JPH0333656A - 核酸測定法 - Google Patents

核酸測定法

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JPH0333656A
JPH0333656A JP2154973A JP15497390A JPH0333656A JP H0333656 A JPH0333656 A JP H0333656A JP 2154973 A JP2154973 A JP 2154973A JP 15497390 A JP15497390 A JP 15497390A JP H0333656 A JPH0333656 A JP H0333656A
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biological
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virus
biological particles
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JP2154973A
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Petrus Johannes Maria Rijntjes
ペトルス・ヨハンネス・マリア・レインテス
Leonardus Paulus Clem Kuijpers
レオナルドウス・パウルス・クレメンス・クーエペルス
Rudolf Arnold Heijtink
ルドルフ・アルノルド・ヘインタンク
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Akzo NV
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Akzo NV
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、検査液（１０３１ｆｌｕｉｄ）中の核酸の定
性及び／または定量法、並びに測定を実施するための検
査キットに関する。
食品中のサルモネラ菌の存在を検出する方法は米国特許
第４．６８９，２９５号明細書に記載されている。
この目的のために食品から検査用サンプルをとり、この
サンプル中でサルモネラ菌を溶菌することにより、細菌
ＤＮＡを遊離させる。次に、この細菌ＤＮＡを変性した
後、特異的なりＮＡプローブを使用して好適な条件下で
ノ＼イブリッド形威させる。
この方法によりサルモネラＤＮＡを検出することができ
る。この目的に使用する方法はかなり労力棟 を要する。例えば単離Ｘ作の間に種々の遠心分離段階や
種々の洗浄段階を実施しなければならない。
さらに、検出可能な量の細菌ＤＮＡを単離しうるために
は、大量の出発材料から始める必要がある。
そのうえ、大きな欠点としては、細菌ＤＮＡの他に細胞
性ＤＮＡが検査サンプルから単離される結果、大過剰の
細胞性ＤＮＡ中で細菌性ＤＮＡを検出可能にするために
、極めて特異的なプローブを入手し得る必要があること
である。
本発明の特徴は、免疫化学的成分を担持した固体担体と
一緒に検査液をインキュベートし、このとき、該担体は
免疫化学反応またはレセプタリガンド相互作用のような
特異的な生物学的相互作用により該検査液からの生物学
的粒子を結合し、該粒子は検出すべき核酸を含有してお
り、次に、該担体に結合した生物学的粒子を該検査液か
ら分離した後に、該担体に結合した生物学的粒子と生物
学的粒子を開裂させ核酸を遊離させる薬剤とを一緒にイ
ンキュベートし、同時にまたは続けて、遊離された核酸
を増幅し、次に、核酸の存在及び／または量を測定して
、検査液中の生物学的粒子の存在及び／または量を測定
することである。
本発明方法は特に、生物学的粒子が蛋白質含有覆物のエ
ピトープに対する（モノクローナル）抗体を担持してい
る場合に好適である。蛋白質被覆物を有している生物学
的粒子は、例えば、ウィルスまたは細胞、恐らく１種以
上のウィルスに感染している細胞例えばＴ細胞である。
生物学的粒子中の核酸は粒子自身の遺伝子組成物に属す
るものであってよい。核酸はその粒子中に浸入している
もしくは導入されているかまたはその粒子によって捕ら
えられているために、核酸は遺伝子組成物に属していて
もよい。単細胞生物も本発明方法で検出しうる。
本発明方法は感染性ウィルス例えば肝炎ウィルス及びＡ
ＩＤＳを引き起こすウィルス（例えば、ＨＩＶ−１，Ｈ
ＩＶ−２）に特に好適である。該ウィルスのエピトープ
に対する好適な（モノクロナル）抗体と組み合わせると
、本発明方法は顕著に良好な結果を与える。
モノクローナル抗体　抗ｐｒｅｓｌを使用するときには
、特に、本発明方法により感染性Ｂ型肝炎ウィルス粒子
（いわゆるＤａｎｅ粒子）を検出することができる。ｐ
ｒｅｓｌ及びｐｒｅｓ２をほとんど含有せず大量のＳ−
蛋白質を含有し核酸を全く含有しない、２２ｎｍのいわ
ゆる“ダミー”粒子量のｐｒｅｓｌ及びｐｒｅＳ２を含
有している（Ｓｕｍｍｅ＋＋、　１．　Ｒｅｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｉｌｉ＋口ｖｉ＋ｕｉｅ＋
、　　Ｉｎ　Ｖｉ「ａｌ　）Ｉｅｐａｌｉｌｉ＋　ａｎ
ｄ　Ｌｉｖｅ＋口１ｓｅａｓｅ、　　Ｖｙａｓ　　Ｇ、
　　Ｎ、、　　Ｄｉｅｎｔｌａｇ　　Ｉ、　　ＬＨｏｏ
ｆｎａｇｌｅ、　　１．　Ｈ，編、　Ｎｅｗ　Ｙｏｌｋ
　１９８４）。
本発明は本発明方法を実施するための検査キットにも係
る。検査キットは、免疫化学的成分を担持した固体担体
、生物学的粒子を開裂させるための薬剤及び核酸を増幅
させるための試薬を含んでいる。
“免疫化学的成分を担持した固体担体”とは、免疫化学
的成分が直接的または間接的に結合している固体担体を
意味するものと理解される。
フレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ（
Ｓａｉｋｉら。
１９８５、　５ｃｉｅｎｃｅ、　　２３０．　　ｐ、１
３５０−１３４５１による及び、最近ではＴａｑポリメ
ラーゼ（Ｓ＋ｉｋｉら、　１９８８プがウィルス塩基配
列を検出するために或は分子クローニング手法にこの方
法を使用してきた。増幅することなしには検出し得ない
ほど少量の核酸を含有する検査液しか入手し得ないとき
には、１Ｏから１０７にＤＮＡ配列を複製できるこの増
幅法は非常に重要である。
現在広く使用されているような方法で検査サンプルから
核酸を単離するために前述の米国特許第４、６８９．２
９５号明細書に記載されている方法を使用する場合には
、本明細書中下記に使用するＰＣＲのような核酸増幅法
は不利である。特に、このタイプの増幅法に使用すべき
プライマーとの特異的ハイブリッド形成の結果、望まし
くない配列も同時に複製されるであろう。ＰＣＲ手法で
は最終生成物がそれ自身の特異的な鋳型であることが知
られている。このことは、プライマーとハイブリッド形
成する物質による汚染のどんな痕跡でも間違った陽性信
号を導くであろうことを意味している。
このことを考慮すると、実際にこのタイプの増幅手法を
使用し得るのであれば、非常に特別な予防手段を用いな
ければならない。このような予防手段の例としては、こ
の特別な使用のためのピペットを確保しておかねばなら
ないこと、ガラス器具は非常に注意深く洗浄しなければ
ならないこと、本来検出すべき粒子に対する分子生物学
的組換え作業は増幅手法を実施する場所とは別の場所で
行うのが好ましいことなどである。多くの予防手段を取
ったにもかかわらず、陰性の検査液が陽性信号を示すこ
とがしばしば認められる。
本発明方法の大きな利点はまさに、１つの（小さい）反
応容器、例えばマイクロタイトレージョンプレートのウ
ェル内で全手順を実施しうることである。さらに、本発
明の方法の実施には最小限の反応段階しか行う必要がな
い。その結果、汚染の危険性が減少する。検出すべき核
酸を含有する生物学的粒子を固体担体に結合させた後で
検査液を除去するので、汚染の結果として検査液中に入
った核酸も除去される。詳細な説明により本発明を下記
に説明する。
検査液、例えば尿、血液及び血液製品中に疾患の原因と
なるウィルスが存在すると仮定する。
少なくとも蛋白質被覆物と核酸、即ちＤＮＡまたはＲＮ
Ａ、からなるこのウィルスは、該ウィルスのエピトープ
に対する特異抗体により固体担体に結合する。この手段
により、ウィルスを検査液中に存在する他の成分から特
異的に分離する。このような成分は例えば細胞物質であ
る。
予め固体担体に結合しである抗体を検査液に接触させる
ことによりこの種のウィルスを固体担体に結合し得る。
ウィルス（抗原）を固体担体に結合させるもう一つの方
法は、生物学的粒子例えばウィルス粒子を、担体に結合
していない抗体と接触させることであり、これらの抗体
を免疫化学反応の間または後にこれらの抗体に親和性を
有している固体担体に結合する。
また、例えばＨＩＶ中のようにエピトープ／リガンドと
してｇ　ｐ　１６Ｇを含有するウィルス粒子を、すでに
固体担体に結合させたＣＤ４　レセプターて捕捉するこ
とによっても、ウィルス（抗原）を固体担体に結合し得
る。
０ 直接または間接的に免疫化学的成分と結合する固体担体
は、担体に結合している（液）相を担体に結合していな
いもう一つの相から分離しうるどんな形状や大きさのど
んな物質でもよい。固体担体への１種又は複数の抗体の
直接的または間接的な結合は共有結合またはイオン結合
または水素結合によるものでよく、または、例えばファ
ンデルものでもよい。好適な担体は例えば試験管、ろ紙
、マイクロタイタープレートのウェルもしくはストリッ
プ、またはガラス、シリカもしくはプラスチック製の小
さい棒、球もしくはディスクである。
生物学的粒子が結合している担体結合相と液相との分離
は慣用法で実施し得る。例えば、ろ過または傾斜によっ
て液体を除去した後に必要に応じて１回以上の洗浄を行
う。
次に、抗原−抗体複合体により固体担体に結合１ している生物学的粒子を、生物学的粒子を開裂させて生
物学的粒子中に存在する核酸を遊離させる薬剤と一緒に
インキュベー１・する。生物学的粒子上の蛋白質である
ことの多い被覆物を開裂させるために使用し得る薬剤は
、プロナーゼまたはプロテイナーゼにのような蛋白質分
解酵素である。他の好適な薬剤は、例えば、ドデシル硫
酸ナトリウム、ドテシル−Ｎ−サルコシン酸すトリウム
、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩化ドテシルピ
リミジニウム、バルミトイルリソレシチン、ドデシル−
Ｎ−ベタイン、ポリオキシエチレンアルコール　ポリオ
キシエチレンイソアルコール、ポリオキンエチレン　ｐ
　−１−オクチルフェノール、ポリオキシエチレンノニ
ルフェノール、脂肪酸のポリオキシエチレンエステル、
ポリオキシエチレンソルビトールエステル、ドデシルス
ルホン酸すトリウム、臭化テトラ−デシルアンモニウム
及びす２ ボニンのような界面活性剤（ｄｅｌｅＢｅ＋ｕ＋）であ
る。
非イオン界面活性剤が好ましい。非常に好適な（Ｒ）　
　　ｌ　　（Ｒ） 非イオン界面活性剤はＢｒｙ、　Ｔ「＃１ｏｎＮｏｎｉ
ｄｅｌ　Ｐ２Ｏ及びＴｗｅｅｎ（Ｒ’　を含むポリオキ
（Ｒ１ ジエチレン誘導体である。
生物学的粒子上の被覆物を開裂させるもう一つの方法は
熱処理及び／またはアルカル処理である。
蛋白質被覆物を開裂した後、核酸、即ちＤＮＡまたはＲ
ＮＡが反応混合物中に遊離される。次に、この反応混合
物を同時にまたは順次反応体で処理し、遊離した核酸を
増幅させる。この目的には、（米国特許第４．６８３．
２０２号明細書に記載されている）前記のＰＣＲ手法、
（ＷＯ８８／１０３１５明細書に記載されている）いわ
ゆるＴＡＳ手法、または（欧州特許第３２９．８２２号
明細書に記載されている）いわゆるＮＡＳＢＡ手法のよ
うな任意の好適な核酸増幅手法が使用できる。
工３ 好適な増幅手性を実施した後、それ自身公知の方法、例
えば直接的または間接的な分光光学的測定性によって、
好ましくは核酸を遊離させたものと同じ（小さな）反応
容器中で核酸の存在及び／または量を測定する。慣用の
ゲル電気泳動法の後にサザンブロッテイングを行っても
よい。増幅反応の間に標識プライマーを使用して増幅し
た核酸を検出することもできる。この方法により、検査
液中の生物学的粒子の存在及び／または量が測定される
。下記の実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
実施例　工 ａ、固相上の抗ｐｒｅｓ１へのＢ型肝炎つィルス悲豊塗 マイクロタイトレージョンプレー１・のウェル中で、３
７℃で１時間、５０ハの血清（陰性血清または、陽性対
照としてのｌＯＰｇのＢ型肝炎ウィルスを含有４ する血ｌ青）をインキュベートする。このウェルはＨＢ
　ｓ　Ａ　ｇ上のｐｒｅｓ１エピトープに対する抗ｐｒ
ｅｓ１で被覆されている。Ｐ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｗｅｅｎ（
Ｒ）で５回洗浄した後、直接またはプロテイナーゼに処
理後に、ウェルの内部をアルカリで処理する。ｌＯｍｍ
ｏｌ／　ｌ　Ｔｈ１ｓ　−ＨＣ１（ｐＨ７，５）、　　
１ｍｍｏｌ／　　ＩＥＤＴＡ、　　０．１％ＳＤＳ中ノ
ｏ、　ｏ＋％　（Ｗ／Ｖ）　プロテイナーセＫ　（Ｍｅ
＋ｃｋ、　２７１Ｕ／ｍｇ）　５０／ｊ−ｅを加えてプ
ロテイナーセに処理し、混合物を３７℃で１時間インキ
ユベート・する。
（終濃度５０ｍＭまたは５［１０ｍＭ）のＮａＯＨ２，
５／１１を加えてから、５［１℃で１５分間インキュベ
ートしてアルカリ処理し、次に、適当なモル濃度のＨｉ
２．５〃を加えて溶液を中和する。
ｂ、増幅法（ＰＣＲ手法） ２０ｍｍｏｌ／　ｌ　ＴｒｉＳ−ＨＣ（１（ｐＨｇ、　
３）、　１２ｍｍｏｌ／　ｌＭｇＣｌ２，０．０２％（
Ｗ／Ｖ）　　ゼラチン、　　４００μｍｏｌ　／↓　５ １の各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びイ ｄＴＴＰ、　　２μｍｏｌ　／１の各グラ／マー及び４
単位のＴａｑポリメラーゼを含有する混合物５０Ｉｉ１
を加え、混合物を９４℃で上針間、次に６５℃で４分間
インキュベートする。この９４℃次に６５℃のインキュ
ベーションサイクルを４０回繰り返す。使用したＨＢＶ
ゲノム中の唯一のＥｅｏＲＩ制御エンドヌクレアーゼ切
断部位の周辺に局在する。
この配列は５’　ＣＣＴＣＣＴＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡ
ＴＣＧ−ＯＨ及び５’　ＧＡＡＣＴＧＧＡＧＣＣＡ　Ｃ
ＣＡ　Ｇ　Ｃ，Ａ　Ｇ　Ｇ　−ＯＨである。
Ｃ，アガロースゲル電気泳動／ハイブリッド形成上記の
ＰＣＲ手法の後に、２％アガロースゲルに溶液３１１１
を載せ、５０ｍＡで２．５時間ゲル電気泳動を行う。次
に、ゲルを臭化エチジウムで着色する。
サザンブロツティング後、ニトロセルロースフィ６ ルターを３２Ｐで標識した内部プローブとハイブリット
形成させ、厳格な条件下で洗浄した後、オートラジオグ
ラフィーにかける。この検出法から、本発明方法が一つ
の小さい反応容器中で実施し得る非常に感度の高い（フ
ェムトグラムレベル）の手法を提供することが分かった
。
実施例　■ ＨＩＶ〜エンベロープ蛋白質に対するモノクローナル抗
体で被覆したマイクロタイトレージョンプレートのウェ
ル内で５０ハのサンプル（正常なヒト血清、または陽性
対照としてのＨＩＶ含有血清）を３７℃で１時間インキ
ュベートする。
Ｐ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｗｅｅｎで５回洗浄した後、実施例Ｉ
ａに記載したようにウェルを処理する。
７ ｂ。
ＨｒＶ 核酸増幅 る。
０．２■／ｄゼラチン、４００μＭの各ｄＡＴＰｄＣＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、　　２μＭの両プライマー
（配列は下記に示す）、　ＩＯＵの鳥ミニロブラスドー
マウィルス逆転移酵素及び４ＵのＴａｑポリメラーゼを
含む反応混合物５０／ｉｉ！を加える。４５°Ｃで３０
分間ｃ　ＤＮＡ合威した後、増幅サイクルを４０回行っ
た。１回の増幅サイクルは９５℃で１分間、５２℃で１
．５分間及び７２℃で２分間のインキュベーションから
なる。
使用したＨｒＶ−ｐｏｌ配列は：５′−ＡＣＡＧＧＡ　
　ＧＣＡ　　ＧＡＴ　　ＧＡＴ　　ＡＣＡＧＴＡ　　Ｔ
ＴＡＧ−３’及び５’　−ＣＣ７８ ＧＧＣＴＴＴ　　　ＡＡＴ　　　ＴＴＴ　　　ＡＣＴＧ
ＧＴ　　Ａ−３’　である。
ｂ２．ＮＡｓＢＡ ４０ｍＭ　Ｔｈ１ｓ−Ｈ（ｆｆｌ（ｐＨ８，３）、　　
２０ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ２　。
４０ｍＭ　ＫＯ２，ｆｉｌ　ＤｐＴ、　２ｍＭスペルミ
ジンＨＣ（１，１ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ及びｄ　Ｔ　Ｔ　Ｐ　、　　４ｍＭの各ＡＴＰ、ＣＴ
Ｐ、ＧＴＰ及びＵＴＰ、　　０．１μＭの両プライマー
（配列は下記に示す）　、１９ＵのＲＮＡガード（ＲＮ
Ａ　ｇｕａｒｄ）　。
２．５ｎのＢＳＡ、　　０．２ＵのＲＮａ　ｓ　ｅ　　
Ｈ，２０ＵのＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ及び４．２Ｕの
鳥ミニ写 ロブラスドーマウィルス逆転位酵素を含む反応混合物２
０Ｈに抽出混合物５ＩＪＩｌを加える。
４２℃で３時間項幅させる。使用した）ＩＩＶｐｏｌプ
ライマー配列は次の通りである。：５’−ＡＣＡ　　Ｇ
ＧＡ　　ＧＣＡ　　ＧＡＴ　　ＧＡＴＡＣＡ　　ＧＴＡ
　　ＴＴＡ　　Ｇ−３’及び５′９ ＡＡＴ　　　ＴＣＴ　　　ＡＡＴ　　　ＡＣＧ　　　Ａ
ＣＴＣＡＣＴＡＴ　　　ＡＧＧ　　　ＧＣＣＴＧＧＣＴ
Ｔ　　　ＴＡＡ　　　ＴＴＴ　　　ＴＡＣＴＧＧＴＡ−
３’ Ｃ１検出 増幅した生成物を実験例Ｉｃに記載したように検出する
。
０

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）検査液を免疫化学的成分を担持した固体担体と一
    緒にインキュベートし、ここで、該担体は免疫化学反応
    により該検査液からの生物学的粒子と結合し、該粒子は
    検出すべき核酸を含有しており、次に、該担体に結合し
    た生物学的粒子を該検査液から分離した後に、該担体に
    結合した生物学的粒子と生物学的粒子を開裂させ核酸を
    遊離させる薬剤とを一緒にインキュベートし、同時にま
    たは続けて、遊離された核酸を増幅し、次に、核酸の存
    在及び／または量を測定して、該検査液中の生物学的粒
    子の存在及び／または量を測定することを特徴とする検
    査液中の核酸の定性及び／または定量法。
  2. （２）該生物学的粒子が蛋白質含有被覆物を有しており
    、該固体担体が生物学的粒子被覆物のエピトープに対す
    るモノクローナル抗体を担持していることを特徴とする
    請求項１記載の方法。
  3. （３）該生物学的粒子がウィルスであり、該担体に結合
    された該モノクローナル抗体がウィルスのエピトープに
    対するものであることを特徴とする請求項２記載の方法
    。
  4. （４）該ウィルスがＢ型肝炎ウィルスであり、該モノク
    ローナル抗体が抗ｐｒｅＳ１モノクローナル抗体である
    ことを特徴とする請求項３記載の方法。
  5. （５）請求項１記載の測定を実施するための検査キット
    。
JP2154973A 1989-06-15 1990-06-13 核酸測定法 Pending JPH0333656A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL8901512 1989-06-15
NL8901512 1989-06-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH0333656A true JPH0333656A (ja) 1991-02-13

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ID=19854838

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2154973A Pending JPH0333656A (ja) 1989-06-15 1990-06-13 核酸測定法

Country Status (12)

Country Link
EP (1) EP0402997B1 (ja)
JP (1) JPH0333656A (ja)
KR (1) KR910001379A (ja)
AT (1) ATE111533T1 (ja)
AU (1) AU641399B2 (ja)
CA (1) CA2018877A1 (ja)
DE (1) DE69012440T2 (ja)
DK (1) DK0402997T3 (ja)
ES (1) ES2063902T3 (ja)
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