JPH04503158A - 核酸配列又はその中の変化の検出 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 核酸配列又はその中の変化の検出 技工五！ 本発明は、物質中の特定のポリヌクレオチド配列の検出方法、複数もしくは多数 の異なるポリヌクレオチド配列を有する物質中の、少な（とも２つの異なる特定 のポリヌクレオチドの検出方法、特定のヌクレオチド又は塩基が、特定のポリヌ クレオチド配列中の特定の位置にあるか否かの検出方法、同−又は異なる特定の ヌクレオチド又は塩基が、複数もしくは多数の異なるポリヌクレオチド配列を有 する物質中の、少な（とも２つの異なる特定のポリヌクレオチド配列中の特定の 位置に存在するか否かの検出方法、複数もしくは多数の異なるポリヌクレオチド 配列を有する物質中の、少な（とも２つの異なる特定のポリヌクレオチド配列の 存在を検出するためのスクリーニング方法、及び特定のヌクレオチド又は塩基が 、複数もしくは多数の異なるポリヌクレオチド配列を有する物質中の少な（とも ２つの異なる特定のポリヌクレオチド配列中の特定の位置に存在するか否かを検 出するためのスクリーニング方法に関する。

１１民通 現在、ポリヌクレオチド配列の最も一般的な検出方法は、オリゴヌクレオチド又 はポリヌクレオチドプローブを用いるハイブリダイゼーション（ハイブリッド形 成）である。この技法では、標的となる核酸を、通常、セルロース又はナイロン のような固体支持体と不可逆的に結合させる。次に、標識化プローブをハイブリ ダイジング（ハイブリッド形成）条件下で溶液中に付加し、プローブと標的核酸 との間に塩基配列のホモロジーが認められる場合には、プローブは標的となるポ リヌクレオチドとのハイブリッド分子を生成する。このハイブリッドは種々の方 法で、例えば放射能標識又はビオチン標識によって検出される。この方法の欠点 は、第一に、オペレーターのかなりの専門技術を要することであり、第二に、そ の技術が冗長で、時間がかかり、第三に容易に自動化できないことである。全操 作にはしばしば４８時間以上を要する。

試料中の特定の核酸を検出するために一般に用いられる液体一固体法としては、 サザンプロット、ノーザンプロット、及びドツトプロットハイブリダイゼーショ ンが挙げられる。これらの方法は、時間がかかり、非能率的で、技術的に多（を 要し、そして容易に自動化できない。サザン及びノーザンプロットの操作法は、 ゲルからペーパーへの核酸のトランスファーが非能率的であるというさらなる欠 点を有する。その他の群は液体−同体ハイブリダイゼーションを用いたが、その 場合、捕獲プローブは固体支持体と結合し、試料中の問題のＤＮＡ配列は捕獲プ ローブと結合するようになる。この例は、オーストラリア国特許第ＡＵ−７０１ ５２／８７号に記載されていて、この場合は少なくとも２つのオリゴヌクレオチ ドプローブを用い、これは標的のプローブをアニールするための液体ハイブリダ イゼーションフォーマット中の、同−標的核酸の相互排他的領域と相補的であっ て、それが存在する場合、並びにプローブの１つにより２つのプローブ標的のサ ンドイッチの固定化により標的の存在を検出し、その後その他のプローブを検出 する。しかしながらこの方法は、問題のＤＮＡ配列にハイブリダイズするための 第二のディテクタープローブを必要とする。この工程は検定の特異性を低減し、 その結果としてバックグラウンドを増大する。本発明は、捕獲プローブとして及 びディテクタープローブとして作用するプローブを１つだけ包含することにより この問題を克服する。

液体一固体ハイブリダイゼーションに対比して、液体−液体ハイブリダイゼーシ ョンは、標的配列に対するプローブの接触がより大きいために、非常に迅速な反 応速度を有し、感度を改良する。例えば、Ｇｅｎｅ−Ｐｒｏｂｅ　Ｉｎｃは、Ｄ ＮＡ配列を検出するために液体ハイブリダイゼーシ３ンヒドロキシアパタイト法 を用いる。このシステムの主な欠点は、余分のプローブからのハイブリッドの配 列特異的分離というよりむしろ、１開鎖ＤＮＡ配列からの２本鎖ＤＮＡの吸着的 識別による。本発明は、核酸ハイブリダイゼーションを溶液中で起こし、その後 、固体支持マトリックス上へ”ハイブリッド”分子を除去することによって、こ れらの欠点を克服する。液体ハイブリダイゼーションの別の利点としては、支持 体−結合プローブが同一の捕獲分子で標識化される場合は、一般の固体支持体が 多数の標的に対して働くことが考えられる。

試料中の特定の核酸を検出するために、２つのオリゴヌクレオチドの組み合わせ を用いる場合がいくつかある（オーストラリア国特許第ＡＵ−Ａ−７０１５２／ ８７号、ＡＵ−Ａ−２６７５５／８８号、ＡＵ−Ａ−５３１０５／８６号、ＡＵ −Ｂ−８９５７５／８２号、及びＡＵ−Ａ−８００９７／８７号）。これらは全 て、標的−ヒのＤＮＡの２つの短い配列を用いる必要がある。これらの配列は両 者とも、全ての考え得る標的中に含まれねばならず、相互に排他的且つ非重複で なければならず、そして同−条件下で両プローブをそれらの相補的配列にハイブ リダイズし得るよう、同様なＧ＋Ｃ比を持たねばならない。

問題の核酸配列を検出し、ハイブリッドを固体支持マトリックスと結合させるこ とによって、溶液からそれを除去するための捕獲プローブの使用に関して、関連 のある従来技術が存在する（オーストラリア国特許第ＡＵ−Ａ−７０１５２／８ ７号、ＡＵ−Ａ−５３１０５／８６号、ＡＵ−Ａ−２１７８１／８８号、ＡＵ− Ａ−６９７２４／８７号、ＡＵ−Ａ−１４００５／８８号）。しかしながら、こ れらの技法は、別々の捕獲及びディテクタープローブを用い、上記に詳述したよ うな多数の欠点を生じる。本発明は、単一の捕獲／ディテクタープローブ系を用 いることによりこれらの問題を克服する。

非放射性リポータ−分子をＤＮＡに結合する、有用な多数の例があり、特定のハ イブリッドの検出が可能となっている。しかしながら、検出のためにビオチンを ＤＮＡ分子中に包含させる場合は、標的分子当たり数個のビオチン分子を包含可 能である（それにより検出の感度を増大する）としても、包含ビオチンを可視化 する機序は複雑で時間がかかる。

対照してみると、その他の非放射性リポータ−分子（例えば蛍光、発光、化学発 光分子）を包含すると、標的配列を迅速且つ簡単に検出できる。しかしながら本 技術は、単一リポータ−分子を各標的配列に結合させるだけである。この事実は 、最終検定の全体的感度を低減する。本発明は、簡単、迅速な検出のために化学 発光検出系を用いることにより、そしてさらに、各標的中にいくつかのディテク ター分子を導入し、検定感度を有意に増大することによって、一度にこれらの問 題を克服する。

したがって、液体ハイブリダイゼーションの迅速な反応を利用し、分析のため単 一のプローブを必要とするだけで、そして安定したハイブリッドを生じ、検出さ れる配列から非ハイブリッド化物質を容易に除去する簡単な方法がめられる。し たがって本発明は、単一プローブが問題の配列にハイブリダイズし、次に共有結 合により伸長して安定したへイブリッドを生成する、液体ハイブリダイゼーショ ン系を提供する。このハイブリッドを支持マトリックスで捕獲し、次いで洗浄し て、非ハイブリッド化物質を除去する。本発明に記載の系は、簡単、迅速、高感 度で、肉眼で又は簡単なプレートリーダーで読み取れ、そして容易に自動化でき る。

核酸ハイブリダイゼーションのこの領域では、２っの広範な種類の：即ち感染性 及び遺伝的な疾患を検出する必要がある。感染性疾患に関しては、サルモネラ菌 、ナイセリア菌のような細菌、クラミジア及びリケッチアのような寄生性微生物 、Ｂ型肝炎のようなウィルス、マラリア原虫のような原生動物によって引き起こ される疾患を検出するために、多数のＤＮＡに基づく系が記載されている。しか しながら、これらは全て、一つ又はそれ以上の上記の欠点を蒙る。

突然変異（欠失、挿入、点突然変異又は転位）を特徴とする遺伝的疾患に関して は、その技術は余り十分に開発されてはいない。これらの種類の疾患は、制限酵 素断片各型（ＲＦＬＰ）分析を用いることにより、又は短いオリゴヌクレオチド プローブの正確なハイブリダイゼーションによって、一般に診断される。

ＲＦＬＰ検出は、制限酵素部位が突然変異によって変えられることが必要である が、これは常にそうであるわけではない。さらにＲＦＬＰ分析は検出のために、 サザンブロットハイブリダイゼーションを用いる必要がある。点突然変異を検出 する短いオリゴヌクレオチドプローブの使用も、いくつかの重大な欠点を有する 。特に、単一の塩基対不適合がハイブリダイゼーションを結果的に生じないこと を確実にするために、ハイブリダイゼーション条件は正確でなければならない。

実際、塩濃度及び温度はハイブリダイゼーション条件の特異性を決定し、これら は要求される正確さに容易に制御されない。本発明は、サザンハイブリダイゼー ション分析、及びハイブリダイゼーション条件の正確な制御の必要を克服する。

本発明は、突然変異に隣接する遺伝子の一定の切片にハイブリダイズし、酵素即 ちＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ鎖をヌクレオチド又は塩基突然変異を含めてそこ まで延長させる、特定のプライマープローブによって、これを達成する。

ポリメラーゼ反応に付加される、ジデオキシヌクレオチドの操作により、考え得 るヌクレオチド変化の全てを検出できる。

感染性及び遺伝性疾患の検出には、いくつかの種類の標識化分子を水系に組み入 れる必要がある。種々の放射性アイソトープ又は放射能標識化化合物が、標識と して用い得る。しかしながら、放射性標識には、（Ｌ）危険である、（ｉ　ｉ） 高価である、（ｉｉｉ）貯蔵期間が限られている、（ｉｖ）生じたシグナルを測 定するのに高価な装置を要するといったことを含めていくつかの欠点がある。近 年、一連の非放射性物質が、ＤＮＡ分子を検出するために用いられている。

非放射性標識の例としては、蛍光、発光、化学発光、酵素又は免疫性化合物が挙 げられる６ビオチンとアビジン又はストレプトアビジン、ランクニドキレート化 合物、レクチン、及び蛋白質の親和性に基づく標識を用いてもよい。好ましい検 出手段は、分光器又は光化学による、又は標識部分と、酵素、例えばアルカリホ スファターゼ又はホースラディシュベルオキシダーゼを含む、検出可能な変化を 生じ得る存在に結合するポリペプチド、レクチン又は抗体との間の検出可能な複 合体の生成によるものである。

しかしながら、目下の技術に欠けているものは、次の：　（ｉ）ポリヌクレオチ ド配列を検出する迅速な方法を包含し、（ｉｉ）試料中の小さい数の標的配列を 検出するのに十分な感度を有し、そして（ｉ　ｉ　ｉ）非放射性である、単−系 である。現在、これらの用件を満たす単−系はない。

最終的態様としては、試料中の特定のポリヌクレオチド配列を検出する必要性は 、（ｉ）簡単なキットフォーマット中への、又は（ｉ　ｉ）自動装置中への全工 程の組織化を要する。キット及び自動化機械がともに抗体による蛋白質の検出に 有用である一方、試料中の特定のポリヌクレオチド配列を簡単に、迅速に且つ安 価に検出するのに有用な系はまだない。

ｌ肛Ω旦よ 物質中の特定のポリヌクレオチド配列を検出する方法を提供することが本発明の 目的である。

別の目的は、多数（複数）の異なるポリヌクレオチド配列を有する物質中の、少 なくとも２つの異なる特定のポリヌクレオチド配列を検出する方法を提供するこ とである。

さらなる目的は、特定のヌクレオチド又は塩基が、特定のポリヌクレオチド配列 中の特定の位置に存在するか否かを検出する方法を提供することである。

さらに別の目的は、同−又は異なる特定のヌクレオチド又は塩基が、多数（複数 ）の異なるポリヌクレオチド配列を有する物質の、少なくとも２つの異なる特定 のポリヌクレオチド配列中の特定の位置に存在するか否かを検出する方法を提供 することである。

さらに本発明の目的は、多数（複数）の異なるポリヌクレオチド配列を有する物 質の、少なくとも２つの異なる特定のポリヌクレオチド配列の存在を検出するた めのスクリーニング法を提供することである。

別の目的は、同−又は異なる特定のヌクレオチド又は塩基が、多数（複数）の異 なるポリヌクレオチド配列を有する物質の少なくとも２つの異なる特定のポリヌ クレオチド配列中の特定の位置に存在するか否かを検出するためのスクリーニン グ法を提供することである。

及１月λ示 以下の略語及び定義は本明細書及び請求の範囲を通じて適用される： ＳＰ　−特異的プライマー：標的となる配列の部分と相補的なヌクレオチド配列 。

標的　−試料中の検出すべきヌクレオチド配列：例えば、任意のウィルス、カビ 、細菌、マイコプラズマ、線虫、原生動物等を含む任意の感染性又は寄生性生物 から得られる。

ポリメラーゼ酵素　−任意のＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ又はＲＮＡ依存ＤＮ Ａポリメラーゼ。

ｄＮＴＰ−ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、並びにｄＩＴＰ及び ｄＵＴＰである全４つのデオキシリボヌクレオチド。

ｄｄＮＴＰ−ｄ　ｄ　Ａ　Ｔ　Ｐ　、ｄ　ｄ　ＣＴ　Ｐ　。

ｄｄＧＴＰ、及びｄｄＴＴＰ、並びにｄｄＩＴＰである全４つのジデオキシリボ ヌクレオチド。

Ｄ　−ディテクター分子：ヌクレオチド又はヌクレオチド配列と共有的に結合し 得る、そして次に直接又は間接的に検定し得る分子。例えば、ビオチン；炭素、 水素、ヨウ素、燐及び硫黄のラジオアイソトープ；任意の抗原；ハブテン；フル オレセイン、ローダミン及びエオシンを含む蛍光分子；アルカリホスファターゼ 、ペルオキシダーゼ及びルシフェラーゼを含む酵素；任意のモノクローナル抗体 。

ｄＮＴＰ−Ｄ　−４つのデオキシリボヌクレオチドの１つと共有結合しているデ ィテクター分子。

Ｃ−捕獲分子：ヌクレオチド又はヌクレオチド配列と共有的に結合し得る、そし て次に特異的に親和性分子と結合する分子。例えば、ビオチン（アビジン又はス トレプトアビジンと結合する）；抗体（抗原と結合する）；抗原（抗体と結合す る）。

ＳＡＭ　−特異的親和性分子：特定の捕獲分子と特異的に結合する分子。例えば 、アビジン又はストレプトアビジン；抗体；抗原。

ＳＳ　−固体支持体：ＳＡＭが結合する任意の固体マトリックス。例えば、アガ ロース；ポリアクリルアミド；磁気ビーズ；ポリスチレン；マイクロタイタープ レート；ナイロン；ニトロセルロース。

洗浄　−未反応分子を除去するための溶液の付加及び除去。

ストリンジエンシー　−２つの核酸分子間の水素結合の安定性に作用する塩及び 温度の条件。例えば、水素結合は、高温又は低塩又はその両方を反映する高スト リンジエンシーで最も不安定である。

検定　−ディテクター分子の検出に特異的であって、定性的及び定量的に測定可 能な任意の操作。

Ｘ　−４つのデオキシリボヌクレオチドのうちの任意の１つ。

Ｙ　−４つのりボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのうちの任意の１ つ；例えば、ＹはＸと水素結合する、即ち９つのＹ′のヌクレオチド配列は９Ｘ ’のヌクレオチド配列と相補的である。

Ｚ　−その配列と相補的でない配列を形成する４つのヌクレオチドのうちの任意 の１つ。

ｄｄＴ　−ジデオキシチミジン−５゛−トリホスフェート：ｄｄＴは、標的配列 中のＡと塩基対を生じる場合の例として用いた。検出すべき塩基がＣである場合 には、ｄｄＧが用いられ、Ｇである場合にはｄｄｅが、Ｔである場合にはｄｄＡ が用いられる。

ｄｄＴ−Ｃ−ジデオキシチミジン−５°−トリホスフェート／捕獲分子複合体： ｄｄＴは、標的配列中のＡと塩基対を生じる場合の例として用いた。検出すべき 塩基がＣである場合には、ｄｄＧが用いられ、Ｇである場合にはｄｄｅが、Ｔで ある場合にはｄｄＡが用いられる。捕獲分子はｄｄＴと共有結合し、そして上記 の捕獲分子の任意の１つを示す。

直接隣接−特定のポリヌクレオチド配列の一部と結合するプライマーと、検出す べき特定のヌクレオチド又は塩基との間にヌクレオチド又は塩基がないことを意 味する。

画分　−オリゴヌクレオチドブライマーの反応に起因する混合物の少なくとも一 部、伸長試薬、特異的ポリヌクレオチド配列、検出可能要素、及び／又は分離成 分を意味する。

介在配列−特定のポリヌクレオチド配列の一部と結合するプライマーと、検出す べき特定のヌクレオチド又は塩基との間の、少な（とも１つのヌクレオチド又は 塩基を意味する。

オリゴヌクレオチドブライマー　−５〜６０ヌクレオチドの一般長を有するが、 しかし検出すべきポリヌクレオチドの一部と相補的な配列を有する２００又はそ れ以上のヌクレオチドであり得る１本鎖核酸分子。

特定のポリヌクレオチド配列　−一部又は全部公知の配列のヌクレオチド。

ハイブリダイゼーション　−２本鎖ハイブリッド核酸分子を生成するためのオリ ゴヌクレオチドブライマーと標的ポリヌクレオチド配列の相補的領域との物理的 会合。

干渉検出可能（ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ）及び／又は分 離要素は、例えば、検出すべき特定のヌクレオチド又は塩基と相補的な位置に組 み入れられるものと同一のものである。その例を以下に挙げる：（Ａ）特定のポ リヌクレオチド配列Ｓｌ中の検出すべき単一のヌクレオチド又は塩基Ｎ１を考え る。Ｓｌの一部と相補的な配列を有し、Ｓ、と結合する結合オリゴヌクレオチド ブライマーＰ１があると仮定する。

Ｐ、及びＮ１間に介在ヌクレオチドＮＡ、Ｎａ、及びＮｃを仮定する。ＮＡ、Ｎ ｍ　、Ｎｃ及びＮ１に相補的な配列、即ちそれぞれＮｏ　、ｒ’Ｊｔ　、　Ｎｒ 　、　Ｎｚ−３Ｉ（Ｓ、は分離要素に相当する）でＰ＋をＮ、を含めてそこまで 伸長する；その場合、以下の条件を要する：（Ｂ）２つの異なる特定のポリヌク レオチド配列ＳＩ及びＳ２中の検出すべき２つのヌクレオチド又は塩基Ｎ、及び Ｎ２を考える。Ｓ、及びＮ２の一部と相補的な配列を有する２つの異なるオリゴ ヌクレオチドブライマーＰ＋及びＰｉ　（それぞれＳ、及びＮ２に結合する）を 仮定する。

Ｐ、及びＮ１間の介在ヌクレオチドＮ、、Ｎ、及びＮｃ、並びにＰ２及びＮ２間 の介在ヌクレオチドＮｘ、Ｎｙ及びＮ２を仮定する。（ａ）ＮＡ、Ｎ、、Ｎｃ及 びＮ、に相補的な配列、即ちそれぞれＮｏ　、Ｉ’Ｊｔ　、Ｎｒ及びＮ１−ＤＩ 　（ＤＩは検出可能要素に相当する）でＰ＋をＮ１を含めてそこまで伸長し、（ ｂ）ＮＫ、ＮＹ　、Ｎｚ及びＮ２に相補的な配列即ちそれぞれＮ。、Ｎｐ　、Ｎ ｏ及びＮ４−Ｄｌ　（ｐａは別の検出可能要素に相当する）でＰ２をＮ２を含め てそこまで伸長する；その場合、以下の条件を要する：Ｎ１＝Ｎ＊及びり、＝Ｄ 、である場合には、Ｎｃ　）　はＮ１ではあり得ない Ｎ、がＮ２と等しくな（、ＤＩ＝Ｄ２である場合には、 Ｎｃ　）　はＮｌ又はＮ２ではあり得ないＮ１がＮ２と等しくな（、Ｄｌがり、 と等しくない場合には、 ＮＡ　） Ｎｍ　）　はＮ、ではあり得ず ＮＹ　）　はＮ２ではあり得ない。

ＮＺ　） 本発明の第一の態様によれば、以下の：ａ）物質を、特定のポリヌクレオチド配 列の一部と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドブライマー（ここで、この プライマーは、上記のポリヌクレオチド配列の上記物質中に存在する場合の一部 と結合する）にさらし； ｂ）ポリヌクレオチド配列と結合したプライマーを伸長しくここでいかなる伸長 プライマーも検出可能要素及び／又は分離要素を含有する）； Ｃ）上記の伸長プライマーに含有されない検出可能要素を有しない画分に、伸長 プライマーを分け；そして ｄ）上記の伸長プライマーの存在が上記の物質中の特定のポリヌクレオチド配列 の存在を示し、上記の画分中の上記の伸長プライマーの非存在が上記の物質中の 特定のポリヌクレオチド配列の非存在を示す、上記の伸長プライマーに関する上 記の画分の検定により、伸長プライマーが上記の画分中に存在するか否かを測定 する ことから成る、物質中の特定のポリヌクレオチド配列の検８方法が提供される。

本発明の第二の態様によれば、以下の：ａ）上記の物質を、各々が、上記の異な る特定のポリヌクレオチド配列の一部と相補的な配列を有する、少な（とも２つ の異なる特定のポリヌクレオチドブライマー（ここで、上記のプライマーは各々 、上記の物質中に存在する場合、上記の異なる特定のポリヌクレオチド配列の一 方の一部分と結合し、上記のオリゴヌクレオチドブライマーは各々、上記のオリ ゴヌクレオチドブライマーの他方に対して異なる特定のポリヌクレオチド配列の 一部分と結合する）にさらし；ｂ）各々異なる特定のポリヌクレオチド配列と結 合する上記の異なるオリゴヌクレオチドブライマーを伸長しくここで伸長プライ マーは検出可能要素及び／又は分離要素を含有する）； Ｃ）上記の伸長プライマーに含有されない検出可能要素を有しない少なくとも一 つの画分に、伸長プライマーを分け；そして ｄ）上記の伸長プライマーの存在が上記の物質中の少なくとも一つの異なる特定 のポリヌクレオチド配列の存在を示し、上記画分中の上記伸長プライマーの非存 在が上記の物質中の少なくとも一つの異なる特定のポリヌクレオチド配列の非存 在を示す、少な（とも一つの上記の伸長プライマーについての上記画分の検定に より、伸長プライマーが上記画分中に存在するか否かを測定する ことから成る、複数もしくは多数の異なるポリヌクレオチド配列を有する物質中 の、少なくとも２つの異なる特定のポリヌクレオチド配列の検出方法が提供され る。

本発明の第三の態様によれば、以下の：ａ）上記の物質を、特定のポリヌクレオ チド配列の一部と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドブライマー（ここで 、特定の位！に直接隣接する、上記の物質中の上記の特定のポリヌクレオチド配 列の一部と結合する）にさもし； ｂ）特定のポリヌクレオチド配列と結合するプライマーを伸長しく但し、上記の 特定のヌクレオチド又は塩基が特定のポリヌクレオチド配列中の特定の位置にあ る場合、結合プライマーは上記の特定のヌクレオチド又は塩基を含めてそこまで 伸長されるだけである。

この場合、伸長プライマーは、上記の特定のヌクレオチド又は塩基と相補的な位 置に検出可能要素及び／又は分離要素を有する）； Ｃ）上記の伸長プライマーに含有されない検出可能要素を有しない画分に、伸長 プライマーを分け；そして ｄ）上記の伸長プライマーの存在が、特定のヌクレオチド又は塩基が特定のポリ ヌクレオチド配列中の特定の位置にあることを示し、上記の伸長プライマーの非 存在が、特定のヌクレオチド又は塩基が特定のポリヌクレオチド配列の特定の位 置に存在しないことを示す、上記の伸長プライマーについての上記画分の検定に より、伸長プライマーが上記画分中に存在するか否かを測定する ことから成る、特定のヌクレオチド又は塩基が、物質中の特定のポリヌクレオチ ド配列の特定の位置に存在するか否かを検出する方法が提供される。

本発明の第四の態様によれば、以下の：ａ）上記の物質を少なくとも２つの異な ったオリゴヌクレオチドブライマーにさらし、該異なったオリゴヌクレオチドブ ライマーの各々は、上記の異なった特定のポリヌクレオチド配列の１つの一部と 相補的な配列を有しくここで、上記のプライマーの各々は、上記物質中に存在す る場合、その相補的ポリヌクレオチド配列と結合し、上記のオリゴヌクレオチド ブライマーの各々は、他方のプライマーとは異なる特定のポリヌクレオチド配列 の一部分に結合する。さらに上記のプライマーは各々、特定の位置に直接隣接す る上記の物質中のその相補的な特定のポリヌクレオチド配列と結合する） ｂ）その相補的ポリヌクレオチド配列と結合する上記の異なるプライマーを伸長 しく但し、上記の特定のヌクレオチド又は塩基が特定のポリヌクレオチド配列中 の特定の位置にある場合、結合プライマーは各々、特定の位置を含めてそこまで 伸長されるだけである。

この場合、上記の伸長プライマーは各々、上記の特定のヌクレオチド又は塩基と 相補的な位置に検出可能要素及び／又は分離要素を有する）； Ｃ）上記の伸長プライマーに含有されない検出可能要素を有しない少なくとも一 つの画分中の特定の位置の特定のヌクレオチド又は塩基まで伸長するだけである 伸長プライマーを分離し；そして ｄ）伸長プライマーの存在が、特定のヌクレオチド又は塩基が特定のポリヌクレ オチド配列中の特定の位置にあることを示し、画分中の上記の伸長プライマーの 非存在が、少な（とも１つの特定のヌクレオチド又は塩基が少なくとも１つの異 なる特定のポリヌクレオチド配列の特定の位置に存在しないことを示す、上記の 伸長プライマーについての上記画分の検定により、少なくとも１つの伸長プライ マーが上記の画分中に存在するか否かを測定する ことから成る、同−又は異なる特定のヌクレオチド又は塩基が、多数（複数）の 異なるポリヌクレオチド配列を有する物質中の少なくとも２つの異なる特定のポ リヌクレオチド配列の特定の位置に存在するか否かを検出する方法が提供される 。

本発明の第五の態様によれば、以下の：ａ）上記の物質を、特定のポリヌクレオ チド配列の一部と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドブライマー（ここで 、特定の位置に直接隣接しない上記の物質中の上記の特定のポリヌクレオチド配 列の一部と結合し、それによって特定の位置と、特定のポリヌクレオチド配列に 結合するプライマーとの間に介在配列が存在する）にさらし； ｂ）結合プライマーを伸長しく但し、上記の特定のヌクレオチド又は塩基が特定 のポリヌクレオチド配列中の特定の位置にある場合、結合プライマーは上記の特 定のヌクレオチド又は塩基を含めてそこまで伸長されるだけである。この場合、 伸長プライマーは、上記の特定のヌクレオチド又は塩基と相補的な位置に検出可 能要素及び／又は分離要素を有する。但し介在配列は、介在配列と相補的であっ て伸長プライマーに組み込まれるヌクレオチド又は塩基が干渉検出可能及び／又 は分離要素の組込みを引き起こす場合のものではあり得ない）； Ｃ）上記の伸長プライマーに含有されない検出可能要素を有しない画分中の特定 の位置の特定のヌクレオチド又は塩基まで伸長しただけの伸長プライマーを分離 し；そして ｄ）伸長プライマーの存在が、特定のヌクレオチド又は塩基が特定のポリヌクレ オチド配列中の特定の位置にあることを示し、画分中の上記の伸長プライマーの 非存在が、特定のヌクレオチド又は塩基が特定のポリヌクレオチド配列の特定の 位置に存在しないことを示す、上記伸長プライマーについての上記画分の検定に より、伸長プライマーが上記画分中に存在するか否かを測定する ことから成る、特定のヌクレオチド又は塩基が、物質中の特定のポリヌクレオチ ド配列の特定の位置に存在するか否かを検出する方法が提供される。

本発明の第六の態様によれば、以下の：ａ）上記の物質を、上記の異なる特定の ポリヌクレオチド配列の１つの一部と相補的な配列を有する少なくとも２つの異 なるオリゴヌクレオチドブライマー（ここで、上記のプライマーは特定の位置に 直接隣接しないその相補的ポリヌクレオチド配列と結合し、それによって特定の 位置と、特定のポリヌクレオチド配列に結合するプライマーとの間に介在配列が 存在する。上記の物質中に存在する場合、上記のオリゴヌクレオチドブライマー は各々、他方のプライマーのものに対して異なる特定のポリヌクレオチド配列の 一部と結合する）にさらし； ｂ）その相補的ポリヌクレオチド配列に結合する上記の異なるオリゴヌクレオチ ドブライマーを伸長しくここで、上記の特定のヌクレオチド又は塩基が特定のポ リヌクレオチド配列中の特定の位置にある場合、結合プライマーは各々、特定の 位置を含めてそこまで伸長されるだけである。この場合、上記の伸長プライマー は各々、上記の特定のヌクレオチド又は塩基と相補的な位置に検出可能要素及び ／又は分離要素を有する。但し介在配列は、介在配列と相補的であって伸長プラ イマーに組み込まれるヌクレオチド又は塩基が干渉検出可能及び／又は分離要素 の組込みを引き起こす場合のものではあり得ない）； Ｃ）上記の伸長プライマーに含有されない検出可能要素を有しない少なくとも１ つの両分に特定の位置の特定のヌクレオチド又は塩基まで伸長しただけの任意の 伸長プライマーを分け；そして ｄ）伸長プライマーの存在が、少なくとも１つの特定のヌクレオチド又は塩基が 特定のポリヌクレオチド配列中の特定の位置にあることを示し、画分中の上記伸 長プライマーの非存在が、少な（とも１つの特定のヌクレオチド又は塩基が特定 のポリヌクレオチド配列の特定の位置に存在しないことを示す、上記の伸長プラ イマーに関する上記画分の検定により、伸長プライマーが上記画分中に存在する か否かを測定することから成る、同−又は異なる特定のヌクレオチド又は塩基が 、多数の異なるポリヌクレオチド配列を有する物質中の少なくとも２つの異なる 特定のポリヌクレオチド配列の特定の位！に存在するか否かを検出する方法が提 供される。

本発明の第七の態様によれば、以下の：ａ）上記の特定のポリヌクレオチド配列 の一部と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドブライマー；ｂ）オリゴヌク レオチドブライマーを伸長するためのポリメラーゼ酵素； ｃ）ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ％ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄｄＡＴ Ｐ％　ｄｄＣＴＰ。

ｄｄＧＴＰ％ｄｄＩＴＰ及びｄｄＴＴＰから成る群から選択される少なくとも１ つのヌクレオチド；並びに ｄ）オリゴヌクレオチドブライマーあるいは１つ又はそれ以上のヌクレオチドと 任意に結合する、検出可能要素及び／又は分離成分 を包含する、物質中の特定のポリヌクレオチド配列を検出するためのキットが提 供される。

本発明の第への態様によれば、以下の：ａ）各々が上記の特定のポリヌクレオチ ド配列の１つの一部と相補的な配列を有する少な（とも２つの異なるオリゴヌク レオチドブライマー； ｂ）異なるオリゴヌクレオチドブライマーを伸長するためのポリメラーゼ酵素； ｃ）ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ％ｄＴＴＰ。

ｄＵＴＰ、ｄＩＴＰ％　ｄｄＡＴＰ％　ｄｄＣＴＰ。

ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ及びｄｄＴＴＰから成る群から選択される少なくとも１ つのヌクレオチド；並びに ｄ）オリゴヌクレオチドブライマーあるいは１つ又はそれ以上のヌクレオチドと 任意に結合する検出可能要素及び／又は分離成分 を包含する、多数の異なるポリヌクレオチド配列を有する物質中の少なくとも２ つの異なる特定のポリヌクレオチド配列を検出するためのキットが提供される。

本発明の第九の態様によれば、以下の：ａ）特定のポリヌクレオチド配列の一部 と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドブライマー（ここで、上記のプライ マーは特定の位置に直接隣接する上記の特定のポリヌクレオチド配列の一部と結 合する）ｂ）オリゴヌクレオチドブライマーを伸長するためのポリメラーゼ酵素 ； ｃ）ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ％　ｄＩＴＰ、ｄｄＡ ＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ及びｄｄＴＴＰから成る群から選択 される１つのヌクレオチド（但し、上記の特定のヌクレオチド又は塩基が特定の ポリヌクレオチド配列の特定の位置にある場合、上記のヌクレオチドが選択され 、それによって結合プライマーが上記の特定のヌクレオチド又は塩基を含めてそ こまで伸長されるだけである）；並びに ｄ）伸長プライマーが上記の特定のヌクレオチド又は塩基と相補的な位置に検出 可能要素及び／又は分離成分を有し、検出可能要素及び／又は分離成分がオリゴ ヌクレオチドブライマーと任意に結合する検出可能要素及び／又は分離成分 を包含する、物質中の特定のポリヌクレオチド配列中の特定の位置に特定のヌク レオチド又は塩基が存在するか否かを検出するためのキットが提供される。

本発明の第十の態様によれば、以下の：ａ）各々が上記の特定のポリヌクレオチ ド配列の１つの一部と相補的な配列を有する少な（とも２つの異なるオリゴヌク レオチドブライマー（ここで、上記のプライマーは各々、上記の物質中に存在す る場合、その相補的ポリヌクレオチド配列と結合し、上記のオリゴヌクレオチド ブライマーは各々、他方のプライマーとは異なる特定のポリヌクレオチド配列の 一部に結合する。さらに上記のプライマーは各々、特定の位置に直接隣接する上 記の物質中のその相補的な特定のポリヌクレオチド配列と結合する）； ｂ）異なるオリゴヌクレオチドブライマーを伸長するためのポリメラーゼ酵素； ｃ）ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ。

ｄＵＴＰ、ｄＩＴＰ％　ｄｄＡＴＰ％　ｄｄＣＴＰ。

ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ及びｄｄＴＴＰから成る群から選択される少なくとも１ つのヌクレオチド（但し、上記の特定のヌクレオチド又は塩基が特定のポリヌク レオチド配列の特定の位置にある場合、上記のヌクレオチドが選択され、それに よって結合プライマーが上記の特定のヌクレオチド又は塩基を含めてそこまで伸 長されるだけである）；並びに ｄ）伸長プライマーが上記の特定のヌクレオチド又は塩基と相補的な位置に検出 可能要素及び／又は分離成分を有し、検出可能要素及び／又は分離成分がオリゴ ヌクレオチドブライマーと任意に結合する少なくとも１つの検出可能要素及び／ 又は分離成分を包含する、多数の異なるポリヌクレオチド配列を有する物質中の 少な（とも２つの異なる特定のポリヌクレオチド配列の特定の位置に同−又は異 なる特定のヌクレオチド又は塩基が存在するか否かを検出するためのキットが提 供される。

本発明の第十−の態様によれば、以下の：ａ）特定のポリヌクレオチド配列の一 部と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドブライマー（ここで、特定の位置 に直接隣接しない上記の特定のポリヌクレオチド配列の一部と結合し、それによ って特定の位置と、特定のポリヌクレオチド配列に結合するプライマーとの間に 介在配列が存在する）：ｂ）オリゴヌクレオチドブライマーを伸長するためのポ リメラーゼ酵素； ｃ）ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄｄＡＴ Ｐ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ及びｄｄＴＴＰから成る群から選択さ れる１つのヌクレオチド（但し、上記の特定のヌクレオチド又は塩基が特定のポ リヌクレオチド配列の特定の位置にある場合、上記のヌクレオチドが選択され、 それによって結合プライマーが上記の特定のヌクレオチド又は塩基を含めてそこ まで伸長されるだけである。但し、介在配列は、その介在配列と相補的であって 、伸長プライマー中に組み込まれる塩基又はヌクレオチドが干渉検出可能及び／ 又は分離成分の組込みを引き起こす場合のものではあり得ない）；並びに ｄ）伸長プライマーが上記の特定のヌクレオチド又は塩基と相補的な位置に検出 可能要素及び／又は分離成分を有し、検出可能要素及び／又は分離成分がオリゴ ヌクレオチドブライマーと任意に結合する検出可能要素及び／又は分離成分 を包含する、物質中の特定のポリヌクレオチド配列中の特定の位置に特定のヌク レオチド又は塩基が存在するか否かを検出するためのキットが提供される。

本発明の第十三の態様によれば、以下の：ａ）各々が上記の特定のポリヌクレオ チド配列の１つの一部と相補的な配列を有する、少なくとも２つの異なるオリゴ ヌクレオチドブライマー（ここで、上記のプライマーは各々、上記の物質中に存 在する場合、その相補的ポリヌクレオチド配列と結合し、上記のオリゴヌクレオ チドブライマーは各々、他方のプライマーとは異なる特定のポリヌクレオチド配 列の一部に結合する。さらに上記のプライマーは各々、特定の位置に直接隣接し ない上記の物質中のその相補的な特定のポリヌクレオチド配列と結合し、それに よって特定の位置と特定のポリヌクレオチド配列と結合するプライマーとの間に 介在配列が存在する）；ｂ）異なるオリゴヌクレオチドブライマーを伸長するた めのポリメラーゼ酵素； ｃ）ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＩＴＰ％　ｄｄＡ ＴＰ、ｄｄＣＴＰ。

ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ及びｄｄＴＴＰから成る群から選択される少なくとも１ つのヌクレオチド（但し、上記の特定のヌクレオチド又は塩基が特定のポリヌク レオチド配列の特定の位置にある場合、上記のヌクレオチドが選択され、それに よって結合プライマーが上記の特定のヌクレオチド又は塩基を含めてそこまで伸 長されるだけである。但し、介在配列は、その介在配列と相補的であって、伸長 プライマー中に組み込まれる塩基又はヌクレオチドが干渉検出可能及び／又は分 離要素の組込みを引き起こす場合のものではあり得ない）；並びに ｄ）伸長プライマーが上記の特定のヌクレオチド又は塩基と相補的な位置に検出 可能要素及び／又は分離要素を有し、検出可能要素及び／又は分離要素がオリゴ ヌクレオチドブライマーと任意に結合する検出可能要素及び／又は分離要素 を包含する、多数の異なるポリヌクレオチド配列を有する物質中の少なくとも２ つの異なる特定のポリヌクレオチド配列の特定の位置に同−又は異なる特定のヌ クレオチド又は塩基が存在するか否かを検出するためのキットが提供される。

本発明の第十三の態様によれば、以下の：反応器； 上記の反応器に上記のプライマーを伸長するためにオリゴヌクレオチドプライマ ー及び試薬を付加するための手段（付加のための上記の手段は操作上、反応器と 関連する）； 伸長プライマーを少なくとも１つの画分中に分離するための、そして上記の国分 を保持するための手段（分離のための上記の手段は操作上反応器と関連する）； そして 上記の画分の任意の伸長プライマーの存在を検出するための検出器（上記の検出 器は、分離のための上記の手段と操作上関連する） を包含する、本発明の態様のいずれか−の方法を実施するための装置が提供され る。

本発明の第十四の態様によれば、以下の：ａ）上記の物質を、上記の異なる特定 のポリヌクレオチド配列の一部と相補的な配列を有する少なくとも２つの異なる 特定のポリヌクレオチドブライマーに暴露しくここで、上記の物質中に存在する 場合、上記のプライマーは各々、上記の異なる特定のポリヌクレオチド配列の一 方の一部と結合し、上記のオリゴヌクレオチドプライマーは各々、上記のオリゴ ヌクレオチドブライマーの他方に対して異なる特定のポリヌクレオチド配列の一 部と結合する）； ｂ）異なる特定のポリヌクレオチド配列と結合する上記の異なるオリゴヌクレオ チドブライマーを伸長しくここで任意の伸長プライマーは検出可能要素及び／又 は分離要素を含有する）； Ｃ）上記の伸長プライマーに含有されない検出可能要素を有しない少なくとも一 つの画分に伸長プライマーを分け；そして ｄ）上記の伸長プライマーの一つの存在が上記の物質中の異なる特定のポリヌク レオチド配列の少なくとも１つの存在を示し、上記の画分中の上記の伸長プライ マーの非存在が上記の物質中の異なる特定のポリヌクレオチド配列の全ての非存 在を示す上記の全ての伸長プライマーに関する上記の画分の検定により、伸長プ ライマーが上記画分中に存在するか否かを測定する ことから成る、多数（複数）の異なるポリヌクレオチド配列を有する物質中の少 な（とも２つの異なる特定のポリヌクレオチド配列の存在を検出するためのスク リーニング方法が提供される。

本発明の第十五の態様によれば、以下の：ａ）上記の物質を、異なる特定のポリ ヌクレオチド配列の１つの一部と相補的な配列を有する少なくとも２つの異なる オリゴヌクレオチドブライマー（ここで、上記のプライマーは各々、上記の物質 中に存在する場合、その相補的ポリヌクレオチド配列と結合し、上記のオリゴヌ クレオチドブライマーは各々、他方のプライマーとは異なる特定のポリヌクレオ チド配列の一部に結合する。さらに上記のプライマーは各々、特定の位置に直接 隣接する上記の物質中のその相補的な特定のポリヌクレオチド配列と結合する） にさらし； ｂ）その相補的ポリヌクレオチド配列と結合する上記の異なるオリゴヌクレオチ ドブライマーを伸長しく但し、上記の特定のヌクレオチド又は塩基が特定のポリ ヌクレオチド配列中の特定の位置にある場合、結合プライマーは各々、特定の位 置を含めてそこまで伸長されるだけである。この場合、上記の伸長プライマーは 各々、上記の特定のヌクレオチド又は塩基と相補的な位置に検出可能要素及び／ 又は分離要素を有する）； Ｃ）上記の伸長プライマーに含有されない検出可能要素を有しない画分中の特定 の位置の特定のヌクレオチド又は塩基まで伸長するだけである伸長プライマーを 分離し；そして ｄ）伸長プライマーの存在が、少なくとも１つの特定のヌクレオチド又は塩基が 特定のポリヌクレオチド配列中の特定の位置にあることを示し、画分中のすべて の上記の伸長プライマーの非存在が、少なくとも１つの特定のヌクレオチド又は 塩基が少なくとも１つの異なる特定のポリヌクレオチド配列の特定の位置に存在 しないことを示す、上記の伸長プライマーについての上記画分の検定により、少 なくとも１つのの伸長プライマーが上記画分中に存在するか否かを測定する ことから成る、同−又は異なる特定のヌクレオチド又は塩基が、多数（複数）の 異なるポリヌクレオチド配列を有する物質中の少なくとも２つの異なる特定のポ リヌクレオチド配列の特定の位置に存在するか否かを検出するためのスクリーニ ング方法が提供される。

本発明の第十六の態様によれば、以下の：ａ）上記の物質を、各々が上記の異な る特定のポリヌクレオチド配列の１つの一部と相補的な配列を有する少なくとも ２つの異なるオリゴヌクレオチドブライマー（ここで、上記のプライマーは特定 の位置に直接隣接しないその相補的ポリヌクレオチド配列と結合し、それによっ て特定の位置と、特定のポリヌクレオチド配列に結合するプライマーとの間に介 在配列が存在する。上記のオリゴヌクレオチドブライマーは各々、上記の物質中 に存在する場合、他方のプライマーのものに対して異なる特定のポリヌクレオチ ド配列の一部と結合する）にさらし； ｂ）その相補的ポリヌクレオチド配列に結合する上記の異なるオリゴヌクレオチ ドブライマーを伸長しくここで、上記の特定のヌクレオチド又は塩基が特定のヌ クレオチド配列中の特定の位置にある場合、結合プライマーは各々、特定の位置 を含めてそこまで伸長されるだけである。この場合、上記の伸長プライマーは各 々、上記の特定のヌクレオチド又は塩基と相補的な位置に検出可能要素及び／又 は分離要素を有する。

但し介在配列は、介在配列と相補的であって伸長プライマーに組み込まれるヌク レオチド又は塩基が干渉検出可能及び／又は分離要素の組込みを引き起こす場合 のものではあり得ない）； Ｃ）上記の伸長プライマーに含有されない検出可能要素を有しない画分中の特定 の位置の特定のヌクレオチド又は塩基まで伸長しただけの伸長プライマーを分離 し；そして ｄ）伸長プライマーの存在が、少な（とも１つの特定のヌクレオチド又は塩基が 特定のポリヌクレオチド配列中の特定の位置にあることを示し、伸長プライマー の非存在が、特定のヌクレオチド又は塩基が任意の異なる特定のポリヌクレオチ ド配列の特定の位！に存在しないことを示す、上記の全ての伸長プライマーに関 する上記の画分の検定により、任意の伸長プライマーが上記の画分中に存在する か否かを測定することから成る、同−又は異なる特定のヌクレオチド又は塩基が 、多数（複数）の異なるポリヌクレオチド配列を有する物質中の少なくとも２つ の異なる特定のポリヌクレオチド配列の特定の位置に存在するか否かを検出する ためのスクリーニング方法が提供される。

一般に、ヌクレオチド配列又はヌクレオチド配列中のヌクレオチド変化の検出方 法は、以下のニ一部又は全部公知の検出すべきヌクレオチド配列の一部に特異的 な、あるいは検出すべきヌクレオチド又は塩基変化に直接隣接する一部又は全部 公知のヌクレオチド配列の一部に特異的な、あるいは検出すべきヌクレオチド又 は塩基変化に直接隣接しないがしかし結合プライマーと検出すべきヌクレオチド 又は塩基変化との間に介在配列を有する一部又は全部公知のヌクレオチド配列の 一部に特異的な核酸プライマー；核酸ポリメラーゼ酵素により触媒されるプライ マーの伸長、（ｉ）特異的プライマーの５°末端での捕獲分子の結合、ハイブリ ダイゼーション条件下での標的となる配列の付加、及び酵素触媒された伸長プラ イマーにおけるディテクター分子の組入れ、あるいは（ｉｉ）特異的プライマー の５゛末端でのディテクター分子の結合、ハイブリダイゼーション条件下での標 的となる配列の付加、及び酵素触媒伸長プライマーにおける捕獲分子の組入れ： 固体支持体と結合する特異的親和性分子を用いる伸長プライマーの捕獲； ディテクター分子の検定 を用いる。

第一、第二、第七、及び第への態様に関しては、プライマーの伸長は、ｄＡＴＰ 、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴ Ｐ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ及びｄｄＴＴＰから成る群から選択される少な（と も１つのヌクレオチドの使用を包含すると有益である。一般に、２〜４つの異な るヌクレオチド、特に４つの異なるヌクレオチドを用いる。

一般に、第三、第五、第九、及び第十−の態様に関しては、プライマーの伸長は 、ｄＡＴＰ。

ｄＣＴＰ％　ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴ Ｐ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ及びｄｄＴＴＰから成る群から選択される少な（と も１つのヌクレオチドの使用を包含する。

一般に、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ及びｄｄＴＴＰから 成る群から選択される１つのヌクレオチドを用いる。

一般に、第四、第六、第十及び第十二の態様に関しては、プライマーの伸長は、 ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄ、ｔＪＴＰ％　ｄＩＴＰ、ｄｄＡ ＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ及びｄｄＴＴＰから成る群から選択 される少な（とも１つのヌクレオチドの使用を包含する。全般的に、ｄｄＡＴＰ 、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄ４ＴＰ及びｄｄＴＴＰから成る群から選択され る少なくとも１つのヌクレオチドを用いる。

プライマーを伸長する場合に一般に用いられるヌクレオチドに加えて、少なくと も１つの適切なポリメラーゼ酵素及び適切な緩衝剤がある。

ポリメラーゼ酵素の例は、大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ、ｃ○ｌ ｉ　ＤＮＡポリメラーゼ（フレノウ断片）、バクテリオファージエフＤＮＡポリ メラーゼ、バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメ ラーゼ、及びＡＭＶ逆転写酵素である。

水性溶液をｐＨ６〜８．５に緩衝する緩衝剤は、一般に、プライマーを伸長する ためにポリメラーゼ酵素とともに用いるのに適している。一般に、マグネシウム 塩（例えばＭ　ｇ　Ｃｌ　ｚ又はＭｇ５Ｏ，）が、緩衝剤とともに含有される。

５０〜３００ｍＭの総塩濃度が一般に許容される。

伸長反応の温度は使用するポリメラーゼ酵素によって選択され、一般に２５〜８ ０℃、さらに一般的には３０〜７０℃である。

少な（とも１つのヌクレオチドが検出可能要素を有するのが好ましい。

あるいは、又はさらに、検出可能要素はオリゴヌクレオチドブライマーに結合す る。

一般に、検出可能要素は、”　Ｈ％　”’　Ｉ、Ｉｌｌ　工、１４Ｃ％　”Ｓ、 及び”Ｐから成る群から選択される放射性標識である。

検出可能要素は非放射性であってもよ（、一般に、酵素性群、免疫性群、及び分 光器で検出可能な群から成る群から選択される。分光器で検出可能な群は、発光 群、化学発光群、ＮＭＲ検出可能群、蛍光群、又はＩＲ検出可能群である。

伸長プライマーは、伸長プライマーの一次画分中での分離を促す分離要素を含有 するのが好ましい。

一般に、特定のポリヌクレオチド配列は、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列である。

特定のポリヌクレオチド配列は、生存もしくは死滅しているウィルス、細菌、カ ビ又は原生動物であり得る感染性又は発病性生物体からであってもよい。

伸長は、以下の： 上記のプライマーを伸長するために、複数のヌクレオチドタイプをポリヌクレオ チド配列に結合する上記のプライマーに付加し、あるいは 上記のプライマーを伸長するために、単一のヌクレオチドタイプをポリヌクレオ チド配列に結合する上記のプライマーに付加しく第三、五、九及び＋−の態様） 、あるいは 上記のプライマーを伸長するために、少なくとも１つの単一のヌクレオチドタイ プをポリヌクレオチド配列に結合する上記のプライマーに付加することを包含し 得る。

本発明の特定の一方法においては、暴露及びプライマー伸長工程は分離工程の前 に生じる。

本発明の一形態においては、分離要素はオリゴヌクレオチドブライマーと結合す る。あるいは伸長プライマーは、−次画分中への混合物からの伸長プライマーの 分離を促す分離要素を含有する。この場合、少な（とも１つの上記のヌクレオチ ドが分離要素を有する。

本発明の一形態においては、分離工程は：任意の伸長プライマーを、分離要素に 対する親和性を有する分子と接触し、この分子を分離を促す支持体に結合させ、 そして接触した伸長プライマーを分離して画分を提供する。

分離要素及び分子は、以下に記載の群から選択するのが有益である： 立並１１　に・する　る （ａ）受容体が存在する　リガンドに対する受容体；リガンド （ｂ）受容体　受容体に対するリガンド；（ｃ）抗原　抗原に対する抗体； （ｄ）抗原に対する抗体　抗原； （ｅ）抗イデオタイブ　抗イデオタイブ抗体に対す抗体　る抗体； （ｆ）抗イデオタイブ　抗体に対する抗イデオタイ抗体に対する抗体　ブ抗体； （ｇ）ハブテン基　ハブテン基に対する抗体；（ｈ）ハブテン基に対す　ハブテ ン基 る抗体 （ｉ）酵素　酵素に対する結合阻害剤 及び （ｊ）酵素に対する結合　酵素 阻害剤 一般に、分離要素及び分子は、下記の群から選択さくａ）特異的受容体が存　リ ガンドに対する特異的受圧するリガンド　容体： （ｂ）特異的受容体　特異的受容体に対するリガンド； （ｃ）抗原　抗原に対する特異的抗体；（ｄ）抗原に対する特異　抗原； 的抗体 （ｅ）抗イデオタイブ抗　抗イデオタイブ抗体に特異体　的な抗体： （ｆ）抗イデオタイブ抗　抗体に特異的な抗イデオタ体に対する抗体　イブ抗体 ： （ｇ）ハブテン基　ハブテン基に対する特異的抗体； （ｈ）ハブテン基に対す　ハブテン基 る特異的抗体 （ｉ）酵素　酵素に対する強結合阻害剤及び （ｊ）酵素に対する速結　酵素 合阻害剤 有用な受容体が存在するリガンドの一般例は：ビオチンのようなビタミン、グル コース又はマンノースのような糖分子、アドレナリン又はコルチゾンのようなホ ルモン、及びプロゲステロン又はテストステロンのようなステロイドである。有 用な受容体を有する多くの種類のリガンドが存在する。前記の一覧表は例示に過 ぎない。

分離は、一般に、ラテックス、磁気ビーズ、ニトロセルロース、アガロース、セ ルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ガラス及びポリスチレンから成る群 から一般に選択される固体支持体を含む。

肚 １、巨五鳳上孟 本発明の方法の特定の利点は、本システムが、プライマー伸長後に１つのオリゴ ヌクレオチド上で分離及び検出成分を結合することである。はとんどの他のシス テムが、捕獲プローブ及びディテクタープローブの使用を必要とする。

さらなる利点は、本システムが、単数又は複数の（立体配置による）分離又は検 出要素を組み入れるためのプライマーの酵素によって促進される伸長に依ってお り、したがって、単数又は複数の成分は特異的プライマーと共有的に結合する、 ということである。

この共有結合のために、洗浄工程は、バッククラランドを低減し、特異性を増大 する非常に高いストリンジエンシーで実施し得る。

別の利点は、本発明の方法が容易に自動化される事である。

本発明の方法では、工程は簡単なキットフォーマットに組み込まれる。

さらなる利点は、問題の生物体のゲノムの不変又は可変領域と相補的な配列を有 するオリゴヌクレオチドブライマーを用い得るし、したがって高又は低特異性（ 即ち属性異的、種特異的、又は系統特異的な）に関して、単一プローブを用いて 特定のポリヌクレオチド配列中の特定のポリヌクレオチド配列又はヌクレオチド 変化の検出のための迅速且つ高感度の方法を意図し得ることである。

一般に、本発明の方法では、非包含検出可能要素を洗い流し得る固体マトリック スにより検出可能ハイブリッドを捕獲する。これは難かしい工程ではないけれど も、処理に時間を要する。この工程は、検出可能要素を選択することによって克 服し得るし、それによって任意の非包含検出可能要素は、容易に不活性化され、 物理的に除去されるというより反応混合物中に残される。

−Ｍに、１０”〜１０’ゲノムコピーのオーダーの検出感度が、そのそれぞれの 疾患状態において通常、中等度〜多数存在する広範囲のウィルス、細菌及び寄生 性生物を検出するのに非常に適している。感染体が少数でしか存在しない（例え ばＨＩＶ）疾患を検出するためには、本発明の方法は、感度を増大する有効な増 幅工程である重合鎖反応（ＰＣＲ）の技術を用い得る。

２、感゛・　患袷の１悸 本発明の方法は、生物物質、特に感染体の試料中の特定のポリヌクレオチド配列 の迅速、簡単且つ非危険的検出を可能にする。検出可能配列は、ウィルス、細菌 、原生動物又はカビのような感染性生物の一部、あるいはその異常が遺伝的疾患 、例えば踵状赤血球貧血、嚢胞性繊維症、α−地中海貧血又はβ−地中海貧血を 引き起こす遺伝子の一部であり得る。

成育不可生物は、本発明の方法を用いて検出し得る。

さらなる利点は、広範な疾患状態（例えば、肺炎；マイコプラズマ、クラミジア 、連鎖球菌、レジュネラ、Ｒ５Ｖ）を引き起こすと考えられる一部の体の検出の ためにオリゴヌクレオチドブライマーの混合物を用い得ることである。

３、−７、袷の１申 本方法は、ヌクレオチド塩基の変化（点突然変異）の迅速な検出のために、そし てポリヌクレオチド配列中の１つ又はそれ以上の挿入又は欠失の検出のために用 い得る。この場合、遺伝的変化は公知で、そしてＤＮＡ配列レベルで特徴化され ねばならない。

単−又はそれ以上の塩基変化の検出は、自動化できる。

本方法は、単一（又はそれ以上）のヌクレオチド変化に対する大規模スクリーニ ングに適応できる。これは、嚢胞性繊維症のような遺伝性疾患に対するスクリー ニング時に特に重要であるが、しかしＤＮＡプロフィリングに用いるといったよ うな遺伝子発現に必ずしも関与しない対立遺伝子の識別にも適応し得る。

この特定の方法は、固体−液体ハイブリダイゼーションを包含せず、正確な液体 ハイブリダイゼーショ。

ン条件は技術的に要求されない。他の系、例えばサザンブロットハイプリダイゼ ーションは、標的となるポリヌクレオチド配列が固体支持体と結合する（技術的 に要求される）ことを必要とし、及び／又は正確なハイブリダイゼーション条件 を要するオリゴヌクレオチドプローブの使用を必要とする。これらの系は、自動 化できず、大規模スクリーニングに容易に適応し得ない。

区１１コＩＬ欠託朋 本発明の好ましい態様を、以下の図面を参照して説明する： 図１は、特定のポリヌクレオチド配列の検出方法の模式図であり、 図２ａは、伸長プライマーのオリゴヌクレオチドプライマー部分と結合する分離 要素を用いる特定のポリヌクレオチド配列の検出方法の模式図であり、図２ｂは 、伸長プライマーの伸長部分と結合する分離要素を用いる特定のポリヌクレオチ ド配列の検出方法の模式図であり、 図３ａは、伸長プライマーのオリゴヌクレオチドプライマー部分と結合する分離 要素を用いるヌクレオチド又は塩基変化の検出方法の模式図であり、図３ｂは、 伸長プライマーの伸長部分と結合する分離要素を用いるヌクレオチド又は塩基変 化の検出方法の模式図であり、 図３０は、伸長プライマーの伸長部分と結合する検出成分を用いるヌクレオチド 又は塩基変化の検出方法の模式図であり、 図４は、本発明の第三例で生成される伸長オリゴヌクレオチドのサイズを実証す るために用いるオートラジオグラフを示し、 図５は、本発明のいずれか−の方法を実施するための装置の模式的説明である。

日の　の　のモード　びその　のモード本発明の方法の特に好ましい適用は４つ ある。即ち、（ｉ）特定のヌクレオチド配列の検出（主要適用：感染性疾患）、 （ｉｉ）ヌクレオチド又は塩基変化の検出（主要適用二遺伝性疾患及びＤＮＡフ ィンガープリンティング）、（ｉ　ｉ　ｉ）異なる捕獲分子を用いる多数の特定 のヌクレオチド配列の検出（主要適用：多発性感染症）、及び（ｉ　ｖ）異なる ポリヌクレオチド配列における多数のヌクレオチド又は塩基変化の検出（主要適 用：多発性遺伝性疾患及びＤＮＡフィンガープリンティング）である。全適用を 伴う使用には、単一装置（最小度の修正を有する）が適している。

１、のヌクレオチド　の 図１を参照すると、特定のポリヌクレオチド配列の検出方法は、先ず、標的とな るポリヌクレオチド配列と相補的なオリゴヌクレオチドブライマーの合成を包含 する。プライマーの最適長は、最大炎３０ヌクレオチドまでの、検出すべきポリ ヌクレオチド配列の大半の保存配列の長さに依っている。

特異的プライマーは、好ましくは、アシニレ−とマクドナルド（１９８４）の方 法を用いる不活性固体支持体と結合する。小型ＤＮＡ分子が結合し得る任意の不 活性支持粒子、例えばセルロース又はナイロンを用い得る。検出すべきポリヌク レオチド配列を、特異的プライマーとポリヌクレオチド配列間の迅速なハイブリ ダイゼーションを促進する溶液の存在下で、支持体−特異的プライマー抱合体に 付加する。ある適切な溶液は、０．１５Ｍ　塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエ ン酸ナトリウム、及び４％ポリエチレングリコール６０００を含有する。次に支 持体を洗浄する。

洗浄緩衝液の選択は、ストリンジエンシー条件を確定する。標準緩衝液は、１４ ０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、及び２０ｍＭ燐酸ナトリ ウム、ｐＨ７，０である。

４つのデオキシリボヌクレオチド（そのうちの１つを放射能、ビオチン又は蛍光 標識する）の存在下で、ＤＮＡポリメラーゼＩ（フレノウ断片）又は逆転写酵素 を用いて、特異的プライマーを伸長する。伸長の長さは、全化学物質が非限定濃 度である場合は、伸長反応の時間及び温度に依る。

一般に、反応は３７℃で３０分実施し、標識は０Ｐである。標識化ヌクレオチド の伸長プライマーへの組み込みレベルは、標識が０Ｐである場合、液体シンチレ ーシミンにより測定する。

あるいは、標識は蛍光標識であってもよい。

プライマー伸長後、混合物を洗浄し、標識の存在に関して検定する。

最終洗浄後の標識の存在は、プライマーが伸長され、したがって存在が検定され る核酸が存在することを示す。特異的プライマーは、鋳型として相補的な核酸を 用いて伸長し得るだけである。

要するに、本方法は、以下の工程を包含する：公知の又は一部公知の核酸配列、 即ち標的の部分と相補的な特異的プライマーの合成。

捕獲（立体配置Ａ−図２ａ）又はディテクター（立体配置Ｂ−図２ｂ）分子の特 異的プライマーの５°末端への結合。

溶液中での、この特異的プライマーの標的核酸配列とのハイブリダイゼーション 。

特異的プライマーの酵素性伸長に適した条件下での４つのデオキシリボヌクレオ チド、及びＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（標的がＤＮＡである場合）又はＲＮ Ａ依存ＤＮＡポリメラーゼ（標的がＲＮＡである場合）の溶液の付加。１つ又は それ以上のデオキシリボヌクレオチドは、ディテクター分子（立体配置Ａ）又は 捕獲分子（立体配置゛Ｂ）をそれに共有結合した、 ポリメラーゼ酵素は、鋳型として標的となる核酸を用いてプライマーを伸長し、 同時にディテクター又は捕獲分子を伸長プライマー中に組み込む。

その反応液を加熱変性し、そのサイクルを繰り返して伸長特異的プライマーの量 を増幅する。

立体配置Ａに関しては、特異的親和性分子（固体支持体に結合）を、捕獲分子と 特異的親和性分子との結合を実施し得る条件下で溶液に付加する。

立体配置Ｂに関しては、伸長特異的プライマーをエタノールで沈殿し、洗浄して 未包含デオキシリボヌクレオチド捕獲分子複合体を除去する。洗浄後、伸長特異 的プライマーを、捕獲分子と特異的親和性分子とを結合するための溶液中に再懸 濁する。次に、特異的親和性分子（固体支持体に結合）を付加し、伸長特異的プ ライマーが捕獲分子を介して特異的親和性分子一固体支持体複合体に結合したら 直に、高ストリンジエンシー条件下でその混合液を洗浄し、洗浄工程終了時に、 ディテクター分子を検出するのに適した手法を用いてその混合液を検定する。

２、ヌクレオチド　ば声　・　の 本方法は以下の工程を包含する： 公知の又は一部公知の核酸配列、即ち標的の部分と相補的な特異的プライマーの 合成。特異的プライマー配列は、検出すべき単一ヌクレオチド又は塩基に直接隣 接するがしかしそれを含まないか、あるいは検出すべきヌクレオチド又は塩基に 直接隣接しないがしかし結合プライマー及び検出すべきヌクレオチド又は塩基間 に介在配列を有する標的配列と相補的である。

捕獲（立体配置Ａ−図３ａ）又はディテクター（立体配置Ｂ−図３ｂ）分子と特 異的プライマーの５′末端との結合。立体配置Ｃ（図３ｃ）に関しては、捕獲又 はディテクター分子はいずれも５°末端で特異的プライマーに結合しない。

溶液中での、この特異的プライマーの標的核酸配列とのハイブリダイゼーション 。

ジデオキシリボヌクレオチド（又はデオキシリボヌクレオチド）の１つの種類の み、即ち標的配列中の検出すべき塩基又はヌクレオチドと対合又は水素結合する もの、及び特異的プライマーの酵素性伸長に適した条件下でのＤＮＡ依存ＤＮＡ ポリメラーゼ（標的がＤＮＡである場合）又はＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（ 標的がＲＮＡである場合）の溶液への付加。

ジデオキシリボヌクレオチド（又はデオキシリボヌクレオチド）は、ディテクタ ー分子（立体配置Ａ及びＣ）又は捕獲分子（立体配置Ｂ）をそれに共有結合した 。

ポリメラーゼ酵素は、鋳型として標的核酸を用いてプライマーを伸長し、塩基対 が可能な場合には、ジデオキシリボヌクレオチド（又はデオキシリボヌクレオチ ド）の１分子のみを付加する。ジデオキシリボヌクレオチド（又はデオキシリボ ヌクレオチド）及び標的配列間の塩基対が考えられない場合は、特異的プライマ ーは伸長されない。ディテクター（立体配置Ａ及びＣ）又は捕獲（立体配置Ｂ） 分子。

その反応液を加熱変性し、そのサイクルを繰り返して伸長特異的プライマーの量 を増幅する。

立体配置Ａに関しては、特異的親和性分子（固体支持体に結合）を、捕獲分子と 特異的親和性分子との結合を実施し得る条件下で溶液に付加する。

立体配置Ｂに関しては、伸長特異的プライマーをエタノールで沈殿し、洗浄して 未包含ジデオキシリボヌクレオチド−捕獲分子複合体（又はデオキシリボヌクレ オチド−捕獲分子複合体）を除去する。洗浄後、伸長特異的プライマーを、捕獲 分子と特異的親和性分子とを結合するための溶液中に再懸濁する。次に、特異的 親和性分子（固体支持体に結合）を付加する。

立体配置Ａ及びＢに関しては、伸長特異的プライマーが捕獲分子を介して特異的 親和性分子一固体支持体複合体に結合したら直に、高ストリンジエンシー条件下 でその混合液を洗浄する。

立体配置Ａ及びＢに関しては、洗浄工程終了時に、ディテクター分子を検出する のに適した手法を用いてその混合液を検定する。

立体配置Ｃに関しては、反応混合液を好適な組成物のアガロース又はポリアクリ ルアミドゲルのレーン上に置き、電気泳動処理して、伸長特異的プライマー−デ ィテクター分子複合体を分解し、ディテクター分子の検出に適した手法を用いて 最終的に検定する。標識化サイズ基準は、一般に別のレーンのゲル中に含まれる 。

３、　なる　を　いる　ヌクレオ チド　タ１、■ち　感゛　、の 本方法は、以下の工程を包含する： 異なる公知の核酸配列、即ち標的と相補的な多数の異なる特異的プライマーの合 成。

異なる捕獲分子と、異なる特異的プライマーの５′末端との結合。

溶液中での、これらの異なる特異的プライマー（異なる捕獲分子との結合を伴う ）の、異なる特異的プライマーが相補的である異なる標的核酸配列とのハイブリ ダイゼーション。

これらの得意的プライマーが、相補的な標的となる核酸配列である場合、特異的 プライマーの酵素性伸長に適した条件下での４つのデオキシリボヌクレオチド、 及びＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（標的がすべてのＤＮＡである場合）又はＲ ＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（標的がすべてのＲＮＡである場合）の、又は両方 のポリメラーゼ（標的がＤＮＡとＲＮＡの混合物である場合）の溶液の付加。１ つ又はそれ以上のデオキシリボヌクレオチドは、ディテクター分子をそれに共有 結合した、 ポリメラーゼ酵素は、鋳型として異なる標的となる核酸配列を用いて異なる特異 的プライマーを伸長し、同時にディテクター分子を伸長プライマー中に組み込む 。

その反応物を加熱変性し、そのサイクルを繰り返して異なる伸長特異的プライマ ーの量を増幅する。

異なる特異的親和性分子（異なるそれぞれの捕獲分子に対する特異的親和性を有 し、”試験ストリップ”のような固体支持体に結合する）を、異なる捕獲分子と それらの異なる特異的親和性分子との結合を実施させる条件下で溶液中に付加す る。

一旦、異なる伸長特異的プライマーが異なる捕獲分子を介してそれらの特異的親 和性分子一固体支持体複合体と結合すれば、各々の異なる複合体を適切な試験ス トリップで個別に除去し、次いでこれを高ストリンジエンシー条件下で広範に洗 浄する。

洗浄工程終了時に、特定のディテクター分子に適した手法を用いて、ディテクタ ー分子の存在に関して試験ストリップの１つを検定する。検定が、ディテクター 分子が試験ストリップ上に存在することを示す場合には、これはその特定の検出 可能分子を有するプライマーにより標的される特異的ヌクレオチド配列が試験試 料中に存在することを示す。検定がディテクター分子が試験ストリップ上に存在 しないことを示す場合には、これはその特定の検出可能分子を有するプライマー により標的される特異的ヌクレオチド配列が試験試料中に存在しないことを示す 。

各試験ストリップに関して、最終工程の操作を繰りオチド　は　・　、　゛　は ゛ 、　は′　フ　ンガーブリンテ　ングの本方法は、以下の工程を包含する： 異なる公知の核酸配列、即ち標的と相補的な多数の異なる特異的プライマーの合 成。異なる特異的プライマーは、検出すべき単一塩基に直接隣接するそれらのそ れぞれの異なる標的配列と相補的である異なる捕獲分子と異なる特異的プライマ ーの５°末端との結合。

溶液中での、これらの異なる特異的プライマーの、それらの異なるそれぞれの標 的核酸配列とのハイブリダイゼーション。

異なる特異的プライマーの酵素性伸長に適した条件下での４つの種類全てのジデ オキシリボヌクレオチド（例えば、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ％ｄｄＧＴＰ、及び ｄｄＴＴＰ）　、及びＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（標的がＤＮＡである場合 ）又はＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（標的がＲＮＡである場合）、あるいは両 方（標的がＤＮＡ及びＲＮＡの混合物である場合）の溶液の付加。各ジデオキシ リボヌクレオチドは、異なるディテクター分子をそれに共有結合した、ポリメラ ーゼ酵素は、鋳型として異なる標的核酸配列を用いて異なる特異的プライマーを 伸長し、１つのジデオキシリボヌクレオチドの１分子のみを付加する。

その反応物を加熱変性し、そのサイクルを繰り返して異なる伸長特異的プライマ ーの量を増幅する。

特異的親和性分子（異なるそれぞれの捕獲分子に対する特異的親和性を有し、” 試験ストリップ”のような固体支持体に結合する）を、異なる捕獲分子とそれら の異なる特異的親和性分子との結合を実施させる条件下で溶液中に付加する。

一旦、異なる伸長特異的プライマーが異なる捕獲分子を介してそれらの特異的親 和性分子一固体支持体複合体と結合すれば、各々の異なる複合体を適切な試験ス トリップで個別に除去し、次いでこれを高ストリンジエンシー条件下で広範に洗 浄する。

洗浄工程終了時に、特定のディテクター分子に適した手法を用いて、ディテクタ ー分子の存在に関して試験ストリップの１つを検定する。検定が、ディテクター 分子が試験ストリップ上に存在することを示す場合には、これはその特定の検出 可能分子を有するプライマーにより標的される特異的ヌクレオチド配列が試験試 料中に存在することを示す、検定がディテクター分子が試験ストリップ上に存在 しないことを示す場合には、これはその特定の検出可能分子を有するプライマー により標的される特異的ヌクレオチド配列が試験試料中に存在しないことを示す 。

各試験ストリップに関して、最終工程の操作を繰り図５を参照すると、装置１０ ０は、一般に、非自動又は自動操作により本発明の方法を実施するのに適してい る。伸長及び分離操作は、支持容器１１内に配置される着脱可能な反応器１０内 で行う。容器１１は温度制御ジャケット１２によって制御される温度である。反 応器１０の内容物を、振盪器１３を用いて容器１１を振盪することによって混合 する。反応器１０の底面は、膜支持体１５に支持される特異的多孔性膜１４を有 する。反応器１０は、着脱可能反応器２１に対する支持により容器１１中に支持 される。

試料物質、プライマー、及び伸長試薬を、それぞれの容器１６．１７、及び１８ から反応器１０に供給する。一定温度で静かに混合しながら、適切な期間、プラ イマーアニーリング及び伸長が起こる。この反応は、プライマーが特異的ポリヌ クレオチド配列の一部と相補的な配列を有する特異的ポリヌクレオチド配列を試 料が有する場合、検出可能な成分及び分離成分を有する伸長プライマーを生成す る。

次いで、分離成分に対する不活性支持体と結合する特異的親和性分子（ＳＡＭ　 （Ｓ））をＳＡＭ供給容器１９から反応器１０に付加し、適切な期間、伸長プラ イマーと反応させる。次に、未反応試薬、緩衝液、及び未伸長プライマーを、真 空ポンプ２４を有し、支持容器１１の底面に結合する真空ライン２５を介して廃 棄容器２５に除去する一方、ＳＡＭ　（Ｓ）と結合している伸長プライマーは、 膜１４により反応器１０内に保持される。保持プライマー−５ＡＭ複合体を、容 器２２から供給される洗浄試薬で洗浄してバックグラウンドを除去し、それによ って反応器１０内に一次画分を生成する。次に、−次画分をディテクター２３で 、検出可能要素の存在に関して調べる。一般に、検出可能要素は”Ｐのような放 射性成分であって、ディテクター２３はシンチレーション計数器である。

ディテクター分子が存在することを検定が示す場合には、これは特異的ヌクレオ チド配列が試験試料中に存在することを示す。ディテクター分子が存在しないこ とを検定が示す場合には、これは特異的ヌクレオチド配列が試験試料中に存在し ないことを示す。

夫施ヨ 見立■ユ 特定のポリヌクレオチド配列の検出についてのこの実施例では、バクテリオファ ージＭ１３の１本鎖ゲノムＤＮＡの検出のために、図１に示した方法を用いた。

１、Ａ　プライマーのＡ Ｍ２Ｓ　５ｓＤＮＡと相補的な１７−ｍａｒＤＮＡを、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ ｓｙｓｔｅｍｓＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒで合成した。

１７−ｍａｒは、以下のヌクレオチド配列を有した３°−ＴＧＡＣＣＧＧＣＡＧ ＣＡＡＡＡＴＧ−５゜このプライマーはＭ２Ｓ　１本鎖ＤＮＡと相補的であるだ けでなく、細菌２本鎖ＤＮＡプラスミドｐＵｃ１２とも相補的であった。

２、プライマーのセルロースとの″Ａ プライマーをＡＢＭ−セルロースに結合するために、アシュレーとマクドナルド （１９８４）の方法を用いた。ＡＢＭ−セルロース上のアミノベンジルオキシメ チル（ＡＢＭ）基をジアゾ化してジアゾベンジルオキシメチル−セルロース（Ｄ ＢＭ−セルロース）を生成した。特異的プライマーをＤＢＭ−セルロースと結合 した。約４０μｇの特異的プライマーを２０ｍｇのセルロースと結合した。

３、　による　プライマー−セルロースＳＰ−セルロース　のハイブリダイゼー ションｓｐ−セルロースを標的核酸　Ｍ２Ｓ　５ｓＤＮＡ又はｐＵｃ１２、及び 水を含有する溶液に懸濁した。

これを混合し、５分間煮沸して、氷上で冷やした。次に、１４０ｍＭ　塩化ナト リウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、及び２０ｍＭ燐酸ナトリウム、ｐＨ７， ０を含有する洗浄緩衝液を用いて遠心分離で、その混合物を洗浄して、ＳＰ−セ ルロースとハイブリダイズしなかった核酸を除去した。

４、工１エヱニ旦１ ＤＮＡポリメラーゼエ（フレノウ断片）を標識化及び非標識化ヌクレオチドとと もに用いて、特異的プライマーを伸長した。

反応条件を以下に示す： ２０：１　応゛Ａ ３０ｍＭ　ｔ−リス−ＨＣｌ、ｐＨ８，３８ｍＭ　塩化マグネシウム ４ｍＭ　ジチオトレイトール ４ｍＭ　ピロ燐酸ナトリウム １ｍＭ　各々ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ。

７単位　ＤＮＡポリメラーゼエ、フレノウ断片 ポリエチレングリコール６０００を付加して最終濃度を４％にすると、放射能の 取り込みが３倍まで増大することが判明した。

反応混合液を２０℃で２時間インキュベートした。

インキュベーション終了時に、遠心分離によって４回ＳＰ−セルロースを洗浄す ることにより、非包含ヌクレオチドを除去した。洗浄緩衝液は１４０ｍＭ塩化ナ トリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、及び２０ｍＭ燐酸ナトリウム、ｐＨ７ ，０であった。試料を室温で１分間掻き回し、次いで１２，０００ｇで５分間遠 心分離した。これを４回繰り返した。

最後に、ＳＰ−セルロースを、シンチレーション溶液を含有するバイアルに付加 して、液体シンチレーション計数器を用いて取り込みを測定した。

罠急五１ 本発明の第二の態様による、特定のポリヌクレオチド配列の検出についてのこの 実施例では、以下のオリゴヌクレオチドブライマーを用いて、バクテリオファー ジＭ１３　ｍｐ１８からの１本鎖ゲノムＤＮＡを検出した： Ｍ２Ｓ　５ｓＤＮＡ ３°、、、ＴＴＴＧＣＴＧＣＣＧＧＴＣＡＣＧＧＴＴＣＧＡＡ、、、５゜ ５°ＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＣＣ特異的プライマー 本実施例に用いた立体配置を図２ｂに示す；本実施例におけるディテクター分子 は３２ｐであって、特異的プライマーの５°末端と結合する；捕獲分子はビオチ ンであって、ビオチン−１６−ｄＵＴＰ（ｄＴＴＰの類似化合物）として伸長プ ライマー中に取り込まれる；特異的親和性分子はストレプトアビジンであり、固 体支持体はアガロースである。

オリゴヌクレオチド合成器を用いて特異的プライマーを合成し、以下のように、 ポリヌクレオチドキナーゼを用いて”ｐで５°末端標識化した：反応混合物： 特異的プライマー（５０ｐモル５°ＯＨ末端）１μｍ １００ｍＭ　ジチオトレイトール　５μｍ１０ｘＴＭ　緩衝液　５μｍ （６００ｍＭ）リス、ｐＨ７，６；９０ｍＭＭｇＣ１ｇ　） γ−”Ｐ−ｄＡＴＰ　（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）　１５μＩ Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ　２μｍｄｄＨ，０２２ｐ１ 反応混合液を３７℃で２０分、インキユベートした。標識化プライマーを、ＤＥ ＡＥセルロースカラムを用いて非包含ｓｉｐから分離した。

Ｍ２Ｓ　ｍｐ１８又はラムダバクテリオファージ（非相同対照として）で、以下 の反応混合物を用いて、プライマー伸長反応を実施した。

Ｍ２Ｓ　ラムダ 鋳型Ｄ　Ｎ　Ａ　２．５ｕｌ　１Ｏｕｌｌａｐ標識化特異的プライマー　１０ｕ ｌ　１ｏｕｌＤＮＡポリメラーゼ　ｌｕｌ　Ｊｕｌ （フレノウ；１単位／ｕ１） ビオチン−１６−ｄＵＴＰ　（１ｍＭ）　ｌｕｌ　１ｕｌｄＣＴＰ　（Ｉｎ＋Ｍ ）　ｌｕｌ　１ｕｌｄＧＴＰ　（１ｍＭ）　ｌｕｌ　１ｕｌｄＡＴＰ　（１ｍＭ ）　ｌｕｌ　１ｕｌＮａＣ１（５Ｍ）　ｌｕｌ　ｌｕ１ ＭｇＳ０４（Ｉ　Ｍ）　０．５ｕｌ　Ｏ，５ｕｌジチオトレイトール（４ｍＭ） 　１．２５ｕｌ　１．２５ｕｌウシ血清アルブミン（１ｍｇ／ｍｌ）　２．５ｕ ｌ　２．５ｕｌトリスＨＣＩ、　ｐＨ７，０（Ｉ　Ｍ）　２．５ｕｌ　２．５ｕ ｌｄｄＨｘ０　２４．７５ｕｌ　２５／２５ｕ１反応混合物を３７℃で６０分イ ンキュベートした。

インキュベーション完了時に、伸長プライマーをエタノールで沈殿させて、非包 含ビオチン−１６−ｄＵＴＰを除去した。反応混合物に１容積（５０μｌ）の５ Ｍ　酢酸アンモニウム及び２５０μｌのエタノールを加え、その後短時間混合し て、−２０℃で１時間インキュベートした。遠心分離で沈殿物を集め、短時間乾 燥して、５ｏｕｌのｄｄＨ，Ｏに再懸濁し、予め結合緩衝液（１０ｍＭトリス塩 酸、ｐＨ７，５；２００ｍＭ　ＮａＣ１；１ｍＭ　ＥＤＴＡ）で平衡させた２０ ０μｌストレプトアビジン／アガロースカラム（０，１２ｍｇストレプトアビジ ン含有）に用いた。カラムを各５００μｍの結合緩衝液で５回洗浄した。ストレ プトアビジン／アガロースを１ｍｌ結合緩衝液に懸濁して、これに６ｍｌのシン チレーション液を付加し、混合液を液体シンチレーシミンカウンターで計数した 。

Ｍ２Ｓ及びラムダ系に関する結果を以下に示す二！！！　立２皿 Ｍ２Ｓ　２９．０５５ ラムダ　１，０４３ 結果は、相同性鋳型、Ｍ２Ｓの存在下でのみプライマーは特異的に伸長されるが 、しかし非相同鋳型、ラムダの存在下では伸長されないことが実証された。

さらに、ビオチンは伸長プライマー中に取り込まれた。

夫五■ユ ヌクレオチド塩基変化の検出に関する本発明の使用についてのこの実施例では、 図３ｃに示す立体配置を用いた。検出されたＭ１３配列及び用いたオリゴヌクレ オチドブライマーを以下に示す： ＭＩＳ　５ｓＤＮＡ ３°　、、、ＴＴＴＧＣＴＧＣＣＧＧＴＣＡＣＧＧＴＴＣＧＡＡ、、、５゜ ５°　ＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＣＣ特異的プライマー オリゴヌクレオチド合成器を用いて特異的プライマーを合成した。

反応混合物は、以下のように設定した：５００ｎｇＭ１３ｍｐ１８ｓｓＤＮＡ　 ２．５μｍ０．８ｐモル特異的プライマー　２，０μｍ１０ｘ反応緩衝液　１． ５μｍ ｄｄＨ２０１，０μｍ この反応混合液を、５５℃で１０分間インキュベートし、その時点で以下を付加 した： ”Ｐ　ｄＡＴＰ　（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ。

１０ｍＣ１／ｍｌ）　０．５ｕ１ ３２Ｐ　ｄｄＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ。

１０ｍＣ１／ｍｌ）　１．５ｕｌ ＤＮＡポリメラーゼ（フレノウ） （１単位／μｍ）　１．０μｍ この反応混合液を２５℃でさらに１５分インキュベートした。４μｍのホルムア ミド色素（９５％ホルムアミド、０．１％キシレンシアツール、０．１％ブロモ フェノールブルー）を付加して、反応を停止した。反応混合液を１００℃で３分 加熱して、その後２０％ポリアクリルアミドゲル上に置き、３０ミリアンペアで ３０分間電気泳動処理した。次にゲルを１０％酢酸中に固定し、ｄｄＨＩ　Ｏで 洗浄して、−８０℃で１２時間、Ｘ線フィルムに露出した。

その結果生じたオートラジオグラフ（図４）は、１８ヌクレオチド長のバンドを １つだけ示した。したがって、プライマーは、標識化アデニン残基の取り込みに よる１ヌクレオチドのみによって伸長され、したがって核酸配列中の特異的単一 ヌクレオチドを検出した。

！呈１ 特定のポリヌクレオチド配列の検出についての本実施例では、バクテリオファー ジＭ１３の１本鎖ゲノムＤＮＡの検出のために、図２ａの方法を用いた。

１、Ａ　プライマーのＡ ＭＩＳ　５ｓＤＮＡと相補的な２５−ｍａｒＤＮＡを、Ｃ１ｏｎｔｅａ　（ＵＳ Ａ）で合成した。

２５−ｍａｒは、以下のヌクレオチド配列を有した５°　−Ｘ　ＡＣＧ　ＴＴＧ 　ＴＡＡ　ＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ　ＴＧＣＣ−３゜ （ここで、Ｘは修飾ヌクレオチドと共有結合するビオプライマーを、ＭＩＳ　Ｄ ＮＡ（標識）又はニシン精子ＤＮＡ　（対照）を含有する緩衝液と混合し、ＤＮ Ａポリメラーゼエ（フレノウ断片）を用いて伸長した。

反応条件を以下に示す： ５０ｍＭトリス　ｐＨ７，５ １０ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃ１＊ ４ｍＭ　ＤＴＴ １００ｍＭ　ＮａＣｌ ３０１、Ｌｇ／ｍｌ　ウシ血清アルブミン各々０．０２ｍＭ　のｄＡＴＰ％　ｄ ＧＴＰ。

ＴＴＰ ＩＣｉ　”ｐ　ｄＣＴＰ ７４２゜５ｎｇ１５０μｌ　ＭＩＳ又はニシン精子ＮＡ ２５．８ｎｇ１５０μｍ　ビオチン−プライマー０、５　単位ＤＮＡポリメラー ゼＩ、クレノウ断片反応混合液を３７℃で６０分インキュベートし、沈殿させて 終了させ、洗浄した。

沈殿は、５Ｍ　酢酸アンモニウム、担体としてコウシ胸腺ＤＮＡ、及びエタノー ルを付加して実施した。

遠心分離で集めたベレットを洗浄液が５００ｃｐｍ未満を含有するまで、７０％ エタノールで洗浄した。

次に、洗浄ベレットを、２００ｍＭ　Ｎ　ａ　Ｃ１，１０ｍＭ）リス　ｐＨ７， ５，１ｍＭ　ＥＤＴＡから成る結合緩衝液中に溶解し、ストレプトアビジン−ア ガロースのカラムに入れた。カラムを数容積の緩衝液で洗浄し、ストレプトアビ ジン−アガロース（ＳＡ）に結合した数を測定して、以下の結果を得た：標的　 ＳＡに結合したｃｐｍ Ｍ１３　１１，９３９ ニシン精子　８３ 結果は、標的Ｍ１３　ＤＮＡの存在下で伸長されたプライマーのみがカラムに結 合される有意の放射能を生じることを立証する。

ｔｏ腹ユ 本発明の方法は、以下の適用において、容易に用い得る： ａ）ヒト、動物、及び植物の感染性疾患の、簡単、迅速、高感度、且つ自動可能 検出； ｂ）核酸配列における塩基変化、特に遺伝子欠損及びＤＮＡフィンガープリンテ ィングの特異的、迅速且つ大規模な検出； Ｃ）上記の適用による使用のためのキット；　及びｄ）上記の適用による使用の ための自動化装置。

＝＝−ＹＹＹＹＡＺＺＺＺ、ｌ−一　標的−＝ｙｙｙｙＡｚｚｚｚｚ−−−−　 標的り。

十トＸＸＸＸ　特異的プライマー −−−一−ｙｙｙｙＡｚｚｚｚｚ−−−＋＋−標的国際調査報告 Ｎ韻ス頭フ但ＤαローにｎαＱＬＳＩ込顧】」ηＰ）σｌ摺団ジＲ頃胚野毘万五 １１ｇシ双組ｌｒ棹（ロリＣＦに１豪Ｘ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ある物質中の特定のポリヌクレオチド配列を検出する方法であって、 ａ）該物質を、該特定のポリヌクレオチド配列の一部と相補的な配列を有するオ リゴヌクレオチドプライマー（ここで、このプライマーは、上記物質中に存在す る場合、上記ポリヌクレオチド配列の一部と結合する）にさらし； ｂ）このポリヌクレオチド配列と結合したプライマーを伸長し（ここでいかなる 伸長プライマーも、検出可能要素及び／又は分離要素を含有する）；ｃ）伸長プ ライマーを、この伸長プライマーに含有されない検出可能要素を有しない画分に 分け；そして ｄ）上記伸長プライマーの存在が上記物質中の特定のポリヌクレオチド配列の存 在を示し、上記画分中の上記伸長プライマーの非存在が上記物質中の特定のポリ ヌクレオチド配列の非存在を示す、上記伸長プライマーについての上記画分の試 験により、伸長プライマーが上記画分中に存在するか否かを測定することを特徴 とする方法。 ２．ある物質中の特定のポリヌクレオチド配列を検出する方法であって、 ａ）該物質を、該特定のポリヌクレオチド配列の一部と相補的な配列を有するオ リゴヌクレオチドプライマー（ここで、このプライマーは、上記物質中に存在す る場合、上記ポリヌクレオチド配列の一部と結合する）にさらし； ｂ）このポリヌクレオチド配列と結合したプライマーを伸長し（ここで、いかな る伸長プライマーも、検出可能要素及び／又は分離成分を含有する）；ｃ）上記 伸長プライマー中に含まれない検出可能要素を、伸長プライマーから分離し（こ こで、いかなる伸長プライマーも面分に分離される）；そしてｄ）上記検出可能 要素の存在が上記物質中の特定のポリヌクレオチド配列の存在を示し、上記画分 中の上記検出可能要素の非存在が上記物質中の特定のポリヌクレオチド配列の非 存在を示す、上記検出可能要素についての上記画分の試験により、伸長プライマ ーが上記画分中に存在するか否かを測定する ことを特徴とする方法。 ３．複数の異なったポリヌクレオチド配列を有する物質中の少なくとも２つの異 なった特定のポリヌクレオチド配列を検出する方法であって、 ａ）該物質を、少なくとも２つの異なった特定のポリヌクレオチドプライマーに さらし、ここで、該異なったオリゴヌクレオチドプライマーの各々は、上記異な った特定のポリヌクレオチド配列の１つの一部分と相補的な配列を有し、（ここ で、上記プライマーの各々は、上記物質中に存在する場合、上記の異なった特定 のポリヌクレオチド配列の一方の一部分と結合し、上記オリゴヌクレオチドプラ イマーの各々は、上記のオリゴヌクレオチドプライマーの他方に対する異なった 特定のポリヌクレオチド配列の一部分と結合する）； ｂ）それらの異なったポリヌクレオチド配列と結合した上記の異なったオリゴヌ クレオチドプライマーを伸長し（ここで、いかなる伸長プライマーも検出可能要 素又は分離要素を含有する）； ｃ）伸長プライマーを、上記伸長プライマーに含有されない検出可能要素を有し ない少なくとも一つの画分に分離し；そして ｄ）上記伸長プライマーの存在が上記物質中の少なくとも１つの異なった特定の ポリヌクレオチド配列の存在を示し、上記画分中の上記伸長プライマーの非存在 が上記物質中の少なくとも１つの異なった特定のポリヌクレオチド配列の非存在 を示す、少なくとも一つの上記伸長プライマーについての上記画分の試験により 、伸長プライマーが上記画分中に存在するか否かを測定する ことを特徴とする方法。 ４．複数の異なったポリヌクレオチド配列を有する物質中の少なくとも２つの異 なった特定のポリヌクレオチド配列を検出する方法であって、 ａ）該物質を、少なくとも２つの異なったオリゴヌクレオチドプライマーにさら し、ここで、該異なったオリゴヌクレオチドプライマーの各々は、上記の異なっ た特定のポリヌクレオチド配列の１つの一部分と相補的な配列を有し、（ここで 、上記プライマーの各々は、上記物質中に存在する場合、その相補的ポリヌクレ オチド配列と結合し、上記オリゴヌクレオチドプライマーの各々は、他方のオリ ゴヌクレオチドプライマーとは異なった特定のポリヌクレオチド配列の一部分に 結合する）； ｂ）それらの相補的ポリヌクレオチド配列と結合した上記異なったオリゴヌクレ オチドプライマーを伸長し（ここで、いかなる伸長プライマーも検出可能要素及 び分離要素を含有する）； ｃ）伸長プライマーから、上記伸長プライマーに含有されない検出可能要素を分 離し、（ここで、いかなる伸長プライマーも少なくとも１つの画分に分けられる ）；そして ｄ）検出可能要素の存在が、上記物質中の少なくとも１つの異なった特定のポリ ヌクレオチド配列の存在を示し、画分中の上記検出可能要素の非存在が、上記物 質中の少なくとも１つの異なった特定のポリヌクレオチド配列の非存在を示す、 上記検出可能要素についての上記画分の試験により、伸長プライマーが上記画分 中に存在するか否かを測定する ことを特徴とする方法。 ５．ある特定のヌクレオチド又は塩基が、ある物質のある特定のポリヌクレオチ ド配列の特定の位置に存在するか否かを検出する方法であって、ａ）上記物質を 、上記特定のポリヌクレオチド配列の一部分と相補的な配列を有するオリゴヌク レオチドプライマー（ここで、このプライマーは、この特定の位置に直接隣接す る上記物質中の上記特定のポリヌクレオチド配列の一部分と結合する）にさらし ；ｂ）この特定のポリヌクレオチド配列と結合したプライマーを伸長し（但し、 上記特定のヌクレオチド又は塩基が、この特定のポリヌクレオチド配列中のこの 特定の位置にある場合、結合プライマーは上記特定のヌクレオチド又は塩基を含 めてそこまで伸長されるだけである）（なお、ここで、この伸長プライマーは、 上記特定のヌクレオチド又は塩基と相補的な位置に検出可能要素及び／又は分離 要素を有する）；ｃ）伸長プライマーを、上記伸長プライマーに含有されない検 出可能要素を有しない画分に分離し；そして ｄ）上記伸長プライマーの存在が、特定のヌクレオチド又は塩基が特定のポリヌ クレオチド配列中の特定の位置にあることを示し、上記伸長プライマーの非存在 が、特定のヌクレオチド又は塩基が特定のポリヌクレオチド配列の特定の位置に 存在しないことを示す、上記伸長プライマーについての上記画分の試験により、 伸長プライマーが上記画分中に存在するか否かを測定する ことを特徴とする方法。 ６．同一又は異なったある特定のヌクレオチド又は塩基が、複数の異なったポリ ヌクレオチド配列を有するある物質中の少なくとも２つの異なった特定のポリヌ クレオチド配列中の特定の位置に存在するか否かを検出する方法であって、 ａ）該物質を、少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドプライマーにさらし 、ここで、該異なったオリゴヌクレオチドプライマーの各々は、上記の異なった 特定のポリヌクレオチド配列の１つの一部分と相補的な配列を有し、（ここで、 上記のプライマーの各々は、上記物質中に存在する場合、その相補的ポリヌクレ オチド配列と結合し、上記オリゴヌクレオチドプライマーの各々は、他方のプラ イマーのそれに対する異なった特定のポリヌクレオチド配列の一部分に結合し、 さらに、上記プライマーの各々は、上記特定の位置に直接隣接する上記物質中の その相補的な特定のポリヌクレオチド配列と結合する）； ｂ）それらの相補的ポリヌクレオチド配列と結合した、この異なったプライマー を伸長し（但し、上記特定のヌクレオチド又は塩基が、上記特定のポリヌクレオ チド配列中の上記特定の位置にある場合、この結合プライマーの各々は、この特 定の位置を含めてそこまで伸長されるだけである）（ここで、上記伸長プライマ ーの各々は、上記特定のヌクレオチド又は塩基と相補的な位置に検出可能要素及 び／又は分離要素を有する）； ｃ）特定位置にある特定のヌクレオチド又は塩基のところまでのみ伸長された伸 長プライマーを少なくとも１つの画分（ここで、この画分は、該伸長プライマー に含まれていない検出可能要素を有さない）に分け；そして ｄ）伸長プライマーの存在が、特定のヌクレオチド又は塩基が特定のポリヌクレ オチド配列中の特定の位置にあることを示し、画分中の上記伸長プライマーの非 存在が、少なくとも１つの特定のヌクレオチド又は塩基が少なくとも１つの異な った特定のポリヌクレオチド配列の特定の位置に存在しないことを示す、上記の 伸長プライマーについての上記画分の試験により、少なくとも１つの伸長プライ マーが上記画分中に存在するか否かを測定する ことを特徴とする方法。 ７．ある特定のヌクレオチド又は塩基がある物質中の特定のポリヌクレオチドの 特定の位置に存在するか否かを検出する方法であって、 ａ）上記物質を、上記特定のポリヌクレオチド配列の一部分と相補的な配列を有 するオリゴヌクレオチドプライマー（ここで、このプライマーは上記特定の位置 に直接隣接しない上記物質中の上記特定のポリヌクレオチド配列の一部分と結合 し、それによって上記特定の位置と、上記特定のポリヌクレオチド配列に結合す るプライマーとの間に介在配列が存在する）にさらし； ｂ）結合プライマーを伸長し（但し、上記特定のヌクレオチド又は塩基が特定の ポリヌクレオチド配列中の特定の位置にある場合、結合プライマーは上記の特定 のヌクレオチド又は塩基を含めてそこまで伸長されるだけである）（ここで、こ の伸長プライマーは、上記特定のヌクレオチド又は塩基と相補的な位置に検出可 能要素及び／又は分離要素を有する。但し介在配列は、介在配列と相補的であっ て伸長プライマーに組み込まれるヌクレオチド又は塩基が干渉検出可能要素及び ／又は分離要素の組込みを引き起こす場合のものではあり得ない）； ｃ）特定位置にある特定のヌクレオチド又は塩基のところまでのみ伸長された伸 長プライマーを１つの画分（ここで、この画分は、該伸長プライマーに含まれて いない検出可能要素を有さない）に分け；そして能要素を有しない画分中に、特 定の位置の特定のヌクｄ）上記伸長プライマーの存在が、上記特定のヌクレオチ ド又は塩基が上記特定のポリヌクレオチド配列中の上記特定の位置にあることを 示し、画分中の上記伸長プライマーの非存在が、上記特定のヌクレオチド又は塩 基が上記特定のポリヌクレオチド配列の上記特定の位置に存在しないことを示す 、上記伸長プライマーについての上記画分の試験により、伸長プライマーが上記 画分中に存在するか否かを測定することを特徴とする方法。 ８．同一又は異なったヌクレオチド又は塩基が、複数の異なったポリヌクレオチ ド配列を有するある物質中の少なくとも２つの異なったポリヌクレオチド配列中 の特定の位置に存在するか否かを検出する方法であって、 ａ）上記物質を、少なくとも２つの異なったオリゴヌクレオチドプライマーにさ らし、ここで、この異なったオリゴヌクレオチドプライマーの各々は、上記異な った特定のポリヌクレオチドの１つの一部分と相補的な配列を有し、（ここで、 このプライマーの各々は上記特定の位置に直接隣接しないその相補的ポリヌクレ オチド配列と結合し、それによって上記特定の位置と、上記物質中に存在する場 合、上記特定のポリヌクレオチド配列に結合するプライマーとの間に介在配列が 存在し、上記オリゴヌクレオチドプライマーの各々は、他方のプライマーのそれ に対して異なった特定のポリヌクレオチド配列の一部分と結合する）；ｂ）それ らの相補的ポリヌクレオチド配列に結合した上記異なったオリゴヌクレオチドプ ライマーを伸長し（ここで、上記特定のヌクレオチド又は塩基が上記特定のヌク レオチド配列中の上記特定の位置にある場合、結合プライマーの各々は、上記特 定の位置を含めてそこまで伸長されるだけである。この場合、上記伸長プライマ ーの各々は、上記の特定のヌクレオチド又は塩基と相補的な位置に検出可能要素 及び／又は分離要素を有する。但し、介在配列は、介在配列と相補的であって上 記伸長プライマーに組み込まれるヌクレオチド又は塩基が干渉検出可能要素及び ／又は分離要素の組込みを引き起こす場合のものではあり得ない）； ｃ）特定の位置にある特定のヌクレオチド又は塩基のところまでのみ伸長された 伸長プライマーを少なくとも１つの画分（ここで、この画分は、上記伸長プライ マーに含まれない検出要素を有さない）に分け；そして ｄ）伸長プライマーの存在が、少なくとも１つの特定のヌクレオチド又は塩基が 特定のポリヌクレオチド配列中の特定の位置にあることを示し、画分中の上記伸 長プライマーの非存在が、少なくとも１つの特定のヌクレオチド又は塩基が、少 なくとも１つの特定のポリヌクレオチド配列の特定の位置に存在しないことを示 す、上記の伸長プライマーについての上記画分の試験により、伸長プライマーが 上記画分中に存在するか否かを測定する ことを特徴とする方法。 ９．上記伸長がｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＩＴＰ 、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ及びｄｄＴＴＰから成る群 から選択される少なくとも１つのヌクレオチドを用いることを包含する請求項１ 記載の方法。 １０．上記伸長がｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＩＴ Ｐ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ及びｄｄＴＴＰから成る 群から選択される少なくとも１つのヌクレオチドを用いることを包含する請求項 ２記載の方法。 １１、上記伸長がｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＩＴ Ｐ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ及びｄｄＴＴＰから成る 群から選択される少なくとも１つのヌクレオチドを用いることを包含する請求項 ３記載の方法。 １２．上記伸長がｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＩＴ Ｐ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ及びｄｄＴＴＰから成る 群から選択される少なくとも１つのヌクレオチドを用いることを包含する請求項 ４記載の方法。 １３．上記伸長がｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＩＴ Ｐ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ及びｄｄＴＴＰから成る 群から選択される４つの異なるヌクレオチドを用いることを包含する請求項１記 載の方法。 １４．上記伸長がｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＩＴ Ｐ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ及びｄｄＴＴＰから成る 群から選択される４つの異なるヌクレオチドを用いることを包含する請求項２記 載の方法。 １５．上記伸長がｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＩＴ Ｐ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ及びｄｄＴＴＰから成る 群から選択される４つの異なるヌクレオチドを用いることを包含する請求項３記 載の方法。 １６．上記伸長がｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＩＴ Ｐ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ及びｄｄＴＴＰから成る 群から選択される４つの異なるヌクレオチドを用いることを包含する請求項４記 載の方法。 １７．上記伸長がｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＩＴ Ｐ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ及びｄｄＴＴＰから成る 群から選択される１つのヌクレオチドを用いることを包含する請求項５記載の方 法。 １８．上記伸長がｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ及びｄｄＴ ＴＰから成る群から選択される１つのヌクレオチドを用いることを包含する請求 項５記載の方法。 １９．上記伸長がｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＩＴ Ｐ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ及びｄｄＴＴＰから成る 群から選択される少なくとも１つのヌクレオチドを用いることを包含する請求項 ６記載の方法。 ２０．上記伸長がｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ及びｄｄＴ ＴＰから成る群から選択される少なくとも１つのヌクレオチドを用いることを包 含する請求項６記載の方法。 ２１．上記伸長がｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＩＴ Ｐ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ及びｄｄＴＴＰから成る 群から選択される１つのヌクレオチドを用いることを包含する請求項７記載の方 法。 ２２．上記伸長がｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＩＴ Ｐ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ及びｄｄＴＴＰから成る 群から選択される少なくとも１つのヌクレオチドを用いることを包含する請求項 ８記載の方法。 ２３．上記ヌクレオチドの少なくとも１つが検出可能要素を有する請求項９〜２ ２のいずれか一に記載の方法。 ２４．上記ヌクレオチドの少なくとも１つが分離要素を有する請求項９〜２２の いずれか一に記載の方法。 ２５．上記ヌクレオチドの少なくとも１つが分離及び検出可能要素を有する請求 項９〜２２のいずれか一に記載の方法。 ２６．オリゴヌクレオチドプライマーが検出可能要素を包含する請求項１〜８の いずれか一に記載の方法。 ２７．オリゴヌクレオチドプライマーが分離要素を包含する請求項１〜８のいず れか一に記載の方法。 ２８．オリゴヌクレオチドプライマーが検出可能及び分離要素を包含する請求項 １〜８のいずれか一に記載の方法。 ２９．伸長プライマーが分離要素を含有し、上記分離工程が：伸長プライマーを 、この分離要素に親和性を有する分子と接触せしめ、ここで、上記分子が上記分 離を促す支持体に結合され、そして上記接触伸長プライマーを分離して上記画分 を提供することから成る請求項１〜８のいずれか一に記載の方法。 ３０．伸長プライマーが分離要素を含有し、上記分離工程が：伸長プライマーを 、この分離要素に親和性を有する分子と接触せしめ、そして上記接触伸長プライ マーを分離して上記画分を提供することから成る方法であって、上記分離要素及 び上記分子が以下に記載の群から選択される請求項１〜８のいずれか一に記載の 方法： 分離要素分離要素に対する親和性を有する分子（ａ）受容体が存在するリガンド に対する受容体；リガンド （ｂ）受容体　　　　　受容体に対するリガンド；（ｃ）抗原　　　　　　抗原 に対する抗体ｌ（ｄ）抗原に対する抗体　抗原； （ｅ）抗イデオタイプ抗　抗イデオタイプ抗体に対す体　　　　　　　る抗体； （ｆ）抗イデオタイプ抗　抗体に対する抗イデオタイ体に対する抗体　プ抗体； （ｇ）ハプテン基　　　ハプテン基に対する抗体；（ｈ）ハプテン基に対す　ハ プテン基 る抗体 （ｉ）酵素　　　　　　酵素に対する結合阻害剤；及び （ｊ）酸素に対する結合　酸素 阻害剤 ３１．伸長プライマーが分離要素を含有し、上記分離工程が：伸長プライマーを 分離要素に親和性を有する分子と接触せしめ、上記分子が上記分離を促す支持体 に結合され、そして上記接触伸長プライマーを分離して画分を提供することから 成る方法であって、上記分離要素及び上記分子が以下に記載の群から選択される 請求項１〜８のいずれか一に記載の方法：分離要素分離要素に対する親和性を有 する分子（ａ）特異的受容体が存　リガンドに対する特異的受在するリガンド　 容体； （ｂ）特異的受容体　　　特異的受容体に対するリガンド； （ｃ）抗原　　　　　　抗原に対する特異的抗体；（ｄ）抗原に対する特異　抗 原： 的抗体 （ｅ）抗イデオタイプ抗　抗イデオタイプ抗体に対す体　　　　　　　　る特異 的な抗体； （ｆ）抗イデオタイプ抗　抗体に対する特異的な抗イ体に対する抗体　　デオタ イプ抗体； （ｇ）ハプテン基　　　　ハプテン基に対する特異的抗体； （ｈ）ハプテン基に対す　ハプテン基 る特異的抗体 （ｉ）酵素　　　　　　　酵素に対する強結合阻害剤及び （ｊ）酸素に対する強結　酸素 合阻害剤 ３２．特定のポリヌクレオチド配列がＤＮＡ配列である請求項１〜８のいずれか 一に記載の方法。 ３３．特定のポリヌクレオチド配列がＲＮＡ配列である請求項１〜８のいずれか 一に記載の方法。 ３４．特定のポリヌクレオチド配列が感染性又は病因生物からのものである請求 項１〜４のいずれか一に記載の方法。 ３５． ａ）特定のポリヌクレオチド配列の一部分と相補的な配列を有するオリゴヌクレ オチドプライマー；ｂ）該オリゴヌクレオチドプライマーを伸長するためのポリ メラーゼ酵素； ｃ）【配列があります】及びｄｄＴＴＰから成る群から選択される少なくとも１ つのヌクレオチド；並びに ｄ）上記オリゴヌクレオチドプライマーあるいは１つ又はそれ以上の上記ヌクレ オチドと場合により結合している検出可能要素及び／又は分離要素を包含する、 ある物質中の特定のポリヌクレオチド配列を検出するためのキット。 ３６． ａ）各々が特定のポリヌクレオチド配列の１つの一部分と相補的な配列を有する 、少なくとも２つの異なったオリゴヌクレオチドプライマー；ｂ）この異なった オリゴヌクレオチドプライマーを伸長するためのポリメラーゼ酵素； ｃ）【配列があります】及びｄｄＴＴＰから成る群から選択される少なくとも１ つのヌクレオチド；並びに ｄ）上記オリゴヌクレオチドプライマーあるいは１つ又はそれ以上の上記ヌクレ オチドと場合により結合している検出可能要素及び／又は分離要素を包含する、 複数の異なったポリヌクレオチド配列を有する物質中の少なくとも２つの異なっ た特定のポリヌクレオチド配列を検出するためのキット。 ３７．ある物質中の特定のポリヌクレオチド配列中の特定の位置に、特定のヌク レオチド又は塩基が存在するか否かを検出するためのキットであって、ａ）この 特定のポリヌクレオチド配列の一部分と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチ ドプライマー（ここで、このプライマーは上記特定の位置に直接隣接する上記特 定のポリヌクレオチド配列の一部分と結合する）； ｂ）上記オリゴヌクレオチドプライマーを伸長するためのポリメラーゼ酵素； ｃ）【配列があります】及びｄｄＴＴＰから成る群から選択される１つのヌクレ オチド（但し、上記特定のヌクレオチド又は塩基が上記特定のポリヌクレオチド 配列の上記特定の位置にある場合、上記ヌクレオチドが選択され、それによって 結合プライマーが上記の特定のヌクレオチド又は塩基を含めてそこまで伸長され るだけである）；並びに ｄ）検出可能要素及び／又は分離要素（それにより、伸長プライマーが上記の特 定のヌクレオチド又は塩基と相補的な位置に検出可能要素及び／又は分離要素を 有し、検出可能要素及び／又は分離要素が上記オリゴヌクレオチドプライマーと 場合により結合している） を包含するキット。 ３８．複数の異なったポリヌクレオチド配列を有する物質中の、少なくとも２つ の異なった特定のポリヌクレオチド配列の特定の位置に、同一又は異なる特定の ヌクレオチド又は塩基が存在するか否かを検出するためのキットであって、 ａ）各々が上記特定のポリヌクレオチド配列の１つの一部分と相補的な配列を有 する少なくとも２つの異なったオリゴヌクレオチドプライマー（ここで、このプ ライマーの各々は、上記物質中に存在する場合、その相補的ポリヌクレオチド配 列と結合し、上記オリゴヌクレオチドプライマーの各々は、他方のプライマーの それに対する異なった特定のポリヌクレオチド配列の一部分に結合し、さらに、 上記プライマーの各々は、特定の位置に直接隣接する上記物質中のその相補的な 特定のポリヌクレオチド配列と結合する）；ｂ）上記異なったオリゴヌクレオチ ドプライマーを伸長するためのポリメラーゼ酵素； ｃ）【配列があります】及びｄｄＴＴＰから成る群から選択される少なくとも１ つのヌクレオチド（但し、上記の特定のヌクレオチド又は塩基が上記特定のポリ ヌクレオチド配列の上記特定の位置にある場合、上記のヌクレオチドが選択され 、それによって結合プライマーが上記の特定のヌクレオチド又は塩基を含めてそ こまで伸長されるだけである）；並びに ｄ）少なくとも１つの検出可能要素及び／又は分離要素（それにより、伸長プラ イマーが上記特定のヌクレオチド又は塩基と相補的な位置に検出可能要素及び／ 又は分離要素を有し、検出可能要素及び／又は分離要素がオリゴヌクレオチドプ ライマーと場合により結合している） を包含するキット。 ３９．ある物質中の特定のポリヌクレオチド配列中の特定の位置に、特定のヌク レオチド又は塩基が存在するか否かを検出するためのキットであって、ａ）この 特定のポリヌクレオチド配列の一部分と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチ ドプライマー（ここで、このプライマーは、上記特定の位置に直接隣接しない上 記特定のポリヌクレオチド配列の一部分と結合し、それによって特定の位置と、 特定のポリヌクレオチド配列に結合するプライマーとの間に介在配列が存在する ）； ｂ）上記オリゴヌクレオチドプライマーを伸長するためのポリメラーゼ酵素； ｃ）【配列があります】及びｄｄＴＴＰから成る群から選択される１つのヌクレ オチド（但し、上記の特定のヌクレオチド又は塩基が特定のポリヌクレオチド配 列の特定の位置にある場合、上記のヌクレオチドが選択され、それによって結合 プライマーが上記の特定のヌクレオチド又は塩基を含めてそこまで伸長されるだ けである。但し、介在配列は、その介在配列と相補的であって、伸長プライマー 中に組み込まれる塩基又はヌクレオチドが干渉検出可能要素及び／又は分離要素 の組込みを引き起こす場合のものではあり得ない）；並びに ｄ）検出可能要素及び／又は分離要素（それにより、伸長プライマーが上記の特 定のヌクレオチド又は塩基と相補的な位置に検出可能要素及び／又は分離要素を 有し、検出可能要素及び／又は分離要素がオリゴヌクレオチドプライマーと場合 により結合している）を包含するキット。 ４０．複数の異なったポリヌクレオチド配列を有する少なくとも２つの異なった 特定のポリヌクレオチド配列の特定の位置に、同一又は異なった特定のヌクレオ チド又は塩基が存在するか否かを検出するためのキットであって、 ａ）各々が上記特定のポリヌクレオチド配列の１つの一部分と相補的な配列を有 する、少なくとも２つの異なったオリゴヌクレオチドプライマー（ここで、上記 のプライマーの各々は、上記の物質中に存在する場合、その相補的ポリヌクレオ チド配列と結合し、上記のオリゴヌクレオチドプライマーの各々は、他方のプラ イマーのそれに対する異なった特定のポリヌクレオチド配列の一部分に結合して 、さらに上記のプライマーの各々は、上記特定の位置に直接隣接しないその相補 的な特定のポリヌクレオチド配列と結合し、それによって上記特定の位置と、上 記特定のポリヌクレオチド配列と結合するプライマーとの間に介在配列が存在す る）； ｂ）上記異なったオリゴヌクレオチドプライマーを伸長するためのポリメラーゼ 酵素； ｃ）ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄｄＩＴ Ｐ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ及びｄｄＴＴＰから成る群から選択さ れる少なくとも１つのヌクレオチド（但し、上記の特定のヌクレオチド又は塩基 が上記特定のポリヌクレオチド配列の上記特定の位置にある場合、上記のヌクレ オチドが選択され、それによって結合プライマーが上記の特定のヌクレオチド又 は塩基を含めてそこまで伸長されるだけである。但し、介在配列は、その介在配 列と相補的であって、伸長プライマー中に組み込まれる塩基又はヌクレオチドが 干渉検出可能要素及び／又は分離要素の組込みを引き起こす場合のものではあり 得ない）；並びに ｄ）少なくとも１つの検出可能要素及び／又は分離要素（それにより、伸長プラ イマーが上記の特定のヌクレオチド又は塩基と相補的な位置に検出可能要素及び ／又は分離要素を有し、検出可能要素及び／又は分離要素がオリゴヌクレオチド プライマーと場合により結合してし、る）を包含するキット。 ４１． 反応器； 反応器に、オリゴヌクレオチドプライマー及びこのプライマーを伸長するための 試薬を添加するための手段（添加のための上記の手段は、反応器と操作上関連し ている）； 伸長プライマーを少なくとも１つの画分に分け、そしてこの画分を保持するため の手段（分離のための上記の手段は操作上反応器と関連している）；そして 上記画分の伸長プライマーの存在を検出するための検出器（上記の検出器は、分 離のための上記の手段と操作上関連する） を包含する、請求項１〜８のいずれか一に記載の方法を実施するための装置。 ４２．複数の異なったポリヌクレオチド配列を有する物質中の少なくとも２つの 異なった特定のポリヌクレオチド配列の存在を検出するためのスクリーニング方 法であって、 ａ）該物質を、少なくとも２つの異なったオリゴヌクレオチドプライマーにさら し、ここで、このオリゴヌクレオチドプライマーの各々は、上記異なった特定の ポリヌクレオチド配列の１つの一部分に相補的な配列を有し、（ここで、上記の プライマーの各々は、上記物質中に存在する場合、上記異なった特定のポリヌク レオチド配列の一つの一部分と結合し、上記オリゴヌクレオチドプライマーの各 々は、上記オリゴヌクレオチドプライマーの他方に対して異なった特定のポリヌ クレオチド配列の一部分と結合する）；ｂ）それらの異なった特定のポリヌクレ オチド配列と結合する上記異なったオリゴヌクレオチドプライマーを伸長し（こ こで、いかなる伸長プライマーも検出可能要素及び／又は分離要素を含有する） ；ｃ）伸長プライマーを、上記伸長プライマーに含有されない検出可能要素を有 しない画分に分け；そして ｄ）上記の伸長プライマーの存在が上記物質中の異なった特定のポリヌクレオチ ド配列の少なくとも１つの存在を示し、上記画分中の上記伸長プライマーの非存 在が上記の物質中の異なった特定のポリヌクレオチド配列の全ての非存在を示す 、上記の全ての伸長プライマーについての上記画分の試験により、伸長プライマ ーが上記画分中に存在するか否かを測定することを特徴とする方法。 ４３．同一又は異なった特定のヌクレオチド又は塩基が、複数の異なったポリヌ クレオチド配列を有する物質中の少なくとも２つの異なった特定のポリヌクレオ チド配列の特定の位置に存在するか否かを検出するためのスクリーニング方法で あって、 ａ）該物質を、少なくとも２つの異なったオリゴヌクレオチドプライマー（ここ で、この異なったオリゴヌクレオチドプライマーの各々は、上記異なった特定の ポリヌクレオチド配列の１つの一部分と相補的な配列を有しており、さらに上記 のプライマーの各々は、上記物質中に存在する場合、その相補的ポリヌクレオチ ド配列と結合し、上記オリゴヌクレオチドプライマーの各々は、他方のプライマ ーのそれに対する異なった特定のポリヌクレオチド配列の一部に結合し、さらに 、上記プライマーの各々は、上記特定の位置に直接隣接する上記の物質中のその 相補的な特定のポリヌクレオチド配列と結合する）にさらし；ｂ）それらの相補 的ポリヌクレオチド配列と結合する上記異なったオリゴヌクレオチドプライマー を伸長し（但し、上記特定のヌクレオチド又は塩基が上記特定のヌクレオチド配 列中の上記特定の位置にある場合、結合プライマーの各々は、特定の位置を含め てそこまで伸長されるだけである。この場合、上記の伸長プライマーの各々は、 上記特定のヌクレオチド又は塩基と相補的な位置に検出可能要素及び／又は分離 要素を有する）； ｃ）上記の伸長プライマーに含有されない検出可能要素を有しない画分に、特定 の位置の特定のヌクレオチド又は塩基までのみ伸長した伸長プライマーを分け、 ；そして ｄ）伸長プライマーの存在が、少なくとも１つの特定のヌクレオチド又は塩基が 特定のポリヌクレオチド配列中の特定の位置にあることを示し、画分中の上記の 伸長プライマーの非存在が、少なくとも１つの特定のヌクレオチド又は塩基が異 なる特定のポリヌクレオチド配列の特定の位置に存在しないことを示す上記の伸 長プライマーについての上記画分の試験により、少なくとも１つの伸長プライマ ーが上記画分中に存在するか否かを測定する ことを特徴とする方法。 ４４．同一又は異なった特定のヌクレオチド又は塩基が、複数の異なったポリヌ クレオチド配列を有する物質中の少なくとも２つの異なった特定のポリヌクレオ チド配列の特定の位置に存在するか否かを検出するためのスクリーニング方法で あって、 ａ）上記の物質を、少なくとも２つの異なったオリゴヌクレオチドプライマー（ ここで、この異なったオリゴヌクレオチドプライマーの各々は、上記異なった特 定のポリヌクレオチド配列の１つの一部分と相補的な配列を有し、さらに、この プライマーの各々は、特定の位置に直接隣接しないその相補的ポリヌクレオチド 配列と結合し、それによって特定の位置と、特定のポリヌクレオチド配列に結合 するプライマーとの間に介在配列が存在し、上記のオリゴヌクレオチドプライマ ーの各々は、上記物質中に存在する場合、他方のプライマーのそれに対して異な った特定のポリヌクレオチド配列の一部分と結合する）にさらし；ｂ）それらの 相補的ポリヌクレオチド配列に結合した上記異なったオリゴヌクレオチドプライ マーを伸長し（ここで、上記の特定のヌクレオチド又は塩基が特定のヌクレオチ ド配列中の特定の位置にある場合、結合プライマーの各々は、特定の位置を含め てそこまで伸長されるだけである。この場合、上記の伸長プライマーの各々は、 上記の特定のヌクレオチド又は塩基と相補的な位置に検出可能要素及び／又は分 離要素を有する。但し、介在配列は、介在配列と相補的であって伸長プライマー に組み込まれるヌクレオチド又は塩基が干渉検出可能要素及び／又は分離要素の 組込みを引き起こす場合のものではあり得ない）；ｃ）上記伸長プライマーに含 有されない検出可能要素を有しない画分に、特定の位置の特定のヌクレオチド又 は塩基まで伸長しただけの伸長プライマーを分け、；そして ｄ）伸長プライマーの存在が、少なくとも１つの特定のヌクレオチド又は塩基が 特定のポリヌクレオチド配列中の特定の位置にあることを示し、伸長プライマー の非存在が、特定のヌクレオチド又は塩基が異なった特定のポリヌクレオチド配 列の特定の位置に存在しないことを示す、上記の全ての伸長プライマーについて の上記画分の試験により、伸長プライマーが上記画分中に存在するか否かを測定 する ことを特徴とする方法。