JPH07503600A - 改変された結合性を有する変異タンパク質の豊富化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 改変された結合性を有する変異タンパク質の豊富化法発明の分野 本発明は、標的分子に対して改変された結合性を有する新規な結合タンパク質の 製造および体系的な選択に関する。さらに具体的には、本発明は、天然の結合バ ートナニの結合活性を模倣した外性ポリペプチドを製造するための方法に関する 。好ましい態様においては、本発明は、ホルモン、薬物およびその他の小分子（ 特に、成長ホルモンなどの生物学的に活性な分子）などのタンパク質または非ペ プチジル分子を模倣する治療用または診断用化合物の製造に関する。

発明の背景 結合パートナ−とは、通常は非共有性の相互作用によって互いに特異的に結合す る物質である。結合パートナ−の例には、リガンド−受容体、抗体−抗原、薬物 −標的、および酵素−基質の相互作用が含まれる。結合パートナ−は、治療およ び診断の両分野で極めて有用である。

過去において、結合パートナ−は、天然からの収集（例えば、抗体−抗原、およ びリガンド−受容体ベアリング）を含む種々の方法によって、および偶発的な同 定（例えば、候補分子のランダムスクリーニングを用いる伝統的な薬物開発）に よって調製されている。ある場合には、これら２種類の方法が組合せられている 。

例えば、結合に関与している鍵となる機能的残基を含むタンパク質またはポリペ プチドの変異体（ポリペプチドフラグメントなど）が調製されている。次いで、 これらのポリペプチドフラグメントは、伝統的な薬物開発と同種の方法によって 誘導体化されている。このような誘導体化の例には、ポリペプチドフラグメント を立体配座的に制約して新規な候補結合パートナ−を得るための環化などの方法 が含まれるであろう。

従来の方法を用いたときの問題は、天然のリガンドがすべての治療学的応用に適 した性質を有していないことがあることである。さらに、ポリペプチドリガンド は一部の標的物質に対して使用できないこともある。また、非天然の合成結合パ ートナ−を製造するための方法は高価かつ困難であることが多く、通常はそれぞ れの候補を得るために複雑な合成法を必要とする。候補分子をさらに最適化する ために合理的な薬物設計法を適用することができるように、得られた候補の構造 の特徴を調べることができないことが、これらの方法の一層の妨げとなっている 。

これらの問題を克服しようとする試みにおいて、Ｇｅｙｇｅｎ［Ｉｍｍｕｎ、Ｔ ｏｄｓｙ　６：　３６４−３６９　（１９８５）コおよびＧｅｙｓｅｎら［Ｍｏ １．　Ｉｍｍｕｎ、　２３＋　７０９−７１５　（１９８６）］は、体系的な反 復結合パートナ−の同定および製造のための骨組みを与えるポリペプチド合成の 使用を提案した。Ｇｅｙｓｅｎら（同上）によると、初めにジペプチドなどの短 いポリペプチドを、標的分子に結合する能力についてスクリーニングする。次い で、最も活性ポリペプチドを次の試験用に選択する。この試験は、出発ジペプチ ドに別の残基を結合させ（または、最初の出発ジペプチドの構成成分を内部修飾 することによる）、次いでこの一組の候補を所望の活性についてスクリーニング することからなる。所望の性質を有する結合パートナ−が同定されるまでこの過 程を繰り返す。

Ｇｅｙｓｅｎらの方法は、その方法の基礎となっている化学、即ちペプチド合成 が明白ではないかまたは変化に富んだ２次および３次構造を有する分子を生成す るという不都合か障害となっている。選択の繰り返し回数が増えるにつれて、ラ ンダムな相互作用がポリペプチドの種々の置換基の間で加速度的に増え、再現性 ある高次構造を有する＋目互作用分子の真のランダム集団が得られなくなる。例 えば、アミノ酸の側鎖（これらは配列的には大きく離れているが、空間的には隣 接している）の間の相互作用が任意に起こる。さらに、立体配座的に安定な２次 構造を促進しない配列は慢雑なペプチド−側鎖の相互作用を与え、これがあるア ミノ酸の標的分子との側鎖相互作用を妨げることもある。このような複雑な相互 作用は、ポリペプチド候補のポリアミド骨格の柔軟性によって促進される。また 、候補は多数の立体配座において存在することができ、最大の親和性または特異 性を有する標的と相互作用するかまたはそれに結合する配座異性体の同定を困難 にし、合理的な薬物設計を困難にする。

Ｇｅｙｓｅｎの反復ポリペプチド法を用いたときの最後の問題は、現在のところ 、多様性の高い別種ペプチドを製造、スクリーニングおよび分析しうる実際的な 方法が存在しないことである。２０種の天然アミノ酸を用いると、合成しなけれ ばならないヘキサペプチドのすべての組合せの合計数は６４．　ＯＯＯ，ＯＯＯ である。

このような多様性の高いペプチドを製造したとしても、このような多様性の高い ペプチドの混合物を迅速にスクリーニングして標的分子に対して高い親和性を有 するペプチドを選択することができる利用可能な方法が存在しない。現在のとこ ろ、それぞれの「付着」ペプチドは、タンパク質の配列決定を行なうに十分な多 量で回収されなければならない。

Ｇｅｙｓｅｎの方法に固有の多くの問題を克服するために、生物学的な選択およ びスクリーニングが代替法として選ばれた。生物学的な選択およびスクリーニン グは、タンパク質機能の探索および所望の性質を有する変異タンパク質の単離の ための強力な手段である［５ｈｏｒｔｌｅ、　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅ ｒｉｎｇ＋　０ｘｅｎｄｅｒおよびＦｏｘ編、Ａ、Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　Ｉｎｃ、、 　ＮＹ、　ｐＰ、　１０３−１ｏ１１　（１９８８）：およびＢｏｗｉｅら、　 ５ｃｉｅｎｃｅ　２４７：　１３０６|１３１０　（１ ９９０）］。しかし、得られる選択またはスクリーニングは、１つだけかまたは 少数の関連タンパク質に適用できるにすぎない。

最近になって、Ｓｍ１ｔｈとその共同研究者［Ｓｍ１ｔｈ、　５ｃｉｅｎｃｅ　 ２２８：　１３１５−ＨＩ３　（１９８５）；およびＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍ １ｔｈ、　Ｇｅｎｅ　７３：　３０５−３１８　（１９８５）］は、短い遺伝子 フラグメントをｆｄファージ（［融合ファージＪ）の遺伝子ＩＩＩ中に挿入する ことにより、小さなタンパク質フラグメント（１０〜５０アミノ酸）を線状ファ ージの表面に効率的に「表示（顕示）」させうることを示した。遺伝子Ｉ１１の 副コートタンパク質（ピリオンの一方の末端に約５コピー存在する）は、適切な ファージ組立ておよび大腸菌の線毛への付着による感染に重要である［Ｒａ５ｃ ｈｅｄら＋　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｒｅｖ、　５０：　４０１−４２７　（１９ ８６）］。最近、「融合ファージ」は、外性タンパク質［Ｄｅｖｌｉｎら、鈷違 狙ｃｅ　２４９＋　４０４−４０６　（＋９９０）］または抗体［５ｃｏｔＬら 、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４９：　３８６−３９０　（１９９０j： およびＣｖｉｒｌａら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ＾ｃａｄ、　ＵＳ八へ７：　６３ ７ｇ−６３８２（１９９０）］と反応しうるペプチドを同定するための短い突然 変異ペプチド配列を表示させるのに有用であることがわかった。

しかし、このような「融合ファージ」を、新規または増強された結合性を有する 改変されたペプチドまたはタンパク質を同定するために使用する際には、いくつ かの重要な制限が存在する。第１に、大きな挿入体は恐ら（は遺伝子Ｉｌ＋の機 能を破壊し、従ってファージの組立ておよび感染性を破壊するので、１００未満 、好ましくは５０未満のアミノ酸残基のタンパク質を表示させるときにのみ融合 ファージが有用であることが示されている［Ｐａｒｇ＋ｌｅｙら、　Ｇｅｎｅ　 ７３：　３０５−３１８　（１９８８）］。

第２に、従来の方法は、標的分子に対して最大の結合親和性を有するライブラリ ーからペプチドを選択することができない。例えば、ランダムペプチドライブラ リ、−を抗−βエンドルフィンモアクローナル抗体で徹底的に選別した後には、 Ｃｖｉｒｌａとその共同研究者はファージに融合させた高親和性ペプチド（Ｋｄ 〜０．４μＭ）から生親和性ペプチド（Ｋｄ−１０μＭ）を分離することができ なかったであろう。さらに、極めて高い親和性（Ｋｄ〜７ｎＭ）を有する親のβ −エンドルフィンペプチド配列は、エピトープライブラリーから選別されなかっ た。

Ｌａｄｎｅｒ［Ｗｏ　９０１０２８０２］は、ウィルス粒子および細胞の外側表 面に表示された新規な結合タンパク質を選択するための方法を開示しているく異 種タンパク質は１６４個までのアミノ酸残基を有していてよいとされている）。

この方法は、表示されたタンパク質を単離および増幅して標的分子に対して所望 の親和性を有する新しい群の結合タンパク質を設計することを意図している。さ らに具体的には、１、ａｄｎｅｒは、Ｍ１３遺伝子ＩＩ＋コートタンパク質に融 合させた４６残基（クラムビン）から１６４残基（Ｔ４リソチーム）までの範囲 の「最初のタンパク質結合ドメイン」を有するタンパク質を表示する「融合ファ ージ」を開示している。Ｌａｄｎｅｒは、比較的小さいアミノ酸配列に制限部位 をアレンジするのは比較的容易であるので、［必要以上に大きくない」これらタ ンパク質の使用を教示し、５８アミノ酸残基のラン膵臓トリプシンインヒビター （ＢＰＴＩ）を好んで用いている。ＢＰＴＩなどの小さい融合タンパク質は標的 がタンパク質または巨大分子であるときに好ましく、一方、Ｔ４リソチームなど の比較的大きい融合タンパク質はステロイドなとの小さい標的分子に好ましいが 、これはこのような大きいタンパク質が小さい分子を嵌め込むことができる裂は 目および溝を有しているためである。この好ましいタンパク質ＢＰＴＩをＳｍ１ ｔｈらまたはｄｅ　ｌａ　Ｃｒｕｚら［Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｔ　２６３：　４ ３１ｇ−４３２２（１９８８）］が開示した遺伝子１１１の部位に、またはその 末端の一方に、遺伝子ＩＩ＋の第２の合成コピーと共に融合させて、「一部」の 未改変遺伝子ＩＩＩタンパク質が存在するようにすることが提案されている。Ｌ ａｄｎｅｒは、従来技術の生物学的な選択およびスクリーニング法の障害となる 、ランダムペプチドライブラリーから高親和性ペプチドを成功裏に選別する際の 問題についてはふれていない。

ヒト成長ホルモン（ｈ、Ｇ　Ｈ）は、正常なヒトの成長および発達の調節に多大 に関与している。この２２，０００ダルトンの脳下垂体ホルモンは、特に、線状 成長（体形成）、泌乳、マクロファージの活性化、インスリン様および糖尿発生 作用を含む多数の生物学的作用を示す［Ｃｈａｗｌａ、Ｒ，に、＋　Ａｎｎ、Ｒ ｅｖ、Ｍｅｄ、　３４：　５１９　（１９８３）；　Ｅｄｗａｒｄｓ、　Ｃ，Ｋ 、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３９：　７６９　（１９８ｇ）；　Ｔｈｏ＋＊ｅｒ、 Ｍ、Ｏ，ら＋　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅ唐煤A８１ニ ア４５　（１９８８）］。子供における成長ホルモンの欠損は小人症を導くが、 これは１０年以上にわたるｈＧＨの外部投与によって成功裏に治療されている。

ｈＧＨは、胎盤ラクトゲン、プロラクチン、ならびに他の遺伝的および種的変異 体または成長ホルモンを含む一部の相同ホルモンの一員である［Ｎ１ｃｏｌ　１ ．　Ｃ，Ｓ、ら＋　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｒｅμｅｖｓ　７：　１６９　（１９ ８６）］。ｈＧＨはこれらの中で独特であり、広い種特異性を示し、クローン化 した体形成受容体［Ｌｅｕｎｇ、　Ｄ、　Ｌら、　Ｎａｔｕｒｅ　３３０：　５ ３７　（１９８７）］またはプロラクチン受容体［Ｂｏｕｔｉｎ、　Ｊ、　Ｍ、 ら、　Ｃｅ　５３：　６９　（１９８ｇ）］に結合する。クローン化されたｈＧ Ｈの遺伝子は大腸菌において分泌型で発現されており［Ｃｈａｎｇ、　Ｃ，Ｎ、 ら。

並朋５５：　１８９　（１９８７）コ、そのＤＮＡおよびアミノ酸配列が報告さ れている［Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ　２８１：　５４４　（１９７９） ；　Ｇｒａｙら、　Ｇｅｎｅ　３９：　２４７　（１９８５）コ。ｈＧＨの３次 元構造は利用することができない。しかし、ブタ成長ホルモン（ｐＧ　Ｈ）の３ 次元折り畳みパターンは普通の分解能および精度で報告されている［Ａｂｄｅｌ −Ｍｅｇｕｉｄ、　Ｓ。

Ｓ、ら＋　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　ｔｉｓ＾８４：　６ ４３４　（１９８７）コ。ヒト成長ホルモンの受容体および抗体エピトープは、 ホモログ−スキャニング突然変異誘発によって同定されている［Ｃｕｎｎ　ｉｎ ｇｈａｍら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４３：　１３３０　（１９８９月。ヒスチジ ン１８とヒスチ／ン２１を含むヒト成長ホルモンのスプライスされた配列を含有 する新規なアミノ末端メチオニルウシ成長ホルモンの構造が示されている［米国 時Ｒ’ｆ　Ｎｏ、　４．８８０゜９１０］。

ヒト成長ホルモン（ｈＧ　Ｈ）は、種々の動物モデルにおいて線状骨格成長、泌 乳、マクロファージの活性化、インスリン様および糖尿作用などを含む多種の生 理学的および代謝作用を引き起こす［Ｒ，Ｋ、　Ｃｈａｔｉａら、＾ｎｎｕ、Ｒ ｅｖ、Ｍｅｄ、　３４：　５１９　（１９８３）；０、　Ｇ、　Ｐ、　ｌ５ａｋ ｓｓｏｎら、＾ｎｎｕ、Ｒｅｖ、Ｐｈｙｓｉｏ１．　４７：　４８３　（１９８ ５）；　Ｃ，に、Ｅｄｗａｒｄ唐轣A阪橡 ｎｃｅ　２３９＋　７６９　（１９８ｇ）；　Ｍ、０．ＴｈｏｒｎｅｒおよびＭ 、Ｌ、Ｖａｎｃｅ＋　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、　８２F　７４５ （１９８８）：　Ｊ、Ｐ、ＨｕｇｈｅｓおよびＨ，Ｇ、　Ｆｒ１ｅｓｅｎ、＾ｎ ＋＋、Ｒｅｖ、Ｐｈｙｓｉｏ１．４７：　４６９　（１９８T）］。

これらの生物学的作用は、ｈＧＨと特異的な細胞受容体の間の相互作用によって 導かれる。

従って、本発明の目的は、候補の結合物質の体系的製造のための迅速かつ効率的 な方法を提供することである。

本発明の別の目的は、ファージミド粒子の表面に表示される立体配座的に安定な 候補結合物質を製造することである。

本発明の他の目的は、ファージのコートタンパク質と異種ポリペプチドの融合タ ンパク質からなる候補結合物質を製造することである［ここで、該ポリペプチド は長さが１００アミノ酸以上であり、■サブユニット以上であってよく、そして ファージミド粒子上に表示されるものである（該ポリペプチドはこのファージミ ドのゲノムにコードされている）コ。

本発明のさらに別の目的は、非共有性の結合相互作用に関与する可能性のあるす べてのペプチジル部分を与えるかまたは表示し、また、立体的に制限された様式 でこれらの部分を与えるに十分な融通性を備えた結合物質を製造および選択する ための方法を提供するものである。

に強い親和性を示す成長ホルモン変異体の製造である。

本発明の別の目的は、検出可能な融合タンパク質がサプレッサー宿主細胞におい て産生され、異種ポリペプチドだけが非サプレッサー宿主細胞において産生され るように、異種ポリペプチドとファージコートタンパク質の間に機能的に設置さ れた抑制可能な終止コドンを含有する発現ベクターファージミドを製造すること である。

最後に、本発明の目的は、ファージミド粒子の外側表面に１を越える候補結合タ ンパク質のコピーをめったに表示することがなく、従って高親和性の結合タンパ ク質の効率的な選択を達成することができるファージミド粒子を製造することで ある。

本発明のこれらおよび他の目的は、本発明を全体として考慮することにより叩上 ｇ己の目的は、 （ａ）ポリペプチドをコードしている第１の遺伝子と天然または野生型ファージ コートタンパク質の少なくとも一部をフードしている第２の遺伝子を含有する複 製可能な発現ベクター（ここで、第１および第２の遺伝子は異種であり、転写調 節要素が第１および第２の遺伝子に機能的に結合されており、従って融合タンパ ク質をフードしている遺伝子融合か得られる）を構築し：（ｂ）該ベクターの第 １の遺伝子内の１またはそれ以上の選択した位置において突然変異を行なって一 部の関連プラスミドを生成させ；（ｃ）該プラスミドで適当な宿主細胞を形質転 換し；（ｄ）該形質転換した宿主細胞を該ファージコートタンパク質をコードし ている遺伝子を有するヘルパーファージに感染させ；（ｅ）該プラスミドの少な （とも一部を含有する組換えファージミド粒子の形成に適切かつ宿主を形質転換 しうる条件のもと、少量のファージミド粒子だけが融合タンパク質の１を越える コピーを粒子の表面に表示するように該条件を調節して、該形質転換して感染さ せた宿主細胞を培養し；（ｆ）該ファージミド粒子を標的分子と接触させて、フ ァージミド粒子の少なくとも一部を該標的分子に結合させ：そして（ｇ）結合し たファージミド粒子を未結合の粒子から分離する：ことからなる新規な結合ポリ ペプチドを選択するための方法を提供することによって達成した。この方法は、 さらに、標的分子に結合する組換えファージミド粒子で適切な宿主細胞を形質転 換し、工程（ｄ）〜（ｇ）を１またはそれ以上の回数繰り返す工程を含んでいる のが好ましい。

さらに、１を越えるサブユニットからなる新規な結合タンパク質を選択する方法 を、次のように新規な結合ペプチドを選択することによって達成する：即ち、こ の選択法は、 ・１またはそれ以上のサブユニットを含む所望のタンパク質をコードしているＤ ＮＡに機能的に結合させた転写調節要素を含有する複製可能な発現ベクター（こ こで、該サブユニットの少なくとも１つをコードしているＤＮＡはファージコー トタンパク質の少なくとも一部をコードしているＤＮＡに融合している）を構築 し； ・１またはそれ以上の選択した位置において該所望のタンパク質をコードしてい るＤＮＡに突然変異を行なって一部の関連ベクターを生成させ；・該ベクターで 適当な宿主細胞を形質転換し；・該形質転換した宿主細胞を該ファージコートタ ンパク質をコードしている遺伝子を有するヘルパーファージに感染させ；・該プ ラスミドの少なくとも一部を含有する組換えファージミド粒子の形成に適切かつ 宿主を形質転換しうる条件のもと、少量のファージミド粒子だけが融合タンパク 質の１を越えるコピーを粒子の表面に表示するように該条件を調節して、該形質 転換して感染させた宿主細胞を培養し；・該ファージミド粒子を標的分子と接触 させて、ファージミド粒子の少なくとも一部を該標的分子に結合させ：そして・ 結合したファージミド粒子を未結合の粒子から分離する；ことからなる。

本発明の方法においては、プラスミドが転写調節要素の厳格な制御下にあり、粒 子の表面に融合タンパク質の１を越えるコピーを表示するファージミド粒子の量 または数が約１％未満となるように培養条件が調節されているのが好ましい。

また、融合タンパク質の１を越えるコピーを表示するファージミド粒子の量が、 融合タンパク質の単一コピーを表示するファージミド粒子の量の１０％未満であ るのが好ましい。最も好ましいのは、この量が２０％未満である。

通常、本発明の方法においては、発現ベクターはポリペプチドのそれぞれのサブ ユニ、トをコードしているＤＮＡに融合させた分泌シグナル配列をさらに含有し 、転写調節要素はプロモーター系であろう。好ましいプロモーター系は、Ｌａｃ Ｚ１λｐＬ、　Ｔ　Ａ　Ｃ、Ｔ　７ボリメラーゼ、トリプトファン、およびアル カリホスファターゼプロモーターならびにこれらの組合せから選択される。

また、第１の遺伝子は通常は哺乳動物タンパク質をコードしているであろう。

好ましいタンパク質は次のものから選択されるであろう：ヒト成長ホルモン（ｈ ＧＨ）、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、副甲状腺ホルモ ン、チロキシン、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、プロインスリン、レラキシ ンＡ鎖、レラキンンＢ鎖、プロレラキシン、糖タンパク質ホルモン、例えば卵胞 刺激ホルモン（Ｆ　Ｓ　Ｈ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）およびロイチナイ ジング（Ｌｅｕｔｉ旧ｚｉｎｇ）ホルモン（ＬＨ）、糖タンパク質ホルモン受容 体、カルシトニン、グルカゴン、因子ｖｌ比抗体、肺表面活性物質、ウロキナー ゼ、ストレプトキナーゼ、ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ） 、ボンベシン、因子ＩＸ、）ロンビン、造血成長ホルモン、腫瘍壊死因子αおよ びβ、エンケファリナーゼ、ヒト血清アルフミン、ミュラー阻害物質、マウスゴ ナドトロピン関連ペプチド、微生物タンパク質、例えばβ−ラクタマーゼ、組織 因子タンパク質、インヒビン、アクチピン、血管内皮成長因子、ホルモンまたは 成長因子の受容体；インテグリン、トロンボボエチン、プロティンＡまたはＤ、 リウマトイド因子、神経成長因子、例えばＮＧＦ−β、血小板成長因子、トラン スフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β、イン スリン様成長因子■およびＩ＋、インスリン様成長因子結合タンパク質、ＣＤ− ４、ＤＮアーゼ、潜在性関連ペプチド、エリトロポエチン、骨誘導因子、インタ ーフェロン、例えばインターフェロンα、βおよびγ、コロニー刺激因子（Ｃ３ Ｆ）、例えばＭ−Ｃ３Ｆ％ＧＭ−Ｃ３ＦおよびＧ−Ｃ５Ｆ、インターロイキン（ Ｉ　Ｌ）、例えばＩ　Ｌ−１，１１−２、＋　Ｌ−３、ＩＬ−４、スーパーオキ シドジスムターゼ；崩壊促進因子、ウィルス抗原、ＨＩ■エンヘローブタンパク 質、例えばＧＰ１２０、ＧＰ１４０、心房性ナトリウム利尿ペプチドＡ、Ｂまた はＣ１免疫グロブリン、ならびに上記タンパク質のいずれかのフラグメント。

好ましくは、第１の遺伝子は約１００以上のアミノ酸残基を含むｌまたはそれ以 上のサブユニ、トのポリペプチドをコードしており、標的と相互作用しうる複数 のアミノ酸を表示する複数の堅い２次構造を形成するように折り畳まれているで あろう。好ましくは、第１の遺伝子は、堅い２次構造の完全性が保存されるよう に、標的と相互作用しうるアミノ酸にのみ対応するコドンのところで突然変異が 為されているであろう。

通常、本発明の方法は、Ｍ］３に０７、Ｍ１３Ｒ４０８、Ｍ１３−ＶＯ２および Ｐｈ１Ｘ　Ｉ　７４から選択されるヘルパーファージを用いるであろう。好まし いヘルパーファージはＭ１３ＫＯ７であり、好ましいコートタンパク質はＭ１３ ファージの遺伝子ＩＩ＋コートタンパク質である。好ましい宿主は大腸菌であり 、大腸菌のプロテアーゼ欠損株である。本発明の方法によって選択される新規な ｈＧＨ変異体を検出した。このポリペプチドとファージフートタンパク質をコー ドしている核酸の間に機能的に設置した抑制可能な終止コドンを含有するファー ジミド発現ベクターを構築した。

図面の簡単な説明 図１：線状ファージの表面に大きいタンパク質を表示（顕示）させるための方法 および改変された受容体結合性を豊富化する方法を示すものである。ｈＧＨの全 暗号配列をＭ１３遺伝子ＩＩ＋のカルボキシ末端ドメインに融合させたプラスミ ドｐｈＧＨ−Ｍ１３ｇ１１１を構築した。この融合タンパク質の転写はｌａｃプ ロモーター／オペレーター配列の支配下にあり、分泌は５ｔｌｌシグナル配列に よって指令されている。ファージミド粒子は「ヘルパー」ファージＭ１３ＫＯ７ による感染によって得られ、ｈＧＨを表示する粒子はｈＧＨ受容体を含む親和性 マトリックスに結合させることによって豊富化することができる。野生型遺伝子 ＋１１（Ｍ１３ＫＯ７フアージから導く）はファージの先端の４〜５コピーの複 数矢印により図示し、融合タンパク質（ファージミドｐｈＧ　Ｈ−Ｍ　１３　ｇ ｌｌｌから導く）はｈＧＨの折り畳み図形（矢印の頭部を置換）によって図示し た。

図２＝全ファージ粒子の免疫プロットはｈＧＨがファージと同時移動することを 示す。塩化セシウム勾配で精製したファージミド粒子を二重のウェルに付し、３ ７５ｍＭ）リス、４０ｍＭグリシン（ｐＨ９，６）緩衝液中、１％アガロースゲ ルで電気泳動を行なった。このゲルを、２％ＳＤＳおよび２％β−メルカプトエ タノールを含む移転緩衝液［２５ｍＭ）リス（ｐＨ８，３）、２００＋Ｍグリシ ン、２０％メタノールコ中に２時間浸漬し、次いで移転緩衝液中で６時間すすい だ。次いで、ゲル中のタンパク質をイモピロン膜（Ｍｉ　１ｌｉｐｏｒｅ）上に 電気プロットした。１組の試料を含む膜はクーマシーブルーで染色してファージ タンパク質の位置を示した（Ａ）。二重の膜をポリクローナルウサギ抗−ｈＧＨ 抗体と反応させ、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ−フンシュゲート化したヤ ギ抗−ウサギＩｇＧ抗体と反応させることによって、膜のｈＧＨを免疫染色した （Ｂ）。レーン１はＭ１３ＫＯ７親ファージを含み、これはｈＧＨを欠いている のでクーマシーブルー染色した膜においてのみ観察することができた。レーン２ および３はホルモンファージミド粒子の別の調製物を含んでおり、クーマシーお よびｈＧＨ免疫染色の両方で観察することができた。親のＭ１３ＫＯ７フアージ とホルモンファージミド粒子の間の移動距離の差異は、内部にパッケージされた ゲノムの大きさの相違を反映するものである（それぞれ、８．７ｋｂと５．１ｋ ｂ）。

図３：コドン１７２．１７４．１７６および１７８のところをランダム化したｈ ＧＨ−ファージライブラリーの選択法における各工程をまとめる図である。ｈＧ Ｈ（Ｒ１７８Ｇ、Ｉ　１７９Ｔ）遺伝子および唯一のＫｐｎｌ制限部位を含有す る鋳型分子ｐＨ０４１５を本明細書に記載のように突然変異誘発し、大腸菌株Ｗ ＪＭＩ０１中に電気導入して最初のファージミドライブラリー（ライブラリー１ ）を得た。

ライブラリーｌの一部（約２％）を、本明細書に記載のように最初の選択ラウン ドに直接用いてライブラリーｌＧを得た。一方、２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を ライブラリー１から調製し、制限酵素Ｋｐｎｌで消化して鋳型のバックグラウン ドを排除し、ＷＪＭＩＯＩ中に電気導入してライブラリー２を得た。これらに続 く選択ラウンド（または、Ｋｐｎｌ／ｌｊｌ化、陰影を付けた箱）とその後のフ ァージミドの増殖は、本明細書に記載した方法に従い、矢印で示したように行な った。ライブラリー４Ｇ４からの４種の独立したクローンおよびライブラリー５ Ｇ＠がらの４種の独立したクローンをジデオキシ配列決定法によって配列決定し た。これらクローンのすべてが、ｈＧＨ突然変異体（Ｇｌｕ　１７４　Ｓｅｒ、 　Ｐｈｅ　１７６　Ｔｙｒ）に一致する同−ＤＮＡ配列をイｆしていた。

図４：結晶学により決定したブタ成長ホルモンの２．８人折り畳み図から導いた ｈＧＨの構造モデルを示すものである。ｈＧＨ−結合タンパク質への結合を強く 変調させるｈＧＨ中の残基の位置を陰影を付けた円内に示した。結合親和性にお いて１０倍以上の減少（・）、４〜ＩＯ倍の減少（・）、増加（○）、または２ 〜４倍の減少（・）を引き起こすアラニン置換が示されている。α−ヘリックス 領域におけるらせん輪投形により、これらの両極性が明らかになった。黒くした 、陰影を付けた、あるいは陰影を付けていない残基は、それぞれ荷電、極性、ま たは非極性を示す。ヘリックス４において、突然変異のための最も重要な残基は 親水性の面上にある。

図５９表示した経路（ｈＧＨ溶離、グリシン溶離、または予設着後のグリシン溶 離）に対するラウンドｌおよび３の選択工程からの多数のクローンを配列決定し た後にわかったｈＧＨの１７２．１７４．１７６および１７８位のアミノ酸置換 を示すものである（例えば、ＫＳＹＲという表示はｈＧＨ突然変異体１７２に／ １７４Ｓ／１７６Ｙ／１７８Ｒを表す）。非機能的な配列（即ち、ベクターバッ クグラウンド、または他の未成熟に終わった突然変異体および／またはフレーム シフトした突然変異体）はｒＮＦＪとして示している。非サイレントの疑似突然 変異（即ち、上に挙げた組の標的残基以外）を含む機能的な配列は「＋」で示し ている。すべての配列決定クローンの中で１回を越えて現れたが異なるＤＮＡ配 列を有するタンパク質配列は「＃」で示している。配列決定クローンの中で１回 を越えて現れ、そして同じＤＮＡ配列を有するタンパク質配列は「＊」で示して いる。

３ラウンドの選択の後に２種の異なる汚染配列が見い出されたことに注意すべき である（これらのクローンはカセット突然変異体に一致しなかったが、先に構築 したホルモンファージに一致した）。ｐｓＯ６４３汚染体は野生型ｈＧＨ−ファ ー；ｉニ一致する（ｈＧＨｒＫＥＦＲＪ　）。第３ラウンドのグリシン選択した ファージのプールに多いｐＨ０４５７汚染体は、先に同定したｈＧＨの突然変異 体ｒＫＳＹＲ」に一致する。これら汚染体の増幅は、まれにしか発生しない突然 変異体を選択するためのホルモン−ファージ選択法の能力を強調するものである 。また、これらの配列の集中性は３種すべての経路において顕著であった（即ち 、ＲまたはＫは１７２および１７８位に最も多く発生し、ＹまたはＦは１７６位 に最も多く発生し、そしてＳＳＴ、Ａおよびその他の残基は１７４位に発生する ）。

図６　亜鉛の存在下にｈＰＲＬｂｐ−ビーズ上で選択したファージからの配列を 示すものである。表示は図５で説明したものと同じである。ここでは、配列の集 中性は予測できないが、最もストリンジェントな（グリシン）選択条件下で疎水 性配列への偏りかあるようである（Ｌ、ＷおよびＰ残基がこのプールに多く見い 出される）。

図７：亜鉛の非存在下にｈＰＲＬｂｐ−ビーズ上で選択したファージがらの配列 を示すものである。表示は図５で説明したものと同じである。図６の配列とは対 照的に、ここでの配列は比較的親水性が高いようである。ｈＧＨ溶離による４ラ ウンドの選択の後、２ｆｉ類のクローン（Ａ　Ｎ　ＨＱおよびＴＬＤＴ／１７１ Ｖ）がプールに多く存在する。

図８゛ブランクのビーズ上で選択したファージからの配列を示すものである。

表示は図５で説明したものと同じである。グリシン溶離による３ラウンドの選択 の後、同胞体は観察されず、非機能的な配列のバックグラウンド水準が保持され た。

図９・ｐＨ０４１５からのファージミドｆ１起点（ｏｒｉ）の構築を示すもので ある。

カセット突然変異体発およびｈＧＨ−遺伝子ＩＩ＋融合タンパク質の発現のため のこのベクターを次のように構築した。ｐＢＲ３２２およびｆｌの複製起点を含 有し、大腸菌ｐｈｏＡプロモーターの制御下にｈＧＨ−遺伝子ＩＩ＋融合タンパ ク質（ｈＧ　Ｈの残基１〜１９１に１個のＧｌｙ残基か続き、これが遺伝子ＩＩ ＩのＰｒｏ−１９８に融合している）を発現する、ｐｓＯ１３２のオリゴヌクレ オチド指向性の突然変異誘発によって、プラスミドｐｓＯ６４３を構築した。以 下のオリゴヌクレオチド：５°−ＧＧＣ−＾ＧＣ−ＴＧＴ−ＧＧＣ−ＴＴＣ−Ｔ ＡＧ−＾ＧＴ−ＧＧＣ−ＧＧＣ−ＧＧＣ−ＴＣＴ−ＧＧＴ−３゜を用いて突然変 異誘発を行なった。このオリゴヌクレオチドは、ｈＧＨのＰ　ｈｅ−１９１に続 いてＸｂａ１部位（下線部）とアンバー終止コドン（ＴＡＧ）を導入した。

図１０・Ａは、ＨＥＲ−２受容体に指向性のＦａｂヒト化抗体の軽鎖および重鎮 （可変および不変ドメイン１）をコードしているＤＮＡを含有するプラスミドｐ ＤＨ１８８挿入体を図示したものである。ＶＬおよび■、はそれぞれ軽鎖および 重鎮の可変領域である。Ｃｋはヒトに軽鎖の不変領域である。ＣＨｌ、、はヒト γｌ鎖の最初の不変領域である。両暗号領域は細菌性の５ｔｌｌシグナル配列か ら始まっている。

Ｂは、５Ａに示した挿入体を含有する全プラスミドｐＤ８１８８を図示するもの である。このプラスミドを大腸菌５ＲＩＯＩ細胞に導入し、ヘルバーファーシヲ 添加した後、このプラスミドはファージ粒子にバ・７ケージされる。これら粒子 の一部はＦａｂ−ｐＨ！融合体を表示する（ここで、ｐｍはＭ１３遺伝子１１１ 　ＤＮＡによってコードされているタンパク質である）。このプラスミド図中の セグメントは５Ａに示した挿入体に対応している。

図１１（図１１のＡ−Ｃをまとめて説明する）：ファージミド表面に発現された ４Ｄ５Ｆａｂ分子をコードしているＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２５） を示すものである。軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２６）も、重鎖Ｐｉｌ＋融合 体のアミノ酸配列（配列番号２７）と同様に示されている。

図１２．変異Ｆａｂファージミドからの野生型４Ｄ５Ｆａｂフアージミドの豊富 化を示すものである。１　：　１，０００の比の野生型ファージミドと変異４Ｄ ５　Ｆａｂファージミドの混合物を、ＨＥ　Ｒ−２受容体の細胞外ドメインタン パク質で被覆したプレートで選択した。各ラウンドの選択の後、溶離したファー ジミドの一部を大腸菌に感染させ、プラスミドＤＮＡを調製した。次いで、この プラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＶおよびＰｓｔｌで消化し、５％ポリアクリルアミ ドゲルで分離し、臭化エチジウムで染色した。バンドをＵｖ光のもとて可視化し た。野生型および変異プラスミドに起因するバンドは矢印で示した。第１ラウン ドの選択は酸条件のもとでのみ溶離した。以後のラウンドは、酸溶離（図の左側 ）または実施例ＶＩ１１に記載した方法を用いるヒト化４Ｄ５抗体洗浄工程とそ の後の酸溶離（図の右側）のいずれかによって溶離した。３種の変異４Ｄ５Ｆａ ｂ分子を調製した。即ち、Ｈ９１Ａ（ＶＬ鎖の９１位のアミノ酸ヒスチジンをア ラニンに突然変異させた：図中のｒＡＪレーンに示す）、Ｙ４９Ａ（ＶＬ鎖の４ ９位のアミノ酸チロシンをアラニンに突然変異させた１図中のｒＢＪレーンに示 す）、ならびにＹ９２Ａ（ＶＬ鎖の９２位のアミノ酸チロシンをアラニンに突然 変異させた；図中の「Ｃ」レーンに示す）である。アミノ酸位置の数え方はＫａ ｂａｔらに従った［「免疫学的挿入体のタンパク質の配列」、第４版、　Ｕ、Ｓ 、Ｄｅｐｔ　ｏｒ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕａ＋ａｎ　５ｅｒｖｉｃｅｓ、 　ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈ　５ｅｒｖｉｃｅ、　Ｎａｔ’　１．　Ｉｎ５ｔｉ ｔｕｔｅ　ｏｆ　１（ｅａｌｔｈ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　ＭＤ　（１９８V） ］。

図１３：実験プロトコール中に記載したＲＩＡ親和性測定のスカッチャード分析 が示されている。結合した標識化ＥＣＤ抗原の量がＸ軸に示されており、結合量 を遊１ｌＩｌｊ！で割った数値がｙ軸に示されている。線の傾きはＫａを示し、 計算したＫｄは１　／　Ｋ　ａである。

発明の詳細な説明 以下の議論は、図１を参照することによって最も良く理解されるであろう。最も 単純な形態においては、本発明の方法は、標的分子に対して所望の通常は高い親 和性を膏する新規な結合ポリペプチド（タンパク質リガンドなど）を構造的に関 連した結合ポリペプチドのライブラリーから選択する方法からなる。ファージコ ートタンパク質に融合させた構造的に関連したポリペプチドのライブラリーは突 然変異誘発によって調製し、好ましくはそれぞれの関連ポリペプチドの単一コピ ーを、該ポリペプチドをコードしているＤＮＡを含有するファージミド粒子の表 面に表示（８示）する。次いで、これらのファージミド粒子を標的分子と接触さ せ、標的に対して最も高い親和性を冑する粒子を低親和性の粒子から分離する。

次いで、高親和性の結合体を細菌宿主の感染によって増幅し、競合結合工程を繰 り返す。所望の親和性のポリペプチドが得られるまでこの過程を繰り返す。

本発明の方法によって製造される新規な結合ポリペプチドまたはリガンドは、そ れ自体が生物学的有機体の処置において用いられる診断薬または治療薬（例えば 、アゴニストまたはアンタゴニスト）として有用である。また、選択したポリペ プチドの構造分析を用いて合理的な薬物設計を進めることもできる。

本明細書において用いる「結合ポリペプチド」は、選択性の親和性でもって標的 分子に結合するあらゆるポリペプチドを意味する。好ましくは、このポリペプチ ドはタンパク質であり、最も好ましくは約１００以上のアミノ酸残基を含有する タンパク質である。通常、このポリペプチドはホルモンもしくは抗体またはそれ らのフラグメントであろう。

本明細書において用いる「高親和性」は、生理学的条件下で＜１０−’Ｍ、好ま しくは＜　１０−’Ｍの親和定数（Ｋｄ）を意味する。

本明細書において用いる「標的分子」は、それに対してリガンドを製造するのが 所望であるあらゆる分子であり、必ずしもタンパク質に限られない。しかし、こ の標的はタンパク質であるのが好ましく、最も好ましくは、この標的はホルモン 受容体などの受容体である。

本明細書において用いる「ヒト化抗体」は、マウスまたは他の非ヒト抗体の相補 性決定領域（ＣＤＲ）がヒト抗体のフレームワーク（枠組み構造）に結合してい る抗体を意味する。ヒト抗体のフレームワークはＣＤＲを除く全ヒト抗体を意味 する。

■、ファージの表面に表示させるためのポリペプチドの選択本発明の方法におけ る第１の工程は、ファージの表面に表示させるためのポリペプチドの表面に露出 される堅い２次構造を有するポリペプチドを選択することである。

本明細書において用いる「ポリペプチド」は、特異的なりＮＡ配列によって発現 させることができる任意の分子を意味する。本発明のポリペプチドは１を越える サブユニットからなり、それぞれのサブユニットは別個のＤＮＡ配列によってコ ードされている。

本明細書において用いる「堅い２次構造」は、例えば、α−ヘリックス、３．０ へリノクス、πヘリックス、平行および逆平行β−シート、ならびに逆ターンな どにおいて見い出される規則的な反復構造を示す任意のポリペプチドセグメント を意味する。また、認識しうる幾何秩序を欠くある種の「非秩序」構造も、それ らが標的との相互作用が可能なアミノ酸残基のドメインまたは「パッチ」を形成 し、構造の全体形状が構造中のアミノ酸の置換によって破壊されない限り、堅い ２次構造の定義中に含まれる。ある種の非秩序構造は逆ターンの組合せであると 考えられている。これら堅い２次構造の幾何は、ペプチド「骨格」のα−炭素の まわりのφおよびφねじれ角によって十分に定義される。

２次構造をポリペプチド表面に露出させるのに必要なことは、標的分子に対して 露出され標的分子と結合することができるアミノ酸残基のドメインまたは「パッ チ」を提供することである。これは基本的には突然変異誘発によって置換される アミノ酸残基であり、この突然変異誘発によってファージの表面に表示される構 造的に関連した（突然変異体）結合ポリペプチドの「ライブラリー」が得られ、 これから新規なポリペプチドリガンドが選択される。通常、ポリペプチドの内部 に向かうアミノ酸残基の突然変異誘発または置換は避けられ、これにより堅い２ 次構造の全体構造が保存される。堅い２次構造の内部領域のアミノ酸の、特に疎 水性アミノ酸残基による置換の一部は、これら保存性の置換がポリペプチドの全 体構造を歪めるようには考えられないので許容されるであろう。

「ポリペプチド」選択の繰返しサイクルを用い、複数の選択サイクルによって選 択した複数のアミノ酸変化のファージミド選択によってさらに高い親和性の結合 を選択する。第１ラウンドのファージミド選択（リガンドポリペプチド中のアミ ノ酸の選択または第１領域が関係する）に続いて、リガンドポリペプチドの他の 領域またはアミノ酸において追加ラウンドのファージミド選択を行なう。リガン ドポリペプチドの所望の親和性が達成されるまでこのファージミド選択サイクル を繰り返す。この方法を説明するために、実施例ＶｌｌｌのｈＧＨのファージミ ド選択をサイクルで行なった。第１サイクルにおいて、ｈＧＨのアミノ酸１７２ 、＋７４．１７６および１７８に突然変異を行ない、ファージミドを選択した。

第２サイクルにおいて、ｈＧＨのアミノ酸１６７．１７１．１７５および１７９ をファージミド選択した。第３サイクルにおいて、ｈＧＨのアミノ酸１０，１４ ．１８および２１をファージミド選択した。先のサイクルからの最適アミノ酸変 化は、次サイクルの選択の前にポリペプチド中に導入することができる。例えば 、ｈＧＨのアミノ酸置換１７４（セリン）および＋７６（チロノン）を、ｈＧＨ のアミノ酸１６７．１７１．１７５および１７９のファージミド選択の前にｈＧ Ｈ中に導入した。

上記から、ポリペプチドの結合ドメインを形成するアミノ酸残基が連続的に結合 したものではな（、ポリペプチドの異なるサブユニット上に存在していてよいこ とが理解されるであろう。即ち、結合ドメインは、結合部位における特定の２次 構造をたどるものであって、１次構造をたどるものではない。従って、突然変異 はポリペプチドの内部から外側へ向かう部位の特定の２次構造内のアミノ酸をコ ードしているコドンに導入して、それらが標的と相互作用する可能性を持つよう にするのが普通である。説明のため、ｈＧＨ−結合タンパク質への結合を強力に 変調させることが知られているｈＧＨ中の残基の位置を図２に示すＣＣｕｎｎｉ ｎｇｈａｍら。

５ｃｉｅｎｃｅ　２４７：　１４６１−１４６５　（１９９０）］。即ち、突然 変異誘発に適切な代表的な部位には、ヘリックス４の残基１７２．１７４．１７ ６および１７８、ならびに「非秩序」２次構造内の残基６４が含まれる。

ある標的に対するリガンドとして選択したポリペプチドが該標的に正常に結合す る必要はない。即ち、例えばＴＳＨなどの糖タンパク質ホルモンをＦＳＨ受容体 のリガンドとして選択することができ、突然変異ＴＳＨ分子のライブラリーを本 発明の方法に用いて新規な薬物候補を得る。

即ち、本発明は標的分子に結合する任意のポリペプチドを意図したものであり、 抗体を包含している。好ましいポリペプチドは医薬用途を有しているポリペプチ ドである。さらに好ましいポリペプチドには次のものが含まれる：即ち、成長ホ ルモン（ヒト成長ホルモン、デス−Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウ シ成長ホルモンを含む）：副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；チロキシン ；インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、プロインスリン：卵胞刺激ホルモン；カル シトニン；ロイチナイジングホルモン；グルカゴン；因子Ｖｌｌｌ　；抗体；肺 表面活性物質、プラスミノーゲン活性化因子［例えば、ウロキナーゼまたはヒト 組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−Ｐ　Ａ）］　；］ボンベシン：因子Ｉ Ｘ；ｌ−ロンビン造血成長因子；腫瘍壊死因子αおよびβ；エンケファリナーゼ ；血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）；ミニラー阻害物質；レラキ シンＡ鎖；レラキシンＢ鎖：プロレラキシン：マウスゴナドトロビン関連ペプチ ド；微生物タンパク質（例えば、β−ラクタマーゼ）；組織因子タンパク質；イ ンヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子：ホルモンまたは成長因子の受容体： インテグリン；トロンボボエチン；プロティンＡまたはＤ；リウマトイド因子； 神経成長因子（例えば、ＮＧＦ−β）；血小板由来の成長因子：線維芽細胞成長 因子（例えば、ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ）；表皮成長因子ニドランスフォーミン グ成長因子（ＴＧＦ）（例えば、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、インスリン様 成長因子ｌおよび１１：インスリン様成長因子結合タンパク質；　ＣＤ−４；　 ＤＮアーゼ：潜在性関連ペプチド；エリトロボエチン；骨誘導因子；インターフ ェロン（例えば、インターフェロンα、βおよびγ）：コロニー刺激因子（Ｃ３ Ｆ）（例えば、Ｍ−Ｃ３Ｆ、ＧＭ−Ｃ３ＦおよびＧ−Ｃ５Ｆ）；インターロイキ ン（ＩＬ）（例えば、Ｉ　Ｌ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４）；スーパー オキシドジスムターゼ、崩壊促進因子；心房性ナトリウム利尿ペプチドＡ、Ｂま たはＣ；ウィルス抗原（例えば、ＨＩＶエンベロープの一部）；免疫グロブリン ：ならびに上記ポリペプチドのいずれかのフラグメントである。

さらに、ポリペプチド上の１またはそれ以上の予め決定したアミノ酸残基に置換 、挿入または削除を行なって、例えば改善された生物学的性質を有する生成物を 得ることができる。また、これらポリペプチドのフラグメント、特に生物学的に 活性なフラグメントが包含される。本発明のさらに好ましいポリペプチドは、ヒ ）・成長ホルモン、心房性ナトリウム利尿ペプチドＡＳＢおよびＣ１エンドトキ シン、スブチリンン、トリプシン、ならひに他のセリンプロテアーゼ類である。

さらに好ましいポリペプチドホルモンは、第１の細胞において産生される任意の アミノ酸配列であって、同じ細胞種（自己分泌ホルモン）または第２の細胞種（ 非自己分ｌ必）上の受容体に特異的に結合し、受容体保持細胞に特徴的な生理学 的反応を引き起こすアミノ酸配列として定義しうるポリペプチドホルモンである 。このようなポリペプチドホルモンには、サイトカイン類、リンホカイン類、神 経栄養ホルモンおよび脳下垂体線ポリペプチドホルモン、例えば成長ホルモン、 プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、チロ トロピン、絨毛ゴナドトロピン、フルチコトロピン、αまたはβ−ノラノサイト 刺激ホルモン、β−リボトロピン、γ−リボトロピンおよびエンドルフィン類； 視床下部放出抑制ホルモ／、例えばフルチコトロビン放出因子、成長ホルモン放 出抑制ホルモン、成長ホルモン放出因子：ならびに心房性ナトリウム利尿ペプチ ドＡ、１３およびＣなどの他のポリペプチドホルモンが含まれる。

１１、所望のポリペプチドをフードしている第１遺伝子（遺伝子１）の入手所望 のポリペプチド（即ち、堅い２次構造を有するポリペプチド）をフードしている 遺伝子は、当分野で既知の方法によって得ることかできる［一般には、Ｓａｍｂ ｒｏｏｋら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒ ｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ@Ｐｒｅｔ＋ｓ＋ Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｔｖ　Ｙｏｒｋ　（１９８９） を参照］。この遺伝子の配列が既知である場合には、この遺伝子をコードしてい るＤＮＡを化学的に合成してもよい［Ｍｅｒｒｆｉｅｌｄ、　Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅ ｍ、Ｓｏｃ、　８５：　２１４９　（１９６３）］。この遺伝子の配列が未知で ある場合、またはこの遺伝子がそれまでに単離されていない場合には、ｃＤＮＡ ライブラリー（所望の遺伝子が発現される適当な組織から得たＲＮＡから調製す る）から、または適当なゲノムＤＮＡライブラリーからクローン化することがで きる。次いで、適当なプローブを用いて遺伝子を単離する。ｃＤＮＡライブラリ ーのための適当なプローブには、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体（ ただし、ｃＤＮＡライブラリー発現ライブラリーであるとき）、オリゴヌクレオ チド、および相補性もしくは相同性ｃＤＮＡまたはそれらのフラグメントが含ま れる。ゲノムＤＮＡライブラリーから所望の遺伝子を単離するのに用いることが できるプローブには、同一もしくは類似の遺伝子をコードしているｃＤＮＡもし くはそのフラグメント、相同なゲノムＤＮＡもしくはＤ　Ｎ　Ａフラグメント、 およびオリゴヌクレオチドか含まれる。選択したプローブによるｃＤＮＡもしく はゲノムライブラリーのスクリーニングは、５ａｒＡｂｒｏｏｋら（上記）の第 １Ｏ〜１２章に記載されている標準法を用いて行なう。

所望のタンパク質をコードしている遺伝子を単離するための別の方法は、Ｓａｍ ｂｒｏｏｋら（上記）のセクション１４に記載されているポリメラーゼ連鎖反応 法（ＰＣＲ）を使用することである。この方法は、所望の遺伝子にハイブリダイ ズするオリゴヌクレオチドの使用を必要とする。即ち、オリゴヌクレオチドを得 るために、この遺伝子のＤＮＡ配列の少なくと一部が既知でなければならない。

遺伝子を単離した後、これをＳａｍｂｒｏｏｋら（上記）が一般的に記載してい るように増幅用の適当なベクター（好ましくは、プラスミド）中に挿入すること ができる。

１１１、複製可能な発現ベクターの構築いくつかの型のベクターが利用可能であ り、本発明の実施に用いることができるが、プラスミドベクターが本発明におい て使用するに好ましいベクターである。

これは、これらベクターを比較的容易に構築することができ、容易に増幅するこ とができるためである。一般にプラスミドベクターは、当業者には既知のように 、プロモーター、シグナル配列、表現型選択遺伝子、複製起点部位、および池の 必要な成分を含む種々の構成成分を含有している。

原核性ベクターにおいて最も普通に用いられるプロモーターには、ｌａｃ　Ｚプ ロモーター系、アルカリホスファターゼｐｈｏ　Ａプロモーター、バタテリオフ ァージλＰ１．プロモーター（温度感受性プロモーター）、ｔａｃプロモーター （ｌａｃリプレッサーによって調節されるハイブリッドＬｒｐ−１ａｃプロモー ター）、トリプトファンプロモーター、およびバクテリオファージエフプロモー ターが含まれる。プロモーターの全般的な説明については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら （上記）のセクション１７を参照。最もよく用いられるプロモーターが存在する が、他の適当な微生物プロモーターも同様に用いることができる。

本発明の実施に好ましいプロモーターは、融合遺伝子の発現を制御しうるように 厳格に調節することかできるプロモーターである。従来技術において認識されな いままであった問題は、ファージミド粒子の表面における融合タンパク質の複数 コピーの表示かファージミドと標的との複数点結合を導くことであったと考えら れる。「キレート作用」と呼ばれるこの作用は、融合タンパク質の複数コピーか 互いにすぐ近、接してファージミド粒子上に表示されて標的が「キレート化」さ れたときに、誤った「高親和性」ポリペプチドを選択する結果を与えると考えら れる。複数点結合か起こったときには、有効または見掛けＫｄは表示された融合 タンパク質のそれぞれのコピーに対する個々のＫｄの積と同程度に高いであろう 。

この作用が、Ｃｖｉｒｌａとその共同研究者（上記）が比較的高親和性のペプチ ドから中親和性のペプチドを分離できなかった理由であるのかもしれない。

少量（即ち、約１％よりも少ない）のファージミド粒子だけが複数コピーの融合 タンパク質を含有するように融合タンパク質の発現を厳格に調節することによっ て、「キレート作用」が克服され、高親和性のポリペプチドの適切な選択が可能 になることを発見した。即ち、プロモーターに依存して、宿主の培養条件を調節 して単一コピーの融合タンパク質を含有するファージミド粒子の数を最大にし、 複数コピーの融合タンパク質を含有するファージミド粒子の数を最少にする。

本発明の実施に用いられる好ましいプロモーターは、１ａｃＺプロモーターおよ びｐｈｏＡ　プロモーターである。この１ａｃＺプロモーターはｌａｃリプレッ サータンパク質＋ａｃ　ｉによって調節され、従って融合遺伝子の転写をｌａｃ リブレ・７サータンパク質の量の操作によって制御することができる。説明のた めであるが、この１ａｃＺプロモーターを含有するファージミドは、１ａｃＺプ ロモーターのリプレッサーであるｌａｃ　ｉリプレッサー遺伝子のコピーを含有 する細胞株中で増殖させる。１ａｃｌ遺伝子を含有する細胞株の例には、ＪＭＩ ＯＩおよびＸ　Ｌ　１−Ｂｌｕｅが含まれる。

別法によれば、リプレッサー１ａｃ　ｉおよび１ａｃＺプロモーターの両方を含 有するプラスミドて宿主細胞を同時トランスフェクトすることができる。ときに は上記方法の両方を同時に用いる。即ち、ｌａｃ　Ｚプロモーターを含有するフ ァージミド粒子をｌａｃ　ｉ遺伝子を含有する細胞株中で増殖させ、この細胞株 をＩａｃ　Ｚおよび１ａｃ１遺伝子の両方を含有するプラスミドで同時トランス フェクトする。通常、上記のトランスフェクトされた宿主に遺伝子を発現させた いときには、イソプロピルチオガラクトシド（ｌ　ＰＴＧ）などの誘導物質を加 える。しかし、本発明においては、この工程を割愛して、（ａ）遺伝子Ｉｌ＋融 合タンパク質の発現を最少にしてコピー数を最少にしく即ち、ファージミド数に 対する遺伝子ＩＩ＋融合体の数）、そして、（ｂ）低濃度であっても［ＰＴＯな どの誘導物質によって引き起こされるファージミドの劣るかまたは不適切なパッ ケージングを防止する。通常、誘導物質を加えないときには、ファージミド粒子 あたりの融合タンパク質の数は約０．１である（バルク融合タンパク質の数／フ ァージミド粒子の数）。本発明の実施に用いられる最も好ましいプロモーターは ｐｈｏＡである。このプロモーターは細胞中の無機リン酸の量によって調節され ると考えられており、このリン酸がプロモーターの活性を下方調節する。即ち、 細胞のリン酸を減少させること（こよって、プロモーターの活性を高めることが できる。所望の結果は、２ＹＴまたはＬＢなどのリン酸に富む培地て細胞を増殖 させ、遺伝子ＩＩ＋融合体の発現を制御することによって達成される。

本発明の実施に用いられるベクターの他の有用な成分はシグナル配列である。

通常、この配列は融合タンパク質をコードしている遺伝子のすぐ５°側に位置し ており、従って融合タンパク質のアミノ末端に転写される。しかし、ある種の場 合には、このシグナル配列は、分泌させようとするタンパク質をコードしている 遺伝子の他の５゛の位置に存在することが示されている。この配列は、細菌細胞 の内部膜を越えてこの配列が結合しているタンパク質を標的とする。このシグナ ル配列をフードしているＤＮＡは、シグナル配列を有するタンパク質をコードし ている任意の遺伝子から制限エンドヌクレアーゼフラグメントとして得ることが できる。適当な原核性シグナル配列は、例えば、ＬａＩＩＢもしくはＯｕｐ　Ｆ 　［Ｗｏｎｇら。

Ｇｅｎｅ　６８：　１９３　（１９８３）］、ＭａｌＥ、ＰｈｏＡおよびその他 の遺伝子をコードしている遺伝子から得ることができる。本発明の実施に好まし い原核性シグナル配列は、Ｃｈａｎｇら［Ｇｅｎｅ　５５：　１８９　（１９ｇ ？）］が記載している大腸菌の熱安定性エンテロトキンンＩＩ（Ｓ　Ｔ　Ｉ＋） シグナル配列である。

本発明の実施に用いられるベクターの別の有用な成分は、表現型選択遺伝子であ る。通常の表現型選択遺伝子は、宿主細胞に抗生物質耐性を与えるタンパク質を コードしている遺伝子である。説明のためのものであるが、アンピシリン耐性遺 伝子（ａ＋＊ｐ）およびテトラサイクリン耐性遺伝子（Ｌｅｔ）がこの目的に使 用するのが容易である。

上記の成分ならびに所望のポリペプチドをコードしている遺伝子（遺伝子１）を 含有する適当なベクターの構築は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）が記載している 標準的な組換えＤＮＡ法を用いて行なう。ベクターを形成させるために結合され る単離したＤＮＡフラグメントを切断し、加工し、そして特定の順序および配向 で一緒に連結して所望のベクターを創製する。

適当な緩衝液中で適当な制限酵素または酵素群を用いてＤＮＡを切断する。通常 、約２０μｍの緩衝溶液において、約０．２〜ｌμｇのプラスミドまたはＤＮＡ フラグメントを約１〜２単位の適当な制限酵素と共に用いる。適当な緩衝液、Ｄ ＮＡ濃度、ならびにインキュベート時間および温度は、制限酵素の製造元によっ て指定されている。通常、３７℃で約１または２時間のインキュベート時間が適 切であるが、い（っかの酵素はさらに高い温度を必要とする。インキュベート後 に、酵素および他の不純物をフェノールとクロロホルムの混合物による消化溶液 の抽出によって除去し、ＤＮＡをエタノールによる沈澱によって水性分画から回 収する。

ＤＮＡフラグメントを共に連結して機能的なベクターを得るためには、これらＤ ＮＡフラグメントの末端を互いに適合させなければならない。ある場合には、エ ンドヌクレアーゼ消化の後にこれら末端はそのままで適合性である。しかし、こ れらを連結に対して適合するようにするために、通常はエンドヌクレアーゼ消化 によって生成する接着末端を初めに平滑末端に変換することが必要になることも ある。末端を平滑にするために、ＤＮＡを、適当な緩衝液中、４種のデオキシヌ クレオチド三リン酸の存在下に１０単位のＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウフラ グメント（フレノウ）を用いて１５°Ｃで少なくとも１５分間処理する。次いで 、このＤＮＡのフェノール−クロロホルム抽出とエタノール沈澱により精製する 。

ＤＮＡゲル電気泳動を用いて、切断したＤＮＡフラグメントをサイズ分離し、選 択することができる。アガロースまたはポリアクリルアミドマトリックスのどち らかによりＤＮＡを電気泳動することができる。マトリックスの選択は、分離し ようとするＤＮＡフラグメントのサイズに依存するであろう。電気泳動の後、５ ａＩＩｌｂｒｏｏｋら（上記）のセクション６．３０〜６．３３の記載のように 、電気溶離によって、または、低溶融アガロースをマトリックスとして使用した ときにはアガロースの溶融とそれからのＤＮＡの抽出によって、ＤＮＡをマトリ ・ノクスから抽出する。

共に連結しようとするＤＮＡフラグメント（連結しようとするそれぞれの７ラグ メントの末端が適合するように適切な制限酵素により予め消化）を、はぼ等しい 量て溶液に入れる。この溶液は、ＡＴＰ、リガーゼ緩衝液およびリガーゼ、例え ば０．５μｇのＤＮＡあたり約１０単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼをも含んでいる であろう。ＤＮＡフラグメントをベクター中に連結するときには、最初にこのベ クターを適当な制限エンドヌクレアーゼ（群）で切断することによって直線化す る。

次いで、この直線化したベクターをアルカリホスファターゼまたはウシ腸ホスフ ァターゼで処理する。このホスファターゼ処理は連結工程中のベクターの自己連 結を防止する。

連結の後、外来遺伝子が挿入されているベクターを適当な宿主細胞に導入する。

原核生物が本発明に好ましい宿主細胞である。適当な原核性宿主細胞には、大腸 菌株ＪＭ１０１、大腸菌に１２株２９４（ＡＴＣＣＮｏ、　３１．４４６）、大 腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣＮｏ、　２７．３２５）、大腸菌Ｘ　１７７６　（ ＡＴＣＣＮｏ、　３１．５３７）、大腸菌ＸＬ−ＩＢｌｕｅ（ｓｔｒａｔａｇｅ ｎｅ）、および大腸菌Ｂが含まれるが、大腸菌の他の多数の株（例えば、ＨＢ１ ０ＬＮＭ５２２、ＮＭ５３８、ＮＭ５３９）、ならびに他の多数の原核生物の属 および種も同様に用いることができる。上に挙げた大腸菌株に加えて、バとして 使用することができる。

原核細胞の形質転換は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）のセクション１．８２に記 載の塩化カル／ラム法を用いて容易に達成される。別法によれば、電気穿孔法［ Ｎｅｕｍａｎｎら。

ＥＭＢＯＪ、　１：　８４１　（１９８２）］を用いてこれら細胞を形質転換す ることができる。通常はテトラサイクリン（Ｌｅｔ）またはアンピシリン（ａｍ ｐ）などの抗生物質上で増殖させることによって、形質転換した細胞を選択する （形質転換細胞は、ベクター上のＬｅｔおよび／またはａｍｐｉ性遺伝子の存在 によりこれら抗生物質に対して耐性になっている）。

形質転換細胞の選択の後、これら細胞を培養増殖させ、次いでプラスミドＤＮＡ （または、外来遺伝子が挿入された他のベクター）を単離する。プラスミドＤＮ Ａは当分野で既知の方法を用いて単離することができる。２つの適当な方法は、 Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）のセクション１．２５〜１．３３に記載されている 小スケールのＤＮＡ調製および大スケールのＤＮＡ調製である。単離したＤＮＡ は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）のセクション１，４０に記載されている方法の ような当分野で既知の方法によって精製することができる。次いで、この精製し たプラスミドＤＮＡを、制限マツピングおよび／またはＤＮＡ配列決定によって 分析する。通常、ＤＮＡ本発明は、転写中に融合タンパク質が生成するように、 所望のポリペプチドをコードしている遺伝子（遺伝子ｌ）を第２の遺伝子（遺伝 子２）に融合させることを意図している。通常、遺伝子２はファージのコートタ ンパク質遺伝子であり、ファージＭ１３の遺伝子Ｉ１１コートタンパク質または そのフラグメントであるのが好ましい。遺伝子Ｉおよび２の融合は、遺伝子１を 含むプラスミド上の特定の部位に遺伝子２を挿入することによって、または遺伝 子２を含むプラスミド上の特定の部位に遺伝子１を挿入することによって達成す ることができる。

プラスミド中への遺伝子の挿入は、遺伝子を挿入しようとする正確な位置におい てプラスミドが切断されることを必要とする。即ち、この位置に制限エンドヌク レアーゼ部位が存在していなければならない（制限エンドヌクレアーゼ消化中に プラスミドが１カ所でのみ切断されるように唯一の部位であるのが好ましい）。

上記のようにプラスミドを消化し、ホスファターゼ処理し、精製する。次いで、 ２つのＤＮＡを共に連結することによって、この直線化したプラスミドに遺伝子 を挿入する。プラスミドの末端が挿入しようとする遺伝子の末端に適合するとき に、連結を達成することができる。制限酵素を用いてプラスミドを切断し、挿入 すべき遺伝子を単離するときには（平滑末端または適合性の接着末端を創製する ）、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）のセクション１．６８の記載のように、バクテ リオファージＴ４　ＤＮＡリガーゼなどのりガーゼを用い、ＡＴＰおよびリガー ゼ緩衝液の存在下に混合物を１６℃で１〜４時間インキュベートすることによっ て、ＤＮＡを直接−緒に連結することができる。末端が適合性ではないときには 、最初にこれらを、ＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウフラグメントあるいはバク テリオファージＴ４　ＤＮＡポリメラーゼ（これらは、消化されたＤＮＡの突出 １本鎖末端を充填するために４種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸を必要と する）の使用によって平滑にしなければならない。別法によれば、これら末端を 、ヌクレアーゼｓ１あるいは緑豆ヌクレアーゼ（これらは、ＤＮＡの突出１本鎖 を後退切断することによって機能する）などのヌクレアーゼを用いて平滑にする ことができる。次いで、ＤＮＡを上記のりガーゼを用いて連結する。ある場合に は、暗号領域の読み枠が変化するので、挿入すべき遺伝子の末端を平滑にするこ とができないこともある。この問題を克服するために、オリゴヌクレオチドリン カーを用いてもよい。

このリンカ−は、プラスミドと挿入すべき遺伝子を接続する橋となる。これらリ ンカ−は、常法を用いて２本鎖または１本鎖ＤＮＡとして合成により調製するこ とができる。これらリンカ−は、挿入すべき遺伝子の末端に適合する一方の末端 を有しており、上記の連結法を用いて初めにこの遺伝子に連結する。リンカ−の 他の末端は、連結用のプラスミドに適合するように設計されている。リンカ−を 設計する際には、挿入すべき遺伝子の読み枠またはプラスミド上に含まれる遺伝 子の読み枠を破壊しないように注意しなければならない。ある場合には、これら がアミノ酸の一部をコードするように、または１またはそれ以上のアミノ酸をコ ードするようにリンカ−を設計することが必要になることもある。

遺伝子１と遺伝子２の間に終止コドンをコードしているＤＮＡを挿入することも できる。このような終止コドンはＵＡＧ（アンバー）、ｔＪＡＡ（オーカー）お よびＵＧＡ（オベル）である［Ｄａｖｉｓら、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　 Ｈａｒｐｅｒ　＆　Ｒｏｗ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐｐ、２３７、２４５−４ ７および２７４　（１９８０）］。野生型宿主細胞において発現される終止コド ンは、遺伝子２のタフバク質の結合していない遺伝子１のタンパク質産物の合成 の結果を与える。しかし、サプレッサー宿主細胞中での増殖は検出可能な量の融 合タンパク質の合成の結果を与える。このようなサプレッサー宿主細胞は、ｍＲ ＮＡの終止コドン位置にアミノ酸を挿入するように修飾されたｔＲＮＡを含有し ており、従って検出可能な量の融合タンパク質を産生ずる結果を与える。このよ うｃｈｎｉｑｕｅｓ　５：　３７６−３７９　（１９８７）］のように周知であ り、開示されている。任意の受け入れられている方法を用いて、このような終止 コドンを融合ポリペプチドをコードしているｌＲＮＡ中に設置することができる 。

この抑制可能なコドンを、ポリペプチドをコードしている第１の遺伝子とファー ジコートタンパク質の少なくとも一部をコードしている第２の遺伝子の間に挿入 することができる。別法によれば、この抑制可能な終止コドンを、ポリペプチド 中の最後のアミノ酸トリブレットまたはファージコートタンパク’Ｊｔ中の最初 のアミノ酸の置換によって融合部位に隣接して挿入することができる。この抑制 可能なコドンを含有しているファージミドをサプレッサー宿主細胞中で増殖させ ると、ポリペプチドとコートタンパク質を含有する融合ポリペプチドが検出可能 に産生される結果が得られる。このファージミドを非サプレッサー宿主細胞中で 増殖させると、ＵＡＧ、ＵＡＡまたはＵＧＡをコードしている挿入された抑制可 能なトリブレットのところでの終止により、ファージフートタンパク質に融合し ていないポリペプチドが実質的に合成される。非サプレッサー細胞においては、 ポリペプチドが合成され、融合したファージフートタンパク質（他の方法ではポ リペプチドを宿主細胞に固定する）が存在しないことにより宿主細胞から分泌さ れる。

■１選択した位置における遺伝子１の改変（突然変異）所望のポリペプチドをコ ードしている遺伝子ｌを、ｌまたはそれ以上の選択したコドンにおいて改変する ことができる。改変は、ポリペプチドをフードしている遺伝子中の１またはそれ 以上のコドンの置換、削除または挿入と定義される。

この改変によって、同じポリペプチドの未改変または天然の配列と比較してポリ ペプチドのアミノ酸配列が変化することになる。好ましくは、この改変は、分子 の１またはそれ以上の領域において少なくとも１個のアミノ酸を他のいずれかの アミノ酸で置換することによる。この改変は、当分野で既知の種々の方法によっ て行なうことができる。これらの方法には、オリゴヌクレオチド媒介の突然変異 誘発およびカセット突然変異誘発が含まれるが、これらに限定はされない。

八　オリゴヌクレオチド腹合の突然変異誘発オリゴヌクレオチド媒介の突然変異 誘発は、遺伝子１の置換、削除および挿入変異体を調製するのに好ましい方法で ある。この方法は、Ｚｏｌｌｅｒら［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　 １Ｇ＋　６４８７−６５０４　（［９ｇ？）］が記載しているように当分野で周 知である。簡単に説明すると、未改変または天然のＤＮＡ配列の遺伝子１を含有 するプラスミドの１本鎖形のＤＮＡ鋳型に所望の突然変異をコードしているオリ ゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることによって遺伝子１を改変する。ノ＼ イブリタイゼ−７ジンのｉ＆、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、該オリゴヌクレオ チドブライマーが導入されて遺伝子１中の選択した改変をコードしている、この 鋳型の完全な第２相補鎖を合成する。

通常、長さが少なくとも２５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを用いる。最適 オリゴヌクレオチドは、突然変異をコードしているヌクレオチド（群）の両側に 鋳型に完全に相補性である１２〜１５ヌクレオチドを有するものであろう。これ により、オリゴヌクレオチドが１本鎖ＤＮＡ鋳型分子に適切に／＼イブリダイズ することが確実になる。このオリゴヌクレオチドは、当分野で既知の方法、例え ばＣｒｅａら［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７５ ：　５７６５　（１９７８）］が記載している方法を用いて容易に合成される。

このＤＮＡ鋳型は、バタテリオファー７Ｍ１３ベクター（市販品から入手可能な Ｍ１３ｃＡｐ１８およびＭＩ３ｍｐ１９ベクターが適当である）から導かれるベ クター、またはＶｅｉｒａら［Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、＋５３：　３　（１ ９８７）］が記載しているような一本鎖ファージ復製起点を念何するベクターに よってのみ得ることができる。即ち、突然変異を行なうべきＤＮＡは、１本鎖の 鋳型を創製するために、これらベクターのいずれかに挿入しなければならない。

１本鎖鋳型の調製はＳａｍｂｒｏｏｋら（上記）のセク／ＩＩン４．２１〜４． ４１に記載されている。

天然のＤＮＡ配列を改変するために、このオリゴヌクレオチドを適当なノ＼イブ リタイセーンヨン条件のもとて一本鎖の鋳型と／１イブリタイズさせる。次いで 、ＤＮＡ重合酵素、通常はＤＮＡポリメラーゼ１のフレノウフラグメントを加え 、このオリゴヌクレオチドを合成のためのプライマーとして用いて鋳型の相補鎖 を合成する。このようにして、ＤＮＡの一方の鎖が遺伝子１の突然変異形をコー ドしており、他方の鎖（最初の鋳型）が遺伝子１の天然の未改変配列をコードし ているヘテロ２本鎖分子が形成される。次いで、このへテロ２本鎖分子を適当な 宿主細胞、通常は大腸菌ＪＭＩＯＩなどの原核生物に導入する。この細胞を増殖 させた後、アガロースプレートにブレーティングし、３２−リン酸で放射標識し たオリゴヌクレオチドブライマーを用いてスクリーニングして、突然変異したＤ ＮＡを含有する細菌コロニーを同定する。

すぐ上に記載した方法を、プラスミドの両方の鎖が突然変異（群）を含むヘテロ ２本鎖分子が創製されるように修飾することができる。この修飾は次のようであ る。１本鎖のオリゴヌクレオチドを上記のように１本鎖鋳型にアニールさせる。

３種のデオキシリボヌクレオチド、即ちデオキシリボアデノ７ン（ｄＡＴＰ）、 デオキシリボグアノシン（ｄＧＴＰ）およびデオキシリボチミジン（ｄＴＴＰ） の混合物を、ｄＣＴ　Ｐ　−（ａＳ　）と呼ばれる修飾されたチオーデオキ／リ ボ／ト／ン（＾ｍｅｒｓｈａｍから入手することができる）と混合する。この混 合物を鋳型−オリゴヌクレオチドのコンプレックスに加える。この混合物にＤＮ Ａポリメラーゼを加えると、突然変異した塩基を除いて鋳型と同一のＤＮＡ鎖が 創製される。さらに、この新規なりＮＡ鎖はｄＣＴＰの代わりにｄＣＴ　Ｐ　− （ａＳ　）を含有しており、これがこの鎖を制限エンドヌクレアーゼ消化から保 護するように働く。ヘテロ２本鎖の鋳型鎖に適当な制限酵素でニックを入れた後 、この鋳型鎖を、突然変異すべき部位（群）を含む領域を越えてＥＸＯＩＩ＋ヌ クレアーゼまたは別の適当なヌクレアーゼで消化することができる。次いで、こ の反応を停止させて一部だけが１本鎖である分子を残す。次いで、４種すべての デオキシリボヌクレオチド三リン酸、ＡＴＰおよびＤＮＡリガーゼの存在下にＤ ＮＡポリメラーゼを用いて、完全なりＮＡホモ２本鎖を形成させる。次いで、こ のホモ２本鎖分子を、上記のように大腸菌ＪＭＩＯＩなどの適当な宿主細胞に導 入することができる。

■を越える置換すべきアミノ酸を有する突然変異体は、いくつかの方法のいずれ かにより創製することができる。これらアミノ酸がポリペプチド鎖中に互いに近 接して存在しているときには、所望のアミノ酸置換のすべてをコードしている１ つのオリゴヌクレオチドを用いて同時に突然変異させることができる。しかし、 アミノ酸が互いにある程度の距離を置いて存在しているときには（約１０以上の アミノ酸によって隔てられている）、所望の変化のすべてをコードしている単一 のオリゴヌクレオチドを創製するのは比較的困難である。これに代えて、２種類 の異なる方法のいずれかを用いることができる。

第１の方法においては、独立したオリゴヌクレオチドを置換すべきアミノ酸のそ れぞれに対して創製する。次いで、これらオリゴヌクレオチドを１本鎖鋳型ＤＮ Ａに同時にアニールさせると、この鋳型から合成される第２のＤＮＡ鎖は所望の アミノ酸置換のすべてをコードしているであろう。この第１のラウンドは単一突 然変異について説明したものと同じである。即ち、野生型ＤＮＡを鋳型に用い、 第１の所望のアミノ酸置換（群）をコードしているオリゴヌクレオチドをこの鋳 型にアニールさせ、次いでヘテロ２本鎖ＤＮＡ分子を創製する。突然変異誘発の 第２ラウンドは、第１ラウンドの突然変異誘発で得られた突然変異ＤＮＡを鋳型 として用いる。即ち、この鋳型は既にｌまたはそれ以上の突然変異を含んでいる 。

次いで、別の所望のアミノ酸置換（群）をコードしているオリゴヌクレオチドを この鋳型にアニールさせると、得られるＤＮＡ鎖は第１および第２ラウンドの突 然変異誘発の両方に由来する突然変異をコードしている。この得られたＤＮＡを 、第３ラウンドの突然変異誘発における鋳型な、どとして用いることができる。

Ｂ、左！二上未然亥男誘進 この方法も遺伝子ｌの置換、削除および挿入変異体を調製するのに好ましい方法 である。この方法は、Ｙｅｌｌｓら［Ｇｅｎｅ　３４：　３１５　（１９８５） ］の記載の方法に基づいている。出発材料は、突然変異させようとする遺伝子で ある遺伝子１を含有するプラスミド（または、他のベクター〉である。突然変異 させようとする遺伝子１中のコドンは決定されている。決定された突然変異部位 （群）の両側に唯一の制限エンドヌクレアーゼ部位が存在していなければならな い。このような制限部位が存在していなければ、上記のオリゴヌクレオチド媒介 の突然変異誘発法を用、いてこれら部位を創製し、遺伝子ｌ中の適当な位置に導 入することができる。プラスミド中に制限部位を導入した後、プラスミドをこれ ら部位のところで切断して直線化する。これら制限部位の間のＤＮＡ配列をコー ドしており、そして所望の突然変異を含んでいる２本鎖オリゴヌクレオチドを常 法により合成する。この２本の鎖は別々に合成し、次いで常法により一緒にハイ ブリダイズさせる。この２本鎖のオリゴヌクレオチドをカセットと呼ぶ。このカ セットは直線化したプラスミドの両末端に適合する３°および５゛末端を有する ように設計して、これをプラスミドに直接連結できるようにする。これにより、 このプラスミドは遺伝子１の突然変異ＤＮＡ配列を含むことになる。

（以下、余白） ｖｌ、所望のタンパク質をコードしているＤＮＡの調製別の態様においては、本 発明は１またはそれ以上のサブユニットを含有する所望のタンパク質の変異体の 製造を意図するものである。通常、それぞれのサブユニットは別の遺伝子によっ てフードされている。それぞれのサブユニットをコードしているそれぞれの遺伝 子は、当分野で既知の方法によって得ることができる（例えば、セクション！１ を参照）。ある場合には、セクシ９ン１！に記載した任意の方法から選択した独 立した複数の方法を用いて、種々のサブユニットをコードしている遺伝子を得る のが必要であることもある。

所望のタンパク質が１を越えるサブユニットを含有している複製可能な発現ベク ターを構築するときには、すへてのサブユニットを、通常はサブユニットをコー ドしているＤＮＡの５゛側に位置する同一のプロモーターによって調節するか、 または各サブユニットを、ベクター中で適切に配向された独立したプロモーター であってそれぞれのプロモーターが調節しようとするＤＮＡに機能的に連結され たプロモーターによって調節することもできる。プロモーターの選択は上記セク ション１１１の記載のように行なう。

複数サブユニットを存する所望のタンパク質をコードしているＤＮＡを含有する 複製可能な発現ベクターを構築する際には図１０を参照すべきであり、この図に は説明のためにベクターが図示されており、抗体フラグメントの各サブユニット をコードしているＤＮＡが示されている。この図は、通常、所望のタンパク質の サブユニｙｌ−の１つがＭｌ　３遺伝子ＩＩ＋などのファージコートタンパク質 に融合されることを示している。通常、この遺伝子融合体はそれ自体のシグナル 配列を含有しているであろう。別の遺伝子が他のサブユニットまたはサブユニッ ト群をコードしており、各サブユニットが通常はそれ自体のシグナル配列を有し ていることがわかる。また、図１０は、単一のプロモーターが両サブユニットの 発現を調節しうることを示している。これとは異なり、各サブユニットが異なる プロモーターによって独立して調節されていてもよい。所望のタンパク質すブユ ニ／トーファージフートタンパク質の融合構築物は、上記セクション１ｖの記載 のように調製することができる。

所望の複数サブユニットタンパク質の一部の変異体を構築するときには、ベクタ ー中の各サブユニットをコードしているＤＮＡを、各サブユニット中の１または それ以上の位置において突然変異させてもよい。複数サブユニットの抗体変異体 が構築されるときには、好ましい突然変異誘発部位は、軽鎖、重鎮または両鎖の いずれかの相補性決定領域（ＣＤＲ）中に位置するアミノ酸残基をコードしてい るコドンに一致する。通常、このＣＤＲは超可変領域と呼ばれている。所望のタ ンパク質の各サブユニットをコードしているＤＮＡを突然変異させる方法は、実 質的に上記セクションＶの記載のように実施する。

ｖｌｌ、標的分子の調製およびファージミドとの結合受容体などの標的タンパク 質は、当分野で既知の方法により、天然供給源から単離するかまたは組換え法に よって調製することができる。例示すると、糖タンパク質ホルモン受容体はＭｃ Ｆａｒｌａｎｄら［５ｃｉｅｎｃｅ　２４５：　４９４−４９９　（１９８９） ］が記載している方法によって調製することができ、大腸菌中で発現させた非グ リコジル化型はＦｕｈら［Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６５：　３１１１−３ １１５　（１９９０）］が記載している。他の受容体は常法によって調製するこ とができる。

精製した標的タンパク質を、アガロースビーズ、アクリルアミドピーズ、ガラス ピーズ、セルロース、種々のアクリル系コポリマー、メタクリル酸ヒドロキシア ルキル、ポリアクリル酸およびポリメタクリル酸コポリマー、ナイロン、中性お よびイオン性担体などの適当なマトリックスに結合させることができる。マトリ ックスへの標的タンパク質の結合は、文献［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ ｏｌｏｇｙ　４４　（１９７６）］に記載の方法によって、または当分野で既知 の他の手段によって行なうことができる。

マトリックスに標的タンパク質を結合させた後、固定化した標的を、ファージミ ド粒子の少なくとも一部を固定化標的と結合させるに適切な条件下で、ファージ ミド粒子のライブラリーと接触させる。通常、ｐＨ，イオン強度、温度などを含 む条件は生理学的条件に類似したものであろう。

固定化標的に対して高親和性を有する結合ファージミド粒子（「結合体」）を、 洗浄により低親和性の粒子（従って、標的に結合しない粒子）から分離する。結 合体は種々の方法によって固定化標的から解離させることができる。これら方法 には、野生型リガンド、ｐＨおよび／またはイオン強度の変更を用いる競合解離 、ならびに当分野で既知の方法が含まれる。

適当な宿主細胞を結合体とへルバーファージに感染させ、この宿主細胞をファー ジミド粒子の増幅に適切な条件下で培養する。次いで、ファージミド粒子を集め 、標的分子に対して所望の親和性を有する結合体が選択されるまで選択工程を１ またはそれ以上の回数繰り返す。

所望により、ファージミド粒子のライブラリーを、■を越える固定化標的に連続 的に接触させて特定の標的に対する選択性を改善することができる。例えば、ｈ ＧＨなどのリガンドはｌを越える天然受容体を有していることが多い。このｈＧ Ｈの場合には、成長ホルモン受容体とプロラクチン受容体の両方がｈＧＨリガン ドに結合する。ｈＧＨの選択性を、プロラクチン受容体に対する以上に成長ホル モン受容体に対して改善するのが望ましいであろう。これは、初めにファージミ ド粒子ライブラリーを固定化プロラクチン受容体と接触させ、これを低親和性（ 即ち、野生型ｈＧＨよりも低い）でプロラクチン受容体について溶離し、次いで この低親和性プロラクチン「結合体」または非結合体を固定化成長ホルモン受容 体と接触させ、高親和性成長ホルモン受容体結合体を選択することによって達成 することができる。この場合、プロラクチン受容体に対して低親和性を有するｈ ＧＨの突然変異体は、成長ホルモン受容体に対する親和性か野生型ｈＧＨの親和 性よりも若干低いときであっても、治療用途を有しているであろう。これと同じ 方法を用いて、特定ホルモンまたはタンパク質の、そのクリアランス受容体を凌 ぐ１次機能受容体に対する選択性を改善することができる。

本発明の別の包様においては、改良された基質アミノ酸配列を得ることができる 。これらは、タンパク質リンカ−のためのより良好な「切断部位」を作成する際 に、またはより良好なプロテアーゼ２！實／阻害物質のために有用であろう。こ の態様においては、固定化しうる分子（例えば、ｈＧＨ−受容体、ピオチン−ア ビジン、またはマトリ、クスと共有結合しうる分子）をリンカ−によって遺伝子 ＩＩＩに融合させる。このり／カーは、好ましくは長さが３〜１ｏアミノ酸であ り、プロテアーゼの基質として作用する。ファージミドを上記のように構築する （ここで、リンカ−領域をコードしているＤＮＡにランダム突然変異を行なって 、結合部位に異なるアミノ酸配列を何するファージミド粒子のランダムライブラ リーを調製する）。次いで、このファージミド粒子のライブラリーをマトリック ス上に固定化し、所望のプロテアーゼに暴露する。所望のプロテアーゼのライナ ー領域に好ましいかまたはより良好な基質アミノ酸配列を有するファージミド粒 子が溶離され、好ましいリンカ−をフードしているファージミド粒子の豊富化さ れたプールが最初に得られるであろう。次いで、さらに数回これらファージミド 粒子を反復処理し、フンセンス配列（群）をコードしている粒子の豊富化された プールを得る（実施例Ｘｌｌ＋およびＸＩＶを参照）。

Ｖｌｌ＋、成長ホルモン変異体および使用方法ｈＧＨのクローン化遺伝子がＥｓ ｃｈｅｒｉｃｈａ　ｃｏｌａにおいて分泌型で発現され［Ｃｈａｎｇ。

ＣＮ６ら、　Ｇｅｎｅ　５５：　１８９　（１９８７）］、そのＤＮＡおよびア ミノ酸配列が報告されている＋ＬＧｏｅｄｄｅｌら、　Ｎａｔｕｒｅ　２８１： 　５４４　（１９７９）；　Ｇｒａｙら、　Ｇｅｎｅ　３９：　２４７　（１９ ８５）n。本発 明は、ファージミド選択法を用いて得た新規なりＧＨ変異体を記載するものであ る。１０，１４．１８．２１，１６７．１７１．１７２．１７４．１７５．１７ ６．１７８および１７９位に置換を含むヒト成長ホルモン変異体が記載されてい る。比較的高い結合親和性を有する変異体を表Ｖｌ＋、　Ｘｌｌ＋およびＸＩＶ に記載している。これら変異体を記載するためのアミノ酸命名法は後記する。成 長ホルモン変異体は、正規の成長ホルモンと同じように投与および製剤化してよ い。本発明の成長ホルモン変異体は、天然またはｍｅｔｈＧＨを発現しうる任意 の組換え系において発現させることができる。

治療用投与のためのｈＧＨの製剤は、所望の精製度のｈＧＨを所望により生理学 憇、第１６版＋　０ｓｏ１．Ａ編（１９８０）］と混合することにより、凍結乾 燥ケーキまたは水溶液の形態で保存用に調製される。許容しうる担体、賦形剤ま たは安定剤は使用される用量および濃度で受容対象に対して非毒性であり、これ らには、緩衝液（例えば、リン酸、クエン酸、および他の有機酸の緩衝液）；抗 酸化剤（アスコルビン酸を含む）、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド ：タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、あるいは免疫グロブリン） ；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）二アミノ酸（例えば、グリ シノ、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、あるいはリジン）；単糖類、二 種類およびその他の炭水化物（グルコース、マンノースあるいはデキストリンを 含む）；キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）；二価の金属イオン（例えば、亜鉛 、コバルトあるいは銅）：糖アルコール（例えば、マンニトールあるいはソルビ トール）、塩を形成する対イオン（例えば、ナトリウム）、および／またはノニ オン系界面活性化剤［例えば、ツイーン、ブルロニ、りあるいはポリエチレング リコール（ＰＥＧ）］が含まれる。本発明の製剤は、薬学的に許容しうる緩衝剤 、アミノ酸、増量剤、および／またはノニオン系界面活性剤をさらに含膏してい てもよい。これらには、例えば緩衝液、キレート化剤、抗酸化剤、保存剤、共溶 媒などが含まれる。これらの具体例には、トリメチルアマイン塩（「トリス緩衝 液」）、および二ナトリウム・ニブテートが含まれるであろう。本発明のファー ジミドを用いてファージタンパク質を含まない多量のｈＧＨ変異体を製造するこ とができる。融合体の遺伝子１１１部分を含まないｈＧＨ変異体を発現させるた めに、単にｐｓＯ６４３および誘導体を１６０９などの非すプレッサー株中で増 殖させることかできる。この場合には、アンバーコドン（ＴＡＧ）が翻訳の終止 を導き、独立したＤＮＡの構築を必要とすることなく遊離のホルモ／が得られる 。ｈＧＨ変異体は宿主から分泌され、これを培養培地から単離することができる 。

８つのｈＧＨアミノ酸ＦｉＯ，Ｍ１４、Ｒ１８、Ｒ２１，Ｒ１６７、Ｄ１７１、 Ｔ１７５および１１７９のうちの１またはそれ以上のアミノ酸を、ここに示した 天然ｈＧＨ中の該位置に見い出されるアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸に置換 することができる。即ち、ここに示したアミノ酸Ｆ　ｔｏ、Ｍ１４、Ｒ１８、Ｒ ２１、Ｒ１６７、Ｄ１７１．Ｔ１７５および１１７９のうちの１．２．３．４． ５．６．７、または８個全部を、以下に挙げる２０アミノ酸のうちの他の１９ア ミノ酸のいずれかで置換することができる。好ましい態様においては、ここに挙 げた８個全部のアミノ酸を別のアミノ酸で置換する。置換されるべき最も好まし い８個のアミノ酸は、実施例Ｘｌｌ中の表ＸＩｖに示す。

アミノ酸の命名 １文字のｈＧＨ変異体の命名法は、削除されるｈＧＨアミノ酸（例えば、グルタ メート１７９）を最初に記し、次に挿入されるアミノ酸（例えば、セリン）を記 し、結果として（Ｅ１７９５Ｓ）となる。

実施例 さらに説明することなく、当業者なら以上の説明および例示の実施例を用いて本 発明を完全に実施および利用することができると考えられる。即ち、以下の具体 的な実施例は本発明の好ましい態様を示すものであり、いかなる意味においても 開示の残部を限定するものとみなすべきではない。

実施例１　プラスミドの構築およびｈＧＨ−ファージミド粒子の調製プラスミド ｐｈＧＨ−Ｍ　１３ｇ１１１（図１）を、Ｍ１３ＫＯ７’お、、及びｈＧＨ産生 プラスミドｐＢ　Ｏ４７３［Ｃｕｎｎｉｎｇｈａ＋＊、　Ｂ、　Ｃ，ら、５ｃｉ ｅｎｃｅ　２４３：　１３３０−１３３６　（１９８９）］から構築した。合成 オリゴヌクレオチド。

５゛−＾ＧＣ−ＴＧＴ−ＧＧＣ−ＴＴＣ−ＧＧＧ−ＣＣＣ−ＴＴ＾−ＧＣＡ−Ｔ ＴＴ−ＡＡＴ−ＧＣＧ−ＧＴＡ−４’を用いて、ｐＢＯ４７３中のｈＧＨの最後 のＰｈｅ１９１コドンの後に唯一のＡｐａｌ制限部位（下線部）を導入した。オ リゴヌクレオチド：５°−ＴＴＣ−＾Ｃ＾−＾＾Ｃ−Ｇ＾＾−ＧＧＧ−ＣＣＣ− Ｃ７人−ＡＴＴ−ＡＡ＾−ＧＣＣ−ＡＧＡ−３’を用いて、唯一のＡｐａ＋制限 部位（最初の下線部）、およびＧｌｕ１９７−アンバー停止コドン（２番目の下 線部）をＭ１３ＫＯ７遺伝子ＩＩＩ中に導入した。オリゴヌにより、遺伝子Ｉ１ １暗号配列の３′末端の後に唯一のＮｈｅＩ部位（下線部）を導入する。二重に 突然変異させたＭ１３ＫＯ７の遺伝子ＩＩ＋由来の得られた６５０塩基対（ｂｐ ）のＡｐａｌ−Ｎｈｅ１７ラグメントを、ｐＢ○４７３の大きいＡｐａｌ　−Ｎ ｈｅｌフラグメント中にクローン化してプラスミドｐｓＯ１３２を創製した。こ れにより、Ａｐａ１部位からフードされるグリシン残基を挿入しつつｈＧＨのカ ルボキシ末端（Ｐｈｅ１９１）を遺伝子Ｉ１１タンパク質のＰｒｏ１９８残基に 融合させ、この融合タンパク質を大腸菌アルカリホスファターゼ（ｐｈｏＡ）プ ロモーターおよびｓｔｌ［分泌シグナル配列［Ｃｈａｎｇ、　Ｃ，Ｎら、　Ｇｅ ｎｅ　５５：　１８９−１９６　（１９８７）］の支配下に置いた。

豊富培地中での融合タンパク質の誘導可能な発現のために、このｐｈｏＡブロモ −クーをｌａｃプロモーターおよびオペレーターで置換した。ｌａｃプロモータ ー、オペレーター、およびＣａｐ結合部位を含有する１３８ｂｐのＥｃｏＲｌ− ＸｂａＩフラグメントを、オリゴヌクレオチド。

５°−ＣＡＣＧＡＣＡＧＡＡＴＴＣＣＣＧＡＣＴＧＧＡＡＡ−３’　および５’ 　−ＣＴＧＴＴＴＣＴＡＧＡＧＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡ−３f にれらは、所望のｌａｃ配列と境界を接し、ＥｃｏＲｌおよびＸｂａｌ制限部位 （下線部）を導入する］ を用いるプラスミドｐＵｃ１１９のＰＣＲによって調製した。このＩａｃフラグ メントをゲル精製し、ｐｓＯ１３２の大きいＥｃｏＲＩ−Ｘｂａｌフラグメント に連結してプラスミドｐｈＧＨ−Ｍ１３ｇ１ｌｌを創製した。すべての加工した ＤＮＡ連結点の配列はジデオキシ配列決定法によって確認した［Ｓａｎｇｅｒ、 　Ｐ、ら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ｔｌｓＡ　７４：　５４ ６３−５４６７　（１９７？）］。Ｒ６４Ａ変異ｈＧＨファージミドは次のよう にして構築した。即ち、Ａｒｇ６４のＡｌａ置換（Ｒ６４Ａ）［Ｃｕｎｎｉｎｇ ｈａｍ、　Ｂ、　Ｃ，、ｔｅｌｌｓ＋Ｊ、Ａ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４４：　１ ０８１−１０８５　（１９８９）］をコードしているｈＧ　Ｈ［Ｃｕｎｎｉｎｇ ｈａｍら（上記）］のＮｓｉ　Ｉ−８ｇｌｌｌ突然変異フラグメントを、ｐｈＧ 　Ｈ−Ｍ　１３　ｇｉｌ＋プラスミド（図１）中の対応する制限部位の間にクロ ーン化して野生型ｈＧＨ配列を置換した。このＲ６４ＡｈＧＨフア一ジミド粒子 を、野生型ｈＧＨ−ファージミドについて以下に記載したようにして増殖させ、 滴定した。

プラスミドを大腸菌の雄性株（ＪＭＩＯｌ）中に導入し、カルベニシリン・プレ ート上で選択した。単一の形質転換体を２ＹＴ培地（２ｍｌ）中にて３７℃で４ 時間増殖させ、Ｍ１３ＫＯ７ヘルバーフアージ（５０μｍ）に感染させた。この 感染培養物を２ＹＴ（３０ｍｌ）に希釈し、−晩培養し、ポリエチレングリコー ルによる沈澱によってファージミド粒子を集めた［Ｖｉｅｒｒａ、Ｊ、、　Ｍｅ ｓｓｉｎｇ＋Ｊ、＋　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１５３： 　３−１１　（１９８７）］。通常、７フ一ジミド粒子の力価は２〜５　ｘ　１ ０　”ｃｆｕ／ｍｌの範囲内であった。この粒子をＣｓＣ１密度遠心［Ｄａｙ、 Ｌ、Ａ、、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　３９：　２６５−２７７　（１９６９） ］によって均質になるまで精製し、ピリオンに未結合のすべての融合タンパク質 を除去した。

実施例Ｉ＋　融合ファージ上のｈＧＨの免疫化学分析ｈＧＨに対するウサギポリ クローナル抗体をプロティンＡを用いて精製し、５０＋Ｍ炭酸ナトリウム緩衝０ ．（ｐＨ１０）中、２μｓ／ｍｌの濃度にて４°Ｃで１６〜２０時間、微量滴定 プレート（Ｎｕｎｃ）に彼覆した。０，０５％ツイーン２０を含むＰＢＳ中で洗 浄した後、ｈＧＨまたはｈＧＨ−ファージミド粒子を緩衝液Ａ［５０ｍＭトリス （ｐＨ７，５）、５０ｎ＋Ｍ　Ｎａ１ｌ、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、５ｍｇ／ｍｌウシ 血清アルブミン、および０．０５％ツイーン２０］中で２．０〜０．００２ｎＭ に連続希釈した。

室温（「ｔ）で２時間の後、このプレートを十分に洗浄し、示したＭ　ａｂ［Ｃ ｕｎｒ＋　ｉｎｇｈａｍら（上記）］を］構で２時間、緩衝液Ａ中１μｇ／ｍｌ で加えた。洗浄の後、西洋ワサビペルオキシダーゼーコンジュゲート化したヤギ 抗−マウスＩｇＧ抗体をｒｔで１時間結合させた。最後の洗浄の後、ベルオキ／ ダーゼ活性を、基質０−フェニレンジアミノを用いて検定した。

実施例ＩＩＩ　ｈＧＨ結合結合タンパクイリアクリルアミドビーズへの結合およ び結合の豊富化 オキシランポリアクリルアミドビーズ（Ｓｉｇｍａ）を、２３７位に部位指向性 突然変異誘発により導入した余分のシスティン残基（ｈＧ　Ｈの結合に悪影響を 及ぼさない；　Ｊ、　ｔｅｌ　Ｉｓ　未公表）を含むｈＧＨ受容体の精製した細 胞外ドメイン（ｈＧ　Ｈｂｐ）　［Ｆｕｈ、　Ｇ、ら、Ｊ、Ｂｉ硅Ｃｈｃｍ、　 ２６５：　３１１１−３１１５　（１９９０）コとコンジュゲート化した。この ｈＧ　ｔｌ　ｂｐは、供給元の推奨のように、樹脂に対する［”’　Ｉ　］ｈＧ 　Ｈの結合によって測定したときに１７ｐモルｈＧＨｂｐ／ｍｇ乾燥オキシラン ビーズの量となるようにフノンユゲート化した。次いで、すべての未反応オキシ ラン基をＢＳＡおよびトリスてプロ、りした。ファージミド粒子の非特異的結合 の対照として、ＢＳＡを同様にビーズに結合させた。吸着および洗浄のための緩 衝液は、１０１１１Ｍトリス−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、５０ ｍＭ　ＮａＣｌ、１　ｍｇ／ｍｌ　Ｂ　Ｓ　Ａおよび０゜０２％ツイーン２０を 含有していた。溶離緩衝液は、洗浄緩衝液に加えて２００ｎＭｈＧＨまたは０． ２Ｍグリシン（ｐＨ２，１）を含有していた。親ファージＭ１３に○７をｈＧＨ ファージミド粒子とばぼ３０００　：　１（最初の混合物）の比で混合し、５０ μｍ容世中、室温でいずれかの吸収剤（５μｍづつ：０．２ｍｇのアクリルアミ ドビーズ）と８〜１２時間混合した。このビーズを遠心によってベレ・ｌト化し 、上清を注意深く除去した。このビーズを洗浄緩衝液（２００μＬ）に再懸濁し 、室温で４時間混合した（洗浄液ｌ）。２回目の洗浄の後（洗浄液２）、このビ ーズを２回、それぞれ２００　ｎＭのｈＧＨで６〜１０時間溶離した（溶出液ｌ 、溶出液２）。

最後の溶離はグリシン緩衝液（ｐＨ２，１）を用いて４時間行ない、残存するｈ ＧＨファーンミド粒子を除去した（溶出液３）。それぞれの分画を２ＹＴ培地で 適切に希釈し、新鮮なＪＭＩＯＩと混合し、３７℃で５分間インキュベートし、 そして２ＹＴ軟寒天（３ＩＩｌｌ）を用いてＬＢまたはＬＢカルベニシリンプレ ートにブレーティングした。

実施例ＩＶ　遺伝子ＩＩ＋産物の混合物によるｈＧＨ−ファージミド粒子の構築 遺伝子Ｉｌ＋タンパク質は４１０残基からなり、可変リンカ−配列によって隔て られた２つのドメインに分かれている［Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ、　Ｊ、ら、　ＦＥ ＢＳ　Ｌｅｔｔ、　１３５：　１６７−１７２　（１９１１１）］。アミノ末端 ドメインは大腸菌の線毛に付着するために必要であり、一方、カルボキン末端ド メインはファージのコート（外殻）に組込まれ、適切なファージ組立てに必要で ある［、Ｃｒｉｓｓｍａｎ、Ｊｌ、、　Ｓｍ１ｔｈ＋Ｇ、Ｐ、＋　Ｖｉｒｏｌｏ ｇｙ　１３２：　４４５−４５５（１９８４）］。遺伝子ＩＩ＋のシグナル配列 およびアミノ末端ドメインを、遺伝子ＩＩ＋のカルボキシ末端ドメイン中の残基 １９８への融合により、５ｔｌｌシグナルおよび全ｈＧＨ遺伝子［Ｃｈａｎｇら （上記）］て置換した（図１）。このｈＧＨ−遺伝子Ｉ１１重合体を、ｐＢ　Ｒ ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子およびＣｏ１Ｅ１複製起点ならびにファージｆ ｌの遺伝子開領域を含むプラスミド（ｐｈＧＨ−Ｍ　１３ｇ１ｌｌ　；図１）中 のＩａｃプロモーター／オペレーターの支配下に置いた。このベクターは、カル ベニシリンによる選択によって小さなプラスミドベクターとして容易に維持する ことができ、これにより増殖のために機能的な遺伝子ＩＩ＋融合体に依存するこ とが回避される。

また、このプラスミドは、Ｍ　１３　ＫＯ７［Ｖｉｅｒａら（上記）コなどのヘ ルパーファージによる感染によってピリオン（即ち、ファージミド粒子）に効率 的にパッケージングされることができ、これによりファージ組立ての問題が回避 される。この系におけるカルベニシリン耐性に対する形質導入に基づくファージ ミドの感染性力価は、２〜５ｘｌＯ”コロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍｌに変化 した。これらのファージミド保存物におけるＭ１３ＫＯ７ヘルバーフアージの力 価は〜１０１０プラーク形成単位（ｐｆｕ）／ａｔである。

この系を用いて、遺伝子ＩＩ＋に融合した大きいタンパク質の均質発現がファー ジの生成に有害であるという以前の研究［Ｐａｒｍｌｅｙ、　５Ｌｌｉｔｈ　（ 上記）］を確認した（データは示していない）。例えば、Ｉ　ＰＴＧの添加によ るｐｈＧＨ−Ｍ　１３ｇ１ｌｌ中の１ａＣブロモ−クーの誘導により、低いファ ージミド力価が得られた。さらに、遺伝子１１１中にアンバー突然変異を含むＭ １３ＫＯ７による同時感染によって得られたファージミド粒子は、極めて低いフ ァージミド力価（＜　１０　”ｃｒｕ／ｍｌ）を与えた。我々は、ファージミド 表面に結合した複数コピーの遺伝子ＩＩＩ融合体が、固定化標的タンパク質への 融合ファージの複数点結合（「キレート作用」）を導きうるちのと考えた。従っ て、融合タンパク質のコピー数を制御するために、構成的に高レベルのｌａｃリ ブレ、サータンパク質を含有する大腸菌Ｊ　Ｍ　１０１　（ｆａｃｔ’）中でプ ラスミドを培養することによって、ｈＧＨ−遺伝子ＩＩ＋融合体の転写を制限し た。ｐｈＧＨ−Ｍ　１３ｇ１ｌｌを含有する大腸菌ＪＭＩＯＩ培養物を最高に増 殖させ、ｌａｃオペロン誘導物質（Ｉ　ＰＴＧ）の非存在下にＭ１３ＫＯ７に感 染させたくしかし、この系は柔軟性を持っており、他の遺伝子ＩＩ＋融合タンパ ク質の同時発現と平衡させることができる）。我々は、ピリオンあたりのｈＧＨ ｆｆｉの比（ＣｓＣ１勾配で精製したファージミド中のｈＧＨ免疫反応性物質に 基づく）から、約１０％の７１−ンミド粒子が１コピーのｈＧＨ遺伝子Ｉ１１融 合タンパク質を含有しているものと概算している。従って、ｈＧＨ遺伝子ＩＩ＋ 融合体を表示する融合ファージの力価は約２〜５　ｘ　Ｌ　Ｏ”／ｍｌである。

この数値は、これらを導いた培養物中の大腸菌の力価（〜１０１〜１０”／ｍｌ ）よりも相当に大きい。即ち、平均的に全大腸菌細胞は、ｈＧＨ遺伝子ＩＩ＋融 合タンパク質で装飾されたファージをｌＯ〜１００コピー生成する。

実施例Ｖ　ｈＧＨ−遺伝子ＩＩ＋融合体の構造的完全性ｈＧＨ−遺伝子ＩＩ＋フ ァー／ミドの免疫プロｙ）分析（図２）により、ｈＧＨ交差反応性物質がアガロ ースゲル中でファージミド粒子と同時移動することがわかる。

このことは、ｈＧＨがファージミド粒子に強固に結合していることを示すもので ある。このファージミド粒子からのｈＧＨ−遺伝子ＩＩ＋融合タンパク質は単一 の免疫染色されるバンドとして移動し、ｈＧＨが遺伝子ＩＩ＋に結合したときに ｈＧＨの分解がわずかしかないことを示す。約２５％のファージミド粒子が感染 性であるので、野生型遺伝子ＩＩ＋タンパク質が明らかに存在する。これは、Ｕ ｖ吸収によって評価した濃度、および同様に精製（ＣｓＣ１密度勾配法による） した野生型Ｍ１３ファージに対して行なった比感染性評価に類似する［５ｓｉｔ ｈ、　Ｇ、　Ｐ、　（上記）およびＰａｒｗｌｅｙ、　Ｓ＋ｎ１ｔｈ（上記）］ 。即ち、野生型遺伝子Ｉ１１およびｈＧＨ−遺伝子Ｉｌｌ融合タンパク質の両方 がファーンブール中に表示される。

結合選択による結果が天然タンパク質に転換するという信頼性を得るために、表 示されたｈＧＨの３次構造が維持されていることを確認するのが重要であった。

ｈＧＨに対するモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を用いて、表示されたｈＧＨ遺伝 子ＩＩ＋融合タンパク質の構造的完全性を評価した（表Ｉ）。

！＋、ｈＧ）（およびｈＧ）（ファージミド粒子への８種の異なるまたはｈＧＨ −ファージミド粒子の濃度（ｎＭ）を表す。これらの測定の標準誤差は、通常、 表示値の±３０％またはそれ以下である。詳細については原材料および方法の項 を参照。

これらＭａｂに対するｈＧ）１４二のエピトープはマツピングされており［Ｃｕ ｎｎｉｎｇｈａｍら（上記）〕、８種のＭａｂのうちの７種に対する結合はｈＧ Ｈが適切に折り畳まれることを必要とする。すべてのＭａｂのＩＣ，ｏ値は、Ｍ ａｂ５および６を除いて野生型ｈＧＨと等価であった。Ｍａｂ５および６の両方 は、遺伝子Ｉｌｌｌｌ融合タンバクイブロックされるｈＧＨのカルボキン末端の 近くに結合決定基を有していることが知られている。天然および変性ｈＧＨの両 方と反応するＭａｂ　ｌの相対ＩＣ，。

値は、立体配座的に敏感なＭａｂ２〜５．７および８と比較して変わることがな い。即ち、Ｍａｂ　ｌは、ｈＣ，１−（−遺伝子１１１融合体の濃度に対するｈ ＧＨ標準の濃度を適合させる際のあらゆる過誤の良好な内部対照として働く。

実施例Ｖｌ　受容体親和性ビーズに対する結合の豊富化これまでの研究者［Ｐａ ｒｍｌｅｙ、　Ｓｍ１ｔｈ（上記）　；　Ｓｍ１ｔｈ（上記）　；　Ｃｖｉｒｌ ａら（上記）：およびＤｅｖｌｉｎら（上記）］は、ストレプトアビジン被覆し たポリスチレン製ペトリ皿または微量滴定プレートで選別することによってファ ージを分画していた。しかし、クロマトグラフィー系は、異なる結合親和性を有 する突然変異タンパク質を表示するファージミド粒子のさらに効率的な分画を可 能にする。我々は、非多孔性のオキシランビーズ（Ｓｉｇｍａ）を選択してクロ マトグラフィー樹脂中のファージミド粒子の捕捉を回避した。さらに、これらビ ーズは小さい粒子サイズ（１μｍ）を有しており、量に対する表面積の比が最大 になる。遊離のンステイノ残基を含（ＩｆするｈＧＨ受容体の細胞外ドメイン（ ｈＧ　Ｈｂｐ）　［Ｆｕｈら（上記）］はこれらビーズに効率的に結合し、ファ ージミド粒子はラン血清アルブミンにのみ結合させたビーズに対して極めて低い 非特異的な結合を示した（表Ｉ＋）。

！＋＋、ｂｃＨｂｐ被覆したビーズに対するホルモンファージの特異的な結合に より上ｉ青ＢＳＡ　７．４ＸＩ０口　２．８Ｘ１０’　３．８Ｘ１０−’　１． １ｈＧＨｂｐ　７．６ｘｌＯ”　３．’３ｘｌＯ”　４．３ｘｌＯ−’　１．２ 洗浄液Ｉ　ＢＳＡ　１．１ｘｌＯ”　６．０ｘｌＯ＠５．５ｘｌＯ−’　１．６ ｈＧＨｂｐ　１．９ＸＩＯ”　１．７ＸＩＯ’　８．９Ｘ１０−’　２．５洗浄 液２　ＢＳＡ　５．９ＸＩＯ７２，８Ｘ１０’　４．７Ｘ１０−’　１．３ｈＧ Ｈｂｐ　４．９ｘＬＯ’　２．７ＸＬＯ”　５．５ＸＬＱ−’　１．６ｘｌＯ” 溶出液１　（ｈＧＨ）ＢＳＡ　１．１ｘｌＯ”　１．９ｘｌｏ’　１．７ｘｌＯ −３４，９ｈＧ　Ｈｂｐ　１．２ｘｌＯ”　２．１ＸＩ（＋’　１．８　５．　 ｌＸｌ０’溶出液２　（ｈＧＨ）ＢＳＡ　５．９ｘｌＯ’　１．２ｘｌＯ’　２ ．０ｘｌＯ−３５，７ｈＧ　Ｈｂｐ　５．５ｘｌＯ’　１．３ｘｌＯ”　２．４ 　６．９ｘｌＯ１′溶出液３　（ｐＨ２，１）ＢＳＡ　４．６ＸＩＯ’　２．０ ＫＩＯ３４，３ＸＩＯ−”　１２．３それぞれプラーク形成単位（ｐｆｕ）また はカルベニンジン耐性コロニー形成単位（ｃｆｕ）の数値に希釈係数を掛けるこ とによって測定した。詳細には実施例ＩＶを参照。

＊２Ｍ１３ＫＯ７のｈＧＨ−ファージミド粒子に対する比は最初の混合物におい て３０００　：　Ｉに調節した。

＊３吸収物質はＢＳＡまたはｈＧＨｂｐとフンシュゲート化した。

＊４豊富化は、各工程後のｃｒｕ／ｐｆｕ比を最初の混合物のＣｒｕ／ｐｆｕ比 で割ることによって計算した。

代表的な豊富化実験（表Ｉ＋）において、１部のｈＧＨファージミドを＞ａ、ｏ ｏ。

部のＭ１３ＫＯ７フアージとａ合した。■サイクルの結合と溶離の後、１０１′ のファージが回収され、ファージミドのＭ１３ＫＯ７フアージに対する比は２： ｌであった。即ち、１回の結合選択工程によって、＞５０００倍の豊富化が得ら れた。残存するファージミドを除去するための遊＠ｈＧＨまたは酸処理による追 加の溶離によって、さらに高い豊富化が得られた。この豊富化は、被覆ポリスチ レンブレートからのバッチ溶離を用いて５ｗ１ｔｈおよびその共同研究者が得た 豊富化に匹敵した［Ｓｇ＋ｉ　Ｌｈ、　Ｇ、　Ｐ、　（上記）およびＰａｒｍｌ ｅｙ＋　Ｓｍ１ｔｈ（上記）］。しかし、さらに少ない容量がビーズに対して用 いられている（２００μＩ　ｖｓ　６ｍ１）。ＢＳＡにのみ結合させたビーズを 用いたときには、Ｍ１３ＫＯ７を凌ぐｈＧＨファージミドの豊富化はほとんど存 在しなかった。対照ビーズに対して観察されたわずかな豊富化（ｐＨ２，１溶離 に対して〜１０倍；表２）は、ビーズに結合するＢＳＡ中に存在するラン成長ホ ルモン結合タンパク質の微量の不純物に由来するものであろう。

それにもかかわらず、これらのデータは、ｈＧＨファージの豊富化がビーズ上の ｈｃＨｂｐの存在に依存することを示し、結合がｈＧＨとｈＧＨｂｐの間の特異 的な相互作用によって起こることを示唆する。

我々は、融合ファージミド上のｈＧＨの比較的弱い結合変異体を凌ぐ野生型ｈＧ Ｉ（の豊富化を評価して、豊富化の特異性をさらに調べ、精製ホルモンに対する 結合親和性の減少を融合ファージミド選別後の豊富化因子と関連させた。Ａｒｇ ６４がＡｌａで置換されたｈＧＨ突然変異体（Ｒ６４Ａ）を用いて融合ファージ ミドを構築した。このＲ６４Δ変異ホルモンは、ｈＧＨと比べて受容体結合親和 性が約２０倍減少している［それぞれ、Ｋｄ値が７．ｌｎＭおよび０　、３４　 ｎＭ　；　Ｃｕｎｎｉｎｇｈａ＋＊。

ｆｅｌｌｓ（上記）コ。Ｒ６４ＡｈＧＨ−遺伝子ＩＩ＋融合ファージミドの力価 は、野生型ｈＧＨファージミドの力価と同等であった。１ラウンドの結合と溶離 の後（表ＩＩＩ）、野生型ｈＧＨファージミドは、２種類のファージミドとＭ１ ３ＫＯ７の混合物から、ファージミドＲ６４Ａに対しては８倍およびＭ１３ＫＯ ７へルバーファージに対しては〜１０４で豊富化された。

訓、比較的弱い結合のｈＧＨ変異ファージミド以上にｈＧＨファージミドを選択 する試料　ＷＴ７フージミド　ＩＴ／Ｒ６４Ａ　訂７　アージミｌ’　ＩＴ／Ｒ ６４Ａ／全ファージミド　の豊富化　／全ファージミド　の豊富化最初の混合物 　８／２０　（１）　８／２０　（１）上清ＮＤ　−４／１０　１．０ 溶出液１（ｈＧＨ）　７／２０　０．８　１７／２０　８．５＊３溶出ｌ夜２（ ｐＨ２，１）　１１／２０　１．８　２１／２７　５．２＊ＩＩＩＭ１３ＫＯ７ フアージ、野生型ｈＧＨファージミドおよびＲ６４Ａフア一ジミド粒子を１０’ ：０．４：０．６の比で混合した。結合選択は、表Ｉ＋ならびに原材料および方 法の項の記載のように、ＢＳＡ（対照ビーズ）またはｈＧＨｂｐ（ｈＧＨｂｐピ ーズ）により結合させたビーズを用いて行なった。各工程の後、プラスミドＤＮ Ａをカルベニシリン耐性コロニーから単離し［Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、Ｈ，Ｄ、、　 Ｄｏｌｙ、Ｊ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

７：　１５１３−１５２３　（１９７９）ｉ、制限分析によって分析して、この ＤＮＡが野生型ｈＧＨまたはＲ６４ＡｈＧＨ遺伝子ＩＩ＋融合体を含有している か否力櫃１淀した。

＊２Ｒ６４Ａ突然変異体を越える野生型ｈＧＨファージミドの豊富化は、各工程 後に存在するｈＧＨファージミドの最初の混合物中に存在するファージミドに対 する比（８／２０）に基づき、Ｒ６４Ａフアージミドの対応する比で割ることに より計算した。

ＷＴ−野生型、ＮＤ＝測定せず。

＊３全Ｍ１３ＫＯ７親ファージを越えるファージミドの豊富化は、この工程後に 〜１０４であった。

晴−輪 ファージミド粒子上に野生型遺伝子ＩＩ＋および遺伝子ＩＩ＋融合タンパク質の 混合物を表示させることにより、遺伝子Ｉ１１に対する融合体として大きな適切 に折り畳まれたタンパク質を表示するピリオンを組立てそして増殖させることが できる。

遺伝子ＩＩ！融合タンパク質のコピー数を有効に制御して、ファージミドブール において十分に高いレベルになお維持されている「キレート作用」を避け、大き いエピトープライブラリー（＞　１０１０）の選別をすることができる。我々は 、ｈＧＨ（２２ｋＤのタンパク質）を天然の折り畳まれた形態で表示させうろこ とを示した。遊離のｈＧＨて溶離し、受容体親和性ビーズ上で行なった結合選択 は、低い受容体結合親和性を有することが示された突然変異ｈＧＨファージミド 以上に野生型ｈＧＨファージミドを効率的に豊富化した。即ち、結合定数がナノ モル範囲で低下しているファージミド粒子を選別することができる。

タンパク質−タンパク質および抗体−抗原の相互作用は、不連続エピトープによ って支配されている［Ｊａｎｉｎ、　Ｊ、ら、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　２０ ４：　１５５−１６４　（１９８８）；　Ａｒｇｏｓ。

Ｐ、、Ｐｒｏｔ、Ｅｎｇ、２：　１０１−１１３　（１９８Ｂ）；　Ｂａｒｌｏ ｗ、ＤＪ、ら、Ｎａｔｕｒｅ　３２２：　７４７−７４８　i１９８ ７）；およびＤａｖｉｅｓ、　Ｄ、　Ｒ，ら、Ｊ、Ｂｉｏ！、Ｃｈｅｍ、　２６ ３：　１０５４１−１０５４４　（１９８８）コ。即ち、結合に直接関与してい る残基は３次構造において近接しているが、結合に関与していない残基によって 隔てられている。本発明により提供されるスクリーニング系は、さらに好都合に タンパク質−受容体の相互作用を分析し、新規かつ高親和性の結合性を有するタ ンパク質中の不連続エピトープを単離することを可能にするものである。

（以下、余白） 実施例Ｖｌｌ　ｈＧＨフト７１７２．１７４．１７６．１７８においてランダム 化したライブラリーからのｈＧＨ突然変異体の選択４：　３６７−３８２　（１ ９８７）］の方法を用いて構築した。鋳型ＤＮＡは、Ｍ１３〜ＫＯ７フアーンを ヘルパーとして加えて、プラスミドｐｓＯ１３２（Ｍ１３遺伝子ＩＩ＋のカルボ キシ末端側半分に融合させた天然ｈＧＨ遺伝子をアルカリホスファターゼプロモ ーターの支配下に含をする）をＣＪ　２３６細胞中で増殖させることによって調 製した。１本鎖のウランル含有ＤＮＡを突然変異誘発用に調製して、（１）ｂＧ 　Ｈ結合タンパク質（ｈＧ　Ｈｂｐ）に対する結合を大きく減少させるｈＧＨ中 の突然変異：および（２）親のバックグラウンドファージを検定し、それに対し て選択するために使用しうる唯一の制限部位（Ｋｐｎｌ）を導入した。Ｔ７　Ｄ ＮＡポリメラーゼおよび以下のオリゴデオキシヌクレオチド；Ｇｌｙ　Ｔｈｒ ｈＧＨフドコド　１７８　１７９ を用いてオリゴヌクレオチド指向性の突然変異誘発を行なった。このオリゴは、 ｈＧＨ中に突然変異（Ｒ１７８Ｇ、＋１７９７）と共にＫｐｎ１部位（上に示す ）を導入する。突然変異誘発からのクローンをＫｐｎｌ消化によってスクリーニ ングし、ジデオキシＤＮＡ配列決定によって確認した。ランダム突然変異誘発の 鋳型として使用されるこの得られた構築物をｐＨ０４１５と命名した。

ｈ−ＧＨのへリノクス４中のランダム突然変異誘発ここでもＫｕｎｋｅｌの方法 を用いて、コドン１７２．１７４．１７６．１７８をｈＧＨ中のランダム突然変 異誘発の標的とした。上記のようにｐＨ０４１５がら１本鎖鋳型を調製し、以下 のオリゴ： ｈＧＨコドン・　１７２　１７４ ５°−ＧＣＴＴＣＡＧＧ　ＡＡＧ　ＧＡＣＡＴＧ　ＧＡＣＮＮＳ　ＧＴＣＮＮＳ 　ＡＣＡ−１ｅ −　ＮＮＳ　ＣＴＧ　ＮＮＳ　ＡＩＣＧＴＧ　ＣＡＧ　ＴＧＣＣＧＣＴＣＴ　Ｇ ＴＧ　Ｇ−３’のブールを用いて突然変異誘発を行なった。上に示したように、 このオリゴブールはコドン１７９を野生型（ｌｌｅ）に復帰させ、ｐＨ０４１５ の唯一のＫｐｎ１部位を破壊し、そして１７２、＋７４．１７６および１７８位 にランダムコドン（ＮＮＳ、ここで、ＮはＡ、Ｇ、ＣまたはＴであり、Ｓｔ！Ｇ またはＣである）を導入する。上記の配列に対してこのコドン選択を用いて、イ 」加的なＫｐｎ１部位を創製することはできない。このＮＮＳ同義性配列の選択 により、４つの部位に３２種の可能なコドン（１つの「停止」コドンおよび少な くとも１つの各アミノ酸のためのコドン）か得られ、合計（３２）’＝Ｉ、０４ ８．５７６の可能なヌクレオチド配列（この１２％は少なくとも１つの停止コド ンを含有する）、または（２０）’＝１６０．０００の可能なポリペプチド配列 と３４，４８１の未成熟で終止した配列（即ち、少なくとも１つの停止コドンを 含有する配列）が得られる。

最初のライブラリーの増殖 突然変異誘発産物をフェノール・クロロホルム（５０：５０）で２回抽出し、後 の電気穿孔工程を面倒にする塩の添加を避けるために過剰のキャリアーｔＲＮＡ を用いてエタノール沈澱させた。約５０　ｎｇ（１５ｒモル）のＤＮＡを、’０ ．２ｃ＋ｏキュベｙ）中の全容１４５μｍにおいて、単一パルスの電圧設定２． ４９ｋＶ（時間定数＝４．７１＋１秒）でＷＪＭＩＯＩ細胞（２，８ＸＩＯ”細 胞／ｍｌ）に電気穿孔導入した。

この細胞を振盪しなから３７°Ｃで１時間回復させ、次いで２ＹＴ培地（２５亀 ｌ）、１００μｇ／ｍｌカルベニシリン、オヨびＭ１３−ＫＯ７（感染の多重度 ＝１０００）と混合した。この培養物からの連続希釈物をカルベニシリン含有培 地にプレーティノブすることにより、８．２Ｘ１０’の電気形質転換体が得られ たことがわかった。

２３°Ｃで１０分間の後、培養物を振盪しながら３７°Ｃで一晩（１５時間）イ ンキュベートした。

一晩インキュベートの後、細胞をペレット化し、ｐＬＩＢｌと命名した２本鎖Ｄ ＮＡ（ｄｓＤＮＡ）をアルカリ溶解法によって調製した。この上清をもう一度遠 心してすべての残存細胞を除去し、ファージブールφ１と命名したファージをＰ ＥＧ沈澱させ、ＳＴＥ緩衝液［１０ｍＭトリス（ｐＨ７，６）、１μＭ　ＥＤＴ Ａ、５０ｍＭ　Ｎ　ａＣｌ］（Ｉ　ｍｌ）に再懸濁した。ファーシカ価は、ｈＧ Ｈ−ｇ３ｐ遺伝子ＩＩ＋融合（ｈＧ　Ｈ−ｇ’）プラスミドを含有する組換えフ ァージミドについてはコロニー形成単位（ＣＦＵ）として、モしてＭ１３−ＫＯ ７ヘルパーフアー゛ジについてはプラーク形成単位（、Ｐ　Ｆ　Ｕ）として測定 した。

固定化ｈＧＨｂｐを用いる結合選択 １、結合・ファージブールφ１（６ｘｌＯ１ｌＣＦＵ、６ＸＩＯ’ＰＦＵ）（７ ）一部を緩衝液Ａ［リン酸緩衝食塩水、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ツイーン２ ０．０．０１％チメロサール］で４．５倍に希釈し、１．５ｍｌのシラン処理し たポリプロピレン試験管において、５ｅｒ２３７Ｃｙｓ突然変異を含むｈＧＨｂ ｐ（３５０ｆモル）と結合させたオキ７ランーポリアクリルアミドビーズの懸１ １ｉＪ（５μｍ）と混合した。対照として、等量のファージを、ＢＳＡだけで被 覆したビーズと別の試験管で混合した。

このファージを、ゆっくり回転（約７　ｒｐｍ）させながら室温（２３°Ｃ）で ３時間インキュベートすることによって、ビーズと結合させた。以下の工程は、 ２００μｌの一定容量を用い、室温で行なった。

２　洗浄：ビーズを１５秒間回転させ、上清を除去した（上清１）。非特異的に 結合し５たファージ／ファージミドを除去するため、このビーズを緩衝液Ａに再 懸濁することにより２回洗浄し、次いでペレット化した。最後の洗浄は、緩衝液 Ａ中で２時間、このビーズを回転させることにより行なった。

３、ｈＧＨ溶Ｍ：ビーズに弱（結合したファージ／ファージミドを、ｈＧＨによ る段階溶離によって除去した。最初の工程において、ビーズを２μＭｈＧＨ含有 の緩衝液Ａを用いて回転させた。１７時間後に、このビーズをペレット化し、２ ＱｎＭ　ｈａＨａ（ｆの緩衝液Ａに再懸濁し、３時間回転させ、次いでペレット 化した。最後のｈＧＨ洗浄において、このビーズを２００ｎＭｈＧＨ含有の緩衝 液Ａに懸濁させ、３時間回転させ、次いでペレット化した。

４、グリシン溶ｊｌｉ：最も強固に結合したファージミド（即ち、ｈＧＨ洗浄後 になお結合しているファージミド）を除去するため、ビーズをグリシン緩衝液［ １Ｍグリシン、ＨＣＩでｐＨ２，０］に懸濁させ、２時間回転させ、ペレット化 した。この上清（分画ｒＧに２００μＩ）を、ＩＭ）リス塩基（３０μｌ）の添 加によって中和した。

ｈＧ　Ｈｂｐ−ビーズから溶出した分画Ｇ（ｌｘ　ｌＯ’ＣＦＵ、５ｘ　ｌｏ’ ＰＦＵ）は、実質的にＫＯ７Ｏ７ヘルパーファー上にファージミドに富むことは なかった。我々は、これは、ｍ換えファー／ミドの増殖中にパッケージされたＫ Ｏ７フアージがｈＧＨ−ｇ３ｐ融合体を表示するということに起因するものと考 えている。

しかし、ＢＳＡ被覆された対照ビーズから溶出した分画Ｇと比較すると、ｈＧＨ ｂｐ−ビーズは１４倍高いＣＦＵを与えた。これは、非特異的に結合したファー ジミド以上の、強固に結合したｈＧＨを表示するファージミドの豊富化を反映す るものである。

５、増殖：ｈＧＨｂｐ−ビーズから溶出した分画Ｇの一部（４，３ｘ　１０’Ｃ ＦＵ）を用いて対数増殖期のＷＪＭＩＯＩ細胞を感染させた。形質導入は、分画 Ｇ（１００μｌ）をＷＪＭＩＯＩ細胞（ｌ　ｍｌ）と混合し、３７°Ｃで２０分 間インキュベートし、次いでに０７（感染の多重度＝１０００）を加えることに よって行なった。培養物（２５亀ｌの２ＹＴとカルベニシリン）を上記のように 増殖させ、ファージの第２プール（ライブラリーＩＧ、第１のグリシン溶離用） を上記のように調製した。

ライブラリーＩＧからのファージ（図３）を、上記のように、ｈＧＨｂｐビーズ への結合について選択した。ｈＧＨｂｐビーズから溶出した分画Ｇは、この選択 においてＢＳＡビーズから溶出した分画Ｇに比べて３０倍高いＣＦＵを含んでい た。

もう一度、分画Ｇの一部をＷＪＭＩＯＩ細胞中で増殖させ、ライブラリーＩＣ’ （グリノン溶離によってこのライブラリーを２回選択したことを示す）を得た。

また、２本鎖ＤＮＡ（ｐＬ　Ｉ　Ｂ　ＩＧつをこの培養物から調製した。

ｄｓＤＮＡのＫｐｎｌ検定および制限選択バックグラウンド（Ｋｐｎｌ’）鋳型 の量を減少させるため、ｐＬＩＢ　ＩＧ”の一部（約１５μｇ）をＫｐｎｌで消 化し、ＷＪＭ１０１細胞中に電気穿孔導入した。これらの細胞を、最初のライブ ラリーについて記載したようにＫＯ７（感染の多重度−１ＯＯ）の存在下で増殖 させ、新しいファージブールｐＬＩＢ３を調製した（図３）。

さらに、最初のライブラリー（ｐＬＩＢ１）由来のｄｓ［ｊＮＡの一部（約０． ５μｇ）をＫｐｎｌで消化し、ＷＪＭＩＯ＋細胞中に直接電気穿孔導入した。形 質転換体を上記のように回復させ、Ｍ１３−ＫＯ７に感染させ、−晩増殖させて ファージライブラリー２と命名した新しいファージライブラリーを得た（図３） 。

連続ラウンドの選択 （１）過剰（ＣＦＵの１０倍）の精製ＫＯ７フアージ（ｈＧＨを表示しない）を ビーズ結合カクテル中に添加した。および（２）ｈＧＨ段階溶離を緩衝液Ａ単独 の短い洗浄に換えたことを除き、上記のようにしてｐｔ、　Ｉ　８２およびｐＬ ＩＢ３の両方に由来するファージミドに対して連続ラウンドでファージミドの結 合、溶離および増殖を行なった。また、一部においてはＸＬｌ−Ｂｌｕｅ細胞を ファージミドの増殖に用いた。

ＫｐｎｌによるｄｓＤＮＡの追加の消化を、最終ラウンドのビーズ結合選択の前 にｐＬＩＢ　２Ｇ″およびｐＬＩ８３Ｇ’に対して実施した（図３）。

選択したファージミドのＤＮＡ配列決定ＬＩ８４Ｇ’由来の４種の独立して単離 したクローンおよびＬＩ８５Ｇ”由来の４種の独立して単離したクローンを、ジ デオキシ配列決定によって配列決定した。これら８種クローンのすべてが、同一 のＤＮＡ配列：ｈＧＨコドン・　１７２　１７４　１７６　１？！！ｔ５′−Ａ ＡＧ　ＧＴＣＴＣＣＡＣＡ　ＴＡＣＣＴＧ　ＡＧＧ　ＡＴＣ−３’を有していた 。即ち、これらのすべてがｈＧＨの同一突然変異体（Ｅ１７４Ｓ、Ｆ１７６Ｙ） をコードしている。これらクローン中の残基１７２は野生型と同様にＬｙｓであ る。また、１７２に対して選択されたコドンも野生型ｈＧＨと同一である。この ことは、ＡＡＧが同義ｒＮＮｓＪコドンのセットから可能な唯一のりジン−コド ンであるので驚くには当たらない。さらに、残基１７８−Ａｒｇも野生型と同一 であるが、ここではライブラリーから選択されたコドンはＡＡＧであって野生型 ｈＧＨで見い出されるＣＧＣではなかった（後者コドンもｒＮＮｓＪコドンのセ ットを用いて可能である）。

ＫＯ７＠染の多重度 ＫＯ７感染の感染多重度は、組換えファージミドの増殖において重要なパラメー ターである。ＫＯ７の感染多重度は、ファージミドで形質転換またはトランスフ エクンヨンされた実質的にすべての細胞が新しいファージミド粒子をノく・ノケ ージしうることを確保するに十分に高いものでなければならない。さらに、それ ぞれの細胞中の野生型遺伝子１１１の濃度は高く維持されて、複数のｈＧＨ−遺 伝子ＩＩ＋融合分子がそれぞれのファージミド粒子上に表示される可能性を減少 させ、それによって結合におけるキレート作用を減少させるものであるべきであ る。しかし、ＫＯ７の感染多重度が高すぎるときには、ＫＯ７のパッケージング は組換えファージミドのハンゲージノグと競合するであろう。我々は、１〜１０ ％のパ、タグラウンドＫＯ７フアージしか持たない許容しうるファージミド収量 が、ＫＯ７の感染多重度が１００であるときに得られることを見い出した。

色」 ファージ　ｍｏｉ（ＫＯ？）　豊富化　ｈＧＨｂｐ／　分画Ｋｐｎｌブール　Ｃ ＦＭＰＦＩＪ　ＢＳＡビーズＬＩＢ１　１０００　ＮＤ　Ｉ４　０．４４ＬＩＢ ＩＧ　１０００　ＮＤ　３０　０．５７ＬＩＢ３　１００　ＮＤ　１．７　０． ２６ＬＩＢ３Ｇ’　１０　ＮＤ　Ｂ、５　０．１８ＬＩ８３Ｇ’　１００　４６ ０　２２０　０．１３ＬＩＢ５　１００　ＮＤ　１５　ＮＤ ＬＩＢ２　１００　ＮＤ　１．７　＜０．０５ＬＩＢ２Ｇ　１０　ＮＤ　４．１ 　＜０．１ＯＬＩＢ２Ｇ”　１００　１０００　２７　０．１８ＬＩＢ４　１０ ０　１７０　３８　ＮＤファージブールを先に示したように標識した（図３）。

感染多重度（３ｏｉ）ｌまファージミドの増殖の際のＫＯ７感染の多重度（Ｐ　 Ｆ　Ｕ／細胞）を意味する。ＰＦＵを越えるＣＦＵの豊富化は、精製したＫＯ７ を結合工程１こ加えたとき（こ示される。

ＢＳＡビーズから溶出したＣＦＵを越える、ｈＧＨｂｐビーズカ）ら溶出される ＣＦＵの比が示されている。プール中に残存するＫｐｎＩ含有鋳型（即ち、ｐＨ ０４１５）の分画は、ｄｓＤＮＡをＫｐｎｌおよびＥｃｏＲＩで消化し、生成物 を１％アガロースゲルで移動させ、陰性の臭化エチジウム染色ＤＮＡをレーザー −スキャニングすることによって測定した。

ホルモンｈＧＨ（Ｅ１７４Ｓ、Ｆ１７６Ｙ）の受容体結合の親和性単一のクロー ンが２種類の異なる選択経路（図３）から単離されたと（Ａう事実（よ、二重突 然変異体（Ｅ　１７４Ｓ、Ｆ　１７６Ｙ）がｈＧＨｂｐに強く結合することを示 唆した。ｈＧＨｂｐに対するこのｈＧＨ突然変異体の親和性を測定するために、 我々（よこの１１ＧＨ突然変異体を、プラスミドｐＢＯ７２０を用（する部位を 旨同性突然変異誘発によって構築した。このプラスミドは、鋳型としての野生型 ｈＧＨ遺（云子、ならびにコドン１７４および１７６を変化させる次のオリゴヌ クレオチド：ｈＧＨコドン：　１７２　１７４　１７６　１７８Ｌｙｓ　Ｓｅｒ 　Ｔｙｒ　Ａｒｇ ５−　ＡＴＣＧＡＣＡＡＧ　ＧＴＧ　ＴＣＧ　ＡＣＡ　ＴＡＣＣＴＧ　ＣＧＣＡ ＴＣＧＴＧ　−３゜を含有している。得られた構築物ｐＨ０４５８Ｂを、突然変 異ホルモンの発現のために大腸菌株１６Ｃ９に導入した。ｈＧＨｂｐに対するｈ ＧＨ（Ｅ　１７４Ｓ、Ｆ　１７６Ｙ）と”’Ｉ−ｈＧＨの競合結合のスカソチャ ード分析により、この（Ｅ　１７４Ｓ、Ｆ１７６Ｙ）突然変異体が野生型ｈＧＨ の結合親和性よりも少なくとも５．０倍強固な結合親和性を有していることがわ かった。

実施例ｖ］１１　ホルモン−ファージのへリノクス４ランダムカセットライブラ リーからのｈＧＨ変異体の選択 ヒト成長ホルモン変異体を、図９に記載のファージミドを用いる本発明の方法に よって調製した。　′ 悦−融合性のホルモン−ファージベクターの構築状々は、（１）ファージ上でｈ ＧＨ部分の表示をさらに有利にするように、ｈＧＨと遺伝子１１１部分の間の結 合を改良する：（２）実質的に「−価の表示」を得るために融合タンパク質の発 現を限定する：（３）出発ベクターに対する制限ヌクレアーゼの選択を可能にす る：（４）出発ベクターからの融合タンパク質の発現を排除する。および（５） あるｈＧＨ−遺伝子１１１融合突然変異体からの対応する遊離ホルモンの容易な 発現を達成する：という目的をもって、カセット突然変異誘発［Ｗｅｌｌｓら。

譚凹３４：　３１５−３２３　（１９８５）］およびｈＧＨ−遺伝子ＩＩ＋融合 タンパク質の発現のためのベクターを設計した。

ｐＢ　Ｒ３２２およびＨの複製起点を含有し、大腸菌ｐｈｏＡプロモーター［Ｂ ａ５ｓら。

Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　８：　３０９−３１４　（１９９０）］の支配下にｈＧＨ− 遺伝子ＩＩ＋融合タンパク質（ｈＧＨ残基１−１９１、これに１個のＧｌｙ残基 が続き、遺伝子ＩＩＩのＰｒｏ−１９８に融合している）を発現する、ｐｓＯ１ ３２のオリゴヌクレオチド指向性の突然変異誘発［Ｋｕｎｋｅｌら、　Ｍｅｔｈ ｏｄ＋＋　Ｅｎｚｙｍｏｌ、１５４：　３６７−３８２　（１９８７）］によっ てププラスミドルＳ０６３を構築した（図９）。オリゴヌクレオチド：５’　− ＧＧＣ−八ＧＣ−ＴＧＴ−ＧＧＣ−ＴＴＣ−ＴＡＧ−ＡＧＴ−ＧＧＣ−ＧＧＣ− ＧＧＣ−ＴＣＴ−ＧＧＴ−３゜を用いて突然変異誘発を行った［このオリゴヌク レオチドは、ｈＧＨのＰｈｅ−１９１に続いてＸｂａ１部位（下線部）およびア ンバー停止コドン（ＴＡＧ）を導入するコ。

得られた構築物ｐｓＯ６４３においては、遺伝子Ｉｌ＋の一部が削除され、２つ のサイレント突然変異誘発（下線部）が生じ、ｈＧＨと遺伝子ＩＩ＋の間に次の 連結点が生成する： −−−ｈＧＨ−−−−−−−−−＞　遺伝子ＩＩＩ　−−−−−＞１８７　Ｅｌ 　１８９１９０１９１　ａｎ＄　２４９２５Ｑ　２５１２５２２５３２５４Ｇｌ ｙ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　ＧＬｙ　Ｇｌ ｙ　Ｓｅｒ　ＧＬｙＧＧＣＡＧＣＴＧＴ　ＧＧＡ　ＴＴＣＴＡＧ　ＡＧＴ　ＧＧ ＣＧＧＴ　ＧＧＣＴＣＴ　ＧＧＴこれは、融合タンパク質の全体サイズをｐｓＯ Ｌ３２中の４０１残基からｐＳ０６４３中の３５０残基まで短縮する。ｈＧＨに 対するモノクローナル抗体を用いた実験により、ファージ粒子に組立てられる新 しい融合タン／ｆり質のｈＧＨ部分は以前の長い融合体よりも接近しやすいこと がわかった。

ホルモンを表示するファージを増殖させるため、ｐＳ　Ｏ６４３および誘導体を ＪＭｌｏｌまたはＸＬＩ−Ｂｌｕｅなどの大腸菌のアンバー−サブレ’ｙサー株 ［Ｂｕｌｌｏｃｋら、　ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　５：　３７６−３７９　 （１９８７）］中で増殖させることができる。上に示したのは、５ｕｐＥサプレ ツサ一株中で起こるアンバーコドンにおけるＧｌｕの置換である。また、他のア ミノ酸による抑制が、周知かつ一般に入手可能な種々の大腸菌株において可能で ある。

融合体の遺伝子１１１部分を含まないｈＧＨ（または、突然変異体）を発現させ るために、ｐｓＯ６４３および誘導体を単に１６０９などの非サブレ・ツサー株 にお（箋て増殖させることができる。この場合にはアンバーコドン（ＴＡＧ）は 鮒訳の終止を導き、独立したＤＮＡ構築を必要とすることなく遊離のホルモンを 与える。

カセット突然変異誘発のための部位を創製するため、ｐｓＯ６４３をオリゴヌ［ これは、ｐｓ０６４３の唯一のＢｇｌｌ［部位を破壊する］；（２）５°−ＣＴ Ｃ−ＡＡＧ−＾＾Ｃ−ＴＡＣ−ＧＧＧ　−ＴＴＡ　−ＣＣＣ−ＴＧＡ　−ＣＴＧ −ＣＴＴ−ＣＡＧ−ＧＡＡ　−ＧＧ−３’にれは、唯一のＢｓｔＥ１１部位、１ 塩基のフレームソフト、および非アンバー停止コドン（ＴＧＡ）を挿入する］： および（３）　５’−ＣＧＣ−ＡＴＣ−ＧＴＧ−ＣＡＧ−ＴＧＣ−胡かμ：Ｔ− ＧＴＧ−ＧＡＧ−ＧＧＣ−３’［これは、新規なりｇ１１１部位を導入する］で 突然変異させて出発ベクターｐＨ０５０９を得た。ＴＧＡ停止コドンと共にフレ ームソフトを加えることにより、出発ベクターから遺伝子１ｉ１融合体が産生さ れ得ないことが確保される。ＢｓｔＥ　ＩＩ−８ｇｌｌｌセグメントをｐＨ０５ ０９から切出し、所望のコドンのところで突然変異させたＤＮＡカセクトで置換 した。また、ｈＧｌ（中の他の位置におけるカセット突然変異誘発のための他の 制限部位も、このホルモン−ファージベクター中に導入シた。

ｈＧＨのヘリックス４内のカセット突然変異誘発ｈＧＨのコドン１７２．１７４ ．１７６および１７８をランダム突然変異誘発の標的とした。この理由は、これ らすべてがｈＧＨの表面またはその近くに存在し、受容体結合に有意に寄与し［ Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍおよび實ｅｌｌｓ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４４：　１０８ １−１０８５　（１９８９）］　：これらすべてが十分に定義された構造内に存 在し、ヘリックス４の同じ側の２「ターン」を占め：そして、これらのそれぞれ がｈＧＨの既知の進化変異体の中の少なくとも１つのアミノ酸で置換されている ためである。

我々は、それぞれの標的残基にＮＮ５（Ｎ＝Ａ／Ｇ／Ｃ／Ｔ　、Ｓ＝Ｇ／Ｃ）の 置換を選択した。このＮＮＳ同義性配列の選択により、４つの部位に３２種の可 能なコドン（少なくとも１つの各アミノ酸のためのコドン）が得られ、合計（３ ２）’＝］、０４８，５７６の可能なヌクレオチド配列、または＜２０）’＝１ ６０，０００の可能なポリペプチド配列が得られる。唯一の停止コドンであるア ンバー（ＴＡＧ）がこのコドン選択により可能であり、このコドンは大腸菌のｓ ｕｐ　Ｅ株においてＧｌｕｌとして抑制することができる。

コドン１７２．１７４．１７６および１７８にＮＮＳを有する２種類の同義性（ 縮重）オリゴヌクレオチドを合成し、ホスホリル化し、アニールさせて突然変異 カセットを構築した： ５’　−ＧＴ−ＴＡＣ−ＴＣＴ−ＡＣＴ−ＧＣＴ−ＴＴＣ−人ＧＧ−ＡＡＧ−Ｇ ＡＣ−＾ＴＧ−ＧＡＣ−ＮＮＳ−ＧＴＣ−ＮＮＳ−＾ＣＡ−mＮＳ−ＣＴＧ− ＮＮＳ−＾ＴＣ−ＧＴＧ−ＣＡＧ−ＴＧＣ−＾−３′および ５°−ＧＡ−’ｒＣＴ−ＧＣ人−ＣＴＧ−ＣＡＣ−ＧＡＴ−３ＮＮ−ＣＡＧ−３ ＮＮ−ＴＧＴ−３ＮＩＩ−ＧＡＣ−ＳＮＮ−ＧＴＣ−ＣＡＴ|ＧＴＣ−ＣＴＴ− ＣＣＴ−ＧＡＡ−ＧＣＡ−ＧＴＡ−ＧＡ−３’。

ＢｓｔＥＩｌに続いてＢｇｌｌｌでｐＨ０５０９を消化することによってベクタ ーを調製した。生成物を１％アガロースゲル上で移動させ、大きいフラグメント を切り出し、フェノール抽出し、エタノール沈澱させた。このフラグメントをウ シ腸ホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）で処理し、次いでフェノール：ク ロロホルム抽出し、エタノール沈澱させ、突然変異用カセットとの連結用に再懸 濁した。

ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ細胞における最初のライブラリーの増殖連結の後、反応生成物 をＢｓＬＥＩＩでもう一度消化し、次いでフェノール：クロロホルム抽出し、エ タノール沈澱させ、水に再懸濁した［ＢｓｔＥＩＩ認識部位（ＧＧＴＮＡＣＣ） が、コド７１７２の３位に９および１７４にＡ　ＣＣ（Ｔ　ｈｒ）コドンを含む カセット内に創製される。しかし、この工程でのＢｓｔＥ　ＩＩによる処理は、 あらゆる可能な突然変異カセットに対して選択しないはずである。この理由は、 実質的にすべてのカセットがヘテロ２本鎖であり、この酵素によって切断され得 ないためである］。約１５０ｎｇ（４！Ｍモル）のＤＮＡを、０．２ｃｍキュベ ツト中のＸＬｌ−Ｂｌｕｅ細胞（０，０４５＋ｎｌ中に１．８ｘｌＯ１′細胞） に、単一パルスの電圧設定２．４９ｋＶ（時間定数＝４．７＋１１秒）で電気穿 孔導入した。

この細胞を振盪しながらＳ、　Ｏ，Ｃ，培地において３７℃で１時間回復させ、 次いで２ＹＴ培地（２５ｍｌ）、１００ｍｇ／＋ｎｌカルベニシリン、およびＭ ２Ｓ−ＫＯ７（ａｏｉ＝ｌｏｏ）と混合した。２３°Ｃで１０分間の後、培養物 を振盪しなから３７°Ｃで一晩（１５時間）インキュベートした。この培養物か らの連続希釈物をカルペニンジン含有培地にブレーティングすることにより、３ ．９ｘｌＯ’の電気形質転換体が得られたことかわかった。

一晩イノキュベートの後、細胞をペレット化し、ｐＨ０５２９Ｅ（最初のライブ ラリー）と命名した２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）をアルカリ溶解法によって調製 した。

この上清をもう一度遠心してすべての残存細胞を除去し、ファージブールφＨ０ ５２９Ｅ（最初のファージライブラリー）と命名したファージをＰＥＧ沈澱させ 、ＳＴＥ緩衝＋ｆｆｌ［１０ｍＭトリス（ｐＨ７，６）、ＩＯＩＭ　ＥＤＴＡ、 ５０１１１Ｍ　ＮａＣｌ］（１ｍｌ）に再懸濁した。ファーシカ価は、ｈＧＨ− ｇ３ｐを含有する組換えファージミドについてコロニー形成単位（ＣＦＵ）とし て測定した。出発ライブラリーから約４゜５ＸＩＯ１３ＣＦＵが得られた。

出発ライブラリーの同義性（縮重） 電気形質転換体のプールからの５８のクローンを、ＢｓＬＥ　ｌｌ−８ｇｌｌｌ カセットの領域において配列決定した。これらの中で、１７％が出発ベクターに 対応しており、１７％が少な（とも１つのフレームシフトを含有しており、そし て７％が４つの標的コドンの外側に非サイレント（非終止）突然変異を含有して （Ａた。我々は、４１％のクローンが上記基準のいずれかによる欠点を有してお り、２．０ｘ１０７の当初形質転換体の合計機能的プールが残るものと結論した 。それでもなお、この数は可能性あるＤＮＡ配列数をほぼ２０倍越えている。従 って、我々は出発ライブラリーにおいて示されるすべての可能性ある配列を有す ることを確信している。

我々は、選択されなかったファージの配列を調べて突然変異誘発におけるコドン の偏向度を評価した（表■）。これらの結果により、一部のコドン（および、ア ミノ酸）がランダムな予想に比べて多いかまたは少ないことが示されるが、この ライブラリーは極めて多様性が高く、大量の「兄弟」縮重の証拠は存在しな（１ ことがわかった（表■Ｉ）。

及ｙ０選択されなかったホルモンファージのコドン分布（１８８コドンあたり） クローンを出発ライブラリー（ｐＨ０５２９Ｅ）から配列決定した。疑似突然変 異および／またはフレームソフトを含有するクローンからのコドンを含むすへて のコドンを表にした。＊：アンノー停止コドン（ＴＡＧ）はＸＬＩ−Ｂｌｕｅ細 胞においてはＧｌｕとして抑制される。下線を引いたコドンは、５０％またはそ れ以上に多い／少ないことが示された。

Ｌｅｕ　１７．６　１８　１．０ Ａｒｇ　、１７．６　１０　０．５７ Ｐｈｅ　５．９　５　０．９ Ｇｌｕ　５．９　６　１．０ 轟■、オーブン読み枠を有する選択されなかった（ｐＨ０５２９Ｅ）クローン 表示、例えばＴＷＧＳは、ｈＧＨ突然変異体１７２Ｔ／１７４Ｗ／１７６Ｇ／１ ７８５を示す。ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ細胞においてＧｌｕとして翻訳されたアンバー （ＴＡＧ）コドンはεで示す。

Ｋ５ＮＴ　ＫＴＥＱ　ＣＶＬＱ ＴＷＧＳ　ＮＮＣＲＥＡＳＬ Ｐ５ＥＲＦＰＣＬ　５ＳＫＥ ＬＰＰＳ　Ｎ５ＤＦ　ＡＬＬＬ Ｓ　Ｌ　Ｄ　Ｐ　ＨＲＰ　Ｓ　Ｐ　Ｓ　ＨＰＱＱＳＮ　ＬＳＬε　５ＹＡＰ ＧＳＫＴ　ＮＧＳＫ　ＡＳＮＧ ＴＰＶＴ　ＬＴＴＥ　ＥＡＮＮ ＲＳＲＡ　ＰＳＧＧ　ＫＮＡＫ ＬＣＧＬ　ＬＷＦＰ　５ＲＧＫ ＴＧＲＬ　’ＰＡＧＳ　ＧＬＤＧ ＡＫＡＳ　ＧＲＡＫ　ＮＤＰ　＋ Ｇ　Ｈｂｐ（ｒｈｃ　Ｈｂｐ−ビーズ」）を調製した。［”’Ｉ］ｈＧＨとの競 合結合実験により、１μｍのビーズ懸濁液あたり５８ｆモルの機能的ｈＧ　Ｈｂ ｐが結合することがわかった。

プロラクチン受容体［Ｃｕｎｎ　ｉｎｇｈａｍら、旨違ｒｎｃｅ　２５０：　１ ７０９−１７１２　（１９９０）コの２１１残基の細胞外ドメインを用いて、上 記のように固定化ｈＰ　Ｒｔ、ｂｐ（ｒｈｐ　ＲＬｂｐ−ビーズ」）を調製した 。５０ｇＭの亜鉛の存在下での［”’［］ｈＧＨとの競合結合実験により、ｌμ ｌのビーズ懸濁液あたり２．１ｒモルの機能的ｈＰＲＬｂｐが結合することがわ かった。

［ブランクビーズ」は、オキシランーアクリルアミドビーズを０．６Ｍエタノー ルアミン（ｐＨ９，２）により４°Ｃで１５時間処理することによって調製した 。

固定化ｈＧＨｂｐおよびｈＰＲＬｂｐを用いる結合選択ビーズに対するホルモン −ファージの結合を、次の緩衝液のいずれかにおいて実施した：ｈＧＨｂｐおよ びブランクビーズを用いる選択に対しては緩衝液Ａ［ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、 ０．０５％ツイーン２０．０．０１％チメロサールコ；亜鉛の存在下Ｃ＋　Ｚ　 ｎ’°）にｈＰＲＬｂｐを用いる選択に対しては緩衝液Ｂ［５０５Ｍ１−リス（ ｐＨ７，５）、ｌ　ＯｍＭ　ＭｇＣＩｔ、０．５％　ＢＳＡ、０．０５％ツィー ：／２０，１００　ｍＭ　Ｚ　ｎＣＩｔ］　：または、亜鉛の非存在下（＋ＥＤ ＴＡ）にｈＰＲＬｂｐを用いる選択に対シテハ緩衝液ＣＣＰＢＳ、０．５％　Ｂ ＳＡ、０．０５％ツィー：／２０，０゜０１％チメロサール、１０＋Ｍ　ＥＤＴ Ａ］。結合選択は、次の経路のそれぞれに従って実施した＝（１）ブランクビー ズに対する結合、（２）ｈＧ　Ｈｂｐ−ビーズに対する結合、（３）ｈＰ　ＲＬ ｂｐ−ビーズに対する結合（＋　Ｚ　ｎ”°）、（４）ｈＰ　ＲＬｂｐ−ビーズ に対する結合（＋ＥＤＴＡ）、（５）ｈＧ　Ｈｂｐピーズによる２回の予備吸着 とその後の未吸着分画のｈＰＲＬｂｐ−ビーズへの結合（ｒ−ｈＧＨｂｐ、＋ｈ ＰＲＬｂｌ）Ｊ選択）、または（６）ｈ　Ｐ　ＲＬ　１）ｐ−ビーズによる２回 の予備吸着とその後の未吸着分画のｈＧＨｂｐ−ビーズへの結合Ｎ−ｈＰＲＬｂ ｐ、＋ｈＧＨｂｐｊ選択）。後者の２つの操作は、それぞれｈＰＲＬｂｐと結合 するがｈＧＨｂｐとは結合しない突然変異体、またはｈｃＨｂｐと結合するがｈ ＰＲＬｂｐとは結合しない突然変異体を豊富化するものと予想される。

各サイクルにおけるファージの結合と溶離は、次のように実施した：１、結合： ホルモンファージの一部（通常はｌｏ０〜１０１０ＣＦＵ）を等量の非ホルモン ファージ（ｐＣＡ　Ｔ　）と混合し、適当な緩衝液（Ａ、ＢまたはＣ）で希釈し 、１．５ｎｌのポリプロピレン試験管において２００ｍ１の総容量でｈＧＨｂｐ 、　ｈＰ　ＲＬｂｐまたはブランクビーズの懸濁液（１０ｍｌ）と混合した。こ のファージを、ゆっくり回転（約７　ｒｐｍ）させながら室温（２３°Ｃ）で１ 時間インキュベートすることによってビーズと結合させた。以下の工程は、２０ ０μｌの一定容量を用い、室温で行なった。

２、洗浄：ビーズを１５秒間回転させ、上清を除去した。非特異的に結合したフ ァージ数を減少させるため、このビーズを適当な緩衝液に短時間再懸濁すること により５回洗浄し、次いでペレット化した。

３、ｈＧＨ溶離：ビーズに弱く結合したファージを、ｈＧＨにょる溶離によって 除去した。このビーズを４００ｎＭｈＧＨ含有の適当な緩衝液と共に１５〜１７ 時間回転させた。この上清をｒｈＧ　Ｈ溶出液」およびビーズとした。このビー ズを緩衝液に短時間再懸濁し、ペレット化することによって洗浄した。

４　グリ７ン溶１ｌｌｆ：最も強固に結合したファージ（即ち、ｈＧＨ洗浄後に なお結合しているファージ）を除去するため、ビーズをグリシン緩衝液［緩衝液 Ａに０゜２Ｍグリシンを追加し、ＨＣＩでｐＨ２，０にする］に懸濁させ、１時 間回転させ、ペレット化した。この上清（「グリシン溶出液に２００μｌ）を、 １Ｍトリス塩基（３０ｍｌ）の添加によって中和し、４°Ｃで保存した。

５、増殖：各組の条件のもと各組のビーズからのｈＧＨ溶出液およびグリシン溶 出液の一部を用いて対数増殖期のＸＬＩ−Ｂｌｕｅ細胞の独立した培養物を感染 させた。形質導入は、ファージをＸＬＩ−Ｂｌｕｅ細胞（１ｍｌ）と混合し、３ ７℃で２０分間インキュベートし、次いでＫＯ７（ｍｏｉ＝１００）を加えるこ とによって行なった。培養物（２５ｍｌの２ＹＴとカルベニシリン）を上記のよ うに増殖させ、ファー／の次のプールを上記のように調製した。

ファージの結合、溶離および増殖を、上記のサイクルに従って、連続ラウンドで 行なった。例えば、ｈＧＨｂｐビーズがらのｈＧＨ溶出液から増幅したファージ をｈＧ　Ｈｂｐビーズてもう一度選択し、ｈＧＨて溶離し、次いでＸＬＩ−Ｂｌ ｕｅ細胞の新鮮培養物の感染に用いた。上記の選択法のそれぞれに対して５ラウ ンドの選択および増殖の３ラウンドを実施した。

選択したファージミドのＤＮＡ配列決定各サイクルのｈＧＨおよびグリシン溶離 工程からのファージの一部をＸＬｉＢｌｕｅ細胞の接種に用い、これをカルへニ ンジンおよびテトラサイクリン含有のＬＢ培地にブレーティングして各ファージ ブールに由来する独立したクローンを得た。単離したコロニーから１本鎖ＤＮＡ を調製し、突然変異カセット領域の配列決定を行なった。このＤＮＡ配列決定の 結果を、図５、図６、図７および図８に推定アミノ酸配列としてまとめる。

ｈＧＨ突然変異体の発現および検定 ｈＧＨｂｐに対する選択したｈＧＨ突然変異体の一部の結合親和性を測定するた め、配列決定したクローン由来のＤＮＡを大腸菌株１６Ｃ９に導入した。上記の ように、この株は非すプレッサー株であり、ｈＧＨの最後のＰｈｅ−１９１残基 の後でタンパク質の翻訳を終止させる。１本鎖ＤＮＡをこれらの形質転換に用い たが、２本鎖ＤＮＡまたは全ファージであっても、遊離ホルモンの発現用の非す プレッサー株中に容易に電気穿孔導入することができる。

ｈＧＨの突然変異体は、ｈＧＨについて記載されているように、硫酸アンモニウ ム沈澱により浸透圧ショックを与えた細胞から調製した［０１ｓｏｎら、　Ｎａ ｔｕｒｅ　２９３：４０ｇ−４１１（ｔ９ｇｔ）］。また、タンパク質濃度は、 ｈＧＨを標準として用いて、クーマン−染色５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電 気泳動ゲルのレーザー・デンシトメトリーによって測定した［Ｃｕｎｎｉｎｇｈ ａｍおよびｆｅｌｌｓ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４４：　１０８１−１０８５　（ １９８９）］。

各突然変異体の結合親和性は、抗−受容体モツクローナル抗体（Ｍａｂ２６３） を用い、文献［５ｐｅｎｃｅｒら、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６３：　７ ８６２−７８６７　（１９８８）；　Ｆｕｈら、　Ｊ、Ｂｉｏ戟B ｑ徂ｍ、　２６５：　３１１１−３１１５　（１９９０）］記載のように”’Ｉ 　ｈＧＨを置換することによって測定した。

異なる経路（図６）によって選択したｈＧＨ突然変異体数の結果を表ｎｌに示す 。

これら突然変異体の多くが、ｈＧＨｂｐに対して野生型ｈＧＨよりも強い結合親 和性を有している。最も改善された突然変異体であるＫＳＹＲは、野生型ｈＧＨ よりも５．６倍高い結合親和性を有している。これら検定した突然変異体の中で 選択された最も弱い突然変異体は、ｈＧＨに比べて結合親和性が約１０倍低いも のでしかなかった。

結合検定は、ｈＰＲＬｂｐ−結合に対して選択した突然変異体について実施する こともできる。

」旦、ｈＧＨｂｐに対する競合結合 それぞれの突然変異体が見い出された選択したプールを、ＩＧ（第１のグリ／ン 選択）、３Ｇ（第３のグリシン選択）、３Ｈ（第３のｈＧＨ選択）、３＊（第３ の選択：ｈＰＲＬｂｐに結合しなかったがｈＧＨｂｐに結合した）と表示する。

配列決定したすべてのクローンの中に現れる各突然変異体の回数を（）に示す。

突然変異体　Ｋｄ　（ｎＭ）　Ｋｄ（突然変異体）　プール／Ｋｄ（ｈＧＨ） ＫＳＹＲ（６）　０．０６＋Ｏ，ＯＩ　０．１８　１Ｇ、３ＧＲ３ＦＲＯ，ＩＯ ＋０．０５　０．３０　３ＧＲＡＹＲＯ，１３＋０．０４　０．３７　３＊ＫＴ ＹＫ（２）　０．１６＋０．０４　０．４７　Ｈ，３ＧＲ３ＹＲ（３）　０．２ ０＋０．０７　０．５８　１Ｇ、３Ｈ１３ＧＫＡＹＲ（３）　０．２２＋０．０ ３　０．６６　３ＧＲＦＦＲ（２）　０．２６＋０．０５　０．７６　３ＨＲＴ ＹＨＯ，６８＋０．１７　２．０　３８ＱＲＹＲ０，８３＋０．１４　２．５　 ３＊ＫＫＹＫ　１．１　＋０．４　３．２　３＊Ｒ３ＦＳ（２）　１．１　＋０ ．２　３．３　３Ｇ、＊ＫＳＮＲ３，１＋０．４　９．２　３＊結合に及ぼす加 酸および非加成性果 一部の残基において、特定アミノ酸の置換が周囲残基とは独立した実質的に同じ 作用を存している。例えば、＋７２Ｒ／１７４ＳのバックグラウンドにおいてＦ １７６Ｙの置換は結合親和性を２．０倍減少させる（ＲＳ　Ｆ　Ｒ対Ｒ３ＹＲ） 。同様に、１７２に／１７４ＡのバックグラウンドにおいてＦ１７６Ｙ突然変Ｘ 　体（ＫＡＹＲ）の結合親和性は、対応する１７６Ｆ突然変異体［Ｋ　Ａ　Ｆ　 Ｒ；　Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびｆｅｌｌｇ　（１９８９）］よりも２９倍弱 い。

他方、いくつかの選択したｈＧＨ突然変異体について測定した結合定数は、残基 １７２．１７４．１７６および１７８における一部のアミノ酸置換の非加成性の 効果を示す。例えば、１７２に／１７６Ｙのバックグラウンドにおいて、Ｅ１７ ４Ｓの置換は、Ｅ１７４Ａを含有する対応する突然変異体（ＫＡＹＲ）よりも３ ゜７倍強固にｈＧＨｂｐと結合する突然変異体（Ｋ　Ｓ　Ｙ　Ｒ）を与える結果 になる。しかし、１７２Ｒ／１７６Ｙのバックグラウンドにおいて、これらＥ１ ７４置換の効果は逆になる。この場合、Ｅ１７４Ａ突然変異体（ＲＡＹＲ）はＥ １７４Ｓ突然変異体（Ｒ３ＹＲ）よりも１．５倍強固に結合する。

このような近接残基における置換の結合に及ぼす非加成性効果は、いくつかの位 置においてランダム化されたライブラリーから最適突然変異体を選択する手段と してのタンパク質−ファージ結合選択の用途を示すものである。詳細な構造の情 報が存在せず、このような選択法がないと、最適突然変異体の発見までに多数の 置換の組合せが試されることになるであろう。

（以下、余白） 実ｍＭＩＸ　ホルモンーファージのへリノクス１ランダムカセットライブラリー からのｈＧＨ突然変異体の選択 実施例Ｖｌｌ＋に記載した方法を用いて、ｈＧＨｂｐおよび／またはｈＰＲＬｂ ｐへの結合に関与しているｈＧＨの別の領域、即ちヘリックス１の残基１０．１ ４．１８．２１をｐｈＧ　Ｈａｍ−ｇ　３　Ｐベクター（ｐｓＯ６４３としても 知られている；実施例Ｖｌｌ＋を参照）におけるランダム突然変異誘発の標的と した。

我々は「アンバーＪｈＧＨ−ｇ３構築物（ｐｈＧ　Ｈａｍ−ｇ　３　ｐと呼ふ） の使用を選択したが、この理由はそれが結合に対してより接近しやすい標的タン パク質ｈＧＨを作成するようであるためである。このことは、モノクローナル抗 体結合の比較ＥＬＩＳＡ検定からのデータによって支持される。ｐＳ　Ｏ１３２ ［Ｓ、　Ｂａ５ｓ、　、　Ｒ，Ｇｒｅｅｎｅ。

Ｊ、Ａ、Ｗｅｌｌｓ、　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　８：　３０６　（１９９０）コおよ びｐｈＧ　Ｈａｍ−ｇ　３の両方から生成したファージを、ｈＧＨのカルボキシ 末端の近くに結合決定基を有することが知られている３種の抗体（Ｍｅｄｉｘ２ 、ｌＢ５．Ｇ２、および５　Ｂ　７　、　Ｃ１０）［Ｂ、　Ｃ，Ｃｕｎｎｉｎｇ ｈａＩｌｌ。

ならびにヘリックス１および３中の決定基を認識する１種の抗体（Ｍｅｄｉｘ　 １　）　［Ｂ、　Ｃ。

Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ、Ｐｌｈｕｒａｎｉ、　Ｐ、Ｎｇ、Ｊ、Ａ、Ｗｅｌｌｓ、 　５ｃｉｅｎｃｅ　２４３：　１３３０　（１９８９）：　a、Ｃ，Ｃｕ ｎｎｉｎｇｈａｍおよびＪ。＾、Ｗｅｌｌｓ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４４：　１ ０８１　（１９８９）］を用いて試験した。ｐｈｃＨａｍ−ｇ　３からのファー ジミド粒子は、ｐｓＯ１３２からのファージミド粒子よりも抗体Ｍｅｄｉｘ２、 ｌＢ５゜Ｇ２および５Ｂ７．Ｃ１０とさらに強く反応した。特に、ｐｓ０１３２ 粒子の結合は、１Ａｅｄｉｘ　ｌに対する結合と比較して、Ｍｅｄｉｘ２および ５Ｂ７．Ｃ１０の両方に対しては＞２０００倍減少し、ｌＢ５．Ｇ２に対しては 〉２５倍減少した。一方、ｐｈＧ　Ｈａｍ−ｇ　３フアーンの結合は、Ｍｅｄｉ ｘｌに対する結合と比較して、Ｍｅｄｉｘ２、ｌＢ５．Ｇ２および５Ｂ７．Ｃ１ ０抗体に対してそれぞれ約１．５倍、１．２倍および２．３倍弱くなるにすぎな かった。

カセット突然゛異誘発によるヘリックス１ライブラリーの作成アラニン−スキャ ニング突然変異誘発［Ｂ、Ｃ，Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ、　Ｐ、Ｊｈｕｒａｎｉ＋ 　Ｐ、Ｎｇ、　Ｊ、＾。

１’ｅｌｌｓ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４３：　１３３Ｇ　（１９８９）；　Ｂ、 Ｃ，ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＪ、Ａ、Ｗｅｌｌｓ、　５モ奄■獅モ■ ２４４：　ｔｏｇｔ　（１９８９）、　１５．１６］によって以前に同定されて いたヘリックス１中の残基に突然変異を行なって、ｈＧＨおよび／またはｈＰＲ Ｌ受容体（それぞれ、ｈＧＨｂｐおよびｈＰＲＬｂｐと呼ぶ）の細胞外ドメイン の結合を変調させた。カセット突然変異誘発は実質的に文献［Ｊ、Ａ、１１ｅｌ ｌｓ、　Ｍ、Ｖａｓｓｅｒ、　Ｄ、Ｂ、Ｐｏｗｅｒｓ、　Ｇｅｎｅ　３４：　３ １５　（１９８５）コ記載のように行なった。このライブラリーは、オリゴヌク レオチド：をそれぞれ用いる突然変異誘発によって唯一のＫｐｎｌ（ｈＧＨコド ン２７のところ）およびＸｈｏＩ（ｈＧＨコドン６のところ）制限部位（下線部 ）が挿入されたｐＨＧ　Ｈａｗ＋−ｇ３［Ｔ、Ａ、Ｋｕｎｋｅｌ、　Ｊ、Ｄ、Ｒ ｏｂｅｒｔｓ、　Ｒ，Ａ、Ｚａｋｏｕｒ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、 　１５４：　３U７−３８２］ の突然変異体を用いる、４残基を一度にすべて突然変異させるカセット突然変異 誘発（実施例Ｖｌｌ＋を参照）によって作成した。また、後者のオリゴは＋１の フレームンフト（下線部の最後のＧ）を導入し、これが出発ベクターからの翻訳 を終止させ、ファージミドライブラリー中の野生型のバックグラウンドを最少に した。この出発ベクターをｐＨ０５０８Ｂと命名した。ｈＧＨ残基１Ｏ１１４， １８，２１を突然変異させたヘリックス１ライブラリーは、相補性オリゴヌクレ オチド：５’　−ｐＴＣＧ　ＡＧＧ　ＣＴＣＮＮＳ　ＧＡＣＡＡＣＧＣＧ　ＮＮ Ｓ　ＣＴＧ　ＣＧＴ　ＧＣＴ　ＮＮＳ　ＣＧＴ　ＣＴＴ　ＮＮＳ　Ｃ`Ｇ ＣＴＧ　ＧＣＣＴＴＴ　ＧＡＣＡＣＧ　ＴＡＣ−３″および５’　−ｐＧＴ　Ｇ ＴＣＡＡＡ　ＧＧＣＣＡＧ　ＣＴＧ　ＳＮＮ　ＡＡＧ　ＡＣＧ　ＳＮＮ　ＡＧＣ ＡＣＧ　ＣＡＧ　ＳＮＮ　ＣＧＣＧＴＴＧＴＣＳＮＮ　ＧＡＧ　ＣＣ−３’ から調製したカセットを、ｐＨ０５０８Ｂの大きいＸｈｏｌ−Ｋｐｎｌフラグメ ントに連結することによって作成した。このＫｐｎ１部位は連結生成物の連結部 において破壊され、非突然変異バックグラウンドの分析に制限酵素消化を使用す ることを可能にした。

このライブラリーは少なくとも１０７の別個の形質転換体を含んでおり、このラ イブラリーか完全にランダム（ｔｏ’の異なるコドン組合せ）であるときには、 平均して約１０コピーのそれぞれ可能な突然変異ｈＧＨ遺伝子が得られる。Ｋｐ ｎｌを用いる制限分析により、ヘリックスｌライブラリー構築物の少なくとも８ ０％が挿入されたカセットを含有していることがわかった。

このライブラリーからのｈＧＨ−ファージの結合豊富化を、既述（実施例Ｖｌｌ ＋）のようにオキシラン−ポリアクリルアミドビーズ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉ ｃａｌ　Ｃｏ、）上に固定化したｈＧＨｂｐを用いて行なった。へりソクス１中 の４つの残基（ＦＩＯ，Ｍ１４、Ｈ２ＳおよびＨ２１）が同じように突然変異さ れ、４および６サイクル後に非野生型フンセンサスが現れた（表Ｖｌｌ＋）。ヘ リックス１の疎水性面の１ｏ位は疎水性である傾向にあり、一方、親水性面の２ １および１８位は傾向的にＡｓｎが優勢であり、１４位には明白なコンセンサス が認められなかった（表ＩＸ）。

ｈＧ　Ｈｂｐに対するこれらｈＧＨ突然変異体の結合定数は、非サプレッサー大 腸菌株１６Ｃ９中で遊離のホルモン変異体を発現させ、このタンパク質を精製し 、モしてｈＧＨｂｐからの標識化ｗｔ−ｈＧＨの競合置換により検定することに よって測定した（実施例Ｖｌｌ＋を参照）。示したように、いくつかの突然変異 体がｗｔ−ｈＧＨが結合するよりもｈＧＨｂｐに強（結合する。

轟■Ｉ１．ｈＧＨヘリックスｌ突然変異体の選択ファージミド粒子上に発現され たｈＧＨ変異体（残基ＦＩＯ。

Ｍ１４、Ｈ２Ｓ、Ｈ２１においてランダム突然変異）を、ｈＧＨｂｐ−ヒ−７： へＣＩ）結合、およびｈＧＨ（０，４ＩＩＭ）緩衝液ト次イテクリンン（０，２ Ｍ、　ｐＨ２）緩衝液にょる溶離によって選択した（実施例Ｖｌｌ＋を参照）。

Ｇ１ｙ溶離 ＨＧ　Ｎ　Ｎ Δ見１選択したヘリックスｌライブラリーからのコンセンサス配列観察された頻 度は、表示したアミノ酸を有する配列決定した全クローンの分数である。名目頻 度はＮＮＳの３２コドン縮重に基づいて計算した。最大豊富化因子は、ある残基 に対する名目頻度値に依存して１１〜３２に変化する。単一のアラニン突然変異 に対する［Ｋｄ（Ａ　ｌａ突然変異体）／Ｋｄ（ｖｔ−ｈＧＨ）］の値は、文献 ［Ｂ、　Ｃ。

ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＪ、　Ａ、　Ｗｅｌ　Ｉｓ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２ ４４：　１０８１　（１９８９）　；　Ｂ、　Ｃ，Ｃｕｎｎ奄獅■■≠香A　Ｄ 、　Ｊ。

１１ｅｎｎｅｒ、　Ｊ、Ａ、Ｗｅｌｌｓ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４７：　１４６ １　（１９９０）　：　Ｂ、Ｃ，Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍおよ■i、　Ａ、　ｔｅ ｌ Ｉｓ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ八へ８：　３４０７ 　（１９９１）コから採用した。

残基　／　Ｋ　ｄ（ｗＬ−ｈＧ　Ｈ）　残基　観察　名目　豊富化ＦＩ０　５． ９　ＨＯ，５００，０３１１７Ｆ　Ｏ，１４０，０３１５ Ａ　Ｏ，１４０，０６２２ Ｍ１４　２．２　Ｇ　Ｏ，５００，０６２８Ｗ　Ｏ，１４０，０３１５ Ｎ　Ｏ，＋４　０．０３１　５ Ｓ　Ｏ，１４０，０９３２ Ｈ１８１，６Ｎ　Ｏ，５００，０３１１７Ｄ　Ｏ，１４０，０３１５ Ｆ　Ｏ，１４０，０３１５ ８２１０，３３Ｎ　Ｏ，７９０，０３１２６ＨＯ，０７０，０３１２ ｆｉＸ、　ｈＧＨｂｐに対する精製したｈＧＨへワックス１突然変異体の結合競 合結合実験は、［”’Ｉ］ｈＧＨ（野生型）、ｈＧ　Ｈｂｐ（細胞外受容体ドメ イン、残基１〜２３８を含む）、およびＭａｂ２６３　［Ｂ、　Ｃ，Ｃｕｎｎｉ ｎｇｈａｍ、　Ｐ、　Ｊｈｕｒａｎｉ、　Ｐ、　Ｎｇ、　Ｊ、＾。

Ｔｅ１１ｇ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４３：　１３３０　（１９８９）］を用いて 行なった。数値Ｐは、１またはそれ以上の選択ラウンド後に配列決定した全クロ ーン中の各突然変異体の発生率を分数で示すものである。

配列の位置　Ｐ　Ｋｄ（ｎＭ）＼ｆ（Ｋｄ突然変異体）　Ｋｄ（ｗｔ−ｈＧＨ） ＨＧ　Ｎ　Ｎ　Ｏ，５００，１４±０．０４　０．４２Ａ　Ｗ　Ｄ　Ｎ　Ｏ，１ ４０，１０±０．０３　０．３０ｗｔ＝　Ｆ　Ｍ　ＨＨＯＯ，３４±０．０５　 （１）Ｆ　Ｓ　Ｆ　Ｌ　Ｏ，０７０，６８±０．１９　２．ＯＹ　Ｔ　Ｖ　Ｎ　 Ｏ，０７０，７５±０．１９　２．２Ｌ　Ｎ　Ｓ　ＨＯ，０７０，８２±０．２ ０　２．４Ｉ　Ｎ　Ｉ　Ｎ　Ｏ，０７１，２±０．３１　３．４実施例Ｘ　ホル モン−ファージの豊富化により予め見い出した突然変異を含むヘリックス４ラン ダムカセツトライブラリーからのｈＧＨ変異体の選択ｈＧＨ進化変異体の新入の 非結合相同体を用いる我々の実験から、多数の独立したアミノ酸置換を組合せる ことによって特定受容体との結合に関してｈＧＨの累積して改善された突然変異 体を得ることができると示唆される［Ｂ、　Ｃ，ＣｕｎｎｉｎｇｈａｈＧＨ受容 体にさらに強固に結合することがわかったヘリックス４ａライブラリーから選択 したヘリックス４の二重突然変異体（ＥＩ７４Ｓ／Ｆ１７６Ｙ；実施例ｖ１１１ を参照）をさらに改善する試みにおいて、ヘリックス４ｂライブラリーを作成し た。Ｅ　１７４３／Ｆ　１７６Ｙ　ｈＧＨ突然変異体をバックグラウンドの出発 ホルモンとして用いて、ヘリックス４の親水性面上の１７４および１７６位の周 りの残基に突然変異を行なった。

カセット突然変異誘発によるヘリックス４ｂライブラリーの作成実質的に文献［ Ｊ、＾、Ｗｅｌｌｓ、　Ｍ、Ｖａｓｓｅｒ、　Ｄ、Ｂ、Ｐｏｖｅｒｓ、　Ｇｅｎ ｅ　３４：　３１５　（１９８５）］記載のようにしてカセット突然変異誘発を 行なった。唯一のＢｓｔＥＩＩおよびＢｇｌｌｌ制限部位が予め挿入されたｐｈ Ｇ　Ｈａｎｔ　３　（実施例Ｗｉｌ＋）の突然変異体を用い、４残基を一度にす べて突然変異させるカセット突然変異誘発（実施例ｎ１１を参照）を用いて、Ｒ １７４Ｓ／Ｒ１７６Ｙバツクグラウンド内で残基１６７．１７１，１７５および １７９を突然変異させたヘリックス４ｂライブラリーを作成した。相補性オリゴ ヌクレオチド。

５’　−ｐＧ　ＴＴＡ　ＣＴＣτＡＣＴＧＣＴＴＣＮｌｌ５　ＡＡＧ　ＧＡＣＡ ＴＧ　ＮＮＳ　ＡＡＧ　ＧＴＣＡＧＣＮＮＳ　ＴＡＣＣＴＧ　ＣＧＣＮＮＳ　Ｇ ＴＧ　ＣＡＧ　ＴＧＣ＾−３′および５’　−ｐＧＡ　ＴＣＴ　ＧＣＡ　ＣＴＧ 　ＣＡＣ５ＮＩＩ　ＧＣＧ　ＣＡＧ　ＧＴＡ　ＳＮＮ　ＧＣＴ　ＧＡＣＣＴＴ　 ＳＮＮ　ＣＡＴ　fＴＣ ＣＴＴ　ＳＮＮ　Ｇ＾＾ＧＣＡ　ＧＴＡ　ＧＡ−３’から調製したカセットを、 ベクターのＢｓＬＥ　ＩＩ−Ｂｇｌｌｌｔ３１位に挿入した。このＢｓｔＥ１１ 部位は連結したカセットにおいて削除された。このヘリックス４ｂライブラリー 由来の１５の選択されなかったクローンを配列決定した。これらのうち、カセッ ト挿入体を欠くものはなく、２０％がフレーム／フトシており、７％が非サイレ ント突然変異を有していた。

胚はゆ司１１世９殖米 このライブラリーからのｈＧ）（−ファージの結合豊富化を、既述（実施例Ｖｌ ｌ＋）のようにオキシラン−ポリアクリルアミドビーズ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ＠ １ｃａｌ　Ｃｏ、）上に固定化しｆ：、ｈＧＨｂｐを用いて行なった。６サイク ルの結合の後に、合理的かつ明白なコンセンサスが現れた（表ＸＩ）。興味ある ことに、すべての位置が極性の残基、特にＳｅｒ、　ＴｈｒおよびＡｓｎを含有 する傾向があった（表Ｘ１１）。

ｈＧＨ突然変異体の検定 ｈＧＨｂｐに対するこれらｈＧＨ突然変異体の一部の結合定数を、非サプレッサ ー大腸菌株１６Ｃ９中で遊離のホルモン変異体を発現させ、このタンパク質を精 製し、そしてｈＧＨｂｐからの標識化ｗｔ−ｈＧＨの競合置換により検定するこ とによって測定した（実施例ｎｌｌを参照）。示したように、いくつかのへソッ クス４ｂ突然変異体のｈＧＨｂｐに対する結合親和性はｖＬ−ｈＧＨのものより も強固であった（表ＸＩ＋１）。

ｈＧＨ変異体の受容体選択性 最後に、我々は、ｈＰＲＬｂｐに結合する能力について、いくつかの一層強固な ｈｃＨｂｐ結含突然変異体の結合親和性の分析を始めた。Ｅ　１７４Ｓ／Ｆ　１ ７６Ｙ突然変異体は、ｈＧＨに比べてｈＰＲＬｂｐに２００倍弱く結合する。Ｅ Ｌ７４Ｔ／Ｆ１７６Ｙ／Ｒ１７８におよびＲ１６７Ｎ／Ｄ１７１Ｓ／Ｅ１７４Ｓ ／Ｆ１７６Ｙ／Ｉ　１７９Ｔ突然変異体のそれぞれは、ｈＧＨに比べ）、ＰＲＬ ｂｐに〉５００倍弱く結合する。即ち、ファージ表示法によってｈＧＨの新規な 受容体選択性突然変異体を得ることができる。

ホルモン−ファージミド選択によって同定される特定残基の情報内容３種のｈＧ Ｈ−ファージミドライブラリー（実施例Ｗｉｌｌ、　ｌＸ５Ｘ”）において突然 変異させた１２残基のうち、４種が野生型残基の強い（他を排除するものではな い）保存を示した（Ｋ　１７２、Ｔ１７５、Ｒ１７６およびＲ１７８）。驚くべ きことではないが、Ａｌａに変換したときにｈＧＨｂｐに対する結合親和性に最 大の破壊（４〜６０倍）を引き起こす残基が存在した。Ａｌａ置換が結合に対し てより弱い作用（２〜７倍）を引き起こす一部の４個の他の残基（ＦＩＯ，Ｍ１ ４、Ｄ１７１および１１７９）が６在し、これらの位置はわずかの野生型フンセ ンサスしか示さなかった。最後に、ｈＰＲＬｂｐへの結合を促進したがｈＧＨｂ ｐへの結合は促進しなかった別の４残基（Ｒ１８、Ｒ２１、Ｒ１６７およびＲ１ ７４）は、ｈＧＨｂｐ−ビーズによる選択によって野生型ｈＧＨ配列に対してど のようなコンセンサスも示さなかった。事実、２つの残基（Ｒ１７４およびＲ２ １）は、Ａｌａ置換したときにｈＧＨｂｐに対する結合親和性を２〜４倍に高め る［Ｂ、Ｃ，Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ、　Ｐ、Ｊｈｕｒａｎｉ、　Ｐ、Ｎｇ、　Ｊ 。

４０７　（１９９１）］。即ち、アラニン−スキャニング突然変異誘発データは 、それぞれの位置を置換する可変性と十分合理的に関係している。事実、アラニ ン置換によって引き起こされる結合親和性の減少［Ｂ、Ｃ，Ｃｕｎｎｉｎｇｈａ ｍ、　Ｐ、Ｊｈｕｒａｎｉ、　Ｐ、Ｎｇ＋　Ｊ、Ａ、Ｙｅ（１９９１）’ｌは、 ３〜６ラウンドの選択後にファージミドプール中に野生型残基が見い出される割 合を合理的に予言するものとなる。アラニン−スキャニングの情報は結合を変調 させる側鎖を標的化するのに有用であり、ファージ選択は側鎖の最適化に、およ び置換のための各部位（および／または部位の組合せ）の可変性を定義するのに 適している。スキャニング突然変異法［Ｂ、Ｃ，Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ、　Ｐ、 Ｊｈｕｒａｎｉ。

面の設計およびインビトロでの分子進化の研究に対する強力な手段である。

ホルモン−ファージミドライブラリーの反復富化のｈＧＨ中の組合せ突然変異が 受容体に対する結合親和性に加酸効果を有して（する場合には、結合を改良する ためのホルモン−ファージミド豊富化により既知となった突然変異を、単に制限 フラグメントの切断と連結または突然変異誘発によって組合わせてｈＧＨの累積 して最適化された突然変異体を得ることができる。

一方、受容体結合を最適化するｈＧＨの１つの領域における突然変異が、分子の 重なり合うかまたは別の領域における突然変異と構造的または機能的１こ適合し ないこともある。このような場合には、以下に挙げる反復豊富化法の−べつかの 変法のいずれかによってホルモン−ファージミド豊富化を行なうことができる： （１）カセットまたは他の突然変異誘発法によって分子の２つ（または、恐らく はそれ以上）の領域のそれぞれにおいてランダムＤＮＡライブラリーを創製する ことができる二次いで、これら２つのＤＮＡライブラリーからの制限フラグメン トの連結によって混合ライブラリーを創製することができる；（２）分子の１つ の領域における突然変異により結合を最適化されたｈＧＨ変異体を、ヘリックス ４ｂライブラリーの例のように分子の第２の領域においてランダムに突然変異さ せることができる：（３）２またはそれ以上のランダムライブラリーを、ホルモ ン−ファージミド豊富化により、改善された結合について巡分吟に選択すること ができる：この最適化結合部位のｒ１選択」の後、なお部分的な別のライブラリ ーを制限フラグメントの連結によって再混合して、分子の２またはそれ以上の領 域において部分的に異なっている単一のライブラリーを得ることができ、次いで このライブラリーをホルモン−ファージミド豊富化を用いて最適化結合について さらに選択することができる。

ｐＸｌ、４および６サイクルの豊富化の後にヘリックス４ｂライブラリーから選 択したｈＧＨの突然変異ファージミド それぞれがＥ　１７４Ｓ／Ｆ　１７６Ｍ二重突然変異を含むｈＧＨへワックス４ ｂ突然変異体（残基１６７．１７１，１７５．１７９においてランダム突然変異 ）を、ｈＧＨｂｐ−ビーズへの結合、およびｈＧＨ（０，４＋ａＭ）緩衝液と次 いでグリシン（０，２Ｍ５ｐＨ２）緩衝液による溶離によって選択した。１つの 突然変異体く＋）が疑突然変異Ｒ１７８Ｈを含んでいた。

Ｄ　Ｎ 老人■　選択したライブラリーからのコンセンサス配列観察された頻度は、表示 したアミノ酸を有する配列決定した全クローンの分数である。名目頻度はＮＮＳ の３２フドン縮重に基づいて計算した。最大豊富化因子は、ある残基に対する名 目頻度値に依存して１１〜１６〜３２に変化する。単一のアラニン突然変異に対 する［Ｋｄ（Ａｌａ突然変異体）／　Ｋ　ｄ（ｖｔ−ｈＧ　Ｈ）：］の値は、以 下の文献から採用した。１７５位に対してはＴ１７５Ｓ突然変異体の値のみ［Ｂ 、Ｃ。

ＣｕｎｎｉｎｇｈａＩＩｌ、　Ｐ、Ｊｂｕｒａｎｉ、　Ｐ、Ｎｇ＋　Ｊ、Ａ、Ｔ ｅ１ｌｓ＋　５ｃｉｅｎｃｅ　２４３：　ｔａ３ｏ　（１９W９）　；　Ｂ、Ｃ ，Ｃｕ ｎｎｉｎｇｈａｍおよびＪ、＾、Ｗｅｌｌｓ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４４：　１ ０８１　（１９８９）　；　Ｂ、Ｃ，Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ{　ＤＪ、Ｈ ｅｎｎｅｒ、　Ｊ、Ａ、Ｗｅｌｌｓ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４７：　１４６１　 （１９９０）　；　Ｂ、Ｃ，ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＪA　Ａ、　Ｗｅｌｌ ｓ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　ＵＳ＾８８：　３４０７ 　（＋９９１）］。

残基　／Ｋｄ（ｗｔ−ｈＧＨ）　残基　観察　名目　」１厳化Ｒ１６７０，７５ Ｎ　Ｏ，３５０，０３１１１Ｄ０．２４０．０３１　８ Ｋ　Ｏ，１２０，０３１４ Ａ　Ｏ，１２０，０６２２ Ｄ１７１　７．Ｉ　Ｓ　Ｏ，７６０，０９３８Ｎ　Ｏ，１８０，０３１６ Ｄ　Ｏ，１２０，０３１４ Ｔ１７５　３．５　Ｔ　Ｏ，８８０，０６２１４Ａ　Ｏ，１２０，０３１４ ＋１７９　２．７　Ｔ　Ｏ，７１０，０６２１１Ｎ　Ｏ，１８０，０３１６− 表狂Ｉ１．　ｈＧｔ（ｈｐに対する精製したｈＧＨ突然変異体の結合競合結合実 験は、［’　”　Ｉ　］ｈＧ　Ｈ（野生型）、ｈＧＨｂｐ（細胞外受容体ドメイ ン、残基１〜２３８を含む）、およびＭａｂ２６３　（ＩＩ）を用いて行なった 。数値Ｐは、ｌまたはそれ以上の選択ラウンド後に配列決定した全クローン中の 各突然変異体の発生率を分数で示すものである。ヘリックス４ｂ突然変異（＊） はｈＧＨ（Ｅ　１７４　Ｓ／Ｆ１７６Ｙ）のバックグラウンドにあることに注意 すべきである。このヘリックス４ｂ突然変異のリストにおいて、！６７．１７１ ，１７５．１７９にｗｔ残基を有するＥＩ７４Ｓ／Ｆ１７６Ｙ突然変異体（＊） は下線で示す。

／　Ｋｄ（ｖＬ−ｈＧ　Ｈ） Ｎ　Ｓ　Ｔ　Ｔ　Ｏ，１８０，０４±０．０２　０．１２Ｅ　Ｓ　Ｔ　Ｉ　Ｏ， ０６０，０４±０．０２　０．１２Ｋ　Ｓ　Ｔ　Ｌ　Ｏ，０６０，０５±０．０ ３　０．１６Ｎ　Ｎ　Ｔ　Ｔ　Ｏ，０６０，０６±０．０３　０．１７ＲＤ　Ｔ 　Ｉ　ＯＯ，０６±０．０１　（０，１８）Ｎ　Ｓ　Ｔ　Ｑ　Ｏ，０６０，２６ ±０．１１　０．７７実施例ｘ１　ファージミド表面におけるＦａｂ分子の組立 てプラスミドの構築 プラスミドｐＤＨ１８８は、ＨＥＲ−２受容体を認識する４Ｄ５と呼ばれるヒト 化１ｇＧ抗体のＦ　ａｔｅｊ分をフードしているＤＮＡを含有する。このプラス ミドは大腸菌株５ＲＩＯＩ中に含まれ、ＡＴＣＣ［Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ ］に寄託されている。

簡単に説明すると、このプラスミドは次のようにして調製された。出発プラスミ ドは、上記のアルカリホスファターゼプロモーターを含有するｐｓＯ１３２であ る。ヒト成長ホルモンをコードしているＤＮＡを切り出し、プラスミドの末端を 連結に適合するようにする一連の操作を行なった後、４Ｄ５をコードしているＤ ＮＡを挿入した。この４Ｄ５　ＤＮＡは２つの遺伝子を含有している。第１の遺 伝子は、軽鎖の可変および不変領域をコードしており、その５゛末端に５ｔｌｌ シグナル配列をコードしているＤＮＡを含有する。第２の遺伝子は４つの部分を 含有し、その第１は５′末端の５ｔｌｌシグナル配列をコードしているＤＮＡで ある。

これに重鎮の可変ドメインをコードしているＤＮＡが続き、次いで重鎮不変領域 の第１ドメインをコードしているＤＮＡが続き、さらにＭ１３遺伝子Ｉ１１をコ ードしているＤＮＡが続（。この構築物の顕著な特徴が図１０に示されている。

４Ｄ５をコードしているＤＮＡの配列を図１１に示す。

大腸菌の形質転換およびファージの生成ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およ び電気穿孔の両方を用いて、５ＲＩＯＩ細胞にプラスミドを導入した。ＰＥＧコ ンピテントな細胞は、ＣｈｕｎｇおよびＭｉｌ　ｌｅｒ［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ １ｄｓ　Ｒｅｓ、１６：　３５８０　（１９８ｇ）コの方法に従って調製し、形 質転換した。

電気穿孔にコンピテントな細胞は、ＺａｂａｒｏｖｓｋｙおよびＷｉｎｂｅｒｇ ［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１８：　５９１２　（１９９０）］の 方法に従って調製し、次いで電気穿孔により形質転換した。ＳＯＣ培地［Ｓａｍ ｂｒｏｏｋら（上記）が記載］（１ｍｌ）に細胞を蒔いた後、振盪しなから３７ °Ｃで１時間増殖させた。この時点で、細胞濃度をＯＤ、、。の光分散を用いて 測定した。滴定したＫＯ７フアージストノクを加えて感染多重度（Ｍｏｌ）が１ ００となるようにし、このファージを室温で２０分間、細胞に付着させた。次い で、この混合物を２ＹＴブロス［Ｓａｎ＋ｂｒｏｏｋら（上記）が記載］（２５ ＋ｅｌ）中に希釈し、振盪しながら３７°Ｃで一晩インキユベートした。翌日、 ５０００ｘｇで１０分間遠心することによって細胞をペレット化し、上清を集め 、０．５ＭＮａＣ１および４％ＰＥＧ（最終濃度）を用いて室温で１０分間、フ ァージ粒子を沈澱させた。１０、ＯＯＯｘｇで１０分間遠心することによってフ ァージ粒子をペレット化し、ＴＥＮ［１０ｍＭトリス（ｐＨ７，６）、１ｍＭＥ ＤＴＡ、および１５００１Ｍ　ＮａＣｌコ（１ｍｌ）に再懸濁し、４°Ｃで保存 した。

抗原被覆したプレートの調製 ０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ８，５）中のＢＳＡ（対照抗原）の０．５ｏ ＋ｇ／ｍｌ溶液またはＨＥＲ−２抗原の細胞外ドメイン（ＥＤＣ）の０．１＋ｇ ／腸ｌ溶液からの０゜５１づつを用いて、Ｆａｌｃｏｎ　１２ウ工ル組織培養プ レートのウェルを被覆した。溶液をウェルに適用した後、このプレートを揺れ台 の上にて４℃で一部インキユベートした。次いで、最初の溶液を除去し、ブロッ ク緩衝液［０，１Ｍ炭酸水素ナトリウム中に３０ｍｇ／ｍｌ　Ｂ　Ｓ　Ａ］（０ ，５ｍ１）を適用し、そして室温で１時間インキュベートすることによって、プ レートをブロックした。最後に、このブロック緩衝液を除去し、緩衝液Ａ［ＰＢ Ｓ、０．５％ＢＳＡ、および０．０５％ｙイー７２０］（１１）を加え、そして このプレートをファージ選択に使用するまで４℃で１０日間まで保存した。

ファージの選択法 約１０＠のファージ粒子を１００倍過剰のに○７ヘルバーフアージおよび緩衝？ 夜Ａ　（１ｍｌ）と混合した。この混合物を０．５麿ｌづつ２つに分け、その１ つをＥＣＤ彼覆９エルに適用し、他方をＢＳＡ被覆ウェルに適用した。これらの プレートを振盪させながら室温で１〜３時間インキュベートし、次いで緩衝液Ａ （１１づつ）を用いて３０分間、３回洗浄した。プレートからのファージの溶離 は次の２つの方法のいずれかにより室温で行なった：　（１）０．０２５ｍｇ／ ＋ｉｌの精製Ｍｕ４Ｄ５抗体（ネズミ）の最初の一部インキュベートとそれに続 いて酸溶離緩衝液［０，２Ｍグ’Ｊ　シン（ｐＨ２，１）、０．５％ＢＳＡ、お よび０．０５％ｙイー７２０］（０，４１１１）による３０分間インキュベート 、または（２）酸溶離緩衝液単独によるインキコベート。次いで、溶出液をＩＭ ）リス塩基で中和し、ＴＥＮ（０，５ｍｌづつ）を加えた。次に、これら試料を 増殖させ、滴定し、４℃で保存した。

ファージの増殖 溶出したファージの一部を２ＹＴブロス（０，４ｍ１）に加え、約１０”の中間 対数期雄性大腸菌株５ＲＩＯＩと混合した。ファージを室温で２０分間、細胞に 付着させ、次いで５０μｇ／ｍｌカルベニシリンおよび５μｓ／ａ＋１テトラサ イクリンを含有する２ＹＴグロス（５ｍｌ）に加えた。これら細胞を、中間対数 相に到達するまで３７°Ｃで４〜８時間増殖させた。ＯＤ、、、を測定し、細胞 をファージ生成用のＫＯ７ヘルパーフアージに重感染させた。ファージ粒子を得 た後、これらを滴定してコロニー形成単位（ｃｆｕ）数を測定した。これは、あ るファージストックの連続希釈液の一部を取り、中間対数期の５ＲＩＯＩに感染 させ、５０シｇ／ｍｌカルベニシリン含有のＬＢプレートにブレーティングする ことにより行なった。

ＲＩＡ親和性の測定 ＥＣＤ抗原に対するＦａｂファージおよびｈ４Ｄ５Ｆａｂフラグメントの親和性 を、競合受容体結合Ｒ［Ａ［Ｂｕｒｔ、Ｄ、Ｒ，、Ｒｅｃｅ　ｔｏｒ　Ｂｉｎｄ ｉｎ　ｉｎ　Ｄｒｕｇ　Ｒｅ＋＋ｅａｒｅｈ、　Ｏ’Ｂｒ１ｅｎ、　Ｒ，Ａ、　 （編）、　ｐｐ、３−２９．　Ｄｅｋｋｅｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８６ ）］を用いて測定した。このＥＣＤ抗原は連続クロラミン−Ｔ法［Ｄｅ　Ｌａｒ ｃｏ、　Ｊ、　Ｅ、ら、　Ｊ、Ｃｅ１１．Ｐｈｙｓｉｏｌ、　１０９：　１４３ −１５２　（１９８１）］を用いて１１６）で標識した。これにより、受容体１ モルあたり０．４７モルのヨウ素が導入された１４μＣｉ／μｇの比活性を有す る放射活性トレーサーが得られた。０．５ｎｇ（Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａによる）の ＦａｂまたはＦａｂファージ、５０ｎＣｉの”Ｉ−ＥＣＤＩ−Ｌ／−サー、およ びある範囲量の未標識ＥＣＤ（６，４ｎｇ〜３２７７　ｎｇ）を含有する一連の ０．２ｍｌ溶液を調製し、室温で一部インキユベートした。

標識化ＥＣＤ−ＦａｂまたはＥＣＤ−Ｆａｂファージコンプレックスを、抗ヒト ＩｇＧ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ　４Ｏ−ＧＨ２３）と６％ＰＥＧ３０００の添加 により誘導される集合コンプレックスを形成させることによって、未結合の標識 化抗原から分離した。このコンプレックスを遠心（１５，０００ｘｇで２０分間 ）によってベレット化し、標識化ＥＣＤの量（ｃｐＨ）をガンマカウンターで測 定した。解離定数（Ｋｄ）は、スカッチャ匝ｍ、　１０７：　２２０−２３９　 （１９８０）コを用いて計算した。このＫｄ値を図１３に示す。

競合細胞結合の検定 ロドゲン法を用い　１１５１によりネズミ４Ｄ５抗体を４０〜５０μＣｉ／μｇ の比活性に標識した。一定量の標識化抗体と増加量の未標識変異Ｆａｂを含有す る溶液を調製し、９６ウ工ル微量滴定皿中のほぼ全面の５Ｋ−ＢＲ−３細胞培養 物に加えたく標識化抗体の最終濃度は０．ｉｎＭであった）。４°Ｃで一部イン キユベートした後、上清を除去し、細胞を洗浄し、細胞に結合した放射活性をガ ンマカウンターで測定した。プログラムＬＩＧＡＮＤの改良バージョン［Ｍｕｎ ｓｏｎ、　Ｐ、およびＲｏｔｈｂａｒｄ、　Ｄ、　（上記）］を用いてデータを 分析することによってＫｄ値を決定した。

プラスミドｐＤＨ１８８（ＡＴＣＣＮｏ、６８６６３）の寄託は、特許手続上の 微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定およびその規則（ブダペ スト条約）のちとに為されている。これにより、寄託日から３０年間の生存微生 物の維持が確保されている。この微生物は、ブダペスト条約の条項のもとで、お よびジエネンテク、インコーポレイテッドとＡＴＣＣの間の同意のもとてＡＴＣ Ｃから入手可能となるものであり、関連米国特許の発行またはいずれかの米国も しくは外国特許出願の公開のいずれか早い方により、だれでもこの培養物の子孫 を永続的かつ制限されずに入手可能になることが保証されており、また、３５Ｕ ＳＣ！３１２２に従って権利を付与された米国特許商標庁長官およびそれに従う 規則（８８６０Ｇ６３８に具体的に言及している３７　ＣＦＲ目１．１４を含む ）によって決定された者に該子孫が入手可能になることが保証されている。

本出願の譲受人は、寄託微生物が適切な条件下で培養されたときに死滅している か、失われているか、または破壊されているときには、通知により該培養物の生 存試料と速やかに交換することに同意している。寄託培養物の入手可能性は、各 国特許法に従っていずれかの政府の権限のもとに認可された権利に違反して本発 明を実施するライセンスと解釈すべきではない。

以上に既述した明細書は、当業者に本発明の実施を可能ならしめるに十分である と考えられる。寄託が為された態様は本発明の特定態様の独立した例示として意 図されており、機能的に等価なあらゆる培養物が本発明の範囲内にあるので、本 発明は寄託された微生物によってその範囲を限定されるものではない。本明細書 中の物質の寄託は、本明細書中に含まれる既述が本発明のいずれかの態様（最良 の態様を含む）の実施を可能にするに不適切であるということを認めたものでは なく、また、特許請求の範囲をその特定の例示に限定することを意図するもので もない。実際には、本明細書中で説明および示したものに加えて本発明の種々の 修飾が上記既述から当業者には明白になるものであり、これらは添付した請求の 範囲内に入るものである。

必然的に本発明を好ましい態様との関係で説明したが、上記明細書を読んだ後に 当業者なら、本発明の思想および範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載 した対象に種々の変化、等個置換、変異を加えることができるであろう。即ち、 本発明は本明細書に具体的に記載した方法以外の方法で実施することができる。

従って、本願の特許証により認められる保護は添付した請求の範囲およびその等 飾物によってのみ限定されるものである。

（以下、余白） 客ｍ％囚吐　へワックスｌおよびヘリックス４　ホルモン−ファージ変異体の組 合せ体からのｈＧＨ変異体の選択 ｈＧＨの加酸変　体の作 加成性の原理［３，＾、１ｅｌｌｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２９：　１ １５０９　（１９９０）］によると、タン１＜り質の異なる部分の突然変異が相 互に作用を及ぼしていないときであっても、それらを組合せることによって、別 の分子に対する結合の遊離エネルギーにおいて加酸的な変化が得られることが予 想される（変化はΔΔＧ　ｂ１４１ｄｌｌ’１ｇの点で加法的であるか、または Ｋｄ＝ｃｖｐ［−ΔＧ／ＲＴ］の点で乗法的である）。即ち、結合親和性におい て２倍の増加を与える突然変異は、３倍の増加を引き起こす第２の突然変異と組 合せたときに、出発変異体の６倍増加した親和性ををする二重突然変異を与える ことが予想される。

ｈＧＨ−ファージ選択によって得た複数の突然変異がｈＧ　Ｈｂｐ（ｈＧ　Ｈ− 結合タンノ（り質；ｈＧＨ受容体の細胞外ドメイン）結合において累積的に良好 な効果を与えるか否かを試験するため、ヘリックス１ライブラリーに由来するｈ ＧＨの最も強固に結合する３ｆｉの変異体（実施例ＩＸ：　Ｆ　１０Ａ／ＭＩ　 ４Ｗ／Ｈ１８Ｄ／Ｈ２ＩＮ、Ｆ１０Ｈ／Ｍ１４Ｇ／Ｈ１８Ｎ／Ｈ２１Ｎ、および Ｆ　ＩＯＦ／Ｍ］４Ｓ／Ｈ１８Ｆ／Ｈ２１Ｌ）に見い出される突然変異を、ヘリ 、ラス４ｂライブラリーにお℃１て見い出される最も強固に結合する３種の変異 体（実施例Ｘ、Ｒ１６７Ｎ１０１７Ｉｓ／Ｔ１７５／Ｉ　１７９Ｔ、Ｒ１６７Ｅ ／Ｄ１７１ｓ／Ｔ１７５／ｌ　１７９、およびＲ１６７Ｎ／Ｄ１７　ＩＮ／Ｔ１ ７５／′ｌ　１７９Ｔ）に見い出される突然変異と組合せた。

１ヘリックス変異体のそれぞれからｈＧｌ−１−ファージミド２水鎖ＤＮＡ（ｄ ｓＤＮＡ）を単離し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢｓＬＸ　Ｉで消化した。次い で、それぞれのへワックス４ｂ変異体から大きいフラグメントを単離し、それぞ れのへ１ルックスｌ変異体からの小さいフラグメントと連結して表Ｘｌｌ＋に示 す新規な２へり・ノクス変異体を得た。さらに、これら変異体のすへては先のｈ ＧＨ−ファージ結合選択において得られたＥ］７４Ｓ／ＦＩ７６Ｙの突然変異を 含有していたく詳細には実施例Ｘを参照）。

ｈＧＨの選択組合せライブラリーの作成加成性の原理は多数の突然変異の組合せ に当てはまるようであるが、一部の組合せく例えば、Ｆ１７６Ｙを伴うＥ１７４ Ｓ）は明らかに非加成性である（実施１ｌｉｌＩｖＩ１１オヨヒＸを参照）。例 えば、ヘリックスｌ中に４つの突然変異とへワックス４中に４つの突然変異を有 する最も強固に結合する変異体を確実性をもって同定するためには、理想的には ８残基金部を一度に突然変異させ、次いで全体的に最も強固に結合する変異体の プールを選別することになるであろう。しかし、このようなプールは、２．６ｘ ｌＯ”の異なるポリペプチドをコードしている１、１ｘ１０＋１のＤＮＡ配列（ ＮＮＳコドンの縮重を用いて）からなる。全変異体（恐らく、１０１３の形質転 換体）の表示を確実にするに十分大きなランダムファージミドライブラリーを得 ることは、現在の形質転換法によっては実際的ではない。

我々は、第１に、連続ラウンドの突然変異誘発を用い、１つのライブラリーから 最も強固に結合する変異を取り、次いで他の残基を突然変異させてさらに結合を 改善することによってこの難題に取り組んだ（実施例Ｘ）。第２の方法において 、我々は、加成性の原理を用いて２つの独立して選別したライブラリーからの最 良の突然変異を組合わせて、改善された結合を有する複数の突然変異体を創製し た（上記）。ここで我々は、ランダムまたは部分的ランダム突然変異体の組合せ ライブラリーを創製することによって、ｈＧＨ中の１０．１４．１８．２１，１ ６７．１７１．１７５、および１７９位における可能な突然変異の組合せをさら に探索した。ヘリックスｌライブラリーからのプールしたファージミド（独立し て０１２または４サイクル選別：実施例ＩＸ）およびヘリックス４ｂライブラリ ーからのプール（独立して０，２または４サイクル選別、実施例Ｘ）を用いてｈ ＧＨ−ファージミドの３つの異なる組合せライブラリーを作成し、この組合せ変 異体プールをｈＧＨｂｐ結合について選別した。ある量の配列多様性がこれらプ ールのそれぞれに存在するので、得られる組合せライブラリーは手で作成しうる 配列の組合せよりも多くの配列組合せを調へることができる（例えば、表Ｘｌｌ ＋）。

ｌヘリックスライブラリーのプール（０，２または４ラウンド選択）のそれぞれ からｈＧＨ−ファージミドの２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を単離し、制限酵素Ａ ｃｃｌおよびＢ＋、ＬＸ　Ｉで消化した。次いで、それぞれのへワックス１変異 体プールから大きいフラグメントを単離し、それぞれのへワックス４ｂ変異体プ ールからの小さいフラグメントと連結して、３つの組合せライブラリーｐＨ０７ ０７Ａ（実施例ＩＸおよびＸに記載の未選択のへワックスｌおよびヘリックス４ ｂプール）、ｐＨ０７０７Ｂ（２回選択したヘリラフスミブールと２回選択した ヘリックス４ｂプール）、およびｐＨ０７０７ｃ（４回選択したヘリラフスミブ ールと４回選択し−たヘリックス４ｂプール）を得た。さらに、より少ないＤＮ Ａを用いて同じ連結を行ない、ｐｌ−１０７０７Ｄ、ｐＨ０７０７ＥおよびｐＨ ０７０７Ｆ　（それぞれ、Ｏ１２および４ラウンドの出発ライブラリーに対応す る）と命名した。また、これら変異体プールのすへては、先のｈＧＦトファーン 結合選択で得られた突然変異Ｅ１７４Ｓ／Ｆ１７６Ｙを含有していた（詳細につ いては実施例Ｘを参照）。

、ｈＧＨ−ファージ変異体の組合せライブラリーの選別連結生成物ｐＨ０７０７ Ａ−Ｆを加工処理し、記載（実施例Ｖｌｌ＋）のようにＸＬ］−Ｂｌｕｅ細胞に 電気導入した。コロニー形成単位（ＣＦＵ）に基づいて、それぞれのプールから 得られた形質転換体の数は次のようであった＋　ｐＨ０７０７Ａから２．４ｘ１ ０’、ｐＨ０７０７Ｂから１．８Ｘ１０’、ｐＨ０７０７Ｃから１６×１０＠、 ｐＨ０７０７Ｄから８Ｘ１０５、ｐＨＯ７０７Ｅから３ｘｌＯ’、およびｐＨ０ ７０７Ｆから４ＸＩＯ’。ｈＧＨ−ファージミド粒子を調製し、実施例Ｖｌｌ＋ の記載のように２〜７サイクルにわたってｈＧ　Ｈｂｐ−結合について選択した 。

ｈＧｉ（−ファー／ミドライブラリーの迅速な選別平衡結合親和性によって測定 したときの強固に結合するタンパク質変異体についてのファージミドライブラリ ーの選別に加えて、受容体あるいは他の分子に対する結合のオン−速度（ｋ、、 、）またはオフ−速度（ｋ、＋＋）のどちらかが変化した変異体を選別すること も重要である。熱力学から、これら速度は平衡解離定数Ｋｄ＝（ｋ、目／ｋ。。

）に関係している。我々は、特定タンパク質の一部の変異体は結合に対して類似 したＫｄを有しているが、非常に異なったに６．、およびｋａｒｔを有している ものと想定している。逆に、ある変異体と別の変異体のＫｄの変化は、ｋ　ｏｎ に対する効果、ｋｏｌ、に対する効果、またはその両方によるものであろう。タ ンパク質の薬理学的性質は、結合親和性またはｋ　ａｎもしくはｋ　ｏｒｔに依 存していることもある（作用の詳細な機序に依存する）。ここで我々は、より高 いオン−速度を有するｈＧＨ変異体を同定してに６．、の変化の効果を調べよう とした。我々は、結合時間を増加させることによって、ならびに同族リガンド（ ｈＧＨ）による洗浄時間および／または濃縮を増加させることによって、選択を ｋ　ａｒｔの方に選択的に加重することができると想定している。

固定化ｈＧＨｂｐに対する野生型ｈＧＨ−ファージミド結合の経時分析から、最 終のｐＨ２洗浄液中に溶出されうる全ｈＧＨ−ファージミド粒子（全体の結合お よび溶離プロトコールについては実施例Ｖｌｌ＋を参照）のうち、１０％未満が １分間のインキュベートの後に結合するが、９０％以上は１５分間のインキュベ ート後に結合するようである。

「迅速な結合選択」のために、ｐＨ０７０７Ｂプール由来のファージミド粒子（ ヘリックス１および４に対して独立して２回選択）を固定化ｈＧＨｂｐと１分間 だけインキュベートし、次いで結合緩衝液（１＋ａｌ）で６回洗浄した［ｈＧ　 Ｈ洗浄工程は削除し、残存するｈＧＨ−ファージミド粒子はｐＨ２（結合緩衝液 中の０．２Ｍグリシン）洗浄液で溶離したコ。非表示粒子に対するｈＧＨ−ファ ージミド粒子の豊富化は、短時間の結合を用い、同族リガンド（ｈＧＨ）チャレ ンジを用いないときであっても、ｈＧｌ（−ファージミド結合選択がランダム化 プールから強固に結合する変異体を選別することを示した。

ｈＧＨ突然変異体の検定 これらｈＧＨ突然変異体の一部のｈＧＨｂｐに対する結合定数を、非サプレッサ ー大腸菌株１６Ｃ９または３４Ｂ８中で遊離のホルモン変異体を発現させ、この タンパク質を精製し、そして放射免疫沈澱検定法におけるｈＧＨｂｐからの標識 化ｖｔ−ｈＧＨの競合置換（実施例Ｖｌｌ＋を参照）により検定することによっ て測定した。以下の表Ｘ１ｌｌ−Ａにおいて、すべての変異体はセリン、７．に ょって置換されたグルタメート、□４およびチロノン、７．によって置換された フェニルアラニン、、＠（Ｅ　ｌ　７４Ｓ　オ、Ｊ：ヒＦ　１７６　Ｙ）Ｅ加エ テ、ｈＧＨ７ミ／酸（７）１０，１４．１８．２１．１６７．１７１．１７５お よび１７９位に表中に示した追加の置換を有している。

表Ｘ１ｌｌ−Ａ、ヘリックスｌおよびヘリックス４ｂ突然変異の加算にょるｈＧ Ｈ変異体ＨＯ６５０ＡＤ　ＨＧ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｓ　Ｔ　ＴＨＯ６５０ＡＥ　ＨＧ 　Ｎ　Ｎ　Ｅ　Ｓ　Ｔ　１８０６５０＾Ｐ　ＨＧＮＮ　ＮＮＴＴ ＨＯ６５０ＢＤ　Ａ　Ｙ　Ｄ　Ｎ　Ｎ　Ｓ　Ｔ　ＴＨＯ６５０ＢＥ　Ａ　Ｗ　Ｄ 　Ｎ　Ｅ　Ｓ　Ｔ　１１１０６５０ＢＦ　Ａ　Ｗ　Ｄ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｔ　Ｔ１１ ０６５０ＣＤ　Ｆ　Ｓ　Ｆ　Ｌ　Ｎ　Ｓ　Ｔ１１０６５０ＣＤ　Ｆ　Ｓ　Ｆ　Ｌ 　Ｅ　Ｓ　Ｔ　１１１０６５０ｃＤ　Ｆ　Ｓ　Ｆ　Ｌ　Ｎ　Ｎ　Ｔ　Ｔ以下の表 ＸＩｖにおいて、ｈＧＨ変異体を、ファージミド結合選択法によって組合せライ ブラリーから選択した。表ｘｌｖ中のすべてのｈＧＨ変異体は２つのバックグラ ウンド突然変異（Ｅ　１７４ｓ／Ｆ　１７６Ｙ）を含んでいる。ライブラリーｐ Ｈ０７０７ＡＣパー　トＡ）、ｐＨ０７０７ＢおよびｐＨ０７０７Ｅ（バー　ト Ｂ）；ｊりＩｔｐＨ０７０７Ｃ（バートＣ）からのｈＧＨ−ファージミドブール を、ｈＧＨｂｐに対する結合について２〜７サイクルで選別した。数値Ｐは、そ れぞれのプールから配列決定した１組のクローン中のそれぞれの変異体型の分数 発生率を示す。

訓４組合せライブラリーのホルモン−ファージミド結合選択からのｈＧＨ変異体 ０．６０　ＨＯ７１４Ａ、ｌ　１１　Ｇ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｓ　Ｔ　ＮＯ，４０ＨＯ ７１４Ａ、　４　＾　ＮＤＡＮＮＴＮ＊０．１３　ＨＯ７１２Ｂ、Ｉ　Ｆ　Ｓ　 Ｆ　Ｇ　ＨＳ　Ｔ　ＴＯ，１３１１０７１２Ｂ、２　ＨＱ　Ｔ　Ｓ　Ａ　Ｄ　Ｎ 　ＳＯ，１３ＨＯ７１２Ｂ、４　１（Ｇ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ａ　Ｔ　ＴＯ，１３ＨＯ ７１２Ｂ、５　Ｆ　Ｓ　Ｆ　Ｌ　Ｓ　Ｄ　Ｔ　ＴＯ，１３ＨＯ７１２Ｂ、６　Ａ 　Ｓ　Ｔ　Ｎ　ＲＤ　Ｔ　１０．１３　ｌ０７１２Ｂ、７　Ｑ　Ｙ　Ｎ　Ｎ　Ｈ Ｓ　Ｔ　ＴＯ，１３ＨＯ７１２Ｂ、ｐ　Ｗ　Ｇ　Ｓ　Ｓ　ＲＤ　Ｔ　１０．１３ 　ＨＯ７１２Ｅ、Ｉ　Ｆ　Ｌ　Ｓ　Ｓ　Ｋ　Ｎ　Ｔ　ＶＯ，１３ＨＯ７１２Ｅ、 ２　Ｗ　Ｎ　Ｎ　Ｓ　１１　Ｓ　Ｔ　ＴＯ，＋３　）１０７１２Ｅ、３　Ａ　Ｎ 　Ａ　Ｓ　Ｎ　Ｓ　Ｔ　ＴＯ，１３＋１０７＋２Ｅ、４　Ｐ　Ｓ　Ｄ　Ｎ　ＲＤ 　Ｔ　１０．１３　）１０７１２Ｅ、５　ＨＧ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｔ　ＳＯ，１ ３ＨＯ７１２Ｅ、６　Ｆ　Ｓ　Ｔ　Ｇ　ＲＤ　Ｔ　１０．１３　）１０７１２Ｅ 、７　Ｍ　Ｔ　Ｓ　Ｎ　Ｑ　Ｓ　Ｔ　ＴＯ，１３ＨＯ７１２Ｅ、８　Ｆ　Ｓ　Ｆ 　Ｌ　Ｔ　Ｓ　Ｔ　Ｓ４サイクル： ０．１７）１０７１４Ｂ、１人ＷＤＮＲＤＴＩＯ，１７１（０７１４Ｂ、２　Ａ 　Ｉ’　Ｄ　Ｎ　＋１　Ｓ　Ｔ　Ｎｏ、１７　１（０７１４Ｂ、３　Ｍ　Ｑ　Ｍ 　Ｎ　Ｎ　Ｓ　Ｔ　ＴＯ，１７１（０７１４Ｂ、４　ＨＹ　Ｄ　ＨＲＤ　Ｔ　Ｔ Ｏ，１７ＨＯ７１４Ｂ、５　Ｌ　Ｎ　Ｓ　ＨＲＤ　Ｔ　１０．１７　）１０７１ ４Ｂ、６　Ｌ　Ｎ　Ｓ　ＨＴ　Ｓ　Ｔ　Ｔ７サイクル： ０．５７　ＨＯ７１７Ｂ、ｌ　Ａ　Ｗ　Ｄ　Ｎ　Ｎ　Ａ　Ｔ　ＴＯ，１４ＨＯ７ １７Ｂ、７　１　Ｑ　Ｅ　ＨＮ　Ｓ　Ｔ　ＴＯ，５０ＨＯ７１７Ｅ、Ｉ　Ｆ　Ｓ 　Ｌ　Ａ　Ｎ　Ｓ　Ｔ　Ｖ以下の表ｘｖにおいて、ｈＧＨ変異体を、ファージミ ド結合選択法によって組合せライブラリーから選択した。表ｘｖ中のすべてのｈ ＧＨ変異体は２つのバックグラウンド突然変異（Ｅ１７４Ｓ／Ｆ１７６Ｙ）を含 んでいる。数値Ｐは、４サイクルの迅速結合選択の後に配列決定した全クローン 中の特定変異体の分数発生率である。

飢、ｈＧＨ−ファージミド組合せライブラリーの迅速ｈＧＨｂｐ結合選択からの ｈＧＨ変異体 ０．１４　ＨＯ７ＢＦ４．２　Ｗ　Ｇ　Ｓ　Ｓ　ＲＤ　Ｔ　１０．５７　ｌ０７ ＢＦ４．３　Ｍ　Ａ　Ｄ　Ｎ　Ｎ　Ｓ　Ｔ　ＴＯ，１４ｌ０７ＢＦ４．６　Ａ　 Ｗ　Ｄ　Ｎ　Ｓ　Ｓ　Ｖ　Ｔｆ以下の表ＸＶＩにおいて、ｈＧＨｂｐ（１〜２３ ８）およびＭａｂ５またはＭａｂ２６３のいずれかを用いる＋＊ｓｌ−襟識化ホ ルモンＨＯ６５０ＢＤまたは標識化ｈＧＨの競合置換によって結合定数を測定し た。変異ＨＯ６５０ＢＤは野生型ｈＧＨよりも３０倍強固に結合するようである 。

」旦１選択したｈＧＨ変異体の平衡結合定数ｈＧｌ（３２−１−３４０±５０ ８Ｏ６５０ＢＤ　−１−０，０３１１０±３ＩＯ６５０８Ｆ　１．５　０．０４ ５　１５±５ＨＯ７１４Ｂ、６　３．４　０．０９９　３４±１９１１０７１２ Ｂ、７　７．４　０．２２　７４±３０ＨＯ７１２Ｅ、　２　１６　０・４８　 ６０＋７０実施例Ｘｌｌ＋　プロテアーゼ基質配列を含有するｈＧＨ−ファージ と非基質ファージの選択豊富化 実施例■に記載したように、プラスミドｐｓＯ１３２は、余分のグリシン残基の 挿入を伴って遺伝子ＩＩ＋タンパク質の残基Ｐｒｏ１９８に融合したｈＧＨの遺 伝子を含有している。このプラスミドを用いて、ｈＧＨ−遺伝子ＩＩ＋融合産物 がファージ表面に１価で表示されるｈＧＨ−ファージ粒子を得ることができる（ 実施例ＩＶ）。

この融合タンパク質は、可変性リンカ−配列によって遺伝子Ｉ１１のカルボキン 末端ドメインに融合した全ｈＧＨタンパク質を含有している。

あるタンパク質加水分解酵素の好ましい基質配列を選択するためにファージ表示 法を使用することの可能性を調べるために、スブチリシンＢＰＮ’の遺伝子操呼 ふ）は以下の突然変異：　５ｅｒ２４Ｃｙｓ、Ｈｉｓ６４Ａｌａ、Ｇｌｕ１５６ Ｓｅｒ、Ｇｌｙ１６９ＡｌａおよびＴｙｒ２１７　Ｌｅｕを含んでいる。この酵 素は必須の触媒残基Ｈｉｓ６４を欠いているので、その基質特異性が大きく制限 されており、ある種のヒスチジン含有基質が優先的に加水分解される［Ｃａｒｔ ｅｒら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３７：　３９４−３９９　（１９８７）］。

ｈＧＨ−基質−ファージベクターの構築ｐｓＯ１３２中のリンカ−領域の配列を 、オリゴヌクレオチド；５°−ＴＴＣ−ＧＧＧ−ＣＣＣ−ＴＴＣ−Ｇ　ＣＴ　− Ｇ　ＣＴ−ＣＡ　Ｃ−Ｔ　ＡＴ−Ａ　ＣＧ　−ＣＧＴ−ＣＡＧ　−ＴＣＧ　−Ａ ＣＴ@−Ｇ　ＡＣ−ＣＴＧ　−ＣＣＴ　−３’を用いて突然変異させ、Ａ６４Ｓ ＡＬスブチリシンの基質配列を創製した。これにより、タンパク質配列： Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ− ＾ｒｇ−Ｇｉｎ−６ｅｒ−Ｔｈｒ−＾ｓｐがｈＧＨと遺伝子ＩＩ＋のカルボキシ 末端ドメインの間のりンカー領域中に導入される結果が得られた（上記配列中の 最初のＰｈｄ残基はｈＧＨのＰｈｅ１９１である）。

配列： ＾１ａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−＾ｒｇ−ＧｉｎはＡ６４ＳＡＬスブ チリシンの良好な基質であることが既知である［Ｃａｒｔｅｒら（１９８９）、 上記コ。得られたプラスミドをｐｓＯ６４０と命名した。

ｈＧＨ−基質−ファージの選択豊富化 ｐｓ０１３２およびｐｓＯ６４０から導がれるファージミド粒子を実施例■の記 載のように作成した。最初の実験において、それぞれのファージブール（１０μ ｍづつ）を、２０ｍＭ）リス−ＨＣＩ（ｐＨ８，６）および２．５ＭＮａＣ１を 含有する緩衝液（１００μり中でオキ７ランビーズ（実施例ＩＩの記載のように 調製；３ｏμｌ）と別々に混合した。結合と洗浄工程は実施例Ｖ１１の記載のよ うに行なった。次いで、このビーズを５０ｎＭのＡ６４ＳＡＬスブチリ／ンを含 むがまたは含まない同緩衝ｉ＆（４００μｌ）に再懸濁した。１０分間インキュ ベートした後、上清を集め、ファーシカ価（ｃｆｕ）を測定した。表ＸＹＩ＋は 、約１０倍多い基質含有ファージミド粒子（ｐｓＯ６４０）が、酵素の非存在下 よりも酵素の存在下において溶出され、また、酵素の存在下もしくは非存在下の 非基質ファージミド（ｐｓＯ１３２）の場合よりも多く溶出されることを示して いる。酵素、ファージミドまたはビーズ濃度の増加はこの比率を変えることはな かった。

選択豊富化法の改良 固定化ファージミドの非特異的溶離を減少させる試みにおいて、強固に結合する ｈＧＨ変異体を野生型ｈＧＨ遺伝子の代わりにｐｓＯ１３２およびｐｓＯ６４０ に導入した。使用したｈＧＨ変異体は実施例Ｘ＋に記載した変異体（ｐＨ０６５ ０ｂｐ）であり、突然変異ＰｈｅｌＱＡｌａ、Ｍｅｔ１４ＴｒｐＳＨｉｓ１８Ａ ｓｐ、Ｈｉｓ２１Ａｓｎ、Ａｒｇｌ　６７Ａｓｎ、Ａｓｐｌ　７１Ｓｅｒ、Ｇｌ ｕｌ　７４Ｓｅｒ、Ｐｈｅ１７６Ｔｙｒおよび１ｌｅ１７９Ｔｈｒを含有してい る。これにより、２つの新規なファージミド・ｐＤＭＯ３９０（強固に結合する ｈＧＨを含有し、基質配列を含まない）およびｐＤＭＯ４１１（強固に結合する ｈＧＨおよび基質配列ΔＩａ−Ａ　１ａ−Ｈ１ｓ−Ｔ　ｙｒ−Ｔ　ｈｒ−Ａ　ｒ ｇ−Ｇ　Ｉｎを含有する）が構築された。また、結合の洗浄および溶離のプロト コールは次のように変えた。

（ｉ）結合：　Ｃ０３ＴＡＲｌ　２ウ工ル組職培養プレートを、０．５ｍｌ／ウ ェルの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０，０）中の２μｇ／＋ａｌ　ｈＧＨｂｐ で１６時間被覆した。次いで、このプレートを、ｌｌｌ１／ウエルのブロック緩 衝液［０，１％Ｖ／Ｖウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ ）］とともに２時間インキュベートし、］］ＯｍＭトリスーＨＣＩｐＨ７，５） 、１ｍＭＥＤＴＡおよび１００ｍＭ　ＮａＣ１を含有する検定緩衝液で洗浄した 。ファージミドを再び実施例Ｉの記載のように調製し、ファージブールを上記検 定緩衝液で１・４に希釈し、ウェルあたり０．５ｇ＋１のファージを２時間イン キュベートした。

（ｉｉ）洗浄・このプレートをＰＢＳ＋Ｑ、Ｑ５％ツイーン２０で徹底的に洗浄 し、この洗浄緩衝液（１ｍｌ）とともに３０分間インキュベートした。この洗浄 工程を３回繰返した。

（ｉｉｉ）溶離：コノプレートラ、２０＋Ｍ　ト’）　ス−ＭＣＩ（ｐＨ８，６ ）＋１００ｍＭＮ　ａ　Ｃｌからなる溶離緩衝液中で１０分間インキュベートし 、次いで５００ｎＭのＡ３４ＳＡＬスブチリ／ンを含むかまたは含まない上記緩 衝液（０，５ｅ＋１）でファー／を溶離した。

表ＸＶ１１は、ｐｓＯ６４０およびｐｓＯ１３２について先に記載した方法と比 較して、特異的に溶出した基質−ファージミド粒子の割合が劇的に増加したこと を示している。この結果は、強固に結合するｈＧＨ突然変異体が、野生型ｈＧＨ に比べてｈＧＨ結合タンパク質への結合に対して有意に低いオフ−速度を有して いることによるものと考えられる。

ＦｔＸＶＩｌ、　Ａ６４ＳＡＬスブチリシンによる基質−ファージミドの特異的 溶離ファージのｌＯ（＠希釈液（１０μｍ）を、５０μｇ／ｍｌ力ルベニノリン を含有するＬＢ寒天プレート上のＸＬＩ−Ｂｌｕｅ細胞のｌＯμｌスポット上に ブレーティングすることによってコロニー形成単位（ｃｆｕ）を評価した。

（ｉ）野生型ｈＧＨ遺伝子：ｈＧＨｂｐ−オキシランビーズへの結合ファージミ ド　＋５０ｎＭＡ６４ＳＡＬ　酵素なしｐｓＯ６４０（基質）　９ｘｌＯ’ｃｆ ｕ／１０μｌ　１．５Ｘ１０”ｃｆｕ／ｌｏμｍｐｓＯ１３２（非基質）　６Ｘ ＩＯ’ｃｆｕ／ＩＯμｌ　３ＸｌＯ’ｃｆｕ／１０μｍ（ｉｉ）ｐＨ０６５０ｂ ｐ突然変異体ｈＧＨ遺伝子：ｈＧＨｂｐ肢覆プレートへの結合ファージミド　＋ ５０ｎＭ’　Ａ６４ＳＡ［−酵素なしｐＤＭＯ４１１（基’ｊｉ）　１．７Ｘ１ ０’ｃｒｕ／ｌｏμｌ　２Ｘ１０’ｃｒｕ／１０μｍｐＤＭＯ３９０（非基質） 　２Ｘ１０’ｃｆｕ／１０μｌ　ＩＸ］Ｏ’ｃｆｕ／１０μｍ実施例ＸＩＶ　基 質配列ライブラリーの選択豊富化を用いるＡ６４ＳＡＬスブチリ／ンの好ましい 基質の同定 実施例Ｘｌｌ＋に記載した選択的豊富化法を用いてランダム基質配列のライブラ リーから良好な基質配列を同定しようとした。

ランダム化Ｍ質カセットの挿入のためのベクターの構築ランダム化基質カセット の導入およびその後の基質配列ライブラリーの発現に適したベクターを設計した 。出発点は実施例Ｖｌ１１に記載したベクターｐＳ　Ｏ６４３であった。オリゴ ヌクレオチド： ５°−ＡＧＣ−ＴＧＴ−ＧＧＣ−ＴＴＣ−ＧＧＧ　−ＣＣＣ−ＧＣＣ−ＧＣＣ− ＧＣＧ　−ＴＣＧ　−ＡＣＴ−ＧＧＣ−ＧＧＴ−ＧＧＣ−ＴbＴ−３’ を用いて部位指向性の突然変異誘発を行ない、これによってｈＧＨと遺伝子Ｉ１ １の間にＡｐａｌ（ＧＧＧＣＣＣ）および５ａｉｌ（ＧＴＣＧＡＣ）制限部位が 導入された。

この新規な構築物をｐＤＭ０２５３と命名した（ｐＤＭＯ２５３の実際の配列は 、５°−１へＱＣ−ＴＧＴ−ＧＧＣ−ＴＴＣ−ＧＧＧ−ＣＣＣ−ＧＣＣ−ＣＣＣ −ＧＣＧ−ＴＣＧ−＾ＣＴ−ＧＧＣ−ＧＧＴ−ＧＧＣ−ＴＣＴ|３。

であり、下線を引いた塩基の置換は突然変異オリゴヌクレオチド中の偽錯誤によ るものである）。また、ｐＤＭＯ４１１（実施例Ｘｌｌ＋）由来のフラグメント を交換することによって、実施例中に記載した強固に結合するｈＧＨ変異体を導 入した。

得られたライブラリーベクターをｐＤＭ０４５４と命名した。

ライブラリーカセットベクターの調製および突然変異カセットの挿入ライブラリ ーカセットを導入するために、ｐＤＭＯ４５４をＡｐａｌ、次いでＳａｌ　１　 テ？ｆ４化し、次１ｍ　ｌ　３％Ｐ　ＥＧ８０００　＋　１０ｍＭ　ＭｇＣＩｔ テ沈澱させ、７０％エタノールで２回洗浄し、再懸濁した。これによりベクター が効率的に沈澱するが、小さいＡｐａｌ−３ａｌ［フラグメントが溶液中に残る ［Ｐａ１Ｌｈａｎｋａｒ、　Ｋ、　Ｒ，およびＰｒａｓａｄ、に、Ｓ、Ｎ、、　 Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１９：　１３４６］。この生 成物を１％アガロースゲル上を移動させ、Ａｐａｌ−８ａｌｌ消化したベクター を切り出し、Ｂａｎｄｐｒｅｐキｙ　）　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて精製 し、そして突然変異カセットとの連結用に再懸濁した。

挿入するカセットはｐｓＯ６４０およびｐＤＭＯ４１１のリンカ−領域中のＤＮ Ａ配列と同様の配列を含有していたが、ランダム化コドンによって置換された基 質配列中のヒスチジンおよびチロシン残基のコドンを有していた。実施例Ｖｌｌ ＋に記載したようにランダム化位置のそれぞれにおいてＮ　Ｎ　Ｓ　（Ｎ　＝　 Ｇ／ｆｉ、／Ｔ／Ｃ、Ｓ＝Ｇ／Ｃ）を置換することを選択した。突然変異カセッ ト中に用いたオリゴヌクレオチドは、 ５°−Ｃ−ＴＴＣ−ＧＣＴ−ＧＣＴ−ＮＮＳ−ＮＮＳ−ＡＣＣ−ＣＧＧ−ＣＡ人 −３°（暗号路）および５°−Ｔ−ＣＧＡ−ＴＴＧ−ＣＣＧ−ＧＯＴ−３ＮＮ− ３ＮＮ−＾ＧＣ−ＡＧＣ−ＧＡＡ−ＧＧＧ−ＣＣ−３°（非暗号鎖）であった。

また、このカセットは５μｌ１部位を破壊し、従って５ａｌｌによる消化を用い てベクターバックグラウンドを減少させることができる。これらオリゴヌクレオ チドはＡｐａ−３ａｌ力セツト部位への挿入の前にホスホリル化しなかった。

この理由は、続いて起こるカセット小集団のオリゴマー化が複数カセット挿入体 による偽の結果を導くことがあることを恐れたためである。アニールと連結の後 、反応生成物をフェノール：クロロホルム抽出し、エタノール沈澱させ、そして 水に再懸濁した。最初は、バックグラウンドベクターを減少させるための５ａｌ ｒによる消化を行なわなかった。実施例Ｖｌ１１に記載したように、約２００ｎ ｇをＸＬＸ−Ｂｌｕｅ細胞に電気穿孔導入し、ファージミドライブラリーを調製 した。

基質ライブラリーからの切断されやすい基質の選択使用した選択法は、実施例Ｘ ｌｌ＋においてｐＤＭｏ４１１およびｐＤＭＯ３９０について記載した方法と同 じである。各ラウンドの選択の後、実施例ＶｌｌｌにおいてｈＧＨ−ファージに ついて記載されているように、新鮮なＸＬＩ−Ｂｌｕｅ細胞の培養物に形質導入 し、新しいファージミドライブラリーを増殖させることによって、溶出したファ ージを増殖させｔこ。選択法の進行は、溶出ファージの力価の測定および各ラウ ンドの選択後の個々のクローンの配列決定によってモニターした。

表Ａは、１．２および３ラウンドの選択後の酵素の存在下および非存在下での溶 離に対する連続ファーシカ価を示すものである。特異的に溶出したファージ：非 特異的に溶出したファージ（即ち、酵素を用いて溶出したファージ：酵素を用い ずに溶出したファージ）の比がラウンドｌからラウンド３まで劇的に増加してい るのが明らかであり、このことは、良好な基質集団が各選択ラウンドにつれて増 加していることを示唆する。

出発ライブラリーからの１０個の単離体の配列決定は、これらのすべてか野生型 ｐＤＭＯ４６４配列からなることを示した。このことは、Ａｐａ＋による消化の 後に５ａｉ１部位がＤＮＡフラグメントの末端に非常に近接しており、従って低 効率の消化を導くことに起因している。それにもかかわらず、ライブラリー中に ４００の可能な配列が存在しているにすぎず、従ってこの集団はなお特筆される べきである。

表ＢＩおよびＢ２は、ラウンド２およびラウンド３の選択後に得られた単８の配 列を示すものである。２ラウンドの選択の後に、ヒスチジン残基の高い発生が明 確に存在する。これは正に予想されていたことである（実施例Ｘ１１１に記載し たように、Ａ６４　ＳΔＬスブチリシンは基質中にヒスチジン残基を必要とする が、この理由はそれが基質−助力の触媒機序を使用するためである）。３ラウン ドの選択の後に、配列決定した１０ｆｌｌのクローンのそれぞれがランダム化カ セット中にヒスチジンを有している。しかし、これら配列の２つはｐＤＭＯ４１ １のものであり、出発ライブラリー中に存在していなかったものであり、従って 不純物であることに注意すべきである。

表Ａ、　最初のファージプールおよび３ラウンドの選択豊富化からの溶出ファー ジの滴定 ファージの１０倍希釈液（１０μｍ）を、５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを含有 するＬＢ寒天プレート上のＸＬｌ−Ｂｌｕｅ細胞の１０μｍスポット上にブレー ティングすることによってコロニー形成単位（ｃｆｕ）を評価した。

出発ライブラリー：　３ＸＩＯ１ｆｆｃｆｕ／ｍｌライブラリー：　’　＋５Ｑ ＯｎＭ　Ａ６４ＳＡＬ　：　４ＸＩＱ’ｃｆｕ／ＩＱｕｌ酵素なし　’　３ＸＩ Ｏ’ｃｆｕ／１０μｍｐＤＭｏ　４　１　１　：　＋５００ｎｌｉ　Ａ６４ＳＡ Ｌ　：　２Ｘ１０”ｃｒｕ／ｆｏμｍ（対照）　酵素なし　・８ＸＩＯ’ｃｆｕ ／１０μｍラウンド２ ラウンドｌライブラリー：　？ＸＩＯ”ｃｆｕ／ｍｌライブラリー：　＋５００ ｎＭ　Ａ６４ＳＡＬ　：　３Ｘ１０’ｃｆｕ／１０μ！酵素なし　・６ＸＩＯ’ ｃｆｕ／ｌＯμｍｐＤＭｏ　４　１　１　：　＋５Ｇ（１１＋１　Ａ６４ＳＡＬ 　：　３ＸＩＯ＠ｅｆｕ／１０μｍ（対照）　酵素なし　・１．６Ｘ１０’ｃｆ ｕ／１０μｍラウンド３ ラウンド２ライブラリー：　７ＸＩＯ”ｃｒｕ／ｍｌライブラリー：　＋５００ ｎＭ＾６４ＳＡＬ　：　１Ｘ１０’ｃｆｕ／１０μｍ酵素なし　・　＜ｌＯ”ｃ ｒｕ／１０μｍｐＤＭｏ　４１１　：　＋５００ｎＭ　Ａ６４ＳＡＬ　：　５Ｘ ＩＯ’ｃｆｕ／ＬＯｇＬ（対鍼　酵素なし　：　３ＸｌＯ’ｃｆｕ／１０４１表 ８１．２ラウンドの選択豊富化の後の溶出ファージの配列すべてのタンパク質配 列はＡＡ＊＊ＴＲＱの形態にあるはずである（ここで、＊はランダム化コドンを 表す）。以下の表においては、ランダム化コドンおよびアミノ酸に下線を引く。

＊　＊ ＡＡＨＹＴＲＱ 、、、　ＧＣＴ　ＧＣＴ　ＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＧＧ　ＣＡ＾９．．２゜、、野 生型ｐＤＭＯ４５４３ ＃　カセット内の１フドンの偽削除 １！＃アンピギコアス配列 表Ｂ２．３ラウンドの選択豊富化の後の溶出ファージの配列すべてのタンパク質 配列はＡＡ＊＊ＴＲＱの形態にあるはずである（ここで、＊はランダム化コドン を表す）。以下の表においては、ランダム化コドンおよびアミノ酸に下線を引く 。

＊　＊ ＃ｐＤＭ０４１１由来の汚染配列 ＃＃「違法」コドンＣＡＴを含有する：Ｔがコドンの３番目の位置に現れるはず がない 配列表 （１）　−較的情報 （ｉ）　特許出願人：　ジェネンテク、インコーポレイテッドマ／ユーズ、ディ ピッド・ジェイ （■−）配列の数：２７ （１ｖ）連絡先： （Ａ）　名宛人：ジェ不ンテク５　インコーポレイテ、ド（Ｂ）　通り・ポイン ト・サン・ブルーフ・ブールバード４６０１（Ｃ）市：サウス・サン・フラッジ スフ（Ｄ）　州：カリフォルニア （Ｅ）　国、アメリカ合衆国 （Ｆ）　ＺＩＰ：９４０８０ （ｖ）　コンピューター解読書式： （Ａ）　媒体型・５．２５インチ、３６０Ｋｂフロツピーデイスク（Ｂ））ンピ ５−９−：　ＩＢＭ　ＰＣ適合（Ｃ）　オペレーティング・７スｆム：　ＰＣ− ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）　ソフトウェア：　ｐａｔｉｎ　（ジェネンテク） （ｖｌ）本出願のデータ。

（Ａ）　出願番号：未　定 （Ｂ）　出願口８本　日 （Ｃ）　分類、未　定 （ｖｉｉ　ン　優先権主張出願のデータ：（Ａ）　出願番号：　０７／７４３６ １４（Ｂ）　出願日：１９９１年８月９日 （ｖｌｌ）優先権主張出願のデータ゛ （Ａ）　出願番号：　０７／７１５３００（Ｂ）　出随臼：１９９１年６月１４ 日（、ｉｉ）　優先権主張出願のデータ・（Ａ）　出願番号：０７／６８３４０ ０（Ｂ）　出願口：１９９１年４月１０日（ｖｉｉ）　優先権主張出願のデータ ：（Ａ）　出願番号：　０７／６２１６６７（Ｂ）　出願日：１９９０年１２月 ３日（ｖｉ）弁理士／代理人情報。

（Ａ）　氏名：ベンソン、ロバート・エイチ（Ｂ）　登録番号・３０，４４６ （Ｃ）　参照／整理番号＋６４５Ｐ４ （ＩＸ）電話連絡先情報： （Ａ）　電話番号＋　４１５／２６６−１４８９（Ｂ）　ファックス番号：　４ １５／９５２−９８８１（Ｃ）　テレックス番号：　９１０／３７１−７１６８ （２）　配列番号ｌの情報 （ｉ）　配列の特徴・ （Ａ）　長さ：３６塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数・−重鎖 （Ｄ）　トポロジー　直鎖状 （ｘｉ）　配列：配列番号ｌ： ＧＧＣＡＧＣＴＧＴＧ　ＧＣＴＴＣＴＡＧＡＧ　ＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴＧ ＧＴ　３６（２）　配列番号２の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ＝３６塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数ニー水路 （Ｄ）　トポロジー、直鎖状 （ｘｌ）　配列：配列番号２・ ＾ＧＣＴＧＴＧＧＣＴ　ＴＣＧＧＧＣＣＣＴＴ　ＡＧＣＡＴＴＴＡＡＴ　ＧＣＧ ＧＴ＾３６（２）　配列番号３の情報 （１）　配列の特徴・ （Ａ）　長さ、３３塩基 （Ｂ）　型　核酸 （Ｃ）　鎖の数、−重鎖 （Ｄ）　トポ日ノ−。直鎖状 （ｘｉ）　配列：配列番号３： ＴＴＣＡＣＡＡＡＣＧ　ＡＡＧＧＧＣＣＣＣＴ　ＡＡＴＴ＾＾ＡＧＣＣＡＧ＾３ ３（２）　配列番号４の情報 （１）　配列の特徴・ （Ａ）　長さ：３０塩基 （Ｂ）　型・核酸 （Ｃ）　鎖の数　−重鎖 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）　配列、配列番号４゜ Ｃ＾＾ＴＡＡＴＡＡＣＧＧＧＣＴＡＧＣＣ＾＾＾＾ＧＡＡＣＴＧＧ　３０（２） 　配列番号５の情報 （１）　配列の特徴。

（Ａ）　長さ：２４塩基 （Ｂ）　型・核酸 （Ｃ）　鎖の数、−重鎖 （Ｄ）　トポロジー　直鎖状 （ｘｉ）　配列：配列番号５： ＣＡＣＧＡＣＡＧＡＡ　ＴＴＣＣＣＧＡＣＴＧ　ＧＡＡＡ　２４（２）　配列番 号６の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ・２３塩基 （Ｂ）　型・核酸 （Ｃ）　鎖の数ニー水路 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）　配列：配列番号６： ＣＴＧＴＴＴＣＴＡＧ　ＡＧＴＧＡ＾＾ＴＴＧ　ＴＴＡ　２３（２）　配列番号 ７の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ：２１塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数ニー水路 （Ｄ）　トポロジー・直鎖状 （ｘｉ）　配列：配列番号７゜ ＡＣＡＴＴＣＣＴＧＧ　ＧＴＡＣＣＧＴＧＣＡ　Ｇ　２１（２）　配列番号８の 情報 （ｉ）　配列の特徴・ （Ａ）　長さ二６３塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数ニー水路 （Ｄ）　トポロジー・直鎖状 （ｘｉ）　配列：配列番号８： Ｇ（：ＴＴＣＡＧＧ＾＾ＧＧＡＣＡＴＧＧＡＣＮｌｌ５ＧＴＣＮＮＳＡ　ＣＡＮ ＮＳＣＴＧＮＮ　５ＡＴＣＧＴＧＣＡＧ　５０ＴＧＣＣＧＣＴＣＴＧ　ＴＧＧ　 ６３ （２）　配列番号９の情報 （ｉ）　配列の特徴。

（Ａ）　長さ：２４塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数−一本鎖 （Ｄ）　トポロジー二直鎖状 （ｘｉ）　配列、配列番号９゜ ＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡ　ＣＡＴＡＣＣＴＧＡＧ　ＧＡＴＣ２４（２）　配列番号 １０の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ、３３塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数、−水路 （Ｄ）　トポロジー・直鎖状 （ｘｉ）　配列：配列番号１０： へＴＧＧＡＣへへＧＧ　ＴＧＴＣＧＡＣＡＴＡ　ＣＣＴＧＣＧＣＡＴＣＧＴＧ　 ３３（２）　配列番号１１の情報 （ｉ）　配列の特徴。

（Ａ）　長さ：３６塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数ニー水路 （Ｄ）　トポロジー、直鎖状 （ｘｉ）　配列：配列番号１１： ＧＧＣＡＧＣＴＧＴＧ　ＧＣＴＴＣＴＡＧＡＧ　ＴＧＧＣ（、ＣＣＧＧＣＴＣＴ ＧＧＴ　３６（２）　配列番号１２の情報 （１）　配列の特徴： （Ａ）　長さ：３６塩基 （Ｂ）　型、核酸 （Ｃ）　鎖の数ニー水路 （Ｄ）　トポロジー・直鎖状 （ｘｉ）　配列：配列番号１２； ＧＧＣＡＧＣＴＧＴＧ　ＧＡＴＴＣＴＡＧＡＧ　ＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧ ＧＴ　３６（２）　配列番号１３の情報 （ｉ）　配列の特徴。

（Ａ）　長さ・１２アミノ酸 （Ｂ）　型二アミノ酸 （Ｄ）・　トポロジー二直鎖状 （ｘｉ）　配列：配列番号１３ Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　 Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙｌ　５　１０　１２ （ｘｉ）　配列・配列番号１９： ＧＣＣＴＴＴＧＡＣＡ　ＧＧＴＡＣＣＡＧＧＡ　ＧＴＴＴＧ　２５（２）　配列 番号２０の情報 〈ｉン　配列の特徴： （Ａ）　長さ：３３塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数ニ一本鎖 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （にｉ）　配列：配列番号２０： ＣＣＡＡＣＴＡＴＡＣＣＡＣＴＣＴＣＧＡＧ　ＧＴＣＴＡＴＴＣＧＡ　ＴＡＡ　 ３３（２）　配列番号２１の情報 （ｉ）　配列の特徴。

（Ａ）　長さ：６６塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数・一本鎖 （Ｄ）　トボロ／−：直鎖状 （ｘｉ）　配列・配列番号２１： ＴＣＧＡＧＧＣＴＣＮ　Ｎ５ＧＡＣＡＡＣＧＣＧＮＮＳＣＴＧＣＧＴ　ＧＣＴＮ ＮＳＣＧＴＣＴＴＮＮＳＣＡＧＣＴ　５０ＧＧＣＣＴＴＴＧＡＣＡＣＧＴＡＣ６ ６（２）　配列番号２２の情報 （ｉ）　配列の特徴。

（Ａ）　長さ：５８塩基 （Ｂ）　型、核酸 （Ｃ）　鎖の数ニ一本鎖 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｘｌ）　配列：配列番号２２、 ＧＴＧＴＣＡＡＡＧＧ　ＣＣＡＧＣＴＧＳＮＮ　ＡＡＧＡＣＧＳＮＮＡ　ＧＣＡ ＣＧＣＡＧＳＮ　ＮＣＧＣＧＴＴＧＴＣ５０ＳＮＮＧＡＧＣＣ５１１ｔ （２）　配列番号２３の情報 （１）　配列の特徴。

（Ａ）　長さ、６５塩基 （Ｂ）　型：核酸 （ロン　鎖の数、一本鎖 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｘｌ）　配列二配列番号２３゜ ＧＴＴＡＣＴＣＴＡＣＴＧＣＴＴＣＮＮＳＡ　ＡＧＧＡＣＡＴｆＪ！Ｉ　５ＡＡ ＧＧＴＣＡＧＣｌｌＮ５ＴＡＣＣＴＧＣ５０ＧＣＮＮＳＧＴＧＣＡ　ＧＴＧＣ＾ ６５（２）　配列番号２４の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ：６４塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数ニ一本鎖 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （×１）　配列、配列番号２４゜ ＧＡＴＣＴＧＣＡＣＴ　ＧＣＡＣ５ＮＩＩＧＣＧ　ＣＡＧＧＴＡＳＮＮＧ　ＣＴ ＧＡＣＣＴＴＳＮ　ＩＩｃＡＴＧＴｃｃＴＴ　５０ＳＮＮＧ＾＾ＧＣＡＧ　ＴＡ Ｇ＾６４ （２）　配列番号２５の情報 （１）　配列の特徴・ （Ａ）　長さ：２１７８塩基 （Ｂ）　型、核酸 （Ｃ）　鎖の数、一本鎖 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）　配列、配列番号２５： ＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡ　＾ＴＡＴＣＧＣＡＴＴ　ＴＣＴＴＣＴＴＧＣＡ　ＴＣＴ ＡＴＧＴＴＣＧ　ＴＴＴＴＴＴＣＴＡＴ　５０ＴＧＣＴＡＣ＾入＾ＣＧＣＧＴＡ ＣＧＣＴＧ　ＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴ　ＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＧＡＧＣＴＣＣ Ｃ１００ＴＧＴＣＣＧＣＣＴＣＴＧＴＧＧＧＣＧＡＴ　ＡＧＧＧ丁ＣＡＣＣＡ　 丁ＣＡＣＣＴＧＣＣＧ　ＴＧＣＣＡＧＴＣＡＧ　１５０ＧＡＴＧＴＧＡＡＴＡ　 ＣｒｃｃｒｃＴＡａｃ　ＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡ　ＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧ　ａ＾＾ ＾ＡＧＣＴＣＣ２００Ｇ＾＾八ＣＴＡＣＴＧ　ＡＴＴＴＡＣＴＣＧＧ　ＣＡＴＣ ＣＴＴＣＣＴ　ＣＴＡＣＴＣＴＧＧＡ　ＧＴＣＣＣＴＴＣＴＣ２５０ＧＣＴＴＣ ＴＣＴＧＧ　ＡＴＣＣＡＧＡＴＣＴ　ＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴ　ＴＣＡＣＴＣＴＧ ＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴ　３００ＣＴＧＣＡＧＣＣＧＧ　ＡＡＧＡＣＴＴＣＧ ＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＣＡｎＡ’ｒＡｃＴＡｃ　３５０Ｔ ＣＣＴＣＣＣＡＣＧ　ＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧ　ＧＴＡＣＣＡＡＧＧＴ　ＧｃＡｃ Ａｒｃ′ＡＡＡＣＧＡＡＣＴＧＴＧＧ　４００ＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴ ＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴ　ＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡ　ＧＴＴＧＡＡＡＴＣ Ｔ　４５０ＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴ　ＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧ　ＣＣＴＧＣ丁ｆｌ； ＡＡＴ　ＡＡＣＴＴＣＴＡ丁ＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣ５００ＣＡＡＡＧＴＡＣＡ Ｇ　ＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧ　ＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴ　ＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴ　Ａ ＡＣＴＣＣＣＡＧＧ　５５０ＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣ ＡＡＧＧＡＣＡ　ＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧ　ＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣ８００ＡＣＣＣ ＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧ　ＡＡＡＣＡＣＡＡＡ Ｇ　ＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧ　６５０ＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣ ＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡ＾ＡＧ　ＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡ　Ｔｏ。

ＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧ　ＴＴＡＡＧＣＴＧＡＴ　ＣＣＴＣＴＡＣＧＣＣＧＧＡＣ ＧＣＡＴＣＧ　ＴＧＧＣＣＣＴＡＧＴ　７５０ＡＣＧＣＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＡ ＡＡＡＡＧ　ＧＧＴＡＴＣＴＡＧＡ　ＧＧＴＴＧＡＧＧＴＧ　ＡＴＴＴＴＡＴＧ ＡＡ　８００ＡＡＡＧＡＡＴＡＴＣＧＣＡＴＴＴＣＴＴＣＴＴＧＣＡＴＣＴＡＴ 　ＧＴＴＣＧＴＴＴＴＴ　ＴＣＴＡＴＴＧＣＴＡ　８５０ＣＡＡＡＣＧＣＧＴＡ 　ＣＧＣＴＧＡＧＧＴＴ　ＣＡＧＣＴＧＧ”ｆＧＧ　ＡＧＴＣＴＧＧＣＧＧ　Ｔ ＧＧＣＣＴＧＣＴＧ　９００ＣＡＧＣＣＡＧＧＧＧ　ＧＣＴＣＡＣＴＣＣＧ　Ｔ ＴＴＧＴＣＣＴＧＴ　ＧＣＡＧＣＴＴＣＴＧ　ＧＣＴＴＣＡＡＣＡＴ　９５０Ｔ ＡＡＡＧＡＣＡＣＣＴＡＴＡＴＡＣＡＣＴ　ＧＧＧＴＧＣＧＴＣＡ　ＧＧＣＣＣ ＣＧＧＧＴ　ＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧ　、１０００ＡＡＴＧＧＧＴＴＧＣＡＡＧＧ ＡＴＴＴＡＴ　ＣＣＴＡＣＧＡＡＴＧ　ＧＴＴＡＴＡＣＴＡＧ　ＡＴＡＴＧＣＣ ＧＡＴ　１０５０ＡＧＣＧＴＣＡＡＧＧ　ＧＣＣＧＴＴＴＣＡＣＴＡＴＡＡＧＣ ＧＣＡ　ＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡ　ＡＡＡＡＣＡＣＡＧＣ１１００ＣＴＡＣＣＴＧ ＣＡＧ　ＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＴＧＡ　ＧＧＡＣＡＣＴＧＣＣＧ ＴＣＴＡＴＴＡＴＴ　１１５０ＧＴＴＣＴＡＧＡＴＧ　ＧＧＧＡＧＧＧＧＡＣＧ ＧＣＴＴＣＴＡＴＧ　ＣＴＡＴＧＧＡＣＴ’Ａ　ＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡ　１２０ ０ＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧ　ＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＧＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡ ＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴ　１２５０ＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡ　ＣＣＣＴ ＣＣＴＣＣＡ　ＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡ　ＧＣＧＧＣＣＣＴ ＧＧ　１３００ＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴ　ＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡ ＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴ　ＧＴＣＧＴＧＧＡ＾Ｃ１３５０ＴＣＡＧＧＣＧＣＣ ＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧ　ＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧ　ＴＣＣ ＴＡＣＡＧＴＣ１４００ＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡ　ＧＣＡＧ ＣＧＴＧＧＴ　ＧＡＣＴＧＴＧＣＣＣＴＣＴＡＧＣＡＧＣＴ　１４５０ＴＧＧＧ ＣＡＣＣＣＡ　ＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡ　ＡＴＣＡＣＡＡＧ ＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣ１５００ＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡ　ＡＧＡＡＡＧＴＴＧ Ａ　ＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴ　ＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡ　ＣＴＣＡＣＡＣＡＧＧ　１ ５５０ＧＣＣＣＴＴＣＧＴＴ　ＴＧＴＧＡＡＴＡＴＣＡＡＧＧＣＣＡＡＴＣＧＴ ＣＴＧＡＣＣＴＧ　ＣＣＴＣＡＡＣＣＴＣ１６００ＣＴＧＴＣＡＡＴＧＣＴＧＧ ＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧ　ＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧ　ＣＧＧＣＴＣＴ ＧＡＧ　１６５０ＧＧＴＧＧＴＧＧＣＴ　ＣＴＧＡＧＧＧＴＧＧ　ＣＧＧＴＴＣ ＴＧＡＧ　ＧＧＴＧＧＣＧＧＣＴ　ＣＴＧＡＧＧＧＡＧＧ　１７００ＣＧＧＴＴ ＣＣＧＧＴ　ＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧ　ＧＴＴＣＣＧＧＴＧＡ　ＴＴＴＴＧＡＴＴ ＡＴ　ＧＡＡＡＡＧＡＴＧＧ　１７５０ＣＡＡＡＣＧＣＴＡＡ　Ｔ＾＾ＧＧＧＧ ＧＣＴ　ＡＴＧＡＣＣＣＡＡＡ　ＡＴＧＣＣＧＡＴＧＡ　＾人ＡＣＧＣＧＣＴＡ 　１８００ＣＡＧＴＣＴＧＡＣＧ　ＣＴＡＡＡＧＧＣＡＡ　ＡＣＴＴＧＡＴＴＣ Ｔ　ＧＴＣＧＣＴＡＣＴＧ　ＡＴＴＡＣＧＧＴＧＣ１８５０ＴＧＣＴＡＴＣＧＡ Ｔ　ＧＧＴＴＴＣＡＴＴＧ　ＧＴＧＡＣＧＴＴＴＣＣＧＧＣＣＴＴＧＣＴ　ＡＡ ＴＧＧＴＡＡＴＧ　１．９００ＧＴＧＣＴＡＣＴＧＧ　ＴＧＡＴＴＴＴＧＣＴ　 ＧＧＣＴＣＴＡＡＴＴ　ＣＣＣＡＡＡＴＧＧＣＴＣＡＡＧＴＣＧＧＴ　１９５０ ＧＡＣＧＧＴＧＡＴＡ　ＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴ　ＡＡＴＧＡＡＴＡＡＴ　ＴＴＣ ＣＧＴＣＡＡＴ　ＡＴＴＴＡＣＣＴＴＣ２０００ＣＣＴＣＣＣＴＣＡＡ　ＴＣＧ ＧＴＴＧＡＡＴ　ＧＴＣＧＣＣＣＴＴＴ　ＴＧＴＣＴＴＴＡＧＣＧＣＴＧＧＴＡ ＡＡＣ２０５０ＣＡＴＡＴＧＡＡＴＴ　ＴＴＣＴＡＴＴＧＡＴ　ＴＧＴＧＡＣＡ ＡＡＡ　ＴＡＡＡＣＴＴＡＴＴ　ＣＣＧＴＧＧＴＧＴＣ２１００ＴＴＴＧＣＧＴ ＴＴＣＴＴＴＴＡＴＡＴＧＴ　ＴＧＣＣＡＣＣＴＴＴ　ＡＴＧＴＡＴＧＴＡＴ　 ＴＴＴＣＴＡＣＧＴＴ　２１５０ＴＧＣＴＡＡＣＡＴＡ　ＣＴＧＣＧＴＡＡＴＡ 　ＡＧＧＡＧＴＣＴ　２１７ｇ（２）　配列番号２６の情報 （１）　配列の特徴： （Ａ）　長さ＝２３７アミノ酸 （Ｂ）　型二アミノ酸 （Ｄ）　トポロジー、直鎖状 （ｘｉ）　配列：配列番号２６： Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　ｌｌｅ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　 Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｐｈｅ　Ｍａｌ　Ｐｈｅｌ　５　１０　１５ Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｔｙｒ＾ｌａ　Ａｓｐ　Ｉ ｌｅ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　５ｅｒＰｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅ ｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｔｈ ｒ　ｌｉｅ　ＴｈｒＣｙｓ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｖａｔ 　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　ＧｌｎＧｉｎ　 Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　 ｌｌｅ　Ｔｙｒ　Ｓｅｔ　Ａｌａ　５ｅｒＰｈｅ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｇ ｌｙ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｇａｙ　Ｓｅｒ　Ａ ｒｇ　５ｅｒＧｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｉｌ ｅ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　ＡｓｐＰｈｅ　Ａｌａ 　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｇｌｎ　Ｈｉｓ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ 　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒｌｌｏ　１１５　１２０ Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　ｌｌｅ　 Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｌａ＋２５　＋３０　１３５ Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｍａｌ　Ｐｈｅ　ｌｌｅ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　 Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　５ｅｒ１４０　１４５　１５［Ｉ Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　 Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　ＡｒｇＧｌｕ＾Ｉａ　Ｌｙｓ　Ｖａ ｌ　Ｇｉｎ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｖａｔ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌ ｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ＾ｓｎ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ 　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ＾ｓｐ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ＋８５　１ ９０　１９５ Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　 Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　ＧｌｕＬｙｓ　Ｈｉｓ　Ｌｙｓ　Ｖ ａｌ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｍａｌ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｇｉｎ　Ｇ ｌｙ　Ｌｅｕ　５ｅｒＳｅｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｔ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｐｈ ｅ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ（２）　配列番号２７の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ＝４６１アミノ酸 （Ｂ）　型・アミノ酸 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）　配列：配列番号２７゜ Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　ｌｉｅ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　 Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｐｈｅｌ　５　１０　１５ Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　 Ｍａｌ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　５ｅｒＧｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｌ ｅｕ　Ｍａｌ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｌ ｅｕ　Ｓｅｒ　ＣｙｓＡｌａ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　ｌｉ ｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　ｌｉｅ　Ｈｉｓ　Ｔｒｐ　Ｖａ１＾ｒｇ 　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ 　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　ＴｙｒＰｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　 Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　 Ｇｌｙ　ＡｒｇＰｈｅ　Ｔｈｒ　ｌｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｓ ｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇ１ｎＭｅｔ　Ａｓ ｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｍａ ｌ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　５ｅｒＡｒｇ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ 　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　１ＩＩｅｔ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ　Ｇ ｌｙ　Ｇ１ｎＧｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｓｅ ｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　５ｅｒＶａｌ　Ｐｈｅ 　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ 　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　丁ｈｒ八ｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇａｙ　Ｃｙｓ　 Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　 Ｖａ１Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｌ ｅｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｉ（ｉｓ　Ｔｈｒ１８５　＋９０　１ ９５ Ｐｂｅ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　 Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　５ｅｒＶａｌ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖ ａｌ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ｔ ｈｒ　Ｔｙｒ　ｌ１ｅＣｙｓ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　）ｌｉｓ　Ｌｙｓ　Ｐ ｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　ＬｙｓＶａ ｔ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｈｉ ｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　ＶａｔＣｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｎ 　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ 　Ｐｒｏ　Ｖａ１Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　 Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　ＧｌｕＧｌｙ　Ｇ ｌｙ　Ｇａｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇ ｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇ１．ｕ２９０　２９５　３ｏ。

Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　 Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　ＴｙｒＧｌｕ　！、ｙｓ　Ｍｅｔ　 Ａｌａ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　 Ｇｌｕ　Ａｓｎ　ＡｌａＡｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｓ ｅｒ　Ａｓｐ　Ａ１．ａ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　５ｅｒ’ ／ａｌ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｌａ　ｌｉｅ　 Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　ＡｓｐＶａｌ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌ ｅｕ　Ａｌｇ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ａ ｓｐ　Ｐｈｅ＾１ａＧｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｍｅｔ＾ｌａ　 Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｇａｙ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　５ｅｒＰｒｏ　Ｌ ｅｕ　ＭｅＬ　Ａ８ｎ　ＡＳｎ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｐ ｒｏ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇ１ｎＳｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ａｒ ｇ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｒ ｏ　ＴｙｒＧｌｕ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　ｌｉｅ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ 　ｌｉｅ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｍａ１４２５　４：（０ ４３５ Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｆ’ｈｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　ＶａｌΔｌａ　Ｔｈｒ　 Ｐｈｅ’Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　５ｅｒＴｈｒ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ａ ｓｎ　ｌｉｅ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　５ｅｒＦＩＧ、１ ＡＢ ＦＩＧ、２ ４クローンの配列決定 ３．９ｘｌＯ形質転換体 ｈＧＨ溶離　グリシン溶離　グリシン溶離ＦＩＧ、５ ３．９２１０　形質転換体 ３．９ｘｌＯ形質転換体 ｈＧＨ溶離　７　！Ｊ　＞　＞溶離 ＦＩＧ、７ １ｏｒｉ １．０５ｘ　ｔｏ６ＤＮＡｓｅｑ、’ｓ　８．２ｘ　ｌ○６１．６ｘｌ○５．Ａ 、Ａ、　ｓｅｑ、’ｓ　ＦＨＧ、ｇ？？ ｕｃｕｕ’ｔ　ｏ、−ｔ　１−ＩＱ、　＜＞　（Ｊコ　Ｅ−１１−１゜ｕ　Ｅ− ４，−ｔへ　ｈｒａ　＜ｔｎ　（り−１Ｅ−１０ｕｃ＋ｍ（”）　＜ＨＣＤ＞　 ＣＤ＜　ｏｃｐ　ｏ−ｈｃｎ、。　。＜　。よ　よ。　Ｕ　目茨＝藝戻ＯΦ−Ｑ −〇−〇Φ ト　：Ｉ　Ｏ１）　Ｏコ　−　い ←の　Ｑ−−■　〇−炬５８８お　８おＣＪＡ　ＣＤ＜　Ｌ）Ｊ　Ｃ）＜　○Ｃ Ｄｌ−１ｃＱ　ｈｗ？：ＩＣＪ（：０　（Ｊｌ−１（ＪＯ’）　１−ｔｌ−１（ ＪＷ　（ＪΦのし５　ＧＮ　：ε　旨と　口〜　ごと　ｉｇｏ＜ｔｏＬＬ′）Ｅ −＋ｆｆｌ　Ｇｏ　ＣＪ（Ｌ）　（Ｊｍ　ＣＤ００ｈｌ−＋（Ｊ、−１（ＪＦ− ４０１−１？Ｉ−１（Ｊ−←のさ　。■ＣＤ＜　ＣＤ＜　（ＪＱＩ　＜ＨＣＤ＜ 　ＣＪ−Ｅ−１ｃＱの Ｏ ＣＤ　３　＜Ｏ（ＪＯＪ　Ｌ）＋ｔ＋ｏＦ−＋Ｏ（Ｊ＞　○で＜Ａ　Ｌ）ＬＩ　 Ｅ−＋４：　（Ｊ、−１ｏ　ＣＪＬＩ　（）、−１（ＪＦ４ＣＤｏ　ｕｃｂ　ｈ ａ、　ａｌｅｒｔ　ｏｃｖ　ｏｏ　ａ＜−司ｏ　ｃｐｃｕ　飄　Ｑ仁　ト　−　 Ｑのの　く−ｖ、−＜Ｉｊ）＜ｒ−＋　ｖＨ＜Ｐ−１＜　為ａ＜へＬｌ（！ｌ　 ｖｖ　（ＪＣ！＋　ｈｈ　２６藁足ｅＱＬＪ　Ｃ）　、−Ｉ　Ｅ−１１Ｊの　ト ［Ｆ］　←Φ　（Ｊ−１（、＋にｉご　６　ｇ　ｕ屑吊　８ギ　ギ＝　昌ε　て ｐ葺÷　■　Ｉ　舅冨　翳扉豐ぶ　ギ３ ＣＪＣＣＪ＞Ｏ＜ｍ　ＣＤ０−　＜ｍ　ｈＱ、　（ＪＭｆｆｉ認３　８目に　８ 冒　黛ど　８四　西国　と屑＝＜ｕ　←＞　←の　０のＬｌ”ＩＦ−＋、−１（ ＪＱ　く−υに　■ｒ＠　ＣＤ＞　＜・−〇’＋　１ｍ１ｌｌｌ　（ＪＡ　ＣＪ 、α＜ｈ　ａａ　←（ＪＵ工ＮＣ！：ｌ＞　ＣＤ＜　＜ＥｓＦ−Ｉ＋’５　Ｌｌ ”ｌ　（Ｊ　＞　（Ｊ　Ｍ　＜　Φ　Ｏα　ｌ−＋１．ｊＯ（Ｊ　α（Ｊ−ＩＬ Ｉ”ｌ　＜Ｊ−４（ＪＱ　＋、−ｔ　Ｑｌ−１＜＞へ　くのＯ＜へ　００　←Ｃ Ｑ　＜　ｌ−Ｉ　Ｆ−１？　Ｅ−１←ｒ’＋　ａ＜にシ　乙＝　？ｇ：　ミミ　 −！　ご汗　ご二＜ＨＥ４の　トーヘ　トＥ−１ｏｏ　＜＜　ａ＜Ｅ−１１−１ ｏｐ　Ｅ−１０（Ｊｌ−１ｏ　コの　−−Ｑ−（ＪＧＪ　＜−＋　Ｌ）　−〇二 　−ω０Ｌ）二　〇　ΦＨリ　ｔＤｃＤ　Ｃ）＜　＜Ｅｓ　Ｕ、５ｒ＊　＜Ｅ− ｓ　＜θ日　■　ｏＰ＠ｕ’ｔ　ｕ　コ　（ＪＱ、　ＣＪ＞　Ｅ−ｒＱ　＜Ｑ） ｃ：ｒ８Ｊ：＋　←つψ　ト■　くの　Ｑ−べ≧　トＨｎ＋ｃｉ、　Ｌ）：＞（ Ｎ　Ｃ）ＩＪ　ａ＜　ｏｏ　ｈｈ　＋（１−ＩＦ）閣　■　韮　芥葺Ｕ　葺灯　 職 ＱＯｏ　ｏｃｏ　飄　トΦ　Ｈ飄　ト　ｃの　ＱＯＥ−ＩＪ：Ｌｎ　＜−Ｌｌ− ＋　Ｅ−＋−＠　Ｌｌｌ−１←山へ　ｖａ　ｔｖｔｖ　＜Ｈａａ　が芝吾　にた 田 （ＪｆｌｌｌＦ−１１−ＩＬＩ”ＩＱ−■コ　（Ｊｌｔｌ　０ｒ−Ｉ　Ｌｌ−〇 Ｑｒ−１＜＞ＬＣＦ−＋＋’ＯＦ−１Φ　ＣＪ−ｅｍ　ｅｍｍＣＤ＜　？ｈｍ　 ＣＤ＞　ＣＪ−Ｉり＜　（り＞　Ｌ）＞９ｈＨＣＪ（Ｊ）　（ＪＷ　０００　（ りｒＣＪ（りｊＯＯ＞ＣＪｒ　Ｅ−＋ｇ　Ｌ）Ｊ：　ＣＪｙｃｙｚ　（Ｊ、−１ （Ｊｋ　ＣＤｓ＜Ｅ−ＩｈＱｔ　＜ｈ　ｕｃｂｍ　ａ＜　（ＪＱＪ　Ｌ）■Ｑα ロ　（Ｊ＞　（Ｊ、−１ くのの　。、−ｔ　ｅ、、、！芸　ごぶ　炬二＝　８＝ｏ＜ｒｒ’＋　ｏｏ　（ り＞　Ｅ−ＩＱＪ　＜ｈ　Ｌ）（り？　＜ｕ＞Ｑり　ｕｐ、Ｃりコ哨　（Ｊ、− ４Ｑ≧　ｏｏ　Ｑ−＜ｒ−＋　＜ｃｎ　Ｅ−１Φｒ−Ｅ−＋ｒＱ（Ｄ−〇−０ｇ ＣＤＣＤ　ＣＤ＜　ＣＪＡｒ’＞　ＣＤ＞　（ＪＣＤ　（ＪＱＪ　＜Ｅ−＋ｈｍ 　Ｃり＞　（Ｊｙ　ＣＤｕ　ＣＤ＞ＯＵΦＣＤｚ（Ｊ−Ｉ　Ｃ！ＪＰ−１（ＪＤ 　（ＪＣＩ　（１−１ｏ　Ｅ−−二Ｅｓ０）ＣＤ＜　ＬＩＬＩ　＜Ｅ＠　Ｅ−１ （１）　（）（りｗ　Ｅ−ＩＱＪ　（Ｊ−Ｅ−１ｅ７１　＜＞０　＜為＜Ｏ？ｌ −ｔ　（Ｊｌ−１（Ｊ１６Ｌｌ”）■１．Ｉ　Ｑ−リ　（り−１Ｑｌ−Ｉ　Ｑの 　くト　。−へＣ）＜　（Ｄ（りｌ”）　ＣＤＣＤ　ＱＯ−Ｉ　Ｅ−＜Ｕ＞　Ｆ −１−＋　ＣＤ＜す８ｇ　８汁　認５　８ご＝　８ぶ　藁訃　８シｕ−ｈｈ　ｕ ｏ　（り（りＦ）　＜ｈ　ＣＤ＜　（り（りｖｗｖ”＋　＜ｔｙ＋　Ｅ−１：） Ｍ　ｃｐｃｎ　（Ｊｌ−１（り０）０　＜ｙ淀謂詔　定曝　８０　炬ご　定温　 て汐；Ｈ８（Ｊ（：　ＨＷ　ＬＩＱＯＣＪＷ　Ｃりの　ＣＪ、−（Ｑにて５　Ｈ ８８μ宮　足陪　臣ご　Ｕ躍　炬３０ｕ　Ｆ−＋ｆｆ）　Ｑｌ−ｔ　ＱＷ　ＱＷ ｔＪ”ｌ（、！Ｏ：ｊ　（）Ｑａ←（Ｌ）　Ｌ）＞　＜＞　（Ｊ（Ｌ）　ＣＪΦ ａ’ｔｈｃ＋ｏｈ＜）：　ｈＯＥ−１←　Ｅ−１ｃＱ　ｈｗｒｙ”＋　ｕｑ　Ｅ −ＩＥ−ＩＱｃ　Ｅ−４−Ｌｎ　Ｏα　ＣＪＩｔｌ　（ＪＬＩ　ＱＣＱ　（！＋ Ｌ＋。

＜／−１＜＞の　くの　（Ｊ、−Ｉ　ＵＯＱト　ＱＯへＣＪＣＤ　Ｆ−１−＋ｃ ’＞　ＣＤ＜　ＣＤ＜　Ｅ−ＩＣ／）　Ｅ−１（Ｊ　Ｉ■０コ　ト一　（りＪＪ 　Ｌ）ＬＩＯＣＪＯＣＪ：）Ｍ　ＣＤ５Ｅ−ＩＱ　＜＞　Ｅ−１ｃＩ　（Ｊ（Ｌ ）００Ｍ　ＣＤ−ｈｍＱ−Ｅ−４Ｆ＋　＜Σ　トりの　Ｑ山　００　０＞（Ｊｌ −１（Ｊコ　ｕｏ　Ｅ−４＋−＋　Ｈ＋−＋ｕ”＋　ｈａ　ｈ’ｌ−＋く洲　ト ■　（、）ｌ−１ ト←　−４。ユ　Ｈｙ　ｉ〜；　認３　Ｈ８ＣＪ’５　（Ｊ　−の　■　の 述　定冗乏片　ヨシ　韮　属冨　属外 ｄ：＞（，１１−Ｉ　Ｑ（Ｑ　０００　１−＋の　トＯＱトＬ）−１■■　＜− Ｓ　Ｕ−の　０飄　（Ｊｌ−＋　ＣＤ、−＋ｃＤａ　＜ｔｎ　ｕ工　（ＪＱＩ＜ ｌ’　Ｅ−１（Ｊ　（ＪＬ　（ｊＯ＜Ｉ−ＩＱ　ζ−−仁　Ｏコ　←、−１　ｈ Ｏ旧　−飄とぶ；　Ｈｙ　＝５　色目　相ε　８だｇ　８０８お　８８　２完こ 　号；　と芸　炬二　乙＝Ｅ−４ｃ／）ｕｃｖ　ｃｐ＞？　Ｌ）＞　ｈｃｂ　ｕ ｏ　Ｅ−１ｃＱＬＩＣ：　ｏ、−＋　ｕ　に ８　昌ｙ　８　ｕ　眠８目左　舅ぎ （：ｊ　Ｆ−＋１−１０　０ｃＱ　（ｖＯ’）　ＣＤ＞　Ｑコ　ｈ＞ｕ’ｔＨΦ 　Ｑ、Ｃの　Ｑ　≧ Ｑ＋、２　４Ｅ−Ｉ？ｌ−ＩＱ　短片　呂ぢ　ε３　呂己詔Ｑ＋　（）＋　（Ｊ 　Φ　Ｑｌの　く絢　Ｑｌ　ト≧くのｒ’−ｖｇ＜の　Ｑ− ｏ＞　ｏ＞　＜Ｈａ＜望　＜ｈ　ａ＜　ａａ−弓の　ｏ、＋　ａｔ−ｔ　ＣＤ＠ 　（Ｊの　−−ｏ　トーＯ−０←　で　＜＞　ｈｒａ　＜・−Ｑ　ＱＯＱ　Φａ ＜−ｒａ＞　ｅ＋　（り＞　ｕ：ｃ　ｈす１　Ｈψ■Ｏ（、ｌＵ　Ｌ）Ｉ−ＩＯ Ｃりの　Ｆ−＋１＋　（＋１４　Ｌ）＞８だ　定Ｓ　８艶　短片　藁陪　ビ品　 ８ＳｈＪ：、ｃｚＯ＜、−＋　ｕ−ヨ３誓　ε　便Ｑ　Φ　（ＪＩＪ　ｏ　α　 ０１−１ ト山　＜ｃ／）ｖｒｖ　＜←　ＵＯ■■ＱＬ＋　Ｑ：ｊＬＩ”ｌ　（，１１−１ （ＪＣ：　（Ｊ　α　ＣＪ＞　（Ｊ：）−、ＯＱ二　ＨΦリ　○垣 くト　。−リ　＜８　≦３　ご３　８０　８ざ詔３３　４、ｇ　炬ご　況冒　乙 Ｓ譜　８６　８湧扉硼　腿寥韮　瑚三　芥　ロ　茹耗 Ｏシ＋Ｖ１　＜＞　ト　α　〇　− ＱいＣ！ｌＯバ　＜Ｅ−４ギ３　Ｉ芸瑚コ０Ｐ−１へ　０．−１　＜の　Ｏ− 工 乏五３　ビ芸　Ｕス　如芸　試２　”−；：　Ｆ６３鼾υ０１．０　？Ｉｎ＋　 Ｅ−１（Ｊ　Ｅ−１山Ｌ）＞　ＣＤ＞Ｕ　ｌ−＜（１）ＷＩ　琴　１影邦　腿ぎ 　Ｈト　邦 ε　８井８＝　１　目　ｌ　瑚ヨ芸 ＱＣ＜Σリ　Ｆ＠の ８＝８　隠只　ヨ長ｎ１　葺と　砦！ Ｈの　−一　〇〇 −ｙ　＜ｗ　□＝１０　Ｅ−１勺　くΦ　−一　くΦ０　■　Ｑ　Φ　ト　Φリ 　○−Ｉ　Ｅ−１，−Ｉ　Ｅ−１弓　−Ｈ−の　Ｈの　Ｑ−ψ　＜Ｄ＜　＜ＨＣ Ｄ＞　＜Ｈ酸溶離　４Ｄ５洗浄、酸溶離 ＦＩＧ、１２ 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１４１５７ ５　８３１８−４Ｈ１４／６１　８３１８−４Ｈ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｈ９２８２−４Ｂ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｈ Ｃｌ２Ｒ１：１９） （３１）優先権主張番号　７１５，３００（３２）優先臼　１９９１年６月１４ 日（３３）優先権主張国　米国（ＵＳ） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、　ＣＡ、Ｊ Ｐ、　ＵＳ （７２）発明者　パース、ステイーブンアメリカ合衆国カリフォルニア９４０６ １、レッドウッド・シティ−、シーラ・ストリート１３５５番 Ｉ （７２）発明者　グリーン、ロナルド アメリカ合衆国ノース・キャロライナ ２７７０７、ダラム、ノーウッド・アベニュー１０１４番 （７２）発明者　ロウマン、ヘンリー・ビーアメリカ合衆国カリフォルニア９４ ５４７、バーキュリーズ、フアシヨン・ウェイ２０幡（７２）発明者　ウェルズ 、ジェームズ・ニーアメリカ合衆国カリフォルニア９４０１０、バーリンゲーム 、コロンブス・アベニュー１３４１番 （７２）発明者　マシューズ、ディピッド・ジェイアメリカ合衆国カリフォルニ ア９４１２２、サン・フランシスコ、ノリニガ・ストリート１５２７番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．新規な結合ポリペプチドを選択するための方法であって、（ａ）ポリペプチ ドをコードしている第１の遺伝子とファージコートタンパク質の少なくとも一部 をコードしている第２の遺伝子を含有する、融合タンパク質をコードしている遺 伝子融合体に機能的に結合した転写調節要素を含有する複製可能な発現ベクター を構築し； （ｂ）該ベクターの第１の遺伝子内の１またはそれ以上の選択した位置において 突然変異を行なって一群の関連プラスミドを生成させ；（ｃ）該プラスミドで適 当な宿主細胞を形質転換し；（ｄ）該形質転換した宿主細胞を該ファージコート タンパク質をコードしている遺伝子を有するヘルパーファージに感染させ；（ｅ ）該プラスミドの少なくとも一部を含有する組換えファージミド粒子の形成に適 切かつ宿主を形質転換しうる条件のもと、少量のファージミド粒子だけが融合タ ンパク質の１を越えるコピーを粒子の表面に表示するように該条件を調節して、 該形質転換して感染させた宿主細胞を培養し；（ｆ）該ァージミド粒子を標的分 子と接触させて、ファージミド粒子の少なくとも一部を該標的分子と結合させ； そして（ｇ）該結合したファージミド粒子を未結合の粒子から分離する；ことか らなる方法。 ２．適当な宿主細胞を、結合したファージミド粒子に感染させ、工程（ｄ）〜（ ｇ）を繰り返すことをさらに包含する請求項１に記載の方法。 ３．工程を１またはそれ以上の回数繰り返す請求項２に記載の方法。 ４．発現ベクターが分泌シグナル配列をさらに含有する請求項１に記載の方法。 ５．転写調節要素が、ｌａｃＺ、ｐｈｏＡ、トリプトファン、ｔａｃ、λＰＬ、 バクテリオファージＴ７、およびこれらの組合せからなる群から選択されるプロ モーター系である請求項１に記載の方法。 ６．第１の遺伝子が哺乳動物タンパク質をコードしている請求項１に記載の方法 。 ７．タンパク質が、成長ホルモン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、デス−Ｎ−メ チオニルヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、チロキシン 、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、プロインスリン、レラキシンＡ鎖、レラキ シンＢ鎖、プロレラキシン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン （ＴＳＨ）、ロイチナイジングホルモン（ＬＨ）、糖タンパク質ホルモン受容体 、カルシトニン、グルカゴン、因子ＶＩＩＩ、抗体、肺表面活性物質、ウロキナ ーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ ）、ボンベシン、因子ＩＸ、トロンビン、造血成長ホルモン、腫瘍壊死因子αお よびβ、エンケファリナーゼ、ヒト血清アルブミン、ミュラー阻害物質、マウス ゴナドトロピン関連ペプチド、β−ラクタマ−ゼ、組織因子タンパク質、インヒ ビン、アクチビン、血管内皮成長因子、インテグリン受容体、トロンボポエチン 、プロテインＡまたはＤ、リウマトイド因子、ＮＧＦ−β、血小板成長因子、ト ランスフォーミング成長因子；ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β、インスリン様成長 因子ＩおよびＩＩ、インスリン様成長因子結合タンパク質、ＣＤ−４、ＤＮアー ゼ、潜在性関連ペプチド、エリトロポエチン、ＨＥＲ２リガンド、骨誘導因子、 インターフェロンα、βおよびγ、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、Ｍ−ＣＳＦ、 ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ− ２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、スーパーオキシドジスムターゼ；崩壊促進因子、ウイ ルス抗原、ＨＩＶエンベロープタンパク質ＧＰ１２０およびＧＰ１４０、心房性 ナトリウム利尿ペプチドＡ、ＢまたはＣ、あるいは免疫グロブリン、ならびに上 記タンパク質のフラグメントからなる群がら選択される請求項６に記載の方法。 ８．タンパク質がヒトタンパク質である請求項７に記載の方法。 ９．タンパク質が約１００以上のアミノ酸残基を含有する請求項８に記載の方法 。 １０．タンパク質が標的と相互作用しうるアミノ酸を表示する複数の堅い２次構 造を含有し、突然変異が主として該アミノ酸をコードしているコドンに対応する 位置において生成する請求項１に記載の方法。 １１．堅い２次構造がα−（３．６１３）ヘリックス、３１０ヘリックス、π− （４．４１■）ヘリックス、平行および逆平行β−プリーツシート、逆ターン、 ならびに非秩序構造からなる群から選択される構造を含有する請求項１０に記載 の方法。 １２．突然変異が１を越えるコドンにおいて生成する請求項１０に記載の方法。 １３．突然変異が１を越える堅い２次構造において生成する請求項１２に記載の 方法。 １４．ヘルパーファージがＭ１３ＫＯ７、Ｍ１３Ｒ４０８、Ｍ１３−ＶＣＳ、お よびＰｈｉＸ１７４からなる群から選択される請求項１に記載の方法。 １５．ヘルパーファージがＭ１３ＫＯ７であり、コートタンパク質がＭ１３ファ ージの遺伝子ＩＩＩコートタンパク質である請求項１４に記載の方法。 １６．宿主が大腸菌である請求項１５に記載の方法。 １７．プラスミドが転写調節要素の厳格な制御下にある請求項１６に記載の方法 。 １８．量が約１％未満である請求項１７に記載の方法。 １９．量が融合タンパク質の単一コピーを表示するファージミド粒子の量の２０ ％未満である請求項１８に記載の方法。 ２０．量が１０％未満である請求項１９に記載の方法。 ２１．工程（ａ）において、ポリペプチドをコードしている第１の遺伝子とファ ージコートタンパク質の少なくとも一部をコードしている第２の遺伝子の間に、 ｍＲＮＡの抑制可能な終止コドンをコードしているＤＮＡトリプレットを挿入す ることをさらに包含する請求項１に記載の方法。 ２２．ｍＲＮＡの抑制可能な終止コドンがＵＡＧ（アンバー）、ＵＡＡ（オーカ ー）およびＵＧＡ（オペル）からなる群から選択される請求項２１に記載の方法 。 ２３．該抑制可能な突然変異の結果、発現ベクターをサプレッサー宿主細胞中で 増殖させたときにはポリペプチドとコートタンパク質を含有する融合ポリペプチ ドが検出可能に産生され、そして非サプレッサー宿主細胞中で増殖させたときに は該ポリペプチドが実質的に該ファージコートタンパク質に融合することなく合 成される請求項２２に記載の方法。 ２４．ｈＧＨアミノ酸の１７２、１７４、１７６および１７８のそれぞれが、群 として （１）Ｒ、Ｓ、Ｆ、Ｒ；（２）Ｒ、Ａ、Ｙ、Ｒ；（３）Ｋ、Ｔ、Ｙ、Ｋ；（４） Ｒ、Ｓ、Ｙ、Ｒ；（５）Ｋ、Ａ、Ｙ、Ｒ；（６）Ｒ、Ｆ、Ｆ、Ｒ；（７）Ｋ、Ｑ 、Ｙ、Ｒ；（８）Ｒ、Ｔ、Ｙ、Ｈ；（９）Ｑ、Ｒ、Ｙ、Ｒ；（１０）Ｋ、Ｋ、Ｙ 、Ｋ；（１１）Ｒ、Ｓ、Ｆ、Ｓ；および（１２）Ｋ、Ｓ、Ｎ、Ｒのいずれかから 順に選択されるヒト成長ホルモン変異体。 ２５．融合タンパク質をコードしている遺伝子融合体に機能的に結合させた転写 調節要素を含有する複製可能な発現ベクターからなるファージミドであって、該 遺伝子融合体がポリペプチドをコードしている第１の遺伝子とファージコートタ ンパク質の少なくとも一部をコードしている第２の遺伝子を含有し、そして、Ｕ ＡＧ、ＵＡＡおよびＵＧＡから選択されるｍＲＮＡの抑制可能な終止コドンをコ ードしているＤＮＡトリプレットコドンが該第１および第２の遺伝子の融合末端 の間に挿入されているか、または該遺伝子融合連結点に隣接するアミノ酸コード 化トリプレットコドンの代わりに置換されているファージミド。 ２６．第１の遺伝子が哺乳動物タンパク質をコードしている請求項２５に記載の ファージミド。 ２７．タンパク質が、成長ホルモン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、デス−Ｎ− メチオニルヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、チロキシ ン、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、プロインスリン、レラキシンＡ鎖、レラ キシンＢ鎖、プロレラキシン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモ ン（ＴＳＨ）、ロイチナイジングホルモン（ＬＨ）、糖タンパク質ホルモン受容 体、カルシトニン、グルカゴン、因子ＶＩＩＩ、抗体、肺表面活性物質、ウロキ ナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−Ｐ Ａ）、ボンベシン、因子ＩＸ、トロンビン、造血成長ホルモン、腫瘍壊死因子α およびβ、エンケファリナーゼ、ヒト血清アルブミン、ミュラー阻害物質、マウ スゴナドトロピン関連ペプチド、β−ラクタマ−ゼ、組織因子タンパク質、イン ヒビン、アクチピン、血管内皮成長因子、インテグリン受容体、トロンボポエチ ン、プロテインＡまたはＤ、リウマトイド因子、ＮＧＦ−β、血小板成長因子、 トランスフォーミング成長因子；ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β、インスリン様成 長因子ＩおよびＩＩ、インスリン様成長因子結合タンパク質、ＣＤ−４、ＤＮア ーゼ、潜在性関連ペプチド、エリトロポエチン、骨誘導因子、インターフェロン α、βおよびγ、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよ びＧ−ＣＳＦ、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、Ｉ Ｌ−４、スーパーオキシドジスムターゼ；崩壊促進因子、ウイルス抗原、ＨＩＶ エンベロープタンパク質ＧＰ１２０およびＧＰ１４０、心房性ナトリウム利尿ペ プチドＡ、ＢまたはＣ、免疫グロブリン、ならびに上記タンパク質のフラグメン トからなる群から選択される請求項２６に記載のファージミド。 ２８．タンパ質がヒトタンパク質である請求項２７に記載のファージミド。 ２９．タンパク質が約１００以上のアミノ酸残基を含有する請求項２８に記載の ファージミド。 ３０．タンパク質が標的と相互作用しうるアミノ酸を表示する複数の堅い２次構 造を含有する請求項２５に記載のファージミド。 ３１．堅い２次構造がα−（３．６１３）ヘリックス、３１０ヘリックス、π− （４．４１６）ヘリックス、平行および逆平行β−プリーツシート、逆ターン、 ならびに非秩序構造からなる群から選択される構造を含有する請求項３０に記載 のファージミド。 ３２．ヘルパーファージがＭ１３ＫＯ７、Ｍ１３Ｒ４０８、Ｍ１３−ＶＣＳ、お よびＰｈｉＸ１７４からなる群から選択される請求項２５に記載のファージミド 。 ３３．ヘルパーファージがＭ１３ＫＯ７であり、コートタンパク質がＭ１３ファ ージの遺伝子ＩＩＩコートタンパク質である請求項３２に記載のファージミド。 ３４．宿主が大腸菌の野生型またはサプレッサー型である請求項３３に記載のフ ァージミド。 ３５．プラスミドが転写調節要素の厳格な制御下にある請求項３４に記載のファ ージミド。 ３６．位子の表面に融合タンパク質の１を越えるコピーを表示するファージミド 粒子の数が１％未満である請求項３５に記載のファージミド。 ３７．ファージミド粒子の数が約１０％未満である請求項３６に記載のファージ ミド。 ３８．ファージミド粒子の数が約２０％未満である請求項３７に記載のファージ ミド。 ３９．ｈＧＨアミノ酸の１０、１４、１８および２１のそれぞれが、群として（ １）Ｈ、Ｇ、Ｎ、Ｎ；（２）Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｎ；（３）Ｆ、Ｓ、Ｆ、Ｌ；（４）Ｙ 、Ｔ、Ｖ、Ｎ；および（５）Ｉ、Ｎ、Ｉ、Ｎのいずれかから順に選択されるヒト 成長ホルモン変異体。 ４０．ｈＧＨアミノ酸の１７４がセリンであり、１７６がチロシンであり、そし てｈＧＨアミノ酸の１６７、１７１、１７５および１７９のそれぞれが、群とし て （１）Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｔ；（２）Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｉ；（３）Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｌ；（４） Ｎ、Ｎ、Ｔ、Ｔ；（５）Ｒ、Ｄ、Ｉ、Ｉ；および（６）Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｑのいずれ かから順に選択されるヒト成長ホルモン変異体。 ４１．新規な結合ポリペプチドを選択するための方法であって、（ａ）１または それ以上のサブユニットの少なくとも１つをコードしているＤＮＡがファージコ ートタンパク質の少なくとも一部をコードしているＤＮＡに融合している、その ような１またはそれ以上のサブユニットを含む所望のタンパク質をコードしてい るＤＮＡに機能的に結合させた転写調節要素を含有する複製可能な発現ベクター を構築し； （ｂ）１またはそれ以上の選択した位置において該所望のタンパク質をコードし ているＤＮＡに突然変異を行なって一群の関連ベクターを生成させ；（ｃ）該ベ クターで適当な宿主細胞を形質転換し；（ｄ）該形質転換した宿主細胞を該ファ ージコートタンパク質をコードしている遺伝子を有するヘルパーファージに感染 させ；（ｅ）該プラスミドの少なくとも一部を含有する組換えファージミド粒子 の形成に適切かつ宿主を形質転換しうる条件のもと、少量のファージミド粒子だ けが融合タンパク質の１を越えるコピーを粒子の表面に表示するように該条件を 調節して、該形質転換して感染させた宿主細胞を培養し；（ｆ）該ファージミド 粒子を標的分子と接触させて、ファージミド粒子の少なくとも一部を該標的分子 と結合させ；そして（ｇ）結合したファージミド粒子を未結合の粒子から分離す る；ことからなる方法。 ４２．発現ベクターが所望のタンパク質の各サブユニットをコードしているＤＮ Ａに機能的に結合した分泌シグナル配列をさらに含有する請求項４１に記載の方 法。 ４３．所望のタンパク質が哺乳動物タンパク質である請求項４２に記載の方法。 ４４．所望のタンパク質が、インスリン、レラキシン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳ Ｈ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、ロイチナイジングホルモン（ＬＨ）、糖 タンパク質ホルモン受容体、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、肺表面 活性物質、インテグリン受容体、インスリン様成長因子ＩおよびＩＩ、ならびに 上記タンパク貧のフラグメントからなる群から選択される請求項４３に記載の方 法。 ４５．所望のタンパク質がヒト化抗体である請求項４４に記載の方法。 ４６．所望のタンパク質がＨＥＲ−２受容体（ヒト表皮成長因子受容体−２）に 結合しうるヒト化Ｆａｂフラグメントである請求項４５に記載の方法。 ４７．ｈＧＨアミノ酸のグルタメート１７４がセリン１７４によって置換され、 フェニルアラニン１７６がチロシン１７６によって置換され、そして８個の天然 ｈＧＨアミノ酸Ｆ１０、Ｍ１４、Ｈ１８、Ｈ２１、Ｒ１６７、Ｄ１７１、Ｔ１７ ５およびＩ１７９の１またはそれ以上が別の天然アミノ酸によって置換されてい るヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）変異体。 ４８．８個の天然ｈＧＨアミノ酸Ｆ１０、Ｍ１４、Ｈ１８、Ｈ２１、Ｒ１６７、 Ｄ１７１、Ｔ１７５およびＩ１７９のそれぞれが、群として（１）Ｈ、Ｇ、Ｎ、 Ｎ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｔ；（２）Ｈ、Ｇ、Ｎ、Ｎ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｉ；（３）Ｈ、Ｇ、 Ｎ、Ｎ、Ｎ、Ｎ、Ｔ、Ｔ；（４）Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｎ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｔ；（５）Ａ、 Ｗ、Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｉ；（６）Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｎ、Ｎ、Ｎ、Ｔ、Ｔ；（７） Ｆ、Ｓ、Ｆ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｔ；（８）Ｆ、Ｓ、Ｆ、Ｌ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｉ；（ ９）Ｆ、Ｓ、Ｆ、Ｌ、Ｎ、Ｎ、Ｔ、Ｔ；（１０）Ｈ、Ｇ、Ｎ、Ｎ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、 Ｎ；（１１）Ａ、Ｎ、Ｄ、Ａ、Ｎ、Ｎ、Ｔ、Ｎ；（１２）Ｆ、Ｓ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、 Ｓ、Ｔ、Ｔ；（１３）Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｓ、Ａ、Ｄ、Ｎ、Ｓ；（１４）Ｈ、Ｇ、Ｎ、 Ｎ、Ｎ、Ａ、Ｔ、Ｔ；（１５）Ｆ、Ｓ、Ｆ、Ｌ、Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｔ；（１６）Ａ、 Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｒ、Ｄ、Ｔ、Ｉ；（１７）Ｑ、Ｙ、Ｎ、Ｎ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｔ；（１ ８）Ｗ、Ｇ、Ｓ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｔ、Ｉ；（１９）Ｆ、Ｌ、Ｓ、Ｓ、Ｋ、Ｎ、Ｔ、 Ｖ；（２０）Ｗ、Ｎ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｔ；（２１）Ａ、Ｎ、Ａ、Ｓ、Ｎ、 Ｓ、Ｔ、Ｔ；（２２）Ｐ、Ｓ、Ｄ、Ｎ、Ｒ、Ｄ、Ｔ、Ｉ；（２３）Ｈ、Ｇ、Ｎ、 Ｎ、Ｎ、Ｎ、Ｔ、Ｓ；（２４）Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｒ、Ｄ、Ｔ、Ｉ；（２５）Ｍ、 Ｔ、Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｔ；（２６）Ｆ、Ｓ、Ｆ、Ｌ、Ｔ、Ｓ、Ｔ、Ｓ；（２ ７）Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｎ、Ｒ、Ｄ、Ｔ、Ｉ；（２８）Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｎ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、 Ｎ；（２９）Ｍ、Ｑ、Ｍ、Ｎ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｔ；（３０）Ｈ、Ｙ、Ｄ、Ｈ、Ｒ、 Ｄ、Ｔ、Ｔ；（３１）Ｌ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、Ｒ、Ｄ、Ｔ、Ｉ；（３２）Ｌ、Ｎ、Ｓ、 Ｈ、Ｔ、Ｓ、Ｔ、Ｔ；（３３）Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｎ、Ｎ、Ａ、Ｔ、Ｔ；（３４）Ｆ、 Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｒ、Ｄ、Ｔ、Ｉ；（３５）Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｎ、Ｎ、Ａ、Ｔ、Ｔ；（３ ６）Ｉ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｔ；（３７）Ｆ、Ｓ、Ｌ、Ａ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、 Ｖ；（３８）Ｆ、Ｓ、Ｆ、Ｌ、Ｋ、Ｄ、Ｔ、Ｔ；（３９）Ｍ、Ａ、Ｄ、Ｎ、Ｎ、 Ｓ、Ｔ、Ｔ；（４０）Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｎ、Ｓ、Ｓ、Ｖ、Ｔ；（４１）Ｈ、Ｑ、Ｙ、 Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｔ、Ｉ；のいずれかから順に選択される対応アミノ酸によって置換 されている請求項４７に記載のｈＧＨ変異体。 ４９．ヒト成長ホルモン変異体（１１）が、アルギニン１５によって置換された ロイシン１５およびアルギニン１８６によって置換されたリジン１６８をさらに 含有する請求項４８に記載の方法。 ５０．ヒト成長ホルモン変異体（４０）がフェニルアラニン１７８をさらに含有 する請求項４８に記載の方法。 ５１．新規な結合ポリペプチドを選択するための方法であって、（ａ）結合アミ ノ酸配列に機能的に連結したポリペプチドをコードしている第１の遺伝子とファ ージコートタンパク質の少なくとも一部をコードしている第２の遺伝子を含有す る、融合タンパク質をコードしている遺伝子融合体に機能的に結合した転写調節 要素を含有する複製可能な発現ベクターを構築し；（ｂ）該ベクターの第１の遺 伝子の結合アミノ酸配列内の１またはそれ以上の選択した位置において突然変異 を行なって一群の関連プラスミドを生成させ；（ｃ）該プラスミドで適当な宿主 細胞を形質転換し；（ｄ）該形質転換した宿主細胞を該ファージコートタンパク 質をコードしている遺伝子を有するヘルパーファージに感染させ；（ｅ）該プラ スミドの少なくとも一部を含有する組換えファージミド粒子の形成に適切かつ宿 主を形質転換しうる条件のもと、少量のファージミド粒子だけが融合タンパク質 の１を越えるコピーを粒子の表面に表示するように該条件を調節して、該形質転 換して感染させた宿主細胞を培養し；（ｆ）該ファージミド粒子を標的分子と接 触させて、ファージミド粒子の少なくとも一部を該標的分子と結合させ； （ｇ）該結合したファージミド位子を、該結合したファージミド粒子の少なくと も一部の結合アミノ酸配列を加水分解しうるプロテアーゼと接触させ；そして（ ｈ）該加水分解したファージミド粒子を単離する；ことからなる方法。 ５２．適当な宿主細胞を、加水分解したファージミド粒子に感染させ、工程（ｄ ）〜（ｈ）を繰り返すことをさらに包含する請求項５１に記載の方法。