JPH03504199A - 迅速な核酸検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 迅速な核酸検出法 発明の分野 この発明は核酸配列の検出のための核酸ハイブリダイゼーションに関し、より具 体的には標的核酸配列の増幅と増幅した標的物質の溶液サンドウィッチハイブリ ダイゼーションとを組み合わせる方法に関する。

発明の背景 問題の核酸配列の検出に使用することができる実用的な核酸ハイブリダイゼーシ ョン法の開発は幾っがの要因により制限されてきた。これらは感度の欠如、方法 の複雑さ、及び、放射能測定検出法を非放射能測定法に変更することへの希望を 含む。種々な方法が非放射能測定法の感度を増加する目的で検討された。一つの 一般的な解決法においては、複雑さと非放射能測定検出という問題点に同時に効 果を示す全試験法における改良が検討された。

他の解決法においては、そのような測定法で検出される核酸の量を増加する方法 が追求された。

Ｆａｌｋｏｗに付与された米国特許！４，３５８．５３５号は存在するのではな いかと思われる生物の細胞数の増加とそれによる核酸量を増加するための細胞培 養法、試料を固定した支持体の上に置き、次いで試料を付標したグローブと接触 させ、次に支持体を洗浄し、標識を検出する方法を記述している。この方法の一 つの欠点は最初に生物を培養することなくしては測定法が適当な感度を持たない ことである。しかしながら、培養段階を付加することは時間がかかり、又常に成 功するとは限らない。ＭａｎｉａＬｉｓ等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ ｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　 Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８２年刊）、３９０〜４０１ペー ジは問題の核酸を適当な宿主系でクローニングすることにより増幅する方法を記 述している。次いで、宿主生物が培養中に複製すると問題の核酸も複製する。こ の方法も培養段階の実行と、従って時間がかかり且つ複雑な方法の準備を必要と する欠点がある。

生物の核酸の量を増加する別の方法が米国特許第４．６８３．２０２号及び第４ ．６８３．１９５号ｌこ記述されている。これらの特許は［核酸又はそれらの混 合物に含まれる任意の標的核酸配列の増幅と検出の方法」を開示している。この 方法は各循環が完了した後増幅するべき核酸配列が倍増するインビトロ循環機構 を用いる。これは増幅するべき核酸配列の相補的鎖を分離し、これらの鎖を過剰 のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させ、プライマーを酵素処理により伸長 して各プライマーとアニーリングした核酸と相補的なプライマー伸長生成物を形 成させることにより実行される。次いでこの方法を必要な回数反復する。この方 法の利点は問題の生物の核酸配列の小部分を大量に速やかに生産できることであ る。この方法の欠点は直接測定法を使用する生成した核酸の検出が、増幅過程に おいて複製されるはずの元の核酸の正しくない写しである核酸配列が生成するこ とがあるため複雑化することである。これらの虚偽の核酸配列は測定の際誤った 陽性値を与え、これがバックグラウンドの雑音を増加し、これにより全体の方法 の感度を減少させる。

過去において問題の核酸の検出のため多くのＤＮＡグローブ測定法が記述されて いる。Ｆａｌｋｏｗ法（上述）は最初に標的核酸を一本鎖にし、これを固体支持 体上に固定化する。次いで標的核酸と相補的な付標したグローブを固体支持体上 で接触させる。すべての過剰なプローブを洗浄して除き、生成するハイブリッド 中の標識の存在を測定する。この方法の欠点は時間がかかり、面倒なことである 。測定段階すなわちハイブリダイゼーションと洗浄段階は膜（固体支持体）並び に緩衝溶液を含む密封した袋の中で実行される。

Ｈｉｌｌ等、ＷＯ第８６１０５８１５号は標的ＤＮＡを付着したニトロセルロー ス被覆磁気粒子を使用し、次いでビオチニル化プローブで直接ハイブリダイゼー ションし、ストレプトアビジン複合検出剤で検出する上記測定法の変法を記述し ている。

Ｄｕｎｎ等、Ｃｅ１ｌ　（１９７７年）１２巻、２３−３６ページは標的核酸を 固体支持体に付着した第一の又は捕捉プローブを含む溶液と混合したポリヌクレ オチドプローブを使用する二段階サンドウィッチ測定法を使用する異なるノーイ ブリダイゼーション法を記述している。一定時間後、支持体を洗浄し、同じく標 的核酸と相補的であるが捕捉プローブとは相補的でない第二の又は検出剤（灯標 した）プローブを添加し、捕捉プローブ−標的核酸複合体とハイブリダイズさせ る。すべてのハイブリダイズしていない検出剤グローブを洗浄して除いた後、標 的核酸とハイブリダイズした検出剤グローブの存在を検出する。

Ｒａｎｋ　ｉ等、米国特許願嬉４，５６３．４１９号は固体支持体に付着した捕 捉プローブ及び検出剤プローブを標的核酸に同時に添加し、次いですべてのハイ ブリダイズしていない検出剤プローブを除く一段階サンドウィッチハイブリダイ ゼーション法を開示している。この測定法は一つの洗浄段階を除くことにより方 法を簡単にし、感度を増加する点で二段階サンドウィッチハイブリダイゼーショ ン法の改良法である。

一段階法の幾つかの変法が記述されており、例えばＥＰＡ第０１３９４８９号、 ＥＰＡ第０１５４５０５号、ＷＯ第８６１０３７８２号、及びＥＰＡ第０２００ １１３号が参照される。これらのすべては第一の又は捕捉グローブをハイブリダ イゼーション前に固体支持体上に固定化する測定法を用いている点を認識すべき である。

ドイツ特許出願公開第３．５４６．３１２　ＡＩ号は更に別の変法を記述してい る。この方法はＲａｎｋｉ等の記述と同様に、標的核酸のまったく別の部分とハ イブリダイズする捕捉プローブと検出剤グローブを使用する。標的核酸を溶液中 で二つのプローブと接触させる。第一の又は捕捉プローブはビオチンのような結 合成分を含み、このものは固体支持体に付着したストレプトアビジンのような受 容体成分と結合することができる。捕捉プローブ−標的核酸−検出剤グローブ複 合体が形成された後、ストレプトアビジン変更固体支持体を添加する。すべての ハイブリダイズしていない検出剤プローブを洗浄して除き、次いで固体支持体に 結合した複合体に取り込まれた標識を検出する。この方法のＲａｎｋｉ等の開示 に対する利点は溶液中で行われるハイブリダイゼーションが速度論的に有利なこ とである。多少の欠点は標的核酸の長さが反応の全効率に影響し、標的核酸の長 さが増加すると効率は減少する。又、サンドウィッチ核酸プローブ測定法は不均 一な二段階又は一段階、もしくは溶液ハイブリダイゼーションを利用するいずれ の方法も直接測定法のように感度は良くない。

発明の開示 予め選択した配列を含む核酸を含むのではないかと思われる試料中の予め選択し た核酸配列の検出及び／又は測定のためのこの発明の核酸プローブ測定法は（Ａ ）　ＩＩ’的核酸を一本鎖にし、 （Ｂ）予め選択した核酸中に含まれる少なくとも一つの特定の核酸配列を （１）鎖を各々の異なる特定の増幅をする配列のための二つのオリゴヌクレオチ ドプライマーで、各々の異なる増幅をする配列のため各核酸鎖と相補的な各プラ イマーの伸長生成物が合成される条件下で処理し、この場合前記プライマーは各 々の特定の配列は異なる鎖と充分相補的であるように選択され、それによりそこ でハイブリダイズされて一つのプライマーから合成された伸長生成物はその相補 体から分離したとき、他のプライマーの伸長生成物の合成のだめの鋳型としての 役割をすることができ、 （２）プライマー伸長生成物をそれらが合成された鋳型から分離して一本鎖分子 を生成させ、及び（３）段階（２）で生成した一本鎖分子を段階（１）のプライ マーで、段階（２）で生成した一本鎖の各々を鋳型として使用してプライマー伸 長生成物が合成される条件下で処理し、 （４）段階（２）と（３）を反復して検出及び／又、は測定のため充分量のプラ イマー伸長生成物を生成させることにより増幅し、 （Ｃ）段階（Ｂ）（４）の生成物を一本鎖にし、（Ｄ）段階（Ｃ）の生成物を溶 液中で捕捉及び検出剤プローブと接触させ、この場合前記捕捉プローブは両プラ イマーにより限定される核酸配列を含まないプライマー伸長生成物の部分と相補 的であり、前記検出剤プローブは捕捉プローブと両プライマーにより限定される 核酸配列を含まないプライマー伸長生成物の部分と相補的であり、並びに捕捉及 び検出剤プローブは同じ核酸鎖と相補的であり、 （Ｅ）段階（Ｄ）のサンドウィッチ生成物を捕捉グローブのアンカー基と相互作 用することができるアンカー受容体基をその表面に持つ固体支持体と接触させる ことにより固定化し、 （Ｆ）すべてのハイブリダイズしていないグローブを除き、及び （Ｇ）固体支持体上に固定化した検出基を検出及び／又は測定する段階からなる 。

発明の詳細な説明 この発明の核酸ゾロープ測定は次の予め選択した配列の標的核酸の検出のための 全過程からなる。すなわちａ）米国特許第４，６８３．２０２号に記述されたポ リメラーゼ鎖反応（ＰＣＢ）核酸増殖法を使用し、特定のアミノ酸配列を変性し た試料中に存在する標的核酸を標的に特異的なプライマーとアニーリングし、伸 長生成物を形成させることにより増幅し、前記文献は参考例としてここに組み入 れる。形成した各伸長生成物は標的核酸に含まれる予め選択した核酸配列の部分 と相補的であり、更にプライマー結合の鋳型となる。次いでこの方法を必要なだ け反復して検出及び／又は測定のため所望量のプライマー伸長生成物を生成させ る。

ｂ）生成する核酸を加熱、カオトロピック剤（ｃｈａｏｔ−ｒｏｐｉｃ　　ａｇ ｅｎｔ）による処理、もしくはｐＨの上昇又は低下によるような公知の方法で一 本鎖にする。次いでこのように生成した一本鎖核酸をそれぞれ核酸捕捉及び検出 剤プローブを含む緩衝化溶液と同時に又は順次接触させる。捕捉プローブと称す る第一のプローブは標的核酸の一部分と相補的であるが、増幅段階で利用される プライマーとは相補的でなく、それにアンカーと称する官能基が付着しているオ リゴヌクレオチド（核酸）配列である。検出剤プローブと称する第二のプローブ は標的核酸の捕捉プローブと相補的な配列及びプライマーとのそれとはまったく 別な部分と相補的であり、それに検出基が付着しているオリゴヌクレオチド（核 酸）配列である。

捕捉プローブと検出剤プローブは同じ核酸鎖と相補的でなければならない。その 結果標的核酸、捕捉プローブ、及び検出剤グローブを含むサンドウィッチが形成 される。

Ｃ）次いで核酸サンドウィッチを捕捉プローブのアンカー基と固体表面に付着す るアンカー受容体との相互作用により溶液から捕捉する。捕捉したサンドウィッ チを適当な緩衝液で洗浄してハイブリダイスしていない検出層グローブを洗浄す る。次いで支持体上の検出基の存在と量を検出及び／又は測定し、これは増幅し た標的核酸の量と比例する。次に、存在する増幅した標的核酸の量は試料中に元 から存在した増幅しない標的核酸と比例する。

ここで使用する用語ｒ　ＰＣＲＪは米国特許第４，６８３．２０２号に記述され ているようにプライマーオリゴヌクレオチドを使用して酵素的方法により標的核 酸の小部分の太きく増加した数の写しを生産する標的核酸配列の増幅法を意味す る。

ここで使用する用語、捕捉プローブは標的核酸の予め選択した配列の部分と相補 的であり、それにアンカーと称する官能基が付着しているオリゴヌクレオチドを 意味する。捕捉プローブはプライマー又はその核酸配列がプライマーにより限定 されるプライマー伸長生成物の部分と相補的であることはできない。捕捉プロー ブはアンカー基が付着しているオリゴヌクレオチドである。アンカー基の付着は 、例えばオリゴヌクレオチドの予め決められたヌクレオチド塩基を少なくとも３ 原子長のリンカ−アームが付加するような変更をすることにより達成することが できる。このリンカ−アームはアンカー受容体と相補的なアンカーに付着するこ とができる。アンカー受容体は固体支持体の表面に置かれ、捕捉プローブの固定 化に使用される。

ここで使用する用語、検出剤プローブは標的核酸の予め選択した配列の部分と相 補的なオリゴヌクレオチドを意味し、前記配列は捕捉プローブと相補的な標的核 酸の部分と全く別である。検出剤グローブはプライマー又は核酸配列がプライマ ーにより限定されるプライマー伸長生成物の部分又は捕捉プローブと相補的であ ることはでキナい。検出基はオリゴヌクレオチドに共有結合的に付着して検出剤 プローブを形成する。この付着は上述のようにリンカ−アームを介して実現する ことができる。

この発明の測定は同じ核酸鎖と相補的な捕捉プローブと検出剤プローブの両方を 必要とする。

この発明の有用な検出剤プローブ用検出基は酵素、蛍光団、化学ルミネセンス化 合物、色原体、及び発色団のようなハイブリダイゼーションと固定化に引き続い て検出可能な任意の部分を含む。酵素にはアルカリホスファターゼ、セイヨウワ サビパーオキシダーゼ、及びルシフェラーゼが含まれる。

この発明の有用な捕捉グローブ用アンカー基は前記支持体の表面に付着するアン カー受容体基と相互作用してハイブリダイゼーション過程で形成されるサンドウ ィッチの固定化を可能にする任意の部分を含む。例えば、アンカーは抗原−抗体 、タンパク質Ａ　−ＴｇＧ、及びビオチン−アビジン又はストレプトアビジンの ような任意の特異的免疫又は非免疫結合対の一員であることができる。

ここで使用する溶液サンドウィッチハイブリダイゼーションは標的アミノ酸を捕 捉及び検出剤オリゴヌクレオチドプローブと同時に又は順次接触させる方法を表 わす。

両グローブの溶液を標的核酸の溶液に同時添加するのが好ましい。ＰＣＲ標的増 幅反応はそれ以上のハイブリダイゼーションのための充分量の増幅した標的核酸 を生成させるためには約２０〜３０回の反復循環を必要とする。増幅した核酸の 変性はアルカリ、酸、カオトロピック剤、又は加熱による処理で達成されるが、 好ましい方法は増幅した標的核酸を沸騰水浴に少なくとも１０分間、次いで冷水 浴（４°Ｃ）に少なくとも２分間置くことである。

溶液ハイブリダイゼーションは一本鎖標的核酸を溶液中で適当な緩衝液に溶解し た捕捉及び検出剤グローブの両方と１〜３０分間好ましくは１０分間接触させる ことにより達成することができる。両プローブは過剰に使用するのが好ましい。

捕捉グローブの長さはその合成の容易さ、望ましい反応速度論、及び検出剤プロ ーブとプライマーの特性により決定されるが、好ましいのは約２０〜３０ヌクレ オチド塩基のオリゴヌクレオチドである。検出剤プローブの長さはその合成の容 易さ、望ましい反応速度論、及び検出剤グローブとプライマーの特性により決定 されるが、好ましいのは約２０〜３０ヌクレオチド塩基のオリゴヌクレオチドで ある。

次いでこのように形成された捕捉プローブ−標的核酸−検出剤グローブサンドウ ィッチを捕捉プローブのアンカー基を介するサンドウィッチとの複合体のような 安定な付着を形成することができるアンカー受容体をその表面に持つ固体支持体 と接触させる。種々な固体支持体とアンカー受容体を利用することができる。固 体支持体にはＬａｕ等、米国特許第４，６６１．４０８号に開示された二酸化ク ロム粒子のような磁気粒子、ミクロ滴定板、又は膜が含まれ、前記文献は参考例 としてここに組み入れる。この発明の測定の実行に有用な装置に組み込む好まし い膜は出願人譲り受は人がイー・アイ・デュポン・ド・ネモアース・アンド・コ ンパニーであり、１９８８年５月１０日に出願し、出願番号第０７／１９２．０ ８７号、代理人事件番号第ＮＮ−０２１２号の係属中の特許願に記述されており 、前記文献は参考例としてここに組み入れる。

この装置は物質を含むのではないかと思われるが又は含むことが知られている試 料中の物質の存在又は不存在を検出又は定量するための改良された測定装置であ り、前記装置は（ａ）付着した捕捉試薬を持つ透過性膜、（ｂ）中間層、及び（ Ｃ）吸着層からなる多重層を持ち、ここで層（ｂ）は層（ａ）と（ｃ）に直接通 じており、層（ｂ）は選択的に透過性の膜でそこを通る少なくとも一つの穴を持 つ改良がなされており、穴は捕捉試薬の直下にあり、及び前記穴の面積又は多数 の穴の合計した面積は捕捉試薬により覆われる面積より小さい。用語「選択的に 透過性の」は有機溶媒のような他の液体がもし存在する場合そこの通過を許すか 否かにかかわらず、水溶液の実質的な通過を許さない物質を意味する。

捕捉試薬の斑点をその上につける透過性層に使用することができる物質は種々な 天然又は合成の物質を含み、それらは個々の物質又は物質の組み合わせでもよく 、又有機、無機又はその組み合わせでもよい。透過性層は吸水性であること、す なわちそれは測定に使用する溶質の動きを実質的に妨げることなく、水溶液のそ こを通る流れを許容するものでなければならない。又、選択する物質はそれに対 して捕捉試薬が下で論するように装置の制限された領域に共有結合又は非共有結 合のいずれかにより、直接又は間接に付着できるものでなければならない。

使用できる模範的な物質は多糖類、例えば紙、酢酸セルロース、ニトロセルロー ス及び裏張りしたニトロセルロースのようなセルロース性物質；多孔性重合体母 体中にビニルクロリド、ビニルクロリド−プロピレン共重合体、及びビニルクロ リド−ビニルアセテート共重合体のような重合体と共に実質的に均一に分散した シリカ、不活性化アルミナ、珪藻土、ＭｇＳＯ４のような無機物質又は他の無機 の微粉砕した物質；布、天然の例えば綿、及び合成の例えばナイロン布；多孔性 ゲル、例えばシリカゲル、アガロース、デキストラン、及びゼラチン；ポリマー 性フィルム、例えばポリアクリルアミド等である。

特に、タンパク質が共有結合的に付着することができる膜についても述べること ができる。その一覧表には次の市販品：孔径が約０．５〜約５マイクロメーター の微孔性アフィニティー膜、接触するタンパク質を固定化する高密度の共有結合 部位を持つ化学的に予め活性化した表面を提供する膜、及び基礎膜が親水性ポリ ビニリデンフルオリドであり、７〜９のｐＨ範囲でリジン又はアルギニンのニブ シロンアミノ基を介してタンパク質固定化を許容するために化学的に誘導体化し た化学的に活性化した親木性微孔性膜を含む。感度の高い測定のためには膜の選 択は主として膜を封鎖することによりその非特異的結合を防ぐ能力に依存する。

これは次に選択する試薬である封鎖剤及び膜自身に依存する。本発明の実行に好 ましい膜は化学的に活性化した親木性微孔性膜である。

この多重層装置の選択的に透過性の層は測定条件下で水溶液の流れを妨げる。こ の流れに対する抵抗は捕捉試薬が測定に使用する他の試薬と接触する時間の量を 増加し、それによりサンドウィッチを構成し酵素を測定する以後の段階、並びに 測定の全体の感度を改良することから重要である。既知の流動特性を持つ広範囲 の種類の組成物を選択的に透過性の層として使用することができ、これはポリエ チレン、ポリエチレン裏張りポリテトラフルオロエチレン及び繊維状多孔性ポリ テトラフルオロエチレンを含む。繊維状多孔性ポリテトラフルオロエチレン膜が 本発明の実行における選択的に透過性の層の好ましい材料である。膜の繊維状多 孔性の性質は選択的に透過性の層において孔が存在する中心に向かって液体が流 れるように表面の放射状の流れを促進するように見える。

測定の量水性試薬は繊維状多孔性ポリテトラフルオロエチレン膜の孔を通過せず 、この膜は水性測定試薬に関して選択的に透過性である。

吸着層は過剰な試薬溶液の貯蔵所の役割をする。その結果、色の生成に必要なす べての試薬は吸着層に存在する。吸着層における発色は望ましくないので吸着層 におけるバックグラウンド色の生成を減らすため種々な試薬を吸着層に添加する ことができる。本発明により、驚くべき且つ予期しなかったことであるが、酵素 に基づく検出系を使用する場合吸着層における発色は検出用に選択した酵素に特 異的な酵素阻害剤を含む溶液で飽和することにより最小化できることが分かった 。

ハイブリダイズしていない検出剤グローブを除くため固定化したサンドウィッチ は引き続いて数回、例えば２５℃〜３７℃の範囲の温度で洗浄周期当たり約５〜 ｌＯ分間洗浄することができる。

検出剤プローブに存在する検出基の種類により種々な公知の検出法をこの発明の 測定に利用することができる。

一般に検出基が酵素の場合、その酵素に特異的な一つ又は複数の基質をすべての 他の必要な試薬と共に使用する。

次いで色形成を測光的に検出及び／又は測定することができる。検出基がアルカ リホスファターゼ酵素の場合について言えば、固体支持体が磁気粒子又はミクロ 滴定板の場合は４−メチルアンベリ７エリルホス７エート又はｐ−ニトロフェニ ルホスフェート、及び固体支持体が上述の変更した膜の場合はニトロ−ブルーテ トラゾリウム（ＮＢＴ）と５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェー ト（ＢＣＩＰ）の組み合わせが好ましい基質である。

予期しなかったことであるが、この発明の測定を実行する場合、そのような測定 の感度は従来のＤＮＡプローブ測定法より著しく改善されることが分かった。Ｐ ＣＲ法を直接ハイブリダイゼーション測定（ドツトプロット（ｄｏｔｂｌｏｔ） 　）と組み合わせる場合、ＨＩＶ　ｒ　ＤＮＡの１．０００コピーを色原体検出 法を使用して検出することができる。そのような直接測定法は溶液サンドウィッ チ測定法より感度が良いことが知られているので、膜装置の溶液サンドウィッチ 測定法は本発明の測定におけるＰＣＲ法と組み合わせ再度色原体検出を使用した 場合、ＨＩＶ　Ｉ　ＤＮＡの１００コピーを検出し、１０倍の改良が認められた ことは特に驚くべきことである。この発明の測定に蛍光検出を利用した場合も、 固体支持体の種類と無関係に旧Ｖ　Ｉ　ＤＮＡの１００コピーへの検出水準の増 加が認められた。その上、蛍光検出法は直接測定法（ドツトプロット）と共に利 用することができないので、従ってこれはより感度の低い検出限界に限定される 。

この発明の核酸プローブ測定の感度を評価するため、測定手順のＰＣＲ部分によ り生成する増幅した標的ＤＮＡの５％のみを使用したことに示されるように絶対 的な感度は増幅しない当初のＨＩＶ　　Ｉ　　ＤＮＡの５コピーに等しいことに 注意すべきである。そのような結果はストレプトアビジン被覆ミクロ滴定板又は ストレプトアビジン二酸化クロム粒子と組み合わせる蛍光検出法と共にこの発明 の膜装置を使用して得られた。この感度の水準はこの種類の測定法でこれまで達 成できなかった目標である。

以下の実施例は本発明を例証するものである。

次の特別の条件と試薬を利用し、米国特許第Ｋｉｔ　（＃　Ｎ　８０１−００４ ３）の製品報告に記述の方法に従った。

プラスミド（大部分の旧Ｖｌゲノムが組み込まれるプラスミドをｐＢＨｌｏ−Ｒ ３と称する）に組み込まれたＨ［Ｖ　　ＩのＧＡＧ　ｐ１７領域にある１０３塩 基配列を下に示すプライマーＡとＢを使用して増幅した。

５　’　−ＴＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＧＡＧＣＴＡＧＧプライマーＡ ５　’　−ＴＣＴＧＡＡＧＧＧＡＴＧＧＴＴＧＴＡＧＣブライマーＢ プラスミドｐＢＨ１０−Ｒ３の連続希釈液（ＩＸＩＯ＋７、ＩＸ　１０”、１ｘ 　ｌ　Ｑ　＋　６、Ｉ　Ｘ　１０”、ｌＸｌ０″３、ｌ　Ｘ　１０”、ｌ　Ｘ　 １０”。

及び０コピー）の一部分をＰＣＲを使用して増幅した。各部分をｄＡＴＰ　　ｄ ＴＴＰ、　ｄＣＴＰ、及びｄＧＴＰの各々が２００μＭ１　プライマーＡとプラ イマーＢの各々が１．０μＭであり、及び１μ９のヒト胎盤ＤＮＡ／反応物と２ ．５単位のＴＡＱポリメラーゼを含む緩衝液と合併して１００μＱの全反応液量 とした。

次いで反応混合物を製品報告に記載された三拾（３０）回の温度循環に置いた。

この方法により、Ｉ　Ｘ　１０”〜ｌ　Ｘ　１０”と推定される標的分子の数の 増加が起こった。

Ｂ、溶液サンドウイツチノ１イブリダイゼーションｌ）変性 １．５ｍＱのエツベノドルフ管中で上記試料部分の各々から得られた１０μａの 増幅した標的ＤＮＡと３０μａのＨ，Ｏを合併し、沸騰水浴中にｌＯ０分間置た 。次いで管を冷水浴（４°Ｃ）に移して２分間置き、次いでミクロ遠心分離機で １０秒間遠心分離した。

２）ハイブリダイゼーション 重複した試料につき実験するため変性した試料を二つの２０μＱの部分に分けた （エツペノドルフ管中で）。３７°Ｃで１０分間予め平衡化した１００μａのハ イブリダイゼーション混合物を添加した。ハイブリダイゼーション混合物（ＨＭ ）は１９８７μＱのハイブリダイゼーション緩衝液、１２．４μａのアルカリホ スファターゼ灯標検出剤プローブ（６，２Ｘ１０−”＋ｎｏＱｅ）　、１．５μ Ｑのビオチニル化捕捉ズローブ（４，５ＸｌＯ−”ｍｏ（ｌｅ）　、及び４０ｕ Ｑのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の５０ｍｇ／ｍｆｆ溶液を合併して調製した 。プローブの配列を下に示す。ハイブリダイゼーション緩衝液（ＨＢ）は３ｒａ Ｑの２０Ｘ　　ＳＳＣ（ｐＨ７，０）　、Ｏ，ｌ＋ＱのＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１０ ０，９〜ｌＯのエトキシ単位を含むアルキルアリールポリエーテルアルコール、 １．０ｍＱの脱イオンしたホルムアミド、６−３７５ｍＱのＨ，Ｏｌ及び２５μ ａの１．ＯＮ　ＨＣＱを合併して調製した。試料は３７℃で１０分間ハイブリダ イズした。

５　’　−ＣＣＣＡＧＴＡＴＴＴＧＴＣＴＡＣＡＧＣＣＴＴＣＴＧ検出剤プロー ブ ５　’　−ＣＡＧＧＣＣＡＧＧＡＴＴＡＡＣＴＧＣＧＡＡＴＣＧＴ捕捉プローブ Ｃ０固定化と検出 上述のように調製したハイブリダイズした試料溶液を三つの異なる固体支持体、 すなわち上述のストレプトアビジン被覆酸化クロム粒子、ストレプトアビジン被 覆ミクロ滴定板、及びストレプトアビジン被覆膜を使用して固定化した。

各々の標的核酸増幅希釈水準の溶液サンドウィッチ／％イブリダイゼーション混 合物の１２０μＱ部分を米国特許第４．６６１．４０８号に記述のように調製し たストレプトアビジン被覆酸化クロム粒子（１２０μｇ）の１２μＱに添加した 。次いで試料を３７℃で１０分間インキュベートし、ミクロ遠心分離機で５秒間 遠心分離し、コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）磁気ラックに２５℃で２分間置いた 。ベレットを２５°ＣでｌＸ５ＳＣ（ｐＨ７，０）及び０．１７％Ｔｒｉｔｏｎ 　Ｘ−１００を含む洗浄用緩衝液の２００μａを添加し、混合し、試料を磁気ラ ック中に２分間置き、洗浄用緩衝液を除く手順で２回洗浄した。

検出は１Ｍジェタノールアミン（ｐＨ８，９）　、５　ｍＭ　ＭｇＣＱｆｆｉ、 ２ｍＭ酢酸亜鉛、２ｍＭＮ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸 （ＨＥＤＴＡ）　、及び２００μＭ４−メチルアンベリ７エリルホス７エー）　 、！ｌ：　２００μＭｐ−二トロフェニルホスフェートをそれぞれ蛍光検出と色 原体検出用として含む５０μＱのアルカリホスファターゼ基質溶液を各試料溶液 に添加することにより達成された。試料は３７℃で２時間インキュベートした。

蛍光検出のため、ｌＯμａの各試料を３９０μＱの水で希釈した。３６５ｎｍで 励起し、４５０ｎｍで発光する蛍光を測定することにより、各試料から発生する 蛍光シグナルを５ＰＥＸ　Ｆ　２１２分光蛍光光度計で測定した。

色原体検出には、ｐ−ニトロフェノールの存在を４０５ｕｍに８ける試料の吸収 を測定することにより検出した。

ストレプトアビジンを次のようにミクロ滴定板に被覆した。すなわち、ｐＨ９， ６の１１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液で調製したストレプトアビジンの１０μｇ／ｒ ｎＱ溶液の１００μａをミクロ滴定板の多槽に添加し、４°Ｃで一晩（１６時間 ）結合させた。次いで多槽を１５ｍＭのクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化 ナトリウムからなり、及び０．１７％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む洗浄用緩衝 液で２５°Ｃで３回洗浄した。次いで槽を２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と ０．０１％チメロサールを含むＩＸリン酸緩衝液添加食塩水（ＰＢＳ）　（ｐＨ ７，４）の３００ｕｇを添加して封鎖し、３７℃で２時間インキュベートした。

ミクロ滴定板はこの緩衝液中で４℃で必要時まで保存し、その時点で２５°Ｃで 洗浄用緩衝液で１回洗浄しｔこ　。

各々の標的核酸増幅水準の溶液サンドウィッチハイブリダイゼーション混合物の １００μＱをミクロ滴定板の個々の槽に添加し、３７℃で１時間インキュベート した。次いで多槽を２５℃で洗浄用緩衝液で３回洗浄した。４−メチルアンベリ フェリルホスフェート又はｐ−ニトロフェ；ルホスフエートのいずれかを含む基 質緩衝液（上述の通り）の１００μＱをミクロ滴定板の多槽に添加した。板を３ ７°Ｃでインキュベートした。４−メチルアンベリフェロンの形成による蛍光を ３時間後上述のように測定し、及びｐ−ニトロフェノールの存在を２．５時間後 分光光度計で４０５ｕｍにおける試料の吸収を測定することにより検出した。

３）膜装置における固定化と検出 膜装置を上記出願人譲り受は人の係属中出願に記述のように調製した。この測定 の目的のため、Ｉ　Ｘ　ＰＢＳを含む２μα量中５０μ９のストレプトアビジン を装置の透過性上部膜に斑点状に付けた。膜を３７°Ｃで５分間乾燥した。次い でＩＸＰＢｓ中５％魚ゼラチンの５００１１βを各膜に添加し、３７℃で一晩イ ンキユベートした。次いで装置を上記出願人譲り受は人の係属中出願に記述のよ うに組み立てた。

固定化のため各々の標的核酸増幅水準の溶液サンドウィッチハイブリダイゼーシ ョン混合物の１００μＱをＨｅｒｐｔ−ｒａｎ”で４００μａに希釈し、個々の 膜装置に添加し、これを２５℃で１０分間静置した。洗浄用緩衝液（０，０５％ Ｔｗｅｅｎ”２０を含む０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ９，５）の２００ｕりを添 加し、装置を通じて流した。次いで基質溶液（出願人譲り受は人の係属中出願に 記述のようにＢＣＩＰ／　ＮＥＴを含むｐＨ９，６のＯ，ＩＭＴｒｉｓ）を各装 置に添加し、次いでこれを２５℃で１０分間インキュベートした。次いで別の２ ００μａの基質溶液を各試料に添加し、これを２５℃で更に１０分間インキュベ ートした。２００μＱの停止溶液（１，ＯＮ　ＨＯ２）を各試料に添加した。

膜の中心における着色スポットの存在は陽性反応の指標であった。

実施例　■ Ｈｎ　Ｉ　ＤＮＡの検出−比較実施例 Ａ、増殖した標的ＤＮＡの固定化 実施例Ｉにおける各試料部分からの増幅した標的ＤＮＡを最初に５μＱの各希釈 反応物を９５μＣの０．２Ｎ水酸化ナトリウム中で室温で１分装置いて変性し、 次いで反応生成物をドツトプロット装置を使用して膜を通して濾過することによ りＧＥＮＥ　５ＣＲＥＥＮＴ’ハイブリダイゼーシヨン膜上に固定化した。次い でＰＣＲ法で生成するＤＮＡをＧＥＮＥＳＣＲＥＥＮ表面に保持する。次いでド ツトプロット装置の槽を２００μρの５ＸＳＳＣで洗浄した。次いで膜をドツト プロット装置から除き、３０２ｕｍの紫外光に５分間露出し、これにより膜表面 へＰＣＲ生成物を連結した。

次いで固定化したＰＣＲ生成物と実施例■で利用する検出剤プローブとのハイブ リダイゼーションを密封可能な袋の中で実行した。これは最初に膜を固定化した ＰＣＲ生戒物を５　Ｘ　ＳＳＣ，０，５％ウシ血清アルブミン、０．５％ポリビ ニルピロリドン、及び１％ＳＤＳを含む１ｍ（２の緩衝液中で５０℃で１０分間 予備ハイブリダイズし、次いでアルカリホスファターゼ検出剤グローブをハイブ リダイゼーション用袋Ｊ二２．５ｍＭの最終濃度に添加して実行した。膜を５０ °０Ｔ１５分間ハイブリダイズした。膜を密封可能な袋から除き、膜を１％ＳＤ Ｓを含む２５０＋ｎＱのｌＸ５ｓｃの溶液中で撹拌することにより２回洗浄して ハイブリダイズしないプローブを除いた。更に膜を１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ１００ を含ム２５０ｍＱのｌＸ５ＳＣ中で４５℃で５分間撹拌して２回洗浄した。

最後に膜を２５０ｍ１２のｌＸ５ＳＣ中で室温で５分間撹拌して１回洗浄した。

Ｂ、検出 ハイブリダイズしたグローブを８ｍ（ｌの発色用緩衝液（５０ｍＭ　ＮａＣｌ２ ．１０ｍＭ　ＭｇＣＱｚ、及びＮＢＴとＢＣＩＰの各々の１０μｍを含むｌｏｍ Ｍ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ９，６））中に膜を置いて検出した。反応物を３７℃で３０ 分間インキュベートした。ＰＣＲ反応生成物にハイブリダイズしたプローブをそ のアルカリホスファターゼ活性により生成する色素の析出により膜上で見えるよ うにした。

この実験の結果とこの発明の測定法を利用して実施例Ｉで得られたデータを第工 表に要約して示す。ＰＣＲ，この発明の測定法と組み合わせる溶液サンドウィッ チ測定法を使用した場合、ＰＣＲ増幅法をドツトプロット測定法と組み合わせた 場合より驚くべき大きな感庸が得られる。

ドツトプロット直接測定法においては、非特異的起源のバックグラウンドが予め 増幅したｐＢＨｌｏ−Ｒ３標的ＤＮＡの１０００コピーの水準以下に検出を弱め る。

第１表 直接法「ドツトプロットＪ　　　１０００　　−　　　　３０　　６時間この発 明 ・ミクロ滴定板　　　　　　１０００　　１００　　　３０　　６時間註：括弧 内の数値は各々の測定法と固定化／検出法における各測定点で増幅反応物量の５ ％のみを使用した事実から表される大略の水準の感度を示す。

国際調査報告 １・１・・醪・６＋１１＾ＯＩ＋・ＣＩ＋・”ＮＯＰＣＴ／’［５８９／ｌ’ｌ １９７６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（Ａ）標的核酸を−本鎖にし、 （Ｂ）予め選択した核酸中に含まれる少なくとも一つの特定の核酸配列を （１）鎖を各々の異なる特定の増幅をする配列のための二つのオリゴヌクレオチ ドプライマーで、各々の異なる増幅をする配列のため各核酸鎖と相補的な各プラ イマーの伸長生成物が合成される条件下で処理し、この場合前記プライマーは各 々の特定の配列の異なる鎖と充分相補的であるように選択され、それによりそこ でハイブリダイズされて一つのプライマーから合成された伸長生成物はその相補 体から分離したとき、他のプライマーの伸長生成物の合成のための鋳型としての 役割をすることができ、 （２）プライマー伸長生成物をそれらが合成された鋳型から分離して−本鎖分子 を生成させ、及び（３）段階（２）で生成した−本鎖分子を段階（１）のプライ マーで、段階（２）で生成した−本鎖の各々を鋳型として使用してプライマー伸 長生成物が合成される条件下で処理し、 （４）段階（２）と（３）を反復して検出及び／又は測定のため充分量のプライ マー伸長生成物を生成させることにより増幅し、 （Ｃ）既階（Ｂ）（４）の生成物を−本鎖にし、（Ｄ）段階（Ｃ）の生成物を溶 液中で捕捉及び検出剤プローブと接触させ、この場合前記捕捉プローブは両プラ イマーにより限定される核酸配列を含まないプライマー伸長生成物の部分と相補 的であり、前記検出剤のプローブは補足プローブと両プライマーにより限定され る核酸配列を含まないプライマー伸長生成物の部分と相補的であり、並びに捕捉 及び検出剤プローブは同じ核酸鎖と相補的であり、 （Ｅ）段階（Ｄ）のサンドウィッチ生成物を捕捉プローブのアンカー基と相互作 用することができるアンカー受容体基をその表面に持つ固体支持体と接触させる ことにより固定化し、 （Ｆ）すべてのハイブリダイズしていないプローブを除き、及び （Ｇ）固体支持体上に固定化した検出基を検出及び／又は測定する段階からなる 予め選択した配列を含む核酸を含むのではないかと思われる試料中の予め選択し た核酸配列の検出及び／又は測定のための核酸プローブ測定法。 ２．固体支持体は装置に含まれる選択的に透過性の膜であり、前記装置は（ａ） 付着した捕捉試薬を持つ透過性膜、（ｂ）中間層、及び（ｃ）吸着層からなる多 重層を持ち、ここで層（ｂ）は層（ａ）と層（ｃ）に直接通じており、層（ｂ） は選択的に透過性の膜でそこを通る少なくとも一つの穴を持つ改良がなされてお り、穴は捕捉試薬の直下にあり、及び前記穴の面積又は多数の穴の合計した面積 は捕捉試薬により覆われる面積より小さい請求の範囲第１項記載の測定法。 ３．予め選択した核酸配列はＨＩＶ　Ｉ　ＤＮＡに含まれる請求の範囲第１項記 載の測定法。