PT96388B - Processo para a obtencao de um promotor artificial para a expressao de proteinas em levedura - Google Patents

Description

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inici.aç3o da transcrição é suas subsequências: a sequência que se egue ou uma das

CCTA7CACA7ATAAA7AGA

GTACGGA7AG7G7A7A77TATCT GTGCCAGTAGCGACTTT7 7 TCACAC7CGAGATAC7C7 TACT ACTGC7C7C7 7G77G7777 .... -......... ....................................

C ACGG7 C A7 CGCTGAAAAAAGTGTGAGC 7 C 7 ATGAGAAT GA T GACGAGAGAAC AACAAAA

7A7CAC7 7C7 7G7 7 7C7 7C7 7GG7AAA7AGAAT A7CAAGC7 ACAAAAAGCA7ACAA7CAA ---« _......................................«--------------- -

A7 AG7GAAGAACAAAGAAGAACCA7 7 TATC7 TATAG7 7CGATGTT 7 77CGTA7G7TAGTT

C

I • 1 C7ATCAAC7A7 7AAC7A7A7Í . ..........*......

GA7AG7 7GA7AA7TGA7A7AGC que

Um promcior particularmente interessante é o compreende a sequência seguinte:

Μ

I υ

I

CGCGTCTATACTTCGGAGCACTGTTGAGCCMAGGCTCAT TAGATAT ΑΤ.Ι Τ TCTGTCAT ................................... —...... - · —

AGATATGAAGCCTCGTGACAACTCGCTTCCGAGTAATCTATATAAAAGACAGTA

7 Τ TCC Τ TAACCCAAAAATAAGGGAGAGGGTCCAAAAAGCGC TCGGACAACΤΟΤ TGACCOT ··*.........*.........................·--*♦.........»---- -

AAAGGAATTGGGT Τ1 HAT TCCCTCTCCCAGGT Τ Τ Τ TCGCGAOCCTGT TGACAACTOGCA GATCCGAAGGACTGGCTATACAGTGITCACAAAATAGCCAAGCTGAAAATAATGTOTAOC ----· —............................ — - —

CTAGGC7 TCCTGACCGATAIGTCACAAGTGI Τ 1 TATCGGT TCGACT I ϊ ΤΑΤ TACACATCO /

S Ρ h

I

CTTTAGCTATGITCAGITAGTTTGGCATGCCTATCACATATAAATOGA ........................ι· ....... * - · -

GAAATCGATACAAGTCAATCAAACCGTACGGATAGTG7A7AT7TATCT

G7GCCAG7AGCGACTTTnTCACACTCGACATACTCTTACTACTGCTCTCnGT7GTTTT ........-.................................* .................

C ACGGTCA1CGC TGAAAAAAG ΙΟΐ GAGC TC T ATGAGAATGATGACGAGAGAACAACAAAA

TATCACT TCTTGTTTCT TCT TGGTAAATAGAATAT CAAGCTACAAAAAGCATACAATCAA -- I.............................. — · * -----'.........'.....- ATAGTGAAGAACAAAGAAGAACCA11 TATCTTATAGTTCGATGTTTT tcgtatgt tagtt c

I •

J CTATCAACTATTAACTATATÍ - - - « ---------------

GATAGT TGATAATTGATATAGC G promotor de acordo com o invento pode ser obtido por técnicas clássicas de DNA recombinante bem conhecidas do técnica da especialidade. 0 promotor do invento apresenta vantagens importantes relativamente aos oromotores conhecidos e em particular em relação ao promotor ADH^ e ao do gene GAL7.

Ele permite um nível máxima de transcrição e portanto expressão elevada, em particular para a urato-oxidase de A. fiavas, e oferece a possibilidade de regular esta a trás níveis: em presença de glucose e na ausência de galactose nível nulo: não se detecta expressão, resultada idêntico ao publicado para o promotor do gene GAL7 numa estirpe de Sa.ccharomyces cerevísiae colocada nestas condiçBes (TAJIMA et al., 1986,

Molecular Cellular Bioloqy, 6, 246-256) . 0 promotor ADH,, apresenta um nível de expressãofraco mas detestável nestas condições. - na ausência de glucose e de galactose nível de fundo: existe apenas uma expressão fraca, resultado intermédio entre o observado para o promotor ADH0 (nível máximo) s o publicado para o promotor do gene BAL7 (nível nulo: TAJIMA et al., 1986, Molecular Cellular Biology, 6, 246—256;. - na ausência de glucose e na presença de galactose nível de expressão máximo. 0 interesse, para a expressão de proteínas heteróloqas em levedura, de dispôr de um promotor apresentando u.m nível nulo em certas condiçSes é da ter a possibilidade de evitar toda a pressão de selecção que favoreceria as células menos produtoras durante a propagação da estirpe. Isto é particularmente importante no caso da proteína ser tóxica para a célula hospedeira. A vantagem de um promotor de dois níveis de expressão: Um de fundo (não induzido) e outro máximo (induzido) reside na faculdade de escolher um nível intermédio jogando com a concentração do indutor. 0 invento dotou igualmente um vector de expressão para .levedura portador de um gene de interesse com os meias necessários â sua expressão, sua replicação a à seleccção de células

transformadas, caracterizada por o gene com interesse estar sob o controle do promotor anteriormente definido.

Este gene revestido de interesse pode ser um gene endógeno da levedura ou um gene exógeno eucarionte ou procarion-te. Como gene exógeno eucarionte usa—se particuiarmente um gene recombinante codificando a urato-oxidase de Aspergi11us f1avus, um gene recombinante codificando uma citoquina humana bem como um gene recombinante codificando a hirudina.

No caso da proteína codificada pelo gene exógeno ser segregada, naturaimente, a sequência codificando esta proteína é, de preferência, precedida de uma sequência sinal. Esta sequência sinai, escolhida em função da célula hospedeira, tem por função permitir a exportação da proteína recombinante para fora do citoplasma, o que permite à proteína recombinante adquirir uma conformação próxima da da proteína natural, o que facilita consideravelmente a sua purificação. Esta sequência sinal pode ser clivada, quer numa só etapa por uma sinal-peptidase que liberta a proteína madura, sendo a sequência eliminada designada habitualmente por sequência pré ou peptídeo-sinal, quer em vãrias etapas, quando esta sequência sinal compreende para além da sequência eliminada pela sinal-peptidase, denominada sequência pré, uma sequência, eliminada mais tardiamente no decurso de um ou vários acontecimentos proteolíticos, denominada sequência pro. 0 invento dis iqualmente respeito a estirpes de levedura, em particular de Saccharomyces cerevisiae. transformadas pelo vector de expressão anterior, assim como a um processo de produção de uma proteína com interesse que compreende a cultura destas últimas em presença de galactose. 0 inventa diz respeito nomeadamente às estirpes Saccharomyces cerevisiae transformadas pelo vector de expressão

acima referida, que foram depositadas na CdecçSo de Lu1 tura de Microrganismos, Insituto Pasteur, França; - NQ I - 919 em 28 de Dezembro de 1989 - N9 T 1Ô21 em 27 de Dezembro de 1990 01 1 I - 1022 em 27 de Dezembro de 1990 - MO I -- 1023 em 27 de Dezembro de 1990 □ invento será melhor compreendido com a ajuda dos exemplos que se sequem;

Uma grande parte do conjunto de técnicas a sequir mencionadas, bem conhecidas do técnico da especial idade, e explicada em pormenor na obra de Maniatis et al. : "Molecular cloning ; a Laboratory manual", publicada e, 1989 pelas edições Co1d Spring Harbour Press em Nova Iorque (2ã edição). A síntese dos o1igonuc1eótidas é realizada com o auxílio de um sintetizador de DMA Biosearch 4ώΘ€’. EXEMPLO 1: Determinação da sequência do cSNA da urato-oxidase de A. flavus 1 ) Isolamento de RNAs mensageiros de Asoeraillus flavus A estirpe de A. flavus produtora de urato-oxidase foi cultivada nas condições de produção da urato-oxidase, ou seja num meio contendo ácido úrico com a seguinte composição: glucose 15 g/1, MgSO^jJH^O lg/1, ΚΉ,-,ΡΟ^ &, 75 g/1, CaCO^ 1,2 g/1, ácido úrico 1,2 g/1, KOH 0,5 g/1, óleo de soja θ,όό ml/1, FeSO^,71-1^,0 10 rng/ICuSO^.SH^ 1 mg/1, ΣηΒΟ^,/Ή-,Ο 3 mg/1, MnSO^jPU.O 1 mg/1. 0 meio foi ajustado a pH 7 com H-,S04 1M e fo.i esterilizado a 120C'C durante 80 min

Num erienmeyer de 5 I semeou-se i,o 1 de meio com cerca de 1 a 3 1$' esporas. A cultura fci incubada durante cerca de 40 h a 30°C sob agitação <120 tr/min). G micélio foi recuperado por filtração sobre gaze, lavado com áqua e congelado em azoto líquido. 15 q de micélio (peso húmido)foram descongelados e ressus pensos em 45 ml de tampão de lise depois colocado num vai ume igual de esferas <0,45 pm de diâmetro). 0 tampão de lise é constituído por tiocianato de guanidina 4M, Tris-Hill 10 mM pH 7,6, EDTA IO mM, fi-mercaptoetano 150 ml/ 1. A suspensão de micélio foi triturada no triturador Zellmuhller < vibrogene) durante 5 min . 0 material triturado foi recuperado e as esferas decantadas. 0 sobrenadante foi ajustado para cerca de 45 ml e levado a 3M final em cloreto de lítio e conservado a 0°C.

Após deis dias, centrifugou-se durante 60 min a 10 000 rpm. 0 sobrenadante foi rejeitado e o sedimento ressuspenso em 40 ml de LiCl 3M e recentrifugado a 10 000 rpm durante 1 h 30.

Os RNAs são conservados a -80C‘C em

Adicionou-se proteinase K (SIGMA) 40 pg/ml de SDS (0,17. p/v) e EDTA a 20 mM. Incubou-se a 37°C durante 3 h. Precipitou-se com 2 volumes de etanol, depois faz-se uma lavagem com etanol a 707.. Ressu.pende-se o sedimento em 0,5 ml de tampão TE (tris HC1 10 mM EDTA, 1 mM pH 7,5), extrai-se 2 vezes com clorofórmio, precipita-se com etanol. álcool.

ϋ) i~‘ur.1 j icflcâo dã ^ r£~;cj dg Ri~·-ίR uoli A

Cerca de i mg de RNA é precipitado 20 min a 4°C (15 000 rpm) depoi lavado com etanol a 7&V. e seco. 0 sedimento è ressus— penso em 1 ml de tampão 7Ξ e ressuspenso por agitação com vortes;. Oliga dT-celulose tipo 3 <comercializada epla Coiaborative Research Inc, Siomedicals Product Division) foi preparada segundo as recomendações do fabricante. 0 RNA e depositado sobre oligo dT, agitado suavemente para pôr em suspensão as esferas, depois aqueceu-se durante 1 min a 65 °C. A suspensão é ajustada a 0,5 M NaCl depois posta a agitar suavemente durante 10 min. A suspensão e então centrífuga-de durante 1 min» a 1 000 rpm, o sobrenadante é eliminado, o sedimento é lavado duas vezes com 1 ml de tampão TE contendo 0,5 M NaCl. us sobrenadantes são rejeitados. A eluição da fracção de RNA poliadeni. lado (constituída por RNA mensageiros) é conseguida por ressuspensão das esferas em 1 ml de tampão TE, mais aquecimento desta suspensão a 60C‘C durante 1 min, seguido de uma agi taçãc* durante 10 min sobre placa basculan te. Centrífuga—se em seguida lmin a 1 000 rpm, o que permite recuperar por um lado o sobrenadan te contendo miRNA livre em solução e por outro lado o sadimento de esferas de celulose. Repete-se o conjunto das operações atrás (a partir da eluição). Os sobrenadantes assim obtidas são reunidos, elimina-se o excesso de esferas por centrifugação e precipita-se o sobrenadante com etanol contendo NaCl seguindo as técnicas habituais. (Maniatis: op. prec.).

3> Constituição da biblioteca de cPNA h partir dos RNA mensageiros isolados como descrito no parágrafo anterior, realizou-se uma biblioteca de cE>NA no vector pTZl?R (comercializado pela PHARMACIA). Este vector é um plasmídeo compreendendo um poii-adaptador contendo sítios únicos de restrição. A técnica de clonaqem utilizada é a descrita por Caput (técnica do iniciador—adaptado (Primef—adapter): (Caput Proc . Nat 1 . Ac:ad . Sei. (U.S.A. ) ( 18936) 33, 1670-1674) > .

Ela consiste por um lado em digerir o vector por Pstl, adicionar uma cauda de poli dC na extremidade pratuberante 3’, depois em digerir os plasmideos assim obtidos por BamHI. 0 fragmento correspondente ao vector é purificado em coluna de Sepharosa CL4B (PHARMACIA). Ele compreende portanto uma cauda polidC numa extremidade, a outra extremidade é coesiva do tipo BamHI. Por outro lado, os RNAs mensageiros foram submentidos à transcrição reversa a partir de um iniciador cuja sequência é a seguinte 5’<6ATCC6GGCCCT^^^)<3. Assim, os cDNAs apresentam na sua extremidade 5’ a sequência GATCC complementar do extremo coesiva BamHI. Os híbridos RNA-DNA obtidos pela acção da trans-criptase reversa são submetidas a uma hidrólise alcalina que permite a eliminação do RNA. Os cDNAs de cadeia simples são então purificados por 2 ciclos am coluna de Sepharose CL4B e submetidos a um tratamento com transferase terminal de modo a adicionar poli dG ao extremo 3’ . Os cDNAs sãoinseridos na forma de cadeia simples no vector preparado como descrito mais à frente. Um segundo ol iqonu.c leótido "adaptador11 complementar do iniciador é necessário para gerar um sítio BamHI "aberto" na extremidade 5’ dos cDNAs. Após hibridação do vector, cDNA e "adaptador", as moléculas recombinant.es são circularizadas pela acção da ligase do fago T4. As regiões de cadeia simples são então reparadas qraças a uma DNA-poIimerase do fago T4. 12 D conjunto de piasinídeos assim obtido serve para ^ansformar a estirpe MC 1061 quanto à resistência à ampicilina Cssa.oadan Chou. et Coheri J. Bact. (1980) 143 páginas 9971-980). ^ * Determinação na sequência parcial da urato-o:<idase

Uma preparação de urato-oxidase de A f 1 avus (SIGMA) Τι-·ί repurificada por cromatografia numa coluna de Red-aqarose 120 SIGMA) , seguido de uma. filtração num gel de acri lamida-agarose ‘-tltroqel Ac a 44 (IBF).

Com a finalidade de obter informações sobre a sequência aminoácidos da urato-oxidase purificada , permitindo a síntese de sondas necessárias à clonaqem do cDNA, foi tentada uma sequen-ciação amino-terminal directa da proteína. Esta não foi conseguida. prováveimente devido ao bloqueio amino-terminal da proteína. A estratégia que se segue foi pois desenvolvida para obtenção da sequência parcial da urato-oxidase: "Corte da proteína por enzimas proteolíticas (com a ajuda de snzimas tripsina e protease V8 de Staphvlococcus aureus) ~ separação dos polipeptídeos obtidos por HPLC de fase inversa ~ sequenciaçãodos peptídeos purificados. 1) Hidrólise da urato-oxidase gela tripsina, purificação e sequenciação de peptídeos: A urato-oxiaase em 9 mg/ml num tampão de carbonato de amónio 100 mM pH 8,9 foi digerido pela tripsina (Worthington, TPCK) com uma razão urata-oxidase/tripsina de 30/1 em peso a 30°C durante 24 h. Após hidrólise triptica, 6Θ pg de urato-oxidase digerida foram directamente injectadas numa coluna de HPLC de fase inversa de silica BrownLee G1B (coluna 10 x 0,2 cm).

ácido trifluorcacético 0,1% em seguida eluidos por um solução de ácido trifluoro-de 17. a 60% de acetonitrilo equilibrada em acetonitrilo 1% (v/v) , : V/V > em aqua. Os peptideos foram gradiente linear de acetonitrilo numa acéti c o i 0, í 7. v / v > em á g u a v aria n d o em 60 min, com um débito de 150 μΐ/min. Os peptideos ét saída da coluna foram detestadas par medição da densidade óptica a 218 nm. 0 perfil de eluiçáo está aoresentado na Figura 1, na qual os números a seguir à letra T (Tripsina) correspondem aos picos identificados. cada um aos picos foi colhido e conservado a -20°C até ac momento da análise num sequertciador de proteínas (o modelo 470 A da Applied Biosystems), equipado com um cromatógrafo (modelo 430 A da Applied Biosystems) que analisa em contínua as derivados feni1tio-hidantóicos formados, após cada ciclo de degradação. D quadro (1) a seguir apresenta as sequências peptídi- cas dos ? picos identificados. 2) Hidrólise da uratc-o?;idase pela proteína '78, purificação s saguenciação das peptideos; h urato-oxitíase, numa concentração de 2 mg/ml num tampão actato de amónio 100 mM pH 6,8 foi digerido pela protease V8 de Staphylococcus aureus (Boehringer-Mannheim) com uma razão urato-oxidase/protease VB de 60/1 a 30°C durante 72 h. 160 pg de u.rato-oííidase digerido foram em seguida mjectadas numa. coluna de HPLC de fase inversa de sílica BrownLee G18 (coluna 10 x 0,2 cm); partículas (7 x 0,03 pm) equilibradas em acetonitrilo a 1%, ácido trifluoroacático 0,1% (v/v> em água. Os peptideos fforam em seguida eluidas por um gradiente linear de acetonitrilo numa solução de ácido trifluoroacético em água (0,1% (v/v)) variando

de IV. a ó0V. de acetonitrilo em òfe) min, com um débito de 1ΞΘ μΐ/ml. Ds peptídeos à saída da coluna foram detectados pela medição da densidade óptica a 218 nm. u perfil de eluição está apresentado na Figura 2, na qual os números a sequir à letra V (protease V8) correspondem aos picos identificados'.

Cada um dos picos foi colhido e conservado a -2d°C até ac momento da análise no sepuenciador de proteínas já referido. O quadro (1; a seguir apresenta as sequências peptidi-cas dos 5 picos identificados. 15

Sequênciação dos produtos obtidos por hidrólise IO 1 0i 1 Oi l 3 ím 1 a 1 3 Oi 1 3 mm* mmj 0) ar to Or X Or —J | M | ►H mJ GO < _f a. _J α u t. a *O mmJ X X 1 X 0> to fO 1— | G0 | to | < < > o o 13 c to O) X X 0r L. 0i u u a 1 L. X u mm* mm* ar w X ar u CJ o _l c O o l-H GO H- G0 h- GO CO α to 3 Oi Oi 3 c —^ ar 3 (V 1 3 •F- 0l X X —-rf to ro —» QJ X Or -J l t— X mJ Qu. CL O c > ►-« j a. X L. a a» 3 3 <υ a L. L. I- c jC u JC a> Oi X to 0i X CJ —« Or o r ►— >— a. mJ CL < go >— GO O GO 3 t. (0 u X 3 3 L. D C 0r 1 1 G. G. 1 t» «Ό or 0> —* —» X to —» 0) 0r O 1 > 00 < GO o O a h— a < *-« G0 G0 GO 3 3 α 3 a o o to 03 a t~ co C 1 to 'ϋ -' <υ 10 Oj U u U ·»- to X X to X > 1 O | < 1 0. a. X < < 1- _l < -J C Í0 α α Qj o o to 0i rt) C 1 1 ar c. 1 ro mm* to 03 (O X G» U X X w (0 —/ ^ > O < | < 1 > 1 < X CL a. •J . CL < «5 h* H* ►H o. D a 0; α 4í c U u c u to to 1 1 CL L 1 Q. ±n 0/ t_ —* to —* —* X X to X X X < l _í I H- < ►H O >— 1— < h- _J -J <C GO X l. 3 u 3 u O to to t- CJ ( 'O jC jC —· o <z L X X X — _-r X > | o | >— O 1— O GO > > Cu _j h- k-i >-< _l -H _J C u 0i G. <u c o c O t- 3 to 3 ro L. (_ X 3 1 1 o —> £ 0) JC to L X U X O ·*“ 0i —' X 0i O l GO | <C 0. GO a. 1 < CL h- Cl. h— _J x mJ C r— go O -J. o 2! CJ CL t. 3 u u C X c x g. a *- c G. Q. 1 f I 1 x tO X 0l X X tO mm* to —' Oj g. X —' > 1 o. I < ►— | -J H* r— < O < O G0 H- >— o G0 < -J > «a: _J > c c OI to 0> to u C 3 C 3 L. G. G. L 1 t 1 X l_ Ό 1 1 1Λ jC **· *·“ Oi _ a, w ¢, >S 4> rO fO X X w X < 0. X 00 O -J O _l H- G0 > > 1— h- O 1— _j o í- o ro X ao O rvj ro *“* (Ni (NI rsj (Ni (Ni m h0 r-0 r- fNI ΓΟ GO Ό h- >— »— h“ 1— H- 1— 1— h- > > > > > Ό (Q 3 c a) <υ r-' •H Ό w (d to 3 td α Ό (D m «H «J 4-> SL O e 4-i rj L CL O <U ε CJ Ό Cl Π) co a m > 16 5) Despiste de bactérias 1 ) PrsR^r3Ç.ão..de..sondas...marçadas;

Dais conjuntas de sondas deduzidas de sequências de

aminoá.cidos da proteína foram sintetizador de DNA Eiosearch ponde a sequência de resíduos sequência de T 27), de 5’ para A T G G TCGAT TC Aft ' T C A A

sensitizados com a ajuda de um 46Θ0. 0 primeira conjunta corres-His—'Tir—Fen—Glu—Ile—Asp (parte da T ? · G A TG A 4 t.ste conjunto é com efeito constituído por 2 >; 3 = 48 oligonu.- cleótidos diferentes representando todas as combinações possíveis. U segundo conjunto corresponde à sequência de resíduos de aminoácidos Gln-Fen-Trp-Gli-Fen-Leu (parte da sequência de V‘5) , de 5" para 35:

GG A G T

A AA6CCCCA AA TG AA C A C

T

Este conjunto é constituído por 24 ;·: 4 = 64 combinações.

As sondas são marcadas com desoxinucleotidi1-terminal--transferase terminal (TdT) (comercializada por IBI, Inc). A reacção efectua—se em 100 ng de uma mistura de o 1 igonuc 1 eótidos em solução <100 mg/ml) num tampão de reacção •'Cabal t" (fornecida 1Θ vezes concentrado pela IBI inc. : 1,4 M de cacodilato de potássio pH 7,2, 300 mM de ditiotreitol, 1 gl da enzima besoxinuc 1 eotidi 1 -termina 1 —transferase < ΪΒΙ Inc ) e 50 gCi de tíesccitidiltrifosfato dCTP marcado com P32. A reacção dá-se a 37°C durante 10 min e depois e parada adicionando 1 μΐ de EBTA o,5 M.

Extrai-se com fenol e dialisa-se em coluna de polia-c r 11 amida. 6ioge 1 F' 10 ( Biorad : 150-1Θ50) . 2 > Hibridação e dsteccão Ja colónias contendo o cDNh da u ra to—o :· i dase cerca de 40 000 colónias foram despistadas pela técnica de hibridação in si tu descrita por Grunstein e Hooriess (1975, Fvoc „ Watl . Acad. Sei. ÍU..3.A. ), 72 3961),. Cerca de 6 000 bactérias são despistadas em caixas de petri de modo a obter colónias isoladas,. Após incubação durante 24 horas a 37°C, cada uma das caixas foi replicada para 2 filtros, cada filtro sendo destinado a ser tratado com um de 2 conjuntos de sondas, de forma a que todas as colónias obtidas sejam testadas com os 2 conjuntos de sonsas, sm paralelo. 10 Μ. A solução 10 0s filtros foram hibridados com um dos 2 conjuntos de sondas num tampão contendo ó x SSC, 10 x Denhardfs e ÍO0 pq/ml de DMA de esperma de salmão sonicado s desnaturado (SIGMA). A temperatura de hibridação è de 42°C e a duração de lò h. A solução 6 x SSC obtem-se por diluição de uma solução 20 x SSC. A preparação do tampão 20 x SSC está descrita em Maniatis, Fritsch e Sambrook (op. cit.). Resumindo, este tampão contem 175,3 g/ml de NaCl; S8,2 g/1 de citrato de sódio e ajustado a. pH 7 com algumas gotas de NaOH 10 M. A solução 10 x Denhardt contem 1 g de 18 ricoll, 1 g de paiivmilpirroiidana, 1 g de albumina =>érica humana para. 5ΘΘ ml de volume final.

Após lavagem na solução 6 x SSC a 42°C (3 h com o mudas de banho), os filtros são secos em papel Josech e realizada au t.o-radiagraf ia. Os filtras são reveladas após 16 h. Farece que uma fracção de cerca de 0,5¾ de colónias hibridou com os 2 conjuntos de sondas. 5 colónias entre estas foram repicadas e purificadas. Preparou-se DNA de piasmideo de cada uma das colónias e analisou--se este DNA por diqestão com BamHI ou com Hindi II ou com as duas si mu I tãnearnen te .

Após análise em gel de aqarose, observou-se que os 5 plasmideos obtidas foram linearizados por BamHI e por HindIII. As duplas digestões permitem libertar um fragmento correspondendo na totalidade ao cDNA clonado. 0 tamanha deste fragmento é de cerca de 1,2 Kb em 3 casos, cerca de 0,9 Kb nos outros 2 casos. Para a determinação que se seque selecc.ionou-se um dos fragmentos de 0,9 Kb e um dos fragmentos de 1,2 Kb que foram reclonados (ver ponto ó a seguir). y 6) Determinação da. sequência de cDNA da ura to-o κ idase

Reclonou-se um destes fragmentos de 0,9 Kb por um lado (cione 9A) e um dos fraqmentos de 1,2 Kb (clone 90 por outro lado, no DNA da forma replicativa do fago de cadeia simples M13. □ DNA dos clones M13 contendo por um lado o fragmento de 1,2 Kb foi submetido a uma digestão com exonuclease de forma a gerar uma série de clones ίΊ13 sobreponiveis (processo "Cyclone I Biosystem" de IEtI > . Estes últimos foram sequenciados pelo método dos desaxir— r i bonuc leótidos (Sanqer F‘NAS-USA 1977, 14, 5463-5467). 19 A sequência de nucleótidos do ciorte 9C está representado na Figura 3 a qual indica igualmente par uma seta o começo do cione 9A e por um símbolo nucleótidico munido de um asterisco * os nucleótidos sequenciados do cione 9Λ não idênticos aos do cione ?C (quando se faz corresponder as duas sequências e os sítios da restrição Accl e BamHI utilizadas nas construcóes posteriores (Cf. 2)).

Observou-se que: - que a sequência nucleótidica do fragmento maior (cione 90 cobre a do fragmenta mais curto (cione 9A) , tem duas diferenças perto (v figura 3). Uma das diferenças é silenciosa, a outra corresponde a uma alteração de um resíduo triptofano para um resíduo glicina» Estas diferenças podem ser devidas quer a diferenças nos RNA mensageiros isolados, (Cf. 2) abaixa), quer a erros da transcriptase reversa utilisada quando da constituição da biblioteca de cDNA (Cf. 3) abaixo).

No caso do fragmento maior, um codão ATG (na posição 1Θ9 na Figura 3> abre uma grelha de leitura correspondendo a um polipeptídeo de 3Θ2 aminoácidos, de peso molecular perto de 34240 Da, cuja sequência corresponde à sequência parcial da urato-oxi-dase de A. f1avus purificada (Cf. 4)).

Representou-se na Figura 4 a sequência de DNA aberta pele codão ATG e o polipeptídeo codificado, assim como por flechas face ao polipeptídeo codificado os peptídeos sequenciados (Cf. 4) obtidos por hidrólise da urato—oxidase de A. f1avus com a ajuda ae tripsina e de protease V8.

Observa-se que a. sequência do polipeptídeo termina pelo tripleto Ser-Lis-Leu, típico das enzimas localizadas nos peroxis-somas (Gould S.J. et al., J. Cel1 Biology 108 (1989) 1657-1664).

3EXEMPLO 2; Construção dg três vectores de e/!orassao do cDNA da urata-oiadase em levedura, o plasmídeo pEHR4ò9 portaaor de um promotor hDH._ e os plasaideps pEMR473 p£S1R515 portadores do promotor artificial da invento A estratégia posta, em prática utiliza os fragmentos obtidos a partir de piasmídeos pre-sxistentes acessíveis ao público e de fragmentos preparados por síntese segundo técnicas correnteraente utilizadas. As técnicas de clonagem empregues são as descritas por T, MANIATIS, EF. FRITSCH e J. SAMBRGOK em "Molecu.lar Cloninci a Laboratory Manual" (Cold Bpring Harbor Laboratory, 1984),. A síntese de ol igonucleótidos foi realizada com a ajuda de um sintetizador de DNA Biosearch 4 60Õ. A descrição que se seque será melhor compreendida. pela leitura das figuras 5, 6 e 7 que representam respectivamente os mapas de restrição do plasmídeo pEWR414 e dos piasmídeos pEMR469 e pEMR473. Os símbolos utilizados nas figuras serão definidos na descrição que se seque. No caso de um sítio ter sido tornado "o “ cerse pela polunerase de Klenow, ele vem afectado do índice ; quando os sítios foram suprimidas par ligação são indicados entre parêntesis. 1 ) Construção do plasmídeo pE)Y!R469:

Este plasmídeo foi construido a partir do vector vai-vem para E. zoli-levedura. pEMR414, construido por ligações sucessivas dos elementos que se seguem: - o fragmento PstI-HindIIIo - simbolizado por ++++ na figura 5 - do plasmídeo pJBB297 (BEGGS, 1978 : Gene Cloning in Yeast -p. 175-203 em: Genetic Engineering vol 2 - WILLIAMSQN - Academic Press - London UK> compreendendo a parte a montante do gene de

O resistência à ampicilina Amp do pBR322 (Sutcliffe 1979 Cold

Sprinç Svmp. Quart. Biol. 43, 779) e um fragmenta de 2μ endógeno forma 3 portador da gene LEU2 as 5. csrsvisxae tendo o seu promotor parcial mente eliminado (oesignaoc; LEU2d > , c locus STB REP3) s a origem aa replinação de 2u (HARTLEY e DONELSOiv, 198Ô,

Nature, 2Q6, 860-805)« A extremidade Hindi II deste fragmento foi tornada csrse pela acção da poiimerase Klenow. Ela foi designada Hindi II°na figura 5« - o fragmentei Hindi II-SmaI - representado por / 7 7'/' na figura 5 - do cromossoma V de levedura contendo o gene URA3 com o seu promotor (ROSE et ai., 1984, Gene, 29„ p. 113-124). Este f ragmento Hindi I I-Sma.l proveniente do plasmideo pFLl (CHEVALIER et al., 1980, Gene 11, 11-19)). A extremidade Hindi II deste plasmideo foi tornada cerse pela acção da poiimerase K1eenow. - um fragmento SamI-BamHI - simbolizado per --- na figura 5 — contendo uma versão sintético do promotor do pene ADH-, diferindo da versão natural descrita por RUSSEL e SMITH (RUSSEL et ai-, 1983). J. Biol. Chem. 258, 2674-2682) apenas nalguns pares de bases destinados a introduzir sities de restrição. C A sequência natural poderá ser utilizada com resultados poucos diferentes). A sequência deste fragmento è dada a seguir: •v

S Μ m I a u I I

tGGGACGCGTC7CCTCTGCCGGAACACCGGGCATCTCCAACTTATAAGTTGGAG -------4----------------4 - - -------4---------4 ----- -

CCCTGCGCAGAGGAGACGGCCT TGTGGCCCGTAGAGGTTGAATAT TCAACCTC AAAT AAGAGAAT T TC AGAT TGAGAGAATGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGC AGAGGAGA -----------------------♦-----------------------------4---‘---

T7TATTCTCTT A A AG TC T AACTCTCT T ACTT TT TT TTTTTTTTTTTTTT CCGT CT CCTCT

S

P h

I

GCAT AG AAAT GGGGTTCACT TT T T GGTAAAGCT AT AGC ATGCC T ATC AC AT AT AAAT AGA ---4---------4---------4---------4--------------------------

CGT ATCT T T ACCCCAAGT GAAAAACCAT T TCGAT AT CGT ACGGAT AGT GTATATTTPTCT GTGCCAGT AGC G ACTT T T T TCACACTCGAGAT ACTCT TPC T ACTGC TC TCTTGTTGTTTT ---4 ---------4---------4---------4---------4---------4------

CACGGTCATCGCTGAAAAAAGTGTGAGCTCTATGAGAATGATGACGAGAGAACAACAAPP

TATCACTTCTTGTTTCTTCTTGGTAAATAGAATATCAAGCTACAAAAAGCATACAATCPA ---4---------4---------4---------4---------4----------------

ATAGTGAAGAACPAAGAAGAACCATTTATCTTATAGTTCGATGTTT TTCGTATGTTPGTT

B %5* C a 1 m

a H

1 ’T

CTATCAACTATTAACTATATCGATACCATATGGATCCGTCGACTCTAGAgtGATCGTC ---4---------4-----------------------------4-------------

GATAGTTGATAATTGATATAGCTATGGTATACCTAGGCAGCTGAGATCTCCTAGCAG

B a m

H GACTCTAGAGÍ

CTGAGATCTCCTAG - d fragmento Bq 1111-Hirid 111 - simooi izado por na Figura 5 — cortador na extremidade 3’ do gene PGK de levedura. Este fragmento provem aa digestão completa com a ajuda de BglII do fragmento Hindi II do DNA cromossóinico de levedura, portador do gene PGK descrito por HI7ZE)'!ftN et al . , ÍNucleic Acids Res., lô, 7791--7808) o qual só apresenta um sitio BglII. Esta digestão permite? obter dois fragmentes Hindi I I-Bgl 11 , em que o mais pequena tendo cerca de ô,4 i<b, possuidor da extremidade 3’ do gene PGK de levedura é usado. A sequência deste último fragmento está descrita por HITZEMANN et al., κreferência citada atrás). 0 sítio BglII foi clonado no sítio BamHI do fragmento anterior (os sítios BamHI e BglII desaparecem portanto) e α sitio Hindi II, tornado cerse pela acção da polimerase Kleenow, foi clonado no sítio PvuII do fragmento PvuII-Pstl da pJ3R322 descrito a seguir. - o fragmento PvuII-Pstl - simbolizado por XXX na fiqu.ra 5 - da pBR322 contendo a origem de replicação e a parte a jusante do

R gene de resistência à ampicilina Amp". D plasmídeo pEMR414 assim constituído comporta portanto os elementos seguintes: - uma origem de replicação e um gene de resistência à

R ampicilina Amp permitindo a replicação e a selecção do plasmídeo em células Ecol i. Estes elementos permitem a transformação de células E. coli. - uma origem de replicação para a levedura (ARS), o locus STB e o gene LEU2 de S. cerevisiae sem promotor e o gene URA3 com o seu promotor de S, cerevisiae. Estes elementos permitem a replicação e a selecção do plasmídeo em células de S. cerevisiae assim como uma eficácia de partição suficiente em células contendo o plasmídeo 2μ endógeno. 0 plasmídeo pEMR414 foi submetido a uma digestão completa pelas enzimas de restrição Nhel e Ciai. 0 fragmento

pequeno Nhel-Clal contenda a gene URA3, designada a seguir como fragmento A, foi puriTicaao. 0 plasmídeu pEMR414 foi submetido a uma digestão completa pelas enzimas Nhel e BamHl. 0 fragmento grande Nhel--Ba.mHI contendo principal mente o gene LEU2d e a origem de repli-caçeÍD do plasmídeo pBR322, designado a seguir fragmento B, foi purificado,

Por outro lado preparou-se o fragmento sintético Clal-Accl contendo o 'principio ae um gene codificador da proteína deduzida da sequência ae cDNA da urato-oxidase íclone 90. Este fragmento possui modificações relativamente ao clone 9C, introduzidas com a finalidade ae colocar no lugar codoes usados pela levedura (Cf. SHARP et ai., 198ó, Nuc1. Ac. Res. Vol. 14, 13, pp. 5125-5143) sem alteração dos aminoácidos codificadas. A sequência deste fragmento, designada a seguir fragmento C, é a. seguinte (os nucleótidos sublinhados são os modificados relativamente ao clone 90 .

A c c I

C l a I

CGATATACACAATGTCTGCTGTTAAGGCTGCTAGATACGGTAAGGACAACGTTAGAGT ---+---------+---------+---------+---------+---------+----

TATATGTGTTACAGACGACAATTCCGACGATCTATGCCATTCCTGTTGCAATCTCAGA

Submeteu-se o plasmídeo do clone 9C (Cf. figura 3> a uma digestão pelas enzimas Accl e BamHl. 0 fragmento AccI-BamHI que contem o fim do cDNA da urato—o:<idase, a seguir designada fragmento D, foi purificada. Este fragmento tem a seguinte sequências

Accl .

y CTACAAGGTTCACAAGGACGAGAAG * ------+---------+

[TGTTCCAAGTCTTCCTGCTCTTC

ACCGGTGTCCAGACGGTGTACGAGATGACC GTCTGTGTGCTTCTGGAGGGTGAGATTGAG

TGGCCACAGGTCTGCCACATGCTCTACTGG CAGACACACGAAGACCTCCCACTCTAACTC

ACCTCTTACACCAAGGCCGACAACAGCGTC ATTGTCGCAACCGACTCCATTAAGAACACC ---------4.---------+---------+---------+---------+---------+

TGGAGAATGTGGTTCCGGCTGTTGTCGCAG TAACAGCGTTGGCTGAGGTAATTCTTGTGG ATTTACATCACCGCCAAGCAGAACCCCGTT ACTCCTCCCGAGCTGTTCGGCTCCATCCTG — — — — — — — — - +- -- - — -+ — .- — — — — — — + - + — — — — — — +

TAAATGTAGTGGCGGTTCGTCTTGGGGCAA TGAGGAGGGCTCGACAAGCCGAGGTAGGAC

GGCACACACTTCATTGAGAAGTACAACCAC ATCCATGCCGCTCACGTCAACATTGTCTGC ---------+---------+---------+---------+---------+---------+

CCGTGTGTGAAGTAACTCTTCATGTTGGTG TAGGTACGGCGAGTGCAGTTGTAACAGACG CACCGCTGGACCCGGATGGACATTGACGGC AAGCCACACCCTCACTCCTTCATCCGCGAC . — — — + — — . — — + . — . — — + - — — - — - — — . + - — .......+

GTGGCGACGTGGGCCTACCTGTAACTGCCG TTCGGTGTGGGAGTGAGGAAGTAGGCGCTG

AGCGAGGAGAAGCGGAATGTGCAGGTGGAC GTGGTCGAGGGCAAGGGCATCGATATCAAG ---------+---------+---------+---------+---------+---------+

TCGCTCCTCTTCGCCTTACACGTCCACCTG CACCAGCTCCCGTTCCCGTAGCTATAGTTC

TCGTCTCTGTCCGGCCTGACCGTGCTGAAG AGCACCAACTCGCAGTTCTGGGGCTTCCTG ---------+---------+---------+---------+---------+---------+

AGCAGAGACAGGCCGGACTGGCACCACTTC TCGTGGTTGAGCGTCAAGACCCCGAACGAC

CGTGACGAGTACACCACACTTAAGGAGACC TGGGACCGTATCCTGAGCACCGACGTCGAT .-...-...+....-....+.........+

GCACTGCTCATGTGGTGTGAATTCCTCTGG ACCCTGGCATAGGACTCGTGGCTGCAGCTA

GCCACTTGGCAGTGGAAGAATTTCAGTGGA CTCCAGGAGGTCCGCTCGCACGTGCCTAAG ---------+---------+---------+---------+---------+---------+

CGGTGAACCGTCACCTTCTTAAAGTCACCT GAGGTCCTCCAGGCGAGCGTGCACGGATTC

TTCGATGCTACCTGGGCCACTGCTCGCGAG GTCACTCTGAAGACTTTTGCTGAAGATAAC ---------+---------+---------+---------+---------+---------+

AAGCTACGATGGACCCGGTGACGAGCGCTC CAGTGAGACTTCTGAAAACGACTTCTATTG

AGTGCCAGCGTGCAGGCCACTATGTACAAG ATCGCAGAGCAAATCCTGGCGCGCCAGCAG ... _--------+---------+ _______-- +---------+

TCACGGTCGCACGTCCGGTGATACATGTTC TACCGTCTCGTTTAGGACCGCGCGGTCGTC

CTGATCGAGACTGTCGAGTACTCGTTGCCT AACAAGCACTATTTCGAAATCGACCTGAGC

GACTAGCTCTGACAGCTCATGAGCAACGGA TTGTTCGTGATAAAGCTTTAGCTGGACTCG

TGGCACAAGGGCCTCCAAAACACCGGCAAG AACGCCGAGGTCTTCGCTCCTCAGTCGGAC ---------+---------+---------+---------+---------+---------+

ACCGTGTTCCCGGAGGTTTTGTGGCCGTTC TTGCGGCTCCAGAAGCGAGGAGTCAGCCTG

CCCAACGGTCTGATCAAGTGTACCGTCGGC CGGTCCTCTCTGAAGTCTAAATTGTAAACC ---------+---------+---------+---------+---------+---------+

GGGTTGCCAGACTAGTTCACATGGCAGCCG GCCAGGAGAGACTTCAGATTTAACATTTGG

AACATGATTCTCACGTTCCGGAGTTTCCAA GGCAAACTGTATATAGTCTGGGATAGGGTA ---------+---------+.........+ -........+---------+---------+

TTGTACTAAGAGTGCAAGGCCTCAAAGGTT CCGTTTGACATATATCAGACCCTATCCCAT TAGCATTCATTCACTTGTTTTTTACTTCCA ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΛΑΑΑΑΑΑΑΑΑ ATCGTAAGTAAGTGAACAAAAAATGAAGGT χχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχχ

BamHI AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGGCCCG·* ---------+---------+ --------

TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCCCGGCCT AG

Os fragmentos A, B, C e D foram ligados de forma a obter se o plasmídeo pEMR469 representada na Figura 6, na qual os símbolos tem o mesmo significado que na Figura 5, os novos Traqmentos Clal-Acel e AccI-BamHI sendo simbolizados por sequência codifida urato-Dxida-promotor ADFL, a sequência: ::t Q í J Y~ cf d e, sob o róxi/no do 0 plasmídeo pEMR469 é portador de uma prc-tema deduzida da sequência de cDNA controle de um promotor designado promotor ADH0 natural, compreendendo

Μ t u 3:

tGCGTCTCCTCTGCCGGAACACCGGGCATCTCCAACTTATAAGTTGGAG ·»...................*............................

AGAGGAGACGGCCTTG7GGCCCGTAGAGGTTGAATATTCAACCTC

AAATAAGAGAAT.TTCAGATTGAGAGAATGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGCAGAGGAGA ···♦-------------------------...».........

1 T TAT TCTCTTAAAGTCTAACTCTCTTACTTTTTTT ITT T TT T7 T7 T7 TCCG7C7CCTCT s

P h

2 Elemento TATA

GCATAGAAATGGGGTTCACTTTTTGGTAAAGCTATAGCATGCCTATCACATATAAATAGA .......................................................

CCTATCTTT ACCCCAAGTGAAAAACCA1 T TCGAT ATCGT ACGGAT AGTGTA7 A7 T TATCT

Xf©£- οτοοαΑθΤΑοεαΑςτ7 7 7 7 τοΑςΑα7ϊ0ΑθΑΤΑςτο7ΤΑθΤΑςτοατοτετ7αττοτ7Ττ ......................-4.---..-..4.--..----4.-.......4.....-

C ACGG7CA7 CGCTGAAAAAAGT GTGAGC7CT ATGAGAATGATGACGAGAGAACAACAAAA TATCAC7 7CT7GTT7CT7CTTGGTAAA7AGAATATCAAGCTACAAAAAGCATACAATCAA ........................................---«.........4......

RTflGTCflflGAflCflAfiGflPGflPCCfllITflTCITflTfiGnCGflTGTTI T TCGTATGTTAGTT < —1 > C Região de iniciação 1 da transcrição a 1 CTATCAACTATTAACTATAT' 35.....................

GATAG77GATAATTGATATAGC 23 2) Construção do olasmidea OEÍTR4/3: O piasnuaso p£)1R469 foi submetida a uma digestão completa pelas enzimas MluI e Sphl. 0 grande fragmente Mlul-Sphl contendo o gene da urato-oxidase tox em seguida ligaaa ao fragmento sintético, cuja sequência é dada a seguir, corresoondendo a uma parte (200 pb) da sequência a montante do elemento TATA do promotor GAL7 de S. cerevisiae. a qual compreende duas sequências ce activação a montante UASi e UAS2 de alta afinidade, enquadradas abaixo (Cf. R. J. BRAli et al. (19S6) EMBO J. vol. 5 nQ3, p. 603-608).

M

I u

UASI

CGCGTCTAT

I

TTCGGAGCACTGT TGAGCGAAC.GC TCAT TAGATATAT T 1 TCTGTCAT - ------------------------------♦---------*----- AAGCCTCGTGACAACTCGCTTCPGAGTAATCTATATAAAAGACAGTA --UAS2 AGATAT T T TCC T TAACCCAAAAATAAGGGAGAGGGTCCAAAAAGC 3CTCGGACAACTGT TGACCGT AAAGGAAT TGGGT TIT TAT TCCCTCTCCCAGGT T T T TCG :gagcctgt tgacaactggca GÃÍT CCG AAGGAC T GGCI AT ACAG TG T T C ACAAAAT AGCCAAGC T GAAAAT AATGT G.T AGC ---- *---------♦---------4 - --------4---------4---------4 ----- C T =»GGCT TCCTGACCGATATGTCACAAGTGT T TTATCGGT TCGACT I T T AT T ACACATCG

S

P h

I CTT TAGCTATGT TCAGTTAGT T TGGCATG· ----4---------4 ---------♦ -----

GAAATCGATACAAGICAATCAAACC O plasmídeo pEMR473 assim obtido está representado na figura 7, na qual os símbolos têm o mesmo significado que na o novo fragmento Mlul-Sphl introduzido sendo simboli-

Figura 6 , zado por

uma sequên-de cDNA da do invento. o plasmídeo pEMR47i ô portanto portador ae cia codificadora da proteína deduzida da sequência ura to-o:: idase, sob o controle do promotor artificial o qual compreende a sequancza: UAS1

CGCGTCTaTACT TCGGAGCACTGT rGeocce AGATAT

Ot^GCrCATTAGATATAt.TTTCTt :tgtcat UAS 2 3AAGCC T CG TGACAAC TCGCTTrpGAG r AA Γ c ΓΑ Γ A ΓAAAAGACAG T A TTTCCTTAACCCAAAAATAAGGGAGAGGGTCCAAAAAGC 3C TCGGACAAC TG T TGACCGT AAAGGAA T TGGG Τ T TITAΓ TCCC TC TCCCAGGT T T T TCG « :gagcctgt tgacaactggca

GAjTCCGAAGGAC TGGCTATACAG TGT TCACAAAATAGCCAAGC TGAAAATAATGTGtAGC ct]aggct TCCTGACCGATATGTCACAAGTGT t ttatcgg r TCGAC r T T TAT TACACA TCQ

Elemento TATA

C T T TAGCTATGT TCAGT TAGT T TGGCATGCCTATCACAIATAAATAGA G AA A T C G A T ACA AG TC AA T C AAACCGfAC GG A T AG TG t A T A T T T A TC T GTGCCAGTAGCGACTTTTTTCACACTCGAGATACTCTTACTACTGCTCTCTTGTTGTTTT CACGGTCATCGCTGAAAAAAGTGTGAGCTCTATGAGAATGATGACGAGAGAACAACAAAA TATCACTTCTTGTTTCTTCTTGGTAAATAGAATATCAAGCTACAAAAAGCATACAATCAA - — — - — ♦ - - —.....· - - — - - - — * - I ·

ATAGTGAAGAACAAAGAAGAACCATTTATCTTATAGTTCGATGTTTTTCGTATGTTAGTT --- c .1

Região de iniciação da transcrição

I •

I

CTATCAACTAT TAACTA1 AT ....................

aflTSOl TGATAATTGATATAGC 31 Construção do plasmídeo pEMRSIS: Q plasmídeo pEME473 foi submetido a uma digestão parcial pela enzima Xbal e a uma digestão total pela enzima Mlul. 0 fragmento grande Xbal-Mlul foi purificado. Este fragmento

contem principalmente as sequências da origem de re.olica.ção e o locus STB do 2μ, o gene i_EU2d, o gene de resistência á ampicilina p /-iínp , a origem de replicaçáo cio pbft322 e a cassete de expressão da urato~o;;idase. Pelo contrária ele não contem nem 1:1 gene URA3 nem a parte de 2μ compreendida entre os sítios Xbal e Nhel. D grande fragmento Xbal—Mlui foi recircularizado através de um adaptador coma sequência que se seque tendo as extremidades coesivas Xbal modificada e MluI:

Xba modificada CTAGG C T AGCGGG C C C GCAT GCA

CGATCGCCCSGGCGTACGTGCGC

Μ1 u I 0 plasmideo pEMR515 assim obtida sò possui um dos três elementos do sítio alvo FRT da recombinase codificada pelo gene FLP de 2μ. 0 plasmídeo pEMR515 é portanto portador de uma. sequência codificadora da proteína deduzida da sequência do cDNA da urato-oxidase sob c controle do promotor artificial do invento. EXEMPLO 3; Transformação da estirpe de levedura EMV761, pelos plasmídeos pEHK:469, pEMR473 e pEHR5 15 — Transformação das estirpes de leveduras EMYSfrft e GRF18 pelo plasmídeo pMER515 - Transformação com selecçãío para prototrofia de leucina

Utilizou-se como estirpes recipientes três estirpes de Saccharomyces cerevisiae não isogônicas: - a estirpe EMY7Ó1 (Mata, Leu2, ura3, his3) - a estirpe ΕΜΥ5ΘΘ (Mata, Leu2, ura3, pep4) 31 - - a estirpe GRF18 (Mata,

Leu 2, his3);

A estirpe bftFIS é bem conhecida dos familiarizados com a matéria (Gerry FTNK, MIT, USA). As estirpes EMY761 e ΕΜΥ5Θ0 parecidas com a estirpe GRF1B. Elas foram obtidas por cruzamentos sucessivos da estirpe SRF18 com uma estirpe ura? derivada da estirpe FL1O0 (depositada na ATCC com o nQ 28 383) e com a estirpe 20B12 (Mata, tspl, pep4> descrita por E.W.Jones (E.W. JONbS et al. (1977) Genetics, 85, 23).

Pode-se obter a estirpe GRF18 pEMR515 (Leu+) depositada na CilCM com a referencia n9 1-920, em 23 de Dezembro de 1989 e a estirpe EMY500 pEMRS15 (Leu+) depositada na CNCM com a referência nÇ 1-919, em 25 de Dezembro de 1989.

As estirpes contêm mutações (Leu2 e ura3). susceptiveis de serem complementadas pela marca, de selecção defectiva LEU2d e pela marca de selecção URA3, presentes em cada um dos plasmídeos pE'MR469 e pEMR473. A técnica de transformação utilizada suma variante da descrita por Beggs et al., (Beggs et al. (1978), Nature 275, 104-109). Ela consiste em submeter as leveduras a um tratamento cara obtenção de protoplastos na presença de um estabilizamte osmótico, o sorbitol na concentração de 1M. 0 protocola precisa de transformação está descrito a segui r κ a) 200 0)1 de meio YPG liquido (Cf. Tabela I) são inoculados coit» cerca de 5 :< 10ώ células de uma cultura em fase estacionária e a cultura assim inoculada é colocada uma noite com agitação a 30°C-

¥ ¥

PEG b) Logo que a cultura atinge cerca de 10' células por ml, as células são centrifuqadas a 4000 rpm durante 5 min e o sedimento lavado com sorbitoi 1M. c) As células são ressupensas em 5 ml de solução de sorbitoi 1M contendo 25 mM EDTA e 50 mM de ditiotreitol e incubadas durante 10 min a 30°C. d) As células são lavadas uma ve: com 10 ml de sorbitoi 1M e ressusosnsas em 20 mi de sorbitoi. Adiciona-se zimolase-í0ΘΤ (preparação obtida por purificação parcial sobre coluna de afinidade do sobrenadante de cultura de Arthobacter iuteus e contendo (1-1,3-qlucano-iaminaripenta-hidrolase, comerciai i sado pela 5EYKAGAKU KDGYO Co. Ltd> para uma concentração finai de 26 pg/ml e incuba-se a suspensão à temperatura ambiente durante 15 min . e) As células são ressuspensas em 20 ml de um meio contendo sorbitoi designado meio YPG sorbitoi (Cf. Tabela I a seguir) e incubadas durante 20 min a 30':’C com agitação. f) Centrifuga-se durante 3 min a 2 500 rpm. g > Ressuspende-se em 9 ml de tampão de transformação (sorbitoi 1M, Tris-HCl de pH 7,5 10 mM e CaCl-, 10 mM). h) Adiciona—se 0,1 ml de células e 5 μΐ de solução de DNA (cerca de 5 pg) e dei::a-se a suspensão obtida durante 10 min a 15 min à temperatura ambiente. i > Ad.iciona-se 1 ml da solução: polietilenoglicol 4000 a 207., Tris-HCl de pH 7,5 10 mM e CaCl^ 10 mM.

j) Deita-se 0,1 ml da suspensão obtida em i) num tubo contendo meio sólido de regeneração sem leucina (Cf- tabela I a seguir) préviamente fundida e mantida líquida a cerca de 45°C. Verte-se a suspensão sobre uma caixa de petri contendo uma camada solidificada de 15 mi de meio de regeneração sólido sem leucina. k) Repete-se o passo j) com com o resto da suspensão celular obtida em 9 h).

Os transformantes começam a aparecer ao fim de tris dias.

Repicou-se um transformante EMY761 pEMR469 <1su+), tris transformant.es EMY7Ó1 pEMR473 <leu+) íclones 1, 2 e 3), um transf orman te EMY761 pEMR'515 (Leu+) , um transf orman te EI1Y500 PEMR515 (Leu+) e um transf orman te 6RF18 pEMF<515 (Leu+) .

QUADRO I i-nncipais meios utilizados nos exemplos 3. 4. 4bis. ç> e meio sólido sem uracilo 6,7 g de base azotada de levedura sem aminoácidas (Yeast nitrogen base without Amino Acids da DIFCO) 5,0 g de hidrolisado de caseína (Casamino acids da DIFCO) 10 g de glucose 20 g de aqar misturar todos os ingredientes em água destilada, completar o volume final para 1 1 com água destilada. Autoclavar 15 min 12Θ°C. 3

- meio líquido seu; uracilc)

Utilizar a fórmula ao meio solido sem uracilo omitindo o agar -Autocl avar 15 min a 12Õ‘:'C. mexo sólido sem leucina 6,7 9 de ba se azot ad a 1 i V i eas t n i troqen bas> 2õ mg de adenina 20 mg de ur ac i 1 o 2Õ mq de L- triptof ano 20 mg de L- histid1 na 20 mq L-. arg inina 2Õ mg de L- metion i na 50 mq de L- tirosin a 3õ mg de L~ isoieuc ma 30 mg de L- 1isina 50 mg de L- fenilal anin ? levedura sem aminoácidos 100 mg de ácido L-glutâmico 15õ mg de L-valina mg de L-leucina 2Θ g de glucose 20 g de agar misturar tDdos os ingredientes em água destilada. Completar o para um volume final de 1 .1 com água destilada - Autoclavar 15 min a 12õ°C. Após autoc1avagem, adicionar 2O0 mg de L-treonina e 100 mg de ácida L-aspé.rtico. - meio sólido de regeneração sem leucina utilizar a fórmula do meio sólido sem leucina misturando 30 g de agar em vez de 20 e adicionando à mistura 182 g de sorbitol.

- mexo liquido sem ieucina omitindo o aqar -adicionar 200 mg utilizar a fórmula do meio sólido sem Ieucina ftutoclavar 15 min a 12ô‘:'C. Após autoc lavagem, de L-treonina e 1Θ0 mq de ácido L-aspártico,

- mexo liquido YP 10 q de extracto de levedura (Bacto-yeast extract da DIFCD) 2Θ g de peptana (Bacto-peptone da DIFCO) misturar os ingredientes em água destilada. Completar o volume finai para 1 1 com água destilada - ftutoclavar 15 min a 120,;'C. - Meio líquida ΥΡΘ utilizar a fórmula do meio liquido YP ao qual se adiciona, após au.toclavagem, glucose para uma concentração de 20 g/1. - mexo YPG sorbitol utilizar a fórmula do meio liquido YPG ao qual se adiciona, após autoclavagem, sorbitol para uma concentração de ÍM. 4/ - meie YP etano1-q1icero1 utilizar a fórmula do meio Y'P liquido. Após autoc lavagem, adicionar 10 ml de etanol a 1Θ07. <17. final) e 30 g de glicerol. ~ meio VP etanol-glicerol-qalactose utilizar a fórmula do meio liquido YP. Após autoclavagem, adicionar IO ml de etanol a 1007., 30 g de glicerol e 30 g de galactose. EXEMPLO 4: Expressão da uratc-Diiidase pelas estirpes EMY7Ó1 I3EMR4Ó9. (Leu+> e EMY7&1 PEMR475 (Leu+) (clones 1« 2 e 3>ImuncdetEc;ào aor transferência Western, dosagem d a a atividade da urato-oxidase e da proteínas solúveis 1 ) Expressão da urato^QK^dase: a' Estirpes trarisformadas

Muro primeiro passo, uma colónia de cada uma das estirpes EMY761 pEMR4ó9 (Leu1-) e EMY761 pEM473 (Leu+) (clones- 1,2 e 3) foi cultivada em 25 ml de meio liquido sem leucina (Cf. quadro I, exemplo 3). Isto permitiu obter e manter um número elevado de copias de plasmídeos fazendo a selecção relativamente á comple-mentaçao da mutação Leu2 peio gene LEU2 presente nos plasmídeos PEMR4Ó9 e pEMR473.

Após 22 h a 30 °C com agitação, as duas culturas foram centrifugada durante 10 min a 7000 rpm. Os sedimentos foram ressu.spensos em 10 ml de água destilada estéril e novamente centrifugados durante 10 min a 7 000 rpm. A expressão da urato— -oxidase foi induzida ressuspendendo as células em 20 ml de meio YP etanol-glicerol para a estirpe EMY761 pEIÍR469 (Leu+) e 20 ml de meio YP etanol-glicerol-galactose (Cf. quadro I, exemplD 3) para a estirpe EMY761 pEMR473 (Leu+). As culturas foram colocadas a 30°C com agitação durante 27 h. c) Estirpe testemunha A estirpe EMY761 não transformada, ou seja sem plasmí-deo, foi cultivada como descrito atrás excepto a primeira cultura ter lugar em meio líquido YPG. Ela foi sujeita por um lado a indução em 10 ml de meio líquida YPetanal-g1icerol e por outro lado a. indução em 10 ml de meio YP etanol-g 1 icerolgalactose.

Fraoaracctt:; das amostras: a) As células cultivadas em la), 1b) e lc) foram centrifuaadas e o soorenadante rejeitado. Os sedimentos foram ressuspensos em 10 ml de água destilada e centrifuqados durante 10 mina 7 000 rpm. 0s sedimentos assim lavados foram ressu.pensos sm cerca de 1 ml de tampão trietilenamina TEA de pH 8,9. Cerca de 300 μΐ de células assim preparadas foram lisadas em presença, de esferas de vidro (de 400 a 500 pm de diâmetro) representando cerca, de metade do volume final. Esta mistura foi agitada com vortex fortsmente durante 1 min, 4 vetes, as amostras foram colocadas durante 30 s em gelo entre cada agitação. 0 líquido foi retirado dos tubos com uma pipeta pasteur e transferido para um microtubo. As esferas de vidro foram lavadas 1 vez com cerca de 200 ul de tampão TEA de pH 3,9. As esferas foram agitadas com vortex durante 1 min, 1 vez, e o líquido foi retirada cooin pipete de pasteur para ser adicionado ao lisado anterior. 0 lisado foi em seguida cent.rifugado num microtubo durante 5 mirt a 7 000 rpm. 0 sobrenadante foi cuidadosamente retirado e conservado a -20*C para transferência Western, doseamento da actividade de urato-oxidase e doseamento de proteínas totais solúveis. 0 sedimento de células lisadas foi conservado separadament a -20 °C para transferencia Western (Cf. 3) abaixo).

Por outro lado, amostras das culturas realizadas em la) e ib) foram analisadas como se segue após induçãox 2 ml de cultura foram centrifugados durante 10 min a 7 OOO rpm. Os sedimentos foram ressuspensos em 500 μΐ de água destilada e novamente centrifugadas durante 5 min a 7 000 rpm. Os sedimentos foram ressuspensos em cerca de 200 μΐ de tampão TEA de pH 8,9 e lisados como atrás em presença de esferas de vidro. Os sobrenadardes e os sedimentos das células lisadas foram conservados a -20°C separadamente. 0 doseamento da actividade de urato-oxidase e o doseamento das proteínas totais solúveis foram efectuados nos sobranadantes. 3) Imunodetecção da urato—oxidase cor transferência Western a) Protocolo

Os sedimentos e os sotrenadantes de diferentes amostras foram submetidos a uma transferência Western, técnica bem conhecida dos familiarizados com a érea, que compreende os seguintes passos: - solubi 1 ização do sedimento por fervura durante 10 min num tampão designado tampão de amostra constituído por Tris-HCl 0,125 M pH 6,8, SDS 4%, azul de bromofenol O,002%, glicerol 20‘Λ, fi-mercaptoetanol 107. ídecordo com o protocolo descrito por LAEMMLI (U.K. LAEMMLI, Nature, 227 (1970), 660-6850), (passo realizado apenas para os sedimentos), - separação electroforética das diferentes proteínas contidas no solubilizado segundo o protocolo descrito por LAEMMLI (U.K. LAEMMLI, Nature, 227 (1970), 680-685), - transferência das referidas proteínas contidas no gel para um filtro de nitrocelulose (segundo a técnica de H. TOWBIN et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76 (1979) 435Θ-4354), A imunodetecção, realizada segundo a técnica de BURNETTE (W.W. BURNETTE Ana. Biochem. U2. (1981) 195-203), .implica sucessivamente: . lavagem do filtro de nitrocelulose durante 10 min com um tampão A <tris-HCl 10 mM, NaCl 170 mM, KC1 1 mM). . incubaçãodo filtro de nitrocelulose durante 30 min a 37,;,C com um tampão B (tampão A a que se adicionou albumina sérica bovina na proporção de 3 g para 100 ml).

. incubação do filtro de nitrocelulose durante lha Z7C'C

-··$/ .·& com um soro imune (anticorpos policlonais que reconhecem a urato-DMidase de A„ flavus). . lavagem do filtro de nitrocelulose com o tampão B. „ incubação do filtra de nitrocelulose durante 1 hora a 37‘-'C com uma solução de proteína 6 marcada com iodo 125 a 0,1 microcurie/ml. . lavagem do filtro com o tampão A. .. secagem aa filtro entre duas folhas absorventes. . exposição a um filme de raiso X. . revelaçãodo filme. b) Resu 1 c a d os

Observou-se que as estirpes EMY761 pEMR469 (leu > e EMY761 pEiv1R473 (leu+) (clone 1) produzem uma proteína de peso molecular aparente de apraximadamente 33 KDa que è reconhecida pelos anticorpos dirigidos contra a urato-oxidase de A. flavus (preparadas em coelho segundo as técnicas bem conhecidas dos familiarizados com a matéria: Cf. VAITUKAITIS et al. (1981) 'Mfethods in Enzymology" Academic Press, New York, vol . 73, p. 46) e que está ausente na estirpe testemunha. A comparação entre as quantidades desta proteína nos sedimentos e nos sobrenadantes permite deduzir que cerca de Q0Y* desta está sob a forma solúvel no lisado. 4) Doseamento da actividade de urato-oxidase: A actividade de urato-oxidase foi medida nas sobrenadantes das células lisadas. a) Fundamento

Seguiu-se a transformação do ácido úrico em alantoina pela diminuição da absorvância a 292 nm. A. reacção é a seguinte:

(abaorvância a 290 nm) b> Reagentes

a) Tampão TEA 0,05 M pH 8,9/EDTA - dissolver 7,5 g de TEA (reagente para análise-ProLabo ref. 287.46»266) em 400 ml de água destilada, - dissolver 0,372 g de Complexon III (Merck-ref. 8413) em 50 ml de água destilada, - reunir as duas soluçoes e completar para 500 ml (solução 1), - ajustar o pH desta solução a 8,9 com HC1 0,2 N, - completar para 1 ©®0 ml com água destilada (solução 2). b) Solução stock de ácido úrico - dissolver 100 mg de ácido úrico (Carbiochem ref. 6671) em 50 ml da solução 1, - ajustar com HC1 0,2 N para pH 8,9, - completar para 100 ml com água destilada. A solução obtida pode ser conservada uma semana a 4'5C. c) Solução substrato de ácido úrico - retirar 1,5 ml da solução stock. de ácido úrico (Carbiochem ref. 6671) e diluir para 1Θ0 ml com tampão TEA/reagente para análise 41

Prolabo ref. 2S7.4ó.2óá).

Esta solução deve ser utilizada no próprio dia. c) Protocolo

Introduz-se na cuvete de quartzo de um espectofotómetro regulado para 292 rim e termostatizado para 30':,C os seguintes volumes: - 600 μι 1 da solução substrato de ácido úrico (pré-aquecida a 30 °C) , - 10Θ μΐ dos sobrenadantes abaixo aos quais se adicionou 200 pl de TEA pH 0,9 (pre-aquecidos a 30,;'C).

Mistura-se e lê-se a alteração da densidade óptica, daqui em diante designado DO, de 30 em 30 s durante 5 min.

Calculou—se /\E.. a variação da densidade óptica por minuto. d > Expressão dos resultados A actividade A enzimática da urato-oxidase expressa em U/ml é calculada a partir da medição de /\E com a ajuda da fármu- 1 a: /\E :·: Vr d na qual os símbolos Vr, d, I e Vp^. representam respectivamente o volume de reacção <0,9 ml), a diluição (2)? ° coeficiente de extinção do ácido úrico a 292 nm (12,5) e o volume da amostra <0,1 ml). 42 b) Doseamento aas proteínas totais soláveis nos lisados:

Utili sou-se o kit de determinação de proteína BIORAD para dosear as proteínas totais presentes no sobrenadante de células lisadas. é baseado na observação de que a absorvancia máxima para uma solução ácida de azul brilhante de Coomassie g-250 passa de 465 nm para 595 nm quando as proteínas se lhe fixam (Cf. Reisner et al., Anal. Biochem, 64, 509- (1975)).

Protocolo

Introduz-se na cuvete de um espectofotómetro regulado para 595 nm os seguintes volumes: - ΙΟ μΐ de amostra à qual se adicionou 799 μΐ de água destilada -299 μΐ de "Dye reagerit" concentrado (BIORAD).

Mistura-se e Γέ'-se a densidade óptica a 595 nm. Fez-se uma curva padrão com concentrações crescentes de BSA (Albumina Sérica Bovina) de forma semelhante. Leu-se a concentração desconhecida das proteínas totais dos lisados na curva padrão obtida. 6) Resultadoss

Os resultados estão apresentados no quadro que se segue (II). Este descreve para cada estirpe o meio de cultura, a fonte de carbono e de energia da cultura, a actividade de urato-oxidase em U/ml, a quantidade de proteínas totais solúveis. Este último parametrc· foi calculado supondo que a actividade específica da proteína recombinante é idêntica à da urato-oxidase obtida a partir de A. flavus: 39 U/mg. 43 & ν'

Quadro II

44

0 quadra mostra: ai em presença de glucose, o nível ("reprimido") da urato--oxidase não é detectável no caso do promotor artificial do invento (estirpe EMY761 pEMR473 (Leu+>) (clone 1, 2 ou 3) enquanto que o é no caso do promotor ADH? (estirpe EMY761 pEMR4é>9 (Leu+)). 0 promotor artificial permite portanto, em presença de glucose, uma melhor repressão que o promotor ADH^. b) ria ausência de glucose, mas na presença de etanol/g 1 ice-rol , o nível de urato-oxidase é importante para o promotor ADH^, (cerca de 14Y. das proteínas totais solúveis) e fraco mas detectável para o promotor artificial. c) na ausência de glucose mas na presença de etanol/glice-rol/galactose, o nível de urato-oxidase possui um valor pouco diferente do caso anterior para o promotor ADH^ (cerca de 13,5¾ das proteínas totais solúveis), mas atinge um valor elevado (cerca de 187. das proteínas totais solúveis) para o promotor arti ficial. 0 promotor artificial do invento permite portanto uma produção de proteína recombinante a um nível elevado e apresenta três níveis de expressão: - nível nulo a) ν' - nível de fundo b) - nível máximo c) EXEMPLO 4bis: Expressão em erlenmever do cDNA da urato-oxidase pelas estirões EMY761 PEMR515 (Leu+). ΕΜΥ5Θ3 PEMR515 < Leu+) e GRF18 PEHR515 (Leu+)

Uma colónia de cada uma das três estirpes acima foi cultivada em 2Θ ml de meio líquido sem leucina.

Após uma noite a 30 °C com agitação, as três culturas foram centrifugadas durante lô min a 7 000 rpm. Os sedimentos celulares foram ressusqensos em 10 ml de água destilada estéril e navamente centrifugados durante 1Θ min. A expressão da urato-αχi-dase foi induzida ressu.spendendo as células em 2O ml de meio YP etano 1-g 1 icerol-qaiactose (Cf. quadro I, exemplo 3).. As culturas foram novamente colocadas a 30°C com agitação durante cerca de 20 h. Como testemunhas foram realizadas de cada uma das estirpes hospedeiras não transformadas.

As células de cada uma das seis culturas foram novamente sedimentadas por centrifugação e α sobrenadante eliminado. Os sedimentos foram ressuspensos em lú ml de água destilada e centrifugados durante 1Θ min a 7 000 rpm. Os sedimentas assim lavadas foram ressuspensos em cerca de 1 ml de tampão TEA de pH 3,9 e o rebentamento assim como eliminação das partículas por centrifugação foram realizadas como descrito no exemplo 4, 2). 0 sobrenadante de cada uma das culturas serviu como ariteriormente para o doseamento da urato-oxxdase e de proteínas totais. Os principais resultados obtidos estão apresentados no Quadro IV a seguir;

V

QUADRO VI 1 j Estirpe/condiçoes i- [Actividade de Ί 1 |Proteínas| 1I | 'L de urato- | j de cultura j urato-oxidase jtotais j [-oxidase nas j 1 j (U/ml) {solúveis j | proteínas j i I 1 1 j <mg/m1> | 1 í [solúveis | 1 ί r j GRF1B pEMR'515 ( 1 eu+) / a) 1 ) < 0,1 t 1 i 2>2 ; 1 1 1 < 0,05 | | EMY5OO pEMRõ 15(1 eu+ > /a) j <0,1 i ! | : 0,05 | |EMY 761 pEMR515(1eu+) / a > j - 0,1 i I 1 < 0,05 j J GRF18 pEMR515 (1 eu + >/b) 1 38 i 5’4 i | 23/» | j ΕΜΥ5ΘΘ pEMRS15(1eu+)/b) 1 20 1 2>5 ! 26% 1 j EMY761 pEMRS15(1eu+)/b) l........ -J_ 1 4>2 l | L6a | 1_1 a) : as estirpes foram cultivadas na presença de glucose < condições de não indução) b) ; as estirpe·:; foram cultivadas na ausência de glucose e na presença de galactose (indução)» 0 promotor de acordo com o invento permite portanto um nível de expressão elevada da urato-oxidase em três estirpes não isagénicas. EXEMPLO 5s Construção de dois vectores de expressão da fè.~qalactosidase em levedura: o plasmídeo pEMR42? portadnr de um promotor ADI-b-, e o plasmideo PEMR437 portador do promotor artificial do invento A estratégia posta em prática utiliza fragmentos obtidos a partir de plasmídeos pré-existentes acessíveis ao 47 público e fragmentos preparadas por síntese segundo técnicas convencionais. As técnicas de clonagem empregues são as descritas por I. MANIATIS EF, FRITSCH e J. SAMBRQGK em "Molecular Cloning, a Laboratory manual” (Cold Sprinq Harbor Laboratcry, 1984). A síntese dos oligonuc1eótidos é realizada com a ajuda de um sintetizador de DMA Biosearch 4 6ÚÚ. 1 ) Construção do plasmideo pEiiR429; 0 plasmídeo pEMR414 (Cf. figura 5) foi submetido a uma digestão completa pela enzima de restrição BamHI. 0 sitio BamHI, localizado entre as sequêcias promotoras (AE/H^) e terminadoras FGK) é único. 0 DMA linear do olasmídeo foi purificado por eluição de um gel de aqarose após electraforese. 0 plasmideo pMC14€»3 í ref . Casadaban et al . , < 1980>, J . Bacteriol. , 143, 971-930) foi submetida a uma digestão completa pelas enzimas BamHI e EcoRI, o que permite libertar um fragmento de DMA BamHI--EcoRI com cerca de 3 Kb que contem o essencial (parte a montante) da sequência codificadora da (ϊ-galactosidase de E. coli. A sequência completa foi reconstituída com a ajuda do fragmento sintético com a seguinte sequência: y 48 0 fragmento BamHI-EcoRI proveniente da dupla digestão de pMC1403 foi ligado em EccRI com o fragmento sintético atrás. 0 fragmento BamHI-BamHI obtido foi em seguida ligado ao DNA linear do plasmídeo pEMR414 digerido por BamHI de modo a obter o plasmideo pEMR429, representado na figura 8, na qual os símbolos têm o mesmo significado da figura 5, os fragmentos BamHI-EcoRI e EcoRI-BamHI introduzidos sendo representados por

Neste olasmídeo, a sequência codificadora da iv-qalacto-sidase está sob o controle do promotor ADH^ descrito no exemplo 2 (Cf. p. 17). 2) Construção do plasmideo pEHR4ól 0 plasmideo pEMR429 foi submetido a uma digestão completa pelas enzimas MluI e Sphl. D grande fragmento Mlul-Sphl contendo o gene da p-qalactosidase fo.i em sefuida ligado ao fragmento sintético, cuja sequência dada a sequir possui as sequências de activação a montante (Upstream Activation Sequence: UAS) do promotor do gene Ga 17 de 5. cerevisiae e as extremidades coesivas fllul e Sphl. 49 Μ

I υ

I

CGCGTCTATACTTCGGAGCACTGTTGAGCGAAGCCTCATTAGATATATIΤ TCTGTCAT ..................

AGATATGAAGCCTCGTGACAACTCGCTTCCGAGTAATCTATATAAAAGACAGTA

ΤΤ TCCTTAACCCAAAAATAAGGGAGAGGGTCCAAAAAGCGCTCGGACAACTGTTGACCGT

AAAGGAATTGGGTΤ1TTATTCCCTCTCCCAGGT TT TTCGCGAGCCTGTTGACAAC ΓGGCA

GATCCGAAGGACTGGCTATACAGTGTTCACAAAATAGCCAAGCTGAAAATAATGTGTAGC —.....— ·-- ......— * - · - · · · ' — * * — * ”

CTAGGCT TCCTGACCGATATGTCACAAGTGTΤITATCGGT TCGACT ΤΤ TAT TACACATCG

• S

P h

I CT Τ TAGCTATGT TCAGT TAGTΤ TGGCATG· ------t--... GAAATCGATACAAGTCAATCAAACC·

O plasmideo pElvIR46i assim obtido está representado na. figura 9, na qual os símbolos tem o mesmo significado da figura 3, o novo fragmento Mlul-Sphl introduzido sendo simbolizado por

Neste plasmideo, a sequência codificadora da β-galacto-sidase está sob a controle do promotor artificial do invento descrito no exemplo 2 (Cf. p. 18). EXEMPLO 6: Transformação da estiroe de S. cerevisiae DBY746 para os plasmldeos PEMR429 e pEMR461

Transformação com selecção para prototrofia de uracilo:

Uma colónia da estirpe DBY746 que é (Mata, his3, leu2, ura.3, trpl , cyhR) (ROSE et al. (1981), PNAS USA, 78, 2460-2464) serviu para semear 100 ml de um meio designado YPS liquida (CF; quadro I do exemplo 3). Quando da obtenção de uma densidade celular de IO7 célu.ias por mi, as células foram tratadas com acetato de li tio 0,21*1 para a transfarmação segundo uma técnica bem conhecida dos familiarizados com a matéria, descrito por ITQ et al., ( ITG et al , , 1983, J. Bacterialogy 153, 163-ló8).

As células DBY746 foram transformadas paralelamente com cerca de 1 pg de cada um dos plasmídeos pEMR429 e pEMR4ól. As células transformadas foram seleccionadas relativamente ao carácter de auxotrofia do uracilo (ura.1") num meio designado meio sólido sem uracilo, (Cf. quadra I do exempla 3). Assim repicou-se um transformante DBY746 pEMR429 (ura+) e um transformante DBY746 _ O.

PtMR4ól (ura’). EXEMPLO 7: F‘rpducã'0 de B-galactosidase com a ajuda das estirpes BBY74Ò__(ura+) e DBY74é> pEMR461 (ura1-) 1 * Expressão da jl-qa 1 ac tosidase i

Uma colónia transformada DBY746 pEMR429 (ura1) e uma colónia transformada DBY74ó pEMR461 (ura1) serviu para semear 20 ml de meio líquido sem uracilo ao qual se adicionou préviamente t.riptofano (10 mg/1). Após uma naite a 3ô°C com agitação, adiciona-se 17« de glucose e deixa-se a cultura prosseguir durante 4 h. Observou-se então que há ainda glucose nas culturas. Retirou-se uma amostra para dosear a (1-galactosidase.

Após uma noite a 30':‘C com agitação, as duas culturas foram centrifugadas durante IO min a 7 000 rpm. Os sedimentos foram ressuspensos em 10 ml de água destilada estéril e novamente centrifugados durante 1Θ mina 7 0O0 rpm. A expressão de β-galac-tosidase foi induzida ressuspendendo as células em 20 ml de meio 51 Φ yP etanai~giice.rol (Cf. quadro I, exempla 3) para a. estirpe DBY746 pEMR429 (ura+) e 2& ml de meio YP etanal-giicerol-qaiacto-çuadro Ϊ, exemplo 3) para a estirpe DBY746 pEMR4òl (ura i. As culturas foram colocadas a 3€>°C com agitação durante uma noita. se (Cf +. 2) Preparação de amestras e doseamentos As células cultivadas atrás foram centrifugadas e o sobrenadam te foi rejeitado. Os sedimentos foram ressuspensos em iú ml de água destilada e cent.rifugadas durante 10 mm a 7000 rpm. Os sedimentos assim lavados foram ressupensos em 1 ml de tampão de doseamento da fi-qalact.osidase (EDTAs x 10' '~'M; Na._HP0. 1 MaH._P0, 10 iy!í MqSu4 10 fl; MnS0„ d x 10 " M)„ ressuspensa; presença de esferas de vidro (de 400 a 500 pm de diâmetro) representando cerca de metade do volume final. Esta mistura foi fortemente agitada com vortex durante 1 min, 4 vezes, as amostras sendo colocadas durante 30 s em gelo entre cada agitação. 0 líquido foi retirado dos tubos com uma pipeta. de pasteur e transferido para um micratubo. As esferas de vidro foram lavadas 1 vez com cerca de 2Θ0 μΐ de tampão ΤΞΑ de pH 3,9. As esferas foram agitadas com vortex durante 1 min, 1 vez e o liquido foi retirado com pipeta de pasteur para ser adicionado ao lisado anterior,. Q lisado foi em seguida centrifuqada num microtubo ourante 5 min a 7 000 rpm. 0 sobrenadante foi cuidadosamente '4 ~ '· * ' "·’ "=»ww4 * -’ 11 * 1" ,ww4 Cerca da 3Θ0 μΐ de células assim ressuspensas foram lisadas na -20°C para retirado e conservado transferência Western, doseamento da activitíade de urata--oxida.se e doseamento de proteínas totais solúveis. Q sedimento das células lisadas foi conservado separadamente a -20OC. A actividade de β-galactosidase foi doseada segundo a técnica de PARDEE (PARDEE et al., J. Mol. B. (1959), 1, 1056-178.

as protemas totais soláveis foram por outro lado IDRAD. doseaaas com a ajuda do kit de ensaio de proteínas como descrito no exemplo 4.

stâa apresentadas na quadra IV

Os resultadas obtidas este ?e?qu i r:

QUADRO IV Estirpe Fonte de carbono e de enerva da cultu-tura Activida- B-galacto sidade μ/ml Proteínas totais solu veis μβ/ml Meio de cultura 0BY746 p^B429 (ura+) glucose 59 375 Meio líquido sem uracilo + triptofano (10mc/l) + elucoseí 1‘i DBY746 pB*R429 (ura+) etanol/ glicerol 6 500 1 700 Meio YP etanol glicerol 06Y746 p0*FM61 (ura+) glucose 0 350 1 Meio líquido sem uracilo/triptofano (10 mg/l)+glucose(1? DBY746 p0f!461 (ura+) ! etanol/ glicerol/ galactoae 480 j 520 j • Meio YP etanol/ glicerol-galactose

Este quadro mostra que: — na presença de glucose, a estirpe EMY74Ò ptlvlR42<? (ura ) produz um pouco de (5-galactosidase enquanto que não se detecta. esta proteína para a estirpe DBY746 pE'fiR461 (ura*”) . D promotor artificial do invento permite portanto uma melhor repressão relativamente ao promotor ADH^. - em condições de indução o promotor artificial conduz à expressão elevada de β-qalactosidase apesar de nestas condições ser mais fraca do que o nível obtido com o promotor ADH„,. 4

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CGCGTCTATACT 7CGGAGCACTGT TGAGCGAAGGC TCAT TAGATATATT T TC1GTCAT ............................................. . — -

AGATATGAAGCCTCCTGACAACTCGCTTCCGAGTAATCTATATAAAAGACAGTA

TTTCCTTAACCCAAAAATAAGGGAGAGGGTCCAAAAAGCGCTCGGACAACTGItGACCGT ............................................,.........1-.-..

AAAGGAAT TGGGT TΠΤΑΤ TCCCTCTCCCAGGT T T T TCGCGAGCCTGT TGACAACTGGCA gatccgaaggactggctatacagtgt tcacaaaatagccaagctgaaaataatgtgtagc ·*··♦*·..................................................... ctaggct t cctgaccgatatgtcacaagtgt t t tatcggt tcgact t t tat tacacatco s

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I

CTITAGCTAIGT TCAGTIAGM TGGCATGCCTATCACAIAIAAATAGA

GAAATCGATACAAGTCAATCAAACCGTACGGA1AGTGTATAT1TATCT

GTGCCAGTAGCGACTTtTUCACAÇTCGAGATACTCTTACTACTGCTCKMGMGTTTT . ..........................................................-

CACGGTCA1CGCTGAAAAAAGTG1GAGCTCTATGAGAATGATGACGAGAGAACAACAAAA

TATCACT 1CTTGT1 TC1TCTTGGTAAAIAGAATATCAAGCTACAAAAAGCATACAATCAA ............................................................

A1AGTGAAQAACAAAGAACAACCA11TATCT TATAGT TCGATGIT T T TCGTATGT TAGT T c

I • 1

CfATCAACTATfAACTAlArf gatagttgataattgatatagc

EvEMPLO 5: Construção ae qois vacrores de expreasão e ae sscrecao da citocina nuroana grc-B em levedura; os □ iasmídec-s Q!~r*)R 575 o__pENR 5S3, jortaaorgs ao promotor artificial da invento us exemolos descritas antsriormente dizem respeito a oroteínas cuja localização é intracelular. Sabe-se que a levedura pose sacratar as proteínas recombinantes para o meio ae cultura. h utilização da via metaoólica que conduz è secreção da oroteína taíti as ssgumtss vantagens importantss; i - oer mi te recuperar no sobrenadar» te da cultura, um produto relativamente puro e correctamente processado. c - permite oeneficiar as proteínas de modificações associadas à via da secreção como seja a formação ae pontes aissulfuretD, a glicosilação, etc...

Existem várias proteínas ou polipeptídeos naturalmante secretados pela levedura. Na maior parte dos casos conhecidos, sstas proteínas são sintetizadas sob a forma de um precursor maior cuja sequência NH_,~termina 1 é decisiva para a entrada na via metabólica que conduz a secreção. Estas sequências NH.-, — terminais Dodem em certos casos, ser utilizadas para a secreção de proteínas heteróIogas. Entre estas sequências, sabe-se oue se pode utilizar o sistema pre-pro da feromona alfa. A feromona sexual alfa de levedura é um peptídeo de 13 aniinoácidos que é secretada para o meio de cultura pelas leveduras S. cerevisiae do tipo sexual Mata. e G factor alfa atrai as células do tipo sexual oposto (Mata) na fase 61 e induz as alterações bioquímicas e morfológicas necessárias à conjugação dos 2 tipos celulares. Kurjan, J.

Herskowitz, I. (1982) Cei1, 3Θ, 933-943 cionaram a aene estruturai ao factDr alfa a aeauziu-ss oa saqulncia desta gene que este factor de 13 aminoácidos é sintetizado soí: a forma de uma sequência prs-pro da proteína precursora de 165 aminaácidas. 0 precur— sor contem uma sequência nidrófoba amino-terminal de 22 ammoâci-dos -seguido de uma sequência hidrófoba amino-terminai de 22 aminoácidos seguido de uma sequência de 61 aminoácidos contendo 3 sítios de glicosilação seguido de 4 cópias da factor a. Estas 4 cópias foram separadas por sequências "esoaçadoras" e a proteína madura foi libertaaa a partir do precursor graças ás actividades s n z i m á 11 c a s s e g u i n t e s i 1 - uma sndopeptidase no tipo Cathepsine B que corta ao nível da extremidade carboxi terminal os dipeotídeos Lis-Arq (produto do gene KEX2 designado yscF > « 2 - uma exopeotidase do tipo carboxipeptidase (produto do gene KEX1> que corta os resíduos básicos ao nível da extremidade carboxi terminai os peptídeois removidos. 3 - um dipeptidilaminopeptidase (dita A) que possui dubletos 61u-Ala e Asp-Ala (produto do gene STE 13).

Um primeiro exemplo de proteína secretada por este sistema e que utiliza o promotor do invento é a citocina humana gro-β. 0 cDNA desta proteína, designado gro-β <S. Hask.il 1, et al . , 1990 Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87, 7732-7736) ou MIP-2a iP. Tekamp-Olson et al., 1990 J. Exp. I4ed. , 172, 911-919), foi clonado e sequenciado recenteinente. Gro-β pertence a uma família de citocinas cujos membros parecem estar implicados na modulação da resposta inflamatória e rias actividades do tipo factor de crescimento.

U requerente testou a utilização do promotor para a. secreção de gro~B por ã „ c e r e v 1 s i a e . Com esta finalidade substituiu a sequência pre-pro da feromona alfa pela sequencia sinal natural de qro—Ά e colocou o precursor de qro—β à frente do promotor do invento. 1 - Construção do plasmídeo pEMR 53Θ Cvector de clonaqem)s 0 plasmídeo pEMR 473 descrito mais atrás ^exemplo 2 2)-t iqura 7) foi digerido pelas enzimas Xhoi e Bali e o fragmento grande, designado daqui em diante fragmenta E, foi isolado. Este fragmento grande compreende as sequências do gene URA 3, a origem de repiicação e o locus STB de Ξμ, o gene da resistência à ampicilina Amp^', a origem de replicaçlo cia plasmídeo pBR322 e as sequências UAS da promotor do gene Ga17 de S. cerevisiae assim como o terminatíor do gene PGK.

Uma sequência ol igonucleotídica de cadeia. dupla com cerca de 4Θ0 pares de bases, designado fragmento F, foi sintetizada sob a forma de um fragmento Xhol-SalI. Esta sequência é portadora da região ΓΑΤΑ e da região de iniciação do promotor ADH„ que se prolonga por uma. sequência sintética precedendo o o comeco da região pre-pro da feromona. alfa. A sequência desta região pre-pro da feromona alfa difere da descrita por Kurjan e Nerskowitz 1982, Cel1, 30, 933-943 pela introdução de um sítio

Hindi II através da mutação silenciosa do codão TCT - correspondendo à serina 91 do precursor da feromona - em ABC. A seguir estã apresentado o conjunta da sequência do fragmento: 53

X h ο

I

(rÇGAGATACTCTTACTACTGCTCTCTTGTTGTTTTTATCACTTCTTGTTTC - + - —1----------------+.---------+--------------- — - - -

Jtatgagaatgatgacgagagaacaacaaaaatagtgaagaacaaag ttcttggtaaatagaatatcaagctacaaaaagcatacaatcaactatcaatcagatcta *--------- <---------+---------4----------*---------4---------- aagaaccatttatcttatagttcgatgtttttcgtatgttagttgatagttagtctagat

ATATTAATAAAAAATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTC +---------4·---------+---------+---------4. ---------+---------

TAT AATTATTTTTTACTCTAAAGGAAGTT AAAAATGACGTCAAAATAAGCGTCGTAGGAG CGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGA +. — _ — _ — _ — + — — — - _ — — _ — — — - — - —

GCGTAATCGACGAGGTCAGTTGTGATGTTGTCTTCTACTTTGCCGTGTTTAAGGCCGACT i

N AGCTGTCATCGGTTACTTAGATTTAGAAGGGGATT7CGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTC *------------------*---------+---------+----------------_____

TCGACAGT AGCCAATGAATCTAAATCTTCCCCTAAAGCTACAACGACAAAACGGTAAAAG caacagcacaaataacgggttattgtttataaatactactattgccagcattgctgctaa 4--------------------+---------+--------- ----------+--------- gttgtcgtgtttattgcccaataacaaatatttatgatgataacggtcgtaacgacgatt

H i n

d S I a

I I

I I AGAAGAAGGGGTA/l^CrTGCATGCCTGCAGG1_ +---------+ -- -------+---------*·----I-----+ TCTTCTTCCCCATT6G· ^acgtacggacgtccagct).

Os fragmentos E e F foram ligados de forma a obter o plasmídeo pEMF:53'd, representado na Figura 10, na qual os símbolos tem o mesmo significado que na Figura 7, o novo fraqmento Xhol— -3alI (fragmento F) introduzido sendo representado por: tste plasmideo invento cuja sequência

Diupreende o promotor dada na exempla 2» artificia 1 do v - Construção do piasmi<s. pEMR 5tí3 (plasmideo de expressão da litocina humana qro—p, u plasmideo completa pelas enzimas N he I~H. i n d 111 contend o o faromona u assim como ,0 designado G daqui em d i

Nhel e C;,f~Omi:.'tor ^ gene foi submetido a uma digestão Hindi II., 0 fragmento pequeno artificial e a região pre-pro da. JRA3 foi purificado (fragmento Ãr‘te> U plasmideo QRw.,-, , . , , IR 4/u roí submetido a uma digestão e restrição Nhel e BamHI. 0 fragmento m oiante fragmento H>, compreendendo a -r^gem de r_pj. icação e o iocus 373 2μ, o gene LEU2d, o gene de ... _ i- icia à ampici^ina, a origem da pBR-322. e o terminadar da gene PGK foi purificado. romoleta pelas enzimas grande» ''designado daqui e 0 cDNh de qra-β foi clonaoa e sequenciado segunda d metatiu descrito por Teoamp—Olson et al . , referência atrás citada, ri sequência dD cDNA de gro-β (descrito nesta referência - em particular a figura 2) apresenta um sitio EcoRI (sequência: 5’ -oAATTL) que cobre o codâo ATT (Isoleucina na posição <-18 da sequência madura do gro-β, Tekamp-Olson et al, referência acima) e abrange os dois codSes flanqueantes GOA e CAc. Q cDNA clonado de gro-β termina em 3’ por uma cauda de poliA» flanqueada por um sitio de restrição BamHI. 0 fragmento EcoRI-BamHI compreendendo a maior parte da sequência codificadora de gro-β seguida da sequência 3’ correspondendo ao extremo não traduzida do mRNA flanqueado pela cauda poiiadenilada, foi isolado segundo as técnicas convencionais e 6Θ descritas em Mania tis et al. (Ref. citada atrás). Q fragmento é daqui em diante designado fragmento I.

Por outro lado preparau-se um fragmento sintético Hind 111-EcoRI contendo o fim da região pre-pro da feromona α (correspondendo aos resíduos Ser Leu Asp Lis Arg) e o começo da sequência codificadora da proteína madura de qro-β. A sequência deste fragmento, designada fragmento J, e dada a seguir. Deve-se notar que a sequência correspondente ac* começo do cDNA de qro-β +'oi modificada relativamente á sequência do cDNA descrita por Tekamp-Olson et ai., referência atrás de modo a que os codoes utilizados estejam entre os mais frequentemente utilizadas por S. cerevisiae (Cf. Sharp et al. 1986 Nucleic Acids Research, vol. 14, 13, 5125-5143).

AGCTTGGATAAAAGAGCGCCTTTGGCTACTGAATTGAGATGTCAATGTTTGCAAACCTTGCAAGG

ACCTATTTTCTCGCGGAAACCGATGACTTAACTCTACAGTTACAAACGTTTGGAACGTTCCTTAA

EcoRI

Os fragmentos G, Η, 1 e J foram ligados de forma a obter—se o plasmideo pEMR 583, representado na Figura 11, na qual os símbolos têm o mesmo significado das figuras 7 e 1®, o fragmento E sendo representado por e o fragmento F por

As sequências de nucleótidos e de peptídeos do começo de proteína madura de gro-β e do fim da região pre-pro da feromona α sl'o as seguintes:

L·? i Ho HljLro I 1 b* td Η T . Η A A. A b A v’ai. Ser. Leu. Asp. Lis. Arg. rim da regiâa pre-pro da feromana a jS υ S. L C T. í T G I 1 [Ala. Pro. Leu. ! jcomeço da proteína í madura

Sítio de corte peia endopeotidaEe do tipo Látepsina BryscF (produto dc qene KEX2). 1PL.G 9:

SeurecSo da citacma aro pela levedura 1. i ransformação da estirpe de levedura EMY 76 1 pelo plasmideo pEMR 583 e expressão de gro—fs pela estirpe transformada, A estirpe EMY761 (Mata, ieu.2, ura3, nis3> descrita no exemplo 3 foi transformada pelo plasmideo pEMR 583 relativamente à prototrofia para a ieucina e segundo a tôcnica já descrita no exemplo 3). Repicaram-se dois transformantes, designados daqui em diante EMY 761 pEMR5B3 (1) e EMY 761 pEMR 583 (2). * 2. Expressão em erlenmever do cDNA de gro-β pelas estirpes EMY 761 pEMR 583 (1) e EMY 761 pEMR 583 (2). Demonstração da presença da proteína no meio de cultura por electroforese em gel de dodecilsuifato de sódio<9DS)-paliacrilamida segundo o protocolo descrito por LAEMMLI (U.K. LAEMMLl, Nature, 227 C197Θ3 680-685). 62 ~ui tura a/ Uma colónia de cada. uma das estirpes EMY 761 pEMR 5G3 (1) e EMY 761 pEMR 583 (2) foi cultivado em 50 mi de meio liquido sem uracilo. Este meio contem por litro: a, 7 g de base azotada de levedura sem aminoâcidos (Yeast Nitrcgen base without aminoacids da DIFCD) 5,0 g de hidrolisado de caseína <Casaminoacids da DIFCD) 10 g de glucose»

Após uma noite a 30 °C com agitação, as duas culturas foram centrifugadas durante 10 min a 7 Θ0€> rpm. Os sedimentos foram ressuspensos em 10 ml de água destilada estéril e novamente cent.ritugadas durante 10 min a 7 00Θ rpm. A expressão de gro-β foi induzida ressuspendendo as células em 50 ml de meio YNB etanoi-glicerol-galactose. G meio YNB etanol-g1icerol-galactose contem em 1 litro: 6,7 g de base azotada da levedura sem aminoâcidos (Yeast Nitrogen base Without Aminuacids da DIFCO) 5,,0 g de hidrolisado de caseína (casaminoacids da DIFCO) 3ô de qlicerol 30 g de çalactose 10 ml de etanoi.

As culturas foram colocadas a. 30 °C com agitação durante 24 h. b/ Estirpe testemunha: A estirpe EMY 761 não transformada, ou seja sem

plasmideos, foi cultivada como atrás. Ela foi sujeita por um lado a pré-cultura em 50 ml de meio líquido sem uracilo ao qual se adicionou uracilo (20pg/ml) e por outro lado, a indução em 50 ml de meio YNB etanol-glicerol-galactose ao qual se adicionou uracilo <2€> pg/ml).

Preparação das amostras:

As células cultivadas em 1 a/ e 1 b/ foram j centrifugadas durante 20 min a 10 000 rpm e o sobrenadante foi colhido. A 10 ml de sobrenadante, adicionou-se 5 ml de ácido tricloroacetico a 50¾ contendo 2 mg/ml de desoxicolato. A mistura foi incubada a 4°C durante 30 min, depois centrifugada durante 30 min a 10 0000 rpm. O sedimento foi ressuspenso em cerca de 1 ml de acetona fria (+4°C) e novamente centrifuqado 30 min a 1Θ 000 rpm. O sedimento após ter sido seco foi ressuspenso em cerca de 20 μΐ de um tampão designado tampão de amostra constituído por Tris-HCl 0,125 M pH ó,B SDS 4/1, azul de bromofenol 0,002¾ , glicerol 20¾, β-mercaptoetanol 10¾ ^ (segundo o protocola descrito por LAEMMLI £19701). 0 4/ sedimento foi salubilizado por ebulição durante 15 min, depois neutralizado adicionando soda 10N até o azul de bromofenol ficar azul.

As amostras foram depositadas no gel de SE»S/pol iacri lamida s 1/ Marcador de peso molecular 2/ EMY761 não transformada não induzida: 20 μΐ aplicados 64 _'· / EMY761 pEMR 583 (1) não induzida: ul aoliçados 4/ EMY761 pEMR 583 í 1 ) induzida durante 24 h: 15 μΐ apliçados 5/ EMY761 oEMR 5323 ( 1 > induzida durante 24 h: 5 ul aoliçados w / Marcador de peso mo 1 seular 7 / EMY761 pEMR 533 (2> induzida durante 24 h: 5 μΐ apliçados 8/ EMY761 pEMR 583 (2) induzido durante 24 h: 15 μΐ apliçados ?/ EMY761 pEMR 583 (2) não induzida: 20 μ ι apliçados 10/ ENY761 não tran st ar mado induzida: 20 μ ι aplicado

Após electroforese as proteínas foram coradas com azul L D O ííi B £ 5 1 £ α RESULTADOS: A análise do gel oDtido mostra que uma proteína supranumerária de peso molecular aparente de cerca de 8 KDa foi produzida pelas estirpes EMY 761 pEMR 583 <1> (faixas 4 e 5) e EMY 761 pEMR 583 (2) (faixas 7 e 8) e não é produzida pelos sobrenadantes de cultura da estirpe EMY 761 nlo transformada (faixas 2 e 10). Parece igualmente que a síntese desta. proteína supranumerária está ligada à indução da promotor pelo crescimento em etanol-glicerol-galactose (bandas ausentes nas faixas 3 e 9). A análise da sequência amino-terminal desta proteína purificada por HPLC permitiu verificar que se trata da proteína madura gro-β descrita por Tekamp-Qlson et ai., referência atrás.

Parece portanto que a citocina gro-β pode ser secretada sob o controle do promotor do invento. A estirpe EMY 761 pEMR 583 (1) foi depositada na C.N.C.M. sob ο n2 I - 1021.

EXEMPLO 1Θ: Construção de um vector de g^pressão e de secreção de IL-S numa levedura; o plasmídeo pEMR 611, portador do promotor artificialdo invento:

Um segundo exemplo de proteína secretada cuja secreção pode ser regulada pelo promotor do inventa e a citocina humana IL-8. Esta citocina de cerca de 8 ΦΘΘ Da, produzida pelos monóci-tos, foi descrita por várias equipas: Yoshimura et al. (1987) J.

Immunol., 139, 788-793, Shroder et al., (1987), J . Immunol. 139, 3474-3483 e Walz, et al. (1987) Biochem Biophys. Res. Commun. 149, 755-761). A IL~8 actua como quimio-atraente dos neutrófilos. A IL-8 apresenta semelhanças notáveis com a estrutura da fi-trom-boqlobina (Van Damme et al., (1989) Eur. J. Biochem 181, 337-344). A citocina IL-8 existe em várias formas diferindo entre elas pela sua extremidade NH? terminal. A forma maioritária ê composta por 72 aminoácidos mas são igualmente produzidas outras 5 formas menores, entre as quais 3 apresentam uma extremidade NH.-,-terminal truncada relativamente à forma maioritária e 2 apresentam uma extensão de respectivamente 5 e 1 aminoácidos relativamente a esta forma maioritária. 0 cDNA da IL-8 foi clonado e sequenciado sequndo o método descrito por hatsushima et al. 1988 J. Exp. Med. 167,

^ 1883-1993.. A sequência deste cDNA engloba um sítio único HindIII > <5?~AAGCTT> que abarca os codoes 42 e 43 da parte madura (forma 72 aa: Cf. Matsushima et al. ref. citada atrás).

Por outro lado, o clone de cDNA da 1L—8 utilizado na clonagem apresenta um sítio BamHI cínico flanqueando directamente o extremo 3* da cauda poli A. 0 fragmento BamHI-HindIII portador da extremidade 3’ do cDNA de IL-8 foi purificado. 66

Um vector de clonagem foi preparado da seguinte maneiras d piasmídeo pEMR583 descrito no exemplo Q foi digerido por Hindi II e BamHI. Esta dupla digestão produz 5 fragmentos: o fragmento mais pesado HindIII—BamHI corresponde ao vector de clonagem (cerca de 776Ô pares de bases). Gs outros 4, HindlII--HindíII (de 169 pares de bases, 92 pares de bases, 529 pares de bases e 187 pares de bases de tamanho) corresponde à sequência do cDNA de gro-R., D sítio HindlII do vector de clonagem está situado um pouco a montante do sitio de inserção no fim da sequência pro da feromone. alfa (e engloba a sequência do codão serina 81 do precursor). 0 sitio EíamHI está localizdo a montante do terminador QP · 0 DMA do fragmento Hindi I Ι-BamHI foi purificado. 0 fragmenta Hindi I Ι-BamHI portador da parte 3’ da sequência do cDNA foi ligada com um fragmenta de DNA sintético Hind11 Ι-Hind111. A sequência deste frsgmento, dado a seguir, destinou-se a reconstruir a sequência da forma madura maioritária da IL-8 (72 aminoá-cidos) precedida da sequência do sitio de clivagem (Ser—Leu-Asp--Lis-Arg>. O novo fragmento HindIII-BamHI foi ligado com um fragmento Hindi IΙ-BamHI correspondendo ao vector de clonagem. A sequência do fragmento sintético HindiI-HindIII é a seguinte:

5 ’ -AGCTTGGATAAAAGATCTGCTAAGGAATTCAGATGTCAATGTATCAAGACTTACTCTAAGCCATTCC ACCTATTTTCTAGACGATTCCTTAACTCTACAGTTACATAGTTCTGAATGAGATTCGGTAACG

ACCCAAAGTTCATCAAGGAATTGAGAGTTATCGAATCTGGTCCACACTGTGCTAACACTGAAATTAT

TGGGTTTCAAGTAGTTCCTTAACTCTCAATAGCTTAGACCAGGTGTGACACGATTGTGACTTTAATA

CGTTA GCAATTCGA-5’ 0 piasmídeo assim obtido, portador do cDNA da IL-8 precedido da sequência pre-pro da feromona α e do promotor da 67 invento, cuja sequência foi descrita no exempla 2, foi designado pEMR 611. EXEMPLO 11: Transfarmação da estirpe de levedura EHY 761 oeio glasmídeo o£MR 611 e secreção da IL-8 A estirpe EMY 761 (Mata, ura3, leu2, his3), descrita no exemplo 3, foi transformada em estirpe (leu+> pelo DNA do plasmi-deo pEMR 611 segundo a técnica já descrita. Entre as colónias (1eu+) obtidas, uma foi tirada ao acaso e cultivada para estudo da secreção de IL-8. Esta estirpe foi designada EMY 761 pEMR 611. 0 protocolo para análise das proteínas pela levedura é o exposto no exemplo 9. As proteínas secretadas pela EMY 761 pEMR 611 foram comparadas com as secretadas pela EMY 761. PSs-se assim em evidência uma banda principal supranumerária correspondendo a uma proteína de 8 00Θ Da secretada pelas células EMY 761 pEMR611-xnduzidas com galactose. Esta proteína é reconhecida especifica-mente por anticorpos de coelho dirigidos contra IL-8 humana (fornecido pela empresa Endogen: Anti human IL-8 polyvalent Ρ8Θ1), segundo os resultados da análise de "transferência Western", método bem conhecido dos fami 1 iarizados com a. área cujo protocolo foi dado detalhadaments no exemplo 4. * ./ 0 plasmídeo de expressão pEMRóll permite pois a expres são a alto nível de IL-8 nas leveduras transformadas. Esta expressão está sob o controle do promotor artificial do invento. í > A estirpe EMY761 pEMR611 foi depositada na C.N.C.M. sob ο n2 I - 1023. 68 EXEMPLO 12; Construção de um vector de expressão e secreção da hirudina: o olasmldeo DEMR576., portador do promotar a r t. i f i c ial d o in v ent o

Natursimente produzida pela sanguessuga Hiruda. a hirudina é um inibidor muito específico e muito eficaz da trombi-na. Um certo número de variantes foram identificadas e designadas HV1, HV2, HV3 (Dodt J. et al. (1986) FEBS Lett. 202, 373, 377). Algumas destas variantes naturais assim como outros análogos foram preparados por engenharia genética em diversas células hospedeiras- 0 exemplo diz respeito à variante rHVr>-Lis47 descrita na publicação do Pedido de Patente ΕΡ-Α-Θ273800. Mais particularmente, a sequência expressa codifica um precursc-r desta variante rHV0-Lis47, caracterizado por conter uma sequência sinais Met - Arg - Fen - Ser - Ire - Tre - Vai - Ala - Tre - Ala -- Ala - Tir - Ala - Leu -· Fen - Fen - Tre - Ala - Ser - Gin - Vai - Ser - Ala precedendo diractamente o começo da sequência da hirudina. A construção e a estrutura deste precursor foram descritas na publicação do Pedido de Patente FR 2646437. A expressão deste precursor permite a libertação da variante eHV^-Lis47 no sobrenadarite de cultura das células transformadas. O plasmídeo pTB3867 cuja construção e a descrição estão detalhadas no Pedido de Patente FR 2 646 437, é um vector de secreção para a hirudina. Nesta construção a hirudina é sintetizada sob a forma de um precursor contendo uma sequência sinal. A hirudina é colocada à frente de um promotor do gene MFal que é constitutivo das estirpes de levedura do tipo de conjugação «. 69

Construção ao plasmideo ~i>r-.i'’1R547 ev.emplo 2 plasmideo tcoHI de1 0 plasmideo qEHR547 deriva do plasmídec> pEMRbiS ict. ) por oeleção da sequência pequena proveniente do 2 μ e localizada entree o fim do gene LE'U.z~d e o sitio imitante oa sequência do plasmideo pBR322. 0 piasmideo pEMR5I5 foi digerido parcialmente por õspMl e totalmente por EcoRI. □ f ragmertto grande BspMI-EcoRI correspondendo ao plasmideo p£i1R515 sem a parte 3' de LEU2 e sequência pequena contígua de foi ligado a. uma sequência sintética EspMI-EcoRI destinado a reconstituir a região 3’ do gene LEU2-d.

Esta sequência sintética è a seguinte:

AATTGCCCGGGACGTCTTATGTACAAATATCATAAAAAAAGAGAATCTTTTT +---------+.---------+---------4.---------+---------

iCGGGCCCTGCAGAATACATGTTTATAGTATTTTTTTCTCTTAGAAAAA

AAGCAAGGATTTTCTTAACTTCTTCGGCGACAGCATCACCGACTTCGGTGGTACTGTTGG + — ---- + ----------------+------— ------+---------

TTCGTTCCT AAAAGAATTGAAGAAGCCGCTGTCGTAGTGGCTGAAGCCACCATGACAACC

B s

P

M

I AACCACCT AAATCACCAGTTCTGATACCTGCATCC + -------— +-----— — +---------+---—----

TTGGTGGATTTAGTGGTCAAGACTATGGACGTAGGTTTT

Construção do plasmideo pEMRbòB G plasmideo pcMR568 deriva de pfcMR547 oa seguinte forma e Nftel distando 0 DNA do plasmideo pEMR547 foi digeriaa por rllul e Nhel. Esta dupla digestão permite linearizar o plasmideo pEMR547 (6,6 Kb) , os dois sítios íilul e Nftel distando alguns pares de

bases um do outro» Entre estes aois sítios in Lroduziu-se um oliaonucleótido sintético de cadeia simples com a sequência:

CTAGC6AGCTCAA8CTTA

GC7CGAGTT CBAA1 uCGC 0 plasmídeo resultante foi designado pEMR568n (' ο η s t ruccto do o lasmídeo cEMR576. plasmídeo de expressão da hírudina A sequência da variante rHV-, -1 ys47 da hírudina foi obtida a partir do plasmídeo pTB3867, cuja construção e a descrição estão detalhados no pedido de patente FR 2 646 437. Nesta construção a hírudina foi sintetizada sob a forma de um precursor composto por um pept.ídeo sinal de 23 aminoácidos ícompreendendo a metionina correspondente ao codão de iniciação). 0 RNA mensageiro codificador do precursor foi transcrito com a ajuda do promotor MFcei que é constitutivo nas estirpes de levedura do tipo de conjugação alfa. A dupla digestão Accl-Sall do plasmídeo pTG3867 liberta várias fragmentos em que o mais pequeno, com cerca de 20€> pares de bases, é facilmente purificadoem qel de aqarose a 27.. 0 sítio Accl que delimita este fragmento dista alguns pares de bases do início da sequência madura segundo a sequência: TAATGC AT j ATGTCT6

Sequência madura 0 sitio Gall está situado a jusante do codão de paraqem da sequência codificadora da hirudina. 0 fraqmento AccI-SalI de 20© pares de bases possui a informação para a maior parte da sequência madura da hirudina. 0 complemento de informação (sequência sinal e começo da sequência madura) é proporcionado por uma sequência sintética com cerca de nucleótidos que se seque:

CGATATACACAATGCGTTTCTCTACTACAGTCGCTACTGCAGCTACTGCGCTATTTTTCACAGCCTCC

TATATGTGTTACGCAAAGAGATGATGTCAGCGATGACGTCGATGACGCGATAAAAAGTGTCGGAGG

CCAAGTTTCAGCTATTACGT

GGTTCAAAGTCGATAATGCATA 0 vector pEMR468 foi linearizada por Sall e digerido parcialmente por Ciai. 0 fraqmento Clal-Sall com cerca de 5,6 Kb, correspondendo a este vector sem a sequência da ura to-o;·; idase. foi liqado ao fragmento AccI-SalI, com cerca de 2©Ô pares de dases, o qual possui a informação da sequência da hirudina madura; e com a pequena sequência sintética Clal-Accl destinado a reconstituir a sequência do precursor da hirudina. 0 plasmídeo resultante foi designado pEMR576.

EXEMPLO 15: bserscão da hirudina 1) Transformação da astirpe EMY761 pelo plasmideo dEMR576, A estirpe EMY761 (Mata, ura3, his3, leu2> foi transfor— + _ nada numa estirpe (leu > pelo plasmideo ptMR576, seguindo a técnica, já descrita.

Uin transformante foi isolado, daqui em diante designado EMY761 pEMR57ó. 2) Expressão da hirudina

Coino testemunha negativa, construiu-se uma estirpe (Ieu+) derivada de EMY761 e designada daqui em diante EMY761 (leu+). A técnica utilizada foi descrita detalhadamente no pedido de patente FR 2 646 437. As estirpes EMY761 pEMR’576 e EMY761 (leu ) foram cultivados paralelamante como descrito a seguir:

As pré—culturas fizeram-se em meio com a composição:

Yeast. Mitrogen Base (DIFCO) 0,77., histidina 50 pg/ml e uracilo 50 5 pg/rnl. Ao fim de 24 h semeou-se as culturas com 10 células em meio com a composição Yeast Nitrogen Base (DIFCO) 0,77., etanol 17, casaminoécidos 0,5'";, uracilo 100 pg/ml, glicerol 37. e galac-tose 17..

Ao fim de 72 h de cultura neste último meio separou-se o sobreriadante das células por filtração através de 0,2 pm. A actividade inibidora do sobrenadante sobre a trombina foi medida utilizando o teste colorimétrico descrito em FR 2 646 437 (actividade proteólitica da trombina sobre um substrato sintético, a cromozima TH comercializada pela Boehringer Mannheim).

m μα ae e 1 , dd 0 quadro abaixo apresenta, os resultados dos doseamentos irudma per ml de sobrenadam te, a uma densidade óptica eja «,3 x 10'' células/ml . Γ i tstirpe ? t j pg/ml 1 i i ! í I EMY761 (leu+) 1 i nãío detectável I ! ! 1 i Ε1ΊΥ761 pEMR576 I y, 5 _J_____ I _i

Parece pois que a hirudina pode ser secretada sdd o ontrole do promotor do invento. A estirpe EJ1Y761 pEMR576 foi depositada na CNCM sob o 74 VINDICASSES: 1*. - Processo para a obtenção de um promotor artificiai para a expressão de proteínas em levedura, que possuem: - uma subsequència a montante do elemento TATA da sequência do promotor do gene GAL7 de Saccnaromyces cerevisiae, que inclui as; sequências de activacão a montante UAS'i e UAS2; - uma subsequència da sequência de um promotor ADH_, portador do elemento TATA da região de iniciação da transcrição; caractsrizado por compreender a junção das duas sub-sequências referidas utilizando técnicas de DMA recomòinante. 2è. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac-tsrizado por a. suosequência da sequência do promotor 6AL7 de Saccharoinyces carevisiae ser escolhida de entre as subsequências da seguinte sequência:

• V

Claims (1)

1. 75 1/AS4- Μ ι υ 1 CCC3TCTA7AC fTCGCAGCACTGl TGAGCGA*: GGC 7 CA 7 7ACA7 A 7 A 7.7 7 7C7G7CA 7 ACA7ATG ÍACCC7CG7GACAAC7CGC77 CCCAG7AA7C7A7A7AAAAGACAG7A UPrSV T7 7CCT 7AACCCAAAAA7AAGGGAGAGGõTCCAAAnACCC C 7CCGACAAC7GT TGACC3 7 ΛΛΑΟΟΑΑίTGGGT77I7ATTCCC7C7CCCACG77777CGC GAGCCTGT 7GACAACTCCCA C*TCCCAACÚ»CTGÚCT«TAC»GTG1 7CACAAAA7ACCCAAC;:TGAAAA7AA7G7G7AGC TAGGC7TCCTGACCCATATG7CACAACTC7 TTTAICCCT 7CGAC T 7 T ΤΑΤ TACACATCO Ρ h I C7T TAGCTAlGI7CAGITAG7tTGGCA7<Í GAAA τ CGA 7 ACAAG JCAA 7CAAACC 3â. - Processa de acordo com uma das reivindicações 1 e 2, caracterizado por a subsequência da sequência de um promotor ADH-, contendo o elemento TATA e a reqião de iniciação ser esco-lhida de entre as suhsequéncias da sequência que se seque:

   CC 7A7CACAJAT ΑΑΑ1 AÇA ·* * * " * ****** ^TrtCCCATAÔlCTATAinAICT Cl CCCAwT ACCCACIT 7 T 1 TCACACTCSAGATAC JC7 7 AC TACTCrTCICfIGnCITIT CAt Cw^CAICv^ * C«A^AAAQTGt G^Ct 1C > ATCAGAA7CA < GACGACACAACAAC>'JiA 7 ATCAC71C77C777C7 7C1TCC7AAATΑΟΛΑTATCAAGC 7ACAAAAAGCAJACAA7CAA AJAG7CAAGAACÃAAGAACAACCAt T 7AIC7 TAIAG7TCCA707 7 7 7 TCGTATC7 TAG77 C I A I C7A7CAACTATTAAC:a7A7^ CATAC7 7CA7AAT7CA7ATACC 4*. - Processo de acorda com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por incluir a sequinte sequências w

   Μ I ν I ccccTcr^fACT icccacc^ctg: icaccchaccc tca t tagataia r: 7 ictctcat AGATAlCAflCCCTCCTCACAACTCCCÍ TCCCiCTAArCTAIAT^flAACACACTA tttcct: aacczaaaaa? aac^w^c^CwGtc^^^^^acccctccgacaa^tgiT caccct AAAGGAAI 7Gwô7 T 11IAÍ TC»·. TC · * | ) 7 "CCCCAGGC^GT TCACA&CTGCCA gatccgaacíac7ccc:aíacag:ct j agcíaacc t gaarataaíctct agc CTAGGC7 TCG7CACCCATATGTCACAACTCI τ 7 TOtCCiT TCSACT T I TAT TACACA7C3 s P A ! CT T TaGCTAIGT TCAGTTAGI Γ ICGCATGCC7 ATCACAJAJaaATACA GAAATCGArACAACTCAAICAAACC-7ACCCATAC:c7ATA7 7TATC7 GTGCGAG7AGC5AC7T7 7 7 JCACAC:CCAGATAC7C77ACTACTGC7C:C.:7C7 7G7TT7 CACG5 TCA7CGCTCAAAAAeG7GTCAGCTC7 AT CAGA® TGATC^GS«CAC.AACAACAnna TATCAC7 JCTTG7 7 7C7TC'.TGGIAAAJAGAA7A7CAAGC*ACAaaaaGCATACAATCAO AtAC7GAAGAACAAAGAAC«ACCAI7TAICTTAIAGI TCGAICI 7 7T7CC:ATGTTACT7 C 1 • I ;i ATCAActamaacJaiati CATAGT TGAfAAI TGATAIACC 5§. - Vector de expressão para a levedura portador de um gene com interesse juntamente com os meios necessários à sua expressão, sua replicação e á selecção das células transformadas, caracterizado por este gene com interesse estar sob o controlo do promotor de acordo com uma das reivindicações 1 a 4. 6â. - Vector de expressão de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o gene com interesse ser um gene recombinan-te codificador da urato-oxidase.