JPH07500615A

JPH07500615A - ポリ−β−ヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）共重合体およびその製造方法、これを生産する微生物とＰＨＡ共重合体の高分子ブレンド

Info

Publication number: JPH07500615A
Application number: JP3515824A
Authority: JP
Inventors: リー　ヤンゴル; イム　ゴンビン
Original assignee: コーハップ　エルティーディー．
Priority date: 1991-04-09
Filing date: 1991-09-16
Publication date: 1995-01-19
Also published as: EP0582567B1; EP0582567A1; DE69126444T2; KR100189468B1; DE69126444D1; US5395919A; KR920019942A; ATE154048T1; WO1992018553A1; AU8612191A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ポリ−β−ヒドロキシアルカノエート（Ｐ　ＨＡ　）共重合体およびその製造方法、これを生産する微生物とＰ　ＨＡ共重合体の高分子ブレンド。

発明の詳細な説明本発明は栄養成分の制限による微生物の生体内でのポリーβ−ｔＦｏ＋ノア／ｌｚカッエート（ｐｏｌｙ−β−ｈｙｄｒｏｘｙ　ａｌｋａｎｏａｔｅ）共重合体（以下Ｐ　ＨＡと略す）の好気的（ａｅｒｏｂｉｃ）生産方法に関するものである。

本発明で使用した微生物により生産されるポリエステルＰＨＡは多様な炭素原子数をもつモノマー（β−ヒドロキノカルボン酸β−ｈｙｄｒｏｘｙ　ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　）からなる共重合体であり、生分解性をもつから農業用フィルムおよび各種のフィルム、各種の容器なとの成形物、手術用縫合糸、人工皮膚組織、光学活性充填物なとに利用できる。

ヨーロッパ特許第０．０４６，３４４号には葡萄糖を利用したポリ−β−ヒドロキノブチレート（ｐｏｌｙ−β−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕ４ｙｒａｔｅ　：　Ｐ　ＨＢ　）の生産にたいする技術が公開されている。

これはアルカリノネス　ユートロブス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｅｕｔｒｏｐｕｓ）Ｉ（１６の突然変異菌株であるＡ、ユートロブス　ＮＣＩＢ　１１５９９を利用して窒素源を枯渇させることにより細胞内にＰｌ（Ｂを蓄積、生産する技術である。

ヨーロッパ特許第０．０６９．４９７号ではＡ、ユートロブスＮＣｌ３　１１５９９の炭素源を葡萄糖とプロピオン酸などのような有機酸を利用してＰ　ＨＢホモポリマーの主成分である３ＨＢ　（３−ヒドロキノブチレート３−ｈｙｄｒｏｘｙ　ｂｕｔｙｒａｔｅ）と３ＨＶ（３−ヒドロキシバレレート　３−　ｈｙｄｒｏｘｙ　ｖａｌｅｒａｔｅ）の共重合体を生産した。この共重合体はＰＨＢホモポリマーの分子チェーン内に３ＨＶ成分を挿入することによってＰＨＢの結晶化度を低め各種の物性および加工性を変形したものである。

そして、特開昭６４−２６９９８９、特開昭６４−４８８２１、特開平１−１５６３２０ではＰＨＢの物性を改良するためＡ、ユートロブスを利用して５ＨＶ（５−ヒドロキシバレレート５−ｈｙｄｒｏｘｙ　ｖａｌｅｒａｔｅ　）　、３　ＨＶ　（３−ヒドロキシバレレート　５−ｈｙｄｒｏｘｙ　ｖａｌｅｒａｔｅ　）と４ＨＢ（４−ヒドロキシブチレート　４−ｈｙｄｒｏｘｙ　ｂｕｔｙｒａｔｅ）などを結合した数種の新しい共重合体を生産した。

これらの改良された共重合体はその生産のために葡萄糖と有機酸を同時に使用せねばならず、共重合体の成分の含量を増大させるためには細胞に有毒な有機酸の濃度を高めねばならないので共重合体の生産性が著しく低下し、主原料である葡萄糖の価格が高くて生産の経済性が落ちるという欠点があった。

また、ヨーロッパ特許第０．０５２，４６０号ではＰＨＢの物性を改良するためにＰ　ＨＢと非生分解性合成高分子をブレンドして改良Ｐ　［（Ｂブレンドを生産したがこれは非生分解性の合成高分子を含むのでＰＨＢの最大長所である生分解性を低下させる欠点があり、日本特許公開公報昭６３−２２６２９１では飽和および不飽和炭水化物（パラフィン、オレフィン）を炭素源としてＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｏｌｅｏｖｏｒａｎを利用したポリエステル共重合体を生産した。

この共重合体は炭素数６から１２までの３−ヒドロキノカルボン酸たちのポリエステル結合の高分子で、栄養成分の制限により細胞内に蓄積生産されたポリエステルの含１が低く、ためにその生産性が極めて低い。

以上の諸技術から推してＰＨＨの物性が改良でき結晶化度の低い生分解性ポリエステルの開発必要性が台頭しており、同時にこの低い結晶化度の生分解性ポリエステルの生産性を高めることのできる製造工程の開発が要求される。

オヤイツ（Ｏｙａｉｚ）などのＪ、Ｇｅｎ、　Ａｐｐｉ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ、　ｖｏｌ、　２９、ｐｐ、１７−４０　（＋９８３）によれば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の諸種の微生物は細胞内の脂肪酸および３−ヒドロキシ脂肪酸の造成に特異性を有することが明かされた。またフルコ（Ｆｕｌｃ。

）のＰｒｏｇ、　ＬｉｐｉｄＲｅｓ、、　ｖｏｌ、２２．　ｐｐ、ｌ　３３−１６０　（１９８３）によると大部分のグラム陰性バクテリアに３−ヒドロキシ脂肪酸が広く分布しているといい、ウィソルトｆｌＬＬｈｏＨ）などのＡｐｐｌ、　Ｅｎｖｉｉｒｏｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　ｖｏｌ、　５４．　Ｎａｌ　２．　Ｉ）　ｐ、２９２４−２９３２　（＋９８８）で提案しているＰ、　ｏｌｅｏｖ。

ｒａｎ種でのＰＨＡ共重合体生合成経路によると３−ヒドロキシ脂肪酸はａｃｙｌ−ＣｏＡ　５ｙｎｔｈｅｔａｓｅとＰ　ＨＡ　５ｙｎｔｈｅｔａｓｅの作用により重合され、以上の発表に基づけばこれは多様な大きさの炭素数０４〜ＣＩ６の３−ヒドロキシカルボン酸が重合したＰＨＡ共重合体が微生物によって生産できることを意味する。

その例として、ダウニス（Ｄａｗｅｓ）などのＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１ｅｔｔｅｒｓ、　ｖａｔ、　１１．　ｋ７．　ｐｐ、　４７１−４７６　（１９８９）ではＰｓｅｕｄｏ＋ｎｏｎａｓ属のＰ、　ｐｕｔｉｄａ、　Ｐ、　ｏｌｅｏｖｏｒａｎ　、　Ｐ、　ａｅｒｏｇｉｎｏｓａ、　Ｐ、　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅなどの種はアルカン（ａｌｋａｎｅ）　、アルカノール（ａｌｋａｎｏｌ　）　、アルカン酸（ａｌｋａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ）を利用してＣ６〜ＣＩＯの３−ヒドロキシ酸ＰＨＡ共重合体ポリエステルを生産している。しかしこれらの菌はその炭素源として葡萄糖、果糖、砂糖のように同化速度の高い炭水化物を利用してＰＨＡを生産しないからその生産性が極めて低いという問題がある。

本発明はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属ｃｅｐａｃｉａ種の微生物を好気的（ａｅｒｏｂｉｃ）細胞培養のあと窒素源などの栄養成分を制限して細胞内で広範囲の炭素数０４〜Ｃ１４の３−ヒドロキノカルボン酸のＰＨＡ共重合体ポリエステルを生産するためのものである。

従来の諸技術をみるとＰＨＨの物性、加工性を改良するために共重合体の生産に力を注いだ結果、共重合体を生産するとき細胞に有毒な有機酸を利用することによってＰＨＢのホモポリマー生産と比べてその生産性が著しく減少するが、日本特許公開公報昭６３−２２６２９１の場合と同じく炭素源として飽和、不飽和炭化水素を使用するから細胞の成長およびＰＨＡの生産性が低かった反面、本発明では広範囲の炭素数を有する３−ヒドロキシカルボン酸の共重合体を砂糖、葡萄糖、果糖、グリセリンなどのような同化性の極めて高い炭水化物を炭素源とし・　て使用するからその生産性が極めて高い製造方法を開発し、ここで開発したＰＨＡ共重合体は結晶化度が低いため既存のＰＨＢを代替するとか高分子ブレンディング技術を利用してＰＨＢの物性を改良するのに有益に利用できるものである。

（１）共重合体のモノマー構成本発明では砂糖、葡萄糖、果糖、グリセリンなどの炭水化物と糖蜜などの複合炭水化物を細胞の成長とＰＨＡ共重合体の生産の同一炭素源として利用する生産性の高い方法でありここで生産された共重合体の構成は次のとおりである。

本発明で生産の共重合体は炭素数がＣ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃｔ０１２、Ｃ１４である３−ヒドロキシカルボン酸たちとその側鎖のω２位置に二重結合を含んだＣ６、Ｃ８、Ｃｌ０１ＣＩ２、ＣＩ４の３−ヒドロキシカルボン酸たちをモノマーとするポリエステル結合の高分子である。

（２）使用菌株本発明で使用した菌株はｏｅｒｇｙのＭａｎｕａｌ　ｏｒ　ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　（Ｎ、　Ｒ，Ｋｒｉｅｇ、Ｊ、　Ｇ、　Ｈｏ１ｅ著）第８版によるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属のｃｅｐａｃｉａ種に属する。しかし、Ｐｓｅｕｄｏ＋ｎｏｎａｓ属各種の細胞内部の脂肪酸（ｌａｔｔｙ　ａｃｉｄ）および３−ヒドロキシ脂肪酸の構成によって分類したオヤイツ（Ｏｙａｉｚ）などのＪ、Ｇｅｎ、　Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　ｖｏｌ、２９．　ｐｐ　１　？−４０でみると３−ヒドロキシテトラゾカッエート（３−ｈｙｄｒｏｘｙ　ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏａｔｅ）をつくる点にあってはｃｅｐａｃｉａ種と一致するが、３−ヒドロキシカルボン酸３−ｈｙｄｒｏｘｙ　ｄｅｃａｎｏａｔｅ　）と３−ヒドロキシウンデカノエート（３−ｈｙｄｒｏｘｙ　ｕｎｄｅｃａｎｏａｔｅ　）を等しく生産するという点にあってはＣｅｐａｃｉａ種と異なる。

本発明で使用した菌株Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｅｐａｃｉａ　Ｋ　Ｙ　Ｇ　 −５０５は１９９０年＋１月２９日に韓国微生物センターと延世大学校工科大学食品工学課（ソウル市西大門区１２０−７４９）に委託された。委託番号はＫＣＣＭＩ　ＯＯ０４である。

菌株Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｅｐａｃｉａは織物工場の排水からサンプルを得て、これを０．８５％（Ｗ／Ｖ）ＮａＣ１溶液により１０’〜１０’倍量に希釈し得られるが、次の国学的性質を有する。

〈細胞分離源〉廃水く細胞の顕微鏡上の形態〉１、細胞の様子：竿状（直径０．７〜１．１μｍ、長さ１．　５〜４．　０μｍ）２、鞭毛：多軸性鞭毛３、単細胞、双細胞で存在４、運動性　揚性５．胞子形成：陰性６、ダラム染色・陰性７、ＰＨＢ生成・陽性く各種培地上での生育状態〉１、酵母エキス寒天培地での表面培養３５℃、２４時間培養隆起度：中間表面　偏平または低い半球形細胞群集の大きさ　１〜３龍細胞群集の色　白透明度　低いＰ　ＨＡを生成２、酵母エキス液体培養３５℃、２４時間培養生育速度　極めて早い、単細胞のみ存在細胞培養液の色、培養初期には白、末期には褐色に変色ＰＨＡを生成３、砂糖（ｓｕｃｒｏｓｅ）含有の寒天培地で表面培養３５℃、２４時間培養隆起度、低い表面：偏平または低い半球形細胞群集の大きさ　０．５〜ｌ、５− 細胞群集の色　白透明度：低いＰ　ＨＡを生成４、砂糖（ｓｕｃｒｏｓｅ）含有の液体合成培地で培養３５℃、２４時間培養生育速度；早い、単細胞および双細胞で存在細胞培養液の色・培養初期には白、末期には褐色に変色ＰＨＡを生成〈生理学的性質ンｌ、カタラーゼ（Ｃａｔａｌａｓｅ）　：陽性２、酸化酵素（Ｏｘｉｄａｓｅ）　陽性３、ウレアーゼ（Ｕｒｅａｓｅ）　：陽性４、硝酸塩還元、陰性５、砂糖（ｓｕｃｒｏｓｅ）からのＬｅｖａｎ形成、陰性６、ゼラチン加水分解：陽性７、澱粉加水分解・陰性８、細胞外部ＰＨＢ加水分解・陰性９、脱窒素化、陰性１０、色素の生成：培養初期には黄白色培養後期には褐色比窒素源の利用　アンモニューム塩および尿素を利用、生育する＋２．酸素にたいする性質　好気性＋３．生育ＰＨ：ＰＨ４〜９で生育ＰＨ６，５〜７．０で最適生育＋４．生育温度　１０〜４０℃ ３０〜３５℃が最適１５、Ｇ＋Ｃ成分含量：　６７．　０〜６７．　５　ｍｏ１％Ｉ６　炭素源の同化性およびＰ　ＨＡ生成（３）ＰＨＡの分析ＧＣ及びＧＣ−マススペクトルの分析のためにＰＨＡをＢｒａｕｎｅｇｇなとのＥｕｒ、　Ｊ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　、　Ｖｏｌ、　６．　ＰＰ２９−３７（１９８７）の方法により処理してサンプルを準備した。定量分析のためにはＰＨＢを標準材料として使用したが、ＰＨＢ量とに対するＧＣスペクトル上の［標準定量直線Ｊは第１図のとおりである。

第２図はＰＨＡのＧＣスペクトル分析結果であり、ピーク１．２．４．６．８．１０は炭素数４．６．１Ｏ２１２，１４の３−ヒドロキノカルボン酸たちで、次の一般構造を有するモノマーである。

またビーク７．３．５．９、ｉｔは炭素数６．８、ｌ０１１２．１４の３−ヒドロキノカルボン酸たちで、側鎖のω２位置に二重結合を有する次の一般構造を持つモノマーである。

各ピークの構造及び成分名は下記表１のとおりである。

各ピークのＧＣ上の保持時間のｌｏｇ値と炭素数の相関関係第３図のとおりであり、炭素数による保持時間の周期性のあごとを知ることができる。ＧＣスペクトル上の他のピーク４１　Ｐ　Ｈへの末端のＯＨ基を封鎖する有機酸またはその誘導体推定され（３）ＰＨＡ共重合体の構造分析第４図は化学イオン（ｃｈｅｍｉｃａｌ　１ｏｎｉｚａｔｉｏｎ）によるマススペクトルで３ＵＡと３ＵＥの資料である。

第４図の（ａ）をみると分子量が２３０であり、（ｂ）をみると分子量が２２８であることを知ることができる。また第５）、（ｂ）ともに分子量の差が２になるピーク（ｍ／ｅ＝１３８、＋３６、ｍ／ｅ＝１８０．１７８、ｍ／ｅ＝２１２．２１Ｏ）があることをみることができ、これは二重結合による分子量２の減少を意味する。

第５図（ｂ）のｍ／ｅ＝１２６のピークは３ＵＥの二重結合を有する側鎖でありＰＨＡのすべての構成成分のマススペクトルでは共通的にＩ　Ｏ３（ＨＯＣＨＣＨ２ＣＯＯＣＨ，）　、／、４３　（ＯＨＣＨＣＨ２）ピークをもっている。

ＮＭＲスペクトルは第６図でＰＨＢのスペクトルと比較した。ＰＨＢと比較するとき側鎖の水素原子ピークが６＝０．９１、ｌ、２７．１．５９ｐｐｍの三つに分離して現れており特に側鎖の二重結合のビニル基の水素原子ピークが６＝２．０５と現れている。

ＩＲスペクトルは第７図で（ａ）はＰ　ＨＢ、（ｂ）はＰＨＡのものである。二つの場合とも１７２５ｃｍ’にエステルカルボニルバンドチレンのバンドが（ｂ）の場合３０８０ｃｍ’で側鎖の炭素二重結合のバンドが現れている。

（４）細胞成長および生産条件すべての実験はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｅｐａｃｉａ　Ｋ　Ｙ　Ｇ　−　５　０　５　（Ｋ　ＣＣＭＩ０００４）を使用した。細胞の成長には炭素源、窒素源およびＰ．Ｍｇ，に、Ｎａなどの塩類が必要であり微量元素のＦｅ−　Ｍｎ．Ｃｏ、Ｃａ，Ｃｕ，Ｚｎなど力（必要である。

このような栄養のほかに好気成長のための酸素の供給を要し生育のための最適の酸性度はｐ）（＝６．５〜７、０てあり、最適の成長温度は３０〜３５℃である。使用可能な炭素源としては砂糖（ｓｕｃｒｏｓｅ）　、果糖（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）、葡萄糖（ｇｌｕｃｏｓｅ）　、マルトース（ｆｆｌａ■ＯＳＣ）ナトノ炭水化物とエタノール（ｅｔｈａｎｏｌ　）、グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）　、ｎ−プロパツール（　ｎ　−　ｐｒｏｐａｎｏｌ）、ｎ−ブタノール（ｎ　 −ｂｕｔａｎｏｌ　）　、プロピレンゲ盲ノコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ）のような７　／ｌ／　コ−　／ｌ／類、７セーｒ−ト（ａｃｅｔａｔｅ　）　、プロピオネート（ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）　、ブチラード（ｂｕｔｙｒａｔｅ）　、バレレート（ｖａｌｅｒａｔｅ）　、ラクテート（　Ｉａｃｔａｔｅ）、ントレート（ｃｉｔｒａｔｅ　）などのような有機酸とグルタメイト（ｇｌｕｔａｍａｔｅ　）　、ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ　）　、アスノ（ラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）などのようなアミノ酸が可能である。複合炭素源としては魚油（ｆｉｓｈ　ｏｉｌ）、糖蜜（ｍｏｌａｓｓｅｓ）　、酵母エキス（ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ）などが利用可能である。

窒素源としてはアンモニュームイオン塩である硫酸アンモニューム、塩化アンモニューム、水酸化アンモニューム産アンモニア水などと尿素を使用することができる。

ＰＨＡ共重合体の細胞内蓄積、生産は培地内の栄養源１種またはそれ以上の枯渇によってはじまり一般的に窒素源の枯渇によって最も高い蓄積をみせる。また蓄積されたＰＨＡはエネルギーおよび炭素源の貯蔵物質であるから培地内の炭素源の枯渇によって代謝過程で再使用されその蓄積率が減少するので培地内の炭素源の十分な状態で窒素源を制限してその生産・蓄積を誘導せねばならない。

細胞の継代培養および保存のためには下の構成をもったＹＭ培地を３５℃で培養した。

ＹＭ培地：酵母エキス　３　ｇ／Ｌ麦芽エキス　３ｇ／Ｌｔｒｙｐｔｏｎ　５　ｇ　／　Ｌｓｕｃｒｏｓｅ　５　ｇ　／　Ｌ細胞の培養はＩＬフラスコで下の構成をもった２００ｔｄの成長培地を培養温度３５℃、１５０〜２　０　０　ｒｐｍの振盪培養器で１２〜２４時間おこなった。

Ｋ１４１　Ｐ　Ｏ，Ｉ　ｇ／　ＬＮａ２ＨＰＯ．ｌ　２Ｈ２０　３．Ｏｇ／ＬＭｇＳ０．　０．４ｇ／Ｌ（ＮＨＩ）２　ＳＯ，　０．５　ｇ／Ｌ微量元素溶液　４−／Ｌ炭素源は０．　５％（Ｗ／　Ｖ　）を使用し微量元素溶液の構成は次のとおりである。

Ｆ　ｅ　Ｓｏ．７　Ｈｉｏ　３．　Ｏ　ｇ／　ＬＣａＣｌｚ　２Ｈｇ　Ｏ　２，５ｇ／ＬＺｎＳ０．７Ｈｔ　０　２　０　０■／ＬＨ３ＢＯ，　ａｏｏ■／ＬＭｎＣＬ　４８．０　６０ｍｇ／ＬＣｏＣ］。６　＋４２０　４０　ｍｇ／　ＬＣｕ　Ｓ　０．５　Ｈ２０２０ＩＩｇ／　ＬＮｉＣｌ、６Ｈ２０４０＊／Ｌ細胞のＰ　Ｉ−（Ａ蓄積・生産実験では他の培養条件はすべて成長培地と同一にし硫酸アンモニュームの濃度だけを０．２５ｇ／Ｌに低めて培養することによって初期１２時間は菌体成長をおこしたあと制限されるようにすることによってＰ　ＨＡの蓄積を誘導した。細胞内で蓄積速度を高めるためには硫酸アンモニュームの濃度がＯ，Ｉｇ／Ｌ以下に制限されねばならず、炭素源は十分に維持せねばならない。また蓄積速度を高めるためにはｐＨ＝６．５〜７．０に維持せねばならず燐酸カリューム塩と燐酸ナトリューム水化物をそれぞれ１．０〜２．０ｇ／Ｌ、３、ｏ＝６．０ｇ／Ｌ、Ｍｇ５Ｏ，の濃度を０．２〜０．４ｇ／し、微量元素の濃度を０．５〜４Ｊ／Ｌにする。

（５）ＰＩ−ＩＡの分離精製細胞内に蓄積のＰ　ＨＡを分離精製するには公知の方法が幾種もあって、アメリカ特許第３，０３６，９５９号、３，０４４．９４２号、３，２７５，６１０号などからみれば培養液から菌体を分離収去のあと、アセトンで洗浄して細胞膜の脂質を一部除去してクロロフォルム、メチレンクロライド、ピリジンなどの溶剤でＰ　ＨＡを抽出してから各種の後処理をおこなう。

本研究でも菌体内に蓄積されたＰＨＡの分離精製には類似の方法を使用した。培養液５００ｇを１０分間遠心分離して菌体を分離収去し、アセトンで洗浄、乾燥のあとクロロフォルムで菌体をよく解いて懸濁させてから８０〜１００℃で４〜８時間静置のあとＰ　ｌ（Ａを抽出した。

抽出したクロロフォルム溶液を濾過して残存菌体を除去したあとクロロフォルム溶液に対し５〜１０倍のボリュウームの沈澱剤を添加して非結晶質のＰ　ＨＡ共重合体を得た。沈澱剤としては水、メタノール、エタノール、アセトン、エーテル、ヘキサンを使用したがメタノールとエタノールだけに非結晶質沈澱がみられた。このあとはすべての分離精製過程で沈澱剤としてメチルアルコールを使用した。

（６）ＰＨＢとＰ　ＨＡの溶液ブレンディングヨーロソバ特許第０．０５２．４６０号ではＰ　ＨＢに合成高分子をブレンディングすることによってＰ　）（Ｂの物性を改良した。しかし添加剤として使用した合成高分子はＰ　ＨＢとは異なり生分解ができない成分なので生産された高分子ブレンドはＰｌ−（Ｂのもっとも大きな長所である生分解性に問題をおこす。

本研究で開発したＰ　ＨＡ結晶化度がすこぶる高いＰＨＢとは反対に結晶化度がすこぶる低い非結晶質の高分子であって生分解の可能な高分子であるがらＰ　ＩＩ　Ｂとブレンディングしてその相対含量を任意に調節して多様な物性の生分解性高分子を得ることができる。

本発明では菌体からＩ）　ＨＡを抽出したクロロフォルム溶液に適量のＰ　ＨＢを添加して溶かしたあと２０〜ＩＯθ℃で１０〜６０分間攪拌してからクロロフォルムを蒸発させるが５〜１０倍！（クロロフォルム溶液にたいして）の沈澱剤を添加してＰＨＡブレンド高分子の沈澱を生成させ濾過して１００℃で真空状態で乾燥させ１月４Ａブレンドを得た。

（７）ＰＨＡの物性および生分解性生産されたＰＨＡは非結晶質の高分子であり融点（Ｔｍ）は存在しない。分子量の分布は第８図のとおりである。

ブランドル（Ｂｒａｎｄｌｅ）なとのＡｐｐｌ、　Ｅｎｖｉｒｏｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　ｖｏｆ、５４．ＮＱ８．、ｐｐ１９７７−１９８２　（＋９８９）てみると長い側鎖を有するＰＩＣＡの生分解速度はＰ　Ｉ−Ｉ　Ｂと比べてより遅いだろうと主張している。

本研究で開発したＰＨＡは側鎖の長さの長いＰ　ＨＡてあり生分解速度がＰ　ＨＢより遅いことと予測されるがＰＨＢとブレンディングすることによってその生分解速度が調節可能である。

（８）産業上の打用性本発明によって獲得したＰ　ＨＡ共重合体はポリエステル重合体であり既存のＰＨＢと類似の高分子である。

熱可塑性の生分解性高分子であるＰＨＢは農業用および各種フィルム、容器などの成形物、手術用の縫合糸、人工皮膚組織、骨移植組織、光学活性充填物、医薬伝達体系などの分野に応用性があるがその物性が加工に適しないという欠点がある。

本発明で獲得したＰ　ＨＡはＰＨＢとブレンディングすることによって既存のＰ　ＨＢの物性を改良してその応用性をはるかに拡大する長所を有し、同時に生分解性をそのまま保有する高分子ブレンドをこしらえるのに使用できる。

すなわち、本発明のＰ　ＨＡはＰ　ＨＢの産業的用途がすべて代替できる高分子であり、また一部モノマーの側鎖のω２位置に二重結合を保有しているから各種有機化学的変形を通しての機能性が付与できるので多様な機能をもった生分解性高分子を得ることができる。

本発明は下記の実施例を通して一層詳細に説明するが、これらに局限されるものではない。

実施例１Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｅｐａｃｉａ　ＫＹＧ　−５０５（ＫＣＣＭ　Ｉ　ＯＯ０４）を利用して炭素源５　ｇ／Ｌ、窒素源０．２５ｇ／Ｌをもった次の合成培地２００−をＩＬ振盪フラスコで２４時間培養した。

ＫＨ２ＰＯ，ｌ　ｇ／ＬＮａ２　ＨＰＯ，Ｉ　２１−１２０　３　ｇ／Ｌ（ＮＨ，）　２　Ｓｏ、　０．２５　ｇ／ＬＭｇＳ０．　０．　４ｇ／Ｌ微量元素溶液　４−／Ｌここて微量元素溶液の構成は次のとおりである。

Ｆ　ｅ　Ｓ　０．７　Ｈ２０３ｇ　／　ＬＣａＣ１２２Ｈ＋　０　２．５ｇ／ＬＺｎＳ０．７Ｈ，０２００ｘ／ＬＨ３ＢＯ１６００■／ＬＭｎＣＩ２４Ｈ２０６０ｗ／ＬＣｏＣＩ□６Ｈ□０　４００ｍｇ／ＬＣｕＳ０，５Ｈ＋　０　２０ｍｇ／ＬＮｉＣ１゜６　Ｈ＋　０　４０ｍｇ／　Ｌ実験した炭素源は砂糖（ｓｕｃｒｏｓｅ）　、果糖（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）、葡萄糖（ｇｌｕｃｏｓｅ）　、マルトース（ｍａｌｔａｓｅ）　、グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、糖蜜（ｍｏｌａｓｓｅｓ）　、魚油（ｆｉｓｈ　ｏｉｌ）　、これらで培養した１００Ｔｎｌの培養液を遠心分離してアセトンで洗浄のあと２０■の乾燥細胞からＰ　Ｉ（Ａを抽出・分析した。

それぞれの炭素原料にした細胞濃度およびＰ　ＨＡ含有量は次の表２に示すとおりである。

表２．炭素源別にした細胞濃度およびＰＨＡ蓄積率実施例　２．ＰＨの細胞成長およびＰＨＡ蓄積に及ぼす影響Ｐｓｅｕｄｏｆｆｉｏｎａｓ　ｄｅｐａｃｉａ　ＫＹＧ−５０５（ＫＣＣＭ　１０００４）を実施例１の合成培地にて５　ｇ／Ｌの砂糖（ｓｕｃｒｏｓｅ）　、０．２５ｇ／Ｌの（ＮＨ，）２　ＳＯ，を添加してそれぞれｐＨ４，５，６，７，８で２４時間培養した。各ｐＨでの培養液を１００−遠心分離し、アセトンで洗浄のあと２ｏ■の乾燥細胞がらＰＨＡを抽出、分析した。

各ｐＨによる細胞の濃度およびＰＨＡは表３に示し、表４ではＰＨＡの各モノマーの含量を示した。

表５ではｐＨの変化による二重結合含有成分の相対的含量を示した。

表３．ｐＨ変化による細胞濃度および蓄積重要４．ｐＨの変化によるＰＨＡの各モノマーの含量表５．ｐＨによる二重結合の相対的含量（ｗｔ％）実施例３．ＰＯ，”−の細胞成長およびＰＨＡ蓄積に及ぼす影響Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｅｐａｃｉａ　ＫＹＧ　−５０５（ＫＣＣＭ　Ｉ　ＯＯＯ４）を、実施例１（７）合成培地でＫＨｚ　ＰＯｔ　１．０ｇ／Ｌ、Ｎａ２　ＨＰＯｌ−１２Ｈ２０３，Ｏｇ／Ｌの００ＯＳ０．２，０．５．１．Ｏ１２，０，３，０，５，０倍濃度にしてそれぞれＩＬ振盪フラスコに入れて２４時間培養した。

各濃度の培養で１００−を遠心分離しアセトンで洗浄のあと２０■の乾燥細胞からＰＨＡを抽出、分析した。

それぞれの燐酸塩の濃度による最終細胞濃度およびＰＨＡ蓄積率は表６に示し、ＰＨＡ各成分の含量は表７に示した。

表６　燐酸塩の１度による最終細胞濃度およびＰＨＡ蓄積蓄積率表情酸塩の１度にょるＰＨＡ各単量体の含量（ｗｔ％）実施例４−　Ｍｇ　Ｓ　ｏ　＋の細胞成長およびＰＨＡの蓄積に及ぼす影響Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｅｐａｃｉａ　ＫＹＧ　−５０５（ＫＣＣＭ　１０００４）を実施例Ｉの合成培地からＭｇ５Ｏ＋だけを除いて５．　０ｇ／Ｌの砂糖、０．２５ｇ／ＬＯ）（ＮＨ，）２３ｏｔを添加してＭｇ５ＯＩの濃度を各お（７）Ｏ，０，０，２，０，４，１，０，３，０ｇ／Ｌの濃度にしてＩＬ振盪フラスコで２４時間培養した。各濃度の培養液から１００４を遠心分離してアセトンで洗浄のあと２ｏ■の乾燥細胞がらＰＨＡを抽出、分析した。

Ｍｇ５Ｏ＋の各濃度による最終細胞濃度およびＰＨＡ蓄積率は表８に示し、ＰＨＡ各成分の含量は表９に示した。

表ｓ　、　Ｍ　ｇ　Ｓ　ｏ　＊の濃度による最適の細胞濃度およびＰＨＡ蓄積率表９．Ｍｇ５Ｏ，濃度にょるＰＨＡ各モノマーの含量実施ｆＩＩＩ５．微量元素が細胞の成長とＰＨＡの蓄積に及ぼす影響Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｅｐａｃｉａ　ＫＹＧ　−５０５（ＫＣＣＭ　１０００４）を、実施例１の合成培地から微量元素だけを除外して５゜０ｇ／Ｌの砂糖（ｓｕｃｒｏｓｅ）　、０．　２５　ｇ／Ｌの（ＮＨ４）ｓ　ＳＯ，を添加し、微量元素溶液をそれぞれ０．０．０．５、■。

５．４，０．８．０，１５．０Ｊ／Ｌの濃度にして、ＩＬ振盪フラスコで２４時間培養した。各濃度の培養液から１００−を遠心分離してアセトンで洗浄の上２０■の乾燥細胞からＰＨＡを抽出、分析した。

それぞれの微量元素溶液濃度による最終細胞濃度、Ｐ　ＨＡ蓄積率を表ＩＯに示し、ＰＨＡ各成分の含量は表１．１に示した。

表ＩＯ微量元素溶液別の最終細胞濃度およびＰＨＡ蓄積率表重要、微量元素溶液濃度別の各モノマー含量（ｗｔ％）実施例６．ＰＨＢとＰＨＡ溶液のブレンディングＰｓｅｕｄｏｉｏｎａｓ　ｃｅｐａｃｉａ　ＫＹＧ　−５０５（ＫＣＣＭ　１０００４）を利用、実施例１の合成培地から砂糖（ｓｕｃｒｏｓｅ）と（ＮＨ、＞　、ＳＯ，を利用して細胞培養した７５％ＰＨＡ蓄積率の乾燥細胞２２ｇを５００−のクロロフォルムで抽出した。抽出したクロロ７ｔルム溶液０．０．５．１０，２０．５ｏ、８０ｉを２ｇのＰＨＢを溶かしたｌｏｍＬのクロロフォルム溶液とそれぞれ混ぜて２５℃で１時間攪拌のあとクロロフォルム溶液にだいし５倍量のメチルアルコールを加えて沈殿させてから濾過して１００℃、真空状態で乾燥させてＰ　ＨＡ高分子ブレンドを得た。添加したＰＨＡ抽出溶液の量による沈殿量は第９図に示すとおりで、第１０図は溶液ブレンディングのとき沈殿前の溶液状態でのＰ　ＨＡの相対含量と沈殿のあと生成の高分子ブレンド内での相対含量を分析して表示したものであり、沈殿前後Ｐ　Ｉ−（Ａの相対含量には変化がなくこれはＰＨＡとＰＨＢが同時に沈殿することを意味する。

図面の簡単な説明第１図はＰ　ＨＡ共重合体の定量のためのＰＨＢ標準定量直線である。ＰＨＡの定量のためにＰ　ＨＢを標準試料として、ＧＣスペクトルを分析、面積を比較、計算することによってＰＨＡの量を計算する。

第２図はＰ　ＨＡ共重合体のＧＣスペクトルである。ＰＨＡをメチルエステル化してＧＣを分析した結果、各ピークはＰＨＡを構成するモノマーたちのメチルエステル分子であることが判明した。

第３図はＧＣスペクトル上でＰ　ＨＡ共重合高分子の各モノマーの保持時間（ＲＴ　：　Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ）のｌｏｇ値と炭素数との関係を表す。

炭素数に比例してＲＴのｌｏｇ値が増加することを表す。

第４　（ａ）図は３−ヒドロキシウンデカノエートメチルエステル（３−ｈｙｄｒｏｘｙ　ｕｎｄｅｃａｎｏａｔｅ　ｍｅｔｈｙｌ　ｅｓｔｅｒ　：　３　ＵＡ）のＣＩ　（Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）質量スペクトルである。分子量＝２３１−１．＝２３０であることが分かり２１３番ピークは３ＵＡメチルエステル分子からＨ２Ｏが脱落して生じたピークである第４　（ｂ）図は３ −ヒドロキシ−１Ｏ−ウンデセノエートメチルエステル（３−ｈｙｄｒｏｘｙ　 −１０−ｕｎｄｅｃｅｎｏａｔｅ　ｍｅｔｈｙｌ　ｅｓｔｅｒ　：　３ＵＡ）のＣＩ質量スペクトルである。（＊分子量＝２２９−１＝２２８であることが分かり、２１１ビークは３ＵＡのメチルエステル分子からＨ＋Ｏが脱落して生じたピークである。

第５（ａ）図は３−ヒドロキシウンデカノエートメチルエステル（３−ｈｙｄｒｏｘｙ　ｕｎｄｅｃｅｎｏａｔｅ　ｏ＋ｅｔｈｙｌ　ｅｓｔｅｒ　：　３　ＵＡ）のＥ　Ｔ　（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ　Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）質量スペクトルである。

第５　（ｂ）図は３−ヒドロキシ−１０−ウンデセノエートメチルエステル（３ −ｈｙｄｒｏｘｙ　−１０−ｕｎｄｅｃｅｎｏａｔｅ　ｍｅｔｈｙｌ　ｅｓｔｅｒ　：３ＵＥ）のＥＩ７ｉ量スペクトルである。

第６図はＰＨＡ共重合高分子の’ｌ−ｌ−１−Ｎスペクトルである。

第７　（ａ）図はＰ　ＨＢのＩＲスペクトルである。

第７　（ｂ）図はＰＨＡ共重合体のＩＲスペクトルである。

第８図はＰ　ＨＡ共重合体の分子量分布曲線である。

第９図はＰＨＡ共重合体とＰＨＨの溶液ブレンディング中ＰＨＡ共重合体の量（クロロホルム抽出液により生成した沈澱の量）である。

第１Ｏ図はＰＨＡ共重合体とＰ　ＨＢの溶液ブレンディング後共沈を起こす前のＰＨＡの相対含量と共沈後に生成の沈澱でのＰＨＡの相対含量の比較を示す。

ＦＩＧ、ＩＰＨＢ　（ｍｇ）／２ｍＬクロロフォルムＦＩＧ、２ＦＩｏ、３ＦＩＧ、Ｌ、（ｂ）質量／１１荷ＦＩｏ、５（ａ）質量／電荷ＦＩＧ、５（ｂ）質量／電荷ＦＩＧ、７にａＪＦｌｏ、８分子量ＦＩＧ、９クロロフォルム抽出液量（ｍＬ）クロロフォルム抽出液量［ｍＬ）国際調査報告一一一−＾−ｍｋ、ＰＣ？／にＲ９１１０００１９フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号庁内整理番号／／（Ｃ１２Ｎ　１／２０Ｃ１２Ｒ１：３８）Ｉ

Claims

【特許請求の範囲】１．下記構造式（１）のモノマーと構造式（２）のモノマーで構成される平均分子量１０．０００以上のポり−β−ヒドロキシアルカノエート（ｐｏｌｙ−β− ｈｙｒｏｘｙａｌｋａｏａｔｅ；ＰＨＡ）の共重合体。（１）▲数式、化学式、表等があります▼（２）▲数式、化学式、表等があります▼（ｎ＝２、４、６、８ａｎｄ　ｍ＝０、２、４、６、８）２．下記のようなモノマー及び重量含量範囲の構造を有することを特徴とする請求項１記載のＰＨＡ共重合体。３−ヒドロキシブチレート（３−ｈｙｄｒｏｘｙ　ｂｕｔｙｒａｔｅ）；０．０ −０．５Ｗｔ％３−ヒドロキシヘキサノエート（３−ｈｙｄｒｏｘｙ　ｈｅｘａｎａｔｅ）１．０−５．０ｗｔ％３−ヒドロキシ−４−ヒキサノエート（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｈｅｘｅｎｏａｔｅ）；０．０−１．０ｗｔ％３−ヒドロキシオクタノエート（３−ｈｙｄｒｏｘｙ　ｏｃｔａｎｏａｔｅ）５．０−１５．０ｗｔ％３−ヒドロキシ−６−オクタノエート（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｏｃｔｅｎｏａｔｅ）；０．０−５．０ｗｔ％３−ヒドロキシデカノエート（３−ｈｙｄｒｏｘｙ　ｄｅｃａｏａｔｅ）；４０．０−６０．０ｗｔ％３−ヒドロキシ−８−デカノェート（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−８−ｄｅｃｅｎｏａｔｅ）；０．０−１０．０ｗｔ％３−ヒドロキシウンデカノエート（３−ｈｙｄｒｏｘｙ　ｕｎｄｅｃａｎｏａｔｅ）；１０．０−２０．０ｗｔ％３−ヒドロキシ−１０−ウンデセノエート（３−ｙｄｒｏｘｙ−１０−ｕｎｄｅｃｅａｏａｔｅ）；０．０−２０．０ｗｔ％３−ヒドロキシテトラデカノエート（３−ｈｙｄｒｏｘｙ　ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏａｔｅ）；０．０−５．０ｗｔ％３−ヒドロキシ−１２−デセノエート（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−１２−ｔｅｔｒａｄｅｃｅｎｏａｔｅ）；０．０−５．０ｗｔ％３．請求項１記載のＰＨＡ共重合体を生産するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｅｐａｃｉａ（ＫＣＣＭ　１０００４）およびその変種。４．炭素源、窒素源、その他を栄養源として含む培養液からＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｅｐａｃｉａ（ＫＣＣＭ　１０００４）およびその変種を培養した後、窒素源およびその他の栄養源を制限して菌体からＰＨＡ共重合体を生産する方法。５．炭素源が葡萄糖、果糖、マルトース、糖蜜、魚油であることを特徴とする請求項４記載の方法。６．炭素源としてアセテート（ａｃｅｔａｔｅ）、プロピオネート（ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、ブチレート（ｂｕｔｙｒａｔｅ）、バレレート（ｖａｌｅｒａｔｅ）、ラクテート（ｌａｃｔａｔｅ）、シトレート（ｃｉｔｒａｔｅ）などの有機酸を使用することを特徴とする請求項４記載の方法。７．炭素源としてエタノール（ｅｔｈａｎｏｌ）、グリセロール（ｇｌｙｓｅｒｏｌ）、ｎ−プロパノール（ｎ−ｐｒｏｐａｎｏＩ）、ｎ−ブタノール（ｎ−ｂｕｔａｎｏｌ）、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ）などのアコールを使用することを特徴とする請求項４記載の方法。８．窒素源としてアンモニュームイオン塩または尿素を使用して菌体を増殖させたあと培養液中のアンモニュームイオンの濃度を０．０３ｇ／Ｌ以下に制限してＰＨＡ共重合体を生産することを特徴とする請求項４記載の方法。９．硫酸マグネシュームの濃度が０．２−０．４ｇ／しであることを特徴とする請求項４記載の方法。１０．微量元素溶液の濃度が０．５−４ｍｅ／しであることを特徴とする請求項４記載の方法。１１．請求項１記載のＰＨＡ共重合体０．５−９９．５ｗｔ％とＰＨＢ　９９．５−０．５ＷＴ％とで構成される分子量１万以上の高分子ブレンド。１２．請求項２記載のＰＨＡ共重合体０．５−９９．５ｗｔ％とＰＨＢ９９．５ −０．５ｗｔ％とで構成される分子量１万以上の高分子ブレンド。