JPH05508321A - ペプチドライブラリィ及びスクリーニングシステム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ペプチドライブラリィ及びスクリーニングシステム発明の分野 本発明は、一般的に対象のレセプター分子に対するペプチドを選択するための方 法及びより特定には、所望する結合特徴を有するペプチドのための大きなペプチ ドライブラリィを生成し、そしてスクリーニングするための方法に関する。

発明の背景 分子生物学は、特定の生物学的活性に寄与するタンパク質の領域の定義を助けて 来たので、それらの活性を模倣するために（又は阻害するために）短いペプチド を合成することが所望されるようになった。′＃製されたタンパク質、又は組換 え手段により生成されたタンパク質により、治療、診断及び産業環境において遭 遇される多くの欠点が短い合成ペプチドにより容易に回避され得る。たとえば、 合成ペプチドは、特異性、サンプル又はバルク調製の便利さ、比較的低い費用、 高い程度の純度、及び長い貯蔵寿命の利点を付与する。

合成ペプチドの高い見込にもかかわらず、その技法は、はとんどの程度まで実験 室用工具のままである。正確な配列及び結合データは、有意な医学、農学又は産 業的興味のほとんどのタンパク質のために利用できない、タンパク質の配列が知 られている場合でさえ、生物学的活性を担当し、又はそれに寄与する短い配列を 同定する方法は、ひじょうに退屈であり、そうでない場合、はとんど不可能であ る。

従って、所望する結合活性のためにペプチドのひじょうに多くの収集物を生成し 、そして効果的にスクリーンする能力が、ばく大な興味の対象である。それは、 レセプターのための新規のアゴニスト及びアンタゴニストの同定、酵素の特異的 インヒビターの単離を可能にし、多くのタンパク質の結合部位の構造的及び機能 的分析のためのプローブ及び広範囲の種類の用途に使用される多くの他の化合物 のためのりガントを供給する。

オリゴヌクレオチドのランダムに生成された混合物のクローニング及び発現によ る多くの数のペプチド配列の生成は、適切な組換えベクターにおいて可能である 。たとえば、０１ｉｐｈａｎｔなど、、江匣４４：　１７７〜１８３　（１９８ ６）を参照のこと。しかしながら、効果的な物理的且つ遺伝子的選択のための方 法が必要とされるような多数の化合物が生成され得る。そのような方法なしでは 、実質的に興味あるリガンドの供給においてそれらの大きなペプチドライブラリ ィの有用性は失われ得る。本発明は、それらの及び他の関連する必要性を満たす 、大きなペプチドライブラリィからの効果的なスクリーニング及び選択のための 方法を提供する。

発明の要約 本発明は、予備選択されたレセプター分子に結合するペプチドを同定するための 新規方法及び組成物を提供する。そのペプチドは、たとえばレセプター又はその 相同体を結合し、そしてその活性を阻害し、又は促進せしめることで、種々の治 療、診断および関連する用途に使用され得る。

１つの態様において、本発明は、予備選択さたレセプターに結合するペプチドを 同定するための方法に関する。ある観点において、その方法は一般的に、前記ペ プチドをコードする少なくとも約１０６個のメンバーのオリゴヌクレオチドライ ブラリーを含んで成るバクテリオファージ発現ベクターを構成することを含んで 成る。そのライブラリィ−メンバーは、バクテリオファージの外側の構造タンパ ク質をコート′するヌクレオチド配列の５′領域に読取り枠を整合して連結され る。適切な宿主細胞は、一般的にエレクトロポレーションによって、発現ベクタ ーにより形質転換され、そして形質転換された細胞は、バクテリオファージの発 現及びアセンブリーのために適切な条件下で培養される。アフィニティースクリ ーニング方法を用いて、バクテリオファージライブラリィ−メンバーは、特定の ペプチド−レセプター結合の助けとなる条件下で予備選択されたレセプターと接 触せしめられ、そしてコートタンパク質がレセプター分子を結合するペプチドを 有するバクテリオファージが選択される。

次に、その選択されたファージ上に前記ペプチドをコードするヌクレオチド配列 が決定され得る。そのアフィニティー選択方法を１又は複数回くり返すことによ って、対象のペプチドが富化される。選択の厳重性を高めることによって、たと えば実質的な一価性にペプチド−ファージ相互作用の価を減じることによって、 ますます高い親和性のペプチドが同定され得る。

もう１つの観点において、本発明の方法は、融合タンパク質をコードするように ヌクレオチド配列と読取り枠を整合して連結されるオリゴヌクレオチドライブラ リィ−メンバーを有する発現ベクターに関し、ここで前記ライブラリィ−メンバ ーは、前記融合体の５′メンバーを示し、そして３′メンバーは、バクテリオフ ァージの外部構造タンパク質の少なくとも一部を組んで成る。ライブラリィ−メ ンバーによりコードされるペプチドの最初の残基は、ファージコートタンパク質 をコードする配列の５′−末端で存在する。好ましい態様においては、ファージ タンパク質が初めプレタンパク質として発現され、そして次に、成熟タンパク質 に宿主細胞により処理される場合、ライブラリィ−メンバーは、プロセッシング の後、成熟ファージタンパク質又はそれに実質的に相同のタンパク質のＮ−末端 でそれによりコードされるペプチドを残すように挿入される。

本発明はまた、バクテリオファージの外部構造タンパク質をコードするヌクレオ チド′配列のＳ′領領域読取り枠を整合して連結される、オリゴヌクレオチドラ イブラリィ−を有するバクテリオファージ発現ベクターにより形質転換された宿 主細胞にも関し、ここで前記ライブラリィ−メンバーは、少なくとも約５〜２５ 個のアミノ酸のペプチドをコードする。

一般的に、本発明のオリゴヌクレオチドライブラリィ−は、対象のペプチドをコ ードするコドン可変領域を含んで成り、そして場合によっては、１又は複数のス ペーサーアミノ酸残基、たとえばＧｌｙをコードする配列を含むことができる。

その可変領域は、　（ＮＮＫ）。

又は（ＮＮＳ）、によりコードされ、ここでＮはＡ、Ｃ，Ｇ又はＴであり、Ｋは Ｇ又はＴであり、ＳはＧ又はＣであり、そしてＸは５〜少なくとも約８である。

ある好ましい態様において、オリゴヌクレオチドライブラリィ−メンバーの可変 領域はへキサペプチドをコードする。そのコドン可変ｉＩＩＭはまた、活性化さ れたトリヌクレオチドの縮合から調製され得る。

図面の簡単な説明 第１図はオリゴヌクレオチドライブラリィ−の構成を示す。

（Ａ）ベクターｆＡＦＦ１は、３ｏｂｐのスタッフ７−（ｓｔｕｆｆｅｒ）フラ グメントにより分離される２つの非相補的Ｂｓｔに■部位を含む、　Ｂｓｔ　Ｘ Ｉフラグメントの除去は、適切な付着端によるオリゴヌクレオチドの配向された 連結を可能にする。（Ｂ）オリゴヌクレオチドＮｏ　−４９は、そのベクターに おいてＢｓｔ　Ｘ１部位１及び２に相補的な付着末端を形成するために２つの“ 半一部位”フラグメントにアニールされた。

一本Ｍ　９Ｍ　！４が種々のへキサコドン配列及び２　（ｇｌｙ）コドンスペー サーを含むギャップ形成された構造体が前記ベクターに連結され、そしてＥ、コ リ（ｌ！、ｃｏｌｊ）中に電気形質転換された。

第２図は、ライブラリィ−からランダムに選択された感染性ファージのＰ■上で のＮ−末端へキザベブチドのアミノ酸配列（［ｌＮＡ配列から推測される）を示 す。配列は単一のペプチダーゼ部位で始まる。アミノ酸のための一文字コードは 、次の通りである：Ａ（Ａｌａ）、　Ｃ（Ｃｙｓ）、　Ｄ（Ａｓｐ）、　Ｅ（Ｇ ｌｕ）、　Ｐ（Ｐｈｅン、　Ｇ（Ｇｌｙ）、　Ｈ（）Ｉｉｓ）、　Ｉ（Ｉｌａ） B Ｋ（Ｌｙｓ）、　Ｌ（Ｌｅｕ）、ｌ’１（Ｎｅｔ）、Ｎ（Ａ５Ｆ＋）、Ｐ（Ｐｒ ｏ）、Ｑ（Ｇｌｎ）、Ｒ（Ａｒｇ）、５（Ｓｅｔ）。

Ｔ（丁ｈｒ）、Ｖ（Ｖａｌ）、Ｗ（Ｔｒｐ）、Ｙ（Ｔｙｒ）。

第３図は、（Ａ）ライブラリィ−からの感染性ファージ及び（Ｂ）−八８３Ｅ７ に基づいてのパンニングの１．２又は３区域から回収されたファージのプールの 可変領域の複合ＤＮＡ配列を示す、ファージは、耐テトラサイタリンコロニーと して増幅され、そして数千のそれらのコロニーに由来するファージのプールから の［ｌＮＡが単離され、そして配列決定された。ｇｅｎｅ　ｍにおけるクローニ ング部位に対応する配列決定ゲルの部分が示される。配列決定プライマーは、ク ローニング部位の方に向かって約４０個の塩基でファージＤＮＡにアニールされ た。ゲルの実際の読み出しは、コード鎖に相補的な配列である。

コドン同定の明確さのために、レーンは、コード（＋）鎖の配列ヲ同定するため に、左から右に及び５′から３′の方向、すなわち上部から低部にＣ，Ｔ、Ａ、 Ｇとして読まれる。

第４図は、ｍＡＢ３Ｅ７に基づいての３段階のバンニングにより分離された５′ フアージのｐ■のＮ末端ペプチドのアミノ酸配列（ＤＮＡフラグメントから推測 される）を示す。

第５図は、ストシブタビジン被覆ウェル上に最大密度で固定されたビオチニル化 されたモノクローナル抗体３Ｅ７　ｉｇＧ（第５　ＡＩＭ）又は３Ｅ７　Ｐａｂ フラグメント（第５Ｂ図）及び結合されたファージを検出するためのラベルされ たポリクローナル抗−ファージ抗体によるＹＧＧＦＬ−及びＹＡＧＦＡＱ−ファ ージについてのファージサンドイッチＥＬｒＳＡの結果を示す。

第６図は、ＹＧＧＦＬ−及びＹＡＧＦＡＱ−ファージの回収に基づいての５ｎＭ （第６Ａ図）及び５０ｐＭ　（第６Ｂ図）での３Ｅ７　Ｆａｂ　濃度及び洗浄時 間（分）の効果を比較するファージサンドイッチＥＬ２ＳＡの結果を示・　す。

第７図は、既知の親和性のペプチドを担持するファージ、ＹＧＧＦＬ及びＹＧＦ ＩＩＧＩＩからの３Ｅ７　Ｆａｂ解離を示す。

好ましい態様の記載 対象のレセプター分子に結合するペプチドを同定するための方法及び組成物が提 供される。ペプチドは、バクテリオファージ構造タンパク質に結合されるペプチ ドをコードするオリゴヌクレオチドライブラリィ−から生成される。親和性富化 の方法は、ひじょうに大きなペプチドのライブラリィ−のスクリーンを可能にし 、そして所望するペプチドを担持するファージが選択される０次に、核酸がファ ージから単離され、そしてオリゴヌクレオチドライブラリィ−メンバーの可変領 域が配列決定され、その結果、所望するペプチドのアミノ酸配列がそれから推定 される。これらの方法を用いて、次に、所望する分子のための結合親和性を有す るものとして同定されるペプチドが従来の手段により大量に合成され得る。

ペプチド０　匹」を同定することによって、レセプター分子の配列又は構造、又 はその天然の結合パートナ−の配列を知る必要はない。実際、多くの“レセプタ ー”分子のためには、結合パートナ−はまだ同定されていない。本発明の有意な 利点は、予測されるリガンド構造に関する従来の情報が、対象のペプチドリガン ドを単離するために必要とされないことである。従って、同定されたペプチドは 、生物学的活性を有し、これは、選択されたレセプター分子のために少なくとも 特異的結合親和性を含むことを意味し、そして多くの場合、他の化合物の結合を 阻止し、代謝路を刺激し又は阻害し、シグナル又はメツセンジャーとして作用し 、細胞活性を刺激し又は阻害し、そして同様のことをする能力をさらに包含する であろう。

ペプチドリガンドが本発明の手段により同定され得る可能なレセプター分子の数 は実質的に限界がない。たとえば、レセプター分子は抗体（又はその結合部分） であり得る。抗体が結合する抗原は知られており、そしてたぶん配列決定され得 、この場合、本発明は、抗原のエピトープの地図を形成するために使用され得る 。抗原が未知である場合、ある自己免疫疾患に関して、その疾患を有する患者か らの血清又は他の流体が、ペプチド及び結果的に、自己免疫応答を誘発する抗原 を同定するために本発明において使用され得る。特定の個人の疾患を適合するよ うにペプチドと合わせることが、これらの方法を用いて可能である。ペプチドが 同定されれば、それ自体は、ワクチンの開発、治療剤、診断試薬、等として作用 し、又はそれらのための基礎を提供することができる。

本発明は、抗体の他に、広範囲のＷ類の物質のためのペプチドリガンドを同定す ることができる。それらは、成長因子、ホルモン、酵素、インターフェロン、イ ンターロイキン、細胞内及び細胞外メンセンジャー、レクチン、細胞接着分子及 び同様のもの、並びに、前記分子のその対応するレセプターのためのリガンドを 包含するが、但しこれだけには限定されない、ペプチドリガンドはまた、ペプチ ド又はタンパク質でない分子、たとえば炭水化物、非タンパク質性有機化合物、 金属、等についても本発明により同定され得る。従って、抗体は広く利用でき、 そして便利に操作されるが、それらは、ペプチドリガンドが本発明の手段により 同定され得るレセプター分子の単に代表に過ぎない。

本明細書に記載されるように基準に従って調製されるオリゴヌクレオチドライブ ラリィ−は、バクテリオファージ構造タンパク質、好ましくは入手しやすいファ ージタンパク質、たとえばバクテリオファージコートタンパク質をコードする適 切なベクターに挿入される。当業者は、種々のバクテリオファージが本発明に使 用され得ることを認識しているが、好ましい態様においては、ベクターは繊維状 バクテリオファージ、たとえばｆｌ、　ｆｄ、　Ｏｆｌ、　ＭＩ３、等であり、 又はそれらに由来する。より好ましい１！様において；その繊維状バクテリオフ ァージはｆｄであり、そして選択マーカー、たとえばテトラサイタリン（たとえ ばｆｄ−ｔｅｔ“）を含む、ｆｄ−ｔｅｔベクターは文献に広く記載されている 。たとえば、Ｚａｃｈｅｒなと、、Ｇｅｎｅ　９　：１２７〜１４０　（Ｌ９８ ０）、　Ｓ＋ｗｉｔｈなど、、５ｃｉｅｎｃｅ　２２８　：　１３１５〜１３１ ７（１９８５）及びＰａｒｌｌｅｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｇｅｎｅ　７ ３　：　３０５〜３１８　（１９８Ｂ）　（これらの開示は引用により本明細書 に組込まれる）を参照のこと。

ファージベクターは、ペプチドが下記のように親和性選択及び富化工程において レセプターに近づきやすいように、バクテリオファージ構造タンパク質をコード する遺伝子の５′領域に位置するクローニング部位を含むように選択され又はそ れを含むように構成される。構造ファージタンパク質が好ましくはコートタンパ ク質である場合、ファージｆｄにおいて、好ましいコートタンパク質はり［［で ある。個々の繊維状ｆｄファージは、ｐ■タンパク質の４又は５個までのコピー を有することが知られている。

適切なベクターは、ペプチドが成熟コートタンパク質のＮ−末端の約１００個の アミノ酸残基の距離で又はそれ以内に発現されるようにペプチドをフードするオ リゴヌクレオチド配列の配向されたクローニングを可能にする。コートタンパク 質は、典型的には、リーダー配列を有するプレタンパク質として発現される。従 って、所望には、オリゴヌクレオチドライブラリィ−は、処理されたバクテリオ ファージ外部タンパク質のＮ−末端がペプチドの第１残基であるように、すなわ ちリーダー配列をコードする配列の３′末端と成熟タンパク質又は５′末端の一 部をコードする配列の５′末端との間に挿入される。

ライブラリィ−は、選択されたクローニング部位に、ライブラリィ−メンバー（ 及び下記に論ぜられるようないづれかのスペーサー、枠組み決定基、等）の可変 領域を含むオリゴヌクレオチドをクローニングすることによって構成される。既 知の組換えＤＮＡ技法（一般的には、５ａｓｂｒｏｏｋｅなど、、Ｍｏ１ｅｃｕ ｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ＋第２版、 Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、 　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｙ、Ｙ、、　１９８９　、引用によ り本明細書に組込まれる）を用いて、オリゴヌクレオチドが構成され得、これは 中でも、所望しない制限部位を除き、そして所望する部位を付加し、除去された いづれかの配列の正い部分（たとえば正しいシグナルペプチダーゼ部位）を再構 成し、存在されるスペーサー又は枠組み残基を挿入し、そして活性感染性ファー ジを生成するために翻訳フレーム（必要なら）を正しくする。オリゴヌクレオチ ドの中央部分は一般的に、１又は複数の可変領域ドメイン及びスペーサー又は枠 組み残基を含むであろう。その配列は、結局、アセンブルされたバクテリオファ ージ粒子の外部の近づくことができる表面上の成熟コートタンパク質Ｎ−末端又 はそこで融合されるペプチド（スペーサー又は枠組み残基を有するか又は有さな い）として発現される。

オリゴヌクレオチドの可変領域ドメインはライブラリィ−源を含む。ライブラリ ィ−の大きさは、種々のコドンの数及び従って、所望するペプチドの大きさに従 って変化するであろう。一般的に、ライブラリィ−は少なくとも約１０６個のメ ンバー、通常少なくとも１０？個及び典型的には１８０個又はそれ以上のメンバ ーであろう。アミノ酸のランダム収集物をコードする一連のコドンを形成し、そ して結局、ベクター中にクローンされるオリゴヌクレオチドの収集物を生成する ためには、コドンモチーフたとえば（ＮＨＫ）ｘ　（ここで、ＮはＡ、Ｃ，Ｇ又 はＴであり（名目上等モル）、ＫはＧ又はＴであり（名目上等モル）、そしてＸ は典型的には、約５．６．７．又は８又はそれ以上である）が使用され、それに よって、ペンタ−、ヘキサ−、ヘプタ−及びオクタ−ペプチド又はそれ以上のペ プチドのライブラリィ−が生成される。その第三位置、すなわち“Ｓ“と命名さ れる位置はまた、Ｇ又はＬであり得る。従って、ＮＮＫ又はＮＮＳは、（ｉ）す べてのアミノ酸をコードし、（ｉｉ）単に１つの停止コドンをコードし、そして （ｉｉ）　６　：　１から３＝１にコドンバイアスの範囲を減じる。より長いペ プチドに関して、生成されるライブラリィ−の大きさは、クローニング工程にお いて強制的になり、そして従ってその大きなライブラリィ−は、この後記載され るように、サンプルを取られることが理解されるべきである。適切な組換えベク ターにおけるオリゴヌクレオチドのランダムに生成された混合物からのペプチド の発現は、０１ｉｐｂａｎｔなど、、Ｇｅｎｅ　４４　：　１７７〜１８３（１ ９８６）（引用により本明細書に組込まれる）に論ぜられる。

例示されたコドンモチーフ（ＮＮＫ）６は、３２個のコドンを生成し、個々の１ つは１２個のアミノ酸であり、個々の２つは５個のアミノ酸であり、個々の３つ は３個のアミノ酸であり、そして１つは（アンバー）停止コドンである。このモ チーフはオリゴヌクレオチド合成の標準方法により利用できるのとほぼ等しいコ ドン分布を生成するが、それは１つのコドン残基を含むペプチドに対してのバイ アスをもたらす、たとえば、ヘキサコドンの完全な収集体は、たった１つのコド ンアミノ酸から製造された個々のペプチドをコードする１つの配列を含むが、し かしたった３個のコドンアミノ酸を有する個々のペプチドをコードする７２９　 （３６）の配列も含む。

１つのコドン残基に対するバイアスを最少にするための他のアプローチは、２０ の活性化されたトリーヌクレオチドの合成を包含し、ここでそれぞれは、前記２ ０の遺伝的にコードされたアミノ酸の１つのためのコドンを表わす、一般的にＭ ｃＢｒｉｄｅ　ａｎｄ　Ｃａｒｕｔｂｅｒｓ＋Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔ ｔｅｒＳ２２：２４５　（１９８３）　（引用により本明細書に組込まれる）に 記載されているように、従来の段により合成され、支持体から除かれるが、しか し塩基及び５−０１１−保ｍ基を維持し、そしてモノヌクレオシドの活性化のた めに使用される方法による３′０−ホスホラミシトの付加（及びｂ−シアノエチ ル基によるホスフェート保護）により活性化する。変性“オリゴコドン”は、構 築ブロックとしてそれらのトリマーを用いて調製される。トリマーは、所望する モル比で混合され、そして合成機に設置される。その比率は、通常、はぼ等モル であるが、しかし変性オリゴヌクレオチド収集体によりコードされる一定のアミ ノ酸の過剰−〜過少−表示を得るために＆１節された不平等な比率で存在し得る 。オリゴコドンを形成するためにトリマーの縮合は、構築ブロックとして活性化 されたモノヌクレオチドを用いて、従来の合成について記載されるようにして実 質的になされる。一般的に、Ａｔｋｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ。

ｔｌｌｉ　ｏｍｕｃｌｅｏｔｉｄｏ　５ｕｎｔｈｅｓｉｓ＋　Ｍ−Ｊ、Ｇａ１ｔ ＋　３５〜８２ページ（１９８４）を参照のこと、従って、この方法は、等しい 分布（又は調節された不平等な分布）の可能なペプチド配列をコードすることが できるクローニングのためのオリゴヌクレオチドの集団を生成する。このアプロ ーチは、（ＮＮに）、モチーフにより生成されるバイアスの範囲が個々の追加の アミノ酸残基により３倍、高まるので、より長いペプチド配列の生成において特 に有用である。

コドンモチーフが（ＮＮＫ）舅であり、そしてＸが８である場合、２．６　ＸＩ Ｏ”の可能なオクタ−ペプチドが存在する。はとんどのオクタ−ペプチドを含む ライブラリィ−は、生成するのに困難である。

従って、オクタ−ペプチドのサンプリングは、可能な配列の約０．１〜１％、５ ％又は１０％はどまでを用いてサブセットのライブラリィ−を構成することによ って達成され得、この組換えバクテリオファージ粒子のサブセットが次にスクリ ーンされる。ライブラリィ−サイズが上昇するにつれて、低い％が許容される。

所望により、サブセットのライブラリィ−の多様性を拡張するために、回収され たファージサブセットが突然変異誘発にゆだねられ、そして次に、続くスクリー ニング段階にゆだねられる。この突然変異誘発段階は、２つの一般的な手段で達 成され得る：回収されたファージの可変領域が突然変異誘発され、又は追加の可 変アミノ酸が初期の可変配列に隣接する領域に付加され得る。

種々の技法が、ペプチドライブラリィ−を多様化し、又は十分な結合活性を有す るようにバンニングの初期段階で見出されるペプチドの回りを多様化するために 本発明に使用され得る。１つのアプローチにおいて、陽性のファージ（バンニン グの初期段階において同定されるもの）が、活性ペプチドの同定を決定するため に配列決定される０次に、オリゴヌクレオチドは、−次オリゴヌクレオチド配列 のわずかな変動を生成するために個々の段階で組込まれる低いレベルのすべての 塩基を用いて、それらのペプチド配列に基づいて合成される０次に、（わずかな ）変性オリゴヌクレオチドのこの混合物が、本明細書に記載されているようにし て親和性ファージ中にクローンされる。この方法は、出発ペプチド配列の組織的 な調節された変動を生成する。しかしながら、個々の陽性ファージが、変異誘発 の前、配列決定され、そして従って、少数の回収されたファージの多様性を拡張 するために有用であることが必要である。

選択されたファージ−ペプチドの認識部位のまわりを変動するためのもう１つの 技法は、低精度条件下でのポリメラーゼ鎖反応（Ｐｃｔ？）の使用を通してペプ チドにおけるヌクレオチド変化の敏感な誤組込みを包含する。Ｌｅｕｎｇなど、 、ｎ蝕見■岨１　：１１〜１５　（１９８９）の方法は、２％の変異頻度を生成 するためにヌクレオチドの割合及びマンガンイオンの付加を変える。選択された ファージを変動するためのもう１つのアプローチは、回収されたファージのプー ル又はサブセントの変異誘発を包含する。パンニングから回収されたファージは プールされ、そして一本１ｉｔ）ＮＡが単離される。ＤＮＡは、たとえば亜硝酸 、蟻酸又はヒドラジによる処理により変異誘発される。これらの処理は、ＤＮＡ において種々の損傷を生成する。その損傷を受けるＤＮＡは、塩基が損傷の部位 に出合う場合、それを誤組込む逆転写酵素によりコピーされる０次に、変動ペプ チドをコードする配列を含むセグメントが、可変領域を端に有する部位に対して 特異的な制限ヌクレアーゼにより切断することによって切断される。この変異誘 発されたセグメントは、次に、本明細書に記載される態様に類似する態様で損傷 されたベクターＤＮＡ中に再クローン化される。ＤＮＡは、細胞中で形質転換さ れ、そして二次ライブラリィ−が記載のようにして構成される。一般的な変異誘 発方法は、Ｍｙｅｒｓ　＋　など、。

Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１３　：　３１３１〜３１４５　（１９８ ５）、　Ｍｙｅｒｓなと、、５ｃｉｅｎｃｅ２２９　：　２４２〜２４６　（１ ９８５）及びＭｙｅｒｓ＋　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎＭｏｌ ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ■　第１巻、８．３．１〜８．３．６．　Ｆ、Ａｎｓ ｅｂｅｌ＋　など、。

ＪＪｆｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ、　Ｎｅｉ＊　Ｙｏｒｋ　（１９８９）（これ ら引用により本明細書に組込まれる）に詳細に記載される。

活性であることが見出されたペプチドに追加のアミノ酸を付加する第２の一般的 なアプローチにおいては、種々の方法が利用できる。

初期バンニングにおいて選択されたペプチドの配列がそれぞれ決定され、そして その決定された配列を組込む新規オリゴヌクレオチド及び隣接する変性配列が合 成される０次に、これらは二次ライブラリィ−を生成するためにクローン化され る。

ペプチドを担持するファージのプールに二次可変領域を付加するもう１つのアプ ローチにおいては、制限部位は、−次可変領域の次に配置される。好ましくは、 酵素はその認識配列の外部を切断し、たとえばＢｓｐＭＩは、４個の塩基の５′ 側オーバーハングを残して；認識部位の３′側に向かって４個の塩基を切断する 。従って、認識部位は、−次表性領域から４個の塩基を配置され得る。−次可変 領域を挿入するためには、ファージＤＮＡのプールが消化され、そしてフレノウ フラグメントによりオーバーハングをフィルインすることによってプラント末端 化される０次に、二本鎖のプラント末端化された、変性的合成化オリゴヌクレオ チドが、−次可変領域に装置され二次可変領域を生成するためにこの部位中に連 結される９次にこの二次ライブラリィ−が増幅され、そして前記のようにしてス クリーンされる。

ある場合、一定のレセプターを結合するために隣接する可変領域を有するペプチ ドを合成することが適切であるが、他の場合、スペーサー残基により分離される 複数の変動領域を有するペプチドを供給することが所望される。たとえば、可変 領域は、ペプチドの変動ドメインの種々の段階でのレセプターへの提示を可能に するスペーサーにより分離され得る。可変領域間の距離は、１つの残基はどであ り、時々５〜１０個及び約１００個までの残基である。大きな結合部位をプロー ブするために、可変漁期は、２０〜３０個のアミノ酸残基のスペーサーにより分 離され得る。存在する場合、スペーサー残基の数は好ましくは、少なくとも２個 、典型的には少なくとも３個又はそれ以上であり、そしてしばしば、１０個以下 、頻繁には８個以下の残基であろう。

従って、スペーサーにより分離される可変領域を有するオリゴヌクレオチドライ ブラリィ−は、次の式：％式％） により示され、ここで前記Ｎ及びＫは前記で定義された通りであり（前記で定義 されたようなＳは、Ｋにより置換され得ることを注目のこと）、そしてｙ＋ｚは 約５．６，７．８又はそれ以上に等しく、ａ、ｂ及びＣはスペーサーアミノ酸を コードするコドンを含む同じ又は異なったヌクレオチドを表わし、ｎは約２０〜 ３０個又はそれ以上のアミノ酸である。

スペーサー残基は、ファージタンパク質への結合により比較的抑制されていない 大きな結合部位における部位と相互作用する能力を有するライブラリィ−の変動 ドメインを供給するために、いく分柔軟であり、オリゴ−グリシンを含む。不動 スペーサー、たとえばオリゴ−プロリンはまた、別々に挿入され、又は　ＧＩｙ を包含する他のスペーサーと組合して挿入され得る。お互い隣接する可変ドメイ ンを有し、そして配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙのスペーサーにより供給されるよ うに、２種の配列間での転換を用いることによって、お互いに対して可変ドメイ ンを配向するためにスペーサーを使用することが所望される。そのような転換に 安定性を付与するために、個々の可変領域のいづれかの端又は両端でＣｙｓ残基 を付加することが所望され、又は必要とされる０次に、Ｃｙｓ残基が、ループに 可変領域を一緒に保持するためにジスルフィド架橋を形成し、そしてこの態様に おいて、また環状ペプチドを模倣するように作用することができる。もちろん、 当業者は、環状化のための糟々の他のタイプの共有結合がまた、達成され得るこ とを認識するであろう。

上記スペーサー残基はまた、可変ヌクレオチド領域のいづれかの又は両端上に位 置することができる。たとえば、環状ペプチドは、ペプチドの両端上にＣｙｓ残 基を有することによって介在スペーサーを伴わないで達成され得る。上記のよう に、可動なスペーサー、たとえばオリゴ−グリシンは、選択されたレセプターと ペプチドとの相互作用を促進することができる。他方、不動スペーサーは、不動 スペーサーの末端上に存在するかのように、ペプチドの付与を可動にし、ここで 残基、たとえばＰｒｏの数がアームの長さのみならず、また、ペプチドが配向さ れるアームのための方向も決定する。荷電された及び／又は荷電されていない親 水性アミノ酸（たとえばＴ　ｈ　ｒ　＋Ｈｉｓ＋＾ｓｎ、　Ｇｉｎ、　Ａｒｇ、 　Ｇｌｕ、　Ａｓｐ、　Ｍｅｔ、　Ｌｙｓ、等）から製造される親水性スペーサ ー、又は疎水性アミノ酸（たとえばＰｈｅ＋　Ｌｅｕ＋　１１ｅ＋Ｇｌｙ、　Ｖ ａｌ、　Ａｌａ　、等）の疎水性スペーサーが、種々の局部的な環境を伴って結 合部位にペプチドを付与するために使用され得る。

翻訳機械による合成の間又はその後、変性されなければ、組換えペプチドライブ ラリィ−は、２０個の通常のし一アミノ酸の配列から成る。そのようなライブラ リーのための利用できる構造的変動が大きい場合、追加の変動性が種々の手段、 たとえばアミノ酸の化学的変性により導入され得る。

たとえば、追加される変動性の１つの源として、本発明のペプチドライブラリィ −は、アミド化されたそのカルボキシル末端を有することができる。カルボキシ ル末端のアミド化は、多くの天然に存在する生物活性ペプチドの活性に必要であ る。この変性は、酵素ぺブチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼ（Ｐ ＡＭ）及びヒドロキシグリシンアミノトランスフェラーゼ（ＨＧＡＴ）により触 媒される２段階反応においてカルボキシ末端Ｇｕｙ残基のＮ−Ｃ結合の分解を通 して−１７１，＝−＊で生じる。Ｂｉｐｐｅｒなど、、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ ｅｓｓ、　２６６　ニア８２７〜７８２３　（１９９１）　；　Ｍｉｚｕｒ＋ｏ など、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ　ｂ　ｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏ　ｍ。

１３７　（３）：９８４〜９９１　（１９８６）　；　Ｍｕｒｔｔ＋ｙなど、、 Ｊ、　Ｂｉｏｌ、、　Ｃｈｅ　、　２６１（４）　：　１８１５〜１８２２１　 （１９８６）　；にａｔｏｐｏｄｔｓなど＋ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｓｉｓｔｒ　２９ 　：６１５〜６１２０　（１，９９０）　；及びＹｏｕｎｇ　ａｎｄ　Ｔａ５ｂ ｕｒｉｒ＋ｉ、Ｊ、４ｍ、　Ｃｈｅｗ。

Ｓａｃ、１．１１　：　１９３３〜１９３４　（１９８９）　（これらは引用に より本明細書に組込まれる）を参照のこと。

カルボキシル末端アミド化は、カルボキシル末端で暴露される可変領域を有する 本発明のペプチドライブラリィ−に対して行なわれ得る。アミド化は、酵素、た とえばＰＡＭ及びＨＧＡＴにより、インビボ又はインビトロで及び生物活性ペプ チドの構造的統合性を維持することに伝導性の条件下で処理することによって行 なわれ得る。本発明のランダムペプチドライブラリィ−において、アミド化は、 ライブラリィ−サブセット、すなわちカルボキシル末端Ｇｕｙを有するそれらの ペプチド上で生しるであろう。アミド化について企画されるペプチドのライブラ リィ−は、そのライブラリィ−の可変領域ドメインの末端でＧＬＹコドンを導入 することによって構成され得る。アミド化の後、富化されたライブラリィ−は、 アミド化されたペプチドを選択的に結合するレセプターのためのリガンドの特に 効果的な源として作用する。

Ｃ−末端アミド化生物活性ペプチドの多くは、大きなプロホルモンから加工され 、ここでアミド化されたペプチドは、配列−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−χ・・・ （ここでＸはいづれかのアミノ酸である）をそのＣ−末端で有する０本発明にお いて、配列−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｘ−５ｔｏｐをコードするオリゴヌクレ オチドは、可変オリゴヌクレオチド領域の３′末端で配置される０発現される場 合、そのＧｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｘはインビボ又は工！ビトロでの酵素処理に より除去され、そしてペプチドライブラリィ−は、上記のようにしてアミド化さ れたカルボキシル末端である。

カルボキシル末端のアミド化を通してライブラリィ−変動性に付加するためのも う１つの手段は、暴露されたＣ末端を典型的には有するペプチド、すなわち膜の 細胞外側上で暴露されるそのカルボキシル末端とその膜とを交差するペプチドの 使用を包含する。この態様において、最後の位置に停止コドンを有する可変オリ ゴヌクレオチド領域は、Ｃ末端暴露タンパク質、又はＣ末端外記向を担当するタ ンパク質の少なくとも一部をコードする配列の３′末端に挿入される。トランス フェリンレセプタータンパク質は、１つのそのようなタンパク質の例である。こ のレセプターは、ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄなど、。

皿　３９　：　２６７〜２７４　（１９８４）　（引用により本明細書に組込ま れる）に報告されているようにしてクローン化され、そして配列決定されている 。トランスフェリンレセプターの内部トランスメンブランセグメントは、そのカ ルボキシル末端外でタンパク質を配向するように作用する。ｃＤＮＡが典型的に は真核細胞において発現される場合、トランスフェリンレセプターに融合される それらのアミノ末端及び遊離カルボキシル末端を有するランダムペプチドが細胞 外に配置される。

カルボキシル末端ペプチドライブラリィ−のためには、ｃｏｓ細胞発現クローニ ングシステムがまた、使用され、そしである環境下において好ましい。ＣＯ３細 胞は、ＣＯ３細胞中にトランスフェクトされる場合、ｗＲＮＡを染色体外で複製 し、そして生成する発現プラスミドに含まれる種々のヌクレオチドライブラリィ −によりトランスフェクトされる。ランダムペプチドを担持するトランスフェク トされた細胞は、結合タンパク質を担持する固定されたりガント又は細胞上で選 択され、そしてそのプラスミドがその選択された細胞がら単離される（離放され る）。次に、プラスミドが増幅され、そして第２段階のスクリーニングのために ｃｏｓ細胞をトランスフェクトするために使用される。ランダムオリゴヌクレオ チドは発現プラスミド中に直接的に挿入されるので、多くのライブラリィ−（す なわち多くの数の新規ペプチド）が構成される。もちろん、個々の段階のパンニ ングのためには、プラスミドは、ｃｏｓ細胞から解放され、増幅のために細菌中 にトランスフェクトされ、再単離され、そしてｃｏｓ細胞中に再びトランスフェ クトされる必要がある。

本発明のカルボキシル末端アミド化のための他の発現システムがまた使用され得 る。たとえば、可変オリゴヌクレオチド配列は、たとえばバキュロウィルストラ ンスファーベクターに含まれるトランスフェリンレセプターｃＤＮＡの３′末端 中に挿入される。ウィルスＤＮＡ及びトランスファーベクターは、培養において ウィルスを増殖するために使用される昆虫細胞（たとえばＳｆ９細胞）中に同時 トランスフェクトされる。トランスフェリンレセプターが発現される場合、組換 えウィルスを有する細胞、すなわちトランスフェリンレセプター７種々のペプチ ド融合タンパク質を生成する細胞が、分離を促進するために粒子、たとえば磁気 微小球又は他の物質に結合される抗−トランスフェリンレセプターモノクローナ ル抗体を用いて選択される。その選択された細胞はさらに増殖され、培地中への 組換え細胞外発芽ウィルスのライブラリィ−の溶解及び解放を可能にされる。

組換えウィルスのライブラリィ−が増幅され（たとえばＳｆ９細胞において）、 そしてそのライブラリィ−のアリコートが貯蔵される。

次に、Ｓｆ９細胞が、組換えウィルスのライブラリィ−により感染され、そして 固定された標的レセプター上でバンニングされ、ここで前記バンニングはトラン スフェリンレセプターの発現と共に生じるように調節される。その選択された細 胞は、増殖され、そして溶解され、そしてその上精液が新規Ｓｆ９細胞を感染す るために使用され、標的レセプターに結合するペプチドをコードするウィルスの 増幅がもたらされる。いくつかの段階のパンニング及び増幅の後、１つのウィル スが、Ｓｕ＋ｕ＋ｅｒｓ　ａｎｄ　Ｓａ＋ｉｔｈ、Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｍ ｅｃｈｏｄｓ　ｆｏｒＢａｃｕｌｏｖｔｒｕｓ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｉｎ ５ｅｃｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ、　ＴｅｘａｓＡ ｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　５ｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｌｌｅ ｔｉｎ　ＮＯ，１５５５（１９８８）（これは引用により本明細書に組込まれる ）に記載されるようにしてＳｆ９細胞プラークアッセイによりクローンされる。

ペプチドライブラリィ−のスクリーニングのためのバキュロウィルスシステムの 利点は、トランスフェリンレセプター／ランダムペプチド融合タンパク質の発現 がひじように高い（細胞当たり数ミリオン以上のレセプター）ことである、高い 発現ベルは、理論的に好結果をもたらすパンニングの可能性を高め、そして／又 は固定された標的レセプターとの多価相互作用に貢献する。バキュロウィルスシ ステムのもう１つの利点は、ファージ方法に基づくペプチドの類似する感染性が 、パンニング方法により選択されるウィルスを増幅するために開発されることで ある。一連のバンニングの間、ＤＮＡは単離され、そして細胞の続（トランスフ ェクションのために使用される必要はない。

他の発現システムは本発明において使用され得る。単一の真核配列が酵母及び細 菌において操作可能であるので、カルボキシル末端外記向を有するタンパク譬、 たとえばトランスフェリンレセプターは、適切には酵母又は細菌において発現さ れ、そして配向され得る。

酵母又は細菌の使用は、大きなライブラリィ−を可能にし、そして増幅に関連す る可能性ある問題の回避を可能にする。

天然に存在するペプチド及びタンパク質に見出される他の増幅は、追加の変動性 を供給し、そして所望する生物学的活性に寄与するためにライブラリィ−に導入 され得る。たとえば、可変領域ライブラリィ−は、リン酸化、グリコジル化、硫 酸化イソプレニル化（又は他の脂質の付加）、等に関与されるアミノ酸残基をコ ードするコドンを供給され得る。天然に存在する酵素により触媒されない変性は 、化学的手段（比較的温和な条件下で）又はたとえば触媒性抗体及び同様のもの の作用により導入され得る。はとんどの場合、ライブラリィ−構成のための効果 的な手段は、はとんどのライブラリィ−メンバーが変性されるように、ライブラ リィ−の可変ヌクレオチド領域に隣接する又はその内部での酵素（又は化学的） 基質認識部位の特定を包含する。付加される基質認識部位は、所望には、単に単 一の残基（たとえばリン酸化のためにはセリン）又は複合コンセンサス配列であ る。

構造的強制又は骨格形成（ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ）がまた、ペプチドライブラ リィ−の構造体中に導入され得る。既知のタンパク質及びペプチド構造体からの 多くのモチーフがこの目的のために適合され得る。

その方法は、所望するペプチド構造体に貢献するように、可変ヌクレオチド領域 中に又はそれに隣接して、保存された構造残基をコードするヌクレオチド配列を 導入することを包含する。その構造体に必須でない位置は変えられない。

本明細書に記載されるような変性ペプチドライブラリィ−は、生物活性ペプチド 又はそれらの結合レセプター要素の種類のメンバーを生成し、そして／又は同定 するために、保存された枠組みを導入することができる。いくつかの種類の生物 活性ペプチドは、ある場合、種々の一連の残基を端に有する一対のシスティンで ある保存された９枠組み“をもたらす二次構造体により関連される。これは、上 記のように、ジスルフィド結合により開じられるループにおいて種々の残基の表 示をもたらす。

多くの場合、より複雑な枠組みが、ペプチドの生物活性に寄与するペプチド種類 のメンバー間に共有される。この種類の例は、コノトキシン、すなわち捕食性イ モ臭（ｃｏｎｅ　５ｎａｉｌ）として知られている毒性性軟体動物により生成さ れる１０〜３０個のアミノ酸のペプチド毒素である。このコノトキシンペプチド は、一般的に高密度のジスルフィド架橋を有する。高く架橋されるそれらの中で 、はとんどは２種のグループ、簡Ｕ及びオメガに属し、それらは次のように保存 された一次枠組みを有する： ｍｕ　ｃｃ、、、、、ｃ、、、、、ｃ、、、、、ｃｃ；　及びオメガ　ｃ、、、 、、ｃ、、、、、ｃｃ、、、、、ｃ、、、、、ｃ個々の対のＣを端に有する残基 の数は、報告されたペプチドにおいて２〜６と異なる。　Ｃｙｓ残基を端に有す る残基の！！饋は、類似する又は同一の特異性を有する種々の種からのペプチド におけるように、異なった特異性を有するペプチドに明らかに保存されない、従 って、コノトキシンは、多くの異なった薬理学的効果を有する大きな一連のペプ チドを生成するために超可変領域のための枠組みとして保存された密に架橋され たモチーフを開発した。

前記ｍｕ及びオメガの種１ｒ（６Ｃ’を有する）は、ジスルフィド結合の１５の 可能な組合せを有する０通常、それらの形態のうちたった１つが活性”正しい” 形である。ペプチドの正しい折りたたみは、そのベノムに現われる小さな成熟し た生物学性ペプチドを生成するためにコノペプチドのＮ−末端から切断される保 存された４０個の残基ペプチドにより指図され得る。

個々の対のＣ′間の２〜６個の種々の残基により、ｍｕ種類（２゜２．２〜６， ６．６）のための１２５　（５３）の可能な枠組み配置及びオメガ（２，２，２ ，２〜６，６．６．６）のための６２５（５’）　の可能な枠組み配置が存在す る。個々の枠組み内での残基の同一性をランダム化することが、１０”〜１０’ １００ペプチドを生成する。保存されたジスルフィド枠組み、個々の超可変領域 における種々の数の残基及びそれらの残基の種々の同一性を有する“コノー株” ペプチドライブラリィ−が構成される。従って、本発明に使用するための構造枠 組みのための配列は、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｙ−Ｃｙｓ−Ｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ又はＣ ｙｓ−Ｙ−Ｃｙｓ−Ｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｙ−Ｃｙｓ−Ｙ−Ｃｙｓ（ここでＹは （ＮＮＫ）Ｘ又は（ＮＮＳ）　ｘ、であり、そしてＮはＡ、Ｃ，Ｇ又はＴであり 、ＫはＧ又はＴであり、ＳはＧ又はＣであり、そしてＸは２〜６である）を含ん で成る。

他の変更は、種々のアミノ酸がライブラリィ−メンバーによりコードされるまわ りにペプチド構造に貢献する残基を供給するために導入され得る。たとえば、そ れらの残基は、記載されるようにα−ヘリックス、ヘリツタスーターンーへリッ クス構造、４つのヘリックス束、等を供給することができる。

他の典型的な骨格構造は、ペプチド構造を構造的に強制する金属イオン結合の利 点を有する。ある二価のカチオン（たとえば亜鉛、コバルト、ニッケル、カドニ ウム、等）のための適切に間隔を置かれた不変の金属リガンド（システィン及び ヒスチジン）が、ペプチドライブラリィ−中に特異的に組込まれ得る。特定のモ チーフに依存して、特定されたそれは、Ｂｅｒｇ　（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ ＋ｍ、　２６５　：　６５１３〜６５１６　（１９９０））、’　Ｇｒｅｅｎな ど、（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ｌｓＡ＋　８６　： ４０４７　〜４０Ｓ１（１９８９））、　Ｐａｒｒａｇａなど、　（Ｓｃｉｅｎ ｃｅ　２４１　：　１４８９〜１４９２（１９８８））、　Ｒｅｇａｎなど、（ Ｂｉｏｃｈｅｍ、＋　２９：　１０８７８〜１０８８３　（１９９０））及びＶ ａｌｌｅｅなど、（Ｐｒｏｃ、にａｔＬ。Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　［ＩＳＡ、　 ８８　：　９９９〜１００３（１９９１））（これらは引用により本明細書に組 込まれる）により一般的に記載されるように、亜鉛ループ、亜鉛フィンガー、亜 鉛ツイスト又は亜鉛クラスターをもたらすことができる（たとえば亜鉛配位の場 合）。

他のＤＮＡ結合ペプチド、たとえばロイシンジノバーとして言及される転写トラ ンスアクチベーターに対応するペプチドがまた、枠組みとして使用され、ここで ロイシン残基はモチーフにおいて７個の残基ごとに反復され、そしてその領域は りシン及びアルギニンに冨むαらせん領域に隣接し、そして保存されたらせん面 及び種々のらせん面により特徴づけられる。

構造的強制の他の特定形がまた、本発明に使用され得る。たとえば、一定のセリ ンプロテアーゼは、保存された構造体の小さななタンパク質（たとえば膵臓トリ プシンインヒビター）により阻害される。この保存された枠組みは、新規のプロ テアーゼインヒビターについてスクリーンするためのライブラリィ−を生成する ために、本明細書に記載されるように変性領域を組込むことができる。

ペプチドライブラリィ−のための枠組みに関する他の観点においては、既知のり ガントの構造からの情報が、既知のりガントの特徴から変性された特徴を有する 新規ペプチドリガンドを見出すために使用され得る。このＭ様においては、たと えば２０−１００個の塩基対の断片に制限されたＤＮＡ消化により調製される、 既知のりガントをコードする遺伝子のフラグメントが、本明細書に記載されるよ うにして、単独で又はいくつかのフラグメントのランダム組合せのいづれかによ り、可変ヌクレオチド領域システム中にサブクローンされる。次にそのフラグメ ントライブラリィ−が、レセプターに結合し、そして親ペプチドリガンドとは所 望のように異なるＨを有することができる小さなペプチドを同定するために、レ セプターへの結合について、本明細書における方法に従ってスクリーンされる。

これは、１又は両メンバーが、遺伝子、たとえば成長因子、ホルモン、サイトキ ン及び同様のもの、たとえばインシュリン、インターロイキン、インシュリン様 成長因子、等によりコードされるレセプター−リガンド相互作用についてのスク リーニングのために有用である。

本発明のペプチド−ファージライブラリィ−はまた、タンパク質を変性する酵素 の部位特異性、たとえばプロテアーゼの切断特異性を決定するためにも使用され 得る。たとえば、因子Ｘａは、配列？ｉｅ−Ｇｌｕ−Ｇｕｙ−Ａｒｇの後を切断 する１本明細書に記載されるような可変領域コドンのライブラリィ−が構成され 、ここでそれは、次の構造体：シグナル配列−可変領域−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌ ｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ｐ　ｍを有する。次に、ライブラリィ−からのファージが 因子Ｘａに暴露され、そして次に、Ｎ−末端暴露されるＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ −Ｐｂｅ−Ｌｅｕに対して特異的である抗体（たとえば３Ｅ７）上でバンニング される。３Ｅ７によるプレ切断パンイング段階は、Ｅ、コリプロテアーゼにより 切断されるクローンを排除するために使用され得る。因子Ｘａによる切断と適合 するランダム配列を有するライブラリィ−の唯一のメンバーが、バンニングの後 、単離され、この配列はＩｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ部位を模倣する。

プロテアーゼ基質同定へのもう１つのアプローチは、キャリヤータンパク質と複 合体（たとえばＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｕｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ）を同定するために使 用されるレポーター配列との間に可変領域を配置することを包含する。ライブラ リィ−は、レポーター配列（たとえば３Ｅ７抗体）を結合するレセプターを用い て同定される。切断に適合する配列を有するファージクローンは、所望するプロ テアーゼによる処理により放される。

それらの大きさ及び／又は配列の原因により、いくつかのペプチドは、それらの キャリヤーファージの感染性に厳しい欠点を引き起こす。これは、個々のバンニ ング循環に続く、再感染及び増幅の間、その集団からのファージの損失を引き起 こす。欠点性感染に関する問題を最少にするためには、溶離されたファージから 調製されたＤＮＡが、たとえばＤｏｗｅｒなど、、Ｎｕｃｌ、大山址Ｒｅｓ、　 １６　：　６１２７〜６１４５　（１９８８）　（これは引用により本明細書に 組込まれる）に記載されるようにして、好ましくはエレクトロボレーシランによ り又は既知の化学的手段により、適切な宿主細胞、たとえば旦−ユユ中で形質転 換される。細胞はマーカー発現のための十分な時間、培養され、そして選択が、 典型的には、ＤＮＡ形質転換のために適用される。コロニーが増幅され、そして 下記のようにしてファージが、親和性富化のために収穫される。親和性富化にお いて同定されるファージは、適切な宿主への感染により、追加の増殖段階で再増 幅され得る。

好結果をもたらす形質転換体が、選択培地における、又は選択条件、たとえば適 切な抗生物質（ｆｄ　−ｔｅｔベクターの場合、好ましくはテトラサイクリンで ある）下での増殖により典型的には選択される。これは、固体又は液体増殖培地 上で行なわれる得る。固体培地上での増殖のためには、細胞は、たとえば集密層 を実質的に形成するために選択抗生物質を含むし一寒天の大きな表面上に高密度 （約１０’〜１０９のｔｒｓ／ｒｒｆ）で増殖される。細胞及び押出されたファ ージは、その表面から剥き取られ、そしてファージは、Ｐａｒｓｌｅｙ　ａｎｄ Ｓｍｔｔｈ、Ｇｅｎｅ　７３　：　３０５〜３１８　（１９８８）により記載さ れているようにして、第１段階のバンニングのために調製される。液体培地での 増殖のためには、細胞は、約１０回又はそれ以上の倍増を通してＬ−ブイヨン及 び抗生物質中で増殖され得る。ファージは、下記のようにして標準の方法（Ｓａ ｓｂｒｏｕｋｅなど、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｊｎ　、第２版（１９８ ９）、　前記、Ｍ１３ファージの調製について）により収穫される。

液体培地での増殖は、ライブラリィ−の大きさのためにより便利であり、そして 固体培地上での培養は、増幅工程の間、より低いバイアスの機会をたぶん提供す る。

所望するクローンの親和性富化のめには、一般的に約１０’〜１０４個のライブ ラリィ−同等物（ライブラリィ−同等物は個々の組換え体の１つであす；１０” 個のメンバーのライブラリィ−の１０４個の同等物は、１０’　ＸＩＯ’　＝１ ０１３個のファージである）、但し典型的には少なくとも１０ｚ個から約１０’ 〜１０”個のライブラリィ−同等物が、所望するペプチドが見出されるレセプタ ー（又はその一部）と共にインキュベートされる。レセプターは、親和性富化ス ケムのために適切ないくつかの形の１つで存在する。１つの例において、レセプ ターは、表面又は粒子上に固定され、そして次にペプチド担持ファージのライブ ラリィ−が、下記方法に従って、固定されたレセプター上でバンニングされる。

レセプター表示の第２の例は、認識可能リガンド（つなぎ鎖により結合され得る ）に結合されるレセプターである。そのようなリガンドの特定の例は、ビオチン である。そのようにして変性されたレセプターは、ファージのライブラリィ−と 共にインキュベートされ、そして結合は、溶液における前反応体と共に生じる０ 次に、得られた複合体がビオチン成分を通してストレブタビジン（又はアビジン ）に結合される。ストレブタビジンは、表面、たとえばプラスチックプレート又 は粒子上に固定され得、この場合、複合体（ファージ／ペプチド／レセプター／ ビオチン／ストシブタビジン）が物理的に保持され；又はストレブタビジンが蛍 光団によりラベルされ、たとえば蛍光活性化細胞ソーター丘での分類方法により 検出及び／又は単離のための活性ファージ／ペプチドを標識する。

所望する特異性を有さないペプチドを発現するファージは洗浄により除去される 。必要とされる洗浄の程度及び厳重さは、対象の個々のレセプター／ペプチドの ために決定されるであろう、ある程度の制御が、結合インキュベージランの条件 及び続く洗浄を調節することによって回収されるペプチドの結合特徴にわたって 付与され得る。温度、ｐＩ（、イオン強度、二価カチオン濃度及び洗浄の体積及 び期間が、レセプターのための特定範囲の親和性内で、ペプチドについて選択す るであろう。通常、高い親和性の表示である通り解離速度に基づく選択は、最っ とも実際的な路である。これは、遊離リガンドの飽和量の存在下での連続したイ ンキュベージランにより、又は洗浄の体積、回収及び長さを高めることにより行 なわれ得る。個々の場合、解離されたペプチド−ファージの再結合が妨げられ、 そして時間と共に、ますます高い親和性のペプチド−ファージが回収される。結 合及び洗浄工程の追加の変性が、特定条件下でレセプターを結合するペプチドを 見出すために適用され得る。

ファージスクリーニング方法は高い特異性であるが、その方法は一般的に、適度 な親和性のペプチド（μモルの解離定数）と高い親和性のペプチド（ｎモル又は それ以上の解離定数）との間を区別しない。相対的に低い親和性のペプチドを担 持するファージを選択する能力は、ファージ／ペプチド粒子とレセプターとの間 の多価相互作用の結果であり得る。たとえば、レセプターがＩｇＧ抗体である場 合、ペプチドを担持する個々のファージが、１つのＩｇＧ分子の両部値に結合す る単一のファージ結合により、又は多価相互反応が洗浄の間、ファージの高い結 合活性及び強い付着性を生成するファージｒｇＧのネットワークを形成すること によって８．１以上の抗体結合部位に結合できる。

最高の親和性ペプチドリガンドを富化するためには、ファージとレセプター（典 型的には、固体組上に固定される）との間での実質的に一価の相互作用が適切で ある。実質的に一価の相互反応によるスクリーニング（選択）は、バクテリオフ ァージの増幅及び選択の追加の段階の部分として反復され得る。従って、これら の環境下で、レセプター分子、たとえば抗体分子のＦａｂ結合フラグメントは実 質的に一価である。

多価又は−価の相互反応を好む条件の組合せを用いる手段は、レセプター分子の ための新規ペプチドリガンドを生成することに利益をもたらすために使用され得 る。多価相互反応を促進するための条件下で第１段階のスクリーニングを行なう ことによって、高い厳重な洗浄が、非特異的混合ファージのバックグラウンドを ひじょうに減じるために使用され得る。この高い結合活性段階は、広範囲の親和 性を有する大きなプール又はペプチド、たとえば比較的低い親和性を有するそれ らを選択することができる。それは特異的認識核、たとえば下記例に記載される Ｔｙｒ−Ｇｌｙジペプチドを選択できる。次に、遅い解離速度に基づくファージ の一価相反応及び単離を好む条件下での続くスクリーニングは、最高の親和性の ペプチドの同定を可能にする。−価の相互反応は、低濃度のレセプター（たとえ ば約１〜１０１００ｐを用いることによって達成され得る。

本発明の観点として、対象のペプチドのための解離速度の決定及び実質的に一価 の条件下での選択されたレセプター分子の決定は、レセプターのためのペプチド の結合親和性の推定を可能にすることが注目されるべきである。この方法は、大 多数のペプチドが選択される場合、特に厄介である選択されたペプチドのための 結合親和性を別々に決定する必要性及びその不便さを回避する。

レセプター分子に対していくらかの親和性／及び特異性を付与するペプチド配列 が既知である場合、この“認識核“のまわりの変動性が装飾され得る。たとえば 、可変ペプチド領域は、同定された配列の一端又は両端を置換され得る。既知の 配列は、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓρの場合におけるように文献から及びＲｕｏｓ！ ａｈｔｉ　ａｎｄ　Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ。

５ｃｉｅｎｃｅ　２３８　：　４９１〜４９７　（１９８７）に記載されるよう にレセプターのインテグリンファミリーから同定され得、又は本発明の内容から 、初期段階のバンニングに由来する。

本発明に従って生成され、そしてスクリーンされたファージに基づくペプチドの ライブラリィ−が、抗体エピトープを地図で示すために特に有用である０本明細 書に記載されるように、多数の可能性あるエピトープをサンプルする能力は、数 ある中で、Ｇｅｙｓｅｎなど、。

Ｊ、　Ｉ＠ｍｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈ、１０２：　２５９〜２７４　（１９８７） に使用され、そして記載される化学的合成に基づく方法よりも明確な利点を存す る。さらに、それらのライブラリィ−は、重要な結合分子、たとえばホルモンレ セプター、付着分子、酵素、及び同様の分子のための新規リガンドを供給するこ とにおいて有用である。

従って、次の例は、例示的であって、本発明を制限するものではない。

基Ｊ及ｌ抹 Ｂｓｔ　ＸＩ制限エンヌクレアーゼ、Ｔ４　［ＩＮＡリガーゼ及びＴ４キナーゼ を、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｃｆ　Ｂｉｏｌａｂｓから得た。ストレブタビジン及 びビオチニル化されたヤギ抗−マウスＩ［ＧをＢＲＬから得た。　５ｓｑｕｅｎ ａｓｅ　２．０をＵ、Ｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｓ＋１ｃａｌから得た。初期研究に使 用されるモノクローナル抗体３Ｅ７は、Ａ、　［Ｉｅｒｚ　ａｎｄ　Ｍｅｏなど 、、藍（引用により本明細書に組込まれる）により供給され、そしてまた、Ｇｒ ａｍｓｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　（Ｓｃｈｗａｂｈａｕｓｅｎ、　Ｔｄ ｅｓｔ　Ｇｅｒｖａｎｙ）から導入された。（Ｉｔｓ（−Ｔｙｒ”″〕ｂ−エン ドルフィン（２０００Ｃｉ　／　ｍモル）を、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐ。

（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ、　ＩＬ）から購入した。オリゴヌクレ オチドを、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　ＰＣＲ−Ｍａｔｅにより 合成し、そしてｏｐｃカラム（ＡＢＩ）上で精製した。ペプチドを、Ａｐｐｌｉ ｅｄ　ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ　４３１Ａ（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ）又 はＢｉｏｓｅａｒｃｈモデル９６００　（Ｓａｎ　Ｉ？ａｆａｅｌ、　ＣＡ）に より合成し、そしてＧＹ逆相ＨＰＬＣにより９５％以上の純度に精製した。

純粋なペプチドのペプチド含有率を、アミノ酸分析により決定し、そして組成を ＦＡＢ−ＭＳにより確かめた。バクテリオファージｆｄ−ｔｅｔ及びＥ、コリに ９１は、Ｇ、　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｕｎｉｖ、　ｏｆ　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ＋　Ｃｏｌ ｕｍｂｉａ、　ｌ’ｔ。

６５２１１により供給され、そして数ある中で、Ｚａｅｈｅｒなと、、Ｇｅｎｅ ９　：　１２７〜１４０　（１９８０）、　Ｓｍ１ｔｈなど、、５ｃｉｅｎｃｅ 　２２８　：　１３１５〜１３１７（１９８５）及びＰａｒｓｌｅｙ　ａｎｄ　 Ｓｍ１ｔｈ、Ｇｅｎｅ　７３：　３０５〜３１８１　（１９８Ｂ）に記載される 。

ベクターｆＡＦＦ１の 繊維状バクテリオファージベクターを、Ｚａｃｈｅｒなと、、剪起に記載される テ奮うサイクリン耐性形質導入−クターｆｄＴ・、から構成した。ｆＡＦＦｌと して命名されたベクターを、ｐＭバクテリオファージタンパク質に発現融合され るペプチドの大きさ及び位置に多くの選択を提供するように企画した。ｐｍを、 それが損なわれていないファージ粒子にアセンブルされる前、ａＩご宿主の内部 膜にｐｍを向ける１８個のアミノ酸リーダー配列を有するプレタンパク質として 製造する　（Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ　ａｎｄ　Ｋｏｎｉｇｓｂｅｒｇ、　Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、　１６　：　２６８６〜２６９４（１９７７）及びＢｏｅｋｅ　ａｎｄ 　Ｍｏｄｅｌ、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７９ ：５２００〜５２０４　（１９８２）（これらは引用により本明細書に組込まれ る）、下記にさらに説明されるように、ペプチドライブラリィ−は、処理された タンパク質のＮ−末端で可変へキサペプチド領域を配置するように、第１Ｂ図に 示される構造のオリゴヌクレオチドをクローニングすることによって構成された 。これらの初めの６個の残基の後、２つのグリシン及び次にｐｍの通常の配列が 続く。そのライブラリィ−は、約３Ｘ１０”個の独立した組換え体から成る。

２つの非相補的Ｂｓｔ　Ｘ１部位から成るクローニング部位を、遺伝子■の５′ 領域中に構築した。第１Ａ図に示されるように、２つの非相補的Ｂｓｔ　Ｘ１部 位は、シグナルペプチダーゼ部位（成熟ｐｍのＮ−末端）を取り囲むアミノ酸を コードするＭ＠を端に有する。ｆＡＦＦｌはまた、非感染性ファージをもたらす ｐｍにおける一１フレームシフト変異を有する。Ｂｓｔ　ＸＩフラグメントを除 去し、そして適切な構造体のオリゴヌクレオチドを挿入することによって、（ａ ）その除去された配列の部分が正確に再構成され（たとえば、正しいシグナルペ プチド部位）、（ｂ）１又は複数の追加のアミノ酸がいくつかの位置で発現され 、そして（ｃ）正しい翻訳フレームが活性感染性ｐｍを生成するために再保存さ れる。

遺伝子■の５′Ｎ域でのクローニング部位の構成は、まず、ｆｄＴｅｔのＴＮＩ ０８１域にすでに存在するＢｓｔ　ＸＩ制限部位を除去することによって達成さ れ、ＲＦ　ＤＮＡは、Ｂｓｔ　ＸＩ制限エンドヌクレアーゼにより消化ために添 加された。プラント末端化れた。プラント末端化された分子を次に、連結し、そ してＭＣｌ０６１細胞を形質転換した。いくつかのテトラサイクリン耐性形質転 換体から単離されたＲＦ　［ｌＮＡを再びＢｓｔＸＩにより消化し；切断されな かったクローンを二重Ｂｓｔ　Ｘ１部位の構成のために選択した０部位特異的突 然変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌなど、。

厘ぷ工士区比虹、１５４：３６７〜３８２　（１９８７）、引用により本明細書 に組込まれる）を、オリゴヌクレオチド５　’　−ＴＡＴ　ＧＡＧ　Ｇ”ｒＴ　 ＴＴＧ　ＣＣＡＧＡＣＡＡＣＴＧＧ　ＡＡＣＡＧＴ　ＴＴＣＡＧＣＧＧＡ　ＧＴ Ｇ　ＣＣＡ　ＧＴＡ　ＧＡＡ　ＴＧＧ　ＡＡＣＡＡＣＴＡＡ　ＡＧＧにより行な った。正しい突然変異誘発配列の挿入が、い（つかのテトラサイクリン耐性形質 転換体から単離されるＲＦ　ＤＮＡのジデオキシ配列決定により確かめられた。

々の第１ゴヌクレオチドーイブーリイーのクローンされたオリゴヌクレオチドは 、第１Ｂ図に示される一般構造を有する。その５′及び３′末端は、シグナルペ プチダーゼ部位に接近してアミノ酸配列を再構成するために選択された固定配列 を有する。中央部分は、オリゴヌクレオチドライブラリィ−メンバーを含んで成 る可変領域を含み、そしてまた、その可変配列の１端又は両端上にスペーサー残 基をコードする。

すべての可能なヘキサペプチドをコードするオリゴヌクレオチドの収集体は、配 列５　’　−（：　ＴＣＴ　ＣＡＣＴＣＣ（ＮＮＫ）、　ＧＧＣＧＧＣＡＣＴ　 ＧＴＴＧＡＡ　ＡＧＴ　ＴＧＴ　−３’により合成された。ＮはＡ、Ｇ、Ｃ及び Ｔ（名目上、等モル）であり、そしてＫはＧ及びＴ（名目上、等モル）である、 ０Ｎ−４９と命名されるこの配列を、２つの“半一部位”オリゴヌクレオチド、 ０Ｎ−２８（５’　−ＧＧＡ　ＧＴＧ　ＡＧＡ　ＧＴＡ　ＧＡ−３’　）及び０ Ｎ−２９（５’　ＣＴＴ　ＴＣＡ　ＡＣＡ　ＧＴ−３’　）（これらはそれぞれ ＯＮ　−４９の５′及び３′部分に相補的である）にアニールした後、ｆＡＦＦ ｌのＢｓｔ　Ｘ１部位中に連結した。“半一部位”のオリゴヌクレオチドは、適 切なりｓｔχ■付着端を形成するためにオリゴヌクレオチドＯＮ　−４９の５′ 及び３′末端にアニールする。これは、Ｂｓｔ　ｔｒより消化する必要を伴わな いで暴露される適切なりｓｔ　ＸＩ部位を残し、従って、可変領域に現われるい づれかのＢｉｔ　Ｘ１部位の切断を回避する。ベクターｆＡＦＦｌ（１００μｇ ）を、Ｂｓｔχ１による完結のために消化し、６５°Ｃで熱不活性化し、そして ２Ｍの酢酸アンモニウムの存在下で２度エタール沈殿せしめた。オリゴヌクレオ チドをＴ４キナーゼによりリン酸化し、そして１．５μｇのＯＮ　−２８、１， ２μｇの０Ｎ−２９及び０．５μｇの叶−４９を２０ｕｇのＢｓｔ　ＸＩ消化さ れたｆＡＦＦｌ　ｉｌＦ　ＩＩＮＡと共に混合し、６５℃に５分間加熱し、そし てその混合物を室温にゆっくりと冷却することによって、２０ｍＭのトリス−） ＩＣＩ、　ｐＨ７，５，２ｗＭのＭｇＣ１ｚ　、　５０ｍＭのＮａＣＩ中でアニ ールした。これは、１　：　５　：　１００　：　１００　（ｆＡＦＦ１ベクタ ー：０Ｎ−４９：　０Ｎ−４８：　０Ｎ−２９）のモル比を示した０次に、アニ ールされた構造体をＢｉｔ　ＸＩにより切断されたｆＡＦＦＩ　ＲＦ　ＤＮＡに 連結し、小さな一木組ギャップを有する二本鎖環状分子を生成した。これらの分 子を用いて、宿主細胞を形質転換することができる。アニールされたＤＮＡを、 ２０単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼの添加により、２０ｍＭのトリス−）ＩＣＩ　 、　ｐＨ７，５，５ｓＭのＭｇＣ１ｘ、２　ｓＭのＤＴＴ、１　ｍＭのＡＴＰに おいて連結し、そして１５℃で一晩インキユベートした。

他方、形質転換の前、そのギャップを、可変領域において二次構造を好まない条 件下でフィルインすることができる。いくつかの実験においては、この連結によ り創造されたそのギャップされた環状構造体は、共有閉環された二本鎖分子を生 成するために、リガーゼ及びｄＮＴＰ　（それぞれ４００μＭ）の存在下でＴ４ 　［ＩＮＡポリメラーゼによりフィルインされた（Ｋｕｎｋｅｌなど、、り、そ の連結されたＤＮＡを、０．３Ｍの酢酸ナトリウムの存在下でエタノール沈殿せ しめ、水に再懸濁し、そしてエレクトロポレーシヨンによりＭＣ１０６１中に形 質転換した。それぞれ８０μＥの細胞及び４ＮｇのＤＮＡ　（５０ｄｇ／ａｆ） を含む５種の電気形質転換を、Ｄｏｗｅｒなと、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ 　Ｒｅｓ。

１６　：　６１２７〜６１４５　（１９８８）（引用により本明細書に組込まれ る）に記載されるようにして１２．５ＫＶ／Ｃ１ｌで５ｍ秒間、パルスすること によって行なった。　ＳＯＣ媒体（２％のＢａｃｔｏ　トリプシン、０．５％の Ｂａｃｔｏ酵母抽出物、１０ｍＭのＮａＣ１，２，５ｍＭのＫＣＩ　、１０ｍＭ のＭｇＣｈ　、　１０ｍＭのＭｇＳＯａ２０ｍＭのグルコースＨＨａｎａｈａ＠ 、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１６６＝　５７７〜５８０（１９８３）を参照の こと）２Ｍｉ中において３７゛Ｃで、非選択的増殖の１時間後、形質転換体をプ ールし、アリコートを除き、そしていくつかの希釈溶液を、形質転換効率を評価 するために、テトラサイクリン（２０ｄｇ／ａｍ）を含むＬＢ寒天プレート上に プレートした。残りを用いてテトラサイクリン（２０ｕｇ／ｄ）を含むし一ブイ ヨン１１を接種し、そしてライブラリィ−を増幅するために３７°Ｃで約１０回 の二倍体化を通して増殖せしめた。

ヱエニ乏少単崖 液体培養物からのファージを、遠心分離（ＪＡＩＯローターでの１０分間、４℃ で、８０００ＲＰ）１での）により２度、その上清液を透明にし、そしてポリエ チレングリコール（最終濃度３．３％のポリエチレングリコール−８０００，０ ，４ＭのＮａＣ１）によりファージ粒子を沈殿せしめることによって得、そして 上記のようにして遠心分離した。ファージベレットを、ＴＢＳ　（５０ｍＭのト リス−ＩＣ！、　ｐＨ７，５，１５０ｍＭのＮａＣ１）に再懸濁し、そして４° Ｃで貯蔵した。多くの場合、ファージは、寒天表面から剥ぎ取り、Ｌ−ブイヨン に再懸濁し、そして上記のようにして精製することによってプレートストックか ら単離した。

アフィニティー ファージの約１０３〜１０４個のライブラリィ−同等物を、ＩｄのＴＢＳ中、精 製された抗体１μｇにより４°Ｃで一晩反応せしめた。

（これらの条件下で、ファージ及び抗体はほぼ等モルであり；従って、抗体はフ ァージリガンドペプチドよりもひじょうに過剰量で存在する。　）　ｍＡｂ３Ｅ ７のための親和性を有するペプチドを発現するファージを、Ｐａｒｓｌｅｙ　ａ ｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ　、　肚の方法の変法により単離した。

６０　Ｘ　１５ｍｍのポリスチレン性ペトリ皿を、ストレプタビジン溶液（０， １ＭのＮａＨＣＯ，中、Ｉｍｇ／ｄのストレブタビジン、ＰＨ８，６，０，０２ ％のＮａＨｓ）１　ｌｉにより被覆し、そして４℃で一晩インキユベートした。

そのストレブタビジン溶液を次の日、除去した。プレートをブロッキング溶液Ｃ ３０ｍｇ／ｌｌのＢＳＡ、０．１ＭのＮａＨＣＯｓ中、３ｔａｇ／ｄｌのストレ プタビジン、ｐＨ９，２，０，０２％のＮａＨ３）　１０ｄにより満たし、そし て室温で２時間インキュベートした。ビオチニル化されたヤギ抗−マウスＩｇＧ （２μｇ）をその抗体反応化ファージライブラリィ−に添加し、そして４℃で２ 時間インキュベートした。バンニングのすぐ前、ブロンキング溶液をストレブタ ビジン被膜プレートから除去し、そしてプレートをＴＢＳｌｏ、０５％のＴｗｅ ｅｎ２０により３度洗浄した。次に、抗体−反応性ファージライブラリィ−をそ のプレートに添加し、そして室温で３０分間インキュベートした。ファージ溶液 を除去し、そしてプレートを、室温で６０分間、１０Ｍ１のＴＢＳｌｏ、０５％ のＴｗｅｅｎ２０により１０度洗浄した。付着性ファージを、ベトリ皿に８００ μｌの溶離緩衝液（グリシンにより９Ｈ２，２に調節された、０．ＩＮのｊＩＣ Ｉ中、ｌ■ｇ／ｄのＢＳＡ）を添加し、そして１０分間インキュベートし、免疫 複合体を解離することによって除去した。溶離物を除去し、２Ｍのトリス塩基４ ５μ２の添加により中和し、そして対数相のＥ、コリに９１細胞を感染せしめる ために使用した。

次に、感染された細胞を、テトラサイクリン（２０ｄｇ／ｄ）を含むＬＢ寒天プ レート上にプレートし、そして３７℃で一晩増殖した。ファージを上記のように してそれらのプレートから単離し、そしてアフィニティー精製方法をさらに２段 階くり返した０個々の段階のバンニング及び増幅の後、数千のコロニーからのフ ァージのＤＮＡをプールし、そしてクローニング部位における変動性を評価する ために配列決定した。個々のコドンの初めの２つの位置において、はぼ同じ強度 のバンドが個々のレーンに出現し、これはそれらの位置で塩基の予測される分布 を示した。個々のコドンの第三位置において、ＧバンドはＴバンドよりもいく分 、濃かった。

最終段階のバンニング及び増幅の後、溶出物の一部を、ＬＢテトラサイタリンプ レート上に低密度でプレートされた細胞を感染せしめるために使用した。より直 接的な手段でライブラリィ−におけるペプチド配列の変動性を分析するために、 感染性ファージを生成する５２個の個々のコロニーを取り、そしてそれらの可変 領域のＤＮＡを配列決定した１個々のコロニーを取り、そしてＩＪテトラサイク リン２ｄを含む培養管に移し、そして飽和まで増殖した。ファージＤＮＡを単離 し、そして次に、９６〜ウェルマイクロタイターヲ用いテＢｅｃｋｍａｎｆｌｉ ａ＋ｅｋ　Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎのために企画された方法にり配列決定した（ Ｍａｒｄｉｓ　ａｎｃｌ　Ｒｏｅ、Ｂｉｏｔｅｃ山状旺腔７　：　８４０〜８５ ０　（１９８９）、引用ににより本明細書に組込まれる）、一本額ＤＮＡを、５ ｓｑｕｅｎａｓｅ　２．０　％及びｆＡＦＦｌにおける第２のＢｉｔ　Ｘ１部位 の３′側に４０個のヌクレオチドが位置する配列に相補的であるオリゴヌクレオ チド配列決定ブライ７−　（５’　−ＣＧＡ　ＴＣＴ　ＡＡＡ　ＧＴＴ　ＴＴＧ 　ＴＣＧ　Ｔ（：Ｔ　−３’　）を用いて配列決定した。

個々のコドン内での個々の位置での塩基の分布が第１表に与えられる９個々のコ ドンの初めの２つの位置は、４個の塩基の予測される等モル分布に隣接する。こ のサンプルにおいてＴよりも約５０％多いＧを含む第３位置は有意に変動される 。この変動は、オリゴヌクレオチド混合物の化学的合成の間にたぶん導入される が、しかしまた、発現されたペプチド上に付与される生物学的変動に影響を及ぼ すことができる。

第１表ニライブラリイーからランダムに選択された感染性ファージ変動領域にお けるヌクレオチド分布Ｇ　３１　２７　５９ Ａ　２２　２２　＜１ Ｔ　２５　２６　３９ Ｃ２２２４１ 第２図において、アミノ酸配列は、ランダムに選択された完成性ファージのサン プルのオリゴヌクレオチド挿入体によりコードされるペプチドについて列挙され る。５２のランダムに選択された感染性ファージからの発現されたペプチドのア ミノ酸含有率が第２表に示第２に示されるように、コドン頻度に基づいて予測さ れる出現に対する個々のアミノ酸の観察された出現の割合は、約０．５〜２の範 囲であり、配列のランダム分布に適合する。

処理されたｐｍのＮ−末端上に示されるペプチドのライブラリィ−の構成は、シ グナルペプチダーゼ切断部位に隣接するアミノ酸を必ず変更する。主なコートタ ンパク質、ｏＶｌ［［の対応する領域における一定の変更は、処理効率を遅くし 又は妨げる。ｐｍが同様に影響される場合、ライブラリィ−に含まれるペプチド の変動性が減じられる。はとんどのアミノ酸がランダムに選択されたファージの 種々のペプチドの個々の位置で出現する発見は、プロセッシング欠陥がライブラ リィ−の変動性に厳しい強制を付与しないことを示す。

−ｂ−エンドルフィン　のために　い　ム　る）　−ジの　び配ｌ“ モノクローナル抗体３Ｅ７は、Ｂ−エンドルフィンに結合し、そしてδ〜オビオ イトルセブターのように、はとんどの天然のオピオイドペプチド上に存在するタ ンパク質のＮ末端部分（Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ）を認識する。その抗 体はまた、Ｉｅｕ−及びｍｅｔ−エンケファリン（ＹＧＧＦＬ、　ＹＧＧＦＭ） 及び種々の関連するオピオイドペプチドに堅く結合する（Ｗｏｅなと、、Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ−Ｓｃｉ、　ｌｌ５Ａ　８０：４０８４〜４０８８ （１９８３）、　Ｈｅｒｚなと、、Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　３１：１７２ １〜１７２４　（１９８２）及びＧｒａｍｓｃｈなど、、Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｃｈ ｅ＠、　４０：　１２２０〜１２２６　（１９８３））、　Ｎ　−末端へキサペ プチドライブラリィ−は、三段階のバンニング、溶離及び増幅を実施することに よって３Ｅ７に対してスクリーンされた。

この方法からのファージの回収は第３表に示される０個々の段階において、抗体 に吸着されるファージの割合は、約１００倍、高まり、そして最後の段階におい ては、３０％以上の投入ファージが回収された。これらの結果は、ファージが個 々のパンニング段階において選択的に富化されたことを示した。

第３表：　＠Ａｂ３Ｅ７に基づくバンニングからのファージの回収１０−”　４ ．０ｘｌＯ”　１．９Ｘ１０’　４．８ｘ１０−３”　２．０ｘｌＯ”　５．０ ｘｌＯ”　２．５ｘ個々段階のバンニングの後、数千の溶離されたファージを示 すＤＮＡをプールし、そして配列決定した。遺伝子■における挿入部位に対応す る配列決定ゲルの部分が第３図に示される。可変領域に先行するセリンを特定す るコドンＴＣＣが矢印により示される。第１段階のバンニングの後、このセリン に続くコドンを、ＴＡＴ　（チロシンのための単一のコドン）において明確に富 化した。第２段階の後、プールされたＤＮＡにおける実質的にすべて第１コドン がＴＡＴであることがわかった。第２コドンはＧＧ）［（グリシンのための２つ のコドン）である。３段階目のバンニングの後、最初の４個の位置に比較的少な い種類のアミノ酸を含むファージが選択されたように思え、ところが第５及び第 ６番目の位置は出発ファージ集団における位置とは異なるように思えた。

第３段階のバンニングから回収された５１個の個々のファージからのＤＮＡサン プルを配列決定した。Ｎ末端へキサペプチドの推定されるアミノ酸配列が第４図 に示され、そしてそれらのペプチドのアミノ酸分布が第４表に要約される０分析 された個々の５１個のバンニングされたファージはＮ−末端トリプシンを有し、 そしてほぼすべてが（９４％）、第２位置にグリシンを有した０本サンプルにお ける第３位置は多くのアミノ酸により占められ、そのいくつかは、偶然に予測さ れるよりもしばしば存在する。第４番目の位置は、大きな芳香族残基Ｔｒｐ及び Ｐｈｅ　（−緒に５０％）及び大きな疎水性残基Ｌｅｕ及びｌｉｅ　（追加の４ ５％）により主に占められる。第５及び第６番目の位置は、アミノ酸のランダム 分布を実質的に含み、そしてアラニンのみが、位置５における機会よりもわずか に高い機会で出現する。

Ｉ　Ｙ　、０３１　１．００　３３ 例■ レセプターモノクローナル抗体３Ｅ７のためのペプチドの結合親和性３Ｅ７抗体 のためのペプチドの親和性を、天然に存在するオピオイドペプチドに関連するそ れらのペプチドのために前もって決定した。

Ｍｅｏなと、、藍、前記方法により同定されるペプチドはどれも前もって記載さ れているので、これらのペプチドのうち６個を、化学的に合成し、そしてそれら の結合親和性を評価した。

ペプチドを、たとえばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３２　：　 ３４７１〜３４７（１９８６）　（引用により本明細書に組込まれる）に記載さ れているような良く知られた方法に従って合成した。溶液ラジオイムノアッセイ を用いて、ｓＡｂ　３Ｅ７のためのペプチドの結合親和性を評価した。

〔１ｔＳＩ〕ｂ−エンドルフィン（２０，ＯＯＯｃｐｍ）及び精製された３Ｅ７ 抗体（０，２５μｇ／ｄ）を用いての溶液ラジオイムノアッセイを、Ｍｅ。

など、５前記により記載されているようにして行なった（但し、最終体積は１５ ０μｌであった）、抗体−結合された及び遊離〔Ｉ！ゝ！〕ｂ−エンドルフィン を、Ｇｈａｚａｒａｓｓｉａｎなど、、Ｌｉｆｅ　Ｃｃｉｅｎｃｅ　２７　ニア ５〜８６　（１９８０）に記載されているように、活性炭の添加、続く遠心分離 により分離した。上端液中の抗体−結合（＋！Ｊ）ｂ−エンドルフィンを、ガン マカウンターで測定した。個々のペプチドに関して　（＋ｚＪ）ｂ−エンドルフ ィンの阻害を、１／３１ｏｇ単位の間隔で６種の異なった濃度で決定し、そして ５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を、ＤｅＬｅａｎなど、、Ａｓ、　Ｊ、　Ｐｈ　５ ｉｏ１．　２３５　：　Ｅ９７〜Ｅ１０２　（１９７８）に記載されるようにし て、ＡＬＬＦＩＴプログラムを用いて２−パラメーター算定等式にデータを導入 することによって決定した。

天然に存在するオピオイドペプチドに共通する損なわれていないＮ−末端エピト ープＴｙｒ−Ｇｕｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅのための３Ｅ７抗体のこれまで報告された 高い程度の特異性を、Ｍｅｏなど８１皿前記従って評価した。Ｔｙｒの除去又は 配列Ｔｙｒ−Ｇｕｙ−Ｇｕｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕのアミノ酸のいづれかの欠失は、 結合親和性に対して有害な効果を有した（第５表）。

ファージバンニング法により同定され、そして化学的に合成された６種のペプチ ドについてのＩＣ５０が表５に示される。ラジオイムノアッセイの条件下で（３ ０−の（ｌｆｆｉｓｌ）ｌ、−エンドルフィン；２０％トレーサー結合；１８時 間のインキュベーション）　、ＩＣ５０は、ペプチドのための解離定数（Ｋｄ） にひしように近づくべきである。ペプチドは、ＹＧＧＦＬに比較して、すべて比 較的低い親和性を有し、そしてＩＣ５０は０．３５〜８．３μＭの範囲であった 。

第５表：溶液ラジオイムノアッセイにより決定された３Ｅ７抗体についてのペプ チドの相対的親和性婁ＹＧＧＦＬ　（６）　０．００７１（０，００５４，０， ００９３）　ＩＹＧＧＦ　（３）　０．１９　（０，０９３，０，３８）　０． ０３７ＹＧＧＬ　（３）　３．８　（２，１，６，６）　０．００１８ＹＧＦＬ 　（３）　２８　（１７，４７）　０．０００２５ＹＧＧ　（２）　＞１０００ 　＜０．０００００７１ＧＧＦ！、　（２）　＞１０００　＜０．０００００７ １ＧＧＦ　（２）　＞１０００　＜０．０００００７１ＧＦＬ　（２）　＞１０ ００　＜０．０００００７１ｙｃｐｗｃｈ　（３）　０．３５　（０，１９，０ ，６３）　０．０２０ｙｒｐｐｗｓ　（３）　１．９　（１，３，２，８）　０ ．００３７ＹＧＧＦＰＤ　（３）　２．３　（１，４，３，７）　０．００３１ ＹＧＧＷＡＧ　（３）　７．８　（６，０，１０）　０．０００９１ＹＧＮＷＴ Ｙ　（３）　７．８　（４，０，１５）　０．０００９１ＹＡＧＦＡＱ　（３） 　８．３　（３，８，１８）　０．０００８６ａ＝データは幾何学的手段であり 、そして独立した決定の数から９５％信頼間隔（ｌｏｇ　ＩＣ５０のＳ、Ｅ、ｌ ’１．から計算された）が示された。

データは、ファージバンニング方法が関係ないペプチドが選択されたことにおい て高い特異性であるが、その方法は、適度な（μＭＫｄ）親和性と高い（ｎＭ　 Ｋｄ）親和性との間を区別しないことを示す。

配列決定された５１種のクローンから選択された６種のペプチドは、３段階のバ ンニングにより選択されたそれらの小さなサブセットのみであった。それらの構 造的変動性に基づけば、ファージライブラリィ−は、μＭ又はそれ以下である解 離定数を有する数千の異なったペプチドを含む。

本発明において使用されるバンニング方法は、非特異的に結合したファージを除 去するために、集中的な洗浄を用いる。■Ａｂ　３Ｅ７及び（”Ｈ）　ＹＧＧＦ Ｌとの結合実験は、室温で約ｔｌ／２＝４５秒の急速な解離速度を示す。従って 、比較的低い親和性を有するペプチドを担持するファージを選択する能力は、個 々のファージが典型的には、ｐｍタンパク譬の４又は５個まのコピーを有し、そ して個々のタンパク譬がファージライブラリィ−からの外来性ペプチドを担持す るので、ファージと抗体との間の多価相互作用の結果であり得る。

例■ ペプチドＹＧＧＦＬ及びＹＡＧＦＡＱを担持するファージは、高い（μＭ　Ｋｄ ）及び低い（μＭ　Ｋｄ）の親和性ペプチドを担持するファージの結合及び回収 に対するＩｇＧ及びＦａｂ濃度の効果を決定するためのモデルとして作用する。

多価性の効果を決定するために、ファージサンドイッチＥＬＩＳＡを開発し、こ こで結合されたファージを検出するためにポリクローナル抗−ファージ抗体を用 いた。精製されたモノクローナル抗体３ε７を、損なわれていないＩｇＧ及びＦ ａｌｉフラグメント　（市販のキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて生成された）と して、及びビオチニル化されたＦａｂフラグメント　（Ｇｒａｍｓｃｔ＋　Ｌａ ｈｏｒａｔｏｒｉｅｓ）として使用した。　ＩｇＧは、それらがＳ［］Ｓ　−Ｐ ＡＧＥゲル上で実施され、そしてクーマシーブルーにより染色される場合、Ｆａ ｂ調製物に検出されなかった。　Ｆａｂを、０．１　Ｍノ硼酸塩緩衝液（ｐＨ８ ，，５）　２０　ａ　１２中、Ｆａｈ５μｇと２５０μＣｉの（”ＳＩ　）　Ｂ ｏｉｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試Ｎ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ）　とを３時間反応するこ とによってヨーフ化し、そして５ｅｐｈａｃｌｅｘ　Ｇ２Ｓ上でのゲル濾過によ り精製した。精製の後、（”’］　ＦＡｂの比活性は約１５μＣｉ／μｇであっ た。

上記のように、遺伝子■の５′末端でのフレームシフトを含み、そして非感染性 ポリファージとして生成される、ｐ　ｍ　ｆＡＦＦｌを欠（ファージ粒子に対し て抗血清を生成せしめた。Ｅ、コリに９１の培養物２１からの細胞を、遠心分離 により除去し、そして培地を、０．５ＭのＮａＣ１中、２０％のＰＥＧ溶液４０ ０Ｍ１と共に混合した。４℃で１時間のインキュベーションの後、沈殿されたフ ァージを、８５００ｒｐ■での遠心分離により単離した。ベレットを、ＴＢＳ　 （５０ｓ＋Ｍのトリス−ＨＣｌ。

１５０＋ｓＭ　（ＤＮａＣｌ、　ｐＨ７，４）ニ再懸濁し、そして次に、４２． ００Ｏｒｐｍ　テ３時間、５ｗ５ｏローターにより超遠心分離した。得られたベ レットを水に再懸濁し、そしてファージの濃度を、Ｄａｙ、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂ ｉｏｌ。３９：２６５　（１９６９）の方法に従って評価した。

３匹のウサギに、完全フロインドアジュバント中、ファージ０．５ｓ＋ｇの溶液 を筋肉内注射し、そして次に、不完全フロインドアジュバント中、ファージ０． ２５ｍｇの溶液により３適間隔で追加免疫化した。血清の力価を、上記のように して、Ｉ＋ｕ＋ｕｌｏｎ　２マイクロタイターウエルに固定されたファージを用 いてＥＬＩＳＡにより測定した。すべてのウサギは、２回目の追加免疫化の後、 高い力価血清を生成した。１匹のウサギから、３回目の追加免疫化の後に集めら れた血清を、アッセイのために使用した。

ファージと反応する抗体を次のようにしてアフィニティー精製した。培養物２１ からの生来のｐ　ｍ　（ｆｄ−Ｔｅｔ）を発現するファージを、単離し、そして Ｐｕｓ　（１抛−のリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣ１，ｐＨ７，４）に より４倍に希釈された血清２０ａｆに添加した。室温で２時間のインキュベージ ５ンの後、ファージ／抗体複合体を、１２０，０ＯＯＸ　ｇで１時間の遠心分離 により単離した。ベレットをＰＢＳ　１０Ｈ１により洗浄し、そして再び遠心分 離した。最終ベレットを、１００ｓ＋Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２，５） 　１０ｍに再懸濁し、そして室温で１０分間インキュベートした。サンプルを同 じ遠心分離にゆだね、そして得られた上精液をＮａＯＨにより中和した。次にＩ ｇＧを、製造業者の指針に従ってＰｒｏｔｅｉｎ−Ａアガロース（Ｐｉｅｒｃｅ ）を用いて単離した。ＩｇＧを、市販のキット　（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてアル カリホスファターゼに接合した。

ファージサンドイッチＥＬＩＳＡを次のようにして行なった。マイクロタイター ウェルを、１００μｇ／ｄのストレブタビジンと共に３７°Ｃで１時間インキュ ベートし、次にＰＢＳ７０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳ＾）２００μ！によ り１時間ブロックした。ビオチニル化されたＩｇＧ　（０，５ｕ　ｇ　／　ｘｉ 　）又はビオチニル化されたＦａｂ（５ｊ／　ｇ　／ｄ）　（ＰＢＳｌｏ、１％ ＢＳＡにおいて１００Ｍ１）を、ウェルに添加し、そして室温でさらに１時間イ ンキュベートした。固定されたＩｇＧ又はＦａｂがアルカリホスファターゼに接 合されるヤギ抗−マウスＩｇＧにより検出される予備研究は、それらの条件がＩ ｇＧ又はＦａｂを有するウェルを最大に飽和することを示した。ストレブタビジ ンの飽和のために必要とされるビオチニル化されたＩｇＧ及びＦａｂのための濃 度の差異は、ビオチニル化されたタンパク質の両分の差異にたぶん影響を与えた 。

ＰＢＳによりウェルを洗浄した後、５０μｉのＰＢＳ／　０．１％Ｂ５Ａ１０． ０５％Ｔｗｅｅｎ２０又は２００μＭのＹＧＧＦＬ　ｉｊＩペプチドを含む同じ 緩衝液をウェルに添加し、そして室温で２０分間インキュベートした。ペプチド ＹＧＧＦＬ又はＹＡＧＦＡＧを担持するファージ（５０μｌのＰＢＳｌｏ、　１ ％Ｂ５Ａ１０．０５％Ｔｈｅｅｎ　２０においてＩＱ１１１個の感染性粒子）を 添加し、そして４℃で１８８時間インキュベートた。　ＴＢＳｌｏ、０５％Ｔｗ ｅｅｎ２０による洗浄の後、アルカリホスファターゼ抗−ファージ抗体（１：１ ００の希釈溶液１００ｕｆｆｉ）を添加し、そして室温で１時間インキュベート した。　ＴＢＳｌｏ、０５％Ｔｗｅｅｎ　２０による洗浄の後、ジェタノールア ミン緩衝液（ｐＨ９，５）中、アルカリホスファターゼ基ｆ　（ＳｒＧ？ｆＡ） １００μＥを添加し、そして４０５ｎｍでの吸光度を１０分後に測定した。

ビオチニル化されたＩｇＧ又はＦａｂのいづれかがストレブタビジン被覆のウェ ル上に最大密度で固定される場合のこのアッセイの結果が第５図に示される。特 異的場合がＹＧＧＦＬ−及びＹＡＧＦＡＧ−ファージの両者のために検出され； そのデータは、１．Ｇ及びＦａｂが使用される場合、結合の量が異ならないこと を示唆する。これらのペプチドの一価解離速度に基づくデータと組合すれば、こ れは、ＩｇＧ及びＦａｂの両者のための抗体結合部位が、個々のファージ粒子に より発現される１つ以上のペプチドの同時結合を可能にするためにお互い十分に 接近して存在することを示唆する。

ファージサンドイッチアッセイはまた、固定された抗体とペプチド担持ファージ の相互作用の特異性及び競争性質を決定するためにも使用され得る。実際、ファ ージライブラリィ−上でのペプチドの使用の重要な観点は、アフィニティー精製 の連続的段階の後、個々のファージ単離物の特徴化である。単離されたファージ は固定化表面上に見出される他の化合物に結合することができ、又は活性部位以 外の部位でタンパク質標的に結合することができる。ファージサンドインチアッ セイを用いれば、ＹＧＧＦＬ−及びＹＡＧＦＡＱ−ファージの結合が抗体に対し て特異的であることが示され、そしてファージと抗体との相互作用が遊離ＹＧＧ ＦＬペプチドによりブロックされ得る。

ＹＧＧＦＬ−及びＹＡＧＦＡＱ−ファージの回収に対するＰａｂ濃度及び洗浄時 間の効果に基づく試験の結果が第６図に示される。マイクロタイターウェルを上 記のようにしてストレブタビジンにより被覆した。

ペプチドＹＧＧＦＬ又はＹＡＧＦＡＱを担持する１０”個の感染性ファージ粒子 を、５ｎＭ又は５０ｐＭのピオニル化されたＦａｂ　１ｏＩＩｊ！と共に４℃で 一晩インキユベートした０次に、アリコートを異なったマイクロタイターウェル に添加し、そして室温で１時間インキュベートした。すべてのウェルを、ＴＢＳ ｌｏ、０５％Ｔｗｅｅｎ２０によりすばやく洗浄し、そして最後の２００μ２の 洗浄液をウェルに放置した。その後、種々の時間で、ウェルをＴＢＳｌｏ、０５ ％Ｔｗｅｅｎによりすばやく洗浄し、そして結合したまま残るファージを０．１ Ｍの■ｃ＋　（ａｌｌはグリシンにより２．２に調整されている）により溶離し 、そして上記のようにして滴定することによって定量化した。

その結果は、低いＦａｂｍ度（５０ｐＭ）及び３０分以上の解ｍ１間が、高い親 和性ペプチドＹＧＧＦＬを担持するファージの選択的回収を可能にすることを示 唆する。高濃度のＦａｂ　（５ｎＭ）の使用は、高い及び低い親和性ペプチドを 担持するファージの区別を可能にしなかった。

低Ａｌのビオチニル　れた３Ｂ７　Ｆ１玉」１式」ど忙肛：区ｌ化５ｎＭの３Ｅ ７　ＩｇＧを用いての３段階のバンニング及び増幅により前もって単離されたフ ァージのプールは、前の手段の変法を用いて追加のアフィニティ精製及び増幅の ための出発材料として作用した。

ファージ（ＴＢＳｌｄ中に１Ｑｔｔ個の感染性粒子）を、２ｎｇのビオチニル化 されたＦａｂと共に４℃で一晩インキユベートした（５０９Ｈの最終濃度）。次 にその混合物をストレブタビジン被覆プレートに暴露し、そして結合されたファ ージを上記のようにして単離した０個々のファージクローンを次に単層し、そし てＤＮＡを上記例１に記載されるように配列決定した。

５ＱｐＭのビオチニル化されたＦａｂを用いての２段階のアフィニティー単離及 び増幅により単離されたファージのペプチド挿入体の配列が第６表に示される。

第５表に示される配列と３段階のアフィニティー精製を用いての例■に同定され る配列との間の注目すべき差異は、第４位置におけるＰｈｅの頻度である：　１ ３／１９　ｖｓ、１０１５１　（Ｐ＜０．０５　Ｆｌｉｓｈｅｒ　Ｅｘａｃｔ　 Ｔｅ５ｔ）　ｍ従って、その配列は、既知の高い親和性ペプチドＹＧＧＦＬ及び ＹＧＧＦＭにひじょうに類似する。配列ＹＧＧＦＬＴをこの方法により単離し、 そして最終プールのファージから選択された２０個のクローンの中に、たった１ つの反復体が存在した（そのヌクレオチド配列はまた同一であった）。

第６表 ”　ｔ　工　２　＝　二Ｐ 人フ　−ジクローン１′の　ＩｔＳＩＦａｂの　の抗−ファージで抗血清を用い てのアッセイを、個々のファージ単履物からの（”　Ｉ　）　Ｆｅｂの解離速度 を決定するために開発した。

個々の融合ファージ単離物を、旦−ユユに９１細胞の液体培養物５−において増 幅し、そしてファージ粒子を単離し、そして上記のようにして定量化した。■ｉ のマイクロタイター小管において、約２×１０９個の怒染性ファージ粒子を含む ＴＢＳ　２５ｕ　ｌを、４０．０００ｃｐ−の（”’　Ｉ　）　Ｐａｂを含むＴ ＢＳ／　０．１％　ＢＳＡ　２５−と共に１０分間インキュベートした０次に、 抗−ファージ抗血清（ＰＢＳ／　０．１％ＢＳ＾における１　：　１０００の希 釈溶液２５μ２）及びヤギ抗−マウスＩｇＧにより被覆された５ｔａｐｈ　Ａ粒 子（ＴＢＳ／　０．１％　ＢＳＡにおいて８倍に希釈されたＴａｃｈｔｓｏｒｂ 　２Ｓμ２）を添加した。４℃での２時間の追加のインキュベーションの後、解 離を開始した。未結合（”’　Ｉ　）　Ｆａｂの結合を防止するために、ＰＢＳ ／　０．１％ＢＳＡの４００μＭ溶液２５μｌをすべての管に添加し、そしてフ ァージ結合（”　Ｉ　）　Ｆａｂの量を、前もって１％ＢＳＡにより処理された ガラス繊維フィルター上での自動化された濾過により決定した。フィルター結合 放射能をガンマ計数により決定した。結合を、ＹＧＧＦＬペプチドの添加後、０ ．５．１，２，４゜８、１６．３２分で及び添加の前、３度決定した。初めに結 合される（　”’　Ｉ　）　Ｆａｂの５０％低下に対応する時間を、結合された 量ｖｓ、時間のセミ一対数プロットの線状回帰により決定した。このアッセイを 、第７図に示されるように、既知の親和性のペプチド（ＹＧＧＦＬ、　７ｎＭ及 びＹＧＦＷＧＭ、　３５０ｎＭ）を担持するライブラリィ−ファージクローンに より検量した。

５ｐＭのＦａｂを用いて単離されたファージのプールから取られたファージクロ ーンのためのｔ１／２値が第６表に示される。クローンのいくつかは、対照のフ ァージＹＧＧＦＬに類（以するｔｌ／２値を有した。

（”’　Ｉ　）　Ｆａｂの特異的結合は、試験される２０個のクローンのうち５ つのクローンについては検出されなかった。

一連の関連するリガンドについては、解離速度のランク順序は、平衡結合定数（ にｄｓ）のランク順序と相互関係すべきである。この相互関係を確かめ、そして 定量関係がその対応する遊離ペプチドのＫｄと解離速度との間に確立された。さ らに、低Ｆａｂ濃度を用いての選択のための親和性必要条件を確立した。

異なった解離速度を有するファージクローンに対応するいくつかのペプチドを化 学的に合成し、そしてそれらの能力を溶液競争アッセイで決定した。そのｔ　１ ／２［は、その対応する遊離ペプチドの１ｃ５０と相互関係した。競争アッセイ の条件下で（低濃度のトレーサー、２０％以下の結合されたトレーサー、１８時 間のインキュベーション）　、ｒｃ５０はＫｄに近づくべきである。５００ｎＭ 以上のＫｄｓを有するペプチドを担持するファージに関しては、特異的結合は、 それらの−価アセンブリーで検出されなかった。

例■ −されたジスルフィド　みを有するコノトキシンペプチドライブ立ユエニ コノトキシンペプチドライブラリイ−を、ＮＮに（又はＮＮ５）モチーフの変性 コドンを含むオリゴヌクレオチドを合成することによって、一般的に上記のよう にして調製する。ここで、Ｎは等モルのＡ、Ｃ。

Ｇ又はＴであり、そしてＫは等モルのＧ又はＴ　（Ｓ＝Ｇ又はＣ）である。この モチーフは、超可表領域における個々の遺伝子量ですべての２０個のアミノ酸を コードする。　（他方、その変性部分は、２０個の活性化されたトリヌクレオチ ドの縮合によりアセンブリーされ得る）、６個のシスティンコドンが、その特徴 的なコノトキシン枠組みを生成するために保存される。

ペプチドライブラリィ−における追加の変動性をサンプリングするために、Ｃｙ ｓ間の残基の数を変える。これは次の通りにして達成される： （１）５種の別々のオリゴヌクレオチド合成カラムを、樹脂上に固定された第１ ヌクレオチドにより調製する。（２）前記オリゴヌクレオチドの３′末端の共通 領域を合成する（すべてのカラムは、この末端でクローニング部位、等を生成す るために同じサイクルを通過する）。すべてのカラム上での合成は、コノ−枠組 みの第１Ｃｙｓ　（又はＣｙｓ　Ｃｙｓ）を通して行なわれる。（３）カラム１ 上で、２種の変性コドンが合成され；カラム２上で、３種の変性コドンが同様に 合成される。今、個々のカラムは、第１の超可表領域に２．３゜４．５又は６個 の変性コドンを有するオリゴヌクレオチドを有する。

（４）１つのＣｙｓコドンがすべてのカラムに添加される（これは、オメガクラ スの第２Ｃｙｓ又はｌＵクラスの第３　Ｃｙｓである）、（５）すべての５種の カラムからの樹脂を除去し、十分に混合し、そして５種のカラム間で再び分配す る。今、個々のカラムは第１の超可表領域のすべての５種の長さを有するオリゴ ヌクレオチドを含む。

（６）個々のカラムは再び、前記のように、変性コドン合成の２゜３．４，５、 又は６サイクルに置かれ；そして次のＣｙｓコドン１又はオメガのためにはＣｙ ｓ　Ｃｙｓ）が付加される。（７）樹脂を再び除去し、混合し、そして５種のカ ラムに再び分配し、そしてその工程を３　（ｍｕのためには）〜４（オメガのた めには）種の超可表領域を通してくり返す。（８）すべてのオリゴヌクレオチド の５′末端上で共通する配列を合成し、そしてオリゴヌクレオチドを樹脂から除 去、そして通常通りに精製する。

生物学的活性を達成するためにペプチドの折りたたみは、プレトキシン分子のＮ 末端で、４０個のアミノ酸の保存された”リーダーベブチド“により指図され得 る０組換え融合タンパク質の一部として合成される場合、このリーダーは、“正 しい”コノトキシン様枠組みへの多くのライブラリィ−メンバーの折りたたみを 増強することができる。他方、システィン枠組みのランダムａ様での形成を可能 にすることは、種々の構造体を生成し、このいくつかは、コノトキシン枠組を模 倣する。この集合体は、ペプチドライブラリィ−の変動性に付加される追加の複 数−ループ構造を提供する。

１つのコンホメーションが優先する可能性を最少にするために、ファージのイン ビトロでの軽い還元を行ない、次にほとんどのコンホメーションを形成するため に軽い酸化を行なう、軽い還元／酸化は、０．２〜５ｍＭのＤＴＴによる処理、 続く非還元条件への集中的な透析により達成され得る。ペプチド担持粒子を急速 に通すだめの再生できる固定されたリボ酸がまた使用され得る。

他のタンパク質へのペプチド結合におけるＣｙｓ残基の乱雑な結合の可能性がま た、軽い還元及び酸化により最少にされ、又はＣｙｓ残基を除去するために部位 特異的突然変異誘発により融合タンパク質を再構築することによって回避され得 る。

コノトキシン枠組みを有するペプチドは、本明細書に記載されるようにいくつか の型のライブラリィ−に発現され得る。たとえば、ペプチドは、ｌ）ファージｆ ＡＦＰｌ　におけるＮ−末端ライブラリィ−に発現され；２）内部的に発現され 、Ｎ−末端で又はその近くでｐｍに融合され、プロセッシング問題を回避するた めに切断点からの２〜ｌＧ個又はそれ以上の残基の変性ペプチドを置換し；３） カルボキシル末端暴露化ライブラリィ−に発現され（多くのコノトキシンがＣ− 末端でアミド化されるので、アミノ側鎖を有する残基がペプチドのＣ末端に付加 され、又はそのペプチドライブラリィ−が−イーたたみペプチド”が、Ｃ末端を 暴露された形態に示される変性ペプチドの上流に設定され得る。

コノトキシンの二次枠組み構造を用いるためのこの一般的な型はまた、本発明に 従って、ペプチド発現を企画し、そして構成し／ライブラリィーをスクリーンす るための基礎として、生物学的活性を有する他のペプチドファミリーにも適用さ れ得る。

前述の発明は、例示的及び測的にいくらか詳細に記載されて来たが、本発明の範 囲内で一定の修飾及び変更が行なわれ得ることは明らかであろう。

ｂ蛇　２ ファージ【旧Ｉ　Ｔｗ／−鳳コ ｂ恢　父 ／’７６：　５１３゜ 時間（分） ＦＩＧ、６Ａ。

時間（分） Ｆｌに、６Ｂ。

時間（分） ＦＩＧ　？ 要約書 選択されたレセプターに結合するペプチドが、アミノ酸のランダム又はｔＡｍさ れた収集物をコードするライブラリィ−をスクリーンすることによって同定され る。そのライブラリィ−によりコードされるペプチドは、バクテリオファージコ ートタンパク質の融合タンパク質として発現され、そして次にバタテリオファー ジが対象のレセプターに対してスクリーンされる。広範囲の種類の用途、たとえ ば治療又は診断用試薬としてのペプチドは、予測されるリガンド又はレセプター の構造に基づいていづれの従来の情報も伴わないで同定され得る。

国際調査報告

Claims (45)

【特許請求の範囲】
1. １．予備選択されたレセプターに結合する対象のペプチドを同定するための方法 であって； ペプチドをコードする少なくとも約１０６個のメンバーのオリゴヌクレオチドラ イブラリィーを含んで成るバクテリオファージ発現ベクターにより宿主細胞を形 質転換し、ここでライブラリィーメンバーは、バクテリオファージの外部構造タ ンパク質をコードするヌクレオチド配列の５′領域に読み取り枠を整合して連結 され；前記形質転換された宿主細胞をバクテリオファージの発現及びアセンブリ ィーのために適切な条件下で培養し；特異的ペプチドーレセプター結合の助けに なる条件下で予備選択されたレセプターにペプチドを発現するバクテリオファー ジを接触せしめ；そして 前記レセプターに結合するバクテリオファージを選択し、そして対象のペプチド を同定することを含んで成る方法。
2. ２．選択されたバクテリオファージにおける対象のペプチドをコードするヌクレ オチド配列を決定する段階をさらに含んで成る請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．前記選択されたバクテリオファージが増殖され、そして接触及び選択段階が 対象のペプチドを発現するバクテリオファージを富化するために反復される請求 の範囲第１項記載の方法。
4. ４．前記特異的ペプチドーレセプター結合相互作用の原子価が、より高い結合親 和性のペプチドを富化するために、接触、選択及び増殖段階の続く反復において 減じられる請求の範囲第３項記載の方法。
5. ５．ペプチドを発現するバクテリオファージ及びレセプターが、レセプターと対 象のペプチドを発現するバクテリオファージとの間に実質的に一価の結合相互作 用を生成する濃度で存在する請求の範囲第１項記載の方法。
6. ６．実質的に一価の結合条件下での接触段階が選択されたバクテリオファージの 追加の段階間で少なくとも１度反復される請求の範囲第５項記載の方法。
7. ７．前記レセプターが一価である請求の範囲第６項記載の方法。
8. ８．前記一価のレセプターが抗体のＦａｂフラグメントである請求の範囲第７項 記載の方法。
9. ９．実質的に一価のペプチドーレセプター結合条件下で対象のペプチド及びレセ プターのための解離速度を決定し、そしてそれから、レセプターのための対象の ペプチドの結合親和性を決定することをさらに含んで成る請求の範囲第１項記載 の方法。
10. １０．前記レセプターが固相に結合され、そして前記選択されたバクテリオファ ージが培養物から分離される請求の範囲第１項記載の方法。
11. １１．前記レセプターが抗体又はその結合フラグメントである請求の範囲第１０ 項記載の方法。
12. １２．前記外部タンパク質がバクテリオファージコートタンパク質である請求の 範囲第１項記載の方法。
13. １３．発現ベクターによりコードされる前記バクテリオファージが繊維性ファー ジである請求の範囲第１項記載の方法。
14. １４．前記繊維性バクテリオファージがｆｌ，ｆｄ又はＭ１３である請求の範囲 第１３項記載の方法。
15. １５．前記バクテリオファージがｆｄ又はその誘導体である請求の範囲第１４項 記載の方法。
16. １６．前記外部バクテリオファージタンパク質がコートタンパク質である請求の 範囲第１５項記載の方法。
17. １７．前記ｆｄバクテリオファージのコートタンパク質がｐＩＩＩである請求の 範囲第１６項記載の方法。
18. １８．前記オリゴヌクレオチドライブラリィーがアミノ酸のランダム収集物をコ ードする一連のコドンを含んで成る請求の範囲第１項記載の方法。
19. １９．前記アミノ酸の収集物をコードするコドンが、（ＮＮＫ）ｘ又は（ＮＮＳ ）ｘ（ここでＮはＡ，Ｃ，Ｇ又はＴであり、ＫはＧ又はＴであり、ＳはＧ又はＣ であり、そしてｘは５〜８である）により表わされる請求の範囲第１８項記載の 方法。
20. ２０．前記オリゴヌクレオチドライブラリィーのアミノ酸のランダム収集物をコ ードする一連のコドンがヘキサペプチドをコードする請求の範囲第１９項記載の 方法。
21. ２１．ｘが８であり、そして前記選択段階においてスクリーンされた組換えバク テリオファージが約１０％までの可能なオクタペプチドを示す請求の範囲第１９ 項記載の方法。
22. ２２．前記オリゴヌクレオチドライブラリィーメンバーが少なくとも１つのスペ ーサー残基をさらにコードする請求の範囲第１８項記載の方法。
23. ２３．前記スペーサー残基がＧｌｙを含む請求の範囲第２２項記載の方法。
24. ２４．前記スペーサー残基がＧｌｙ−Ｇｌｙを含む請求の範囲第２３項記載の方 法。
25. ２５．前記オリゴヌクレオチドライブラリィーが、対象のペプチドのための構造 枠組みを含んで成る保存された残基をコードするヌクレオチド配列を端に有する 請求の範囲第１８項記載の方法。
26. ２６．前記フランキング配列がＣｙｓ残基をコードする請求の範囲第２５項記載 の方法。
27. ２７．前記Ｃｙｓ残基が、対数のペプチドのＮ−及びＣ−末端を端に有する請求 の範囲第２６項記載の方法。
28. ２８．少なくとも１つの保存されたＣｙｓ残基がライブラリィー可変領域内にコ ードされる請求の範囲第２６項記載の方法。
29. ２９．前記構造枠組みがコノトキシン様ペプチドの枠組みを含み、そして前記保 存された残基がＣｙｓである請求の範囲第２５項記載の方法。
30. ３０．前記構造枠組みの配列が、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｙ−Ｃｙｓ−Ｙ−Ｃｙｓ−Ｃ ｙｓ又はＣｙｓ−Ｙ−Ｃｙｓ−Ｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｙ−Ｃｙｓ−Ｙ−Ｃｙｓ〔 ここではＹは（ＮＮＫ）ｘ又は（ＮＮＳ）（ここでＮはＡ，Ｃ，Ｇ又はＴであり 、ＫはＧ又はでＴあり、ＳはＧ又はＣであり、そしてｘは２〜６である）である 〕を含んで成る請求の範囲第２９項記載の方法。
31. ３１．前記可変コドン領域が活性化されたトリヌクレオチドの縮合から調製され る請求の範囲第１８項記載の方法。
32. ３２．予備選択されたレセプターのための既知リガンドをコードする遺伝子の２ ０〜１００塩基対のフラグメントがオリゴヌクレオチドライブラリィー中にクロ ーンされる請求の範囲第１８項記載の方法。
33. ３３．前記宿主細胞がエレクトロポレーションにより形質転換される請求の範囲 第１項記載の方法。
34. ３４．前記オリゴヌクレオチドライブラリィーが少なくとも約１０８個のメンバ ーを含んで成る請求の範囲第１項記載の方法。
35. ３５．前記オリゴヌクレオチドライブラリィーメンバーが、処理されたバクテリ オファージ外部タンパク質のＮ−末端がペプチドの最初の残基であるようにバク テリオファージ発現ベクターに挿入される請求の範囲第１項記載の方法。
36. ３６．前記バクテリオファージタンパク質が、成熟外部構造タンパク質のＮ−末 端で暴露されるオリゴヌクレオチドライブラリィーメンバーによりコードされる ペプチドを残すように宿主細胞により処理されるタンパク質である請求の範囲第 １項の方法。
37. ３７．前記ペプチドが、前記成熟外部タンパク質のＮ−末端とそのペプチドのＣ −末端との間でオリゴヌクレオチドライブラリィーメンバによりコードされるス ペーサーアミノ酸残基を含んで成る請求の範囲第３６項記載の方法。
38. ３８．予備選択されたレセプターに結合する対象のペプチドを同定するための方 法であって； ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドライブラリィーを含んで成るバクテリ オファージ発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、ここでライブラリィーメ ンバーが、融合タンパク質をコードするようにヌクレオチド配列と読み取り枠を 整合して連結され、ここで前記ライブラリィーメンバーが、融合タンパク質の５ ′メンバーを表わし、そして３′メンバーがバクテリオファージの外部構造タン パク質の少なくとも一部を含んで成り；前記形質転換された細胞をバクテリオフ ァージの発現及びアセンブリィーのために適切な条件下で培養し；特異的ペプチ ドーレセプター結合の助けになる条件下で予備選択されたレセプターにペプチド を発現するバクテリオファージを接触せしめ；そして 前記レセプターに結合するバクテリオファージを選択し、そして対象のペプチド を同定することを含んで成る方法。
39. ３９．請求の範囲第１，１３，１９，３１又は３８項記載の方法に従って生成さ れたペプチドを含んで成る組成物。
40. ４０．前記ペプチドが抗体を結合する請求の範囲第３９項記載の組成物。
41. ４１．請求の範囲第１，１３，１９，３１又は３８項記載の方法に従って生成さ れたオリゴヌクレオチドライブラリィー。
42. ４２．バクテリオファージの外部構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列 の５′領域に読み取り枠を整合して連結される、少なくとも約５〜２５個のアミ ノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチドライブラリィーメンバーを含ん で成るバクテリオファージ発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
43. ４３．前記オリゴヌクレオチドライブラリィーメンバーが、５〜８個のアミノ酸 のランダム収集物をコードする一連のコドンを含んで成る請求の範囲第４２項記 載の宿主細胞。
44. ４４．前記オリゴヌクレオチドライブラリィーメンバーが、前記アミノ酸のラン ダム収集物に隣接して発現される少なくとも約１〜５個のスペーサーアミノ酸を コードする配列をさらに含んで成る請求の範囲第４３項記載の宿主細胞。
45. ４５．オリゴヌクレオチドのランダムに生成された混合物からのオリゴヌクレオ チドライブラリィーメンバーによりコードされるペプチドをコートタンパク質の Ｎ−末端上に有する繊維性バクテリオファージの収集物。