JPH07503135A

JPH07503135A - Ｈｉｖ‐１の標的核酸配列を増幅及び検出する方法

Info

Publication number: JPH07503135A
Application number: JP5512640A
Authority: JP
Inventors: ヘンラード，デニス・アール; ミムス，ラリー・テイー; ゼルデイス，ジエローム・ビー
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1992-01-13
Filing date: 1993-01-13
Publication date: 1995-04-06
Also published as: EP0672176A4; AU3471593A; WO1993014225A1; EP0672176A1; CA2127883A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ＨＩＶ−１の標的核酸配列を増幅及び検出する方法発明の背景本発明は、生物試料中の標的核酸配列を検出する方法に係わり、特に生物試料中の標的核酸配列を増幅及び検出するための改良された方法に係わる。

ヒトは、種々のウィルス抗原に対して抗体を産生ずることによりウィルス感染に応答する。産生される抗体の総数及び各種抗体の量は、抗体応答を開始するウィルス抗原に依存する。

問題にされるウィルス感染の１つに肝炎感染がある。肝炎の原因物質として少な（とも４種のウィルス＝Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢｖ）、Ａ型肝炎ウィルス（ＨＡＶ）、Ｄ型肝炎ウィルス（ＨＤＶ）　、及びＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）とも呼ばれる非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス（ＮＡＮＢ）が同定されている。４種の肝炎ウィルスに伴う症状はがなり似ており、血清学的マーカーを使用せずに明確な診断を下すことは不可能なことが多い。ＨＡＶ及びＨＢＶはヒト血液及び他の体液中で固有の抗原及び抗体を産生ずる。かかる抗原及び抗体は、感染の過程で各自独特の血清学的パターンをたどるので、血清学的マーカーとして使用し得る。かかる抗原及び抗体を検出することにより、肝炎の型を診断するだけでなく、感染の段階及び場合によっては予後を判断することもできる。

ＨＢＶ感染に係わる抗原には、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）　、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃ）及びＢ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）が含まれる。これらの抗原は、感染過程を通して種々の時点に様々な組合せで存在する。例えばＨＢｓＡｇは通常は１〜６力月の潜伏期間の後に血清中に出現し、症状発生の直後にピークに達し、一般には１〜３力月以内に消失する。はとんどの場合、ＨＢｓＡｇ及び抗ＨＢｓ（表面抗原に対する抗体）のいずれも検出できない“ウィンドウ期間” が生じる。ウィンドウ期間の長さは一般に２〜６週間である。これに続く抗ＨＢｓの出現の徴候は、Ｂ型肝炎感染から回復し恐ら（は免疫となったことを知らせるものである。この時点で、個体は免疫であると見なされる。

これに対して、ＨＢｃＡｇに対する抗体（抗ＨＢｃ）は発症と同時に出現し、その力価が急増する。これは他のマーカーのない上記ウィンドウ期間中にも存在し、従って、最も信頼性のある感染の指標である。肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）は症状発生の前にＨＢｓＡｇと同時に出現し、急性の場合には、ＨＢｓＡｇの低減前に消失する。ＨＢｅＡｇは、活発なウィルス複製と高いＤＮＡポリメラーゼ活性とを示すものであり、これは高度感染状態を表わしている。

ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇを検出するイムノアッセイは、１ｍｌ当たりたった数個のウィルスしかない感染下限濃度未満では、ウィルス関連抗原を検出することはできない。ＨＢＶ　ＤＮＡのフィルターハイブリダイゼーションアッセイは０．１〜１　ｐｇ　（２５００〜２５．０００ウイルス）を検出し得るのみである。ＨＢｓＡｇ陽性（ＨＢｓＡｇ＋）患者であってもウィルスを自発的に産生せず、感染性ではない場合があるが、現在使用可能なアッセイは、このような個体を、ウィルス複製は低レベルだが感染性である患者と区別することはできない。優れた医療管理のためには、全てのＨＢｓＡｇ陽性患者を感染性と見なす必要がある。

試料中の被分析物質、例えば細菌、ウィルスまたは遺伝子欠陥の存在の指標として特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列の存在を検出することに依存する多数の診断アッセイが開発されている。場合によってはＤＮＡまたはＲＮＡ配列は、ハイブリダイゼーション、特異的抗体との反応、または他の方法によって直接検出するのに十分な量で存在する。しかしながら、問題の配列が少量しか存在しなかったり、試料中に存在する類似配列によって惹起されるバックグラウンドが著しく高い場合、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列を信頼をもって高感度で検出することは難しい。

最近では、問題のＤＮＡまたはＲＮＡ配列の存在について極めて少量の核酸を分析するために、ＤＮＡ及びＲＮＡを検出するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が使用されている。ＰＣＲ法は、特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用し、標的ＤＮＡの変性、プライマーアニーリング及びＤＮＡポリメラーゼによる伸長のサイクルを繰り５−５−２９７（１９８；米国特許第４．６８３．２０２号及び第４．６８３．１９５号。

ＨＢＶ　ＤＮＡ配列を検出するためにＰＣＲ法を使用する上での問題点は、血清がＤＮＡポリメラーゼの阻害物質を含むことである。このことで、ＰＣＲを実施する前に核酸を抽出及び精製することが必要となる。Ｋａｎｅｋｏ　Ｓ、ら。

ＰＮＡＳ、８６　：　３１２−３１６（１９８９）　；　Ｔｈｅｉｒｓ　Ｖ、ら、Ｌａｎｃｅｔ、ｉｉ　：　１２７３−１２７６（１９８８）。核酸の精製は完全に有効ではなく、問題の核酸配列が減損する結果となることが多い。ＰＣＲによって与えられる感度は、感染Ｔ細胞に含まれるＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡの検出における多数の研究を促進した。最近のデータは、プロウィルス負荷の定量化により、抗ウイルス治療を評価すること、及びＡＩＤＳに進行する危険性のより低い患者群を同定することが可能となり得ることを５ｙｎｄｒ、４　：　３１４（１９９０）　；　Ｓ、　Ｍ、　Ｓｃｈｎｉｔｔｍａｎ　ら、＾ｎｎ、Ｉｎｔｅｒｎ。

Ｍｅｄ、　１１３　：　４３８−４４３（１９９０）　；及び菖、　Ｔ、　５ｃｅｃｈｔｅｒら、廷邦５：３７３−３７９（１９９１）。しかしながら、レトロウィルスのプロウィルス形態を検出してもその複製状態についての情報は得られない。即ち、ウィルスまたはウィルス成分を測定することしか真のウィルス負荷を反映するものはない。ＨＩＶの定量的血漿培養から、感染性循環ＨＩＶウィルスの力価は疾患の臨床段階に相関することが示されている。Ｄ、　Ｄ、　ｌｌｏ。

５ｕｐｒａ、Ｎ、Ｖ、Ｃｈｅｌｙａｐｏｖ　ら、５ｕｐｒａ、Ｓ、Ｍ、Ｓｃｈｎｉｔｔｍａｎ　ら、＝ｕｐｒａ、Ｍ、Ｔ、５ｃｈｅｃｈｔｅｒ　ら、５ｕｐｒａ、及びＲ，１，Ｃｏｏｍｂｓ　ら、ＮＬＥｎｇ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３２１：　１６２６−１６３１（１９８９）。しかしながら、培養はやっかいなものであり、完了するまで最高５週間を要する。ＨＩＶ抗原の存在は優れた進行予後マーカーであるが、無症候個体の１５％未満及びＡＩＤＳ患者の約５０％に横１されるに過ぎない。全核酸を抽出して血漿中のＨＩＶ−ＩＲＮＡを検出することが記載されている。１．　Ｋ、　ｔｌｅｗｌｅｔｔながらかかる方法は、入手できる量に比べより多くの試験試料を必要とする。

本発明の目的は、あとで増幅及び検出される標的核酸配列を捕獲する効果的な方法を提供することである。本発明の別の目的は、少量の核酸を直接、信頼性をもって検出し得るアッセイを提供することである。

発明の要約本発明は、生物試料中のＨＩＶ−’Ｌの標的核酸配列を検出する方法及びキットからなる。該方法は、ＨＩＶ−１の標的核酸配列を含み得る生物試料を、抗ＨＩＶ−１工ンベロープ抗体、例えば抗ＨＩＶ−１ｇｐ１２０または抗ＨＩＶ−１ｇｐ４１抗体を結合させた固体支持体上に吸着させ、結合しなかった試料を除去し、標的核酸配列を増幅し、試料中に存在する得られた増幅産物を検出することを含む。必要によっては、試料中に存在し得る妨害の恐れのある物質を除去し、該ア・ソセイ方法の感度を更に高めるべく、吸着させる前に生物試料をクロマトグラフィー材料を含むカラムに通してもよい。

本発明キットは、抗ＨＩＶ　ｇｐ１２０、抗ＨＩＶ　ｇｐ４１または抗ＨＩＶ　ｐ２４抗体のごとき抗ＨＩＶ−１工ンベロープ抗体を結合させた固体支持体と、結合しなかった生物試料を固体支持体から除去する手段と、標的核酸配列を増幅する手段と、生物試料中に存在する増幅産物を検出する手段とを含む。

図面の簡単な説明図ＩＡは、ＨＢＶ　ＤＮＡにおいてＰＣＲを実施するのに使用されるプライマーの位置、長さく塩基対単位）及び向き（方向）を示しており；図ＩＢは、ＨＢＶ　ＤＮＡ上のＳＳＣ及びＸ領域から始まる種々の時計回り及び反時計回り方向プライマー対を使用した血清ＨＢＶ　ＤＮＡの種々の断片の増幅を示す電気泳動である。

図２Ａは、モノクローナル抗ビオチン被覆微粒子が２００μｍの血清中で３０という少量のウィルスを検出したという実験結果を示す電気泳動であり：図２Ｂは、モノクローナル抗ＨＢｓ被覆微粒子がレベル３のウィルスを検出したという実験結果を示す電気泳動である。

図３は、ＨＩＶ　ｎＩ−Ｂ−Ｈ９感染細胞由来の組織培養上清の連続希釈液系を、逆転写酵素活性アッセイ（“ＲＴ”。

黒い四角を結ぶ実線で示す）、トリトンを含まないｐ２４抗原試験（白い三角を結ぶ実線で示す）、トリトンを含むｐ２４抗原試験（黒い三角を結ぶ実線で示す）及び本発明のウィルス捕獲アッセイ（黒い円を結ぶ実線で示す）した結果を示す。

図４は、血清変換の間の、本発明方法を使用したＨＩＶ−Ｉ　ＲＮＡの検出及び市販の抗原アッセイを使用したＨＩＶｐ２４抗原の検出を示すＸ線写真である。

図５は、一連の血清変換試料における逆転写酵素の存在下または不在下のＨＩＶ −Ｉ　ＲＮＡの特異的検出を示す。

発明の詳細な説明は、生物試料中の標的核酸配列を増幅及び検出する方法に係わる。該方法は、生物試料を固体支持体上に吸着させ、結合しなかった試料を除去し、標的核酸配列を増幅し、試料中に存在する得られた増幅産物を検出することを含む。試料中に存在し得る妨害の恐れのある物質を除去すべく、固体支持体に吸着させる前に、生物試料をクロマトグラフィー材料を含むカラムに通すことにより、該アッセイ方法の感度を更に高めることができる。

本発明の適用により、標的核酸配列を含む感染性物質を固相マトリックスに吸着させることにより核酸の直接検出を可能にする、より高感度のＰＣＲアッセイの方法が提供される。該方法は種々のウィルス血症の診断に適用可能であるが、後述の実施例では本発明方法による血清ＨＢＶＤＮＡ及びＨＩＶ　ＲＮＡの検出を示す。かかる実施例は本発明の特定の実施態様を示すものであり、請求の範囲を制限するものではない。当業者は、本発明の範囲内で以下の実施例の明白な変形を容易に考え得よう。

定義核酸配列二本発明方法によって検出可能な核酸配列は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含むヌクレオチドの配列である。核酸配列は一本鎖もしくは二本鎖または一部一本鎖で一部塩基対である領域のいずれかであり得る。リボ核酸配列にはメツセンジャーＲＮＡ及びリポソームＲＮＡの両方が含まれる。

し得る酵素であって、プロテアーゼ、プロテアーゼに１プロナーゼ、トリプシン、アルカリ性プロテアーゼ、ズブチリシン及びキモトリプシンのごときエキソペプチダーゼ及びエンドペプチダーゼの両方を含む。

標的核酸または標的核酸配列二本明細書において使用されるかかる用語は、一本鎖または二本鎖いずれかの形態のＤＮＡまたはＲＮＡを指し、メツセンジャーＲＮＡまたはリポソームＲＮＡをも含む。例えば標的核酸は、ウィルス、原核または真核性の微生物、及び疾患または特定の生理状態に関連し得る任意の異常細胞中に存在し得る。標的核酸とシテハ、ＨＩＶ　（ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２）　、肝炎ウィルス、ヘルペスウィルス、ヒトレトロウィルス、ヒト乳頭腫ウィルス、エプスタイン−パールウィルス、サイトメガロウィルス、ウィルスＲＮＡ転写物、及び複製中間体の核酸が挙げられる。更には、マイコプラズマ、リッヶチア及びクラミジアのごとき細菌、真菌、酵母のごとき真核病原体、異常または変異宿主細胞、特に腫瘍遺伝子、遺伝子欠陥または遺伝子マーカーを含むものの核酸が挙げられる。

生物試料二本明細書において使用される生物試料は、問題の標的核酸を含み得る任意の試料である。生物試料源としては植物、昆虫及び動物が挙げられる。好ましい生物試料は、血清、血漿、滑液、バイオプシー材料、組織培養細胞または組織培養物中の細胞由来の増殖培地、組織抽出物及び膜洗液（ｍｅｌｌｌｂｒａｎｅ　ｗａｓｈｅｓ）である。

特異的結合対：本明細書において使用される特異的結合対は２種の分子からなり、一方の分子は、もう一方の分子の特定の空間的及び極性構成に特異的に結合する領域をその表面またはキャビティ内に有する。特異的結合対のメンバーは、リガンドとレセプター、またはリガンドとアンチリガンドと称されることも多い。

かかる例としては、抗体−抗原、ホルモン−レセプター対、酵素−基質対、ビオチン−アビジン対、及び糖タンパク質−レセプター対が挙げられる。更には、増幅すべきＤＮＡに直接または間接的に関連する細胞またはウィルスタンパク質、例えば増幅すべきＤＮＡに直接または間接的に関連する任意のＨＢＶウィルスタンパク質（例えばＨＢｃＡｇまたはＨＢ　ｐｏｌ遺伝子産物）を含む、特異的結合対のフラグメントまたは部分も挙げられる。また、結合特異性を保持する特異的結合対のフラグメントまたは部分、例えばＦａｂフラグメントなどを含む免疫グロブリンのフラグメントも挙げられる。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルのいずれでもよい。

固体支持体：適当な固体支持体としては、反応トレーのウェル、試験管、ビーズ、ストリップ、膜、フィルター、微粒子（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）　、または当業者にはよく知られた他の固体支持体が挙げられる。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）：本明細書において使用される該方法は、標的ＤＮＡの変性（解離）、プライマーアニーリング、及びＤＮＡポリメラーゼを用いた伸長（相補鎖合成）の反復サイクルにおいて、特異的オリゴヌクレオチドブライマーを使用する。−のプライマーから生成された伸長産物は、次回のプライマーにおいて追加の標的配列として作用する。標的配列の増幅の磨度は実施するサイクル数に応じて決まり、理論的には、ｎをサイクル数とすると単純な式２／ｎ（２’）で計算される。サイクルごとの平均効率を約６５％〜８５％と仮定すると、０．３〜４．８百万の標的配列のコピーを与えるには２５サイクルを要する。

増幅技術：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）並びに当業者には周知の他の方法のごとき標的ポリヌクレオチド配列のコピー数を増加する任意の方法。リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は、ＤＮＡの断片をコピーし、更にＤＮＡ断片のコピーをコピーすることを何回も繰り返すことにより、ＤＮＡの断片を増幅する。この方法は、１９８９年６月１４日公開欧州特許出願第０３２０３０８号に記載されている。該方法においては、標的配列の直ぐ隣の領域に相補的な２つのプローブ（例えばＡ及びＢ）をハイブリダイズ及び連結する。

次いでこの連結されたプローブを標的から変性分離し、次いでこれを最初のプローブＡ及びＢとは逆向きの別の２つのプローブ（Ａ’及びＢ’）を用いてハイブリダイズする。次いで二次プローブ自体を連結する。変性／ハイブリダイゼーション／連結の連続サイクルによってセンス（＋）及びアンチセンス（−）両方の２倍長のプローブが形成される。

ＬＣＲにおいては、試料の核酸は一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡとして与えられるが、二本鎖は、変性して鎖を分離する。４つのプローブが使用されるが、最初の２つのプローブ（Ａ及びＢ）は所謂−次ブローブであり、２番目の２つのプローブ（Ａ’及びＢ’）は所謂二次プローブである。第１プローブ（Ａ）は、標的ヌクレオチド配列の主鎖の第１セグメントにハイブリダイズし得る一本鎖である。

第２プローブ（Ｂ）は、標的ヌクレオチド配列の主鎖の第２セグメントにハイブリダイズし得る。標的の主鎖の第１セグメントの５′末端は、標的の主鎖の第２セグメントの３′末端に関して、両プローブが標的ヌクレオチド配列の主鎖にハイブリダイズしたとき、第１プローブの３′末端を第２プローブの５′末端に結合し得るような位置にある。

第３プローブ（Ａ′）は第１プローブにハイブリダイズし得、第４プローブ（Ｂ ′）は第２プローブ（Ｂ）にハイブリダイズし得る。ハイブリダイズしたプローブを連結して、再構成融合プローブ配列を形成する。次いで試料中のＤＮＡを変性し、連結したプローブを試料ＤＮＡから分離する。

連結プローブ及び標的ＤＮＡに上記プロセスを実施するサイクルを繰返し、試料中の検出可能なりＮＡの量を増加させる。実施するサイクル数は、使用する配列及び要求される試験感度に従う。通常、サイクルは１５〜６０回繰り返され得る。少な（とも１つのプローブをシグナル生成化合物に結合することができる。

ｎｄ　Ｊ、Ｂａｔｔｅｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、Ｉｎｃ、。

１９８６に記載されているハイブリダイゼーション反応及びプローブ合成の一般方法の任意のものによって実施し得る。

かかる方法は、ＥＩＡ、ドツトプロット分析、アガロースゲル電気泳動、サザンプロット、液体ハイブリダイゼーション及び他のＤＮＡハイブリダイゼーション法、並びに当業者には周知の他の方法を含む。

増幅された核酸のＤＮＡ配列決定：増幅された標的核酸の配列は、方法セクションに略述する方法及び当業者には周知の他の方法によって決定し得る。

変性剤二本明細書において使用される変性剤は、解離剤、例えば洗剤、アルカリ、ＳＤＳ、尿素、グアニジンＨＣＩ、Ｎａｌ及び当業者には周知の他のカオトロピック剤を含む。

クロマトグラフィーカラム材料：クロマトグラフィーカラムを使用することにより脱塩を行ない得る。カラム材料は、液体生物試料（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｆｌｕｉｄ）を通過させて化学種を分離し得る多孔性媒質である。適当な方法としては、分子を大きさに従って分離するゲル濾過が挙げられる。他の適当な方法としてはイオン交換、アフィニティー及び疎水性クロマトグラフィー法が挙げられる。Ｐｈａｒｍａｃｉａ　（ＬＫＢＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｃａｔａｌｏｇｕｅ［１９８９］）　ｏこれらの方法は、試料中に存在し得る妨害性物質を除去するためのものである。

種々の慢性ＨＢＶ感染患者から、ＨＢｓＡｇ陽性ＨＢＶＤＮＡ陽性血清を得た。

更に、正常ＡＬＴを有し、ＨＩＶｌＨＢＶ及び梅毒の血清学的マーカーを有さない健康な血液ドナーからも血清を得た。ＨＢｓＡｇ陽性の有志血液ドナーの血漿を採取すると共に、ＨＢｓＡｇ陽性となった２人のプラスマホレーシス（ｐｌａｓｍａｐｈｏｒｅｓｉｓ）　ドナーから一連の血漿試料を得た。かかる患者は、急性Ｂ型肝炎感染の過程で頻繁にプラスマホレーンスした。全ての血清及び血漿を一２０℃で保存した。

血清学的分析市販酵素結合免疫測定装置（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｎｏｒｔｈ　Ｃｈｉｃａｇｏ、　ＩＬ）によってＨＢｓＡｇ、抗ＨＢｃＩｇＭ及びＨＢｅＡｇを試験した。２００μｌの血清を＾ｕｓｚｙＩｌｅ　（登録商標）アッセイ（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｎｏｒｔｈ　Ｃｈｉｃａｇｏ、　ｌ１ｌｉｎ。

ｉｓ）から得たビーズと一緒に室温で一晩インキユベートするラジオイムノアッセイによって、ブレＳ２抗原をアッセイした。洗浄後、１２Ｊ標識抗ブレＳ２モノクローナル抗体をビーズと一緒に４０℃で２時間インキュベートし、洗浄し、カウントした。シグナル対陰性対照比（Ｓ／Ｎ）が３゜０より大きいものを陽性と見なした。

＾ｂｂｏｔｔ　Ｇｅｎｏｓｔｉｃｓ　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　Ｖｉｒａｌ　ＤＮＡアッセイ、Ｋｕｈｎｓ　Ｍ、Ｃ１ら、Ｖｉｒａｌ　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　ａｎｄ　Ｌｉｖｅｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ、　＾、Ｊ。

Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ編、　Ａｌａｎ　Ｌｉ５ｓ　Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＮＹ、　ｐｐ、２５８−２６２（１９８８）及びドツトプロットハイブリダイゼーション、　Ｚｅｌｄｉｓ　Ｊ、Ｂ、ら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、１４　：　１５２−１６６（１９８６）によって、血清ＨＢＶ　ＤＮＡを検出した。各アッセイの感度は実質的に等しい。ＨＢＶ　ＤＮＡドツトプロット分析は、７日間のオートラジオグラフィーの後、約０．　ｌｐｇ／１００μｍ血清を検出すル。クローン化ＨＢＶ　ＤＮＡを使用した試料のオートラジオダラムの光学濃度を基準にしたウィルスＤＮＡ濃度の推定値は、電子顕微鏡、コアタンパク質濃度またはチンパンジー感染性によって決定されたウィルス力価の約１１ｏｇｌＯ以内の大きさであった。検出可能限度（０，１ｐｇ　ＤＮＡ）のわずかなシグナルは、液体ハイブリダイゼーションアッセイによっては確証し得ない一貫性のない結果を与えた。従って、２４時間オートラジオグラフィー後にシグナル（ｌｐｇシグナル）を与えたスポットのみを陽性と評価した。

プライマー図ＩＡは、ＰＣＲを実施するために使用されるプライマーの位置、長さ及び向きを示す。図ＩＢは、ＨＢＶ　ＤＮＡを含む血清においてＳ、Ｃ及びＸ領域から始まる種々の時計回り及び反時計回り方向プライマー対を使用し、ＰｃＲによって生成された種々の増幅ＤＮＡセグメントの長さを示す。ＰＣＲは、長さ５０〜２５０塩基対の疑似ＤＮＡバンドを生成することが多いので、４００塩基対より長いフラグメントを生成するプライマー対を主に使用した。百万倍以上の増幅を行なうためには４０サイクルを要した。生成されたフラグメントは右から左へ：　１４５２ｂｐ　（位置１８２５→７７）；１４１７ｂｐ　（位１１８６１→７７）　；　９２７　（位置２４５１→７７）　；　２１３２（位置１８６１→６９２）　、　２２８５　（位置１８６１→８４５）　；　３０１５　（位置１８６１→１５７５）　；　１４４１　（位置１３４→１５７５）であった。左から６番目のカラムは、ＨＢｖの１つの鎖の両末端のいずれかの側からプライミングすることにより生成される３ｏ１５ヌクレオチドフラグメントを生成することに留意されたい。幾つかのＳ遺伝子配列は、Ｊ、５ｎｉｎｓｋｙ　ａｎｄ　Ｄ、Ｍａｃｋ　ｏｆ　ＣｅｔｕｓＣｏｒｐ、、　Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、Ｃ＾によって提供されたものから誘導した。他のプライマー配列は、ＤＮＡ５ｔａｒ　（登録商標）アライメントプログラム（ＤＮＡ−３ｔａｒ、　Ｍａｄｉｓｏｎ、　ｆｉｓｃｏｎｓｉｎ　：　１４゜Ｏｎｏ　Ｙ　ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１１　：　１７４７−１７５７（１９８３））を使用して分析されている、ＧｅｎＢａｎｋから得た公開ＨＢＶＤＮＡ配列に基づく。オリゴヌクレオチドブライマーはホスホルアミシト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）化学処理によって合金てのアッセイにおいて、リン酸緩衝塩水溶液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）、正常血液バンクドナー由来の陰性対照血清、及びｌｏｇのクローン化ＨＢＶ　ＤＮＡを分析した。夾雑物混入を回避するため、試料はＰＣＲに使用した試薬を除去した実験ベンチ上で取り扱った。

増幅ＤＮＡ配列のＤＮＡ配列決定ＰＣＲ後、反応混合物を５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０（登録商標）スピンカラム、Ｃ，Ｆ、　Ｍｅａｒｅｓら、＾ｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

１４２、６８−７８（１９８４）　；　Ｈ，Ｓ、Ｐｅｎｅｆｓｋｙ、　Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌ。

次いで、製造業者指示に従ってＴａｑＤＮＡポリメラーゼを使用すると共に、ｓｓＳ標識ｄＡＴＰ及び７％ポリアクリルアミドシーケンシングゲルを使用するＳａｎｇｅｒのジデオキシ法によって反応混合物の配列を決定した。Ｓａｎｇｅｒ　Ｆ、ら。

ＰＮＡＳ、　７４　：　５４６３−５４６７（１９７７）　（Ｔａｑｕｅｎｃｅ　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ、ＵＳＢ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、０ｈｉｏ）。５ｅｑＥａｓｙ（登録商標）ディジタイザ− 及びＤＮＡ５ｔａｒ（登録商標）ソフトウェア（ＤＮＡＳｔａｒ、　Ｍａｄｉｓｏｎ、　ｆｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用してオートラジオダラムを分析した。

実施例１非特異的吸着法による血清ＨＢＶ　ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応検出本実施例は、まず生物試料を固体支持体上に吸着させ、結合しなかった試料を除去し、試料中の標的核酸を増幅及び検出する、生物試料中の標的核酸配列を検出する本発明方法を説明する。更に本実施例は、標的核酸、血清ＨＢＶＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅する方法であって、最初にウィルスを吸着させる固体支持体が後述するような微量遠心管（エッペンドルフ試験管）である本発明方法を説明する。

５０〜１００μｌの血清を０．５Ｉｌｌエツペンドルフ試験管内で２０℃で一晩インキユベートした。血清を捨て、試験管をＰＢＳで３回洗浄した。１６μｍの水と１００μｍの鉱油とを加え、試験管を１０分間で９５℃にまで加熱した。３ μｍの１０倍ＰＣＲ緩衝液（５００ａ＋Ｍ　ＫＣＩ、　１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８，３，１５ｍＭ　Ｍｇｃ１！、０．１％（ｖ／ｖ）ゼラチン）を加え、更に２５０μｇ／ｍｌのプロティナーゼＫ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含む溶液１０ｕ１を加えた。混合物を６０℃で６０分間インキュベートした。９μｌの水、２μｍの１０倍ＰＣＲ緩衝液、８μｍのｄＮＴＰミックス（終濃度が各々１．５ａ＋Ｍのｄａｔｐ、　ｄｃｔｐ、　ｄｇｔｐ、　Ｔ　Ｔ　Ｐ　。

ｐＨ７）、各々１μｍの時計回り方向及び反時計回り方向プライマー（各プライマーの終濃度は約１μＭ）からなる“マスターミックス″２１μｍを加えた。プロテイナーゼＫを変性すると共にプライマーを一本鎖ＤＮＡにアニーリングするために、反応物質を１０分間９５℃に加熱し、次いで５分間で５０℃にまで冷却した。５μｌ（０，５単位）のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ　ＥＩＩＩｌｅｒ−Ｃｅｔｕｓ、　Ｎｏｒｗａｌｋ、　ＣＮ）を加えた。７２℃で増幅中のＤＮＡの長さに応じて３０〜１８０秒間、９５℃で１分間、及び５０℃で２分間の反応サイクルを４０回繰り返した。４０サイクル後、７２℃の伸長ステップを更に１０分間行なった。

試料中に存在する標的核酸配列を以下のように検出した。

混合物を１分間で９５℃にまで加熱し、次いで４℃に冷却してから、ドツトプロット分析、０．５μｇ／ｍｌエチジウムプロミドを含む１倍Ｔ　Ａ　Ｂ　（４ｈＭ　Ｔｒｉｓ−酢酸、ｐＨ７，２＋＋Ｍ　ＥＤＴＡ）中の１．８％アガロースにおける電気泳動、サザンプロット分析または液体ハイブリダイゼーションによって分析した。ドツトプロットハイブリダイゼーションは以下に略述する５ｃｏｔｔｏら、　Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　３　：　２７９−２８４（１９８３）の方法に従って実施した。エツペンドルフ試験管に１００μｍの血清試料をピペットで入れた。２００μｌのｌＮＮａＯＨ及び１００μｍの２ＭＮａＣ１をエッペンドルフ試験管に加えた。このように形成された混合物を１０秒間撹拌し、室温で１０分間インキュベートした。次いで試験管を３０秒間遠心し、上清をバイオドツト装置のウェルに添加した。更に、０．５Ｍ　ＴｒｉｓｐＨ７，４及び３ＭＮａＣ１を含む中和溶液を同じウェルに添加した。フィルターをＷｈａｔ＋＋＋ａｎ　３ｍｍ濾紙上で空気乾燥し、８０℃で１２〜２時間ベーキングした。乾燥した濾紙を、６倍標準塩水クエン酸液（Ｓ　Ｓ　Ｃ）　、０．５％ＳＤＳ、５倍Ｄｅｎｈａｒｄｔ、　０．１．ｃｚｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ　（変性）からなる溶液と共に１〜２時間インキュベートした。この溶液を除去した。

ハイブリダイゼーションに使用するＤＮＡプローブを、ＲｉｇｂＹら、　Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、　１１３＋　２３７−２５１（１９７７）の方法を使用してニックトランスレーションによって標識した。得られた混合物を一晩ハイブリダイズした。次いで、混合物を室温の２倍ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳで１５分間ずつ２回洗浄し、更に６８℃の０．１倍ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳで１時間ずつ２回洗浄した。Ｋｏｄａｋ　ＸＡＲ−５フイルムを使用してオートラジオグラフィーを実施した。

実施例２抗体微粒子法による血清ＨＢＶ　ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応検出実施例２は、固体支持体が微粒子である、生物試料中の標的核酸を検出する本発明方法を示す。更に実施例２は、標的核酸血清ＨＢＶ　ＤＮＡをＰＣＲによって増幅する本発明方法を示す。

５ｅｒａｄｙｎｅ　Ｉｎｃ、　（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　ＩＮ）からカルボキシル化ラテックス微粒子（直径０．１〜０．３μＣＩ）を得た。１−エチル −３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）化学処理を使用し、モノクローナルＩｇＧまたはＩｇＭ分子をかかる微粒子に共有結合させた。Ｎａｔｈａｎ　Ｃ，Ｆ、ら、Ｊ。

微粒子（約３０％固形分）を３０ｇのＤｏｖｅｘ樹脂と混合し、揺動じながら室温で２時間インキュベートした。次いで混合物をガラスウールシリンジまたはこの等個物に通し、大きなりｏｖｅｘ粒子を微粒子から分離した。次いで微粒子を約２００１１１１に希釈した。次に、微粒子を１７．０ＯＯＸ　ｇで１５分間遠心し、洗浄した。この遠心及び洗浄ステップをさらに２回繰り返した。微粒子を１８０ｍ１即ち約２．５％固形分で再懸濁させ、２℃〜８℃で貯蔵した。１５ｍＭ　Ｍ　Ｅ　Ｓ中に０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（登録商標）を含む緩衝液Ａ　（ｐＨ４，７５，使用前に新たに調製したもの）１ｍｌを１ｍｌエッペンドルフ試験管に添加した。前述のように調製した１００ａ＋１の微粒子（２，５％固形分）を試験管に加え、混合物を形成した。次いで混合物を撹拌し、（使用前に新たに調製した）蒸留水中に０．４ｍｇ／ｍｌ　ＥＤＣ（１−メチル−３（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）を含む溶液１００μｍを混合物に加えた。モノクローナルＩｇＧまたはＩｇＭ抗体（ＮＨ２含有緩衝液を含まないＰＢＳ中２　ｍｇ／ｍｌ）を、反応混合物の終濃度が０．３〜０．２ｍｇ／ｍｌモツクローナル抗体となるように加えた。反応混合物を撹拌し、室温（約２０℃）で２〜４時間揺動した。インキュベージジン後、反応混合物を１０．０００ｒｐａ＋で５〜１０分間遠心し、ベレットを形成した。上清を除去し、ペレット化した微粒子を１ａＬＰＢＳ／２％Ｔｗｅｅｎ　２０　（登録商標）に再懸濁させた。

ベレットは撹拌すれば再懸濁し得ることもあるが、微粒子塊を崩壊するためには２３〜２５ゲージニードルを有するシリンジに通す必要があることが判明した。

この遠心及び洗浄作業をさらに２回繰り返した。最後の洗浄の後、微粒子の分散性を保証すべくベレットをシリンジに通し、ｌｌｌ１ｌの再懸濁緩衝液（１５０ａ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ、　１００ｗＭ　Ｎ　ａ　Ｃ１及び１．５％牛皮ゼラチンからなる）中に終固形分濃度２．５％で再懸濁させた。カップリング後、微粒子を１７．　ＯＯＯｒｐｍで１５分間遠心しくＪ＾１９０−ター）、上清をデカントし、微粒子を１５０＋ＩＩＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８，０，１００ｍＭ　ＮａＣ１，０，５％ゼラチン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）、９．５％スクロース及び０．０２％ＮａＮ、中に１．６％ｖ／ｖで再懸濁させた。

１００〜２００ｕｌの血清または血漿を、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｓＡｇのブレＳ１領域、ＨＢｓＡｇのプレＳ２領域、または＾ｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｏｒｔｈ　Ｃｈｉｃａｇｏ、ｌ１ｌｉｎｏｉｓから得られるビオチンに対するモノクローナル抗体で被覆した微粒子（全表面積２４〜１００ｃｍ”）の懸濁液２５μｍと一緒に室温で３０分間インキュベートした。微粒子を微量遠心機においてペレット化し、ＰＢＳで１回洗浄し、水に懸濁し、加熱し、プロテイナーゼにで消化し、セクションａに上述したように再び加熱した。反応混合物を遠心し、微粒子をペレット化した。上清を別の試験管に入れ、セクションａに上述したようにＰＣＲを実施した。場合によっては血清または血漿を５ｅｐｈａｃｒｙｌ　３００　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｖａｙ、ＮＪ）　０．９ｍｌスピンカラムによって遠心してから、抗体を被覆した微粒子を加えた。

試料中に存在する標的核酸配列は以下のように検出した。

オリゴヌクレオチドブライマーを、１５ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７，４゜１０ｍＭ　ＭｇＣＩｇ、０．１ａ＋Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ、０．１スペルミジン、５ｍＭ　ＤＴＴ及び７５μＭのγ標識３２Ｐ−ｄＡＴＰを含む合計容積１５μｌの溶液中の１４ポリヌクレオチドキナーゼによって３゜０００ａ＋Ｃｉ／ｍｍｏｌで末端標識した。混合物を１０分間で６５℃に加熱し、次いで水中に２分間室いた。１ μｌ（約５単位）のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを加え、３７℃で３０分間反応させ、１０分間６５℃に加熱し、ハイブリダイゼーションに直接使用した。Ｉ −ＩＢＶＤＮＡを前述のごと（ニックトランスレーションした。Ｚｅｌｄｉｓ　Ｊ、Ｂ、ら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　１４　：　１５２−１６６（１９８６）。

上述の方法は、実施例１及び２に示したように、生物試料を固体支持体上に吸着させ、結合しながった試料を除去し、標的核酸を増幅し、試料中に存在する増幅された標的核酸を検出することにより、生物試料中の標的核酸配列を検出する本発明方法を示している。

血清ＨＢＶＤＮＡ検出に必要なウィルスの最低濃度の滴定終点を基準にすると、ウィルスを吸着することにおいてシリコン処理エッペンドルフ試験管は未処理のポリプロピレンエッペンドルフ試験管と同様に有効である。ウィルス検体をＰＢＳで希釈したほうが、検体を血清で希釈するよりも高感度であった。

微粒子へのウィルス吸着は、表面積がより大きいが故に、エッペンドルフ試験管に勝ることが判った（２４〜１００ｃ＋１１”対１．４〜２．５ｃｍ２）。更に、微粒子に抗体を結合し得ることがら、ウィルスの微粒子への抗体特異的吸着が増加し得る。

図２は、モノクローナル抗ビオチン被覆微粒子は、２００μｌの血清中の僅かレベル３０程度のウィルスを検出し得、モノクローナル抗ＨＢｓ被覆微粒子は２００μｌの血清中の僅かレベル３程度のウィルスを検出し得たという実験結果を示している。図２は、抗ビオチン被覆微粒子の感度の比較を示しており、図２Ａは、抗ビオチン被覆微粒子の感度対抗ＨＢｓ被覆微粒子の感度の比較を示しており、図２Ｂは、血清ＨＢＶ　ＤＮＡを検出する上での抗ビオチン被覆微粒子の感度の比較を示している。対照血清で連続希釈したＨＢＶ　ＤＮＡ陽性血ｍ２００μ ｌのＨＢＶ　ＤＮＡを、６９ｏヌクレオチド離れたＳ遺伝子内の２つのプライマーを使用し、方法セクションに記載したように分析した。本発明方法を使用した結果、モノクローナル抗ＨＢｓ、抗ブレＳ１及び抗ブレＳ２を被覆した微粒子を使用した増幅ＤＮＡの収量は極めて高（、血清検体光たり１０未満のウィルスを検出することにおいて、アガロースゲルのエチジウムプロミド染色はサザンプロット分析と同様に高感度であった。はとんどの血清検体は、アッセイ感度を向上するためにＰＢＳで希釈する必要はなかったが、エチジウムプロミド増幅ＤＮＡフラグメントの強度（収ｊｌ）は、試料をＰＢＳで希釈すると場合によっては増加する。血清または血漿をまずＳｅｐｈａｃｒｙｌ　３００スピンカラムに通してから微粒子に吸着させると、増幅ＤＮＡの収量及びアッセイ感度は向上した。

更に、後述するＳａｎｇｅｒのジデオキシ法によって増幅ＤＮＡの配列を直接決定することができる。Ｓａｎｇｅｒ　Ｆ、ら、　ＰＮ＾シフ４　：　５４６３− ５４６７（１９８７）。本発明方法を使用し、２つのＨＢＶ　ＤＮＡ陽性血清（血清１及び血清２）からＰＣＲによって得られた増幅血清ＨＢＶ　ＤＮＡフラグメントの核酸及びアミノ酸配列を、公開されているＢ型肝炎つィルスサブタイプａｄｗ、　Ｏｎｏ　Ｙ、ら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１１　：１７４７−１７５７（１９８３）の配列と比較した。血清１、サブタイプａｄｗＨＢｓＡｇ陽性、ＨＢｅＡｇ陽性、抗ＨＢｃ陽性血清由来の１９１塩基配列のヌクレオチド配列はａｄｖのものと一致した。

血清２、サブタイプａｄｗ　ＨＢ　ｓＡ　ｇ＋、抗ＨＢｃ血清由来の１７２塩基配列のヌクレオチド配列はａｄｗのものと９８％以上一致した。血清２のＨＢＶ　ＤＮＡ濃度は、ドツトプロットアッセイの感度の下限の約２０．０００ウィルス／ｍｌであった。

血清２の核酸配列から翻訳された５７アミノ酸の配列は、フェニルアラニン（Ｆ）がチロシン（Ｙ）に置換されていた２１３位を除き、ａｄｖのものと一致し、これは、本発明の検出方法を使用すると、増幅ＤＮＡの配列を高精度で決定し得ることを示している。

本発明の検出方法を更に以下のように比較した。４０を超えるＨＢｓＡｇ陽性血清のＨＢＶ　ＤＮＡを、慣用ドツトプロットアッセイとＰＣＲ増幅使用の本発明方法との両方で分析した。ドツトプロットアッセイによると血清が陽性であった場合は、抗体被覆微粒子またはエツペンドルフ試験管のいずれかを使用するＰＣＲ法も陽性シグナルを生成した。逆に、ＨＢｓＡｇ陽性血清試料が、ＰＣＲ増幅を使用する本発明方法によってＨＢＶ　ＤＮＡ陽性であると同定されても、慣用ドツトプロットアッセイでは陰性となることがある。表１は、２４のＨＢｓＡｇ陽性血液ドナーのド・ノドプロット、液体ハイブリダイゼーション、及びＰＣＲ法によって実施したＨＢＶ　ＤＮＡのアッセイ結果をまとめて示すものである。

液体ハイブリダイゼーションまたはド・ソトブロットアッセイのいずれかによると７ドナーがＨＢＶ　ＤＮＡ陽性であった。２つのケース（＃８．　Ｂ２２）で、各ア・ソセイ結果が異なった。増幅にＰＣＲを使用するＨＢＶ　ＤＮＡを検出する本発明方法は、液体／％イブリダイゼーションまたはドツトプロットアッセイによって既に陽性であると同定された全てのＨＢＶ　ＤＮＡ試料と他のア・ソセイでは陰性と評価されたもの（＃　１６）とを同定した。

表２は、２人の急性自己限定性肝炎患者から得た２１の血漿試料のＨＢＶ　ＤＮＡを、ＰＣＲまたは感度がド・シトプロット法に近い液体ハイブリダイゼーションア・ソセイのいずれかによって分析した実験結果を示す。Ｋｕｈｎｓ　Ｍ、Ｃ，ら。

Ｖｉｒａｌ　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　ａｎｄ　Ｌｉｖｅｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ、Ａ、Ｊ、ＺｕｃｋｅｒｍａｎＡｉｉ。

＾１ａｎ　Ｌｉ５ｓ　Ｉｎｃ９．　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＮＹ、　ｐｐ、２５８ −２６２（１９８８）。液体ハイブリダイゼーションによって３つの試料が、またＰＣＲ分析によって６つの試料が陽性であった。いずれのア・ソセイによっても偏性陽性試料はなかった。各患者にお（１て、ＨＢｓＡｇ及びブレＳ２抗原血症が血清ＨＢＶ　ＤＮＡに先行した。１人においては、患者がもはや）（ＢｓＡｇ陽性で１まな（なったあと、ウィルス血症が認められた（　１／３１／８９゜患者Ｅ）。

実施例３抗体微粒子法によるＨＩＶ−１血漿ウィルス血症ＨＩＶ−１２つの血漿収集センターにおいて実施した推定血清変換調査の一環として、血清変換の前及び間の６個体力１ら全部で５１の血漿試料を得た。５個体においては、試料提供回数は２〜７／月であり、平均採取間隔は６日間であった。１ドナー（Ｅ）は、採取間隔がより長くて、平均４４日間であった。１８試料は、ＨＩＶ　ｐ２４抗原陰性及び抗ｐ２４抗体陽性であった血清反応陽性無症候個体から得た。１２試料は、０．５〜２年前にＡＩＤＳと診断されＡＺＴを服用したことのある血清反応陽性患者から採取した。これらの患者のうち３人は、試料採取までの半年間前後、治療を中断していた。

モノクローナル抗体ＨＩＶ−１ウイルスのエンベロープ領域に結合するＨＩＶ−１抗体を使用し得る。ＨＩＶ−１ｇｐ４１まタハＨＩＶ−１ｇｐ１２０に対するモノクローナル抗体を後述のごと（使用した。

使用したＨＩＶ−１ｇｐ４１モノクローナル抗体は以下の通りであった：　８３ −１３７１−２０８　（〕〕Ｘイブリドーマ細胞系８３−１３７１２０８、＾、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，受託番号１（Ｂ１０９５１によって分泌されるもの）：　５− １０−２　（ハイブリドーマ細胞系５−１０−２．　Ａ、Ｔ、Ｃ９Ｃ，受託番号ＨＢ１０９５３によって分泌されるもの）　；　１０−１５−６４　（）へイブリドーマ細胞系１０−１５−６４．＾、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，受託番号１］Ｂ１０９５２１こよって分泌されるもの）及び５６−１３３８−１９３　（／１イブリドーマ細胞系５６−１３３８−１９３．＾、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，受託番号ＨＢ１０９５５によつて分泌されるもの）。これらのハイブリドーマ細胞系は、ブダペスト条約の規定のもとに１９９１年１２月２０日付けでｔｈｅ　Ａｏ＋ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，）　、　１２３０１．　Ｐａｒｋｌａｖｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ　２０８５２に寄託されている。使用したＨ　ＩＶ−１ｇｐ１２０モノクローナル抗体は以下の通りであった：　５２−４４５−２２　（ブダペスト条約のちとに１９９１年１２月２０日付けで＾、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，に受託番号１０９５４で寄託されているハイブリドーマ細胞系５２−４５５−２２によって分泌されるもの）；５２−５８１−２９０　（ブダペスト条約のちとに１９９０年３月２８日付けでＡ。

Ｔ、　Ｃ，Ｃ，に受託番号１１Ｂ　１０３９９で寄託されているハイブリドーマ細胞系５２−５８１−２９０によって分泌されるもの）；及び５２−６８４−２９０　（ブダペスト条約のちとに１９９０年３月２９日付けでＡ、　Ｔ。

Ｃ，Ｃ，に受託番号１１８１０４００で寄託されているハイブリドーマ細胞系５２−６８４−２９０によって分泌されるもの）。モノクローナル抗体を使用したが、ＨＩＶ−１抗原決定基に特異的なポリクローナル抗体を使用し得ることも理解される。また、本発明方法を使用すると共に、ＨＩＶ−１の２つ以上の抗原決定基に対する２種以上の抗体の混合物を使用するか、または、以下に記載のごとき調製した固相を合わせて混合し、各々がＨＩＶ−１ウイルスを捕獲し得る固相の混合物を形成することにより、複数種の標的核酸配列を検出し得ることも理解される。本明細書に記載したＨＩＶエンベロープ領域に対するもの以外の他のタイプの）！ＩＶ−１モノクローナル抗体を使用して、検出対象のＨＩＶ−１標的核酸間列を捕獲することもできる。

アッセイ方法カルボキシル化ラテックス微粒子（直径０．１〜０．３μｍ）を５ｅｒａｄｙｎ、　Ｉｎｃ、　（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｊｓ、　ＩＮ）から入手した。上述したモノクローナル抗ｇｐ１２０または抗ｇｐ４１を、Ｑｕａｓｈら。

Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　２２：　１６５−１７４（１９７８）の方法に従って１−メチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド化学処理を使用して微粒子に共有結合した。結合後、微粒子を微量遠心機において１３．　ＯＯＯｒｐｍで１５分間遠心し、上清をデカントし、微粒子を１倍ＰＢＳで洗浄し、１５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８，０，１０ｈ＋Ｍ　ＮａＣ１，０，５％豚皮ゼラチン、０．１％Ｔｖｅｅｎ−２０（登録商標）、９．５％スクロース及び０．０２％ＮａＮ３中に８〜１０％ｖ／ｖで再懸濁させた。

５０μｍの血清／血漿を１５０μｍの１倍ＰＢＳで希釈し、上述のごと（調製した微粒子懸濁液５０μｍと一緒に室温で３時間インキュベートした。微粒子を微量遠心機においてペレット化し、ＰＢＳで１回洗浄し、２ｏｏμｌの２ＱｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８，３，０，５ｍｇ／＋ｌプｏティｆ−セに、　０．２５％Ｓ　Ｄ　Ｓ、２０μｇ酵母ｔＲＮＡ中に再懸濁させた。５５℃で１時間インキュベートした後、混合物をフェノール／クロロホルム抽出し、エタノールを用いてＲＮＡを沈殿させた。遠心後、ＲＮＡペレットを１５μｍの殺菌水中に再懸濁させた。

ｃＤＮＡ及び増幅５０ｍＭＫＣｌ、２０ｍＭ　ＤＴＴ、各々２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ、並びに各々２５ｎｇのＰＣＲＣラブ７　（Ｓ　Ｋ　３８／３９）　（Ｓ、　Ｋｗｏｋら、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　６１：　１６９０−１６９６［１９８７コ）を含むＣｅｔｕｓ　Ｔ　ａｑ緩衝液中に２．５単位のＡＭＶ逆転写酵素を含む溶液５μｍを試料１５μｌに加え、３７℃で３０分間インキュベートすることにより、第１鎖ｃＤＮＡを合成した。次いで混合物を３０μｍの水で希釈し、９５℃で１０分間加熱した。１倍Ｔａｑ緩衝液中の各々５０ｎＨの各プライマー、各々５０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＸＴＰ及びｄＧＰＴ、並びにｉ、ｏ単位のＴａｑ酵素（Ｃｅｔｕｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ。

ＣＡから入手可能）の存在下に、終容積１００μｍで増幅を実施した。反応は、９４℃で９０秒間及び６０℃で３分間のサイクルを３５回繰り返した。検出のために、前述のごとき、またＳ。

Ｋｖｏｋら、駐且聾に検討されているごとき液相ハイブリダイゼーションを使用し、次いでポリアクリルアミドゲル電気泳動し、強化スクリーンを用いて一７０ ℃で１〜５時間オートラジオグラフィー暴露した。オートラジオグラム上で検出された増幅フラグメントの相対密度を、肉眼判定または走査濃度測定により決定した適当な単位で表わした。

ｐ２４抗原及び血清学的測定ＨＩＶ　ｐ２４抗原を固相サンドイッチ式酵素結合免疫測定装置（ＥＩＡ）（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ａｂｂｏｔｔ　Ｐａｒｋ、　ＩＬから“ＨＩＶ−１ｐ２４抗原アッセイ”として入手可能）において測定した。この市販アッセイはウィルス溶解物及びポリクローナル捕獲抗体を使用し、８〜１０ｐｇ／ｍｌのり２４抗原感度を有する。ｐ２４の存在は、３〜５ｐｇ／ｍｌの感度を有する捕獲モノクローナルｐ２４抗体を使用するアッセイによっても試験した。

抗ＨＩＶ　ＩｇＧ抗体は、ＨＩＶ−１溶解物を使用する市販のＦＤＡ認可ＨＩＶＡＢ　（登録商標）　−１ＥＩＡ　（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ａｂｂｏｔｔ　Ｐａｒｋ、　ＩＬから入手可能）を用いて検出した。製造業者指示（ＤｕＰｏｎｔ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、　ＤＥ）に従ってウェスターンプロットを実施した。

ｐ２４に対する抗体は、組換えｐ２４抗原を捕獲抗原として使用する間接酵素免疫測定装置（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ　Ｐａｒｋ、　ＩＬから入手可能）において、Ｈ，１，５ｈｅｐｐａｒｄら。

Ｊ、＾ｃｑ、　Ｉｍｍｕｎ、　Ｄｅｆｉｃ、　５ｙｎｄｒ、　４：　７０４−７１２（１９９１）に記載のごとく測定した。

逆転写酵素（ＲＴ）アッセイ１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８，２，０，３Ｍ　Ｋ　Ｃ１，０，１５Ｍ　ＭｇＣｌｘ、　０゜０１Ｍ鋳型ＲＮＡに対するＤＴＴ及び３Ｈ−ＴＴＰを含むＲＴ反応ミックス１００μｍを組織培養上清２５μｍに加えることにより、逆転写酵素アッセイを実施した。各試料は２回ずつ分析した。２回の試験において、培養上清から得た破壊ウィルスを陽性対照として使用し、緩衝液単独を陰性対照として使用した。試料を３４℃で１時間インキュベートし、次いでｆｈａｔｍａｎ　ＤＥ８１フィルター上に滴下し、１〜１０分間放置した。フィルターを洗浄及び乾燥した後、シンチレーション液の存在下に放射能を１分間測定した。

Ｈ９ＩＩＩＢ感染細胞由来の組織培養上清を段階希釈し、逆転写酵素活性、ｐ２４抗原及び本発明のウィルス捕獲アッセイによって評価した。簡単に述べると、１〜１０−６組織培養感染用量（ＴＣＩＤ）に相当する組織培養上清の１０倍希釈液を各アッセイによって試験した。かかる結果を図３にまとめて示す。黒い四角を結んだグラフから判るように、いずれの試料中にも逆転写酵素（ＲＴ）活性は検出されなかった。５μｌの試料をＰＢＳで２００μｍに希釈してから、ポリクローナルＨＩＶＡＧ（登録商標）−１試験によってｐ２４抗原を試験した。Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（登録商標）を添加した場合（黒い三角形を結ぶグラフ）及び添加しない場合（白い三角形を結ぶグラフ）でＨＩＶ抗原を測定した。このアッセイにおいて、１０ｐｇ／ｍ１以上のｐ２４抗原を含む場合に試料を陽性と見なした。Ｔｒｉｔｏｎの存在下では、遊離ｐ２４及び破壊されたピリオンから放出された抗原を測定した（即ち全抗原）。Ｔｒｉｔｏｎの不在下では遊離ｐ２４のみを検出した。従って、Ｔｒｉｔｏｎの存在下及び不在下で得られる結果の差は、無傷のピリオンに関連するｐ２４の割合を反映している。Ｔｒｉｔ。

ｎの不在下ではｐ２４抗原は１　（＞２００ｐｇ／ｍｌ）　、１０−’　（＞２００ｐｇ／ｍｌ）及び１０−”　（８０ｐｇ／ｍｌ）　Ｔ　ＣｒＤ　ｓｏで検出された。Ｔｒｉｔｏｎ存在下では、アッセイのカットオフと等価のシグナルが１Ｏ−３ＴＣより、。でなおも検出された。ＨＩｖ−Ｉ　ＲＮＡ検出においては、図３に黒い円を結ぶグラフで示したように、オートラジオグラムにおいて検出された増幅フラグメントの相対密度を、肉眼判定または走査濃度測定によって決定される適当な単位で表わした。比べて見ると、ＨＩＶ−ＩＲＮＡから得られたシグナルは１Ｏ−２Ｔ　ＣＩＤ　ｓｏ以上で最大であり、１０−２から１０”Ｔ　ＣＩＤ　、。まで直線的に減少した。

即ち、本発明のウィルス捕獲アッセイはｐ２４抗原アッセイよりも約１００倍高感度であった。

２、血清変換の間のＨＩＶ−Ｉ　ＲＮＡ検出上述のごと〈実施されるＨＩＶ−１ウイルス捕獲を使用し、感染初期の６個体（Ａ−Ｆ）から収集した５１の一連の血清試料中のＨＩＶ−１ウイルス血症のレベルを判定した。かかる結果は図４に示す。上述の手順に従う本発明アッセイ（ウィルス捕獲アッセイ）及びＨＩＶ抗体の存在についての市販ＥＩＡ試験装置（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ　Ｐａｒｋ、　ＩＬ）によって上記試料を試験した。２００ μｌの試料においてモノクローナルｐ２４抗原試験を実施した。このアッセイにおいては、３〜５　ｐｇ／＋１以上のｐ２４抗原を含む場合に試料を陽性と見なした。ＨＩＶ　ＲＮＡアッセイにおいては、５０μｍの試料を試験した。図４の矢印は、Ｓ　Ｋ　３８／３９プライマーを使用することにより増幅したｔ１ｏｂｐフラグメントを示す。６〜１２時間暴露した後にオートラジオグラムを現像した。幾つかの実験では、より高分子量の非特異的バンドが認められた。図４において、”ＨＣＶ”はＨＣＶ　ＰＣＲ陽性ＨＣＶ試料を表わす。ＨＩＶ抗原においては１３／　２９（４５％）であったのに比べ、ＨＩＶ−Ｉ　ＲＮＡにおいては２９／２９　（１００％）の血清反応陽性試料が陽性であることが判明した。血清変換直前の６つの試料（ドナーＡ、３１及び４３日目；ドナーＤ、１及び５日目；ドナーＦ、８及び１１日目）はＨＩＶ−Ｉ　ＲＮＡ及び抗原の両方に対して陽性であった。

ＨＩＶ抗原に対して陰性の１５の血清変換前試料のうち、１個体由来の血清変換の８〜５力月前の３つの試料（ドナーＢ、　１．２９及び７８日目）と、別の個体由来の抗原陽性の２日前の１つの試料（ドナーＡ、２９日目）において、ＨＩＶ−Ｉ　ＲＮＡが認められた。後者の個体に由来する１つの試料（ドナーＡ、１日目）は、抗原陽性の３０日前及び血清変換の４５日前にｐ２４抗原シグナルを発したが、ＨＩＶ−Ｉ　ＲＮＡについては陰性であった。

検出されたシグナルがＨＩＶ−Ｉ　ＲＮＡに特異的に起因するものであることを確認するため、逆転写ステップの存在下または不在下で幾つかの一連の血清変換試料において分析を実施した。ドナーＦ由来の一連の試料に、上述の本発明方法に従うウィルス捕獲を実施した。抽出した核酸を２つのアリコートに分割し、一方は２．５単位の逆転写酵素（ＲＴ）で処理してから（十）、他方は未処理のままで（−）、Ｔａｑを用いて増幅した。オートラジオグラフ暴露時間は１．５時間とした。図５に示したように、逆転写酵素の不在下では増幅シグナルは検出されず、これは、ウィルス捕獲法のみがウィルスＲＮＡを検出したことを示している。特異性に対する別の対照として、慢性Ｃ型肝炎（ＨＣ■）感染患者由来のパネルＢに試料を添加したところ、これはＲＮＡ　Ｐ　ＣＲ（Ｄｒ、Ｍ、Ｋｕｈｎｓ、　ｐｅｒｓｏｎａｌ　ｃｏａ＋ｍｕｎｉｃａｔｉ。

ｎ）によると陽性であったが、ＨＩＶ−１ウイルス捕獲によると陰性であることが判明した。最後に、ドナーＦ由来の一連の血清変換試料は、慢性Ｂ型肝炎感染個体から得た。

かかる試料を用いて得られた結果は他のパネルと類似であり、これは、他のウィルスがＨＩＶ−１捕獲アツセイを検出可能に妨害することはないことを示している。

３、無症候及びＡＩＤＳ患者におけるＨＩＶ−Ｉ　ＲＮＡ検也血清変換調査の結果から、ｐ２４抗原については陰性であった血清反応陽性試料の１６／２９　（５５％）が、本発明のウィルス捕獲アッセイによって検出可能なＨＩＶ−Ｉ　ＲＮＡを有したことが判った。検出可能なＨＩＶ−１ｐ２４抗原を持たない無症候ＨＩＶ感染個体が測定可能レベルの循環Ｈｒｖ−ｉ粒子を有するか判定するため、１８被験者からなる小集団を評価した。全ての試料はＨＩＶ　ｐ２４抗原について陰性であると予備選択された。検体は、検出可能レベルのＨＩＶ−１ｐ２４に対する抗体をも有した。本実施例に記載のごとき本発明方法を使用し、かかる試料中のＨＩＶ−Ｉ　ＲＮＡの存在を判定した。本実施例に上述したようにアッセイを実施した後、１０／１ｇ　（６０％）の試料がＨＩＶ− Ｉ　ＲＮＡ１：つぃて陽性であることが判明した。ＨＩＶ　ＲＮＡ検出とＨＩＶ −１ｐ２４に対する抗体の力価との間に相関は認められなかった。

大部分（８５％）の患者が血漿培養によって検出可能なウィルス血症を有すると報告されている。Ｒ，ｆ、　Ｃｏｏｍｂｓら。

Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３２１：　１６２６−１６３１（１９８９）。ウィルス捕獲アッセイによって陽性のＡＩＤＳ患者の割合を決定するため、本発明者らは、ＡＩＤＳ　（ＣＤＣクラスＩＶ−ｃ）と診断された１２被験者から採取した試料を分析した。本実施例に上述した本発明方法に従ったところ、１１／１２　（９２％）の試料がＨＩＶ−Ｉ　ＲＮＡについて陽性であった。

片蕩上記実験結果から、ウィルスを固体支持体に吸着させ、支持体を洗浄し、次いでプロティナーゼＫ及び本明細書に記載の他の成分を用いて標的核酸配列を分離及び精製することにより、ＰＣＲは、慣用のドツトプロット及び液体ハイブリダイゼーションアッセイの感度未満の濃度の血清ＨＢＶ　ＤＮＡ及びＨＩＶ　ＲＮＡをも検出し得ることが示された。

ＨＢＶ検出のためには、血清または血漿を吸着させる前に５ｅｐｈａｃｒｙｌ　３００スピンカラムに通して脱塩すると、アッセイ感度が上昇した。ウィルスＤＮＡのおおよその量は、試料をＨＢＶ　ＤＮＡ陰性血清またはＰＢＳで連続希釈することにより推定し得る。２００μｍ当たり３はどの少数のウィルスを、抗ＨＢｓ、抗プレＳ１または抗ブレｓ２被覆微粒子を使用して検出し得る。

ＨＩＶ検出のためには、抗原、抗体及び核酸の種々の高感度血清学的アッセイが臨床及び研究の両方に使用可能である。慢性ＨＢｓＡｇキャリヤにおいてＨＢｅＡｇ陽性は高力価の血清ＨＢＶ　ＤＮＡと相関するが、ＨＢｅＡｇまたはＨＢｅＡｇに対する抗体が不在だからといって血清Ｂ型肝炎ウィルスＤＮＡが存在し得ないことはない。Ｚｅｌｄｉｓ　Ｊ、Ｂ、ら。

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　１４　：　１５２−１６６（１９８６）。

慣用のスポットハイブリダイゼーションアッセイによって評価したところ、慢性ＨＢｓＡｇ、抗ＨＢｅ陽性肝硬変の約２０％が血清ＨＢＶ　ＤＮＡ陽性であることが判った。より感度の高いポリメラーゼ連鎖反応アッセイの開発によって、より高い割合の患者が循環ウィルスＤＮＡを含み、従って潜在的に感染性であることが判明し得る。

ＰＣＲアッセイの感度が向上されていることを表１及び２に示すが、ここでは、本発明方法は、液相ハイブリダイゼーション及びドツトプロット分析によってＨＢＶ　ＤＮＡ陽性と同定された全ての血清及び血漿を同定した上に、いずれのアッセイによっても陽性と評価されなかった幾つかの試料を同定した。２４のＨＢｓＡｇ陽性血液ドナー（表１）の調査では、ＨＢｅＡｇ陽性試料のみがＨＢＶ　ＤＮＡ陽性であった。２人の急性感染症例（表２）では、Ｂ型肝炎表面及びブレＳ２抗原血症は血清ＨＢＶ　ＤＮＡに先立って見られた。これは、感染するまでの２力月間に得られた血漿試料（１／３１／８９．患者Ｅ）は抗原血症ではなくてウィルス血症であるが故に、イムノアッセイがＨＢｓＡｇ及びブレＳ２抗原に対してより高感度であることを必ずしも反映するものではない。

ＨＩＶに関するＰＣＲ研究の大部分は、凝集プロウィルスの検出及び場合によっては半定量化に集中している。プロウィルスＤＮＡのレベルは、ＡＴＺ治療を受けている患者において経時的に減少し得ることも報告されている。Ｄ。

■０　ら、Ｎ、Ｅｎｇ、ＪｌＭｅｄ、３２１：　１６２１−１６２５（１９８９）；Ｎ、Ｖ、　Ｃｈｅｌｙａｐｏｖ　ら、Ｊ、＾ｃｑｕｉｒ、Ｉｍｍｕｎｅ　Ｄｅｆｉｃ、　５ｙｎｄｒ、４　：　３１４（１９９０）。最近のデータでは、プロウィルス（ＤＮＡ）負荷の低い血清反応陽性個体の予後は、プロウィルス負荷の高いものよりもよいことが示されている。Ｓ、　Ｍ、　Ｓｃｈｎｉｔｔｍａｎら。

のプロウィルス形態を測定してもその複製状態についての情報は得られず、それは、感染細胞によって放出される成熟ピリオンの量によって決定される。従って、感染性（血漿培養）またはウィルス成分（ｐ２４抗原、ＨＩｖ−Ｉ　ＲＮＡ）を測定する方法しかウィルス負荷の正確な評価を与えない。

ＨＩＶ−１血清反応陽性血漿の単離及びそのあとのｃＤＮ八合へ及び増幅は以前にも記載されている。１．に、　Ｈｅｗｌｅｔｔがら、これまでに記載されている方法は、比較的大量の血漿から全ＲＮＡを抽出することを含む。本発明のアッセイは、固体支持体に共有結合したモノクローナル抗体によってウィルス粒子を捕獲することによって、より少量の試料中のＨＩＶ−Ｉ　ＲＮＡを検出する、より特異的で且つ感度の高い方法を提供する。

これまでに記載されているものと比較し、本発明の方法を使用することには幾つかの利点がある。第１に、試料を破壊することな（処理し、固相と反応させた後に他の方法によって分析し得る。第２に、微粒子を遠心しＨＩＶ−ＩＲＮＡを抽出するまでの試料少量に制限がなく、それによってアッセイ感度をより向上し得る。第３に、試料の除去及び固相の洗浄によって、プロテイナーゼに消化の間の血漿ＲＮ　Ａ　ａｓｅによるＲＮＡ分解の危険性が実質的に排除され既知のＲＮＡコピー数の標準と直接比較せずにウィルス捕獲ｃＤＮＡ／ＰＣＲアッセイの感度を推定することは困難であるが、ＲＮＡ　ＰＣＲ結果をｐ２４抗原及びＤＮＡ　ＰＣＲを用いて得られたものと比較することにより、近似し得る。培養物ｌｌ１ｌｌ当たり約１０８のウィルス粒子が生成されると、これは、約１０ｎｇまたは２．５Ｘ１０”分子のＨＩＶ−１ｐンパク質が各ウィルス粒子中に存在すると推定し得る。Ａ。

Ｓ、Ｂｏｕｒｉｎｂａｉａｒ、　Ｎａｔｕｒｅ　３４９：　１１１（１９９１）。２００μｍの検体を使用すると、ｐ２４抗原モノクローナルアッセイの感度は約１゜０ｐｇ／２００μｍまたは２．５Ｘ１０−分子のｐ２４抗原であり、これは約１０４ピリオンを表わす。即ち、本発明のウィルス捕獲アッセイは、ＨＩＶ −１ｐ２４抗原アッセイの少な（とも１００倍高感度であり、５０μｍ試料中で１００以下のピリオンを検出し得る。本発明者らは、１０分子の標的ＨＩＶ−Ｉ　ＤＮＡを用いて一貫して信頼性のあるデータを検出し得た。逆転写酵素は比較的非効率的であってＲＮＡの１０〜５０％しかｃＤ　Ｎ　Ａに変換しないので、ウィルス捕獲感度の近似値は適当であると見られる。血清変換後、本発明方法によると全ての血清反応陽性試料はＨＩＶ−１ＲＮＡについて陽性であったが、記載されている工業使用可能なｐ２４抗原アッセイ方法によると１３／２９　（４５％）が検出可能なｐ２４抗原を有した。これは、血清変換後４人のうち３人の患者が、検出可能なｐ２４抗原を保有することな（少なくとも２週間、陽性血漿培養を保持したことを示したＤａａｒらの知見と類似である。血清変換前、ＨＩＶ−Ｉ　ＲＮＡはＨＩＶ抗原と共在してまたは直前に検出された。１症例（ドナーＢ）においては３つの試料が、血清変換の８〜５力月前、若干ではあるがＨＩＶ−Ｉ　ＲＮＡについて陽性であった。この時点の陽性は、感染と同時に起こるウィルスの受動伝播を反映しており、ウィルス複製は数カ月後に開始した可能性がある。或いは、これらの試料は欠陥非感染性粒子を含み得る。その場合、実際の感染誘導血清変換は幾分遅れて発生するであろう。

ウィルス捕獲から得られるＰＣＲシグナルの濃度を実際に定量しようとは考えなかったが、増幅物質の量はｐ２４抗原のレベルに幾分対応することが認められた。２００１）ｇ／ｍ１以上のｐ２４抗原を有する試料は飽和ＰＣＲシグナルを与え、一般に、ＨＩＶ抗原陽性試料は、ＨＩＶ抗原陰性のものよりも強力なＰＣＲシグナルを与えた。増幅物質の量の増減はｐ２４抗原に認められるものに対応した。かがる結果は、半定量的血漿培養物を使用してＨＩＶに対して血清変換する個体における血漿ウィルス血症のレベルを決定することにより得られた先の知見を裏付けるものである。Ｅ、　Ｓ、　Ｄａａｒら、Ｎ、Ｅｎｇ、Ｊ、Ｍｅｄ、３２４　：　９６１−９６４（１９９１）　；　ＳＪ、Ｃ１ａｒｋ　伝Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３２４：　９５４−９６０（１９９１）。興味深いことに、一連試料の１つ（ドナーＣ）において、ＰＣＲシグナルは抗ｇｐ１２０／抗ｐｐ１６０抗体の出現（１０日目）と共に急激に減少した。ドナーＣの１０日目以前の２つの試料は、ウェスターンプロット分析によってのみ抗ｐ２４について陽性であった。

Ｃ１ａｒｋら、靭且凹及びＤａａｒら７鼎且堕のごと（、本発明者らは、何人かの血清変換者はウィルス複製を迅速に且つ効果的に制御するようであるが、他は、高レベルの循環ピリオンをはるかに長期間維持することを見いだした。例えばドナーＡ及びＣはそれぞれ血清変換の１２及び１ｏ日後にわずかに検出可能なウィルス血症を有した。これに反して、ドナーＢ及びＦはそれぞれ血清変換の１８９及び２７日後にはるかに多くの循環ウィルスを有すると見られた。本発明者らはこれらの個体、即ち無症候患者から追跡データを得ることはできなかったが、ウィルス負荷がより低い患者の予後は、循環ＨＩＶ　ＲＮＡのレベルが高い患者よりもよいと推定し得る。

本発明の方法は、ＨＩＶ感染の診断及び監視に幾つかの重要な用途を有する。本発明は、新生児における感染を評価する迅速な手段を与え得る。また、優れた半定量化を行なうことで、ウィルス負荷のレベルに基づいてＡＩＤＳ発症の垂直伝播及び予後を推定し得る。最後に、ウィルス粒子を捕獲することで、感染及び予後に最も関連すると推定される配列が与えられ得る。即ち、ウィルス自体の配列分析によってＨＩＶの病原性への新たな知識がもたらされ得る。

本発明は、生物試料を固体支持体上に吸着させ、次いで標的核酸配列を増幅し、得られた増幅産物を検出することにより、生物試料中のウィルス核酸を検出する直接的方法を記載する。本発明方法によって検出し得る標的核酸は、ウィルスのみならず、原核性または真核性の微生物、疾患または生理学的状態に関連し得る任意の正常、異常または変異細胞も含む。ＰＣＲのほかに、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）のごとき標的ポリヌクレオチド配列のコピー数を増加し得る任意の方法を、標的核酸の増幅に使用し得る。この方法は、血清中のＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）ＤＮＡ及びＨＩＶ−Ｉ　ＲＮＡの検出のための極めて高感度のイムノアッセイを与えるのに特に有効である。

本明細書に記載の全ての文献及び特許出願は、本発明分野の当業者の技術レベルを示すものである。これら全ての文献及び特許明細書は、文献または特許明細書が参照により本明細書の一部を構成すると個別にそれぞれ示された場合と同程度に、参照により本明細書の一部を構成するものとする。

以上、本発明を十分に記述したが、請求の範囲から離れずとも多数の変更及び変形が行ない得ることは当業者には明らかであろう。

表１．　ＨＢｓＡｇ＋血液Ａｇ−の分析表Ｉ１．２人の急性ＨＢＶ患者由来の血漿のブラインドテスト抗ＨＢｅ　ＨＢＶ　ＤＮＡ患者Ｅ１／１０／８９　＋　２２７０　−　十　＋陰性対照　−一一一一陰性対照　−−一一一表Ｉ１．２人の急性１１ＢＶ患者由来の血漿のブラインドテスト（続き）抗ＨＢｅ　ＨＢＶ　ＤＮＡ日付け　ＨＢｓＡｇ　ブレＳ２’　ＩｇＭ　Ｌ、Ｈ，”　ＰＣＲ”患者■ １／２６／８ｇ　−−ＮＤ　−− １／３１　＋　１８　ＮＤ　−− ２／２　＋　３２　ＮＤ　−− ３／２７　＋　６６０　ＮＤ　十　十４１５　＋　６８５　ＮＤ　＋　＋陰性対照　−ＮＤ　−− 陰性対照　−ＮＤ　−− １プレＳ２アツセイを方法セクションに記載のごと〈実施した。

列記したのはＳ／Ｎ比である。

２Ａｂｂｏｔｔ　Ｇｅｎｏｓｔｉｃｓ　ＨＢＶ　ＤＮＡアッセイの結果。

３ｓ遺伝子プライマーは長さ６９０ｂｐのＤＮＡフラグメントを生成した。

抗ＨＢｓ被覆微粒子は、１００μｍの試料を方法セクションに記載のごと＜　０．９ｍ１Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　３００スピンカラムに通してから使用した。

ＮＤアッセイを実施せず。

３　ｘ　１０”ウィルス−１０１２４ＦＪＧ、２Ａウィルス　陰性−３−２−１ＣＭ　２３４　５６８＋ＦＩＧ、２Ｂ日　−（’Ｊ　？　■　−ｒっ　ｔｎｏ　〜　トＣＸＪ　〜　〜　ｎ　寸　マ　い　［Ｆ］　０ＦｆＧ、４ＡＦＩＧ、４Ｂフロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号ＧＯＩＮ　３３１５６９　Ｈ９０１５−２Ｊ３３１５７７　Ｂ　９０１５−２Ｊ／／Ｃ０７Ｈ２１１０４Ｚ　８６１５−４ＣＣ１２Ｐ　２ＶＯ８９１６１−４ＢＣ１２Ｑ　Ｖ３７　６８０７−４Ｂ（７２）発明者　ヘンラード、デニス・アールアメリカ合衆国、イリノイ・６００４５、レイク・フォーレスト、イースト・チェリー・アベニュー・７００Ｉ（７２）発明者　ミムス、ラリ−・ティーアメリカ合衆国、イリノイ・６００４６、レイク・ビラ、ショショーニ・トレイル・８（７２）発明者　ゼルデイス、ジエローム・ビーアメリカ合衆国、カリフォルニア・９５６０８、カーマイケル、キックスフオード・ドライブ・１５０１

Claims

【特許請求の範囲】

１．生物試料中に存在し得るＨＩＶ−１の標的核酸配列を検出する方法であって、ａ）前記生物試料を、ＨＩＶ−１に特異的な抗ＨＩＶ−１エンベロープ抗体を結合させた固体支持体上に吸着させるステップ；ｂ）結合しなかった生物試料を前記固体支持体から除去するステップ；ｃ）標的核酸配列を増幅するステップ；及びｄ）前記生物試料中に存在する増幅産物を検出するステップとからなる方法。
２．前記ステップａの前に、前記試料中に存在し得る妨害性物質に脱塩処理を実施する請求項１に記載の方法。
３．前記試料の脱塩処理を、クロマトグラフィー材料を含むカラムに該試料を通し、試料中に存在し得る妨害性物質を除去することにより行なう請求項２に記載の方法。
４．前記固体支持体が徴粒子である請求項１に記載の方法。
５．前記抗体がモノクローナル抗体である請求項１に記載の方法。
６．前記モノクローナル抗体が、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＨＢ１０９５１、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＨＢ１０９５２、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＨＢ１０９５３、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＨＢ１０９５４、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＨＢ１０９５５、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＨＢ１０３９９及びＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＨＢ１０４００からなる群から選択されるハイブリドーマ細胞系によって分泌される請求項５に記載の方法。
７．前記ステップｄの前に、前記試料を加熱する請求項１に記載の方法。
８．前記ステップｄの前に、前記試料を９５℃に加熱する請求項７に記載の方法。
９．前記ステップｄの前に、前記試料をプロテイナーゼで処理する請求項１に記載の方法。
１０．前記プロテイナーゼがプロテイナーゼＫである請求項９に記載の方法。
１１．前記ステップｄの前に、前記試料を変性剤によって変性する請求項１に記載の方法。
１２．前記ステップｄの前に、前記試料を熱変性によって変性する請求項１に記載の方法。
１３．前記標的核酸をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する請求項１に記載の方法。
１４．前記標的核酸をリガーゼ連鎖反応によって増幅する請求項１に記載の方法。
１５．前記ステップｅの検出を、ドットプロット分析、サザンプロット分析、または液相ハイブリダイゼーションによって実施する請求項１に記載の方法。
１６．前記標的核酸配列がデオキシリボ核酸である請求項１に記載の方法。
１７．前記標的核酸配列がリボ核酸である請求項１に記載の方法。
１８．生物試料中に存在し得るＨＩＶ−１の標的核酸配列を検出するのに適したキットであって、ａ）抗ＨＩＶ−１エンベロープ抗体を結合させた固体支持体；ｂ）結合しなかった生物試料を前記固体支持体から除去する手段；Ｃ）標的核酸配列を増幅する手段；及びｄ）前記生物試料中に存在する増幅産物を検出する手段を含むキット。
１９．前記固体支持体が微粒子である請求項１８に記載のキット。
２０．前記抗体が、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＨＢ１０９５１、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＨＢ１０９５２、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＨＢ１０９５３、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＨＢ１０９５４、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＨＢ１０９５５、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＨＢ１０３９９及びＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＨＢ１０４００からなる群から選択されるハイブリドーマ細胞系によって分泌されるモノクローナル抗体である請求項１８に記載のキット。