JPH07502987A - サイトカインおよび抗原を用いた全身の免疫応答の調節 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

関連した出願の前後参照 これは１９９１年１０月４日に提出された米国出願第０７／７７１，１９４号の 継続出願であり、その開示内容は参考文献として本明細書中に取り入れる。 発明の分野 本発明は、関連する側面すべてにおいて、標的抗原または抗原に対する個人の免 疫応答を変化させる方法に関する。より具体的には、本発明は、個人の免疫応答 を増加させるまたは減少させるように、標的抗原および少なくとも１つのサイト カインを同時に投与することに関するものである。可能な抗原としては腫瘍細胞 、腫瘍細胞抗原、感染性薬品、外来抗原、または非外来性の化合物が含まれる。 また発明は、抗原およびサイトカインを同時に投与する方法および組み合わせに も関するものである。 発明の背景 免疫体系は、感染、自己免疫、異系移植の拒絶、および腫瘍を含む広い範囲の重 要な病気および状態の病原性に重要な役割を担っている。これらの不調において 免疫体系の過ちは、広い意味で、有害な標的に対して十分に強力な応答ができな いため、または望ましい標的に対して不適切に有害な応答をするためであると考 えられる。化学療法、手術、および放射線療法を含むこれらの病気に対する標準 的な医学的処置は、効率および毒性の両方に関して明らかに限界がある。病気ま たは状態を回避することが理想であるが、典型的にはこれらの方法はほとんど成 功したことがない。免疫応答を特別に細工することを基礎とした新しい方法が大 いに必要とされている。 先の技術の記載 読者が便利なように、テキストで参照される参考文献は数字で括弧にいれて表し た。これらの数字は、添えられた文献の中に数字で書かれた参考文献に相当する 。これらの参考文献を通して、これらは明白に参考文献として本明細書中に取り 入れる。 抗腫瘍免疫を昂進させるワクチンとして　がん細胞を利用することは今世紀を通 じて開発された（１）。しかし、普通、がん細胞の免疫原性は病気に打ち勝つの に十分な明白な免疫反応を引き出すには弱すぎる。これらの未熟なワクチンに対 する強い応答は普通部分的かまたは比較的一時的である。ＢＣＧおよびコリネパ クテリウムパルバムのような非特異的免疫刺激剤を使用することを含む、このよ うな予防接種の効能を改良する試みはほとんど進歩が見られなかった。 １つの方法は細胞を異なる方法で処理する事によって腫瘍細胞の免疫原性を増加 させることであった。たとえば米国特許第４．９３１．２７５号は圧力、コレス テリルヘムスクシネート、細胞膜、または自細胞の膜蛋白質で処理した細胞をワ クチンとして用いることを記載している。これらの方法は抗原の免疫原性をより 強くするために表面抗原の露出を促進する試みである。 もう１つの方法はサイトカインと免疫体系の相互作用に焦点をあてている。サイ トカインおよびサイトカインの組み合わせは免疫体系の刺激に重要な役割を果た していることが示されている。たとえば米国特許第５，０９８，７０２号では存 在する腫瘍と闘うのに相乗的に効果的な量のＴＮＦ、ＩＬ−２、およびＩＦＮ− βの組み合わせを用いると記載している。米国特許第５．０７８，９９６号では 、腫瘍をもつ患者を処置するのに、組み変えＧＭ−Ｃ３Ｆを注入する事によって マクロファージの非特異的腫瘍活性の活性化させることを記載している。 この方法をさらに発展させたものとして、腫瘍形成に関わるサイトカインの影響 を評価するために遺伝学的に修飾した腫瘍細胞を用いるものがある。腫瘍発生に 影響を与えるのに必要なサイトカインの量はたいてい全身に有害であるため、患 者を直接処置することは適していないことが多い。（例えば（２）および（３） を参照）。従って、サイトカイン伝達の別の方法が発展してきている。遺伝学的 に修飾された細胞で伝達することによっである種のサイトカインを局所的に高濃 度にすると腫瘍の退行をひきおこすことが示されている（４．　５）。このよう に、ネズミ腫瘍細胞をいろいろなサイトカイン遺伝子で形質導入することによっ て、同系の宿主による遺伝学的に修飾された細胞の拒絶が引き起こされることが 示されている。例えば、マウスに注入された悪性のマウス神経芽腫細胞の増殖は 、γ−■ＦＮを恒常的に高発現させた細胞では強く抑圧された（４．　６）。Ｉ Ｌ−４を発現している乳腺がん腫瘍細胞をいろいろなトランスフェクトしていな い腫瘍細胞と混ぜて注入することによって、すべてのタイプの腫瘍形成が阻害ま たは妨げられた（７）。似たような結果がＩＬ−２（８，９）　、ＴＮＦ−α（ ２，１０゜１１）、Ｇ−Ｃ３Ｆ　（１２）、ＪＥ　（１３）、およびＩＬ−７（ １４）でも見られた。 また他の方法として遺伝学的に修飾された腫瘍細胞をワクチンとして使用すると いうものがある。ＩＬ−２を発現している腫瘍細胞を注入すると、第１に腫瘍形 成を抑圧するだけでなく、一時的な全身の免疫をも付与する。このようにしてマ ウスは次に起こる腫瘍細胞の攻撃を拒絶するようになる（８）。例えば、マウス はワクチン注入後２週間では腫瘍細胞を拒絶することはできたが、４週間後はで きなかった（８）。最初にワクチンを注入して２週間後、他の腫瘍細胞は普通に 増殖しているという点でこの免疫は腫瘍特異的である。似た結果がＴＮＦ−αに おいてもみられた。すなわち、最初の腫瘍拒否反応を経験した動物は２週間後に 攻撃を受け、少な（とも４０日間は新しい腫瘍を作らなかった（２）。ＩＦＮ− γではいくらか長い全身の免疫が見られる。即ち腫瘍細胞を産生ずるＩＦＮ−γ を予防接種したマウスでは注入後６週間に修飾されていない腫瘍細胞を拒絶する ことができた。 ワクチンの最も望ましい特徴である、以前に成長している腫瘍を攻撃する免疫シ ステムを刺激するワクチンの効能はそれほど明白ではない。ＩＬ−４、ＩＦＮ− γ、およびＩＬ−２に関しては、サイトカインを産生ずる腫瘍細胞を注入しても 、動物の異なる部位において修飾されていない腫瘍細胞の増殖に影響を与えなか った。修飾されていない腫瘍細胞または、腫瘍細胞を産生ずる修飾されたサイト カインを同時に注入した細胞はすでに確立された腫瘍かどうかは証明されていな い（それぞれ７．　４．　９および８）。最近の１つの例としては、ＩＬ−４を 分泌するように作製された腫瘍細胞が、確立された腎臓がん細胞を拒絶すること に成功した（１５）。 これらの研究は抗腫瘍免疫を昂進させる方法として遺伝子変換を可能なかぎり利 用することを指示するであろうが、これらのシステムには多くの問題がある。 まず最初に、既に存在するがんを処置することは研究の最初の目的の１つである 。 この方法でワクチンは非常に重要であるが、例えば特に前癌性の患者において、 またはある個人が決まった癌になるような場合（ＡＩＤＳ患者のような）は、全 身に存在する癌を処置できるかどうかが特に興味となる。もう１つの問題点は、 ワクチンの効能が比較的短期間であることである；即ち、一般的にこれらのワク チンは予防接種後２から６週間以下の腫瘍の攻撃に対してのみ有効である。 またサイトカインを発現するように作製する事によってこのような免疫が誘導さ れるメカニズムは目下不明である。たとえば現在までのところ、どんな遺伝子変 換の研究を行っても、このような生きたワクチンの効能を、単に何も導入してい ない細胞で宿主を予防接種することによって促進されたり、γ照射または他の方 法によって、または移植の後手術で除去された何も導入していない細胞によって 不活性化される免疫応答になぞらえるこはできない。これは非常に重要なことで あろう。なぜなら、このような予防接種計画のみで強力な抗腫瘍免疫を刺激する ことができることを多量の文献が示しているからである（１６．　１７．　１８ ゜１９）。 発明の要約 本発明は、ある種のサイトカインおよびサイトカインの組み合わせを発現してい る腫瘍細胞がこれらの細胞の注入を受けた個人に対して長期間の特異的な全身の 免疫を付与するという決定に基づくものである。この発見により、本発明は、有 用な抗原に対する個人の免疫応答の、刺激的または抑圧的な方法での調節を提供 する。本発明の方法は、治療上の実用法ばかりでな（予防的な目的にも有用であ る。即ち、腫瘍の発生または進行、ＡＩＤＳのような細菌またはウィルスの感染 、移植組織の拒否反応、または自己免疫状態から個人を守るのに有用である。 本発明はまた、確立された腫瘍のような既に存在する腫瘍、状態、または病気の 反転または抑圧、ＡＩＤＳのような細菌またはウィルスの感染、移植された組織 の拒否反応、または自己免疫応答において有用性を見いだすだろう。加えて本発 明は、他の細菌、真菌、ウィルス、寄生虫および原生動物の感染ばかりでなくＡ ＩＤＳに関する２次感染のような慢性性の、および生命を脅かす感染の処理に有 用性を見いだす。本発明の特に有利なことは、個人における効果を最大にし、理 想的な結果を最大限に活用するために、サイトカインを選択できる点にある。 本発明の１つの側面として、標的抗原に対する個人の免疫応答を調節する方法が 示されている。標的抗原および少なくとも１つのサイトカイン、接着または補助 分子、またはその組み合わせを、全身の免疫応答が存在するような形で個人に同 時に投与する事によって、調節することができる。抗原およびサイトカイン、接 着または補助分子、またはその組み合わせは、全身の免疫応答を引き起こす治療 上効果的な量を同時に投与する。 本発明のもう１つの側面は、そのままでまたは遺伝学的操作の結果、標的抗原に 対する免疫応答が調節できるように個人に投与されるべき標的抗原および少な（ とも２つのサイトカインを発現する細胞を利用するという点にある。例えば促進 された免疫応答が理想的であるようなタイプの腫瘍細胞を、投与されたサイトカ インが発現されるように作製することができる。結果的に遺伝学的に作製された 腫瘍細胞は、さらなる腫瘍細胞の発生を防ぐようにワクチンとして使用されるか 、または既に存在する腫瘍を反転させるために伝達小胞として使用される。 本発明の特別な点はＧＭ−Ｃ３ＦおよびＩＬ−２という２つのサイトカインを発 現する腫瘍細胞を用いる点、および修飾される腫瘍細胞としてメラノーマ細胞を 用いるという点にある。 本発明の別の側面は、個人に投与される以前に照射されているかまたは増殖不能 となっていて、サイトカインを発現する修飾された腫瘍細胞を用いる点にある。 これらの照射された修飾された細胞は治療上効果的な量投与される。これらの細 胞を投与する事によって、刺激するような形でまたは抑圧するような形で、個人 の全身の免疫応答を調節することができる。ＧＭ−Ｃ３Ｆを発現する細胞、特に ＧＭ−Ｃ３Ｆを発現するメラノーマ細胞はとりわけ有用である。ＧＭ−Ｃ３Ｆ。 ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＣＤ２およびＩＣＡＭを発現する照射された腫瘍細胞は本 発明において有用である。 本発明の別の側面は、存在する以前の腫瘍を反転または抑圧するためのサイトカ インを発現する修飾された腫瘍細胞を使用することにある。腫瘍細胞は２つのサ イトカイン、例えばＩＬ−２およびＧＭ−Ｃ８Ｆ、または３つのサイトカイン、 例えばＩＬ−２、ＧＭ−Ｃ３ＦおよびＴＮＦ−αを発現しているであろう。３番 目のサイトカインはＩＬ−４、ＣＤ−２またはＩＣＡＭかもしれない。腫瘍細胞 はまた投与される以前に照射されているかまたは増殖不能となっているであろう 。 本発明は別の点で、サイトカインを発現する腫瘍細胞を遺伝学的に作製するため に、レトロウィルスベクターを用いた点に触れている。本発明は１つのサイトカ インをコードするレトロウィルスベクターによって腫瘍細胞を１つだけ感染させ る方法、または異なるいくつかのサイトカインをコードするレトロウィルスベク ターによって複数感染させる方法を利用している。 い（つかのレトロウィルスベクターを用いている。１９９１年１０月３１日（Ｐ ＣＴ／ＵＳ９１１０８１２１．１９９１年１０月３１日提出）に提出された米国 出願第０７／７８６，０１５ではＭＦＧ、ａ−３ＧＣ，ｐＬＪ、およびｐＥｍベ クターをより取り入れている。参考文献として本明細書中で取り入れられており 、本発明で特に利用されていることがわかるであろう。 図面の簡単な説明 図１は、本発明に有用な組み換えレトロウィルスベクターの概略図を表す。図Ｉ ＡはＭＦＧベクターの詳細絵図を示す。図ＩＢはｐＬＪベクターを示す。図ＩＣ はｐＥｍベクターを示す。図ＩＤはα−８ＧＣベクターを示す。 図２： 図２Ａは、予防接種後さまざまな時間における野生型Ｂ１６メラノーマ細胞によ る二次攻撃に対する、ＩＬ−２を発現する８１６メラノーマ細胞の防御能力をグ ラフで表す。 図２Ｂは、予防接種後の、野生型Ｂ１６メラノーマ細胞による二次攻撃に対する 、Ｉ　Ｌ−２および第２のサイトカイン（示されている）を発現するＢ１６メラ ノーマ細胞の防御能力をグラフで表す。記号○は腫瘍攻撃に負けて死亡した動物 を表し、記号・は腫瘍攻撃から防御された動物を表す。 図２Ｃは、野生型Ｂ１６メラノーマ細胞による二次攻撃Ｉこ対する、ＩＬ−２お よびＧＭ−Ｃ３Ｆ並びに第３のサイトカイン（示されてし）る）を発現するＢ１ ６メラノーマ細胞の防御能力をグラフで表す。 図３゜ 図３Ａは、野生型Ｂ１６メラノーマ細胞による攻撃に対する、ＧＭ−Ｃ５Ｆを発 現する、放射線照射されたＢ１６メラノーマ細胞の防御＃詮方をグラフで表す。 記号Ｏは腫瘍攻撃に負けて死亡した動物を表し、記号・１ま腫瘍攻撃力１ら防御 された動物を表す。 図３Ｂは、様々な量の、若しくは形質導入されていないＢ１６メラノーマ細胞と 混合したときの野生型Ｂ１６メラノーマ細胞による攻撃（こ対する、ＧＭ−Ｃ３ Ｆを発現する、放射線照射されたＢ１６メラノーマ細胞の防御能力をグラフで表 す。記号Ｏは腫瘍攻撃に負けて死亡した動物を表し、記号・（ま腫瘍攻撃力）ら 防御された動物を表す。 図３Ｃは、ＧＭ−Ｃ３Ｆを発現する、放射線照射されたＢ１６メラノーマ細胞が 、示されたような形質導入されていないＢ１６メラノーマの生細胞（予め確立さ れた腫瘍）を接種しｔこ後の免疫反応を増大させる能力をグラフで表す。言己号 ○は腫瘍攻撃に負けて死亡した動物を表し、記号・（ま腫瘍攻撃力）ら防御され た動物を表す。 図４は、野生型Ｂ１６メラノーマ細胞による二次攻撃：こ対する、サイトカイン （示されている）を発現する、放射線照射された８１６メラノ一マ細月包の防御 能力をグラフで表す。記号○は腫瘍攻撃に負けて死亡しｔこ動物を表し、言己号 ・（は腫瘍攻撃から防御された動物を表す。 図５は、Ｂ１６メラノーマを予防接種した部位の組織学的分析を写真で表す。 図５Ａは、放射線照射され、ＧＭ　Ｃ８Ｆを形質導入された腫瘍を予防接種した 部位を示す。図５Ｂは、放射線照射され、形質導入されてし）なＬλ腫瘍を予防 接種した部位を示す。図５０は、放射線照射され、ＧＭ−Ｃ３Ｆを形質導入され た腫瘍の予防接種からの放出しているリンノく節を示す。図５Ｄ＋よ、放射線照 射され、形質導入されていない腫瘍の予防接種からの放出してし）るＩＪンノ（ 節を示す。図５Ｅは、放射線照射され、ＧＭ−Ｃ８Ｆを形質導入された腫瘍細胞 で予防接種されたマウスの攻撃部位を示す。図５Ｆは、放射線照射され、形質導 入されていない腫瘍細胞で予防接種されたマウスの攻撃部位を示す。図５Ｇは、 予防接種を受けていないマウスにおける攻撃部位を示す。 図６： 図６Ａは、放射線照射され、ＧＭ−Ｃ８Ｆを形質導入されたＢ１６メラノーマ細 胞により生じた全身性免疫にリンパ球の一部が寄与することを、グラフで表す。 図６Ｂは、種々の効果器：標的比でガンマ−インターフェロン処理したＢ１６標 的細胞における、４時間後での５１Ｃｒ放出アツセイにより決定された、ＣＤ８ をブロックしうるＣＴＬ活性をグラフで表す。ＧＭ−Ｃ３Ｆ形質導入された若し くは形質導入されていない、放射線照射されたＢ１６細胞を用いた予防接種後１ ４日百日牌臓細胞を回収し、ガンマ−インターフェロン処理したＢ１６細胞で５ 日間１旦　ｖｉｔｒｏで刺激した。 図７は、以前のサイトカイントランスフエクンヨン研究に使用された、放射線照 射され、形質転換されていないマウス腫瘍細胞の抗原性をグラフで表す。記号○ は腫瘍攻撃に負けて死亡した動物を表し、記号・は腫瘍攻撃から防御された動物 を表す。 図８は、放射線照射された、示されたタイプの腫瘍細胞のＧＭ−Ｃ３Ｆが全身性 免疫を高める能力を、形質導入されていない放射線照射された腫瘍細胞と比較し て、グラフで表す。 図９は、ＩＬ−２、ＧＭ−Ｃ３Ｆおよび示されているような第３のサイトカイン を発現するＢ１６メラノーマ細胞が、予め存在している腫瘍に及ぼす効果をグラ フで表す。記号Ｏは腫瘍攻撃に負けて死亡した動物を表し、記号・は腫瘍攻撃か ら防御された動物を表す。 定義 本明細書中で“免疫反応を調節する”という用語もしくはそれと文法的に同等な 用語により意味されることは、免疫反応に関わるいかなる細胞におけるいかなる 変更である。本定義により意味されることには、細胞数の増加もしくは減少、細 胞活性の増加もしくは減少、または免疫系内で起こりうる他のいかなる変化も含 まれる。細胞は、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マ クロファージ、好酸球、肥満細胞、樹枝状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌ ）もしくは好中球であってもよいが、それだけに制限されるわけではない。本定 義には、有害な標的に対して七分強力な反応を展開させるために免疫系を刺激し 若しくは高めることと共に、望ましい標的に対する破壊的な反応を避けるために 免疫系を抑制することも含められる。免疫系を刺激する場合には、本定義は二次 腫瘍攻撃に対する将来的な防御を含む３、 本明細書中で″サイトカイン”という用語もしくはそれと文法的に同等な用語に より意味されるところは、免疫系の細胞からの一般的なりラスのホルモン、リン ホカインおよびモ、ツカインの両方、並びにその他である。本定義により意味さ れることは、局所的に作用し血液中を循環しないホルモンで、本発明に従って使 用した場合、個体の免疫反応の変更をもたらすものが含まれるが、それだけに制 限されるわけではない。サイトカインはＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ− ７、ＧＭ−Ｃ８Ｆ、γ−ＩＦＮ、ＴＮＦ−α、ＣＤ２若しくはＩＣＡＭであって もよいが、それだけに制限されるわけではない。さらに、ヒト型のＩＬ−２、Ｇ Ｍ−Ｃ３Ｆ、ＴＮＦ−αおよびその他に実質的に相同な、他の哺乳動物のサイト カインは、免疫系に同様の活性を表すことが示されている場合、本発明において 有用であろう。同様に、特定のサイトカインのいずれかに実質的に類似している が、蛋白質配列に比較的小さな変化を有す蛋白質も、本発明において用途を見出 だすことだろう。蛋白質配列におけるある種の小さな変更を、その蛋白質分子の 機能面の能力を妨げずに可能とすることができることはよ（知られており、従っ て、本発明でサイトカインとして機能するが現在知られている配列と微妙に異な る蛋白質を作製することができる。最終的に、本出願における単数形もしくは複 数形での“サイトカイン”という単語の使用は、断定的なものではな（、本発明 および特許請求の範囲の解釈に制限されるべきではない。サイトカインに加え、 接着分子、補助分子（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ）若しくはその組 み合わせを、単独で、もしくはサイトカインと組み合わせて使用してもよい。 本明細書中で“腫瘍細胞からの抗原”という用語もしくはそれと文法的に同等な 用語により意味されることは、免疫反応を引き出すことのできるいかなる蛋白質 、炭水化物もしくは他の構成要素である。本定義により意味されることには、原 形質膜、細胞表面もしくは膜から精製された蛋白質、または細胞表面に結合した 独特な炭水化物分子の部分などの、細胞体から分離される構成要素のいずれかの 他に、付随する抗原すべてと共に腫瘍細胞全体を抗原として使用することが含ま れる。本定義には、対象となる細胞に特殊な処理を必要とする、細胞表面からの 抗原も含まれる。 本明細書中で“全身性免疫反応”という用語もしくはそれと文法的に同等な用語 により意味されることは、局所的でなく、個体全体に影響を及ぼし、従って同じ 刺激に対して特異的な二次反応を可能にする免疫反応である。 本明細書中で“共投与“という用語もしくはそれと文法的に同等な用語により意 味されることは、標的抗原および選択されたサイトカイン（群）が本質的に同時 に個体の免疫系に行き当たるプロセスである。構成要素は同じ投与手段（ｖｅｈ ｉｃｌｅ）により投与される必要はない。それらが２つの独立した手段で投与さ れる場合は、時間的にも投与経路的にも十分近（に投与され請求める特異性を達 成するために、個体の免疫系に本質的に同時に行き当たるようにしなければなら ない。 本明細書中で“確立された腫瘍の逆転（ｒｅｖｅｒｓａｌ　ｏｆ　ａｎ　ｅｓｔ ａｂｌｉｓｈｅｄ　ｔｕｍｏｒ）”という用語もしくはそれと文法的に同等の用 語により意味されることは、予め存在している腫瘍の抑制、退行、部分的若しく は完全な消滅である。本定義により意味されることは、予め存在している腫瘍の 大きさ、効力、増殖速度、外見もしくは感触のいずれかにおける軽減が含まれる 。 本明細書中で“治療に有効な量”という用語もしくはそれと文法的に同等な用語 によって述べられることは、個体の全身性免疫反応を刺激もしくは抑制のいずれ かによって調節するのに十分な調製品の量である。この量は、異なる個体、異な る腫瘍タイプおよび異なるサイトカイン調製品について異なっていてもよい。 本明細書中で“拒絶”という用語もしくはそれと文法的に同等な用語により意味 されることは、新たな腫瘍増殖の確立を許さない全身性免疫反応である。 本明細書中で“攻撃（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）”という用語もしくはそれと文法的 に同等な用語によって意味されることは、後に続いて（二次的に）腫瘍細胞を個 体に導入することである。従って“予防接種後５日目の攻撃用量”とは、サイト カインを発現する腫瘍細胞もしくは放射線照射された腫瘍細胞、またはその両方 による予防接種後５日目に、−服の非改変腫瘍細胞を投与したということを意味 する。“攻撃腫瘍”とは、そのような攻撃から生じた腫瘍を意味する。 本明細書中で“死亡までの日数“という用語若しくはそれと文法的に同等な用語 により意味されることは、マウスが死亡する前の期間である。一般的に、攻撃腫 瘍の長径が２−３センチメートルに達するか、または深刻な潰瘍もしくは出血が 発生した場合に、マウスは死亡した。 本明細書中で“放射線照射された細胞”若しくは“不活化された細胞”という用 語またはそれらと文法的に同等な用語により意味されることは、放射線照射によ って細胞を増殖不能にすることにより不活化された細胞である。この処理により 、体細胞分裂を行うことができないがサイトカインなどの蛋白質を発現する能力 は保持している細胞が生じる。放射線量は約３０．０００ラドまで許容され得る が、典型的には最小放射線Ｉは約３５００ラドで十分である。放射線照射は細胞 不活化の１つのやり方だが、細胞分裂はできないがサイトカインを発現する能力 は保持している細胞を生み出す、他の不活化法は本発明に含まれる。 本明細書中で“個体”という用語もしくはそれと文法的に同等な用語によって意 味されることは、哺乳動物のいずれかの個体である。 預託の記載 １９９１年１０月３日、出願者はファクターＶＩＩＩ挿入物を持つＭＦＧプラス ミド（本明細書中でＡＴＣＣアクセス番号６８７２６にて記載）、ｔＰＡ挿入物 を持つＭＦＧプラスミド（ＡＴＣＣアクセス番号６８７２７を与えられる）、本 明細書で記載されるファクターＶＩＩＩ挿入物を持つα−５ＧＣプラスミド（Ａ ＴＣＣアクセス番号６８７２８を与えられる）およびｔＰＡ挿入物を持つα−８ ＧＣプラスミド（ＡＴＣＣアクセス番号６８７２９を与えられる）をアメリカン タイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）　、ロックビレ、メリーランド州、 ＵＳＡに預託した。１９９１年１０月９日、出願者は本明細書中で記載されるＭ ＦＧプラスミド（ＡＴＣＣアクセス番号６８７５４を与えられる）、および本明 細書で記載されるα−８ＧＣプラスミド（ＡＴＣＣアクセス番号６８７５５を与 えられる）をＡＴＣＣに預託した。これらの預託は、特許手続きを目的とした微 生物の預託に関する国際的認識に基づ（ブダペスト条約の条項およびその（ブダ ペスト条約下の）規定のもとでなされた。これにより、預託臼から３０年間、成 育可能なカルチャーの維持が保証される。生物はＡＴＣＣによりブダペスト条約 の条件の下で入手可能とされ、関連のある米国特許の発行に際して無制限の有用 性を保証する出願者とＡＴＣＣ間での同意の対象となるであろう。預託された株 の有用性は、特許法に従ったいずれの政府の権威の下でも、保証された権利に矛 盾して本発明を実施する許可証として解釈されるわけではない。 発明の詳細な説明 本発明は、標的抗原（群）およびサイトカイン（群）を、個体の免疫系を刺激も しくは抑制するような様式で投与することにより、個体の標的抗原に対する免疫 反応を調節する方法に関する。免疫系の刺激もしくは抑制のいずれの場合におい ても、本発明は、サイトカイン活性を制御することでサイトカインが尋常でない 防御効果もしくは治療効果を提供する成果を生じるための手段を提供する。 本発明のある態様においては、標的抗原および１つ若しくはそれ以上のサイトカ イン、接着分子、補助分子またはそれらの組み合わせが、標的抗原と直接（つつ けられて、若しくは組み合わせられた化学的構成物（サイトカイン、接着分子、 補助分子もしくはそれらの組み合わせの輸送若しくは放出を提供する）として個 体に投与される。２つの構成要素は同じ手段によって投与される必要はない。そ れらが２つの独立した手段で投与される場合、それらが本質的に同時に個体の免 疫系に行き当たるのに、時間的にも投与経路的にも十分近（に投与されなければ ならない。即ち、サイトカイン、接着分子、補助分子もしくはそれらの組み合わ せは、調節されるべき免疫反応に関連した標的抗原と共に、サイトカインの輸送 もしくは配送を提供するいずれの様式によっても、標的抗原と共に共投与される ことができる。このことは、例えば、ゆっくりとした若しくは持続的な放出配送 系、または直接注射を用いることによって達成することができる。この共投与の 結果、非特異的なサイトカインが、標的抗原に対する特定の免疫反応を増幅もし くは変更するという、特異的な効果を持つ。強調されるべきは、サイトカインお よび抗原の同時提示を生理学的に出現したものと模倣させる、サイトカインと標 的抗原との局所的な相互作用であり、これにより効力が最大限にされ、毒性が最 小限にされる。 好ましい態様においては、腫瘍細胞などの標的抗原を発現する細胞は、それ自身 に遺伝子工学を施し、投与されるべきサイトカインを発現するようにされる。 生じた改変腫瘍細胞は、免疫反応がめられる抗原だけでなく、サイトカイン、接 着分子、補助分子もしくはその組み合わせ（その発現は生じる免疫反応のタイプ および程度を決定する）を、宿主の免疫系に提示する。または、標的抗原および サイトカインを天然に発現する細胞を、将来の腫瘍発達に対する防御のためのワ クチンとして使用する、または以前から存在している腫瘍の逆転をもたらす配送 手段として使用することが可能である。逆に、免疫反応の減少がめられる標的抗 原を適当なサイトカイン混合物と共に使用することができる。 ある態様においては、個体の全身性免疫反応を、共投与される分子がない場合に 起こり得るものより増大もしくは上昇させる。全身性反応は、腫瘍細胞などの標 的抗原を個体が拒絶するのに十分なものである。 別の態様においては、移植された細胞若しくは組織上の抗原などの標的抗原、ま たは異物と誤って認識された個体中の細胞が、個体によって拒絶されない、もし くは本発明が用いられない場合に生じる拒絶よりも程度の低いものとなるように 、個体の全身性免疫反応を、部分的もしくは完全に、減少もしくは抑制する。 本発明のある態様においては、標的抗原は、免疫反応の上昇が望まれる腫瘍細胞 、腫瘍細胞抗原、感染性病原体もしくは他の外来性病原体であってもよい。例え ば、ＡＩＤＳウィルス若しくはＡＩＤＳに伴う第２感染症などの慢性的かつ生命 を脅かす感染症の進行に関する抗原、または池の細菌性、真菌性、ウィルス性、 寄生生物および原生動物の抗原を、本発明に利用してもよい。 好ましい態様においては、標的抗原は腫瘍細胞である。好ましい態様はメラノー マ細胞を利用するが、乳癌細胞、白血病細胞、癌性ポリープもしくは前新生物性 患部などの（但し、これらに限られるわけではない）他の腫瘍細胞、または癌遺 伝子（例、「ａｓ、ｐ５３）を発現するようにした細胞も使用することができる 。改変された細胞は、生きている若しくは放射線照射された細胞、または他の手 段によって不活化された細胞であってもよい。さらに、標的抗原として使用され 、サイトカインを発現する腫瘍細胞は、選択されていない細胞集団であってもよ いし、若しくは改変細胞の特定のクローンであってもよい。 好ましい態様においては、腫瘍細胞は改変されて、サイトカインＩＬ−２および ＧＭ　Ｃ８Ｆを発現するようになる。この組み合わせは、野生型腫瘍細胞による 二次攻撃に対して長期的な全身性免疫防御を生み出すので、特に望ましい。 本発明のある態様においては、標的抗原およびサイトカインを発現する腫瘍細胞 は、個体に投与される前に、放射線照射される。生じた成育できない細胞を用い て、個体の免疫反応を調節することができる。そのような放射線照射され、サイ トカインを生産する腫瘍細胞の投与は、恐らくワクチンのような機構によって、 同じタイプの腫瘍の確立を阻害するのに有用であることが示されている。この操 作は、腫瘍を生じる、生きている癌細胞の個体への導入が望ましくないので、特 に重要性がある。初代の腫瘍外植体が新生物でない要素も含んでいる可能性があ り、予防接種前の腫瘍試料の放射線照射は、自身の増殖因子を自己分泌合成する ことにより誘導される新生物でない細胞の自立的な増殖の可能性も防ぐので、こ のことはさらに有意性を持つ。 好ましい態様においては、個体の免疫反応を調節するのに用いられる、放射線照 射された腫瘍細胞は、ＧＭ−Ｃ３Ｆ、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＣＤ２若しくはＩＣ ＡＭ、またはそれらの組み合わせを発現することができる。 最も好ましい態様においては、個体の免疫反応を調節するのに用いられる、放射 線照射された腫瘍細胞は、ＧＭ−Ｃ３Ｆを発現することができる。 ある態様においては、標的抗原およびサイトカインの組み合わせの投与は、確立 された腫瘍の逆転に用いることができる。これは、予め存在している腫瘍を持つ 個体から腫瘍細胞を採取し、これらの腫瘍細胞をサイトカインを発現するように 改変することによって達成することができる。次いで改変された細胞を個体に再 導入すると、予め存在している腫瘍を逆転することができる全身性免疫反応が生 じる。または、予め存在している癌のタイプの腫瘍細胞を、他のソース（ｓｏｕ ｒｃｅ）から得ることができる。発現されるべきサイトカインの同定は、腫瘍の タイプ、および他の要因に依存するであろう。 本発明の好ましい態様においては、腫瘍細胞は、ＩＬ−２およびＧＭ　Ｃ３Ｆ。 並びにＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＣＤ２およびＩＣＡＭのグループからの第３のサ イトカインを発現する。 最も好ましい態様においては、腫瘍細胞は、ＩＬ−２、ＧＭ−Ｃ３Ｆおよび／若 しくはＴＮＦ−αを発現する。 別の態様においては、確立された腫瘍の逆転に用いられる改変腫瘍細胞は、個体 への投与に先立って放射線照射される。 好ましい実施態様において、慢性腫瘍を転換するために用いられる放射線処理さ れた腫瘍細胞は、ＧＭ−Ｃ８Ｆを発現する能力を有する。 本発明の一つの実施態様において、ここで記載されるようなレトロウィルスのＭ ＦＧベクターのようなベクターを、ワクチン細胞を遺伝学的に改質するために用 いることができる。ＭＦＧベクターは、特殊な効用を有し、それはまず第１に系 統的な免疫世代に影響を与える数多くの潜在的免疫調整剤を素速（ふるい分け、 そして複雑に組み合わさった分子の活動を評価するに適化するという効用である 。 ＭＦＧベクターの高い力価及び高い遺伝子発現を組み合わせることで、数多くの 対象群からの形質転換細胞の選択が不要となる。この事は、ワクチン接種する以 前の第１腫瘍細胞の培養に要する時間を最小にし、ワクチン接種材料中の抗原異 質性の発現を最大にする。 本発明において、池のしトロウィルスのベクター類も又有効である。例えば、ｐ ＬＪ、ｐＥｍ、及びαＳＧＣである。（２０）で記載されるｐＬＪは、２つの型 の遺伝子　対象遺伝子及びネオ遺伝子のような支配型選択マーカー遺伝子、を発 現することができる。ＰＬＪの構造を図（ＩＢ）に示す。ｐＥｍは、単独のベク ター（ここで、対象となる遺伝子を、野生型ウィルス配列にコードするｇａｇ、 ｐｏｌ、ｅ　ｎ　ｖ　ｓ　ｌｅｆ！き換えることができる）である。ｐＥｒｎの 構造を、図（１Ｃ）に示す。α−３ＧＣは、対象遺伝子の発現を整えるために、 α−グロビン遺伝子からの転写アクセプター配列を用いる。α−８ＧＣの構造を 図（ＩＤ）に示す。 これらの結果から、本発明におけるさまざまなサイトカイン類の用途が見い出さ れた。例えば、本発明において、ヒト型ＩＬ−２、ＧＭ−Ｃ８Ｆ、ＴＮＦ−αな どにかなり類似する他の哺乳動物のサイトカインは有効である（ただし免疫組織 において同様の作用が示された場合）。さらに本発明において、ある特定のサイ トカインにかなり類似するが、比較的小規模な蛋白質変化を有する蛋白質類の有 用性が見いだされた。蛋白質分子の機能的作用を妨げることな（、蛋白質配列上 で、いくつかの小さな改質は可能であることは公知であり、そしてこのようにし て蛋白質類は、本発明におけるサイトカインと同様であるが、現在知られている 配列とは若干異なるそのような機能を有効にする。 本発明の方法は、化学療法、放射線療法及び他の生物学的応答改質剤などの他の 全身的療法と組み合わされた、抗原及びサイトカイン類、付着剤又は補足的な分 子類或いはそれらの組み合わせによる治療を含むことができる。 更に本発明の方法は、さまざまな抗原に対する個別の全身的免疫応答も含むこと ができる。一つの実施態様において、本発明は、慢性及び例えばエイズウィルス 感染並びにエイズをともなった２次感染などの生命を脅かすような症状の治療に 用いることができる。別の実施態様は、他の細菌、真菌、ウィルス、寄生虫及び 原虫の感染を含む。 好ましい実施態様において、ＨＩ　Ｖ関連症状の治療及び保護が達成された。例 えば、ヒトの免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、ンミアン免疫不全ウィルス（ＳＩＶ ）の場合などは、少な（とも６つの公知標的抗原（２１，２２，２３）が存在す るが、本発明を用いることによりそれらウィルスに対する免疫応答が増大する。 ＨＩＶ標的抗原を発現する適切な宿生細胞は、一つ又はそれ以上のサイトカイン を発現するまでに改質することができ、非感染個体にもワクチンとして投与する ことができ、及び免疫反応を引き出し増大し後のエイズによる感染に対する抵抗 性を増大することができる。あるいは抗原及びサイトカインは、宿主細胞を用い ることなく投与することができる。更に、Ｈ１〜′陽性個体に対し、現感染を抑 制し又はそれに抵抗するために、標的抗原及びサイトカインを併用投与すること ができる。 標的抗原に対する系統的免疫応答を調整するために本発明において用いられる特 定の方法を記述し、またこれらの方法をどのように応用するかを詳細し、及び全 身的免疫応答の成功調整法を示したが、本発明の発見は、一般的に入手可能な技 法を用いての同様の方法による最終結果を生み出すこれらの経験を用いた一つの 優れた技術を得るに充分である。 下記の実施例は、上記発明の製造方法及び用途をより完全に記載するものであり 、また本発明のさまざまな見地を実施する最善の態様を示すものである。これら の実施例は、本発明の実際の範囲を制限するものではなく、詳細な説明のための ものである。

【実施例】

実施例１．サイトカインをコード化する組換えレトロウィルスゲノムの製造レト ロウィルスベクターの製造には、標準の結紮及び公知技法である制限法を用いた 。対象のサイトカインをコード化する遺伝子又は遺伝子類を含む各種レトロウィ ルスベクターを用いた。 ＭＧＦ　このベクターは、共に特許出願中の、Ｕ、　Ｓ、　Ｓ、　Ｎ、　０７／ ６０７．２５２　（１９９０年１０月３１日書簡の表題”内皮細胞の遺伝学的改 質（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ 　Ｃｅ１ｌｓ）　）　、Ｕ、Ｓ、Ｓ、Ｎ　０７／７８６．０１５　（１９９１年 １０月３１日書簡の表題“遺伝療法に有効なレトロウィルスベクター（Ｒｃｔｒ ｏｖｉｒａｌ　ｖｅｃｔｏｒｓ　Ｌｌｓｅｆｕｌ　ｉｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａ ｐｙ）及びＰＣＴ／ｌｌ５９１１０８１２１　（１９９１年１０月３１日書簡） 中に記載されており、それらの教えをここで例として合した。又それらを、サイ トカインをコード化する遺伝子の合併及び発現という特別な例を有する特殊例と して下記に記載した。更に、いくつかのＭＧＦベクターは、上記ＡＴＣＣに寄託 した１゜ 〜ＩＧＦベクターは、下記及び図（１）で示されるｐＥｍベクターと類似するが 、ＭｏＭｕＬのための、１０３８個のｇａｇ配列の塩基対を有し、組み換えゲノ ムのハンゲーノング細胞株への封入を増加させ、ＭＯ−９（スプライスアクセプ ター配列および転写開始因子を含む）から誘導した３５０個の塩基対を含んでい た。 Ａｎは、直接ＭＯＶ−９配列に続（Ｎｃｏ及びＢａｍＨ１部位を含むオリゴヌク レオチドの塩基対であり、それは好都合にも適合性部位を有する遺伝子の挿入を 可能にした。それぞれの場合において、遺伝子のコード領域は、Ｎｃｏ及びＢａ ｍＨ１部位においてＭＧＦベクターの骨格中に導入された。それぞれの場合にお いて、ＡＴＧ開始因子−メチオニンコドンを、枠内、Ｎｃｏ１部位中に補足的に クローンし、そして万が−の場合に生成物の破壊を防ぐため及び潜在部位を導入 するために、少量の配列過剰停止コドンを含んだ。結果として、挿入されたＡＴ Ｇは、野生型ウィルスＡＴＧの発生する地点の部位においてベクター中に存在し た。このようにしてスプライスは、特にはモロニーマウス白血病ウィルス（Ｍ。 １ｏｎｅｙ　Ｍｕｒｉｎｓ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｖｉｒｕｓ）における発生と同 様であり、ウィルスの活動は旺盛であった。ＭｏＭｕＬＶ　ＬＴＲは、転写を調 整し、そして得られたｍＲＮＡは、すぐ後で挿入遺伝子の開放型読み込み枠へと 続（原型ｇａｓ転写のＳ′非転換領域を明らかに含んでいた。このベクターにお いて、モロニーマウス白血病ウィルス（Ｍｏ−ＭｕＬＶ）の長い末端の繰り返し の配列を、両、全長ウィルス性ＲＮＡ　（、ウィルス粒子中に被包するための） 及び挿入された配列の発現に応答する補足遺伝的なｍＲＮＡ　（Ｍｏ−ＭｕＬＶ 　ｅｎｖ　ｍＲＮＡに類似）を生成するために用いた。このベクターは、ウィル ス性ＲＮＡ　（２４）の被包を促進すると思われるウィルス性ｇａｇ領域中の、 及びｅｎｖ　ｍＲＮＡの生成に必要である正常５°及び３′のスプライス部位中 の両開列を保有した。全てのオリゴヌクレオチドの接合部は、ジデオキシ末端法 （２５）及びＴ７−ＤＮＡポリメラーゼを用いた配列であった。ＭＦＧの構造を 図ＩＡに示した。 下記の蛋白質のための遺伝子を含むＭＦＧベクターを製造した：マウスＩＬ−２ 、ＧＭ−Ｃ８ＦＳ　ＩＬ−４、ＩＬ−５、γ−ＩＦＮ、ＩＬ６、ＩＣＡＭ、ＣＤ ２、ＴＮＦ−α及びＩＬｉ−ＲＡ（インターロイキン−１−受容アンタゴニスト ）。更に、ＴＮＦｒ−α、ＧＭ　Ｃ３Ｆ及びＩＬ−２をコード化するヒト配列を 製造したく表１を見よ）。また、以下：ＶＣＡＮ、ＥＬＡＮ、マクロファージ炎 症性蛋白質、熱衝撃性蛋白質（例えばｈｐｓ６０）　、Ｍ−Ｃ３Ｆ、Ｇ−Ｃ３Ｆ 、ＩＬ、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、Ｂ７、ＭＩＰ−２、Ｍ ＩＰ−１α及びＭＩＰ−１β、の一つ又はそれ以上をコード化する遺伝子を含む ＭＧＦベクターを製造することも可能であった。 ＭＧＦ中に補足クローンされた正確なｃＤＮＡは、以下のとおりである：マウス ＩＬ−２（２６）塩基対４９−５６４　：マウスＩＬ−４（２７）塩基対５６− ４７９： マウスＩＬ−５（２８）塩基対４４−４６２；マウスＧＭ−Ｃ８Ｆ　（２９）塩 基対７０−５６１；マウスＩＣＡＭ−１（３０）塩基対３０−１６５７　、マウ スＣＤ２（３１）塩基対４８−１０７９　；マウスＩＬ−１受容アンタゴニスト （３２）塩基対１６−５６３　；ヒトＴＮＦ−α（３３）塩基対８６−７８８゜ 実施例２：サイトカインの測定 感染型、非選択的Ｂ１６集団により分泌されたサイトカインを、１０ｍ１の培地 を含む１０ｃ■平皿に、Ｉ×１０６細胞を接種して４８時間後に測定した。１０ ＩＩｌｌの培地を含む１０ｃｍ平皿にｌＸｌ０’細胞を接種して２４時間後に、 感染型、非選択的３Ｔ３細胞からＩＬ−ＩＲＡの分泌を測定した。測定したサイ トカインを、以下に示す・ＣＴ　Ｌ　Ｌ細胞（３４）及びＥＬＩＳＡ（提携的生 物学的医薬品）を用いたマウスＩＬ−２；ＣＴ４Ｒ細胞（３５）及びＥＬＩＳＡ （！ンドゲン４ｎｄｏｇｅｎ）を用いたマウスＩＬ−４：ＥＬＩＳＡ　（１ンド ゲン・Ｅｎｄｏｇｅｎ）を用いた１−５；Ｔｌ　１６５細胞（４１）及びＥＬＴ ＳＡ（エンドゲン・Ｅｎｄｏｇｅｎ）を用いたＴＬ−６；　ＦＤＣＰ−１細胞（ ３７）及びＥＬＩＳＡ、（エンドゲン・ＥｎｄＯｇｅｎ）を用いたマウスＧＭ− Ｃ８Ｆ、小胞性ロ内炎ウィルス抑制剤（３８）及びＥ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ　（Ｅｎ ｄｏｇｅｎ）を用いたマウス７−ＩＦＮ、Ｌ９２９細胞（３９）及びＥＬＩ　Ｓ Ａ　（Ｌ＆Ｄ組織）を用いたヒトＴＮＦ−α：抑制剤と結合した１２３１−Ｉ　 Ｌ　１βを用いたマウスＩＬ−ＩＲＡ０Ｂ１６標的細胞におけるマウスＩＣＡＭ 及びＣＤ２の発現を、ＥＰＩＣ５−ＣＦＣ３分析器（カルター型）上で、各、Ｙ ＮＩ／１．４７　（４２）及びＲＮ２／１を用いて、標準の手順（４１）により 測定した。 実施例３：サイトカインをコードしている配列を含むＢ１６黒色腫細胞の製造得 られたベクター構成物を、標準の方法により、Ｐｓｉ　ＣＲＩＰ及びｐｓｉＣＲ Ｅ　（４３）として知られるパンケージング細胞株中に導入した。これらの細胞 株は、高いレトロウィルスとそれぞれ両生及び転移性宿主領域との再結合力価を 安定して提供するクローン類を単離するのに有効であることを示した。両生宿主 を有するＣＲＩＰパッケージング細胞株を、両、転移及び電気泳動により生成し た（両法は効率にあまり差がない）。リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈を、ベク９ −２０μｇ及びｐＳＶＺＮＥＯ：　ｌμｇ　（４５）を用いて行った（４４）、 ベクター４０μｇ及びｐｓＶＺＮＥｏ：　８μｇを線状にした後に、遺伝子パル サー電気泳動装置（Ｇｅｎｅ　Ｐｕ１ｓｅｒ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ　 ：　Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて電気泳動を行った。 （条件：１９０Ｖ及び９６０　μＦ）。 ＤＮＡ導入後、操作手順を、Ｇ４１８　（ＧＩＢＣＯ）の選択値中の１ｍｇ／ｗ ｌ−３６時間に設定した。両クローン及び生成物群を生成した。 ウィルス力価をサザーンプロット分析装置（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ　：　 ４６）により測定し、次いで１ｍｌ当り８μｇのポリブレンを含む培地中で、Ｂ １６及び３Ｔ３細胞の感染を測定した。標的ＤＮＡ及び適切な複写数基準にスパ イクする調整ＤＮＡｌ０μｇをＮｈａｌ　（ＬＴＲ裁断装置）により獲得し、ア ガロースゲル中の電気泳動により溶解し、そして標準の手順（４８）を用いてサ ザーン法により測定した。各プロットは、用いた先の任意の方法（４９）により 高い［３３Ｐ］　ｄＣＴＰの特定活性をまでに級される適切な配列を用いて判別 した。判別群には、マウスＩＬ−２（Ｓａｃｌ　／Ｒｓａ１片（２２１−５６４ 塩基対）である）を除外した全長ｃＤＮＡを用いた。細胞当りの１つの複写の力 価は、細胞当り１×１０６レトロウイルス粒子とほぼ同値である。 これらの生成物の生成する過程において、それの鋭敏なり代謝測定（４３）で測 定されるような結合感染の代謝を時折り誘発するＭＧＦベクターを有する結合ラ イン（ＣＡＥないしＣＲＩＰ又はＣＲＩＰないしＣＲＥ）の交差感染を観察した 。そのような交差感染は本来的には避けるべきである。直接の転移又は電気泳動 により生成される生産物に伴う結合機能の代謝は、観察されなかった。 ウィルス力価及び発現レベルを下表に示した。 第１表＋ＭＧＦベクターの構成物 力価 対照群　両生　発現 ＭＧＦ　ｍｕ　ＩＬ−２１，ＯＣ０ｐｙ　５０００　Ｕ／ｍ１ＭＧＦ　ｍｕ　Ｉ Ｌ−４０，２５ｃｏｐｙ　１５　ｎｇ／ｍ１ＭＧＦ　ｍｕ　ＩＬ−５２，０ｃｏ ｐｙ　２５０　ｎｇ／ｍ１ＭＧＦｍｕｌＬ−６領５　Ｃ０ｐｙ４００　ｎｇ／Ｅ ＩＭＧＦ　ｍｕ　ＧＭ−Ｃ５Ｆ　２．Ｏｃｏｐｙ　３００　ｎｇ／ｍ１ＭＧＦ　 ｍｕ　７−ＩＦＮ　Ｏ，１ｃｏｐ’ｌ　２０　ｎｇ／ｍ１ＭＧＦ　ｍｕ　Ｉ　Ｃ ＡＭ　領５　Ｃ□ｐｙ　＋ＦＡＣ３ＭＧＦ　ｍｕ　ＣＤ２　０．５　ｃｏｐｙ　 ＋ＦＡＣ３ＭＧＦ　ｍｕ　ＩＬＩＲＡ　１．０　ｃｏｐｙ　３０　ｎｇ／ｍ１Ｍ ＧＦ　ｈｕ　ＩＬ−２１，０ｃｏｐｙ　１００　ｎｇ／ｍ１ＭＧＦ　ｈｕ　ＧＭ −Ｃ３Ｆ　１．Ｏｃｏｐｙ　５００　ｎｇ／ｍ１ＭＧＦ　ｈｕ　ＴＮＦ　０．５ 　Ｃｏｔ）Ｙ　４００　ｎｇ／ｍｌ研究の初めに、Ｂ１６黒色腫腫瘍モデル（５ ０）を選択した。ヒト黒色腫は、各種の免疫治療（５１，５２）に対して感受性 を示した。表１中で示されるすべての遺伝子生成物が、試験管内又は試験管外の ８１６細胞の増殖に影響を及ぼしたかどうかを検討するために、細胞をウィルス 上澄みに曝し、転換された細胞を、それらの感染効果及び分泌の遺伝子生成物に 特長された。表１に、Ｂ１６黒色腫細胞株（細胞当りの１つの複写力価は、おお よそ１０６個の感染粒子の力価１こ相当する）及び分泌型遺伝子生成物の対応レ ベルに対するそれぞれのウィルスのおおよその感染効率を示した。 ＭＧＦ　γ−ＩＦＮ構成（細胞あたりおよそ０．１コピーを送り込む）を除外す ることにより、はとんどのウィルスは、多くの腫瘍細胞への形質転換が可能とな った。γ−ＩＦＮ分泌細胞の増殖は、非感染細胞よりも低速であり、それらの野 生型対象群と比べて平らであった。対照的に、他の形質転換細胞は、試験管内に おいて増殖特性にまったく変化が見られなかった。細胞を生成するウィルスの両 、集団及び特定クローンを、これらの研究に用いた。 実施例４　ワクチン接種 注入の前に、腫瘍細胞をトリプシン化し、血清を含む培地中で１回、次いでマン クス調整生理食塩水（Ｍａｎｋｓ　Ｂａ１ａｎｃｅｄ　５ａｌｉｎｅ　５ｏｌｕ ｔｉｎ　：　Ｇ　Ｉ　Ｂ　ＣＯ）中で２回洗浄した。トリパンブルーに抵抗性を 有する細胞を適切な濃度まで沈殿させ、ＨＢＳＳ：領　５ｃｃを注入した。次い でワクチンを腹部皮下に投与し、麻酔を投与した後に腫瘍誘発剤をメタファンで 消毒処理されたマウス（ピットマン・ムーア症候群）の背部正中線に注入した。 マウスを、触知腫瘍が記録されるまで２ないし３日おきの間隔で試験した。腫瘍 が直径２ないし３ｃｍに達した時点もしくは重症性外陰腫瘍又は出血が展開した 時点で、マウスを犠牲とした。抗体枯渇実験のために、マウスの右後脚にワクチ ン（０、１ｃｃ）を接種し、そしてマウス左後脚に誘発剤（０、１ｃｃ）を投与 した。肺転移を生成するために、尾血管に細胞０゜２ｃｃを注入した。実験動物 は、Ｂ１６、ルイス肺及びＣ１５Ｂ１／６の実験には生後６ないし１２週間の雌 マウス（ジャクソンラブズ）、及びＣＴ−２６、ＲＥＮＣＡ及びＣＭＳ−５の実 験には生後６ないし１２週間のＢａ１ｂ／ｃ雌マウス（ジャクソンラブズ）を用 いた。 放射線処理されたワクチンを用いる場合は、腫瘍細胞（ＨＢＳＳ中で沈殿後）を 、１２４ラド／分に放電するＣａｓｉｕｍ−１３７源を用いて３５００ラドで被 爆した。 実施例５：組織学 組織学的試験のために、組織を中性に緩衝された１０％ホルマリン中に固定しく パラフィン実施態様までの過程として）、ヘマトキシリン及びエオシンで染色し た。染色された免疫ベルオキシダーゼのための組織を、溶液Ｎ２中で急速冷凍し く凍結部分として調整）、アセトン中に１０分間固定し、−２０℃で保管した。 凍結部を第１吹拭体次いで抗１ｇＧ抗体（特定種）で感染処理し、そして抗原− 抗体の複合を、アビジン−ビオチン過酸化物複合体（ベクター染色剤、ベクター ラボラトリ−製）及びジアミノベンジジンで視覚化した。第１吹拭体には、５０ ０Ａ２（ハムスター抗ＣＤ３１）　、ＧＫｌ、５　（ラット抗ＣＤ４）及びＧＫ ２゜４３（ラット抗ＣＤ８）を用いた。 実施例６　生体形質転換腫瘍細胞を用いたワクチン研究発癌性Ｂ１６細胞におけ るサイトカインの有効性を直接評価するために、それらの同質遺伝子宿主である Ｃ５７Ｂ１／６マウスの皮下に非改質（野生型）Ｂ１６黒色腫細胞又は形質転換 改質細胞のいずれかを接種し、マウスの腫瘍形成を数日おきに検討した。典型的 には、ワクチン投与量は５Ｘ１０’であり、それをＢ１６感染細胞に接種した。 驚くべきことに、ＩＬ−２を分泌する腫瘍細胞のみが、腫瘍を形成しなかった。 他全ての９種のサイトカイン検体が、腫瘍を形成した。腫瘍形成における中程度 の遅延は、Ｉｔ−４、ＩＬ−６、γ−ＩＮＦ及びＴＮＦ−αの発現に関連するも のであった。いくつかのサイトカイン検体では、全身的症候（たぶん細胞の急速 な増加によるものと思われる）が生じた。ＧＭ−Ｃ５Ｆ形質転換細胞は、急速な 白血球増加（多核白血球、単球及び好酸球）、肝臓種火、肺出血、及びＩ　Ｌ− ５を発現する細が顕著な末梢性好酸球増加を示したことで明示される致命的な毒 性を誘発した。ＩＬ−６を発現する細胞は、肝臓種火及び死を引き起こした。Ｔ ＮＦ−αを発現する細胞は、消耗、震え及び死を引き起こした。 実施例７：サイトカイン形質転換腫瘍細胞により生ずる全身的抗腫瘍免疫Ｉ　Ｌ −２転換型細胞の拒絶により、それらの潜在的な系統免疫生成の検討を可能にし た。まずマウスに、Ｂ　］、　６黒６種細胞を発現するＩＬ−２を接種し、次い で１箇月に及ぶ過程中において、非改質型Ｂ１６細胞を用いて誘発を行った。典 型的には、初回の及び誘発剤の投与量は、双方とも５Ｘ１０’生細胞（細胞は、 培養皿から収穫し、後に広範囲に洗浄したものを用いた）を用いた。次いで、細 胞を、５ｃｃ（ハンス緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）中の）においてを注入した。次 いで、５頭のマウス群に、ワクチン投与地点の別の地点に誘発処理を行った。誘 発剤投与群５検体に対する測定の時間割りは、３ないし４日おきで行い、ワクチ ン投与後の３日間に誘発剤の初回投与を行い、ワクチン投与してから一箇月間ま での期間において誘発剤を継続的に投与した。 結果では、Ｉ　Ｌ−２の全身的保護誘導機能がわずかに示された（非改質腫瘍誘 発剤が拒絶された能力を測定することにより）。典型的な実験において、はとん どのマウスは、そのワクチン投与後４０口間の腫瘍誘発剤に対して屈服した。こ の結果は、時折り腫瘍形成に遅延が生じた（図２Ａ）のみで、誘発の期間にかか わりなく、マウスが誘発に対して屈服したということから、Ｆｅａｒｏｎらの結 果（８）とは真さに対照的であった。感染型Ｂ１６細胞の有効性の評価は、マウ スの自然死若しくは人為的な殺傷の時期を確認することにより行なわれた。 実施例８：多発性サイトカイン形質転換細胞により生じる全身的抗腫瘍免疫ＩＬ −２のみを用いて形質転換した細胞の効率的な拒否能力の結果として、サイトカ インの併用を検討した。この測定のために、ＩＬ−２及び２次的な遺伝子生成物 の双方を発現するＢ１６細胞の集団を、ＩＬ−２形質転換細胞を過剰に感染され ることにより生成した。検体動物を、二重に感染した細胞によりワクチン処理し 、次いで７ないし１４日後に、非転換細胞を用いて誘発処理を行った。典型的に は、初回及び誘発剤の投与量は、５Ｘ１０’生細胞であり、細胞は、培養皿から 獲得した後、広範囲に洗浄した。次いで、細胞（ＨＢＳ約０．　５ｃｃ）を皮下 に注入した。 Ｂ１６黒色腫細胞を、ＩＬ−２陽性かを発現するに改質した（それに次いで、Ｇ Ｍ−Ｃ３Ｆ、ＩＬ−４、γ−ＩＦＮ、ＩＣＡＭ、ＣＤ２、ＩＬＩ−ＲＡｌ　１Ｌ −６又はＴＮＦ−α）。 図２Ｂで示される結果は、両、ＩＬ−２及びＧＭ−Ｃ３Ｆを発現する細胞が、潜 在的な統学的免疫を生ずることを示しており、多（のマウスが、長期間の腫瘍誘 発において生存した９例えば、１２０日間の期間においてもマウスは生き残った （その時点で、マウスを犠牲とした）。合計で、マウス５０又は６０匹に、この 併用を用いたワクチン投与をしたところ、マウスが、１０５非改質細胞（およそ マウス７割が保護に成功）ないし、５Ｘ１０’非改質細胞（より低い結果ではあ ったが、はっきりとした保護効果がみられた）の範囲の投与量の誘発剤から保護 されたという結果が示された。 この結果は、ＧＭ−Ｃ３Ｆのみに感染した腫瘍細胞が、宿主中で急速に増殖した 事実が明白になったことは、特に驚Ｘべきことであり、事実宿主は、全身的に分 泌されているＭ−Ｃ５Ｆの毒性に対し屈服した。小程度の保護が、他ののいくつ かの併用において観察された。ＴＮＦ−α及びＩＬ−４は、ＩＬ−２及びＩＬ− ６との併用においてごくわずかな効果しかなかった。また、Ｉ　Ｌ−６も、ＩＬ −２との併用においてごくわずかな効果しかみられなかった。γ−ＩＦＮ、ＩＣ ＡＮ、ＣＤ２及びｌｌ−１を用いた条件の下に、受容アンタゴニストは不活性で あった。感染型８１６細胞の有効性の評価は、自然死又は人為的な死が生じた時 点で確認した。 更なる実験において、３つ目のサイトカイン（ＩＬ−２及びＧＭ−ＣＳＦに加え ）の野生型投与に対する保護のための併用作用に対する影響力を評価した。 ＩＬ−２、ＧＭ−Ｃ３Ｆを発現し、γ−ＩＦＮ、ＩＬ−４のいずれか若しくは両 方を発現するＢＩ３黒色腫細胞を製造した。 予備結果では、ＧＭ−ＴＮＦを伴った１１、−２に、ＩＬ−４を添加したところ 、この試みの効果を促進することが示された（図２を見よ）。更なる試みとして 、ＧＭ−ＴＮＦを伴ったＩＬ−２に、γ−ＩＦＮを添加してワクチンに対するこ の併用効果を確実にする試みも予想される。このデータは、サイトカインの各種 の併用は、免疫応答の強さを増大し、そして減少するという両方の効果があると いう可能性を示した。 実施例９　放射線処理細胞に関するワクチン研究（非転換及び放射線処理された 細胞の免疫性） 両、ＩＬ−２及びＧＭ−Ｃ３Ｆは発現するが、ＩＬ−２のみは発現しない細胞が 、ワクチン処理された宿主に全身的保護効果を提供し、そしてＧＭ−Ｃ３Ｆのみ を分泌する細胞の増殖が活発であるという事実は、ＩＬ−２が、第一にワクチン 処理細胞の拒絶を媒体する働きをもつ可能性が示唆された。 先の多くの研究では、放射線処理された腫瘍細胞が、かなりのワクチン作用を有 することが示されており（１６，１７，１８，１９）、重要な調整として、非転 換型放射線処理細胞のワクチン能力を評価が必要となった。放射線処理及びワク チン接種は、上述のように行われた。図３０のデータは、非転換型で放射線処理 されたＢ１６細胞は、ワクチン及び誘発剤投与量が検討された時点で、誘発細胞 の増殖にわずかな効果し力弓１き出せなかったことを示している。 しかしながら、特定のサイトカインの抗腫瘍作用を同定するために、前もって用 いられた数多くのマウス腫瘍細胞株は、本質的に免疫遺伝性を有していた（放射 線処理の非転換細胞でのワクチン接種を含む研究で発見されたような）。更に、 放射線処理のみの細胞は、生体転換細胞により誘導されたそれらと比較したレベ ルにおいて、全身的免疫性を提供した。これらの実験のために、先の腫瘍拒否又 は腫瘍誘発測定において、サイトカインが有する能力を同定するための研究にお いて用いられたような、いくつかの腫瘍型を用いた。これらの腫瘍を以下に示す ：　（ｉ）ＣＴ２５、細胞株（５３）（ＩＬ−２（８）の作用を同定する研究に おいて用いられた）から誘導したクローン癌；　（ｉ　ｉ）ＣＭＳ−５、細胞株 （５４）（ＩＬ−２（９）及びγ−■ＦＮ（４）の作用を同定するために用いら れた）誘導した繊維肉腫；　（ｉ　ｉ　１）ＲＥＮＣＡ、細胞株（５５）（ＩＬ −４（１５）の作用を同するために用いられた）から誘導した腎臓細胞癌；及び 、（ｉｖ）ＷＰ−４、細胞株（２）（ＴＮＦ−α（２）の作用を同定するために 用いられた）がら誘導された繊維肉腫。これらの初期研究として、ワクチン及び 誘発剤の投与量を、先のサイトカイン遺伝子転移研究で用いられたそれらと比較 した。腫瘍誘発の測定において、放射線処理細胞でワクチン処理されたマウスを 、その後に腫瘍細胞によりフないし１４日間誘発処理した（図７を見よ）。驚く べきことに、それぞれの場合において、放射線処理した細胞は、上で検討された 各種のサイトカインを発現する生細胞を用いた先の記録されたそれと比較して、 強いワクチン作用を有していた。対照的に、先の図３Ｃで示されるように、放射 線処理Ｂ１６細胞は、わずかではあるが全身的免疫性を誘導した。先の試験の誤 認の可能性も示唆され、この結果は、特に重要な意味を有した。先の研究におい て用いられた多くの腫瘍細胞は、本質的に免疫遺伝性を有していたが、生腫瘍細 胞の致死率がそのような特性を示していた。サイトカインの発現は、まれに生腫 瘍細胞の死を媒介する。従ってこのことは、本来の免疫遺伝性の発現を可能にす る。対照的に、本発明の全身的免疫応答は、実際の、免疫組織とサイトカイン及 び抗原の相互作用に依存する。 放射線処理された転換型８１６細胞を用いたワクチン接種上述のように、ＩＬ− ２及びＧＭ−Ｃ３Ｆの両方を発現する放射線処理されたＢ１６細胞は、試験管内 におけるサイトカインの分泌、若しくは試験管外におけるワクチン作用のいずれ も妨げることはなかった（データはなし）。この結果に基づいて、ＧＭ−Ｃ３Ｆ のみを発現する放射線処理されたＢ１６細胞を、ワクチン接種したマウスに投与 し、次いでその後７ないし１４日間誘発処理を行った。 細胞は、３５００ラドで放射した。典型的には、放射線処理された細胞は、５× １０５、続（誘発には同盟の生細胞を用いた。図３Ａて示されるように、そのよ うなワクチン処理は、強い抗腫瘍免疫性を引き起し、はとんどのマウスは、それ らの誘発に対し生き残った。ワクチンとして放射線処理されていない細胞を用い た場合には、最終的には１９中の１頭の検体が保護された：放射線処理した細胞 を用いた場合は、２０中１６頭のマウスが保護された。いずれのマウスも、生体 ＧＭ−Ｃ５Ｆを発現する細胞を注入したマウスにおいて見られた毒性を示すこと はなかった、そしてワクチン接種したマウスの血清中に、環状ＧＭ−Ｃ３Ｆを検 知することができた（　１．０　ｐｇ／ｍｌに感受可能なＥＬＩＳＡを用いた） 。また全身的免疫性のかなり長い持続性も観察され、ＧＭ−Ｃ３Ｆを発現する放 射線処理細胞でワクチン処理し、その後２箇月間で非転換細胞を投与されたほと んどのマウスは、腫瘍を発現することはなかった（データなし）。 また全身的な免疫性も特殊であり、ＧＭ−Ｃ３Ｆを発現するＢ１６細胞は、ルイ ス肺癌細胞（５６）、他種癌（０５７Ｂ１／６原型）の誘発からマウスを保護す ることはなく、（Ｊ４−Ｃ５Ｆを発現するルイス肺癌細胞は、非転換Ｂ１６細胞 の誘発からマウスをを保護することはなかった（データなし）。 放射処理転換細胞のワクチンとしての有効性は、広範囲のＧＭ−Ｃ２Ｆ４度にお いてあきらかであり、感染細胞は１００倍過剰の非転換細胞と混合可能であった が全身的免疫応答をほとんど期待できないことがあきらかであった。（図３Ｂ） 。この結果は、ＭＦＧベクターに寄与するかなり高レベルのＧＭ−ＣＳＦ発現に 反映している。反対に、保護は、ワクチン処理細胞の総接種量に対して高い感受 性を有し、１０分の１１という少量のワクチン処理細胞使用に際しても、その作 用はかなり確定的であった（図３Ｂ）。 非転換細胞を用いた誘発に対して強い保護効果を提供したことに加え、ＧＭ−Ｃ ３Ｆを発現する放射線処理Ｂ１６細胞は、前もって生成された腫瘍の拒絶を媒介 する能力において、放射線処理のみの細胞を用いた場合よりも高い能力を有した （図３Ｃ）。また同様の結果が、慢性メタスターゼを、非転換型細胞の静脈内注 入により生成する研究において得られた（データなし）。 驚くべきことに、８１６の結果により裏付けられるように、ワクチン細胞の局部 的な破壊は、必ずしも全身的免疫を引き起こす訳ではない。生体ＩＬ−２を発現 するＢ１６細胞は、系統学士の宿主に拒否され、このワクチン接種は後の非転換 型Ｂ１６細胞の誘発に対し保護作用を発現しなかった。同じように非転換型放射 線処理Ｂ１６細胞によるワクチン接種においても、全身的保護に失敗した。非、 又は貧弱な免疫遺伝性腫瘍模型の全身的免疫の発生には、このようにして、この 免疫を含めたより免疫遺伝性のある腫瘍模型における応答のそれより質的に相違 する機序がめられる。 Ｂ１６模型における抗腫瘍作用のための多くの遺伝子生成物をふるい分けること は、この仮説に同調するものであり、例えば、そのような免疫性増大が可能であ る他の体系において、すべての分子を同定することなどがあげられ、以上の事か ら事前に同定されていないサイトカイン、ＧＭ−Ｃ３Ｆは、まさに強力であるこ とが示された。 更に、ＧＭ−Ｃ５Ｆ形質転換の有利性が、幾分免疫遺伝性を有する腫瘍模型にお いてさえ発現されるという事実は、他の、腫瘍免疫遺伝性の発見手段と比べて、 ＧＭ−Ｃ３Ｆの比較的強い能力を示唆している。 最後に、他の遺伝子生成を発現する放射線処理型細胞も又、ワクチン処理された 宿主上において全身的免疫性を提供するかどうかを検討するために、異種遺伝子 生成物（放射線処理の後の）を発現するさまざまな細胞集団にも、ワクチン作用 があるかどうかを検討した。ＩＬＩＲＡ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、■Ｌ −６、ＧＭ−Ｃ３Ｆ、γ−ＴＮＦ、ＴＮＦ、ＩＣＡＭ及びＣＤ２を発現するＢ１ ６細胞を、上述のように製造した。ワクチン及び誘発剤の投与量及び方法は、前 述と同様である。 図４に示される結果では、ＧＭ−Ｃ３Ｆを発現するＢ１６細胞は、放射線の照射 の前には、最も強力に思え、Ｉ　Ｌ−４及びＩＬ−６に改質された細胞に関して は、幾分作用に減少がみられた。 他のマウス腫瘍型における、放射線処理されたＧＭＣ３Ｆを発現する細胞を用い たワクチン接種 他のマウス腫瘍型の放射線処理された顕著なワクチン作用のみが、ＧＭ　Ｃ３Ｆ を発現する細胞の実験上の作用を妨げたということから、比較的効果的であるＧ Ｍ−ＣＳＦを発現する非転換放射線処理細胞及び放射線処理細胞の基本条件を評 価するために、上で試験された多くの腫瘍の誘発剤又はワクチンの投与量のそれ ぞれを検討した。これらの条件は、図３Ｂに関連して用いられた条件と同じ条件 であった。これらの条件により、図８で示される非転換型で放射線処理された細 胞とＧＭ−Ｃ５Ｆを発現するで放射線処理された細胞の比較が可能となった。 比較的効果的なＧＭ−Ｃ５Ｆを発現する細胞は、系統において幾分変化に富んで いるが、すべての場合においてＧＭ−Ｃ５Ｆを発現する細胞は、唯一放射線処理 したものと比較して全身的免疫性の引き出しにおいてより効果的であった。 上記概説のように、この実験はルイス肺癌細胞線（５６）を含んでおり、これは 、先のサイトカインの遺伝子転移研究において用いられたことはない腫瘍である 。代表的実験であるＧＭ−Ｃ８Ｆ形質転換の効果を図解により示したが、正確な 投与量によりこれらの有効性は幾分変化に富んでいることが示された。 しかし結果では、放射線処理をする前に、ＧＭ−ＣＳＦを発現するルイス肺癌細 胞 の特殊な全身的免疫性が示された、すなはちマウスは、後の非改質ルイス癌細胞 による誘発では保護されたが、非改質Ｂ１６黒色腫細胞ではその効果はなかった （データなし）。 非転換細胞によるワクチン接種後の、かなり大量の誘発剤投与が事実上拒否され たという理由から、この実験は、ＷＰ−４細胞株を含まない。 実施例１０　サイトカイン導入腫瘍細胞を用いた前もって存在する腫瘍の反転サ イトカインの混合物を発現するＢＩ３黒色腫細胞の、前もって存在する腫瘍に与 える作用を検討した。すべての試験においてマウスが用られ、次いで非改質Ｂ１ ６細胞が注入したところ（１日１回、７日）、顕微鏡で確認できる程度の大きさ の腫瘍が生成された。７日間において、さまざまなサイトカインを発現するＢ黒 色腫細胞を、皮下部に異地点に注入した。典型的には、両、初回及び誘発剤投与 量は、５Ｘ１０５生体細胞であり、細胞は培養皿から収穫し、次いで広範囲に洗 浄した。次いで細胞に、ＨＢＳ約５ｃｃを注入した。 Ｂ１６細胞は改質され、その結果以下のサイトカインの組み合わせを発現した： ＩＬ−２及びＧＭ−Ｃ３Ｆ、ＩＬ−２、ＧＭ−Ｃ３Ｆ及びＴＮＦ−α、ＩＬ−２ 、ＧＭ−Ｃ３Ｆ及びＩ　Ｌ−４；　Ｉ　Ｌ−２、ＧＭ−Ｃ８Ｆ及びＩＬ−６；Ｉ Ｌ−２、ＧＭ−Ｃ３Ｆ及びＩＣＡＭ、ＩＬ−２、ＧＭ−Ｃ３Ｆ及びＣＤ２　；及 びＩＬ−２、ＧＭ−Ｃ３Ｆ及びＩＬＬ−ＲＡ０図９にその結果を示す。 実験では、前もってマウスが腫瘍をもっている場合、ＩＬ−２及びＧＭ−Ｃ３Ｆ を含む改質されたＢ１６細胞で処理したところ、対照検体と比較してそのマウス にわずかな延命がみられた。しかし、治療効果は認められなかった。しかし、Ｉ Ｌ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−αの併用を用いたマウスでは、５頭中３頭のマ ウスに治療効果がみられた（１２０日以上の生存により証明される）。３頭中２ 頭のマウスには、ひき続く野生型Ｂ１６細胞に誘発においても生き残りがみられ た。ＩＬ−２及びＧＭ−Ｃ５Ｆを発現する細胞に、ＩＬ−４、ＩＣＡＭ又はＣＤ ２を個々に添加したところ、５頭中１頭のマウスに治療効果がみられた。改質型 ＩＬ−２、ＧＭ−Ｃ８Ｆ及びＴＭＦ−α細胞を投与した場合には、投与の３日後 に腫瘍が生成されるが、多くのマウスに腫瘍症状はみられず、及びいくつかの群 においては、１００頭中１頭に治療効果がみられた。 又、放射線処理された細胞を用いた場合（実施例９で解説）には、慢性腫瘍の反 転がみられた。図３で示されるように、ＧＭ−Ｃ８Ｆを発現する放射線処理され たＢ１６細胞では、前もって存在する腫瘍拒絶を媒介する能力がみられたが、放 射線処理した非転換細胞ではみられなかった（少なくともこれらの実験の投与量 において）。 図３０は、保護の範囲が、誘発細胞の投与量及び治療の開始時期の双方に依存す ることを示している。同様の結果が、慢性メタスターゼを非転換細胞の静脈内注 入により生成するという研究においても得られた（データなし）。 実施例１１．ＧＫｌ−Ｃ３Ｆを発現する腫瘍細胞により引き出される免疫応答の 特性 ＧＭ−Ｃ３Ｆを発現する放射線処理されたＢＩ３黒色腫により引き出される免疫 応答を、さまざまな方法において特徴した。放射線処理されたＧＭ−Ｃ８Ｆを発 現する細胞を注入した地点の組織学的実験では、注入の５ないし７日後に未熟分 割単球、顆粒球（好酸球が優勢）及び活性リンパ球（図５、区画Ａ）の広範囲な 局所流入が見いだされた。注入して１週間後に、排出リンパ様式が劇的に拡大し 、傍皮質過形成及びいくつかの幼芽芯形成が示された（図５、区画Ｃ）。対照的 に、非転換放射線処理細胞でワクチン処理されたマウスでは、炎症性細胞の軽度 の流入のみがみられたが（図５、区画Ｂ）、それは主にリンパ球、及び比較的小 さな排出リンパ様の拡大を形成した（図５、区画Ｄ）。放射線処理されたＧＭ− Ｃ３Ｆを発現する細胞でワクチン処理された誘発マウスでは（図５、区画Ｅ）、 ５日後に数多（の好酸球、単球及びリンパ球がはっきりと見られたが、放射線処 理された細胞でワクチン処理された誘発マウスでは、リンパ球団のみであった。 実際、Ｂ１６生細胞で誘発された意図を有しない検体において、非応答細胞は観 察されなかった（図５、区画Ｇ）。 どの細胞が全身的免疫上重要であるかを決定するために、一連のマウスから、Ｃ ＤＪ＋、ＣＤＳ＋又は試験管外における抗体投与による本質的なキラー細胞を除 去し、次いで放射線処理されたＧＭ−Ｃ−３Ｆを発現する細胞でワクチン処理を 行った。特に、最初、ワクチン投与の１週間前に、マウスから、それぞれＭａｂ ＧＫｌ、５を用いてＣＤＪ＋細胞を、ＭａｂＧＫ２．４３を用いてＣＤＳ＋細胞 を、そしてＰＫ１３６を用いてＮＫ細胞を除去した。抗体を硫酸アンモニウム沈 降により部分的に精製した。脱脂した腹水を飽和硫酸アンモニウムと１＝１で混 合し、沈殿物を回転除去し、乾燥し、そして再び元の腹水と同じ容量の水中に沈 殿させた。抗体を、ＰＢ５に対し、０．４５μｍフィルターで広範囲に透析した 。 抗体の力缶は、スタイミン（ｓｔａｉｍｉｎ）　Ｉ　Ｘ　１０’巨大球により、 連続的に希釈した抗体を用いて試験し、ＦＡＣ８ＣＡＮ測定により飽和度を測定 した。 すべての調整物は、１　：　２０００に基づいて力価を測定した。抗体を、０． １５ｍ１　ｉ、ｕ、及びＱ、ｌ＋ｎｌ　ｉ、ｐ、／日１回、その後１週間毎に、 １１ｍ１ｉ、り、で除去した。リンパ球の部分的除去は、ワクチン接種口（早期 除去）、野生型腫瘍誘発剤投与口（早期及び後期除去）その後は週末において査 定した。２４３又はＧＫｌ、５に次いでフルオレスセインイソチオンアン酸（ヤ ギ抗体ないしラットＤｇＧを標識）、又はＰＫ１３６に次いでフルオレスセイン イソチオシアン酸（ヤギ抗体ないしマウスＤｇＧを標識）で染色されたリンパ節 胞及び巨大法の流入細胞を測定することにより、他の部分が正常値で存在したの に対し、除去部分がリンパ球の合計より＜０．５％を示したことが明らかになっ た。ワクチン接種の前にそれぞれのＴ細胞の小部分の除去が、全身的免疫の発展 を妨げる一方で、ＮＫ細胞の除去は、わずか又はまった（影響を有しない（図６ 、区画Ａ）という理由から、両、ＣＤＪ＋及びＣＤ８＋のＴ細胞には、効果的な ワクチン接種が必要であった。更に、各種Ｔ細胞の小部分を除去し、次いで誘発 剤投与前に免疫処理をする時点で、両、ＣＤ４＋及びＣＤＳ＋のＴ細胞の重要性 が再び発見され（データなし）、またこのようにして、両、エフェクターにおけ る小部分及び応答の開始段階の双方の役割りが示された。 最後に、ＧＭ−Ｃ８Ｆを発現する非転換放射線処理細胞又は放射線処理細胞のい ずれかでワクチン処理されたマウス中の腫瘍である特定ＣＤＳ＋細胞毒Ｔ細胞の 世代を検討した。放射線処理ＧＭ−Ｃ８Ｆ転換又は非転換Ｂ１６細胞でワクチン 処理したｉ＆１４日間に及ぶのこの一連の実験において、巨大法を収穫し、そし てそれを試験管内で、５日間にわたりＢ１６細胞で処理したγ−インターフェロ ンにより刺激した。 ＣＤ８阻害ＣＴＬ活性を、４時間の５４Ｃｒ放出実験において、Ｂ１６標的細胞 で処理したγ−インターフェロン上で、各種エフェクター二標的比において測定 した。無処理のＣ５７Ｂ１／６からの巨大法及び対照群としてＢａ１ｂ／ｃマウ スを用いた。日程を、図６Ｂで示した（ここで、口は、ＧＭ−Ｃ３Ｆ、・は、Ａ １１ｏ、◇は、無処理、及び△は、放射線処理Ｂ１６を表す）。非転換細胞でワ クチン処理したマウスでは、わずかなＣＤＳ＋阻害剤殺傷を検知したのに対し、 ＧＭ−Ｃ３Ｆを発現する細胞でワクチン処理したマウスから単離した細胞標本に おいては、ＣＤＳ＋阻害殺傷の顕著な増加が示された。 先の研究では、腫瘍細胞を発現するサイトカインが、サイトカインのＴ介助細胞 まで迂回する発現能力により全身的な抗腫瘍免疫を増大する可能性が示唆された 。その様式は、ＩＬ−２を発現する腫瘍細胞が、両、ＣＴ−２６クローン癌及び ＢＩ３黒色型において、全身的免疫を引き出すこと、及び腫瘍免疫が、ＣＤＳ＋ 細胞のみに依存しているという発見に基づいている。しかし、ＩＬ−２を発現す るＢ１６細胞による全身的免疫生成、及びＧＭ−Ｃ３ＦがＣＤ４＋に影響を与え ている事実は、ＧＭ−ＣＳＦを発現する細胞が炎症性の別の様式において全身的 免疫を引き出す可能性を示唆している。ＧＭ−Ｃ８Ｆを発現する放射線処理細胞 を用いたワクチン接種により誘導されたいくつかの免疫応答の特性は、基本的な 機序が、宿主抗原が存在する細胞による腫瘍特定抗原の発現を増大する可能性を 含んでいる事を示唆している。ＧＭ−Ｃ３Ｆを発現する細胞により誘導された全 身的免疫の範囲が試験されたＧＭ−Ｃ５Ｆ分泌の度合いにほんとんど影響されな かった（図３Ｂ）のに対し、ワクチン腫瘍細胞の絶対数は臨界的であった。この 発見は、ワクチン処理のために入手可能な腫瘍特定抗原の絶対量は、通常は制限 されることを示唆している。また、ＧＭ−Ｃ３Ｆを発現する細胞の注入は、単球 細胞の劇的な流入を誘導し、より少数の他の細胞型と共に潜在的な抗原が細胞を 発現していることが解かった。更に、両ＣＤ４＋及びＣＤＳ＋細胞は、免疫応答 には必要であった。本発明において用いられたＢ１６細胞は、γ−ＩＦＮ処理の 後でさえ検知可能な量のＩＩ−ＭＨＣ分子を発現しなかった（未公開結果）。 従って宿主抗原が存在する細胞、というよりもむしろ腫瘍細胞それ自身は、ＣＤ ４＋Ｔ細胞の起爆に対して応答可能であると思われた。このデータは、ＧＭ−Ｃ ５Ｆの局所的な生成は、腫瘍抗原の発現を改質し、従ってＣＤ４＋ヘルパー及び ＣＤＳ＋、細胞毒性キラーＴ細胞間における共同研究は、確立されるか又は改善 されるかした（試験管内）。 実施例１２．池のレトロウィルスベクターの用途ｐＬＪ・このベクターの特性は 、（２０）、１９９１年１０月３１日書簡のＵ。 Ｓ、Ｓ、　Ｎ、　０７／７８６．０１５及び１９９１年１０月３１日書簡のＰＣ Ｔ、　ＵＳ９１．０８１２１中でに記載されている。このベクターは、２つの型 の遺伝子を発現する能力を有する：対象遺伝子及びネオ遺伝子のような支配型選 択マーカー遺伝子。マウスＩＬ−２、ＧＭ−Ｃ５ＦＳＩｔ−４、ＩＬ−５、Ｉ　 Ｌ−６、ＩＣＡＮＳＣＤ２、ＴＮＦ−α及びＩＬＬ−ＲＡ（インターロイキン− １−受容アンタゴニスト）を含むｐＬＪベクターを製造した。更に、ＴＮＦ−α 、ＧＭ−Ｃ３Ｆ及びＩＬ−２にコードされるヒト配列を製造した。対象の遺伝子 を、５°　ＬＴＲのちょうど末端部にクローン化するＢａｍ１（Ｉ／Ｓｍａｌ／ ５ａｌｌ中に直接に配置した。ネオ遺伝子を、内部活性剤（ＳＶ４０から）の末 端に配置した（つまり、内部活性剤は、クローン地点よりも３′遠い位置に配置 されており、すなはち、それをクローン位置の３′に配置したということである ）。ｐＬＪからの転写を、２つの地点：５゛ＬＴＲ（対象遺伝子に応答可能）及 び内部ＳＶ４０促進剤（選択マーカー遺伝子１一応答可能）から開始した。ｐＬ Ｖの構造を、図ＩＢに示した。 ｐＥｍ：この単純なベクターは、１９９１年１０月３１日書簡０）Ｕ、　Ｓ、　 Ｓ、　Ｎ、　０７／７８６．０１５及び１９９１年１０月３１日書簡ノｐｃＴ／ Ｕｓ９１１０８１２１中ニ記載されテいル。 野生型ウィルスのｇａｇＳｐｏｌ及びｅｎｖにコードするすべての配列を、唯一 の遺伝子のみが発現される対象遺伝子と置き換えた。ｐＥｍの構成部分を下記に 示した。５′側面配列、５’　ＬＴＲ及び接触配列の４００の塩基対（ＢａＨＩ 部に達する）は、ｐＺＩＰからのものである。３′側面配列及びＬＴＲも又、ｐ ＺＩＰからのものである；しかじ、上方の、３’　ＬＴＲからのＣＩａＩ部の１ ５０の塩基対は、ＢａｍＨＩクローンリンカ−と結合し、ベクター内に存在する ＢａｍＨＩクローン部の半分を形成した。ｐＢＲ３２２のＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ／ ＥｃｏＲＩ片は、ピラミッド型の骨格を形成した。このベクターは、モロニーマ ウス白血病ウィルスの菌株からクローンされた配列から誘導したものである。 マウスＩＬ−２、ＧＭ−Ｃ３Ｆ、ＩＬ−４、ｒＬ−５、γ−ＩＦＮ、ＩＬ−６、 ＣＤ２、ＴＮＦ−α及びＩＬＬ−ＲＡ（インターロイキン−１−受容アンタゴニ スト）を含むｐＥｍベクターを製造した。更に、ＴＮＦ−α、ＧＭ−Ｃ３Ｆ及び ＩＬ−２をコード化するヒト配列を製造した。 ａｓＧｃ：１９９１年１０月３１日書簡ノＵ、　Ｓ、　Ｓ、　Ｎ、　０７／７８ ６．０１５及び１９９１年１０月３１日書簡のＰＣＴ／ＩＪＳ９１１０８１２１ 中に記載されるα−８ＧＣベクターは、α−グロブリン遺伝子からの転移アクセ プター配列を用いてサイトカインがコード化する遺伝子の発現を整列させる。促 進因子を含む６００個の塩基対片は、更に転移開始因子剤及び確実なα−グロブ リンｍＲＮＡの５°非転移領域を含む。サイトメガロウィルスからの転写エンハ ンサ−を含む３６０個の塩基対片は、α−グロブリンプロモーターを先導し、そ してこの因子からの転写を増大する。更に、ＭＭＬＶエンハンサ−を、３’　Ｌ ＴＲから除去した。この除去は、感染において５’　ＬＴＲに転移し、そして特 に転写的に活性である因子の作用を不活性とした。 α−３ＧＣの構造を図Ｄ１に示した。 マウス、Ｉ　Ｌ−２、ＧＭ−Ｃ３ＦＳ　ＩＬ−４、ＩＬ−５、γ−ＩＦＮ１１Ｌ −６、ＩＣＡＮ、ＣＤ２、ＴＮＦ−α及びＩＬＬ−ＲＡ（インターロイキン−１ −受容アンタゴニスト）α−３ＧＣベクターを製造した。更に、ＴＮＦ−α、Ｇ Ｍ−Ｃ５Ｆ及びＩＬ−２をコードするヒト配列を製造した。 実施例１３：ウィルス抗原及びサイトカインの併用投与適切なワクチン細胞（繊 維芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、単球、ｄｅｎｔｒｉｔｉｃ細胞を含むが 、これに制限しない）に、ＨＩＶ抗原（ｇａｇ、ｅｎｖＳｐ。 ］、ｒａＶ、ｎｅｆＳ　ｔａｔ及びｖｉｆを含むが、これに制限しない）の個別 又は組み合わせ及び放射線処理型又は増殖不能化されたサイトカイン（例えばＧ Ｍ−Ｃ３Ｆ）の単独又は組み合わせを発現するレトロウィルスを感染させ、そし て患者に投与した。 このベクターは、２つの型の遺伝子二対象遺伝子及びネオ遺伝子のような支配型 選択マーカー遺伝子、を発現する能力を有するという仮説に同調するものである 。 実施例１，４．免疫応答の抑制 適切なワクチン細胞（実施例１３を見よ）及び同種移植片（腎臓内の胃管上皮の 細胞）の特定細胞を、放射線処理又は増殖不能化されたサイトカイン（例えば、 γ−インターフェロン）の単独又は組み合わせを発現するウィルスに感染させ、 そして同種移植片に対する免疫応答を減少するために患者に投与した。 更に、本発明は、自己免疫欠損を抑制するために用いることができる。宿主標的 抗原に対する自己免疫応答も又、同様の方法により改質できる。例えば、本発明 は、多発性硬化症に用いることができる。適切な細胞（実施例１３を見よ）は、 ミニリン塩基蛋白質及びサイトカイン（例えばγ−インターフェロン）を表現す るレトロウィルスに感染し、患者のミニリン塩基蛋白質に二対する免疫応答を減 少させる。 実施例１５．免疫応答の増大 更に、本発明は、さまざまな感染疾患に対する免疫応答を増大するために用いる ことができる。例えば、本発明はマラリアの治療に用いることができる。適切な ワクチン細胞（実施例１３を見よ）は、環状スポロゾイト表面の蛋白質からの遺 伝子及び、放射線処理又は増殖不能化されたサイトカイン（例えばＧＭ−Ｃ３Ｆ ）を表現するレトロウィルスに感染させ、そしてそれらをマラリアに対する治療 応答を減少するために患者に投与した。 先の例中に記載されたような本発明のさまざまな改質は、本発明の範囲内におい て用いることができるということは、それらの優れた技術により理解することが できる。それらの多くの変異及び改質が技術的に優れたものであることは明らか であり、又それらは、ここで解説された本発明の精神及び範囲内にある。 文献： （１）：Ｏｃｔｔｇｅｎ　ｅｔ、　ａｌ、　、　Ｔｈｅ　ｈｉｓｔｏｒｙ　ｏｆ 　ｃａｎｃｅｒ　ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、　Ｉｎ　Ｅ奄盾撃盾■奄メ@Ｔ ｈｃｒ ａｐｙ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ、　Ｄｅｖｊｔａ　ｅｔ、ａｌ、ｅｄｓ、　（Ｊ、 Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ　Ｃｏ、）　ｐｐ８７−１１９（１９X１） （２）　：Ａｓｈｅｒ　ａｔ、　ａｌ、　、　Ｊ、　１．、　ｕｎ、　１４６． ３２２７−３２３４（１９９１）（３）　：Ｕａｖｅｌ］、　ｅｔ、　ａｔ、　 、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ。１６７１０６７−１０８５　（１９８８）（４） 　：Ｇａｎ５ｂｂａｃｈｅｒ　ｅｔ、　ａｌ、　、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　 、　５０．７８２０−７８２５（１９９０）（５）：Ｆｏｒｎｉ　ｅｔ、　ａｌ 、、　Ｃａｎｃｅｒ　ａｎｄ　Ｍｅｔ、　Ｒｅｖｉｅｖｓ、　７．２８９−３０ ９（１９８８）（６）　：Ｗａｔａｎａｂｅ　ｅｔ、　ａｔ、　、　Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ　、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８６．９４５６−９４６０i１ ９８９） （７）：Ｔａｐｐｅｒ　ｅｔ、　ａｌ、、　Ｃｅ１１，５７．５０３−５１２（ １９９０）（８）：Ｆｅａｒｏｎ　ｅｔ、　ａｔ、、　Ｃｅ１］、６０．３９７ −４０３（１９９０）（９）　：Ｇａｎ５ｂａｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　 Ｅｘｄ、　Ｍａｄ、　、　１７２．１２１７−１２２４（１９９０）（１０）　 ：Ｂｌａｎｋｅｎｓｔａｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ、　Ｅｘｏ、　Ｍｅｄ、　 、　１７３．１０４７−１０５２（１９９１）（１１）：Ｔａｎｇ　ｅｔ　ａｌ 、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵＳＡ、８８３５３５−３５３９ （１９９１）（１２）　：Ｃｏｌｏｍｂｏ　ｅｔ　ａｔ、　、　Ｊ、　Ｅｘｐ、 　Ｍａｄ、　、　１７３．８８９−８９７（１９９１）（１３）：Ｒｏｌｌｉｎ ｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ、、１１．３１２５−３１３１ （１９９１）（１４）：Ｈｏｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１ ７４．１２９１−１２９８（１９９１）（１５）　：Ｇｏｌｕｍｂｅｋ　ｅｔ　 ａｌ、　、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２５４．７１３−７１６（１９９１）（１６） 　：Ｆｏｌｅｙ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　、　１３．８３５−８３７（１９ ５３）（１７）　：Ｋｌｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｃａｎｃｅｒ　ＲＥｓ、　 、　２０．１５６１−１５７２（１９６０）（１ｇ）　：Ｐｒｅｈｎ　ｃｔ　ａ ｌ、　、　Ｊ、　Ｎａｔｋ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、　、　１８．７６９− ７７８（１９５７）（１９）　：Ｒａｖｅｓｚ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　、 　２０４４３−４５１（１９６０）（２０）　：Ｋｏｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、　 、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８４．２１５０ （１９８７）（２１）　：Ｃ１ｅｒｉｃｉ　ｅｔ　ａｌ、　、Ｊ、　Ｉｍａ＋ｕ ｎｏ１．　、１４６．２２１４−２２１９（１９９１）（２２）　：Ｖｅｎｅｔ 　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、　１４８．２８９９−２９０ ８（１９９２）（２２）：Ｎｏｓｍａｌｉｎ、　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ、　Ｉｍ ｍｕｏｌ、　、　１４６．１６６７−１６７３（１９９１）（２４）：＾ｒＩａ ｅｎｔａｎｏ　ｅｔ　ａＬ、　、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　、　６１．１６４７− １６５０（１９８７）（２５）：Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　、Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、＾ｃｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７４．５４６３−５４６７（１９７ ７j （２６）　：Ｙｏｋｏｔａ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ｓｃ ｉ、　ＵＳＡ、　８２．６８−７２（１９８５）（２７）　：Ｌｅｅ　ｅｔ　ａ ｌ、　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８３．２０６１−２ ０６５（１９８６）（２ｇ）　：Ｃａｍｐｂｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｅｕｒ ｃｏ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　１７４３４５−３５２（１９８ｇ）（２ ９）　：Ｇｏｕｇｈ　ｅｔ　ａｌ、　、ＥＭＢＯＪ、　、　４．６４５−６５３ （１９８５）（３０）　：Ｈｏｒｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ、　、　ＥＭＢＯＪ、　、 　８．２８８９−２８９６（１９８９）（３１）：Ｖａｇｉｔａ　ｅｔ　ａｔ、 　、　Ｊ、　ＩｍＩａｕｎｏｌ、　、　１４０．１３２１−１３２６（１９８８ ）（３２）：ｔｌａｍａｄａ　ｅｔ　ａｌ、　、　ｉｎ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏ ｎ（３３）　：Ｗａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、　、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２２８．１４ ９−１５４（１９８５）（３４）：Ｇｅａｒｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｄｕ ｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｓｓａｙ　ｏｆ　１ｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ　２．Ｉｎ　 Ｌｙ高垂■盾汲鰍獅■■ ａｎｄ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ：＾　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ 、Ｃｌｅｍｅｎｔｓ　ｅｔ　ａｌ、ｅｄｓ、（ＩＲＬ　Ｐｒ■唐刀AＯｘｆ。 ｒｄ、　１９１１１７）ｐｐ２９６−２９９（３５）　：Ｉ］ｕ−Ｌｉ　ｅｔ　 ａｌ、　、　Ｊ、　Ｔｍｍｕｎｏｌ、　、　１４２．８００−８０７（１９８９ ）（３６）　：Ｌａ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ　Ｒｅｓ、　（ ＵＳ）、　７．９９−１０６（１９８８）（３７）　：Ｄｅｘｔｅｒ　ｅｔ　ａ ｌ、　、　Ｊ、　ＥｘｐｌＭｅｄ、　、　１５２．１０３６−１０４７（１９８ ０）（３８）　：Ｄｕｇｒｅ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ａｃｔａ、　Ｐａｔｈｏｌ、 　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　５ｅｃｏｎｄ、　A　８０．８６ ３−８７０（１９７２） （３９）　＋０１ｉｆｆ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｃｅ１１．５０．５５５−５６３ （１９８７）（４０）　：Ｈａｎｎ＋ｍ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｎａｔｕｒｅ、　 ３４３．３３６−３４０（１９９０）（４１）：Ｃｏｌｊｇａｎ　ｅｔ　ａｌ、 、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　（Ｇｒ ｅｅｎｅ　Ｐｕｂ撃奄唐■奄獅■O ５ｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）１９９ １（４２）：Ｔａｋｅｉ、　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、　 １３４．１４０３−１４０７（１９８５）（４３）　：Ｄａｎｏｓ　ｅｔ　ａｌ 、　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８５．６４ ６０（１９８ｇ）（４４）　：Ｄａｎａｓ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８５．６４６０（１９７５）（４５ ）　：５ｏｕｔｈｅｒｎ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ、　Ｍｏ１．＾ｐｐ１．　Ｇｅ ｎｅｔ、　、　１．３２７−３４１（１９９２）（４６）　：５ｏｕｔｈｅｒｎ 、　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　、　９８．５０３−５１ ７（１９７５）（４７）　：Ｃｏｎｅ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｃ ｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　、　７．８８７−８９７（１９８７）（４８）　：Ｓａ ｍｂｒｏｏｘ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ、 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（bｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ ａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ　１９８９） （４９）：Ｆｅｉｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、　、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　 、　１３２．６−１３（１９８３）（５０）　：Ｆｉｄｌｅｒｅｔ　ａｌ、　、 　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　、　３５．２１８−２３４（１９７５）（５１）　 ＋Ｂｅｒｄ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ、　Ｃ１１ｍ、　０ｎｃｏ１．　、８．１８ ５８−１８６７（１９９０）（５２）　：Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、　 、　Ｎ、　Ｅｎｏｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　、　３１９．１６７６−１６８０（１ ９８８）（５３）　：Ｂｒａｔｔａｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒ Ｅｓ、　、　４０．２１４２−２１４６（１９８０（５４）　：Ｄｅｌｅｏ　ｅ ｔ　ａｌ、　、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｅｘｐ、　、　１４６．７２０−７３４（１ ９７７）（５５）：Ｍｕｒｐｈｙ　ｅｔ　ａｌ。、　Ｊ、　Ｎａｔｌ、　Ｃａｎ ｃｅｒ　Ｉｎａｓｔ、　、　５０．１０１３−１０２５（１９７３）（５６）： Ｂｅｒｔｒａｗ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　１１． ６３−７３（１９８０）（５７）：Ｍｏｒｒｉｓｓａｙ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ 、　Ｉｍｍｕｍｏｌ、　、　１３９．１１１３−１１１９（１９８７）均等性 当業者は、これ以上の実験を行う事なく、特に解説した本発明に特有の実施態様 に対する均等の範囲を確認できるであろう。また、そのような均等の範囲は、下 記の請求の範囲内に含まれるものと思われる。 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、ＩＡ ＦＩＧ、ＩＢ ＦＩＧ、ＩＣ ＦＩＧ、ＩＤ 浄書（内容に変更なしン ワクチン接種後の日 ＦＩＧ、２Ａ ＦＩＧ、　２Ｂ 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、３Ａ 手続補正書坊式） ％式％ １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ９２１０８４５５ 平成　５年特許願第５０７１１０号 ２、発明の名称 サイトカインおよび抗原を用いた全身の免疫応答の調節３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所 名　称　ホワイトヘッド・インスティテユート・フォー・バイオメディカル・リ サーチ　（外１名）４、代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区 ５、補正命令の日付　平成　６年　９月２７日　（発送日）６、補正の対象 （１）出願人の代表音名を記載した国内書面（２）委任状並法人国籍証明書及び 翻訳文（３）図面翻訳文 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　Ｓ／１０ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｃ９２８２−４Ｂ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：９１） ９０５０−４Ｂ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。 ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ （ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ， ＳＮ、　ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　 ＣＨ，ＣＳ。 ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、　Ｍ Ｇ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＰＬ、Ｒ○、　ＲＵ、　ＳＤ、　ＳＥ ＦＩ Ｃ１２Ｎ　１５１００　Ａ （７２）発明者　ドラノフ、グレン アメリカ合衆国マサチューセッツ州０２１７３゜レキシントン、アウトルック・ ドライブ（７２）発明者　マリガン、リチャード・シーアメリカ合衆国マサチュ ーセッツ州０１７７３゜リンカーン、サンディー・ポンド・ロード（７２）発明 者　パードル、ドリュー アメリカ合衆国メリーランド州２１２１０．パルティモア、ローランド・スプリ ングズ・ドライブ　４４４８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．抗原に対する哺乳動物の免疫反応を調節する方法であって；個々の動物に ａ）抗原；および ｂ）上記抗原に対する哺乳動物の免疫反応を変化させる、少なくとも１つのサイ トカイン、接着または補助分子； の治療上の有効量を、上記抗原に対する哺乳動物の全身的な免疫反応の調節が達 成されるような方法で同時に投与することからなる方法。 ２．腫瘍細胞タイプに対する哺乳動物の免疫反応を調節する方法であって：哺乳 動物に ａ）抗原であって、該抗原は腫瘍細胞自体あるいは該腫瘍細胞からの抗原である もの；および ｂ）上記抗原に対する哺乳動物の免疫反応を変化させる、少なくとも１つのサイ トカイン； の治療上の有効量を、上記腫癌細胞タイプに対する哺乳動物の全身的な免疫反応 の調節が達成されるような方法で同時に投与することからなる方法。 ３．抗原に対する哺乳動物の免疫反応を調節する方法であって：哺乳動物に少な くとも ａ）サイトカイン；および ｂ）上記抗原； の組み合わせを発現するような方法で修飾された細胞を投与することからなり、 該修飾された細胞の治療上の有効量を、上記抗原に対する哺乳動物の全身的な免 疫反応の調節が達成されるような方法で投与することからなる方法。 ４．腫瘍細胞タイプに対する哺乳動物の免疫反応を調節する方法であって：哺乳 動物に、少なくとも ａ）第１のサイトカイン；および ｂ）第２のサイトカイン； の組み合わせを発現するような方法で修飾された腫瘍細胞を投与することからな り、該修飾された腫瘍細胞の治療上の有効量を、上記腫瘍細胞タイプに対する哺 乳動物の全身的な免疫反応の調節が達成されるような方法で投与することからな る方法。 ５．第１のサイトカインがインターロイキン−２で、上記第２のサイトカインが 顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子である請求項４の方法。 ６．腫瘍細胞タイプが黒色腫細胞タイプである請求項５の方法。 ７．腫瘍細胞タイプに対する哺乳動物の免疫反応を調節する方法であって：ａ） 上記腫瘍細胞タイプの腫瘍細胞であって、少なくとも１つのサイトカインを発現 する腫瘍細胞を提供し； ｂ）上記細胞を照射し； ｃ）上記細胞を上記哺乳動物に投与する；ことからなり、該細胞の治療上の有効 量を、上記腫瘍細胞タイプに対する哺乳動物の全身的な免疫反応の調節が達成さ れるような方法で投与することからなる方法。８．上記照射された腫瘍細胞が顆 粒球−マクロファージコロニー刺激因子を発現する請求項７の方法。 ９．上記照射された修飾された腫瘍細胞が、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＣＤ２および ＩＣＡＭからなる群から選択されるサイトカインを発現する請求項７の方法。 １０．哺乳動物の特定タイプの継代腫瘍を逆戻りさせる方法であって：哺乳動物 に ａ）上記腫瘍タイプの腫瘍細胞；およびｂ）少なくとも１つのサイトカイン； の治療上の有効量を、上記腫瘍細胞タイプに対する哺乳動物の全身的な免疫反応 の調節が達成されるような方法で同時に投与することからなる方法。 １１．哺乳動物の特定タイプの継代腫瘍を逆戻りさせる方法であって：哺乳動物 に、少なくとも ａ）第１のサイトカイン：および ｂ）第２のサイトカイン： の組み合わせを発現するように修飾された腫瘍細胞を投与することからなり、該 修飾された腫瘍細胞の治療上の有効量を、上記腫瘍細胞タイプに対する哺乳動物 の全身的な免疫反応の調節が達成されるような方法で投与し、該調節された免疫 反応は上記継代腫瘍の逆戻りによるものである方法。 １２．上記修飾された腫瘍細胞がさらに第３のサイトカインを発現する請求項１ １の方法。 １３．第１のサイトカインがＩＬ−２で、第２のサイトカインがＧＭ−ＣＳＦで 、第３のサイトカインがＴＮＦ−αである請求項１１の方法。 １４．第１のサイトカインがＩＬ−２で、第２のサイトカインがＧＭ−ＣＳＦで 、第３のサイトカインがＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＣＤ２およびＩＣＡＭからなる 群から選択される請求項１１の方法。 １５．哺乳動物の特定タイプの継代腫瘍を逆戻りさせる方法であって：ａ）上記 腫瘍細胞タイプの腫瘍細胞であって、少なくとも１つのサイトカインを発現する 腫瘍細胞を提供し； ｂ）上記細胞を照射し： ｃ）上記細胞を上記哺乳動物に投与する：ことからなり、該細胞の治療上の有効 量を、上記腫瘍細胞タイプに対する哺乳動物の全身的な免疫反応の調節が達成さ れるような方法で投与することからなる方法。 １６．サイトカインをコードしている遺伝物質を組み込まれており、該遺伝物質 によってコードされたサイトカインのインビボでの発現が可能であり、上記遺伝 物質は、ＭＦＧ，α−ＳＣＧ、ｐＬＪおよびｐＥｍからなる群から選択されるレ トロウイルスベクターの遺伝物質ならびにサイトカインをコードする遺伝物質か らなる請求項３の修飾された細胞。 １７．サイトカインをコードしている遺伝物質を組み込まれており、該遺伝物質 によってコードされたサイトカインのインビボでの発現が可能であり、上記遺伝 物質は、ＭＦＧ，α−ＳＣＧ、ｐＬＪおよびｐＥｍからなる群から選択されるレ トロウイルスベクターの遺伝物質ならびにサイトカインをコードする遺伝物質か らなる請求項４の修飾された細胞。 １８．サイトカインをコードしている遺伝物質を組み込まれており、該遺伝物質 によってコードされたサイトカインのインビボでの発現が可能であり、上記遺伝 物質は、ＭＦＧ，α−ＳＣＧ、ｐＬＪおよびｐＥｍからなる群から選択されるレ トロウイルスベクターの遺伝物質ならびにサイトカインをコードする遺伝物質か らなる請求項７の修飾された細胞。 １９．サイトカインをコードしている遺伝物質を組み込まれており、該遺伝物質 によってコードされたサイトカインのインビボでの発現が可能であり、上記遺伝 物質は、ＭＦＧ，α−ＳＣＧ、ｐＬＪおよびｐＥｍからなる群から選択されるレ トロウイルスベクターの遺伝物質ならびにサイトカインをコードする遺伝物質か らなる請求項１１修飾された細胞。