JPH07502880A - 電気穿孔によるトウモロコシ細胞の安定した形質転換方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｍ… 本発明は、繁殖力があるトランスジェニック（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）　トウモ ロコシ植物体を再生産できる、電気穿孔によるトランスジェニックトウモロコシ 細胞の製造に関するものである。

ｌ肛立茸１ 植物の遺伝子工学は、遺伝物質（通常、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）かりボ核酸 （ＲＮＡ）の形態である）の単離と操作、それによる植物体や植物細胞へのその 遺伝物質の導入を伴い、この遺伝子工学は、現代農業と植物栽培に少なからぬ将 来性を提供する。例えば、農作物の価値の増大・高生産性・飼料価値の増加・生 産コストの減少・害虫への抵抗性・ストレスへの耐性・干ばつへの抵抗性の増加 などの有益な特質は、薬品やその他の有用な化学物質の生産などと同様に、全て 遺伝子工学技術によって潜在的に達成可能である。

一度、ある遺伝子が特定され、合成もしくはクローン化・工業化されても、形質 転換した（直物体の子孫に安定して遺伝させるためには、遺伝子が対象となる植 物のゲノムに組み込まれる必要がある。

一時的形質転換は導入したＤＮＡの欠損を生じ、トランスジェニック植物体を生 み出すには、はとんど役にたたない。安定した形質転換は、組み込まれた配列が トランスジェニック植物体の子孫に伝えられ存在するために、機能的な遺伝子配 列の染色体への組み込みを必要とする。ここでは、染色体への組み込みとは、プ ラスミド染色体への組み込みも含んでいる。プラスミド染色体に組み込まれた遺 伝子は母性遺伝の特徴を示す。トランスジェニックトウモロコシ植物体を製造す るには、安定した形質転換細胞が、繁殖力のあるトランスジェニック植物体を生 じさせる能力をも持たねばならない。これとは対照的に、一時的形質転換では、 導入されたＤＮＡを最終的には失い、トランスジェニック植物体を生成すること にはほとんど役にたたない。しかしながら、安定した形質転換も含めた種々の条 件の最適化と遺伝子発現を評価する際に、一時的形質転換は重要なことである。

電気穿孔は、外来ＤＮＡを様々な植物種に導入するのに用いられてきた。これは 、原形質体をＤＮＡの受容体として使用することで、はとんど他を排して行なわ れてきた方法である。以下の論文を参照のこと。Ｍ、Ｅ、Ｆｒｏｍｍ他、ネイチ ャーＮａｔｕｒｅ。

ｌ上９，７９１　（１９８６）；Ｈ，Ｊｏｎｅｓ他、ブラントモルバイオ　Ｐｌ ａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、上３，５０１　（１９８９）；Ｈ，Ｙａｎｇ他、 プラントセル　−Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ−且旦旦旦工１１上、ヱ、４２１　（１ ９８８）、Ｌかしながら、この手法は、多数の植物種において困難に遭遇した。

一般的に、単子葉植物の原形質体は、双子葉植物による原形質体に比べて、生成 や取り扱いが難しい。単子葉植物の原形質体は、単離し生存可能な状態に保持し ておくのはできるが、様々な環境において簡単に分裂する双子葉植物とは対照的 に、正常な細胞壁を再１岡築し、分裂することはほとんどない、穀物の遺伝子工 学における原形質体の使用に関して、ある指導的な１４学者はトウモロコシの形 質転換について、以下のように述べている。

トランスジェニック穀物が、イネの原形質体から再生可能であったり、人が他の 穀物からもそれが可能であると期待する理由があるとしても、仮に穀物の遺伝子 工学が、この（原形質体の使用）退屈で、予測不能、かつ、信頼できない手法に 頼らざるを得ないとすれば、不運なことであろう。

Ｔ、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ、バイオテクノロジー　Ｂｉｏｔｅｃｈｎ。

Ｌ１且ｚｌ、５３５　（１９９０年６月）現時点において、形質転換したトウモ ロコシ原形質体から繁殖力のあるトランスジェニック植物体を生じさせた報告は 、ただ一つである。Ｇ、Ｄｏｎｎ他、７０、　盲・　び　に　る　、４’　Ａｂ ｓｔｒａｃｔｓ　ＶＩＩｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ。

ｎａｌ　Ｃｏｎ　ｒｅｓｓ　ｏｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｔｉ５ｓｕｅ　ａｎｄ　Ｃｅ１ ｌ　Ｃｕ１ｔ、、アムステルダム　Ａ２−３８　（１９９０年６月２４日〜６月 ２９日）。形質転換は、ポリエチレンゲルコール（ＰＥＧ）によって媒介された ＤＮＡの原形質体への取り込みにてなされたもので、電気穿孔を用いなかった。

一方、Ｚｅｌ−エユＵ原形質体、もしくは、電気穿孔による基底葉節の細胞ある いは組織への外来ＤＮＡの導入を発表した報告は数多くある。

これらの報告は、目的物質の一時的形質転換、または、再生不能あるいは繁殖不 能であるが組織の安定した形質転換のいずれかを含んでいる。電気穿孔を用いた 植物原形質体の生存能力と再生能力の保持に関する困難性については、細胞壁の 大部分を残した細胞にＤＮＡを電気穿孔で入れることによって回避できるかも知 れない、この試みは、今のところ１つの例外を除いて成功していない、Ｊ、５Ｌ ｅｅ他、　’　−−Ｋｏｒｅａｎ　Ｊ、ＧｅｎｅｔｉｃｓＬ　１１，６５　（１ ９８９）は、タバコ（双子葉植物）の細胞での安定的な形質転換の成功を報告し ている。これらの細胞は、電気穿孔の前に酵素による処理を受けていない、他の 報告では、導入したＤＮＡの一時的発現のみを発表している。

Ｍａｒｉｋａｗａ他、’−Ｇｅｎｅ、４↓、１２１　（１９８６）は、マセロザ イム（ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ）を用いて、直接タバコの葉から細胞懸濁液を調製 している。繁殖性も再生性も確認されていないとはいえ、その細胞懸ＩＡ液は、 電気穿孔による一時的形質転換を示す、双子葉植物の電気穿孔に先立ち、ペクチ ノリティック（ｐｅｃｔｉｎｏｌｙｔｉｃ）酵素による細胞の処理が、砂糖大根 の懸濁組織の一時的形質転換を生じると、Ｌｉｎｄｓｅｙ他、ブラントモルバイ オ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ　、１旦、４３　（１９８７）により 報告されている。しかしながら、砂糖大根におけるペクチナーゼ（ｐｅｃｔｉｎ ａｓｅｌ　もしくはペクトリアーゼ（ｐｅｃｔｏｌｙａｓｅ）処理後の細胞は、 原形質体を用いた場合に比べて、非常に低い水準でしか一時的形質転換しない。

この実験に続（このグループによる砂糖大根の形質転換の研究は、原形質体の使 用に戻っている＊　Ｌｉｎｄｓｅｙ他。

プラント　”　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅ　ｏｒｔｓ　、旦、７１　（１９８ ９）　。

電気穿孔は、唯一ではないが、高頻度の植物形質転換のための数少ない方法の一 つである。従って、ＤＮＡが安定して植物ゲノムに組み込まれ、その転換植物の 子孫に遺伝するよう、穀物、特にトウモロコシを異型ＤＮＡでもって形質転換す るために、この技術を適用する方法が必要である。

！附五盟１ 本発明は、電気穿孔を用いて、Ｚｅａ　ｍａ　ｓのような単子葉植物を、予想を はるかに越える頻度で形質転換が起こす手法を提供する。本発明は、本発明の転 換細胞による、トランスジェニックトウモロコシ植物のような繁殖力のある単子 葉植物を提供する。また、本発明は、細胞の生存能力や再生能を十分に保持しつ つ、単子葉植物細胞の組換えＤＮＡ　（分野によっては、”異型”、”外来”。

あるいは”外因性の”ＤＮＡとも言われる）の導入に対する感受性を高める方法 を提供する。ここで使用されている再生能力とは、細胞が植物体へ再生する能力 のことだけではなく、再生された植物体が繁殖能力を有し、組換えＤＮＡをその 子孫に伝えていくことでもある。

本発明は、電気穿孔による単子葉植物の形質転換に際して、原形質体を使用する 必要性を取り除くものである。本発明は、電気穿孔による形質転換の感受性が未 処理細胞よりも十分高くなるように、目的の単子葉細胞、例えば、Ｚｅａ　ｍａ 工Ｌ」−細胞の細胞壁を消化する多情分解酵素を利用している。本発明によれば 、目的とする細胞は高頻度で形質転換し、同じ組織から原形質体に比較して、生 存能力と再生能力を十分に改善されている０組換えＤＮＡによって一度形質転換 されると、細胞集団のかなり多くの細胞が繁殖力のあるトランスジェニック植物 集団を再生するために使うことができる。

本発明中での”高形質転喚頻度”という用語は、凝集した体積０．１ｍｌあたり ２０００以上に転換区分されることを意味するものとして定義される。この「区 分」という用語の定義は、以下に示しである。

区画！」ＩＬ螢脱朋 図１は、５．８ＫｂのプラスミドｐＰｏ　Ｉ　ＨＹＧ　Ｉ−３の地図（パネルＡ ）、及びハイグロマイシン　Ｂ　（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ　Ｂ）リン酸基転移酵 素のキメラ遺伝子（ＨＰＴ）の部分的制限酵素地図（パネルＢ）を示す。

図２は、６．ｌＫｂのプラスミドｐＢＩＩ２２１の地図（パネルＡ）、及びβ− グルクロニダーゼ（ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）のキメラ遺伝子（ＧＵＳ）の 部分的制限酵素地図（パネルＢ）を示す。

図３のパネルＡは、例３で行なわれたサザン・プロッティングで使用したプロー ブと鋳型ＤＮＡの両方と、ハイグロマイシン　Ｂ（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ　Ｂｌ のキメラの遺伝子を示している。

図３のパネルＢは、例３の形質転換系統１８と４３から取ったサザン・プロッテ ィングの写真である。

大１３乞沈明 本発明は、繁殖力のあるトランスジェニックＺｅａ　ｍａ　ｓ植物体や、細胞や 植物組織、トランスジェニック植物体から派生した種子、同様に、その子孫とそ れから派生した生成物のような植物の一部分を生産する方法を開示している。こ こで生成されるトランスジェニック植物は、Ｚｅａ　ｍ旦上玉種の全ての植物が 対象でありフィールド挿トウモロコシ、爆裂種トウモロコシ、せ味種トウモロコ シ、硬粒種トウモロコシ、馬歯種トウモロコシを含む。

”トランスジェニック”とは、ここでは、細胞、細胞系統、カルス（ｃａｌｌ、 ｕｓ）、組織、植物体の一部、または、自然に生起する過程と対立する、遺伝子 工学によって植物の遺伝物質が導入された植物体、あるいは、初期に遺伝子工学 の処理にて植物種に導入され、その後、有性的または無性的に細胞交配や細胞分 裂によって後の世代に移された組換えＤＮＡを含む植物体を包含して使用してい る。

”遺伝性を有する”という文言は、植物の完全な性サイクルを通してＤＮＡが伝 達されることを意味する。すなわち、普通のトウモロコシで起きているのと同じ ような方法で、ある植物からその配偶子を介してその子孫植物に伝えられること である。”遺伝性を有する”という文言は、ここでは、メンデル性遺伝に加えて 母性遺伝や父性遺伝も含んだものとして使っている。

本発明に係るトランスジェニック植物は、以下の手順によって生成可能である。

つまり、 （ｉ）Ｚｅａ　ｍａ　ｓの胚状のカルスからの懸濁培養の作成。

（ｉｉ）上記細胞の細胞壁の部分的酵素分解。これは、上記の細胞な”形質転換 能のある細胞”と称される新規な細胞を生成するために、ある種のペクチン分解 酵素に制御された下でさらすものである。

形質転換能のある細胞とは、電気穿孔によるＤＮＡの取り込み・発現・組み込み 能力が増加したものを言う。

（Ｌｉｉ）前述した形質転換能のある細胞を組換えＤＮＡを用いて電気穿孔で形 質転換を行なう。

（ｉｖ）形質転換された細胞を任意に特定したり、あるいは選択する（Ｖｌ形質 転換細胞からの繁殖能を有するトランスジェニック植物体の再生。

本発明に係るいくつかの植物体は、繁殖力のあるトランスジェニック植物からつ くられたトランスジェニック種子から作ることが可能であるし、あるいは、従来 の雑種形成技術を、上記の組換えＤＮＡを含む、トランスジェニック植物からの 商用雑種の種子の開発に使うことも可能である。

それ故、本実施例において、本発明はＺｅａ　ｍａ　ｓ−細胞集団を生成する方 法を供給する。これらの集団の内のかなりの数の細胞が、安定した形質転換にな る。

その方法は、以下の工程から構成されている。

（ａ）固形の組織培養培地での、胚種のＺｅａ　ｍａ　ｓカルス組織を培養する （ｂ）Ｚｅａ　ｍａ　ｓ細胞の懸濁培養細胞を生成するため、上述の培養したカ ルス組織を液体増殖培地へ転換する、および（ｃ）生存可能なＺｅａ　ｍａ　ｓ 細胞集団を生成するために、水成の浸透性物質の中で、少なくとも一種類のペク チン分解酵素を使用してカルスＺｅａ　ｍａ　ｓ−細胞集団を培養する。ここで は、トランスジェニックＺｅａ　ｍａ　ｓ細胞集団を生成するため、電気穿孔に よって、上述の細胞の中のがなりの数が、組換えＤＮＡを伴った安定した形質転 換が可能であり、また、上述のトランスジェニック細胞のかなりの数が、遺伝性 があって上述の組換えＤＮＡを含む繁殖力のあるトランスジェニック１１見−エ 盈工上植物集団に再生可能となっている。

好ましくは、未成熟のトウモロコシの胚がらＺｅ且−二互Ｕカルス組織培養をつ くり、また、スｅａ　ｍａ　ｓ、カルス組織は、以下、この用語が採用され、定 義されるごとく”もろい”　（これをタイプＩＴカルスとする）。また、工程（ ｃ）に先立ち、培養Ｚｅａｃａｌｌ細胞を脱凝集、さらには散乱させて酵素反応 できる細胞壁表面積を増やすことが行なわれる。例えば、培養細胞をふるにかけ たりフィルターをかけることである。

なお、Ｚｅａ　ｍａ−ｓ細胞集団を形質転換、もしくは再生する能力に関して、 ここで用いられている”かなりの数”という文言は、以下の実験例を参照するこ とで理解される。

本発明は、また、上述のＤＮＡによって安定に転換されたトランスジェニックＺ ｅａ　ｍａ　ｓ細胞集団を生成するため、組換えＤＮＡの存在下、侵透性物質で 緩衝された水、＠液中で酵素反応し、電気穿孔によって形質転換したＬｉｉ−二 重Ｕカルス組織を提供する。そして、遺伝性の上記ＤＮＡから成るトランスジェ ニックＺｅ旦−ｍｅ工Ｌ」−植物集団が、上記のカルス組織から再生可能なよう に、上述のトランスジェニック細胞からのカルス組織を再生する。

本発明は、また、このトランスジェニックのカルス組織から再生された植物体に よってつくられたトランスジェニックＺｅａ　ｍａＬ植物体を提供する。

ここで使用されている”浸透性物質”とは、細胞の生存能力を維持するため、細 胞外媒質と形質転換能力のあるＺｅａ　ｍａ　ｓ細胞の内部との間の浸透圧のバ ランスを保つことができる。細胞外媒質に付加される−あるいはそれ以上の化合 物のことである。浸透性物質としては、フルクトース（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）やシ ュークロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）などの糖類、また、グリセロール（ｇｌｙｃｅ ｒｏｌ）やソルビトール（ｓｏｒｂｉｔｏｌ）、マンニトール（ｍａｎｎｉｔｏ ｌ）などの多価アルコール（Ｃｍ−Ｃ８）などが好ましい。

本形質転換方法において開始物質として扱い易いとされたム旦１！旦細胞は、懸 濁培養の前後及び以下に詳述する選択において再生能力を保ち続けるカルス細胞 である。一般的番乙これらの細胞は、まだ最終的に分化していない細胞を含む分 裂組織に由来する。トウモロコシにおいて、このような組織は、幼形葉脚部位・ 未成熟な房・未成熱狂・成熱狂・子葉組節にて発見された組織にて構成される。

好ましくは、未成熱狂が使われる。

ｌ工覧叉囲ｌ和茄 このようなトウモロコシ組織からカルスを調製し保持する方法は、技術としてよ く知られており、その詳細は文献に記載されている、Ｒ，Ｐｈ１ｌｌｉｐｓ他に よる　ウモロコシ　び　の　Ｃ。

ｒｎ　ａｎｄ　Ｃｏｒｎ　１ｍ　ｒｏｖｅｍｅｎｔ　、Ａｇｒｏｎｏｍｙ　５ｏ ｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ（第３版、１９８８）の３４５〜３８７ペー ジを参照。

再生可能なトウモロコシ懸濁培養細胞は、多くの植物組織から間することができ るが、本発明で有益な細胞培養は、好ましくは、トウモロコシの実の核から胚が 約１ｍｍから３ｍｍの長さのときにとった未成熟トウモロコシ胚からつくられた カルスから由来するものである１通常、受粉後約９〜１４日経つとこの長さにな る。無菌条件下で、胚は胚軸を下にし、胚盤を上にして従来の固形培地に植え付 けられる。数日から２．３週間後には、カルス組織が胚盤から現われる。カルス が十分に成長した後に、胚盤からの細胞分裂増殖が、もろさと明確な胚の存在に 対して評価される。”もろさ”とは、細胞を傷つけることなく組織を簡単に散乱 することができるという意味である。この形態を示す組織は、次に新しい媒質に 移され、約２週間ごとに決められたように植え換えられる。

カルスの開始培地には固形培地が好ましい。これは、カルスは、液体培地では簡 単には開始できないからである。開始／持続培地（Ｆ培地）は、一般的には、Ｃ ，Ｌ、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ他によるプランタ　Ｐｌａｎｔａ　、１旦４，２０７ 　（１９８５）に記載されたＣ、Ｃ，Ｃｈｕ他によるＳｃｉ、Ｓｉｎ、　Ｅｌ、 上１．６５９　（１９７５）のＮ６　５ａｌｔ、あるいは、Ｔ、Ｍｕｒａｓｈｉ ｇｅ他による２五ｌ」ユ」」ユニＰ　ｌ　ａｎｔ、上５，４７３　（１９６２） のＭＳ　５ａｌｔによる。基本培地は、シュークロース（ｓｕｃｒ。

ｓｅ）　、及び、一般的には、２．４−ジクロロフェノキシ酢酸（２゜４−　Ｄ 　）　（ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ）あるいはグ イカンパ（ｄｉｃａｍｂａ）のようなオーキシンにて補われる。Ｌ−プロリンや カゼイン加水分解産物のような補足物質は、カルス培養の開始頻度、形態、そし て、成長を改善させることがわかっている。培地は、一般的に暗部において維持 されるが、低レベルの光があってもよい、生育と繁殖に必要な合成ホルモン２． ４−Ｄの水準は、一般的には、１３９５Ｘ約０．３〜３．０ｍｇ／ｌである。懸 濁細胞の製造のための正確な方法は、本発明では重要なことではない、約３カ月 から約３６カ月まで経過したもろい胚種カルスは、十分高い水準の再生性を生起 することがわかっており、現在、利用されている。

一度確立されると、例えば、４〜６力月経過後、タイプＩＩのカルスは、液体増 殖培地へ移される。再生可能な懸濁細胞培養の製造のための方法と参照文献とし て、Ｃ，Ｅ、Ｇｒｅｅｎ他による二携工白ｉｉ″のためのトウモロコシ　Ｍａｉ ｚｅ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｌ。

１ｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃ、Ｂｉｏｌ、Ａｓ５ｏｃ 、（１９８２）の３６７〜３７２ページ、Ｒ，Ｐｈ１ｆｌｉｐｓ他によるコーン 　びコーンの　Ｃｏｒｎ　ａｎｄＣｏｒｎ　１ｍ　ｒｏｖｅｍｅｎ　、Ａｇｒｏ ｎｏｍｙ　Ｓｏｃ。

米国、（第３版、１９８８）の３４５〜３８７ページ、そして、工ｓ　ｏｆ　Ｐ ｌａｎｔｓ　、Ｖｏｌ、１．実験手法及びその応用（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐ ｒｏｃｅｄｕｒｅ　ａｎｄ　ＴｈｅｉｒＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、Ａｃａｄ ｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９８４１の１５２〜１５８ページがある。

懸濁培地として、典型的な液体成長媒質は、固形カルス誘導培地の組成に類似し ている。アブシジンｕ（ａｂｓｃｉｓｉｃ　ａｃｉｄ、　ＡＢＡ）　（１０−’ Ｍ）が再生能力を増加させ、培地の活力を高めるため液体増殖培地に加えられる 。カルスは、液体培地に入れる前には、こし器にかけないほうがよい。。

液体培地での培養は、活発な成長と再生特性を保持するため適切に植え換えが行 なわれる。好ましい例として、培養は、−週間に一度、新しい増殖培地とともに １．８〜９希釈液に植え喚える。

個々の懸濁培養細Ｍｌの再生能力は、そこからサンプルをカルス保持培地に移し 、続いて再生培地（シェークロース（ｓｕｃｒｏｓｅｌを増加し、２．４−Ｄを 減少させたもの）で培養することでカルスを成長させ、芽や、根、苗の形成を確 認することによって簡単に決定できる。カルス組織についてシャーレ単位、もし くはダラム増加重量（ｇｒａｍ　ｆｒｅｓｈ　ｗｅｉｇｈｔ）あたり生じる苗の 相対的な数は、再生能力の大ざっばな量計算として使い得る。一般には、培養液 は、１〜６グラムあたり少なくとも１つのカルス組織、好ましくは、１〜２グラ ムあたり１つのカルス組織を生成する。

ＩＩ　ン　に　われるＤＮＡ ここで使われている”組換えＤＮＡ”という用語は、何らかの種から単離された ものか、あるいは派生したＤＮＡの配列を示しており、単離された後、化学的な 変化が行なわれ、その後、Ｚｅａ　ｍＵ盈細胞に導入される。

このようなりＮＡの例としては、与えられた有機体の中で有益な一部分として特 定され、次に、本質的に純粋な形で化学的に合成されたＤＮＡの配列を含む、あ る種から単離された組換えＤＮＡの例としては、化学的手段、例えば、制限酵素 を用いて上記の種から切除あるいは取り除かれたされた有用なりＮＡ配列がある 。そして、本発明で使うために、さらに操作、つまり、増幅させたりできる。

それ故、”組換えＤＮＡ”という用語は、合成したＤＮＡ、半合成りＮＡ、生物 学的種から単離したＤＮＡ、導入ＲＮＡから派生したＤＮＡを完全に包含する。

一般的に、このＤＮＡは、もともとＤＮＡの受容体であるＺｅａ　ｍａ　ｓの遺 伝子型には存在していなかったものであるが、与えられたＺｅａ　ｍａ　ｓ遺伝 子型から遺伝子を単離し、続いて複数の遺伝子のコピーを同じ遺伝子型に導入し 、すなわち、与えられた遺伝子生産物の水準を向上させることは、本発明の範囲 内にある。

このＤＮＡは、限定されるわけではないが、植物由来であろうと植物由来でない 場合、例えば、バクテリアや酵母、動物細胞やウィルス由来のものも含む。また 、同あるいは異Ｚｅａ　ｍａ　ｓ遺伝子型に由来する遺伝子を含んで、修飾遺伝 子・部分的遺伝子・キメラ遺伝子を含む。

ここで形質転換に使われている組換えＤＮＡは、環状鎮か直鎮状、また、２本川 もしくは１本鎖ＤＮＡである。一般的に、ＤＮＡは、組換えプラスミド形状をと り、形質転換トウモロコシのゲノム内にあるＤＮＡの発現を促進する規則正しい 配列を有する、有益な異型ＤＮＡのコーディング領域を持っている０例えば、組 換えＤＮＡ自身、Ｚｅａ　ｍａ　ｓ内で活動的なプロモーターにて構成されてい たり、形質転換の樟的であるＺｅａ　ｍａ　ｓ遺伝子型内に既に存在するプロモ ーターを利用している。

ある植物を形質転換できるＤＮＡを組み立てるための構成や方法は、当業者には よく知られている。そして、同じ構成や方法が、ここにおいても有益な組換えＤ ＮＡをつくるのに利用される。ＤＮＡの特異な構成は、本発明において主要な事 柄ではないし、本発明では、使用された特異な形質転換ＤＮＡ構成に依存してい ない。

Ｋ、Ｗｅｉｓｉｎｇ他のＡｎｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２λ、４２１　（ １９８８）は、適切なりＮＡの構成要素、選択可能な４１ｉ１Ｒ遺伝子、レポー ター遺伝子、エンハンサ−１介在配列などを説明するとともに、構成に対する適 切な参照文献を提供している。

Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、クローニング、マニュアルＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ ｏｎｉｎ　：　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒＭａｎｎｕａｌ　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（第２版、１９８９）は 、適切な構造の方法を提供する。一般に組換えＤＮＡは相対的に小さい、すなわ ち、ＤＮＡの大きさが増大するにつれて増加していくとして知られる、物理的、 化学的もしくは酵素的な退化に対する感受性を最小にするために、約３０Ｋｂ以 下の大きさである。

ここで用いる適切な組換えＤＮＡとは、結果として生じるトランスジェニックト ウモロコシの有益な特徴を供給し、あるいは増強する全てのＤＮＡのことを指す 、ＤＮＡは、食物価もしくは飼料価、除草剤への抵抗性、より高い生産高、害虫 への抵抗性、病原抵抗性などの増加を促進するために、蛋白質かアンチセンスＲ ＮＡ転写物をエンコードしている６例えば、あるＤＮＡは、リシンの生産を増加 させるためのｍＡ遺伝子のような非調節性ＤＨＤＰシンターゼ（ｓｙｈｔｈａｓ ｅｌ遺伝子をエンコードし得るし、バシルス　サーーンジェンシス　Ｂａｃｉｌ ｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ）　（Ｂｔ）は、昆虫抵抗性のための蛋白 質分解酵素の阻害物質かδ−エンドトキシン（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）をエンコー ドしている。バクテリアのＥＰＳＰ合成酵素（ｓｙｎｔｈａｓｅ）は、グライフ ォセイト（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）の除草剤に抵抗性を持ち、キチナーゼ（ｃｈ ｉｔｉｎａｓｅｌ　もしくはグルカン　エンド−１，３−グルコシダーゼ（ｇｌ ｕｃａｎ　ｅｎｄｏ−１，３−β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）は、殺菌剤の役割 を果たす、このＤＮＡは、種子の貯蔵蛋白質の一つであるゼインタンパクをエン コードし得る。例えば、分子量１０キロのゼイン蛋白質は、その発現量は核全体 のメチオニンの水準にまで至っているし、どの貯蔵蛋白質にしてもメチオニンや リジンやスレオニン程度まで増加しているのは特に有用である。

転写単位や部分配列として供給されるＤＮＡ配列は別にして、有用なりＮＡは調 節性機能や構造機能を供給するので、転写されない。また、ＤＮＡは、突然変異 体を作り出す遺伝学の道具として振る舞い、および／または、トウモロコシＤＮ Ａの切片の特定、遺伝的印付け、単離を補助するために導入される。これ以外の 例は、先に引用したＷｅｉｓｉｎｇを参照のこと。

植物へ導入された組換えＤＮＡは、さらに、形質転換された細胞の選択が容易に なるように、選択的標識とレポーター遺伝子のどちらか、または両方を含んでい るのが一般的である。あるいは、選択的１識を個別のＤＮＡ切片に載せて運び、 二重形質転換法に用いることもできる０選択的標識とレポーター遺伝子の両方は 、植物内発現できるように、Ｊ切な規則性のある配列を両側に有する。有効な選 択的標識は、本分野においてはよく知られており、例えば、抗生物質や除草剤抵 抗性遺伝子も含まれる。

Ｌ以下♀、１〕 このような遺伝子の特異な例は、先に引用したＷｅｉｓｉｎｇ他に開示されてい る。好ましい選択的標識遺伝子は、太１１工Ｅ、　Ｃｏ１貝に由来するハイグロ マイシンＢリン酸基転移酵素（ＨＰＴ）で、抗生物質であるハイグロマイシンＢ に抵抗性を示す。その他の選択的ｔｊｌｌｌ識は、トランスポゾンＴｎ５　（Ａ ｐｈＩＩ）のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ａｍｉｎｏｇｌｙｃ ｏｓｉｄｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子であり、これは、 抗生物質カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）　・ネオマイシン（ｎｅｏｍｙｃ ｉｎ）、そして、６４１８に対して耐性がある。同様にして、これらのＩｊｌＩ 識は、グライホセイト・２．２−ジクロロプロピオン酸＜ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ 、２．２−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｒｏｐｉｎｉｃ　ａｃｉｄ）、メトトレキセイト （ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、イミダゾリオン（Ｌｍｉｄａｏｚｏｌｉｎｏｎ ｅｓｌ　、サルフォニルウレア（ｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅａｓ）　、ブロモキシ ニル（ｂｒｏｍｏｘｙｎｉｌ）、フォスフイノスリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔ ｈｒｉｃｉｎ）などに対して抵抗性や耐性をコードする遺伝子を含む。これら植 物毒素に対する抵抗性や耐性を授与する選択的標識遺伝子は、結果としてできる 形質転換植物の形で商業的に利用される。この種類の代表的な遺伝子を、下記の 表１に挙げる。

ｌ沢ｌ識」丘ｌ ゛　−、１区１匹班星ｎ１　１胆文見 ネオマイシン　Ｇ　−４１８、Ｐ、Ｊ、　５ｏｕｔｈｅｒｎ　ｅｔリン酸基転（ 多酵素　ネオマイシン、　ａｌ、、　Ｊ、Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ（Ｎｅｏｍｙｃｉ ｎ　ｐｈｏｓｐｈｏ−カナマイシン　、Ｇｅｎ、、１．３２７ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｓｅ　（ｎｅｏ）　）ハイグロマイシン　ハイグロマイシンＢ　Ｙ、５１ｍ１ ｚｕ　ｅｔ　ａｌ、。

リン酸基転移酵素　Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、。

ＩＨｙｇｒｏｆｆｌｙｃｉｎ　ｐｈｏｓｐｈｏ−１０７４（１９８６１ｔｒａｎ ｓｆｅｒａｓｅ （ｈｐｔ　ｏｒ　ｈｇ　ｙｌｌ ジヒドロフォレイト　メトトキセレイト　Ｗ、Ｗ　Ｋｗｏｋ　ｅｔ　ａｌ、。

分解酵素（Ｄｉｈｙｄｒｏ−（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）　ＰＮＡＳ　ＵＳ＾ 。

ｆｏｌａｔｅ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　４５５２（１９８６１（ｄｈｆｒｌｌ ホスフィノスリシン　ホスフィノスリシン　Ｍ、　ＤｅＢｌｏｃｋ　ｅｔ　ａｌ アセチル基転移酵素　（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）　、、　ＥＭＢＯ Ｊ、、６゜（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ　２５１３　（１９８７）ａｃ ｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　（ｂａｒｌ　）２．２−ジクロロ　２．２− ジクロロプロ　Ｖ、　Ｂｕｃｈａｎａｎ−Ｗｏｌプロピオン酸　ピオン酸　１ａ ｓｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、。

デハロゲナーゼ　（Ｄａｌａｐｏｎ）　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

（２，２−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ　５ｕｐｐ、　１３Ｄ、　３３ ０ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｓｅｌ　（１９８９１アセトヒドロキシル酸　スルフォ ニルウレア、　Ｐ、Ｃ，＾ｎｄｅｒｓｏｎシンターゼ　（Ｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒ ｅａｌ　ｅｔ　ａｔ、。

（Ａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙ−ｉｍｉｄａｚｏｌｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ　（Ｕ 、Ｓ、Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ。

ａｃｉｄ　５ｙｎｔｈａｓｅｌ　ａｎｄ　ｔｒｉａｚｏｌｏ−４，７６１，３７ ３）；ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ　Ｇ、ｗ、）Ｉａｕｇｈｎ　ｅｔ　ａｌ系除草剤　 、　、Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ。

２１１、２６６　（１９８８） ５−エノールビルビル−グリフオセイト　Ｌ、　Ｃｏｍａｉ　ｅｔ　ａｌ、。

シキメイトリン酸基　（Ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅｌ　Ｎａｔｕｒｅ、　３１７．７ ４１シンターゼ（ａｒｏＡｌ　（１９８５）ハロアリルニトリラーゼ　ブロモキ シニル　Ｄ、Ｍ　５ｔａｌｋｅｒ　ｅｔ（Ｈａｌｏａｒｙｌｎｉｔｒｉｌａｓｅ ｌ　（ＢｒｏＩＩＩｏｘｙｎｉｌ）　ａｌ、　。

ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ＰＣＴ アセチルーコエンザイム　セソキシデイム、　Ｗ、Ｂ、　ｐａｒｋｅｒ　ｅｔＡ カルボキシラーゼ　（ｓｅｔｈｏｘｙｄｉｍｌ　ａｌ、　。

（Ａｃｅｔｙｌ−ｃｏｅｎｚｙｍｅ　Ａ　ハロキシホップ、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈ ｙｓｉｏｌ、。

ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）　（ｈａｌｏｘｙｆｏｐｌ　９２．１２２０　（１９ ９０）ジヒドロブチロアーチ　スルホンアミド　Ｆ、　Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ　ｅ ｔシンターゼ　（Ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ）　ａｌ、、　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅ ｃ。

（Ｄｉｈｙｄｒｏｐｔｅｒｏａｔｅ　除草剤　Ｂｌｏｌ、。

５ｙｎｔｈａｓｅ　（ｓｕｌ　Ｉ　ｌ）　１５．１２７　（１９９０）３２キロ ドルトン　フォト−トリアジン除草剤　Ｊ、　Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇシステム■ 　ポリペプチド　（Ｔｒｉａｚｉｎｅ）　ｅｔ　ａｌ、。

（３２ｋＤ　ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ　ＩＩ　５ｃｉｅｎｃｅ、　２２２゜ｐｏ ｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　（ｐｓｂＡｌｌ　１３４６　（１９８３）アンスラニレイ ト　５−メチルトリプトファン　に、　Ｈｉｂｂｅｒｄ　ｅｔシンターゼ　（５ −Ｍｅｔｈｙｌｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）　ａｌ、。

（Ａｎｔｈｒａｎｉｌａｔｅ　（Ｕ、　Ｓ、　Ｐａｔｅｎｔｓｙｎｔ、ｈａｓｅ ｌ　Ｎｏ、　４．５８１．８４７）ジヒドロジビコリニック酸　アミノエチル　 にＧｌａｓｓｍａｎ　ｅｔシンターゼ　システィン　ａｌ、。

（Ｄｉｈｙｄｒｏｄｉｐｉｃｏｌｉｎｉｃ　ａｃｉｄ　（Ａｍｉｎｏｅｔｙｌ　 ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ＰＣＴｓｙｎｔｈａｓｅ　（ｄａｐ　Ａｌ）　ｃｙｓｔｅ ｉｎｅ）　ａｐｐｌｎ。

Ｎｏ、　ＷＯ３９／１１７８９ レポーター遺伝子は、与えられた組換えＤＮＡの配列が、トウモロコシの細胞を 形質転換するために使用できるかどうかを決めるために利用ができる。簡単に検 出できる標識蛋白をエンコードするレポーター遺伝子がよく知られている。一般 にレポーター遺伝子は。

受容生物や受容組織に存在しないか、あるいは、発現していない遺伝子である。

そして、レポーター遺伝子は、その発現が何等かの簡単に検出できる性質、例え ば、表現型の変化や酵素活性によってはっきり示される蛋白をエンコードしてい る。このような遺伝子の例は、先に引用したＷｅｒｓｉｎｇ他、に示されている 。

好ましい遺伝子には、　Ｅ、ｃｏｌｉ　のＴｎ９に由来するクロラムフェニコー ルアセチル転移酵素遺伝子（ｃａｔ）、大腸菌のｕｉｄＡ座のβ−グルクロニダ ーゼ（ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）遺伝子、蛍のフオテ　ヌスビラミス　ｈｏ ｔｉｎｕｓ　ｒａｍｉｓに由来するルシフェラーゼ遺伝子が含まれる。レポータ ー遺伝子の発現の検出は、ＤＮＡが受容細胞に導入された後、適当な時点で行な われる。このような好ましい検出は、大腸１のβ−グルクロニダーゼ（ｇｌｕｃ ｕｒｏｎｉｄａｓｅ）（ＧＵＳ）遺伝子の利用が必要となる（Ｒ，Ｊｅｆｆｅｒ ｓｏｎ他、ＥＭＢＯＪ、、上６．３９０１　（１９８７））。形質転換され、こ の遺伝子を発現しているトウモロコシの細胞は、細胞外の培地中にある基質、５ −ブロモ−３−クロロ−３−インドリル−〇−Ｄ−グルクツイドｆ５−ｂｒｏｍ ｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ ）（Ｘ−ＧＬＵＣ）にさらされると青色に染まる。ここで有用な制御配列には、 特定の植物細胞で発現されつる、構成的、誘導的、組織あるいは器官特異的、あ るいは発生段階に特異などんなプロモーターも含まれる。このように適当なプロ モーターは、先に引用したＷｅｉｓｉｎｇ他）に示されている。以下に、使用に 適したプロモ−ターの代表例の一部を示す。すなわち、アクロバクチ１ウム　ラ メツ　シエンス＾ｕｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋＊　ｔｕｍｅｆａｃｌｅｎｃｅｌの ｔ−ＤＮＡに由来するの制御配列、これには、ｍａｎｎｏｐｉｎｅ合成酵素、ｎ ｏｐａｌｉｎｅ合成酵素、ｏｃｔｏｐｉｎｅ合成酵素が含まれる；トウモロコシ 由来のアルコール脱水素酵素プロモーター；様々な種に由来するりブロース２リ ン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ｒｉ　ｂｕ　１　ｏｓｅ−ｂ　ｉ　５ ｐｈｏｓｐｈａ　ｔｅ−ｃａｒｂｏ　ｘ　ｙ　ｌａｓｅｌｏｘｙｇｅｎａｓｅ） スモールサブユニット遺伝子のような、光誘導プロモーター：主要なりロロフィ ルａ／ｂ結合蛋白遺伝子プロモーター；カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭ Ｖ）の３５Ｓと１９３プロモーター；トウモロコシ由来のｗａｘｙ、ｚｅｉｎ、 ｂｒｏｎｚｅなどの発生上制御されたプロモーター；同様に合成的であったり、 または誘導的あるいは構成的な他の天然プロモーターがあり、これには、植物の 器官特異的発現や発生段階特異的発現を示すものが含まれる。

介在配列、エンハンサ−、ポリアデニル化配列のような他の要素もまたＤＮＡ上 に存在する。このような要素は、転写やｍＲＮＡの安定性などに影響を与えるこ とによって、ＤＮＡのより高い発現や働きに供しつるが、ＤＮＡの機能に必要で ある場合もあり、また、ない場合もある。このような要素は、植物において形質 転換ＤＮＡの性能が最大限に発揮されるようにＤＮＡ上に含まれることがある６ 例えば、トウモロコシＡｄｈ　Ｉ　Ｓの第一介在配列は、プロモーターと特定の 組換えＤＮＡのコード配列の間に置かれることがある。

この介在配列は、ＤＮＡＩＭ造中に含まれると、トウモロコシ細胞中の遺伝子発 現が、一般に増加することが知られている（Ｊ、Ｃａ１１ｉｓ他の゛　び　Ｇｅ ｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌ。

ユ、１．１１８３　（１９８７））、Ｌかし、選択的標識が満足に働くのに十分 な発現が、しばしば介在配列なしで得られる（Ｔ、　Ｋｋの５ｈｒｕｎｋｅｎ− １の第一介在配列がある。これら、他の要素は、ＤＮＡｔｌｌ造の残りの部分と 適合しなければならない繁殖力のあるトランスジェニック植物を、電気穿孔によ って首尾よく作るには、４つの要求が満たされなければならない。すなわち、（ ｉ）標的細胞に生存能力がある。　Ｄｉ）標的細胞が、有用な数の細胞の安定し た形質転換を保証するのに十分なくらい高頻度に組換えＤＮＡを取り込むことが できる−　ＬＬｉｉ）一旦形質転換されたならば、安定した形質転換細胞を確認 し特定するのに必要な選択過程の間、受容細胞は細胞分裂を維持し、かつ再生能 力を保持しつづけなければならない。（ｉｖ）形質転換した再生植物は「形質転 換した状態」を遺伝させなければならない。例えば、導入ＤＮＡが、発現能力を 含んだ機能的で変化しない形で子孫に伝えられるということである。

本発明では、電気穿孔によるＤＮＡの取り込みが、形質転換能のある細胞と呼ば れる改変細胞の作成によって改善される。形質転換能のある細胞は、ペクチンの ようなある種の細胞壁成分の加水分解の結果生じ、それは、細胞の生存能力を破 壊することな（、外来のＤＮＡに対する細胞壁の透過性を高めることにつながる 。これは、酵素消化によって完全に細胞壁を除去する原形質体の調製と対称的で ある。原形質体と、本発明に係る形質転換能のある細胞との明確な相違には、以 下のことが含まれる。形質転換能のある細胞は、形態的そして生理的に原形質体 とは異なっており、容易に原形質体と区別できる。形質転換能のある細胞は、球 形をしている原形質体と比較して、カルス細胞の丸みを帯びていない形を維持し ている。形質転換能のある細胞は、カルス細胞のように安定な細胞の固まりから なっているが、原形質体は、もしそれが可逆的に癒着しなければ、安定な固まり を形成しない。セルロース（ｃｅｌ　１ｕｌｏｓｅ）特異的染料であるＴｉｎａ ｐｏｌ　ＢＰＯＴは、形質転換能のある細胞を染めるが、原形質体においては染 めることは観察されない、さらに、スｅａ　ｍａ　ｓの電気穿孔処置に関連した 培養過程中に使われる低張液は、原形質体の溶解を引き起こすと思われる。

この方法において、トウモロコシ細胞は、細胞壁の一部を消化するために、一つ あるいはそれ以上のペクチン分解酵素のような多糖質分解酵素で処理される。こ こで使われる「ペクチン分解酵素」という用語は、直接、ペクチンの分解を触媒 する酵素と、ペクチンのサブユニットの崩壊を触媒する酵素の両方を含む。それ ゆえ、６ｎｄｏｐｅｃｔｉｎ　１ｙａｓｅ、ｐｅｃｔｉｎ　１ｙａｓｅ、ｐｅｃ ｔｏｌｙａｓｅとｅｎｄｏｐｏｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅ・及びｐｏｌｙ ｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅは、ここでその用語が使用されるように、全てペク チナーゼ（ｐｅｃｔｉｎａｓｅｌそのものと同様、ペクチン分解酵素である。キ シラナーゼ（ｘｙｌａｎａｓｅ）、セルラーゼ（ｃｅｌ、１ｕｌａｓｅ）　、ヘ ミセルラーゼ（ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌａｓｅ）　、ドリセラーゼ（ｄｒｉｓｅｌ ａｓｅｌ、トランスエリミナーゼ（ｔｒａｎｓｅｌｉｍｉｎａｓｅ）、マセロザ イム（ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ）のような他の酵素も、ペクチン分解酵素との組み 合わせにおいて有用である。

単子葉植物と双子葉植物では、ペクチンの組成と分布の点で重大な違いがある。

単子葉植物では、ペクチンとベクティトは細胞壁構成成分中に少量（１〜６％） しか存在しない、この比較的少量のペクチンは、細胞壁に固く結合している。こ れは、双子葉植物とは対称的であり、双子葉植物ではペクチンが主要な細胞壁構 成成分であり（約３５％）、主に細胞壁内に等質な層として存在する。１惣威゛ 　にお（る　−　Ｐｈ　５ｉｏｌｏ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌ　Ｅｘ　ａｎｓｉｏｎ　Ｄ ｕｒｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｇｒ。

丘」」ロー、Ｄ、Ｊ、Ｃｏｓｇｒｏｖｅ他、ｅｄｓ、、Ａｍｅｒ。

Ｓｏｃ、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、（１９８７）の２８〜９５ページ中のＮ 、ｃａｒｐｉｔａ、及び、Ａ、Ｄａｒｒｉ　ｌ　ｌ他のの　””　Ｔｈｅ　Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　ｏｆ　Ｐｌａ１工旦り、１．９１　（１９８０）を参照ノ コト。

細胞壁が酵素処理によって過度に分解された穀物細胞は生存能力に乏しく、また 分裂しない、このため、形質転換能のある細胞の調製において、酵素処理はでき るだけ長時間行なうべきであるが、懸濁培養の生存能力や分裂活性、あるいは再 生能力に深刻な影響を与λるほど長時間行なうべきではない、好ましくは、凝集 した体積で１〜２ｍｌの１１且−二二ヱ玉細胞あたり、漫して柔らがくする活性 化として測定される酵素活性の約３００〜５０００単位が、全量が約５ｍｌとな るまで培養培地に導入される。細胞解離活性は、ここでは、ｌ５ｈｉｉのＰｈ　 ｔｏ　ａｔｈｏｌｏ　、１旦、２８１　（１９７６）で指定されたような条件の もとで、じゃがいもの塊茎薄片から放出される単細胞の体積として定義されてい る。

本発明の好適な実施例については、ｅｎｄｏｐｅｃｔｉｎ　１ｙａｓｅ　（Ｅ、 Ｃ，３，２，１，１５，）は、ｅｎｄｏｐｏ　ｌ　ｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓ ｅ　（Ｅ、Ｃ，４，２゜２．３　）と組み合わせて形質転換能のある細胞の作成 に使われている（どちらも、５ｅｉｓｈｉｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　 Ｃｏ、のＩ’Ｐｅｃｔｏ１ｙａｓｅ　Ｙ−２３Ｊ、１ｏｏｘｌｏ”細胞解離活性 単位／ｇｍ、に含まれている）。この酵素の組み合わせは、一般にｐｅｃｔｏｌ ｙａｓｅとも呼ばれ、Ｓｉｇｍａ、Ｃｈｅｍ、Ｃｏ、、ミズーリ州セントルイス から入手可能である。

酵素の希釈Ｌ＠液（０，１〜１％）について、５ｍｌの酵素緩衝液あたり、詰め た体積約１〜２ｍｌのトウモロコシ細胞に対して、室温、特に約２０〜３０℃に おいて、反応時間は、０．７５〜３．０時間、好ましくは１．５〜２．０時間の 範囲にある。この方法のいくつかの具体例において、酵素処理の前に、懸濁培養 細胞を強制的にふるいにかけたり、あるいは、さらに散らしたりばらばらにした 、８６０ＬＬｍのふるいをかけた細胞の固まりから調製した培養は、５２０μｍ のふるいに通したものに比べて生存能力が良好な傾向にあるが、形質転換の頻度 は低い。一般にこの処理は、細胞の大きな固まり、つまり、２０メツシユ（開口 が８６０μｍ）より大きいサイズの固まりの細胞を多く含む懸濁培養に対して最 も有効である。

そして、この処理は、実質的には酵素にさらされる細胞壁の全面積を増大させる 。消化に続いて、細胞は、残留酵素活性を事実上取り除くのに十分な量の緩衝液 ですすぐ、一般に、凝集した体積で１〜２ｍｌの細胞あたり、５〜１５ｍ１の緩 衝液で２〜３回すすげば充分である。

電気穿孔緩衝液の公式化は、細胞の生存能力と形質転換効率に対して最適になる ように定められることが多い。最適化される式の要素には、イオン組成と水素イ オン濃度指数（ｐＨ）が含まれる。浸透性の物質の種類と濃度も最適化される。

上述の他の酵素や酵素の組み合わせに対する最適消化条件は、本発明のもう一つ の特徴を用いて決定しつる。適当な消化条件を決定するために、与えられた酵素 のいろいろな濃度に対する瞬間の形質転換効率−酵素濃度の反応曲線が決められ る。規定の浸透性物質の条件を用いた懸濁培養に対して、いろいろな量の消化が 行なわれる。これによって調製された形質転換能のある細胞は、本発明の条件に したがって電気穿孔にかけられる。β−グルクロニダーゼ（ｇｌｕｃｕｒｏｎｉ ｄａｓｅｌ　をエンコードする遺伝子のようなレポーター遺伝子は、異型ＤＮＡ として用いることができる。そして、電気穿孔と回復に続いて、細胞はレポータ ー遺伝子の発現の分析にかけられる。それに加えて、細胞は、この電気穿孔過程 に続いてその分裂活性が記録される。適当な酵素濃度とは、その酵素濃度に対し て受容できる水準の分裂（２０％以上の増殖）と、短期の形質転換（詰めた体積 で０．１ｍｌの細胞あたり、１００から５０００を越える青区分）が観察される ことである。

分裂活性の維持に加えて、適当に調製された形質転換能のある細胞は、原形質体 とは異なり、培養の中で多細胞の固まりの形態を維持している。これは、細胞壁 の大部分が無傷のままであり、細胞が丸くない形で観察されるからである。それ ゆえ、残ってる細胞壁は、Ｔｉｎａｐｏｌ　ＢＯＰＴ　（Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ ）のようなセルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅｌ染料で染まるのである。これは原 形質体とは対称的であり、原形質体は、セルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）が完 全に除かれているので、染色可能な細胞壁は含まない。

異型組換えＤＮＡは、電気穿孔を経て再生可能な形質転換能のある細胞の培養に 導入される。適切な電気穿孔器具の一般的な解説は、ｔ（、Ｐｏｔｔｅｒ他、Ｐ ＮＡＳ　ＵＳＡ、旦、７１６１　（１９８４）に示されている。再生不能なトウ モロコシの原形質体の電気穿孔処理における器具の使用手順は、Ｍ、Ｆｒｏｍｍ 他、１携狗］Ｐ１．ａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　、２．５９１（１９９０）に述べられて いるが、繁殖力のあるトランスジェニックトウモロコシ植物に再生できるトウモ ロコシ細胞の電気穿孔についての手順は出版されていない。形質転換能のある細 胞の電気穿孔に刻しては、波形、パルス長、パルス数は様々なものが使われる。

さらに、電気穿孔緩衝液のイオン強度の変化は、これら他の要素のいくつかの変 更を必要とする。以下の好適な実施例は例示であり、本発明を限定するものでは ない。

一般に有用な電気穿孔装置は、コンデンサーを含む電子装置からなる。そして、 充電されたコンデンサーは、電気穿孔緩衝液中で電気穿孔される細胞に直列にな るよう回路につなげられる。一旦回路につなげられるとコンデンサーは放電し、 細胞に対して指数関数的に減衰するパルス電流を与える。他のパルス波形を発生 する電気穿孔装置も、入手可能である。ここに概要を述べた実験手順は、仮に満 足な発現と生存能力の許容水準が観察されるならば、その使用を認めるために変 更しつる。

形質転換能のある細胞は、その調製においてより長い遅延期間が作用するかもし れないが、約４５分以内で電気穿孔されることが多い。３時間はど放置された細 胞は、満足な形質転換頻度を示すことが可能である。細胞は、電気穿孔緩衝液の 存在下、室温（２０〜３０℃）で、電気穿孔室にて電気穿孔される（Ｋ、Ｊ、Ｐ ａ１ｔｅ。

Ｍ　−Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅ　ｏｒｔｓ　、４，２７４　（１９８５）（ ｃｈａｍｂｅｒ）を参照のこと）、電気穿孔緩衝液ｉ液において重要なのは、侵 透性とイオン組成である。電気穿孔緩衝液は、細胞と接してる間、細胞と適合し ていなければならず、毒性があったり、そうでな（でも有害であったりしてはな らない。電気穿孔緩衝液は、一般に組換えＤＮＡ、緩衝試薬、浸透性物質を含む 。緩衝試薬は、電気穿孔緩衝液のｐＨを約７から７７の間、多くは約７．５に保 つ。使用できるこのような緩衝液には、ＨＥＰＥＳ、（Ｎ−［２−ｈｙｄｏｒｏ ｘｙｅｔｈｌ］　ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’−［２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｒ ｏｎｉｃ　ａｃｉｄ］）とリン酸ナトリウム、そして、それらの混合物が含まれ る。

浸透性物質は、細胞の生存能力と形質転換効率を維持するのに必要である。適当 な浸透性物質には、イノシトール（ｉｎｏｓｉｔｏｌ）、フルクトース（ｆｒｕ ｃｔｏｓｅ）、シェークロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）のような糖や、マンニトール （ｗａｎｎｉｔｏｌ）、ソルビトール（ｓｏｒｂｉｔｏｌ）、グリセロール（ｇ ｌｙｃｅｒｏｌ）などのような多価アルコール（ｐｏｌｙｏｌ）が含まれる。こ れらの化合物の全てに対して、約０．３〜０．５Ｍの濃度が最適であることがわ かった。しかし、マンニトール（ｍａｎｎ　ｉ　ｔｏ　１　）と使うと、ソルビ トール（ｓｏｒｂｉｔｏｌ）やシュークロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）を使うときに 比べて、常に高い形質転換効率が得られる。電気穿孔緩衝液中に存在する組換え ＤＮＡは、超らせん構造や直線状の一本鎖あるいは二本鎖の状態で存在している 。好適な実施例においては、例えば、組換えプラスミドに由来する直線状二本Ｉ ｌｌ　Ｄ　Ｎ　Ａが使われる。１．Ｏｍｌの電気穿孔緩衝液あたり、約１μｇと いう低濃度でも使用可能であるが、約１．ＯＯＬＬｇ／ｍｌかそれ以上のＤＮＡ 濃度が好ましい。この量は、詰めた体積でＯ，１ｍｌのＺｅａ　ｍａ　ｓ細胞あ たり、約１〜１００μｇのＤＮＡに相当する。

ＩＶ−１ＲＡ１ 形質転換能のある細胞が、組換えＤＮＡの存在下で電気穿孔され、ＤＮＡが、少 なくもい（つかの細胞内に入ったならば、細胞は回復培地上に置かれる。電気穿 孔のすぐ後に、細胞がマンニトール（ＩＩｌａｎｎｉｔｏｌ）を含む固形のカル ス維持培地に置かれることが現在のところ好ましい、−週間後、マンニトールが 取り除かれる。維持培地上での回復は、選択を始めるのに先だって、もう−週間 続けられる。

回復期間の長さは、使用される選択試薬、および／あるいは、電気穿孔された細 胞の数にしたがって変わる。この回復期間の目的は、細胞が電気穿孔から回復す るのを可能にし、さらに、選択とその後の再生過程を容易にするために、細胞の 増殖と安定化を可能にすることにある。１日から４週、好ましくは、約１．５〜 ２．５週の間に、この選択が始められる。

回復の後は、組換えＤＮＡを含み、かつ、植物体を形成するのにまだ十分な能力 を保持している細胞を特定し、選択することが必要である。これを完遂するのに 役に立つと思われる２つの一般的な方法がある。最初の方法では、カルスやそこ から再生した植物体中の形質転換細胞を、レポーター遺伝子の発現の検出や組換 えＤＮＡによる表現型への影響の評価などを含む、様々なｅｌｌ準的な方法によ って組換えＤＮＡが存在するかどうかふるいにかけることができる。

もう一つの方法では、こちらの方が好ましい方法であるが、もし選択可能な標識 遺伝子が組換えＤＮＡと共に、あるいはその一部として遺伝したとすれば、形質 転換したカルスの細胞は、選択可能な標識遺伝子の発現を検出する選択試薬の使 用によって特定されつる。

選択条件は、形質転換した細胞の増殖と蓄積を許容する一方で、同時に形質転換 していない細胞の増殖を阻害するように選ばれるべきである。個々の細胞の生存 能力は、しばしば、隣接する細胞の生存能力に強く依存するという事実により状 況が複雑になる（Ｋ、　Ｎ、Ｋａｓ他、プランタ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｅｒｌ、　、 上２６゜１０５　（１９７５））。また、選択条件も、カルス細胞の植物体再生 能力と、再生の結果生じた植物体の繁殖力が破壊されるほど厳しいものであって はならない、従って、選択試薬の細胞への生存能力や細胞の形態に与える影響は 、見極められるべきである。これは、与えられた選択試薬と、前もって形質転換 された組織に対する増殖阻害曲線を実験的にめられることによって可能である。

増殖を阻害する濃度範囲は確立される。

選択過程は毒性試薬にさらす必要があり、また、その試薬の凝集と選択の多数の 繰り返しにおいて、連続的な変化を使用している。

特異な凝集とサイクルの長さは、試薬により変化する傾向にある。

現在のところ、好適な選択過程としては、ハイグロミシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉ ｎ）　Ｂ　（Ｃａ　１　ｂ　ｉ　ｏｃｈｅｍ、カリフォルニア、サンジエゴ）に ついて、それを６０ｍｇ／ｌ、３〜６週間選択の後、３〜６週間の期間に１．５ ｍｇ／ｌ存在させて、増殖する転換懸濁培養を必要とする。

−２カルス片が、指定上の形質転換体として特定されると、形質転換は１表現型 、および／あるいは遺伝子の分析によって確認できる。仮に選択試薬が使用され たのであれば、表現型分析の例としては、選択試薬の様々な水準に関して、推定 上の形質転換体の生の重量の増加を測ることがあげられる。利用できる他の分析 法は、組換えＤＮＡの機能に依存する。例えば、酵素や蛋白が、そのＤＮＡにエ ンコードされているならば、個々の酵素や蛋白に特異的な、酵素的あるいは免疫 学的検出法が使用される。他の遺伝子産物は、適当な生物学的あるいは化学的検 出法を用いて検出される０組換えＤＮＡの存在は、常套的な手続き、すなわち、 サザン法やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によっても確認できる。

■、　の　ど　の 形質転換した細胞系統は植物体に再生され、再生の結果生じた植物体の繁殖力が 決められる。遺伝子型、および／あるいは表現型分析で陽性を示した形質転換細 胞は、その後、組織の分化と植物体の再生を促す培地上に置かれる。再生は、よ く知られた標準的な手続きに従って行なうことができる。その手続きは、一般に 、カルスの増殖を中断させ、体細胞胚の発生や他の組織の分化を促すオーキシン （ａｕｘｉｎｌの水準を減らすことを必要とする。このような再生手続きの一例 が、Ｃ，Ｅ、Ｇｒｅｅｎ他の　″　６六のだ　のトウモロコシ　Ｍａｉｚｅ　ｆ ｏｒ　Ｂｉｏｌｏ　１ｃａｌ　Ｒｅ５ｅｒ立九り、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃ、Ｂ ｉｏｌ、Ａｓ５ｏｃ、（１９８２）の３６７〜３７２ページに述べられている。

植物体は、増殖室や温室で成熟するまで育てられ、Ｍ、Ｎｅｕｆｆｅｒの１ｂｉ ｄ、の１９〜３０ページに述べられているようにして、適当な他家交配と自家交 配とが行なわれる。

Ｖｌ、Ｒ上五五皮ゲ逝 形質転換した細胞から再生した植物体は、８０世代あるいはＲＯ植物と呼ばれる 。８０世代植物の様々な交配で生じた種は、Ｒ１子孫あるいはＲ１世代と呼ばれ る。Ｒ１種子が発芽すると、その結合で生じた植物もＲ１世代と呼ばれる。

上述した交配において、組換えＤＮＡが首尾よ（遺伝したことを確認するために 、異型ＤＮＡの存在を証明するためのＲ１世代の分析が行なわれる。この分析は 、形質転換の証明のためのカルスの分析板として、先に明らかにした方法と同様 の方法で行なわれる。ただし、ここでは、カルスの代わりに植物体や植物体の一 部が使われていることを考慮しなければならない。

ｖｘｒ、２　に　された　の０ −船に、ここで作られた形質転換トウモロコシの商業的価値は、仮に明換えＤＮ Ａが多くの異なった組み合わせの雑種に組みこむことが可能ならば、非常に大き なものになる。農民は、普通、成熟期や場所、その他の農耕洗上の特徴に基づい て、何種類かの雑種を育てる。また、！Ｉ民は、成熟期や、病気、昆虫への抵抗 性のような特徴の違いのために、一般に穀倉地帯のある地域に適合する雑種は、 別の地域では適合しないので、物理的な場所に基づいて雑種を選ばな（ではなら ない。このようなものとして、異型ＤＮＡを非常に多くの親株系統に組みこみ、 その結果、望ましい組換えＤＮＡを含む多くの雑種の組み合わせを作ることが必 要である。都合がよいことに、これは、最初の繁殖力のあるトランスジェニック 細胞を、優秀な同系交配系統と交配させることによって逆過程（戻し交配）を行 なう品種改良計画により成される。この交配による子孫は、ある植物は同型ＤＮ Ａを持ち、また、あるものはそうでないというように分けられる。そのＤＮＡを 持つ植物は、その後再び、その優秀な親株と交配し、その結果、もう一度分離す る子孫を生じる。この交配は、最初の優秀な系統が組換えＤＮＡを含み、かつ、 その優秀な系統に本来見られた他の重要な特質を全て持っているような遺伝的処 理を受けた系統に変わるまで、繰り返される。

別々の戻し交配計画が、任意の優秀な系統を遺伝的処理を受けた系統に変えるた めに用いられる。交雑トウモロコシ種子の親株の両方が、組換えＤＮＡに対し同 型接合体であることが必要である。トウモロコシの品種改良法や遺伝子を、ある 系統や変種から他へ移す技術や技能は、当業者にはよく知られている。従って、 組換えＤＮＡは、適当なカルスを生じない系統や変種にも導入することができる 。

ＶＩＩｌ、ｌ−ランスジェニック　の１ここで作られたトランスジェニック植物 は、商業的また研究の様々な目的に有用である。トランスジェニック植物は、こ れを伝統的な農業で使用する場合には、農民にとって有益な特徴（例えば、人間 の食べ物や動物の餌に含まれる栄養の改善）、あるいは、食品加工業者に有益な 特徴（例えば、加工上の特徴の改善）を持つように作られる。このような利用法 において、一般にその植物は、人間や動物の食べ物にその穀物を利用する目的で 栽培される。しかし、茎や皮、成長に関係ない部分などを含む、植物の他の部分 も、動物の飼料の一部としての利用や、装飾用の目的（例えば、インディアンコ ーン（Ｉｎｄｉａｎ　Ｃｏａｎ））を含む有用性を持つ。トウモロコシや他の作 物の化学的成分（例えば、油やでんぷん）は、しばしば、食品や産業利用の目的 で抽出されるが、このような成分の水準を高めたり加減したりしたトランスジェ ニック植物が作られる。

この植物もまた、いろいろな目的で種子生産のために利用される。

トランスジェニック植物は、そこに含まれる組換えＤＮＡにエンコードされてい る蛋白やその他の分子の商業的な製造にも利用できる。ここで、その他の分子は 、植物体、種子などがら抽出、あるいは生成される。この植物に由来する細胞や 組織もまた、培養されたりＷで育てられたり、あるいは、このような分子を製造 する目的やその他の目的（例えば、研究目的）で、発酵させられたすする。

トランスジェニック植物は、商業目的の品種改良計画で使われたり、あるいは、 関係のある作物種との交配に使われる。組換えＤＮＡによって改善された形質は 、例えば、トウモロコシ細胞から他の種の細胞、つまり、原形筐体融合によって 移すことができる。

トランスジェニック植物には、後に伝統的な変異体の作成や選択によって作られ るかもしれないような、有益な変異体を特定する目的で、研究や挿入変異による 新しい変異植物の作成を含む品種改良に用いるという要素も多々ある。本発明に よる方法を使って、所有の系統や変ｆ重を特定するために用いられる特有な「署 名配列」や、他の挿識配列を持つ植物を作ることができる。

例 次の制限を有さない例は、本発明を説明するものである。これらは、安定に組換 えＤＮＡを発現し、子孫にそのＤＮＡを遺伝する、繁殖力のあるＺｅ旦−−］」 −と」、ｔＩＩ物の調製に使うことができるという、一般的な過程をよりよく説 明するものとして示されるものである６割合とパーセントは、全て指定がなけれ ば重量によるものである。個々の形質転換は、形質転換過程にかけられる材料の 量の関数である。従って、ここに説明された過程で、形質転換製造物が生じない という状況が生じたとしたら、その成功のためにその過程を繰り返すことが必要 となる。

獣 プラスミドの−’：　Ｐｏ１ＨＹＧＩ−３と　ＢｒＩ２２１プラスミドｐＰｏ　 Ｉ　ＨＹＧ　Ｉ−３は、ベクターｐＰｏｌｆｎｋ２−６中において榎準の組換え ＤＮＡ技術を用いて構築されたものである。ベクターｐＰｏ　ｌ　ｉ　ｎｋ２− ６は、ｐＢＲ３２８（Ｘ、Ｓ。

ｂｅｒｎ他による゛　Ｇｅｎｅ　、旦、２８７　（１９８０）’）の大きなＥｃ ｏＲｒ−３ａｌ　ｒ断片（３，１キロ塩基対）と、マルチクローニング部位を含 む６５塩基対の領域からなる。プラスミドｐＰｏｌＨＹＧＩ−３は、３°エンド においてアクロバクテリウムツメファシェンス（Ａｑｕｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋ ＩＩｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ）のｎｏｐａｌｉｎｅ合成酵素（ｎｏｐａｌｉｎ ｅ　５ｙｎｔｈａｓｅ）　（ｎ　ｏ　ｓ　）ポリアデニル化配列（Ｍ、Ｂｒｅｖ ｅｎ他のＮｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、上１．３６９　（１９８］　Ｊ　と 、５°エンドにおいてトウモロコシ　ＡｄｈＩＳ　第一介在配列（Ｊ、Ｃａｔ　 ｌ　ｉｓ他の遺伝ヱ及ｕ工１」Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏ　、、上、１１８３　 （１９８７）’）を含む５５３塩基対のＢｃｌＵ−ＢａｍＨＩ断片を側面とする 、大皿９　（Ｌ　、　Ｇ　ｒ　ｉ　ｔ　ｚ他の　Ｇｅｎｅ、　２５　、　１７９ 　（１９８３））からのハイグロマイシンβ−リン酸基転移酵素（ｈｙｇｒｏｍ ｙｃｉｎβ−ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）　（ＨＰ　Ｔ　）コーデ ィング配列を含む０発現は、ハイグロマイシンβ−リン酸基転移酵素（ｈｙｇｒ ｏｍｙｃｉｎβ−ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）指示配列の上流に位 置するカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５ｓプロモーター（Ｈ，Ｇ ｕｉｌｌｅｙ他による痰阻」Ω旦土ユ１．３０，７６３　（１９８２））によっ て生起される。電気穿孔の研究のため、プラスミドＤＮＡは、ｎｏｓポリアデニ ル化配列配列゛エンドに存在する唯一のＸｈｏ　Ｉ制限部位において直鎖状化さ れる。ｐＰｏｌＨＹＧＩ−３の地図は、図１として与えられている。

ｐＢＩＩ２２１は　５°エンドにおいてＣａＭＶ３５ｓプロモーターを、また、 ３°エンドにおいてｎｏｓポリアデニル化配列配列面とした　Ｅ、ｃｏｌｉ　β −グルクロニダーゼ（ｇｌｕｃｕｒｏｎＬｄａｓｅ）コーディング配列（ＧＵＳ ）を含んでいる。プラスミドは、トウモロコシＡｄｈＩＳ第一介在配列を、３５ ｓプロモーターとｐＢＩ２２１　（Ｒ，Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ他のＥＭＢＯＪ、、 ±６．３９０１（１９８７））のコーディング配列の間に挿入して構築されてい る。電気穿孔の研究のため、プラスミドＤＮＡは、ｎｏｓポリアデニル化配列配 列′エンドに存在する唯一のＥｃｏＲＩ制限部位において直鎖状化される。ｐＢ ＩＩ２２１の地図は、図２として与久られている。

医ｌ なしの　による夕　を　る　の Ａ、カルスと７、坪　の・　７ 雑種の実は、胚が１．５〜２．０ｍｍの長さに達したときに取った。実全体は、 ５０体体積体積（Ｖ／Ｖ）の市販の漂白剤（２，６３％重量／体積（Ｗ／Ｖ）次 亜塩素酸ナトリウム）中で、室温で２０分間表面殺菌された。続いて、実は、蒸 留、脱イオン滅菌水で洗浄された。未成熟の胚は無菌的に単離され、栄養寒天の 開始／維持培地に、根／苗条の軸を培地にさらすように置かれた。開始／維持培 地（Ｆ培地）は、Ｎ６基礎培地（Ｃｈｉｈ−ｃｈｌｎｇ　Ｐｒ。

ｃｅｅｄｉｎ　ｓ　ｏｆ　Ｓ　ｎ　ｏｓｉｕｍ　ｏｎ　ＰｌａｎｔＴｆｓｓｕｅ 　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、Ｍａｙ　２５−３０．１９７８．５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｒｅｓ ｓ、北東、４３〜５０ページ）に２％（重置／体積）シュークロース（ｓｕｃｒ ｏｓｅ）　、１．５ｍｇ／ｌ　２゜４−Ｄ、６ｍＭ　プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ ）　、２００　ｍ　ｇ　／　ｌ　カゼイン加水分解物、そして、Ｇｅ１ｒｉｔｅ 　（Ｋｅｌｃｏ、Ｉｎｃ、サンジエゴ）０．２５％を加えたものから成ったもめ である。ｐＨは、高圧滅菌に先立って５．８に調整された。

未成熟の胚は、暗所で２５℃で培養された。未成熟胚の胚盤からの分裂増殖は、 もろさと、きちんと形の定まった体細胞性胚の存在から見積られた。この形態の 組織は、未成熟胚の最初の培養より１０〜１４日後に新鮮な培地に移された。そ の後、組織は１４〜２１日毎に継代培養された。約１ｇに達した組織片より６０ 〜８０ｍｇの組織が除去され、新鮮な培地に移された。継代培養には、もろい、 胚の性質の組織を保持するよう注意深（目でよく観察しながら行なわれた。体細 胞性胚の存在は、適当な条件下で培養体が植物体に成長するだろうことを示した 。

液体懸濁細胞培養は、確立されたプレート上のカルス培養から始められた。液体 培地は、オートクレイピング（ａｕｔｏｃｌａｖｉｎｇ）の後、高圧滅菌したＦ 培地に１０−’ＭＡＢＡを加えたもので構成された。

＠濁培養は、−週間に一度、新しい増殖培地とともに１：９希釈液に継代培養を した。培養体は、２６℃の暗所で、２５０ｍ１のフラスコに６０ｍ１の培地をい れた毎分１５０回転の回転振とり培養機中で育てられた。

Ｂ、　酎−木１ζＪＬ盃」豹　夕　る　の・　１継代培養から５日過ぎたＡＢ１ ２懸濁トウモロコシ培養細胞は、強制的に８６０μｍのスクリーンでふるいにか けた。１．５ｍｌ　（凝集した体積）の、こされた懸濁細胞は、０．５％Ｐｅｃ ｔｏｙａｓｅＹ−２３（Ｓｅｉｓｈｉｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ。

東京１日本）、０．２Ｍマンニトール（ｍａｎｎｉｔｏｌ）、　０．２％ＢＳＡ 、８０ｒｒ＋Ｍの塩化カルシウム、ｐＨ５，８の２０ｍＭのＭＥＳを含む溶液５ ｍｌ中で６０．９０．または１２０分間培養された。酵素処理に続き、細胞は、 後述する例３のように、酵素を除くため洗われた。各時間段階で得られた組織の 半分は、ＤＮＡなしで電気穿孔された。１２０ボルトに充電された１４０μＦの コンデンサーが使われた。

０．３Ｍのマンニトール（ｍａｎｎｉｔｏｌｌを含むＦ培地で１：９に希釈した 後、組織（電気穿孔したものと、酵素消化だけをした組織両方）は、ｇｅ　ｉ　 ｒ　ｉｔｅ固化した０、３Ｍマンニトール（ｍａｎｎｉｔｏｌ）を゛へむＦ培地 に２週間置かれた。組織は、３週間、Ｆ培地のもう１回の処理に移された。

酵素消化した非電気穿孔組織の生存率は、５０〜７５％であった、酵素消化した 電気穿孔組織の生存率は、１５〜４５％であった。

Ｆ培地の上で３週間過ぎた後、組織は胚に移され、チアミン塩酸０．５ｍｇ／ｌ 、２．４−Ｄ　（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）０．７５ｍｇ／ｌ、シュー クロース（ｓｕｃｒｏｓｅｌ　５０　ｇ　／　１　、アスパラギン１５０ｍｇ／ ｌ、ｇｅｌｒｉｔｅ２．５ｇ／ｌで補ったＭＳ基礎塩（Ｔ、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ 他の　−Ｐｈ　ｓｉ。

Ｌ２旦上立旦１１．１二、４７３　（１９６２））にて構成される発生培地（Ｒ Ｍ５）に移行された。ＲＭＢ上で２．５週間経過後、分化し成熟しつつある組織 は、ＲＭ５培地から２．４−Ｄを除いたものからなるＲ５培地に移された。培養 体は、２６℃で、１４時間明るく、１０時間暗くする光管理工の元に移される前 に、暗所に１０日！かれた（３００フート燭の弱白色蛍光灯）。

１〜３ｃｍの植物体は、さらに成長させるため、Ｒ５培地を含むフローボックス （ｆｌｏｗｂｏｘｌ　（Ｐｌａｎｔｏｏｎ、Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ ｓ、ＭｃＬｅａｎ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ）に移された。植物体の葉が２〜３枚の段 階に達すると、植物体はバーミキニライト（ｖｅｒｍｉｃｕｌｉｔｅ）に２〜３ 週間移され、２６００フート燭にさらされ、毎週、弱Ｐｅｔｅｒｓ肥料の入った 水を与えられた。植物体は土壌に移され、成体へと成長した。

再生されたトウモロコシ植物体（約１０７処理）は、自家交配または他家交配さ れた。酵素処理し電気穿孔された懸濁細胞から再生された植物体は、酵素処理し た非電気穿孔の懸濁細胞からのもの、非酵素処理の非電気穿孔の懸濁細胞からの ものに比べて、形態上、表現形上、及び繁殖能力上の違いは見られなかった。９ ７％以上の植物体は繁殖能力を持っていた１種は、一つの実あたり平均３０ケ結 ばれた。

駁 ン　る　が　の　−ンスジエニッ　Ｚｅａ　Ｍａｓトウモロコシ　の゛　１ ＡＢ１２系統からの懸濁培養細胞は、例２に記述されているように調製された。

継代培養から３〜７日後の懸濁細胞は、強制的に８６０ｕｍのスクリーンでふる いにかけられた。１．．０ｍ１（詰めた体積）の、こされた懸濁細胞は、０．５ ％ｐｅｃｔｏｙａｓｅｙ−２３，０，２Ｍのマンニトール（ｍａｎｎｉｔｏｌ） 、　０．２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、８０ｍＭの塩化カルシウム、　 ｐＨ５，６の２０ｍＭの２−（Ｎ−モルフォリノ）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ ）の溶液３ｍｌ中で培養され、形質転換能を有する細胞が形成された。培養は、 暗所の卓上娠どう機（４０〜６０ＲＰＭ）中で２６℃にて９０分間行なわれた。

形質転換能を有する細胞は、０．２Ｍマンニトール（ｍａｎｎｉｔｏｌｌ、　８ ０　ｍ　Ｍの塩化カルシウム、０．１％のＢＳＡ、そして、ｐＨ５，６の２０ｍ ＭのＭＥＳ溶液１０ｍ１で２回洗われ、続いて、１０ｍＭのＨＥ　Ｐ　Ｓと０． ４Ｍのマンニトール（ｍａｎｎｉｔｏｌｌからなる電気穿孔緩衝液で２度すすぎ が行なわれた。ｐＨは７．５に調整された。

Ｂ、１ｚ１玉 電気穿孔過程の全工程は室温で行なわれた。１００μｇのｐＰ。

ＨＹＧＩ−３の直鎖状ＤＮＡは、室温で５分間、０．５ｍｌの電気穿孔緩衝液中 で培養された。この溶液に、０．２ｍｌの凝集した体積の酵素処理懸濁細胞を、 ０．５ｍｌの電気穿孔緩衝液に懸濁したものが加えられた。

電気穿孔緩衝液中の０．５ｍｌの細胞とＤＮＡの分画け、滅菌された６０Ｘ１５ ｍｍの滅菌ベトリ皿に置かれた電気穿孔チャンバーに移された。Ｉ　ＳＣＯモデ ル４９４の電源（電界強度２８０ボルト／ｃｍ、４０〜８０ｍ秒のパルス減衰時 間、指数関数的パルス）で７０ボルトに充電された、１４０μＦ、または２５０ μＦのコンデンサーからの電気パルスが細胞を流れた。

電気穿孔から約１０分後、細胞は、０．３Ｍマンニトール（ｍａｎｎｉｔｏｌ） を含むＦ培地で１対１０に希釈された。細胞は遠心され、ｗｈａｔｍａｎ＃１の ４．２５ｃｍのフィルターディスクを２層上に乗せたｇｅ　ｌ　ｒ　ｉ　ｔｅ固 化された、０．３Ｍのマンニトール（ｍａｎｎｉｔ。

ｌ）を含むＦ培地に置かれた。過剰の液体は除かれた。プレートは暗所で２６℃ に保たれた。７〜１０日後、細胞とフィルター紙は選択培地に移される前に１週 間、Ｆ培地プレートに置かれた。電気穿孔後の細胞の生存率は、１５〜３５％だ った。

Ｃ，ハイグロマイシンｍ 電気穿孔から約２週間後、全ての組織は、４５℃に冷したオートクレーブされた （ａｕｔｏｃｌａｖｅｄｌ培地に加えられた１５ｍｇ／ｌ　のハイグロマイシン Ｂ　（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ　Ｂ）を含むＦ培地プレートに移された（−ＬＬ２ Ｌ１」引続：　７０ボルトに充電した２５０μＦのコンデンサーによって電気穿 孔から得られた組織の区分は、形質転換系統４３を特定する。これらの細胞は、 ハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）　（１５ｍｇ／ｌ）プレートに６週 間置かれた。４３系統は、大部分の組織がわずかしか成長しないのに対して、よ く成長した。この区分は、６０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンＢ　（ｈｙｇｒｏｍ ｙｃｉｎ　Ｂ）を含むＦ培地プレートに移された。３週間後、組織は活発に成長 し、６０ｍｇ／ｌのハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）での２回目の選 択に移された。

全ての対象組織は、６０ｍｇ／ｌのハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ） プレートでの２回目の選択で死滅した。４３系統は、これらのプレート上で保存 され、また、Ｆ培地に移された。５日後、Ｆ培地からいくつかの組織がＤＮＡ抽 出のため凍結された。

（ｉニューム１」Ｅ統　７０ボルトに充電した２５０μＦのコンデンサーの放電 によって電気穿孔から得られた組織の区分は、形質転換系統１８を特定する。こ の系統は、ハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）（１５ｍｇ／ｌ）を含む プレートに２度、それぞれ３週間さらされたこと以外は、４３系統と同じ選択手 順に従った。４３系統の場合と同じ結果が観察された。

４３系統は８Ｍ５に移され、現在、Ｒ５上にある。１８系統は８Ｍ５．Ｒ５に移 され、後に土中に植久られた０両植物体は正常に見え、通常の形態を有している 。

Ｄ、カルスのン　の　１ １８系統と４３系統のカルスがハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）耐性 遺伝子を獲得したことを示すために、１８系統と４３系統のサザンプロット（Ｓ ｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔｓｌが、以下のように準備された。１〜６ｇのカルス を液体窒素中で凍らせ、細かい粉にまで砕き、１２．５ｍｌの抽出緩衝液（７Ｍ 尿素、２５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ８，０の５０ｍＭのトリス−塩酸、ｐ Ｈ８，０の２０ｍＭのＥＤＴＡ、１％のサルコシン）を含む、５０ｍ１遠心管に 移すことで、ＤＮＡが上記のカルスと非選択対照カルスから単離された。この混 合物に、１２．５ｍｌの石炭酸：クロロホルム：ｐＨ８，ｏ、ｏ、１Ｍのトリス −塩酸で平衡したイソアミルアルコール（２５：２５：１）が加えられた。管は ５分間強く振られ、２５℃で１５分間培養された。試料は、３０ｍ１のＯａｋ　 Ｒ１ｄｇｅ管に移され、毎分８０００回転、４℃で１５分間遠心された。上清は 、ｍ１ｒａｃｌｏｔｈ　（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｌａ　Ｊｏｌ　ｌａ、ＣＡ） で吸い取られ、５０ｍ１の遠心管に移されて、石炭酸：クロロホルム：イソアミ ルアルコール混合物で再抽出された。遠心後、上清は、等体積のクロロホルム： イソアミル　アルコール（２５：１）で５分間抽出され、上記のように遠心され た。

ＤＮＡは、上清に２．０ｍｌのｐＨ５，２の４．４Ｍ酢酸アンモニウムと、１２ ｍ１のインプロパツールを加え、氷上で１５分間培養することで沈澱させた。Ｄ ＮＡは、４℃で毎分８０００回転、５分間遠心して固められた。ＤＮＡ固化物は 、続いて７０％エタノールと１００％エタノールで洗われ、ＴＥ−１緩衝液に溶 かされる前に乾かされた。ＤＮＡは、すい臓リポ核酸分解酵素とタンパク質分解 酵素に処理、または、塩化セシウム−エチジウムブロマイド勾配遠心処理のいず れかで、さらに精製された。すい臓リボ核酸分解酵素（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉ ｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）は、使用前に１００℃で１５分間加熱され、ＤＮＡ試 料に１１００ＬＬ／ｍｌの濃度で加えられた。３７度で１時間培養後、ドテシル 硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を０．５％、タンパク質分解酵素Ｋ　（Ｂｏｈｒｉｎ ｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を２５μｇ／ｍ ｌになるよう加えた。ＤＮＡ試料は、さらに１時間、３７℃で培養され、続いて 、上記のように石炭酸：クロロホルム：イソアミルアルコールとクロロホルム： イソアミルアルコールで抽出された。ＤＮＡは、１／１０体積の３Ｍ酢酸ナトリ ウムと２倍体積のエタノールを加え、−２０℃で２０分間培養することで沈澱さ せた。ＤＮＡは遠心によって固化され、続いて７０％と１００％のエタノールで 洗い、乾かし、ＴＥ−１緩衝液に再懸濁した。

単離されたＤＮＡ　（１０〜３０μｇ）は、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ　（Ｎ ｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｒｂｅｒｙ、ＭＡ）で、その供給 者によって明示された条件に従ってそれぞれ消化され、続いてＴＡ　Ｅ＆！ｇ＃ ？ｆｆｌ　（４０ｍＭのトリス−酢酸、ｐＨ８０，２ｍＭのＥＤＴＡ）による、 ０．８％重重量体積の寒天ゲル（Ｓｅａｋｅｎ　ＧＴＧ　ａｇａｒｏｓｅ、ＦＭ ＣＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｉｎｅ　Ｂｒｏｏｋ、ＮＪ）で、２０ボルト、６ 時間電気泳動された。ゲル中のＤＮＡは、ゲルを０．２５Ｍの塩酸に６分間浸す ことで脱プリン塩基化され、次に、ゲルを３０分間、０．４Ｍの水酸化ナトリウ ムに浸すことで変性され、切断された。ＤＮＡは、０．４Ｍの水酸化ナトリウム 中で、毛管現象で一晩がけてＧｅｎｅ　５ｃｒｅｅｎ　Ｐｌｕｓ　Ｎｙｌｏｎ　 ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、Ｂｏｓｔｏｎ。

ＭＡ）上に吸い取られた。膜を、０．２Ｍのトリス−塩酸、ｐＨ７，４／　０． １５Ｍの塩化ナトリウムで、１５分間、２度洗った後、真空下、８０℃で時間焼 かれた。

膜のハイブリダイゼーション前処理は、ハイブリダイゼーション溶液（０，５Ｍ Ｌ：ｖｐＨ７，２（７）リン酸ナトリウＡ、７％（７）ＳＤＳ。

０．０５％のどロリン酸ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｇｇ／ｍｌの変性 サケ精子ＤＮＡ）中で、膜１平方ｃｍあたり、０．１５ｍ１のハイブリダイゼー ション溶液を使用して行なわれた。ハイブリダイゼーション前処理は、６５℃で ４時間行なった。

供給者の指示に従い、”Ｐ−ｄＣＴＰ（ＩＣＮ　Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ 、Ｃｏ５ｔａ　Ｍｅｓａ、ＣＡ）とともに、Ｒａｎｄｏｍ　Ｐｒｉｍｅｄ　ＤＮ Ａ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｂ。

ｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、インディアナ州インディアナポリス）を使 用したｒａｎｄｏｍ　ｐｒｉｍｅｒ　ｌａｂｅｌｉｎｇにより、ｍｔｐの標識が 付されたプローブを用意した。使われた鋳型ＤＮＡは、１０５５塩基対のｐＰｏ 　Ｉ　ＨＹＧＩ−３のＢａｍＨＩ断片であったが、それは、ＨＰＴコーディング 配列（図３のパネルＡ）である。断片はゲルから精製された。

ハイブリダイゼーションは、熱変性したプローブ（毎分１０７カウント／１１ｘ １４ｃｍのＩＩりを含む、新しいハイブリダイゼーション溶液とともに行なわれ た。培養は、６５℃で１８時間であった膜は、続いて、以下の各溶液で３０分間 、６５℃で洗われた。つまり、ｌＸ５ＳＣ（０，１５Ｍ（７）塩化ナトリウム、 ０．０１５Ｍ（７）クエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０）、１％のＳＤＳ　；０． ５ＸＳＳＣ１１％のＳＤＳ；０．３ＸＳＳＣ，１％のＳＤＳ、Ｏ，ｌＸ５ＳＣ１ １％のＳＤＳ、膜は、増感スクリーンとともに一７０℃で、Ｋｏｄａｋ社のＸ− ＯＭＡＴ　ＡＲフィルムに感光された。

図３のパネルＢに、オートラジオグラフを示す、レーン８は、直線状二本鎖ＤＮ Ａの分子重量基準として機能する、［”Ｐ］−放射標識が付されたｌＫｂのＤＮ Ａラダー（ＧＩＢＣＯＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ、ＭＤ）を含む、レー ン７は、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄｌＮとともに分離された、５０９ｇの各ｐＰｏｌ ＨＹＧＩ−３ＤＮＡを含む、ＢａｍＨＩは、ＨＴＰ遺伝子の全コーディング配列 を含むｐＰｏｌＨＹＧＩ−３（レーン３）からのＢａｍＨＩ切片とともに移動す る形跡バンド（ｅｖｉｄｅｎｔ　ｂａｎｄ）を示す、１８系統のカルス（レーン １）及び４３系統のカルス（レーン２）からのＤＮＡを制限する（図３のパネル Ａ）、このバンドは、同一の酵素で切り出されたコントロールカルスＤＮＡ中に は観察されない、同様に、ＨｉｎｄＩＩＩは、Ａ　ｄ　ｈ　Ｉ　Ｓイントロン（ ｉｎｔｒｏｎ）の一部、及びＨＴＰ遺伝子全体とノスボリアデニレーション（ｎ ｏｓ　ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎｌ領域の両方に対応するヌクレオチド配 列を含むｐＰｏ　ｌ　ＨＹＧＩ−３（レーン７）からのＨｉｎｄｌＩＩ切片とと もに移動する形跡バンド（ｅｖｉｄｅｎｔ　ｂａｎｄ）を示す、１８系統のカル ス（レーン４）及び４３系統のカルス（レーン５）からのＤＮＡを制限する（図 ３のパネルＡ）。このバンドは、ＨｉｎｄＩＩＩ　（レーン６）とともに切り出 されたコントロールカルスＤＮＡ中には観察されなかった。これらのデータは、 ＨＰＴコーディング配列が１８系統及び４３系統のカルスからのＤＮＡ中に存在 することを示している。

医Ａ マンニトールｌｌ１ａｎｎｉｔｏｌ　”Ａｌ気穿孔巌ｌ羞 例２に記述されているように調製された懸濁細胞系統ＡＢ　１９４ｑｑを使用し た。細胞は、５２０μｍの膜を濾され、０．５％のＰｅｃｔｏｌｙａｓｅＹ−２ ３で２時間処理されて、ｌｏｏｕｇ／ｍ１の直鎖状プラスミドｐＢＩＩ２２１Ｄ ＮＡと、様々な濃度のマンニトール（ｍａｎｎｉｔｏｌｌを含む電気穿孔緩衝液 と混合され、例３に示されているように、１６０ボルトに充電した１４０μＦの コンデンサーの放電により電気穿孔された０組織は、例６のようにＧＵＳ活性が 分析された。青い区分の数は、３時間の保？Ｍ後に計数された。この実験の結果 は、下の表２にまとめられている。

艮１ ＧＵＳ活性を発現している マンニトールｍａｎｎｉｔ、ｏｌ　の　；０゜ ０．２Ｍ　１２０ ０．３Ｍ　１０８０ ０．４Ｍ　１７３０ ０、　５Ｍ　１３７０ 表２に与えられたデータから、電気穿孔緩衝液中の０．４Ｍのマンニトール（ｍ ａｎｎｉｔｏｌｌが、一時的な発現状態が最高になると見ることができる。

２番目の実験は、ＡＢ１２懸濁細胞を用いて、８６０μｍのろ過、９０分間のｐ ｅｃｔｏ　ｌ　ｙａｓｅ処理、５０　ｕ　ｇ／ｍ　１の直鎖状ｐＢ１１２２１Ｄ ＮＡ以外は、上記のように、０．４〜０．８Ｍ（７）マンニトール（ｍａｎｎｉ ｔｏｌ）を用いて行なわれた。結果は、０．４Ｍを越えたマンニトールｆｍａｎ ｎｉｔ、ｏｌ）ｆｉ度では、急速に一時的な発現が低下することを示している。

憇５ １虚上謬り１２１週北 個々の最初の実験の手順に合わせて、ＡＢ１２懸濁細胞は、Ｐｅｃｔｏｌｙａｓ ｅＹ−２３で消化され、５５０−１Ｏ０ＬＬ／ｍｌの直鎖イヒしたプラスミドｐ ＢＩＩ２２１ＤＮＡと、様々な濃度のグリセロール（ｇｌｕｃｅｒｏｌｌ　、シ ュークロース（ｓｕｃｒｏｓｅｌ　、ソルビトール（Ｓｏｒｂｉｔｏｌ）、また はマンニトール（ｍａｎｎｉｔｏｌｌを含む電気穿孔緩衝液中で電気穿孔（１４ ０μＦ、１４０ボルト）された。一時的なＧＵＳ活性は、例６の様に測定された 。この実験の結果は、下の表６にまとめられており、マンニトール（ｍａｎｎｉ ｔｏｌ）が優れた浸透性物質であることを示している。

〔以下　オ、［Ｆ］〕

表呈 ＧｔＪＳ活性を発現 している組織区分の （Ａ）０．４Ｍマンニトール（ｍａｎｎｉｔｏｌ）　１８７５０．１Ｍシューク ロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）　ｌ　１０．２Ｍシュークロース（ｓｕｃｒｏｓｅｌ 　５６２０．３Ｍシュークロース（ｓｕｃｒｏｓｅｌ　ｌ　２６２０．４Ｍシュ ークロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）　ｌ　２２５０．５Ｍシュークロース（ｓｕｃｒ ｏｓｅ）　３５７（Ｂ）０．４Ｍマンニトール（ｍａｎｎｉｔｏｌ）　１４４０ ０．２Ｍソルビトールｆｓｏｒｂｉｔｏｌ）　２５０．３Ｍソルビトール（ｓｏ ｒｂｉｔｏｌ）　２６５０．４Ｍソルビトール（ｓｏｒｂｉｔｏｌ）　４７００ ．５Ｍソルビトールｆｓｏｒｂｉｔｏｌ）　２５０（ＣＩ　０．４Ｍマンニトー ルｆｍａｎｎｉｔｏｌ）　５７５０１％グリセロール（ｇｌｕｃｅｒｏｌ）　７ ０５％グリセロール（ｇｌｕｃｅｒｏｌ）　３８７１０％グリセロール（ｇｌｕ ｃｅｒｏｌ）　７２０％グリセロール（ｇｌｕｃｅｒｏｌ）　０Ｂ、吐１ｊ旨１ １加 形質転換能を有する細胞の調製のための懸濁培養細胞の酵素消化は、様々なマン ニトール（ｍａｎｎｉｔｏｌ）濃度のもとで行なわれ、続いて、電気穿孔が行な われた。

培養したＡＢ１９４ｑｑ）ウモロコシ細胞の懸濁物は、５２０μｍの膜を通過さ せた。濾された細胞は、Ｐｅｃｔｏｌｙａｓｅ　Ｙ−２３で消化された。保温培 地は、Ｏ，０，２Ｍ、０．３Ｍ、または、０．４Ｍのマンニトール（ｍａｎｎｉ ｔｏｌ）を含むよう修正された。電気穿孔は、１００μｇ／ｍｌの直鎖化したｐ ＢＩＩ２２１を含む電気穿孔緩衝液中で、０．３Ｍのマンニトール（ｌＩ＋ａｎ ｎｉｔｏｌ）　（０，４Ｍマンニトール（ｍａｎｎｉｔｏｌ）を使用するよりも ）とともに、例２のように行なわれた。一時的なＧｔＪＳ発現は、例６のように 測定された。

艮Ａ 培養緩衝液内の　ＧＬＩＳ活性を発現しているマンニトールｍａｎｎｉｔｏｌ　 のゝ　ゝ０．２Ｍ　１２２００ ０．３Ｍ　１９８０ ０．４Ｍ　１２５０ 表４にまとめられているデータは、この消化緩衝液中では、０゜２Ｍのマンニト ール（ｍａｎｎｉｔｏｌ）が最適であることを示している。

医互 り　る　の・　゛ Ａ、阪見処」 ＡＢ６１）ウモロコシ細胞の懸濁培養細胞は、例３に述べられているように調製 され、８６０μｍのふるいを通過させた。１．５ｍｌのバック細胞（ｐａｃｋｅ ｄ　ｃｅｌｌ）の酵素消化は、５．０ｍｌの指示された量の酵素とともに９０分 間行なった。続＜５０％ｇ／ｍｌのｐＢｒＩ２１の電気穿孔は、１４０μＦ、１ ４０ボルトで行なわれた、電気穿孔された細胞の染色定数の重置については、そ の結果を下の表５にまとめである。０．５％のＰｅｃｔｏ　１　ｙａｓｅＹ−２ ３での懸濁細胞の処理が、最も高い一時的発現を示した。酵素処理されていない 、対象とする細胞での一時的発現は観察されなかった。

毀二 に挾ユ　ＧＵＳ活性を発現している 醪１　の゛　ン 酵素無し　Ｏ ｏ　５％Ｐｅｃｔｏ　Ｉｙａｓｅ　８０２０、５％ｄｒ　ｉ　ｓｅ　１　ａｓｅ 　７６０．５％キシラナーゼ（ｘｙｌａｎａｓｅ）　１６夾鉄ｌＧ　Ｕ　Ｓ活性 を発現している 終車　のい ０．５％Ｐｅｃｔｏ１　ｙａｓｅ　１３００．１％Ｐｅｃｔｏｌｙａｓｅ　１４ ００３％Ｐｅｃｔｏ１ｙａｓｅ　Ｏ １，０％セルラーゼ（ｃｅｌｌｕｌａｓｅ）　６０５％ｄｒｉｓｅｌａｓｅ　０ Ｏ１５％Ｐｅｃｔｏｌｙａｓｅ Ｙ−２３８３ 及びセルラーゼ（ｃｅｌｌｕｌａｓｅ）１％ｐｅｃｔｉｎａｓｅ　０ ＬＬｕ　Ｇ　Ｕ　Ｓ活性を発現している旺！　の゛ン ０．５％Ｐｅｃｔｏ’ｌ　ｙａｓｅ　６３４０１、Ｏ％ｄｒ　ｉ　ｓｅ　ｌ　ａ ｓｅ　７３０３％キシラナーゼ（ｘｙｌａｎａｓｅｌ　１４１％ｈｅｍｉｃｅｌ 　Ｉｕｌａｓｅ　０１％セルラーゼ（ｃｅｌｌｕｌａｓｅ）　０１％ｐｅｃｔ　 ｉ　ｎａｓｅ　３０２ Ｂ　旦Ｘ」月九出 ０．２Ｍのマンニトール（ｍａｎｎｉｔ、ｏｌ）を加えたＦ培地で１：１０に希 釈した後、電気穿孔した細胞を置いたプレートをパラフィルムで封をし、それを 暗所で２６℃、１６時間、回転振とり培養１ｊｌＩ（毎分４０〜６０回転）上に ！いた。細胞を１５ｍ！遠心管に移し、ベックマンＴＪ−６遠心機にて低速で５ 分間遠心する。全ての液体を取り除いて、ＧＵＳ検出緩衝液を４７５μｌ加える 。ＧＵＳ検出緩衝液は、Ｉｍｇ／ｍｌの５−ブロモ−４り四ロー３インドールー β−Ｄ−グルクツイド（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙ ｌ−β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅｌ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｏｒｇａｎｉｃｓ）、 １００ｍＭのリン酸す）・リウム（ｓｏｄｉｕｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）　（ｐ Ｈ７，０）　、５ｍＭのフェリシアン化カリウム（ｐｏｔａｓｉｕｍ　ｆｅｒｒ ｉｃｙａｎｉｄｅ）とフェロシアン化カリウムｆｐｏｔ、ａｓｓｉｕｍ　ｆｅｒ ｒｏｃｙａｎｉｄｅ）、１０　ｍＭのＥＤＴＡ、０．０６％のトリトンｘ−ｉ　 ｏｏ、そして、０．２Ｍのマンニトール（ｍａｎｎｉｔｏｌｌを含んでいた。サ ンプルは、１２ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ　（Ｃｏｓｔａｒ　３５１２）中に置かれ 、−晩、３７℃で培養した。それぞれのサンプルにおいて青区分の数を数えた。

一つの区分は、一つもしくはそれ以上のひとかたまりの青細胞として定義される 。

ｐＢＩＩ２２１の３０μｇ／ｒｒ＋１を、上記のバートＡに従って様々な組の酵 素にて処理したＡＢ６１細胞へ電気穿孔した。ＧＵＳ検出の結果を、表６に示し た。

６　、の　みＡわせ ＧＵＳ活性を発現している Ｐｅｃｔｏｌｙａｓｅ　＋＋　３０％ ０，５％ Ｐｅｃｔｏｌｙａｓｅ　＋＋＋＋　＜１０％０．５％ｄｒｉｓｅｌａｓｅ ０．５％ Ｐｅｃｔｏｌｙａｓｅ　＋＋＋＋　＜１０％０．５％ Ｐｅｃｔｏ　１　ｙａｓｅ　＋＋　２５％０．　１　％ｄｒ　ｉ　ｓｅ　１　ａ ｓｅｌ、０％ｄｒｉｓｅｌａｓｅ　＋　１０％０、７５％ ｄｒ　ｉ　Ｓｅ　ｌ　ａｓｅ＋　＋＋＋＋十　不実施５％ｐｅｃｔｏ　１　ｙａ ｓｅ ０、９％ｄｒ　ｉ　ｓｅ　ｉ　ａｓｅ＋０．１％ｐｅｃｔｏｌｙａｓｅ　＋１／ ２　不実施様々な組み合わせのｐｅｃｔｏ　１　ｙａｓｅとｄｒｉｓｅｌａｓｅ が、ｐｅｃｔｏ　ｌ　ｙａｓｅＹ−２３、またはｄｒｉｓｅｌａｓｅ単独に比べ て２倍以上大きく一時的な発現を増大できる。しかし、そこには、生存能力の重 大な損失がある。ヘミセルラーゼ（ｈｅｍｉｃｅｌｌｕＩａｓｅ）やセルラーゼ ｆｃｅｌｌｕｌａｓｅ）は、ＧＵＳの発現を示さなかった。一時的発現は、１， ０％のペクチナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔ。

ｎ、Ｆｒｅｅｈｏｌｄ、ＮＪ）を使用した場合、比較できる生存能力において２ ０倍はど低くなった。ＰｅｃｔｏｌｙａｓｅＹ−２３は、好適な処理である。

医ニ ー　・ン　にお番る　゛の と　力１　ム　ＫＣＩ　の パートＡ ＡＢ　１９４ｑｑの懸濁培養細胞を５２０μｍのふるいにかけ、０５％のＰｅｃ ｔｏ　ｌ　ｙａｓｅＹ−２３で、２６℃、２時間処理した。洗浄した組織を、指 示された成分を含む電気穿孔溶液（ｐＨ７，５）に再懸濁した。１００μｇ／ｍ ｌの直鎖状ｐＢＩＩ２２１ＤＮＡを含む電気穿孔緩衝液を等量加え、それで組織 のＤＮＡ混合物の０．５ｍ１分画を、１６０ボルトで充電した１４０μＦのコン デンサーを使用して電気穿孔した１組織のサンプルは、例６に従って、２６℃、 １６時間の培養に続けてＧｔＪＳ活性のため検出した。この研究の結果は、下記 の表７に要約しである。

艮ユ ＧＵＳ活性を マンニトール（Ｍ）発現している 　０ｍＭ リン酸ナトリウム　５０　０．　２　００　０、　２　８６ ０ｍＭ ＨＥＰＥＳ　５０　０．　２．　９ ０　０．２　１１０４ バートＢ ＡＢ１９４ｑｑ！濁細胞培養を５２０４ｚｍのふるいにかけ、０゜５％のＰｅｃ ｔｏ　ｌ　ｙａｓｅＹ−２３で、２６℃、２時間処理した。洗浄した組織を、１ ０ｍＭのＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，５）、０．４Ｍのマンニトール（ｍａｎｎｉｔ ｏｌｌ　、そして、様々な量のＫＣＩを含む電気穿孔緩衝液中において再懸濁し た。１００μｇ／ｍｌの直鎖状ｐＢＩＩ２２１ＤＮＡを含む電気穿孔緩衝液を等 量加え、組織のＤＮＡｌｆｉ合物の０．５ｍ１分画を、１６０ボルトで充電した １　４０μＦのコンデンサーを使用して電気穿孔した６組織のサンプルは、上記 のバートＡのように、２６℃、１６時間の培養に続けて、ＧＵＳの活性のために 検出を行なった。この研究の結果は、下記の表８に要約しである。

〔ν・ｋ千　１−白〕 表呈 ！二ｍ翫液 凡旦上ユニＭ）　ＧＵＳ活性を発現 している組織区分 Δ玉塩数−−−− Ｑ　２９４０ これらのデータは、電気穿孔緩衝液がＨＥＰＥＳ緩衝液を含み、ＫＣｌを含まな いときに、一時的発現が最大になることを示している。

医旦 −・多　の　にお番る　の　の ＡＢ１８トウモロコシ組織の懸濁培養細胞を、５２０μｍまたは８６０μｍのい ずれかのふるいにかけ、Ｐｅｃｔｏ　１　ｙａｓｅＹ−２３で、２６℃、２時間 培養した。洗浄した細胞を、電気穿孔溶液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７， ５）、０．４Ｍのマンニトール（ｍａｎｎｉｔｏｌｌ）中において再懸濁し、そ して、４℃、または２５℃（室温）のいずれかに放置した。５０μｇ／ｍｌの直 鎮状ｐＢＩＩ２２１　ＤＮＡを含む同じ温度の電気穿孔溶液を等量加え、組１１ ＤＮＡの混合物の０．５ｍ１分画を、１６０ボルトで充電した１　４０ｕＦのコ ンデンサーを使用して２５°Ｃで電気穿孔し、そして、直ちに１０〜１５分間、 それらの前の培養温度に戻した。全ての組織のサンプルは、次に２５℃に置かれ 、０．３Ｍのマンニトール（ｍａｎｎｉｔ。

１）を含む溶媒で１０倍に薄められた０組織のサンプルは、上記の例７のように 、２６℃、１６時間の培養に続けて、ＧＵＳ活性のために検出を行なった。この 実験の結果は、下記の表９に要約しであるＡ　６　ｕ）　Ｏ太１１　電気穿孔の 前後での　ＧＵＳを発現している１の　の・・ユ ５２０μｍ　４℃　１１９０．１１１５５２０μｍ　２５℃　２１７５．２２５ ０８６０ｕｍ　４℃　２５０．　３６０ ８６０μｍ　２５℃　１０００．　７５０電気穿孔処置の全期間、２５℃に維持 されていた組織のサンプルは、それに対応する、電気穿孔の前後で４℃にて培養 されていたサンプルより、２〜］ｇ高い水準で一時的形質転換していた。温度は 、電気穿孔後の組織の生存能力には何の効果もなかった。

医ニ ー　多　の　にお（るコンーン　−と ＡＢ１２懸濁培養細胞を５２０μｍのスクリーンを介して強制ふるいにかけ、そ して、０．５％のＰｅｃｔｏｌｙａｓｅＹ−２３で、２６℃、１．５時間処理し た。洗浄した組織を、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，５）と０．４Ｍのマン ニトール（ｍａｎｎｉｔｏｌ）を含む電気穿孔緩衝液中にて再懸濁した。１００ μｇ／ｍｌの直鎖状ｐＢＩＩ２２１ＤＮＡを含む電気穿孔溶液を等量加え、組織 ＤＮＡの混合物の０．５ｍ１分画を、様々な電圧で充電されている指示容量のコ ンデンサーを使用して電気穿孔した。組織のサンプルは、上記の例７に従って、 ２６℃、１６時間の培養の後、ＧＵＳ活性のために検出を行なった。典型的な実 験結果は、下記の表１０に要約しである。

表工且 ＧＵＳ活性を ４６５ｘ　電界強度　発現している コンデンサ　１圧　式虹困ム虹　組織区分の　組織の五凰ユ且工）　玉塩数−− −！正能力 ２５０　１４０　５６０　６５００　＋２５０　１００　４００　２７５０　＋ ＋２５０　７０　２８０　２００　＋＋＋１４０　１４０　５６０　５０００　 ＋１４０　１００　４００　２４８５　＋＋１４０　７０　２８０　１８０　＋ ＋＋表１０のデータは、両方のコンデンサーが同じ電圧で充電されたとき、２５ ０μＦのコンデンサーにて、わずかに高い水準の一時的形質転換が達成できたこ とを示している０両方のコンデンサーにおいて、電圧とともに一時的形質転換が 増大し、その一方で、細胞の生存能力は減少した。２５０μＦと１４０μＦのコ ンデンサーに対するパルス減衰時間は、それぞれ、４０ｍ５ｅｃと８０ｍ５ｅｃ であった。約２８０−５６０　Ｖ　／　ｃ　ｍの電界強度で、７０〜１４ｏＶで 充電したとき、２５０ｕＦと１４０４ｚＦのコンデンサーは、調べられた他のい くつかのコンデンサー及び電圧に比べて、最良の一時的形質転換の組換え及び生 存能力を示した。

匠上ニ ー　・ン　の　にお番るＤＮＡの゛　と多、の懸濁したＡ　Ｅ　］、　８細胞を ５２０μｍのフィルターに通し、０．５％のＰｅｃｔｏ　ｌ　ｙａｓｅＹ−２３ で、２６℃、２時間処理した。

洗浄した組織を、電気穿孔緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，５）、０ ．４Ｍのマンニトール（ｍａｎｎｉｔｏｌ）　）中において再懸濁した。Ｅｃｏ Ｒｌの直鎖状、または超コイル構造のｐＢＩ工２２１ＤＮＡを含む電気穿孔溶液 を、表１１で指示された濃度で等量加え、そして、組織ＤＮＡの混合物の０．５ ｍ１分画を、例９の処置に従って、１６０ボルトで充電された１４０ｕＦのコン デンサーを使用して電気穿孔した０組織のサンプルは、例７の処置に続け、２６ ℃、１６時間の培養に続けて、ＧＵＳ活性のために検出を行なった。

この実験結果は、下記の表１１に要約しである。

表上土 電気穿孔ごとに使用した　ＤＮＡの　ＧＵＳ活性を発現ＤＮＡ　ｍ　１　肚皿− −している組織区分玉虫致−−−−− ４００　直鎮状　１７，８７３ ２００　直鎖状　１５，３２０ １００　直鎖状　９．６５０ １００　超コイル構造　２４０ ７５　直鎖状　４，９４０ ５０　直鎮状　２，３２０ ２５　直鎮状　１，４４５ 表１１のデータは、２００μｇ／ｍｌまでは、直鎖状ＤＮＡの量の増大に従って 、一時的発現が、はぼ直線的に増大してい（ことを示している。２００ｕｇ／ｍ ｌより多いＤＮＡの量では飽和している。一時的発現は、超コイル構造のＤＮＡ に比べて直鎖状のＤＮＡの方が約４０倍大きい、電気穿孔において、２００μｇ ／ｍ＋で型通りにＤＮＡを使用することは論理的に禁止されているので、ＤＮＡ は、５０〜ｌＯＯμｇ／ｍｌで使用するのが好ましい。

上記において引用された全ての文献や文書は、ここに参考のためあげられている 。

本発明は、様々な特異かつ好適な実施例、及び技術を参照しながら述べられてい る。しかし、本発明の主旨及び範囲を逸脱しない限度において、多くの変形や変 更が可能であることは明らかである。

−二 圃静膿審報牛 ｌ＋＋ｘ＋＋１ｗ＋ｌＡｗｌｌｅ＋ｆｆｗＮｅ　ＰＣＴ”Ｓ”１０９６１９フロ ントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＰＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、 　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、Ｒ○、ＳＤ、ＳＥ、５Ｏ （７２）発明者　アンダーソン、　ポール　シー。

アメリカ合衆国　ミネソタ州　５５４１６　ミネアポリス、　ユーイング　アベ ニューサウス　１９３３

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．異種の組換えＤＮＡによって安定した形質転換となるＺｅａｍａｙｓ細胞集 団の製造方法において、（ａ）固形の組織培養培地に、胚様のＺｅａｍａｙｓカ ルス組織の培養を供給し、 （ｂ）Ｚｅａｍａｙｓ細胞の懸濁培養細胞を生成するため、前記培養カルス組織 を液体増殖培地へ移動し、そして（ｃ）形質転換能力のあるＺｅａｍａｙｓ細胞 集団を生成するため、水成の浸透性物質の中で、少なくとも一種類のペクチン分 解酵素にて培養Ｚｅａｍａｙｓ細胞集団の培養を行ない、そこでは、トランスジ ェニックＺｅａｍａｙｓ細胞集団を生成するための電気穿孔によって、前記の細 胞のかなりの数が組換えＤＮＡの安定した形質転換を可能にし、また、前記トラ ンスジェニック細胞のかなりの数が、遺伝性を持つ前記組換えＤＮＡを含む、繁 殖力のあるトランスジェニックＺｅａｍａｙｓ植物集団に再生可能である。
2. ２．請求項１に記載の方法を使用して製造したＺｅａｍａｙｓ細胞集団。
3. ３．トランスジェニックＺｅａｍａｙｓカルス組織を生成する方法において、 （ａ）固形の組織培養培地上に、胚様のＺｅａｍａｙｓカルス組織の培養を供給 し、 （ｂ）Ｚｅａｍａｙｓ細胞の懸濁培養細胞を生成するために、前記培養したカル ス組織を液体増殖培地へ移動し、そして（ｃ）形質転換能力があるＺｅａｍａｙ ｓ細胞集団を生成するために、水成の浸透性物質の中で、少なくとも一種類のペ クチン分解酵素にて培養Ｚｅａｍａｙｓ細胞集団を培養し、（ｄ）組換えＤＮＡ によって安定に形質転換されるトランスジェニックＺｅａｍａｙｓ細胞集団を生 成するために、前記組換えＤＮＡを有する緩衝作用のある水成の浸透性物質の中 で、形質転換能力のあるＺｅａｍａｙｓ細胞集団を電気穿孔し、そして（ｅ）前 記細胞からトランスジェニックＺｅａｍａｙｓカルス組織を育成し、そこでは、 繁殖力のあるトランスジェニックＺｅａｍａｙｓ植物が、前記カルス組織、遺伝 性のある前記ＤＮＡを有する前記植物から再生可能である。
4. ４．請求項３に記載の方法により製造されたトランスジェニックＺｅａｍａｙｓ カルス組織。
5. ５．トランスジェニックＺｅａｍａｙｓ植物の生成する方法において、 （ａ）固形の組織培養培地上に、胚様のＺｅａｍａｙｓカルス組織の培養を供給 し、 （ｂ）Ｚｅａｍａｙｓ細胞の懸濁培養細胞を生成するために、前記培養したカル ス組織を液体増殖培地へ移動し、（ｃ）形質転換能力のあるＺｅａｍａｙｓ細胞 集団を生成するために、水成の浸透性物質の中で、少なくとも一種類のペクチン 分解酵素にて、培養Ｚｅａｍａｙｓ細胞集団を培養し、（ｄ）組換えＤＮＡによ って安定に形質転換されるトランスジェニックＺｅａｍａｙｓ細胞を生成するた めに、前記組換えＤＮＡを有する緩衝作用のある水成の浸透性物質の中で、形質 転換能力のあるＺｅａｍａｙｓ細胞集団を電気穿孔し、（ｅ）前記細胞からトラ ンスジェニックＺｅａｍａｙｓカルス組織を育成し、そして （ｆ）前記トランスジェニックカルス組織から、繁殖力のあるトランスジェニッ クＺｅａｍａｙｓ植物集団を再生し、そこでは、前記植物は、遺伝性のある前記 ＤＮＡを有する。
6. ６．請求項５に記載の方法によって生成されたトランスジェニック植物集団。
7. ７．工程（ａ）におけるＺｅａｍａｙｓカルス組織の培養がもろい請求項１，３ あるいは５に記載の方法。
8. ８．Ｚｅａｍａｙｓカルス組織の培養は、未熟胚の培養によって得られる請求項 １，３あるいは５に記載の方法。
9. ９．前記ペクチン分解酵素は、ペクチナーゼ（ｐｅｃｔｉｎａｓｅ），ｅｎｄｏ ｐｅｃｔｉｎｌｙａｓｅ，ｅｎｄｏｐｏｌｉｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅ，また はそれらの混合にて構成される請求項１，３あるいは５に記載の方法。
10. １０．凝集されたＺｅａｍａｙｓ細胞のｍｌあたり、解離活性として計測された 略３００〜５００単位の酵素活性が、工程（ｃ）における水成の浸透性物質の中 に存在する請求項９に記載の方法。
11. １１．前記ペクチン分解酵素はｐｅｃｔｏｌｙａｓｅである請求項１，３あるい は５に記載の方法。
12. １２．工程（ｃ）における水成の浸透性物質は、さらにセルラーゼ（ｃｅｌｌｕ ｌａｓｅ），キシラナーゼ（ｘｙｌａｎａｓｅ）、またはそれらの混合にて構成 される請求項９に記載の方法。
13. １３．培養は、略０．７５〜３．０時間、略３０℃で行なわれる請求項９に記載 の方法。
14. １４．前記浸透性物質は、糖や（Ｃ２〜Ｃ６）の多価アルコール（ｐｏｌｙｏｌ ）を有する請求項１，３あるいは５に記載の方法。
15. １５．浸透性物質は、グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ），シュークロース（ｓ ｕｃｒｏｓｅ），ソルビトール（ｓｏｒｂｉｔｏｌ），マンニトール（ｍａｎｎ ｉｔｏｌ）、またはそれらの混合である請求項１４に記載の方法。
16. １６．浸透性物質は、略０．３〜０．５Ｍ溶液の糖や（Ｃ２〜Ｃ６）の多価アル コール（ｐｏｌｙｏｌ）を有する請求項１５に記載の方法。
17. １７．電気穿孔は、略１４０〜２５０μＦ，略７０〜１４０Ｖ，略２８０〜５６ ０Ｖ／ｃｍで行なわれる請求項１，３あるいは５に記載の方法。
18. １８．水成浸透性物質のｐＨは、略７〜７．７である請求項１，３あるいは５に 記載の方法。
19. １９．組換えＤＮＡは直鎖状のプラスミドＤＮＡである請求項３あるいは５に記 載の方法。
20. ２０．工程（ｄ）では、凝集したＺｅａｍａｙｓ細胞の０．１ｍ１あたり、略１ 〜１００μｇの組換えＤＮＡが存在する請求項１９に記載の方法。
21. ２１．組換えＤＮＡは、選択できる標識遺伝子あるいはレポーター遺伝子を有す る請求項１９に記載の方法。
22. ２２．前記選択できる標識遺伝子は、ハイグロマイシンＢ（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉ ｎＢ）に対する抵抗性をエンコードしている請求項２１に記載の方法。
23. ２３．レポーター遺伝子は、 β−グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）をエンコードしてい る請求項２１に記載の方法。
24. ２４．組換えＤＮＡは、蛋白質をエンコードしている請求項３あるいは５に記載 の方法。
25. ２５．前記蛋白質は種保存蛋白質である請求項２４に記載の方法。
26. ２６．前記蛋白質は酵素である請求項２４に記載の方法。