に
より例示されるが、それは本発明の範囲を制限するもの
と解釈してはならない。本発明の範囲内の別の方法もま
た当業者には明らかになるであろう。
より例示されるが、それは本発明の範囲を制限するもの
と解釈してはならない。本発明の範囲内の別の方法もま
た当業者には明らかになるであろう。
用いられたインターフェロン アルファ−２はWeissman
n et al.,Science209,1343（1980）により記載されてい
るように大腸菌中で発現された組換えヒト インターフ
ェロン アルファ−2bであった。Leibowitz,P.et al.,
（1982）による米国特許第4,315,852号に既に報告され
ているように細胞を培養し、採取し、抽出した。得られ
た抽出物は通常の精製工程の組合せにより精製された：
エタノール抽出、マトリックスゲル ブルー リガンド
アフィニティー クロマトグラフィー、イオン交換およ
びゲル濾過クロマトグラフィー。得られる精製インター
フェロン アルファ−2b調製液はRainin AutoPrepクロ
マトグラフィ システムを用いて逆相HPLCにより更に精
製された。精製インターフェロン アルファ−2b（50m
g）は27％アセトニトリル,0.1％トリフルオロ酢酸（TF
A）で前もって平衡化したRainin（4.1×250cm）C4300オ
ングストローム カラムによるクロマトグラフィを行っ
た。
n et al.,Science209,1343（1980）により記載されてい
るように大腸菌中で発現された組換えヒト インターフ
ェロン アルファ−2bであった。Leibowitz,P.et al.,
（1982）による米国特許第4,315,852号に既に報告され
ているように細胞を培養し、採取し、抽出した。得られ
た抽出物は通常の精製工程の組合せにより精製された：
エタノール抽出、マトリックスゲル ブルー リガンド
アフィニティー クロマトグラフィー、イオン交換およ
びゲル濾過クロマトグラフィー。得られる精製インター
フェロン アルファ−2b調製液はRainin AutoPrepクロ
マトグラフィ システムを用いて逆相HPLCにより更に精
製された。精製インターフェロン アルファ−2b（50m
g）は27％アセトニトリル,0.1％トリフルオロ酢酸（TF
A）で前もって平衡化したRainin（4.1×250cm）C4300オ
ングストローム カラムによるクロマトグラフィを行っ
た。
0.1％TFA中、30分間40ml/分で27％−72％アセトニトリ
ルの直線濃度勾配によりカラムからインターフェロン
アルファ−２を溶出させた。溶出分画は280ナノメータ
ーにセットされたインラインKnauer UV検出器からの吸
収プロフィールに基づいて集められた。
ルの直線濃度勾配によりカラムからインターフェロン
アルファ−２を溶出させた。溶出分画は280ナノメータ
ーにセットされたインラインKnauer UV検出器からの吸
収プロフィールに基づいて集められた。
結晶化はハンギング、シッティングまたはサンドイッチ
ドロップ技術を用いる蒸気拡散により達成された。ハン
ギングドロップ蒸気拡散実験は24ウェルの培養プレート
（Becton Dickinson and Company,Lincoln park,NJ）で
実施された。サンドイッチドロップ実験は蛋白質結晶化
プレート、Crystal plateTM（Flow Laboratories,McLe
an,VA）で行われ、シッティングドロップ蒸気拡散実験
はMVD/24マルチ−チャンバー蒸気拡散プレート（Crysch
em,Inc.,Riverside CA）中で実施された。
ドロップ技術を用いる蒸気拡散により達成された。ハン
ギングドロップ蒸気拡散実験は24ウェルの培養プレート
（Becton Dickinson and Company,Lincoln park,NJ）で
実施された。サンドイッチドロップ実験は蛋白質結晶化
プレート、Crystal plateTM（Flow Laboratories,McLe
an,VA）で行われ、シッティングドロップ蒸気拡散実験
はMVD/24マルチ−チャンバー蒸気拡散プレート（Crysch
em,Inc.,Riverside CA）中で実施された。
ハンギングドロップに対しては、10％飽和硫酸アンモニ
ウム水溶液、40mMリン酸ナトリウム,pH8.0を含む10μ１
の小滴をLinbro組織培養プレート上に逆さにしたシリコ
ン処理カバーガラスから垂れ下がらせた。これらの小滴
は1mlの20％飽和硫酸アンモニウム,40mMリン酸ナトリウ
ム,pH8.0に対して平衡化された。22℃にて４−15日間イ
ンキュベートするとあちこちに大きな単斜晶系のプリズ
ム状結晶（0.5×0.5×0.5mm）が明らかに存在した。シ
ッティングおよびサンドイッチドロップ実験に対しても
同じような溶液および実験条件が使用された。結晶はＸ
線回折分析に対して安定であり、６Å分解能まで回折さ
れた。結晶の異なったバッチがＸ線分析にかけられた
が、形態に関して一致した結果を与えた。これはインタ
ーフェロン アルファ−２のＸ線回折パターンの最初の
報告である。
ウム水溶液、40mMリン酸ナトリウム,pH8.0を含む10μ１
の小滴をLinbro組織培養プレート上に逆さにしたシリコ
ン処理カバーガラスから垂れ下がらせた。これらの小滴
は1mlの20％飽和硫酸アンモニウム,40mMリン酸ナトリウ
ム,pH8.0に対して平衡化された。22℃にて４−15日間イ
ンキュベートするとあちこちに大きな単斜晶系のプリズ
ム状結晶（0.5×0.5×0.5mm）が明らかに存在した。シ
ッティングおよびサンドイッチドロップ実験に対しても
同じような溶液および実験条件が使用された。結晶はＸ
線回折分析に対して安定であり、６Å分解能まで回折さ
れた。結晶の異なったバッチがＸ線分析にかけられた
が、形態に関して一致した結果を与えた。これはインタ
ーフェロン アルファ−２のＸ線回折パターンの最初の
報告である。
Ｘ線研究のためには結晶はガラスキャピラリーに装着さ
れ、40kVおよび100mAで操作するRigaku RU−300回転式
陽極発生機からのCuKα放射を用いて22℃でプレセッシ
ョン カメラで写真を撮った。生データのセットは同じ
放射源を用いてNicolet X−100A領域検出器上に集めら
れた。
れ、40kVおよび100mAで操作するRigaku RU−300回転式
陽極発生機からのCuKα放射を用いて22℃でプレセッシ
ョン カメラで写真を撮った。生データのセットは同じ
放射源を用いてNicolet X−100A領域検出器上に集めら
れた。
確 認 1.バイオアッセイ 個々の結晶をシリンジで垂れ下がっている小滴から抽出
し、22℃で35％飽和硫酸アンモニウム、40mMリン酸ナト
リウム,pH8.0からなる100μｌの洗浄溶液に再懸濁し
た。懸濁液を遠心分離し、洗浄溶液をパスツールピペッ
トで除去した。洗浄された結晶を100μｌの20mMリン酸
ナトリウム,pH7.5,0.15M塩化ナトリウムに再溶解した。
し、22℃で35％飽和硫酸アンモニウム、40mMリン酸ナト
リウム,pH8.0からなる100μｌの洗浄溶液に再懸濁し
た。懸濁液を遠心分離し、洗浄溶液をパスツールピペッ
トで除去した。洗浄された結晶を100μｌの20mMリン酸
ナトリウム,pH7.5,0.15M塩化ナトリウムに再溶解した。
蛋白質は純粋なヒトインターフェロン アルファ−2bを
比較標準として用いる改良ブラッドフォードアッセイに
より決定された。抗ウイルス活性はヒト包皮二倍体線維
芽細胞および脳心筋炎ウイルス（ATCC−VR−129）を用
いた細胞変性阻害アッセイにより決定された。本アッセ
イの詳細な記述はS.Rubinstein,P.C.Famillettiおよび
S.Pestka,J.Virol.37（1981）755−758,になされてい
る。再溶解溶液から2.0×108Iu/mgの比活性を得た。こ
の値はアッセイの限界内であり（典型的には１×108か
ら３×108Iu/mgの範囲内）結晶化前の本来のインターフ
ェロン アルファ−2b調製液に対して予測されていた値
と同じ値である。
比較標準として用いる改良ブラッドフォードアッセイに
より決定された。抗ウイルス活性はヒト包皮二倍体線維
芽細胞および脳心筋炎ウイルス（ATCC−VR−129）を用
いた細胞変性阻害アッセイにより決定された。本アッセ
イの詳細な記述はS.Rubinstein,P.C.Famillettiおよび
S.Pestka,J.Virol.37（1981）755−758,になされてい
る。再溶解溶液から2.0×108Iu/mgの比活性を得た。こ
の値はアッセイの限界内であり（典型的には１×108か
ら３×108Iu/mgの範囲内）結晶化前の本来のインターフ
ェロン アルファ−2b調製液に対して予測されていた値
と同じ値である。
2.HPLC 再溶解インターフェロン結晶の一部で分析高速液体クロ
マトグラフィー（HPLC）（Waters Ass.Milford,MA）が
実施された。試料をRainin Dynamax C4300オングストロ
ーム カラム（4.6×250mm）に負荷し、続けて0.1％ト
リフルオロ酢酸中27−72％のアセトニトリル直線濃度勾
配で30分の間溶出した。Gilson可変波長検出器280nmに
セットし、0.02吸光単位の感度で溶出液をモニターし
た。再溶解結晶溶液および結晶化前のもとのインターフ
ェロンアルファ−２調製試料の両方ともに保持時間およ
びクロマトグラフのプロフィールは同一であった。
マトグラフィー（HPLC）（Waters Ass.Milford,MA）が
実施された。試料をRainin Dynamax C4300オングストロ
ーム カラム（4.6×250mm）に負荷し、続けて0.1％ト
リフルオロ酢酸中27−72％のアセトニトリル直線濃度勾
配で30分の間溶出した。Gilson可変波長検出器280nmに
セットし、0.02吸光単位の感度で溶出液をモニターし
た。再溶解結晶溶液および結晶化前のもとのインターフ
ェロンアルファ−２調製試料の両方ともに保持時間およ
びクロマトグラフのプロフィールは同一であった。
3.SDS−PAGE 分析 結晶化前および後のインターフェロン アルファ−2bの
比較がLaemmli,U.K.（1970）Nature 227,680に記載さ
れている一次元15％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）法により行われ
た。試料を同じゲル上の平行するレーンで比較した場
合、相対移動度に何の相違もなかった。
比較がLaemmli,U.K.（1970）Nature 227,680に記載さ
れている一次元15％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）法により行われ
た。試料を同じゲル上の平行するレーンで比較した場
合、相対移動度に何の相違もなかった。
前記1,2および３から、結晶化または再構成の間に蛋白
質の化学変化または変性が起こっているとは明らかに考
えられない。
質の化学変化または変性が起こっているとは明らかに考
えられない。
本発明が上に示した特定の実施態様に関係して記載され
てきたが、多くのその修正、変更および変形が当業者に
は明らかになるであろう。すべてそのような修正、変更
および変形は本発明の精神および範囲内であることを企
図している。
てきたが、多くのその修正、変更および変形が当業者に
は明らかになるであろう。すべてそのような修正、変更
および変形は本発明の精神および範囲内であることを企
図している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 レ，ハン・ヴィー アメリカ合衆国ニュージャージー州07866, ロッカエイ，バリー・ビュー・ドライブ 75 (72)発明者 ナガブシャサン，タッタナハリ・エル アメリカ合衆国ニュージャージー州07054, パーシッパニー，サンセット・レーン ３ (72)発明者 トロッタ，ポール・ピー アメリカ合衆国ニュージャージー州07094, セコーカス，ハーモン・コーブ・タワーズ 2429
Claims (3)
- 【請求項１】インターフェロン アルファ−２を含む第
１の硫酸アンモニウム溶液を第２の硫酸アンモニウム溶
液に対して平衡化させ、それによりインターフェロン
アルファ−２溶液をより濃厚にして、そしてインターフ
ェロン アルファ−２の結晶を形成させることからな
る、結晶性インターフェロン アルファ−２の製造方法
において、 第１の硫酸アンモニウム溶液中に硫酸アンモニウムが最
初７％〜15％飽和濃度で存在し； インターフェロン アルファ−２が最初20mg/mlの濃度
で存在し； 第２の硫酸アンモニウム溶液中に硫酸アンモニウムが最
初15％〜25％飽和濃度で存在し；そして 第１および第２の硫酸アンモニウム溶液がいずれもpH7.
3〜8.0である、上記方法。 - 【請求項２】薬学的に受容可能なデポ担体と組合わされ
た、６Å分解能まで回折可能な単斜晶系プリズム状結晶
であるインターフェロン アルファ−２の結晶を含むデ
ポ製剤。 - 【請求項３】インターフェロン アルファ−２の結晶が
亜鉛複合体またはプロタミン複合体の形で存在している
ことを特徴とする、請求の範囲第２項に記載の製剤。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US53322590A | 1990-06-04 | 1990-06-04 | |
| US533,225 | 1990-06-04 | ||
| PCT/US1991/003660 WO1991018927A1 (en) | 1990-06-04 | 1991-06-03 | Method for preparing interferon alpha-2 crystals |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05503292A JPH05503292A (ja) | 1993-06-03 |
| JPH0749440B2 true JPH0749440B2 (ja) | 1995-05-31 |
Family
ID=24125036
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3510285A Expired - Lifetime JPH0749440B2 (ja) | 1990-06-04 | 1991-06-03 | インターフェロン アルファー２結晶の製造方法 |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5460956A (ja) |
| EP (1) | EP0597851B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0749440B2 (ja) |
| CN (2) | CN1033035C (ja) |
| AT (1) | ATE149523T1 (ja) |
| AU (1) | AU636043B2 (ja) |
| CA (1) | CA2084406A1 (ja) |
| DE (1) | DE69125035T2 (ja) |
| ES (1) | ES2098358T3 (ja) |
| FI (1) | FI925515A7 (ja) |
| HU (1) | HUT63185A (ja) |
| IE (1) | IE911892A1 (ja) |
| IL (1) | IL98354A0 (ja) |
| MX (1) | MX9203319A (ja) |
| MY (1) | MY107450A (ja) |
| NO (1) | NO924672L (ja) |
| NZ (1) | NZ238384A (ja) |
| OA (1) | OA09720A (ja) |
| PL (1) | PL166045B1 (ja) |
| PT (1) | PT97849A (ja) |
| SG (1) | SG45207A1 (ja) |
| TW (1) | TW342395B (ja) |
| WO (1) | WO1991018927A1 (ja) |
| ZA (1) | ZA914200B (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US5912015A (en) * | 1992-03-12 | 1999-06-15 | Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. | Modulated release from biocompatible polymers |
| US5711968A (en) * | 1994-07-25 | 1998-01-27 | Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. | Composition and method for the controlled release of metal cation-stabilized interferon |
| SE9302278D0 (sv) * | 1992-10-28 | 1993-07-02 | Kabi Pharmacia Ab | Growth hormone |
| US5441734A (en) * | 1993-02-25 | 1995-08-15 | Schering Corporation | Metal-interferon-alpha crystals |
| AU706180B2 (en) * | 1994-07-25 | 1999-06-10 | Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. | Controlled release of metal cation-stabilized interferon |
| AU710347B2 (en) * | 1995-08-31 | 1999-09-16 | Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. | Composition for sustained release of an agent |
| US5972331A (en) * | 1995-12-22 | 1999-10-26 | Schering Corporation | Crystalline interferon alpha for pulmonary delivery and method for producing the same |
| US6392069B2 (en) | 1996-01-08 | 2002-05-21 | Canji, Inc. | Compositions for enhancing delivery of nucleic acids to cells |
| US20100251425A9 (en) * | 1998-05-15 | 2010-09-30 | University Of Central Florida | Expression of human interferon in transgenic chloroplasts |
| US6281337B1 (en) | 1998-11-12 | 2001-08-28 | Schering Corporation | Methods for conversion of protein isoforms |
| DE19859876A1 (de) | 1998-12-23 | 2000-06-29 | Fraunhofer Ges Forschung | Verfahren zur Kristallisation aus Lösungen |
| US6465425B1 (en) | 2000-02-10 | 2002-10-15 | Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. | Microencapsulation and sustained release of biologically active acid-stable or free sulfhydryl-containing proteins |
| ES2358416T3 (es) * | 2001-10-30 | 2011-05-10 | Novartis Ag | Formulaciones de liberación prolongada de iloperidona y polímero en forma de estrella. |
| GB0216416D0 (en) | 2002-07-15 | 2002-08-21 | Novartis Ag | Organic compounds |
| CA2498319A1 (en) * | 2002-09-09 | 2004-03-18 | Nautilus Biotech | Rational evolution of cytokines for higher stability, the cytokines and encoding nucleic acid molecules |
| JP2006523609A (ja) * | 2002-12-31 | 2006-10-19 | アルタス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | タンパク質結晶およびイオン性ポリマーの複合体 |
| CA2512052C (en) | 2002-12-31 | 2016-06-21 | Altus Pharmaceuticals Inc. | Human growth hormone crystals and methods for preparing them |
| CN103755800B (zh) | 2004-02-02 | 2016-02-24 | Ambrx公司 | 经修饰的人类生长激素多肽与其用途 |
| US8679472B1 (en) | 2006-10-05 | 2014-03-25 | Merck, Sharp & Dohme Corp. | Crystal of human interferon alpha 2B in complex with zinc |
| NZ602170A (en) | 2008-02-08 | 2014-03-28 | Ambrx Inc | Modified leptin polypeptides and their uses |
| US20110027229A1 (en) | 2009-07-31 | 2011-02-03 | Medtronic, Inc. | Continuous subcutaneous administration of interferon-alpha to hepatitis c infected patients |
| US20160303242A1 (en) | 2013-12-09 | 2016-10-20 | Durect Corporation | Pharmaceutically Active Agent Complexes, Polymer Complexes, and Compositions and Methods Involving the Same |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2882203A (en) * | 1951-06-26 | 1959-04-14 | Novo Terapeutisk Labor As | Injectable insulin preparation with protracted effect |
| US2822203A (en) * | 1955-02-17 | 1958-02-04 | Gen Motors Corp | Door latch and control means |
| US4315852A (en) * | 1980-11-26 | 1982-02-16 | Schering Corporation | Extraction of interferon from bacteria |
| US4672108A (en) * | 1981-12-07 | 1987-06-09 | Hoffmann-La Roche Inc. | Crystalline human leukocyte interferon |
| US4853218A (en) * | 1987-02-24 | 1989-08-01 | Schering Corporation | Zinc-protamine-alpha interferon complex |
| US5441734A (en) * | 1993-02-25 | 1995-08-15 | Schering Corporation | Metal-interferon-alpha crystals |
-
1991
- 1991-06-03 HU HU923828A patent/HUT63185A/hu unknown
- 1991-06-03 MX MX9203319A patent/MX9203319A/es not_active Application Discontinuation
- 1991-06-03 MY MYPI91000969A patent/MY107450A/en unknown
- 1991-06-03 ZA ZA914200A patent/ZA914200B/xx unknown
- 1991-06-03 CA CA002084406A patent/CA2084406A1/en not_active Abandoned
- 1991-06-03 AT AT91911595T patent/ATE149523T1/de not_active IP Right Cessation
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