PL166045B1

PL166045B1 - Sposób wytwarzania krystalicznego I nterferonu alfa-2 PL PL PL PL

Info

Publication number: PL166045B1
Application number: PL91297182A
Authority: PL
Inventors: Paul Reichert; Gerald S Hammond; Hung V Le; Tattanahalli L Nagabhushan; Paul P Trotta
Original assignee: Schering Corp
Priority date: 1990-06-04
Filing date: 1991-06-03
Publication date: 1995-03-31
Also published as: CA2084406A1; ES2098358T3; US5460956A; NO924672D0; DE69125035D1; US5741485A; HU9203828D0; IE911892A1; NZ238384A; ATE149523T1; OA09720A; IL98354A0; FI925515L; HUT63185A; NO924672L; MY107450A; AU7955291A; CN1033035C; SG45207A1; AU636043B2

Abstract

1. Sposób wytwarzania krystalicznego interferonu alfa-2, znamienny tym, ze doprowadza sie do stanu równowagi roztwór soli kwasu siarkowego zawierajacy interferon alfa-2 wobec roztworu soli kwasu siarkowego. PL PL PL PL

Description

Sposób według wynalazku umożliwia wytwarzanie jednoskośnych, pryzmatycznych kryształów interferonu alfa-2, stabilnych przy rentgenowskiej analizie dyfrakcyjnej i powodujących ugięcie promieni X do rozdzielczości 6 A.

Korzystnie, doprowadzanie do stanu równowagi prowadzi się na drodze ultrafiltracji lub dializy albo stosując krople, np. krople wiszące lub sandwiczowe.

Korzystnie, roztwór interferonu alfa-2 zawiera sól kwasu siarkowego; ponadto, korzystnie roztwór ten doprowadza się do stanu równowagi wobec bardziej stężonego roztworu soli kwasu siarkowego. Sól kwasu siarkowego korzystnie wybiera się spośród soli amonowej, wapniowej, kadmowej, potasowej, litowej, magnezowej lub sodowej, a zwłaszcza stosuje się siarczan amonu. Siarczan korzystnie jest obecny w roztworze krystalicznego interferonu alfa-2 w czasie, gdy zaczynają się tworzyć kryształy, w stężeniu od około 12% do około 30% nasycenia, a zwłaszcza w stężeniu od około 15% do około 25% nasyconego siarczanu amonu. Jak podano poniżej, stężenie siarczanu na początku procesu doprowadzania do równowagi jest niższe, od około 2% do około 18% nasycenia.

Korzystnie, interferon alfa-2 stanowi interferon alfa-2b, a zwłaszcza stanowi ludzki, rekombinantowy, krystaliczny interferon alfa-2b. W jednej postaci wykonania, krystalicznym materiałem jest interferon alfa-2b, posiadający poniższą sekwencję aminokwasów:

1	Cys	Asp Leu	Pro Gin	Thtr	His	Ser	Leu	G1 y &?r	Arg
13	Arg	Thr Leu	MeL Luu	Leu	Aa	Gin	Met	Arg Arg	Ile
25	Ser	Leu Phe	Ser Cys	Leu	Lys	Asp	Arg	His Asp	Phe
37	Gly	Phe Pro	Gin - Glu	Glu	Phe	Gly	^n	Gin Phe	Gin
49	Lys	Ala <Gu	Thr Ile	Pro	Val	Leu	His	Glu ΜγΓ	He
61	Gin	Gin He	Phe Asn	Leu	Phe	Ser	Thr	Lys tep	&r
73	Ser Al a Aa Trp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe
85	Tyr	Thr GGu	Leu Tyr	Gin	Gin	Leu	Asn	tep Leu	Glu
97	Aa	C>c Val	Ile Gin	Gly	Vvl	Gly	Val	Thr G1 u	TTr
109	Pro	Leu Met	Lys Glu	Asp	Ser	Ile	Leu	Aa Vvl	A^

166 045

121 Lys T^r Phe Gin Arg H © Thr Leu Tyr Leu Lys Glu

133 Lys LyL Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg

145 Aa G1g I 1© Met Ar g Se r Phe &r Leu ^er Thr nsn

157 Leu Glg Glu Ser Lu u Arg Ser L>y Glu

Można też stosować interferon alfa-2a. Pierwotna sekwencja aminokwasów interferonu alfa2a różni się od wyżej podanej sekwencji interferonu alfa-2b tym, że w pozycji 23 arginina jest zastąpiona lizyną.

Roztwór interferonu alfa-2, zawierający siarczan, korzystnie zawiera bufor o pH 6-8,5, zwłaszcza 7,3-8,0, taki jak roztwór buforowy fosforanu sodu.

Krystaliczny interferon alfa-2, wytworzony powyższymi metodami, można stosować jako kryształy zaszczepiające do wytwarzania dalszych ilości interferonu alfa-2.

Szczegółowy opis wynalazku

Jak podano powyżej, sposób według wynalazku polega na doprowadzaniu do stanu równowagi roztworu interferonu alfa-2, zawierającego siarczan, wobec roztworu siarczanu, co powoduje, że roztwór krystalicznego interferonu alfa-2 staje się bardziej stężony i tworzy kryształy interferonu alfa-2. Można stosować dowolny odpowiedni interferon alfa-2, np. interferon alfa-2a i interferon alfa-2b, a korzystniej ludzki, rekombinantowy interferon alfa-2a (r-h-interferon alfa-2a) lub interferon alfa-2b (r-h-interferon alfa-2b). Dostępne handlowe preparaty interferonu alfa-2 są produkowane przez Hoffmann-La Roche (Roferon®) i Schering-Plough (Intron® A.). Mieszaniny czystych interferonów, zawierające interferony alfa-2, produkuje Burroughs-Wellcome Corporation (Wellferon®). Ze względu na wysoki stopień homologii sekwencji w ludzkich interferonach alfa, sposób według wynalazku powinien nadawać się do każdego z podgatunków.

Podgatunki ludzkiego interferonu alfa-2 można otrzymać technologią rekombinacji DNA albo można je oczyszczać ze źródeł naturalnych (np. z ludzkich limfocytów krwi obwodowej, z ludzkich linii komórek limfoblastoidalnych), jak np. opisał Pestka i in. Ann. Rev. Biochem., 56, 727-777 (1987). Korzystnym interferonem alfa-2 jest r-h-interferon alfa-2b o wyżej podanej sekwencji aminokwasów.

Naturalne ludzkie interferony alfa były wyodrębnione i oczyszczane z szeregu źródeł komórek, np. z leukocytów wyodrębnianych z całej krwi, z fibroblastów noworodkowych, z limfoblastoidalnych i różnych leukemicznych linii komórkowych. Pierwszy klinicznie dostępny preparat, zawierający ludzki interferon leukocytowy został opracowany przez K. Cantella i in. w Finlandii; do odwirowanej krwi od normalnych dawców dodaje się interferon, następnie indukuje się ją przez dodanie wirusa Sendai i poddaje odwirowaniu. Otrzymany supernatant wytrąca się tiocyjanianem potasu, ekstrahuje się etanolem, wytrąca przez nastawienie pH i dializuje wobec solanki zbuforowanej fosforanem (K. E. Morgensen, L. Cantell (1977) Pharmacol. Ther. 1, 369-381).

Rekombinantowe interferony alfa były poddawane klonowaniu i ekspresji w E. coli przez szereg grup badaczy, np. C. Weissmann i in. Science 209 (1980) 1343 - 1349. Oczyszczanie rekombinantowych interferonów alfa-2 zostało opisane przez szereg osób, przy użyciu metod chromatograficznych takich, jak wytrącanie siarczanem amonu, chromatografia powinowactwa do barwników, chromatografia jonowymienna i w żelach, opisana np. przez Weissmanna, C., Phil. R. Soc. (Lond.), (1982) b299,7 - 28). Jako alternatywną metodę oczyszczania rekombinantowych interferonów alfa stosuje się chromatografię immunopowinowactwa z unieruchomionym przeciwciałem (P. P. Trotta i in., Developments in Industrial Microbilogy 72, Elsevier, Amsterdam (1987) 53-6^4). Przegląd dostępnych metod oczyszczania rekombinantowych alfa interferonów podany jest w T. L. Nagabhushan i P. P. Trotta, Ullmann's Encyclopedia of Industrial) Chemistry, A14, VCH, Weinheim, RFN (1989) 372-374. Korzystnie, stosowany interferon alfa-2b oczyszcza się konwencjonalnym sposobem oczyszczania, opisanym w Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, A14, VCH, Weinheim, RFN (1989) 373 - 374, z następną ciśnieniową chromatografią z fazami odwróconymi.

166 045 5

Jako odpowiednie metody doprowadzania do stanu równowagi można wymienić dializę, ultrafiltrację, np. diafiltrację lub stosowanie kropel, np. kropelek wiszących lub sandwieżowych. Doprowadzanie do stanu równowagi można prowadzić wobec drugiego roztworu siarczanu, który jest bardziej stężony niż roztwór siarczanu zawierający interferon alfa-2. Szczególnie korzystnym sposobem doprowadzania do stanu równowagi jest równoważenie roztworu r-h-interferonu alfa-2 wobec roztworu siarczanu przy użyciu roztworu buforu fosforanowego. Korzystnie, doprowadzanie do stanu równowagi prowadzi się powoli, np. w ciągu 2-30 dni.

Krystalizację w dużej skali można prowadzić metodami odpowiadającymi dyfuzji par, to jest przez dializę i ultrafiltrację. Przy produkcji w klinice, można stosować krystalizację w dużej skali jako etap oczyszczania lub zatężania. Ponadto, w takich przypadkach można zastępować siarczan amonu innym pospolitym siarczanem.

Końcowe stężenie interferonu alfa-2 w roztworze siarczanu w punkcie krystalizacji, to jest w momencie wytworzenia pierwszych kryształów, może wynosić od około 10 do około 80 mg/ml. Korzystniej, stężenie interferonu alfa-2 wynosi od około 30 do około 50 mg/ml. Korzystnie, wyjściowe stężenie interferonu alfa-2 wynosi około 20mg/ml.

Stężenie siarczanu w roztworze interferonu alfa-2 w początkowym momencie przed rozpoczęciem krystalizacji może wynosić od około 2% do około 18% nasycenia, to jest ilość siarczanu wynosi 2-18% stężenia, które istniałoby, gdyby roztwór był nasycony w 100%. Korzystniej, stężenie siarczanu wynosi od około 7% do około 15% nasycenia w roztworze interferonu alfa-2. Stężenie siarczanu w przeciwroztworze na początku krystalizacji wynosi od około 12% do około 30% nasycenia, a zwłaszcza od około 15% do około 25% nasycenia.

pH roztworu interferonu alfa-2 i przeciwroztworu zawierającego siarczan, korzystnie utrzymuje się na poziomie od około 6,5 do około 8,5, a zwłaszcza od około 7,3 do około 8,0. Można w tym celu stosować dowolny bufor, np. fosforan sodu, chlorowodorek tris-[hydroksymetylo]aminometanu lub kwas N-[2-hydroksyetylo]piperazyno-N'-[2-etanosulfonowy].

Krystalizację korzystnie prowadzi się w kontrolowanych warunkach temperaturowych, szczególnie od około 15 do około 37°C, a zwłaszcza od około 18 do około 25°C.

Ponieważ sposobem według wynalazku nieoczekiwanie otrzymuje się krystaliczny interferon w temperaturze pokojowej, posiada on wyraźną przewagę nad kryształami otrzymywanymi z glikolu polietylenowego w temperaturze 4°C. Umożliwia on przechowywanie i formułowanie kryształów ludzkiego interferonu alfa-2 w temperaturze pokojowej. Kryształy można rozpuszczać na drodze dializy wobec 20 mM buforu z fosforanu sodu o pH 7,5 z dodanymi 0,15 M chlorku sodu. Ponadto, ponieważ roztwór siarczanu jest łatwiejszy do usunięcia, np. przez dializę, niż glikol polietylenowy, to sposobem według wynalazku można otrzymać przy ponownym rozpuszczeniu czystsze kryształy.

Krystaliczny interferon alfa-2, wytwarzany według wynalazku, może stanowić podstawę wielu preparatów farmaceutycznych. Można go np. stosować do środków o przedłużonym działaniu, np. do depotów uwalniających równoważnik dawki dziennej 0,1 -1,0 pg/kg wagi ciała. Depot zawierający kryształy otrzymane według wynalazku powinien wykazywać znacznie niższą szybkość rozpuszczania niż preparat zawierający kryształy wytworzone w temperaturze 4°C. W szczególności, kryształy wytworzone w 22°C powinny być mniej wrażliwe na temperaturę niż te, które wymagają niższej temperatury do ich wytworzenia.

Ponadto, sposobem według wynalazku można wytwarzać i następnie krystalizować kompleksy metali i ludzkiego interferonu alfa-2. Kryształy tych kompleksów można podobnie stosować do sporządzania preparatów o przedłużonym działaniu. Przykłady kompleksów jon metalu-białko, stosowane w preparatach o przedłużonym działaniu są znane. W opisie patentowym St. Zjedn. Am. nr 2 882 203, Novo Terapeutisk Laboratorium A/S, opisano kompleks cynku z insuliną wytwarzany przez dodanie chlorku cynku do jałowego roztworu insuliny. Krystaliczna zawiesina takiego kompleksu wykazywała 4 - 6-krotnie dłuższe działanie niż preparat niekrystaliczny (Remington Pharmaceutical Sciences 17, Gennaro, A. R., Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1985)975 - 976). Kompleksy cynkowo-insulinowe są dostępne od różnych producentów, np.: Lente Insulin (Squibb), Ultra-Lente Iletin (Lilly) i Ultralente Insulin/Ultratard (Squibb-Novo), Remington Pharmaceutical Sciences 17, Gennaro, A. R., Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1985)975-976.

166 045

Insulina izofanowa jest produktem krystalicznym, złożonym z insuliny (insulina cynkowa) oo-z z nlknlicznego białka (salmioydynn). Produkt ten znajduje się w handlu pod różnymi nazwami: NPH-Iletin (Lilly), Insulated (Leo), i NovolinN (Squibb-Novo) (Phnomaceuticnl Manufncturing Encyclopedia 1, Sittig. M. ed., (1988) 820-822). Kompleks cynku z interferonem alfa-2 możnn wytwarzać sposobami opisanymi w opisie patentowym St. Zjedn. Am. nr 2 882 203. Kompleks interferon nlfa-2-cynk możnn krystalizować sposobem według niniejszego wynalazku. Otrzymaną krystnliczną zawiesinę (z^wienającą kryształy o jednakowej wielkości), w połączeniu z odpowiednimi dodatkami (np. metylopnrnben, chlorek sodu i octnn sodu), możnn stosować do iniekcji podskórnych.

Krystaliczny interferon alfn-2, wytworzony sposobem według wynalazku, możnn stosować do poepnrntów farmaceutycznych yasndnicyo trk samo, jak dotychczasowe produkty interferonu nlfa-2; np. możnn wytwarzać depoty interferonu alfa-2 tak zaprojektowane, -by podawały dzienną dawkę od około 0,1 zzg/kg do około 1,0 z/g/kg krystalicznego interferonu alfn-2. Poepnrnty takie zawierają fizjologicznie skuteczną ilość interferonu alfa-2 w połączeniu z konwencjonalnym, farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.

Wynnlnzek ilustruje poniższy pozykłnd, nie ogrrniczającjego zakresu. Dla fachowca oczywiste będą również alternatywne sposoby, wchodzące w zakres wynalazku.

Stosowany interferon nlfa-2 stanowił rekombin-ntooy ludzki interferon alfn-2b, ulegający ekspresji w E. coli, opisany przez Weissmanna i in. w Science, 209, 1343 (1980). Komórki hodowano, zbierano i eksto-hoo-no metodą opisaną w opisie patentowym St. Zjedn. Am. nr 4 315 852, (1982), Leibooity P. i in. Otrzymane ekstrakty oczyszczano za pomocą kombinacji konwencjonalnych operacji oczyszczania, jak ekstrakcja etanolem, chromatografin powinowactwa do niebieskiego ligandu w postaci żelu na matrycy, chrom-togr-fl- jonowymienna i chromatognafia w żelach.

Otrzymany oczyszczony intenferon nlfa-2b oczyszczano dalej za pomocą HPLC z odwróconymi fnznmi, stosując układ Rainin Auto Prep Chnom-togr-phy. 50 mg oczyszczonego interferonu nlfn-2b chrom-togr-foo-no na kolumnie Rainin (4,4 X 250 cm) C 300 Angstrom, którą uprzednio doprowadzono do stanu równowagi za pomocą 27 % acetonitrylu w 0,1 % kwasie trifluorooctowym (TFA). Do eluoorni- interferonu alfa-2 z. kolumny stosowano gradient liniowy 27 - 72% ncetonitrylu, 0,1% TFA, w ciągu 30 min, przy 40 ml/min. Eluoo-ne frakcje zbierano na podstawie profilu -bsonb-ncji z wbudowanego detektora Knauer UV przy 280 nanometrach.

·, Kryst-liy-cję osiągano na drodze dyfuzji par, stosując technikę wiszącej, siedzącej albo s-ndoicyooej kropli. Doświadczenia dotyczące dyfuzji par z użyciem wiszącej kropli pnow-dyono na płytkach do hodowli tkanek z 24 dołkami (Becton Dickinson and Co., Lincoln Park, NJ). Doświadczenia z kroplą s-ndwicyową prow-dyono na płytkach do knyst-liz-cji białek Crystal Płatew (Flow Laboratories, Mc Lenn, VA), zaś doświadczenia z kroplą siedzącą nn oielokomorowych płytkach do dyfuzji par MVD/24 (Cryschem, Inc., Rwerside, CA).

Do prób z wiszącą kroplą z-oiesy-nc kropelki po 10 /1, zawierające 20 mg/ml białka w 10% wodnym, nasyconym si-rcz-nie amonu, 40 mM fosforanu sodu, pH 8,0 z silikonoo-nego szkiełek pokrywkowego odwróconego nn płytkach do hodowli tkanek Linbro. Kropelki te doprow-dy-no do stanu równowagi wobec 1 ml 20% nasyconego si-rcy-nu amonu, 40 mM fosforanu sodu o pH 8,0. Od 4- 15 dnia inkubacji w 22°C wszędzie były widoczne duże, jednoskośne, pryzmatyczne kryształy (0,5 X 0,5 X 0,5mm). W doświadczeniach z siedzącą i s-ndoicyooą kroplą stosowano porównywalne roztwory i warunki. Kryształy były stabilne przy rentgenowskiej analizie dyfrakcyjnej i powodowały ugięcie do rozdzielczości 6 A. Różne partie kryształów poddano rentgenowskiej nnalizie dyfrakcyjnej i otrzymano zgodne wyniki dotyczące morfologii. Jest to pierwsze doniesienie o obrazie dyfrakcyjnym interferonu alfn-2.

Dla badań rentgenowskich kryształy umieszcza się w szklanych knpilarach i fotografuje się kamerą precesyjną w 22°C, stosując promieniowanie CuKa z obrotowego generatora obrotowego Rigaku Ru-300, pracującego przy 40 kV i 100 mA. Zestaw danych natywnych zbiera się na detektorze powierzchni Nicolet Χ-100 A, stosując to samo źródło promienioo-ni-.

166 045

Ί

Charakterystyka

1. Badanie biologiczne.

Z wiszących kropel wyciągano poszczególne kryształy za pomocą strzykawki, następnie zawieszano je ponownie w 100 pl roztworu przemywającego, złożonego z 35% nasyconego siarczanu amonu. 40 mM fosforanu sodu, o pH 8,0, w temperaturze 22°C. Zawiesinę przemyto i usunięto przemywający roztwór pipetą pasteurowską. Przemyte kryształy rozpuszczono ponownie w 100 pl 20 mM fosforanu sodu o pH 7,5, 0,15 M chlorku sodu w temperaturze 22°C.

Białko oznaczono za pomocą zmodyfikowanej próby Bradforda, stosując czysty ludzki interferon alfa-2b jako wzorzec porównawczy. Aktywność przeciwwirusową oznaczono za pomocą próby cytopatycznego hamowania, stosując diploidalne fibroblasty ludzkiego napletka i wirus mózgowego zapalenia mięśnia sercowego (ATCC-VR-129). Szczegółowy opis próby podał

S. Rubinstein, P. C. Familietti i S. Pestka, J. Virol. 37 (1981) 755-758. Ponownie rozpuszczony roztwór posiadał aktywność swoistą 2,0 X 10⁸ lu/mg. Jest to ta sama wartość, którą przewidziano dla oryginalnego preparatu interferonu alfa-2b przed krystalizacją, w granicach próby (typowo w zakresie 1X 10⁸ do 3 X 10⁸ Iu/mg).

2. HPLC

Analizę za pomocą ciśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC) (Waters Ass. Milford, MA) prowadzono na próbce ponownie rozpuszczonych kryształów interferonu. Próbkę przepuszczono przez kolumnę Rainin Dynamax C4 300 Angstrom (4,6 X 250 ml), którą następnie eluowano stosując gradient 27 - 72% acetonitrylu w 0,1% kwasie trifluorooctowym w ciągu 30 min. Monitorowanie eluatu prowadzono na detektorze Gilson o zmiennej długości fali, nastawionym na 280 nm przy czułości 0,02 jednostek absorbancji. Czasy retencji i profile chromatograficzne roztworu ponownie rozpuszczonych kryształów i oryginalnego preparatu interferonu alfa-2b przed krystalizacją były identyczne.

3. Analiza elektroforetyczna - SDS-PAGE

Przeprowadzono porównanie interferonu alfa-2b przed i po krystalizacji za pomocą jednowymiarowej elektroforezy w 15% żelu poliakryloamidowym zawierającym dodecylosiarczan sodu (SDSPAGE), opisanej przez Laemmli, U. K. (1970) Nature 227,680. Nie stwierdzono zmian w ruchliwości względnej przy porównywaniu na równoległych ścieżkach na tym samym żelu.

Z powyższych punktów 1, 2, 3 wynika w sposób oczywisty, że nie ma powodu do przypuszczeń, aby podczas krystalizacji lub rozpuszczania następowały jakiekolwiek zmiany chemiczne lub denaturacja białek.

Powyższe postaci wykonania ilustrują wynalazek, ale dla fachowca jest oczywistych wiele alternatyw, modyfikacji i wariantów tego sposobu, które wchodzą w zakres wynalazku.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania krystalicznego interferonu alfa-2, znamienny tym, że doprowadza się do stanu równowagi roztwór soli kwasu siarkowego zawierający interferon alfa-2 wobec roztworu soli kwasu siarkowego.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że doprowadzenie do stanu równowagi wykonuje się za pomocą ultrafiltracji lub dializy albo na drodze dyfuzji par.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że doprowadzanie do stanu równowagi wykonuje się na drodze dyfuzji par przy zastosowaniu wiszących lub sandwiczowych kropelek.
4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że roztwór soli kwasu siarkowego, zawierający interferon alfa-2, doprowadza się do stanu równowagi wobec bardziej stężonego roztworu soli kwasu siarkowego.
5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako interferon alfa-2 stosuje się ludzki, rekombinantowy interferon alfa-2b.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że stosuje się sól kwasu siarkowego wybraną spośród soli amonowej, wapniowej, kadmowej, potasowej, litowej, magnezowej lub sodowej.
7. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że jako sól kwasu siarkowego stosuje się siarczan amonu.
8. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że stosuje się roztwór soli kwasu siarkowego zawierający interferon alfa-2, z dodatkiem buforu.
9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że stosuje się roztwór interferonu alfa-2 zbuforowany do pH 7,3 - 8,0.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że jako bufor stosuje się fosforan sodu.
11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że w momencie tworzenia kryształów interferonu alfa-2 stosuje się stężenie soli kwasu siarkowego w roztworze interferonu alfa-2 na poziomie od około 12% do około 30% nasycenia.
12. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że w momencie tworzenia kryształów interferonu alfa-2 stosuje się stężenie soli kwasu siarkowego w roztworze interferonu alfa-2 na poziomie od około 15% do około 35% nasycenia.
13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwór zaszczepia się kryształami interferonu alfa-2, uprzednio wytworzonymi.

Ludzkie interferony alfa tworzą rodzinę białek, złożoną z co najmniej 24 podgatunków, Zoon

K. C., Interferon-9,1 - 12 (1987) Gresser I., wyd. Academic Press, New York. Początkowo były one opisane jako środki zdolne do wprowadzania stanu przeciwwirusowego do komórek, ale są znane jako pleotropowe limfokiny oddziaływujące na wiele funkcji układu odpornościowego, Opdenakker etal., Experimentia 45, 513-520 (1989). Poza ich biologicznym działaniem in vitro, ludzkie interferony alfa są obecnie stosowane w wielu ważnych wskazaniach, np. w białaczce kosmatokomórkowej, mięsaku Kaposiego, kłykcinie kończystej, a także są badane do wielu innych celów, Interferon A (interferon alfa-2b) Clinical status (1989). Proceedings from a satellite symposium at the 5-th European Conference on Clinical Oncology, London, U. K. September 1989. Zapotrzebowanie na wysokooczyszczone i krystaliczne postacie interferonu alfa, zwłaszcza typu rekombinantowego alfa-2b, sprawia, że podstawowe znaczenie ma zarówno wyjaśnienie jego struktury, jak i opracowanie różnych postaci farmaceutycznych.

Opisano dwie formy krystaliczne ludzkiego interferonu alfa-2. Miller etal., Science, 215, 689-690 (1982); Kungetal., opis patentowy St. Zjedn. Am. nr 4 672 108; Weissmann, The Cloning

166 045 of Interferon and other Mistakes w: Interferon 1981, Ion Gresser, Academic Press, New York, 101 - 134; Weissmann, Phill. Trans. R. Soc. Lond., B299, 7-28 (1982); oraz Nagabhusban etal., Characterization of Genetically Engineered Alpha-2 Interferon w: Interferon: Research, Clinical Application and Regulatory Consideration, Zoon et al., Elsevier, New York 79 - 88 (1982). Publikacje te opisują sposoby krystalizacji interferonu alfa-2 z glikolu polietylenowego w niskiej temperaturze albo z roztworu buforu fosforanowego przez nastawianie pH lub temperatury. Sposoby te normalnie prowadzą do kryształów igłowych, które nie mogą być dobrze charakteryzowane rentgenowskimi technikami dyfrakcyjnymi. Praca Millera i in. również wymienia krystaliczny interferon alfa-2 w „formie pryzmatycznej.

Ogólnie stwierdzono, że sposoby krystalizowania białek takich, jak interferon są nieprzewidywalne. Np. w opisie patentowym St. Zjedn. Am. nr 4 672108 (1987), Kung i in. wyraźnie stwierdza w kolumnie 1, wiersz 52-64: „Opracowano wiele technik krystalizacji białek, ale nie wynaleziono sposobu ogólnego i wiele białek pozostaje nieskrystalizowanych. Dlatego też krystalizacja białek pozostaje nieprzewidywalna: stosuje się tu, pośród wielu możliwych alternatywnych metod, metodę prób i błędów.

Jedną z najczęściej stosowanych metod obejmuje dodawanie do roztworu białka środka krystalizującego, jakim na ogół jest sól taka, jak siarczan amonu lub cytrynian amonu, albo rozpuszczalnik organiczny taki, jak etanol lub 2-etylo-2,4-pentanodiol. Jednakże, sposoby te nie pozwalają na wytwarzanie krystalicznych ludzkich leukocytowych interferonów.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że można skutecznie wytwarzać krystaliczny interferon alfa-2 o wysokiej jakości, nawet w temperaturze pokojowej, sposobem polegającym na tym, że doprowadza się do stanu równowagi roztwór interferon alfa-2 wobec roztworu soli kwasu siarkowego, co powoduje zatężanie roztworu interferonu alfa-2 i tworzenie kryształów interferonu alfa-2.