JPH07506260A - 低グリコシル化組換えグルコースオキシダーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 低グリコジル化組換えグルコースオキシダーゼ本発明は、低グリコジル化組換え グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ　ＥＣ１，１，３，４）並びにその製造及び診 断検査におけるその使用に関する。

タンパク質が翻訳後に炭水化物を付与されるには、３つの様式がある。それらに は次のような区別がある：★　Ｎ−グリコジル化 −Ａｓｎへの炭水化物鎖のＮ−グリコシド結合★　Ｏ−グリコノル化 −Ｔｈｒ又はＳｅｒへの炭水化物鎖のＯ−グリコシド結合★　グリコシルーホス ファチジル−イノシトールアンカー（ＧＰＩ）−幾つかの膜タンパク質の成分、 −ＧＰＩアンカーは、それらをリン脂質膜内に埋め込む役割をする。

タンパク質のグリコジル化は、例えば、次の文献に記載されている： 一りクルジンス力（Ｋｕｋｕｒｕｚｉｎｓｋａ、　Ｍ、Ａ、）ら、　Ａｎｎ　Ｒ ｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｌｌｌ。

５Ｇ　（１９８７）　９１５−９４４　；−ポールノン（Ｐａｕｌｓｏｎ、　Ｃ ，Ｐ、）、　ＴｌＢ５１４　（１９８９）　２７２−２７６；−ワーレン（Ｗａ ｒｒｅｎ、　Ｃ，Ｅ、）、　ＩＩＥＥ　？　（１９９０）　３９２−３９５　； −バルー（Ｂａｌｌｏｕ、　Ｃ，Ｅ、）　：ストラサーン（Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ 、　Ｊ、Ｎ、）ら、　Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｒ　ｔ ｈｅ　Ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏ ｒｋ、ｐｐ、３５５−３６０（１９８２）において； 一コーンフェルト（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ、　Ｒ，）　；コーンフェルト（Ｋｏｒｎ ｆｅｌｄ。

Ｓ、）、　Ａｎｎ　Ｒｅｖ、　［Ｉｉｏｃｈｅｍ、　５４　（１９８５）　６３ １−６６４　；−タナ−（Ｔａｎｎｅｒ、　Ｗ、）　；レール（Ｌｅｈｌｅ、　 Ｌ、）、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　９０６　（１９８７）　８１−９９　；−イニス 　（ｌｎｎｉｓ、　Ｍ、八、）。バー　（口ａｒｒ、　ｒ’、Ｊ、）ら、　Ｙｅ ａｓｔｇｅｎｅｔｉｃ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、 Ｓｔｏｎｅｈａｍ、Ｍａｓｓ。

ｐｐ、２３３−２４６　（１９８９）において。

酵母タンパク質のＯ−グリコンド炭水化物構造は、１〜５マンノース残基の非分 枝状マンノース鎖からなる。Ｏ−グリコジル化は、ＥＲ内（第１マンノース残基 の移動）で始まってゴルジ体内で完了する。

Ｎ−グリコノル化は２段階で起こる。Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノース及 びグルコースのコアユニ・ノドが脂質キャリヤー中間体上に築かれ、これが糖タ ンパク質のＡｓｎ残基上のＥＲ内に移動する。このタンパク質結合コアユニツト が切断（ＥＲ内におけるグルコース残基及び特定マンノース残基の開裂）された 後、その糖構造がゴルジ体内で伸長してゆく（“外路（ｏｕｔｅｒｃｈａｉｎ） ”グリコジル化）のである。外路グリコジル化体の構造は、生体特異的である。

アスペルギルス・ニガーからのグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ　ＥＣ１，１， ３，４）は、サブユニット（ＳＵ）　、コファクター／　Ｓ　ＵとしてのＩ　Ｆ ＡＤ及びｌジスルフィド橋／ＳＵ当たり約８０ｋＤａの分子量を有する天然に分 泌されるＮ−グリコジル化ホモダイマーである。Ａ、ニガーからのＧＯＤは比較 的均一な炭化水素構造（コアグリコジル化体）を有している。

しかしなが呟アスペルギルス・ニガーからのグルコースオキシダーゼの工業的製 造は難しい。アスペルギルス・ニガー中のＧＯＤは、プロセシングを阻害するベ ルオキシソーム内に明らかに輸送される（デュケン・ファン（Ｄｉｊｋｅｎ、　 Ｊ、Ｐ、　ｖａｎ）とビーニュイス（Ｖｅｅｎｈｕｉｓ、　Ｍ、）、　Ｅｕｒ、 　Ｊ、　Ａｐｐｌｅ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　９　（１９８０）２７５−２８ ３）。しかしながら、一定の条件下では、この酵素は培地中にも分泌され得る（ ミノヤツク　（Ｍｉｓｃｈａｋ、　Ｉｆ、）ら、　Ａｐｐｌ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｂｉｏｔｅｃｈ、　２１　（１９８５）　２７−３１） 。この場合にはＣＯＤの収率は僅かに過ぎない。これらの理由から、アスペルギ ルス・ニガーからのグルコースオキシダーゼをサツカロミセス・セレビシェ内で 組換え法で産生させるための多くの試みが行われてきた。

サツカロミセス・セレビシェからの組換えＣＯＤは、アスペルギルス属からの天 然酵素よりも大きい熱安定性及びｐＨ安定性がある（デ・バエトセリア−（Ｄｅ 　Ｂａｅｔｓｅｌｉｅｒ　Ａ、）　ら。

Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　９　（１９９１）　５５９−５６１）　、しかし ながら、この組換え産生てこの酵素が高収率で得られるとはいえ、この組換え酵 素Ｃ；！、１５０マンノース残基までの不均一な“外路グリコジル化”のために 、炭水化物部分及び８０〜１４０　ｋＤａ／ＳＵ　（ＳＵ＝サブユニット）の分 子量の点て異種のものである。この組換え酵素ｃヨ高グリコジル化体である（炭 水化物部分が天然酵素におけや１６％に対して約７０％である）（デ・Ｉくエト セリア−ら。

Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　９　（１９９１）　５５９−５６１　）ので、天 然酵素よりも相当に高い分子量（約８０〜１４０ｋＤａ／ＳＵ）を有して（する 。これは、特に診断検査へのＣＯＤの応用にとって不利である。例えば、高グリ コジル化組換え酵素は、単位重量当たりのユニットで低い特異性しか持たない（ アスペルギルス属からの天然酵素（７）　１７８Ｕ／ｍｇに比べて約６５Ｕ／ｍ ｇ）。

−クリークバウム　（Ｋｒｉｅｃｈｂａｕｍ、　Ｍ、）ら、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔ ｔ、　２５５（＋９８９）　６３−６６　。

一フレデリック　（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ　Ｋ、Ｒ，）ら、　Ｊ、　［１ｉｏ１． 　Ｃｈｅｍ、　２６５（１９９０）　３７９３−３８０２　；−デ・バエトセリ ア−（Ｄｅ　Ｂａｅｔｓｅｌｉｅｒ、　Ａ、）ら、　ＢｉＢｌｏｌｅＣｈｌｌＯ ｌｏ　９（１９９１）　５５９−５６１　： −ウィティンテン（Ｗｈｉｔｔｉｎｇｔｏｎ、　Ｉｆ、）ら、　Ｃｕｒｒ、　Ｇ ｅｎｅｔ、１８（＋９９０）　５３１−５３６　； −ローゼンベルグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、　Ｓ、）、　Ｗｏ　８９／１２６７５ ゜これら刊行物には、アスペルギルス・ニガーからのグルコースオキシダーゼの 配列も記載されている。

本発明の目的は、これら不利な点を回避すること及びそのＮ−グリコジル化が（ 例えば、外路グリコジル化の完全な又は部分的な欠如で）できるだけ均一かつ低 いものでありしかも高い特異性を有する組換えグルコースオキシダーゼを提供す ることにある。

この目的は、６８〜８０　ｋＤａの分子量、単位重量あたり約２００Ｕ／ｍｇの 比活性、約１２％の炭水化物部分を有する低グリコノル化組換えグルコースオキ シダーゼにより達成され、それはアスペルギルス属からのＣＯＤ遺伝子を含有す る組換えＤＮＡのＮ−グリコジル化能欠損酵母突然変異株ＤＳＭ７０４２、ＤＳ Ｍ７１６０、ＤＳＭ７３３８若しくはＤＳＭ７３４０又はその対立性突然変異株 内での発現、発酵及びその培養上澄み液又はそれら細胞からのその酵素の単離に よって得ることができる。

驚いたことに、Ｎ−グリコジル化能欠損酵母突然変異株（例えば、ｎｇｄ２９突 然変異株）から単離したＣＯＤが、匹敵する炭水化物部分、分子量（６８〜８０ ｋＤａ、好ましくは６８〜７５ｋＤａ）及び比活性を有するアスペルギルス・ニ ガーからの酵素よりも大いに安定であることが分かった。

本発明によるＣＯＤを産生するのに適する酵母株及びその製造は、その内容が本 発明の開示内容の主題である同じ優先権を有するドイツ特許出願Ｐ４２２６０９ ４．９に記載されている。

かかる酵母株は、〔月１〕−マンノース自殺選択（ｓｕｉｃｉｄｅｓｅｌｅｃｔ ｉｏｎ）、■又は幾つかの選択可能マーカー（栄養素要求性及び／又は耐性）の 導入及び、プラスミドＹＥｐＬ／ＣＯＤでの形質転換後に標準的条件下で培養し た後に培地内にｌｏｍｇ／ｊ’を超えるＣＯＤを分泌しかつサツカロミセス・セ レビシェ突然変異株ｎｇｄ２９　（ＤＳＭ７０４２、ＤＳＭ７３３８）又はｎｇ ｄ６２　（ＤＳＭ７１６０、ＤＳＭ７３４０）に対立性の株の選択により得るこ とができる。

〔３Ｈ〕−マンノース自殺選択法は、次の操作を必須とするニー突然変異誘発（ 例、ｉｆｆ、野生型株Ｘ２１８０−ＩＡ、ＡＴＣＣ２６７８６から出発） −（’１ｌ）−マンノースとのインキュベーション−細胞の生存率がＩＯの２〜 ３の累乗倍低下するまで（２〜４力月）それら細胞を一８０℃で保存することに よる高グリコリル化能欠損突然変異株の蓄積 一相同的に発現されたインベルターゼに基づく、Ｎ−グリコジル化能が低下した 突然変異株の選択 −活性染色による分析、及び／又は −分泌されたインベルターゼの免疫沈降及び５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分子ｆｆ１ （グリコジル化）の測定。

栄養素要求マーカーは、酵母株を掛は合わせて二倍体を形成させ（顕微操作によ る接合子の単離）、そのあと必要に応じて胞子形成させて一倍体を形成させる（ 四分子分析）ことによって導入される。ｎｇｄ表現型は、スクロース及び２．３ ．４−１−リニトロフェニルテトラゾリウム・クロリドを基質／グルコース試薬 として用いる天然ＰＡＧＥゲルによる外部インベルターゼの活性染色によって確 認される。

適切なＣＯＤ産土産生認は、標準的条件下での培養後に培地中に分泌されるＣＯ Ｄの活性を測定することによって行われる。これを行うためには、好ましくは完 全培地中での選択的予備培養後に、試験すべき株（ＣＯＤ形質転換体）を農産し ながら３〜４日間インキュベートする。好ましくは、酵母エキス、バクトペブト ン、フルクトース及びマルトースを中性ｐＨてこの完全培地に添加する。

グルコースオキシダーゼの確認は、例えば、実施例の“一般的方法”に記載した 方法に従って行う。

本発明による突然変異株（対立性突然変異株）は、被験突然変異株が、酵母株Ｄ ＳＭ７０４２／７３３８　（ｎｇｄ２９）及び０３Ｍ７１６０／７３４０　（ｎ ｇｄ６２）と同じ遺伝子内に突然変異を有するか否かについて分析する試験によ って確認することができる。

これを行うためには、被験株をそれぞれ酵母株ＤＳＭ７０４２／７３３８及びＤ ＳＭ７１　Ｇ　Ｏ／７３４０と掛は合わせ、この方法で得られる二倍体株を分析 する。

被験突然変異（株）は、それら突然変異が二倍体細胞内で相殺されていないなら ば、本発明によるｎｇｄ突然変異株（ＤＳＭ７０４２／７３３８　（ｎｇｄ２９ ）及び／又はＤＳＭ７１６０／７３４０　（ｎｇｄ６２））に対立性である。

被験突然変異（株）は、それら突然変異が二倍体細胞内でそれら自体を補い、そ の結果としてＮ−グリコジル化に関して野生型の表現型が生じるならば、本発明 によるｎｇｄ突然変異株（ＤＳＭ７０４２／７３３Ｂ　（ｎｇｄ２９）及び／又 はＤＳＭ７１６０／７３４０　（ｎｇｄ６２）　）に対立性ではない。

本発明によって好ましく用いられる酵母株は、ＤＳＭ７０４２、ＤＳＭ７１６０ 、ＤＳＭ７３３８及びＤＳＭ７３４０株である。

ＤＳＭ７３３８及びＤＳＭ７３４０株が特に好ましい。

熱安定性は、ＤＳＣスペクトル（“示差走査熱量分析″）に基ついて測定した。

これによれば、Ｔｍ値はアスペルギルス・ニガーからのＧＯＤについての６８． ５℃に比較して少なくとも７３℃である。

５５℃で２時間の温度ストレスをかけた後でも、ＣＯＤの残留活性は依然として 少なくとも３０％である。

本発明によるＣＯＤの好ましい態様は、複数の追加ヒスチジン又はンステインを 含有するＣ−末端活性ＣＯＤ融合タンパク質である。かかる誘導体は、例えば、 ＥＰ−８０１８４３５５に記載されており簡単な方法で精製することができる。

本発明は、更にアスペルギルス・ニガーからの均一な炭水化物構造を有する組換 えグルコースオキシダーゼをサツカロミセス・セレビシェ内で産生させる方法で あって、ｎｇｄ２９遺伝子（例えば、０３Ｍ７０４２／７３３８）及び／又はｎ ｇｄ６２遺伝子（例えば、０３Ｍ７１６０／７３４０）内に欠損を有するサツカ ロミセス・セレビシェ株を、ＣＯＤの遺伝子を含有する組換えＤＮＡで形質転換 し、それら細胞を培養した後に、それら細胞又はその上澄み液からグルコースオ キシダーゼを単離することを特徴とする方法に関する。

最後に、本発明は、更に、本発明によるグルコースオキシダーゼの診断検査にお ける使用に関する。

特許のために、次のものを“ドイツ微生物及び培養物収集社（Ｄ　Ｓ　Ｍ）　（ Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｆｕｏｒ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｅｎ　ｕｎｄＺｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ　ＧＩｌｌｂｔｌ　（ＤＳＭ）、　Ｍａ ｓｃｈｅｒｏｄｅｒ　Ｗｅｇ　ＩＢ、　Ｄ−３３００Ｂｒａｕｎｓｃｈｅｂｅｉ ｇ）″に寄託した：寄託番号　寄託日 １、プラスミドＹＥｐＬ　ＤＳＭ　７０３８　１９９２年４月７日２、酵母変異 株ＢＭＹ３−９Ａ　（ｎｇｄ２９）　ＤＳＭ　７０４２　１９９２年４月８日３ 、酵母変異株ＢＭＹ３−９Ｃ（ｎｇｄ２９）　ＤＳＭ　７１９３　１９９２年７ 月２４日４、酵母変異株ＢＭＹ１２−２００（口ｇｄ６２）　ＤＳＭ　７１６０ 　１９９２年７月９日５、酵母変異株ＢＭＹ８−１２Ａ　（ｎｇｄ６２）　ＤＳ Ｍ　７１５７　１９９２年７月９日６、酵母変異株ＢＭＹ１３−７８　（ｍｎｎ ９）　ＤＳＭ　７１５８　１９９２年７月９日７、酵母変異株ＢＭＹ１３−ＩＣ （ｍｎｎ９）　ＤＳＭ　７１５９　１９９２年７月９日８、酵母変異株ＪＭＩ９ ３５　ＤＳＭ　７１５６　１９９２年７月９日９、酵母変異株ＤＢＹ７４６　Ｄ ＳＭ　４３１（ｉ　１９８７年１２月１４日１０、酵母変異株Ｎ−［ＩＭＹ３− ９Ａ　ＤＳＭ７３３８　１９９２年１２月８日１１、酵母変異株Ｎ−ＢＭＹ１３ −ＩＣ０３Ｍ７３３９　１９９２年１２月８日１２、酵母変異株Ｎ−ＢＭＹ１２ −２０Ｄ　０３Ｍ７３４０　１９９２年１２月８日１３、酵母変異株Ｎ−ＢＭＹ ３−９ＣＩ）３Ｍ７３４１　１９９２年１２月８日以下の実施例は本発明を更に 説明するものである。

実施例 マニアチス（ＭａｎｉａＬｉｓ、　Ｔ、）らによりＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ ｎｉｎｇ：　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ 　１ｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８９）に 記載された如き標準的方法を用いてＤＮＡを操作した。使用した分子生物学試薬 は、メーカーの使用説明書に従って用いた。

酵母形質転換 サツカロミセス・セレビシェ株をベッグス（Ｂｅｇｇｓ、　Ｊ、Ｄ、）の方法（ Ｎａｔｕｒｅ　２７５　（１９７８）　１０４−１０９　；イトウ（ｌｔｏ、　 Ｈ，）、　Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５３　（１９８３）　１６３−１６８又はデローメ　 （Ｄｅｌｏｒｍｅ、　Ｅ、）の方法（Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎ ｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　５５　（１９８９）２２４２−２２ ４６）に従って形質転換した。フルクトースをＣスクロースとしてのグルコース の代わりに用いた。

グルコースオキシダーゼ活性の測定 ＣＯＤ活性の測定は、２５℃、ｌ　ｍ　ｌ容量で、０．１８モル／ｌグルコース 、１５ユニツト／　ｍ　１ホースラデイツシユペルオキシダーゼ及び１．７５　 ミリモル＃ＡＢＴＳ■グルコース試薬を含有する酸素で飽和した０、　１モル／ １リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７゜０）中で行った。反応をグルコースオキシダ ーゼ（５〜２０ｍＵ／　ｍ　ｌに希釈したＣＯＤを含有するｌＯμｌサンプル） を添加することにより開始して、吸光度の変化７分（ΔＡ／分）を４０５ｎｍで 測定した（εｔｏｓ　＝３６．８　Ｃミリモル’ｘ　１　ｘ　ｃｍ”）　）。

ｌユニット（Ｕ）活性を、２５℃で分当たりにｌμモルグルコースを酸化する酵 素の量として定義する。精製Ａ、ニガーＣＯＤの比活性は、これら試験条件下で 約２３０Ｕ／ｍｇである。

タンパク質測定 タンパク質測定は、ラン１１１［清アルブミンをスタンダードとするマイクロビ ユレット法（ザメンホフ　（Ｚａｍｅｎｈｏｆ、　Ｓ、）ら。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　３　（１９５７）　６９６−７０４）によ って行った。

精製ＣＯＤ酵素のタンパク質濃度は、２８０　ｎｍにおける光学密度に基づいて 計算した（ｌＯＤｚｓａ　’１．５ｍｇ／ｍｌ精製Ｇ。

Ｄ）。

細胞溶解及び粗製抽出物の単離 ５ｍｌ培地からの細胞（約０．１〜０．２ｇ酵母、湿量）を遠心分離にかけた。

細胞ペレットをｌＯミリモル／１リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で１度洗浄してか ら、ホイールミックス（Ｗｈｉｒｌｎ＋ｉｘ）での均質化（シリアシイ（Ｃｉｒ ｉａｃｙ、　Ｍ、）、　Ｍｕｔ、　Ｒｅｓ、　２９　（１９７５）３１５−３２ ６）によりカラスビーズで溶解した。そのあと、細胞を２ｍｌのＩＯミリモル／ ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）中に再懸濁／抽出し、細胞デブリを遠心分離によ って除去し、そして上澄み液を粗製抽出物として更に処理した。

ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）可溶性サンプル（ 培地上澄み液及び細胞溶解産物）を１１５容量の５ＸＳＤＳサンプル緩衝液（Ｉ ＸｓＤｓサンプル緩衝液＝５０ミリモル／（トリス−〇Ｃ１（ｐＨ６，８）、１ ％ＳＤＳ、１％メルカプトエタノール、１０％グリセロール、０．００１％ブロ モフェノールブルー）と混合して９５℃で５分間インキュベートした。細胞デブ リ部分の不溶性タンパク質を２ｍｌのｌＸ５ＤＳサンプル緩衝液及び６〜８モル ／１尿素で抽出し、９５℃に５分間加熱することにより変性し、そして遠心分離 により不溶性成分と分離した。そのあと、これらタンパク質を５ＤＳ−ＰＡＧＥ 　（ラエムリ　（Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｕ、に、）、　Ｎａｔｕｒｅ　２２７　（ １９７０）　６８０−６８５）によって分離してツマシーブリリアントブルー０ 色素で染色した。

実施例１ Ｓ、セレビシェ内でＡ、ニガーＣＯＤを分泌させるためのプラスミドの構築 酵母発現ベクターＹＥｐＬ（出発ベクター）の構築プラスミドＹＥｐＬは、α− グルコシダーゼベクターＹＥｐ１５Ｃ６ｂ３（：Ｉペツキ（ＫｏｐｅＬｚｋｉ） ら、　Ｙｅａｓｔ　５　（１９８９）　１１−２４　；コペツキら、　ＥＰ−Ａ 　０３２３８３８）に基づくものである。プラスミドｐＢＲ３２２からの約２． ３　ｋ　Ｂ　Ｉ）長のＥｃｏＲＩ／Ｐｖｕｌｌ断片（プラスミド起点、アンピシ リン耐性遺伝子）がこのプラスミドを大腸菌内で複製するのに役立つ。酵母内で 復製するために、このベクターは（大腸菌／酵母シャトルベクターＹＥｐ２４か らサブクローン化した）酵母の２μｍＤＮＡからの約２．２　ｋ　Ｂ　ｐ長のＥ ｃｏＲＩ断片を含有する。更に、このベクターは、栄養素要求酵母株中のこのプ ラスミド及びα−グルコシダーゼ発現カセット（ＧＬＵＣＰＩ遺伝子）を選択す るために、ＵＲＡ３及びＬＥＵ２ｄ遺伝子を含有する。それは、α−グルコシダ ーゼプロモーター、ポリリンカー（発現される遺伝子のためのクローニング部位 ）及びα−グルコシダーゼターミネータ−からなる。更に、その遺伝子産物、つ まりＭＡＬ２−８ｃｐタンパク質がα−グルコンダーゼプロモーターを活性化す るＭＡＬ２−８ｃｐ遺伝子が存在する。このα−グルコンダーゼプロモーターは 、グルコースの存在ドで抑制される。グルコースが消費された後は抑制が解除さ れて、マルトースで誘発された後にその最大活性を達成する。

１．１　プラスミドＹｌｌ）／ＫＬ６ｂ３の構築α−グルコンダーゼターミネー タ−とＭＡＬ２−８ｃｐプロモーターの間の必要ではない約１、Ｊ　ｋＢｐ長の ＤＮＡ配列をプラスミドＹＥｐ１５Ｃ６ｂ３　（図１）から欠失させた。

これを行うために、プラスミドＹＥｐ１５Ｃ６ｂ３をＸｈｏｌて線状にし、突き 出た５°末端をクレノーポリメラーゼで充填し、このプラスミドをＭｒｏＩて再 開裂し、そして８．７　ｋ　Ｂ　ｐ長のＭｒｏｌ／Ｘｈｏｌ（平滑）ベクター断 片を単離した。第２の調製では、プラスミドＹＥｐ１５Ｃ６ｂ３を制限エンドヌ クレアーゼＭ　ｒ　ｏ　Ｉ及びＳｃａ　Ｉで消化し、α−グルコシダーゼ遺伝子 を含有する２、　５　ｋ　Ｂ　Ｉ）長のＭ　ｒ　ｏ　Ｉ　／　Ｓ　ｃ　ａ　Ｉ断 片を単離し、そして８、７　ｋ　Ｂ　ｐ長のＭｒｏＩ／Ｘｈｏｌ（平滑）ベクタ ー断片と連結した。所期のプラスミドを制限酵素地図作成によって同定し、ＹＥ ｐ／ＫＬ（ｉｂ３と名付けた。

１．２　プラスミドＹＥｐ／ＫＬ−６ｂ３Ｍの構築Ｍｌ　ｕ　Ｉ−’）ンカ−（ ５°−ＧＡＣＧＣＧＴＣ−３’　）を、ＭＡＬ２−８ｃｐ遺伝子の５°非翻訳領 域の５ｓｐｌ制限工ンドヌクレアーゼ開裂部位内に連結した。プラスミド構築物 ：ＹＥＩ）／ＫＬ−６ｂ３Ｍ。

１．３　ブラスミＦＹＥｐ／ＫＬ−６ｂ３Ｍ−ＭＣ３の構築α−グルコシダーゼ の構造遺伝子を“ポリメラーゼ連鎖反応”（ＰＣＲ）法（ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ 、　Ｋ、Ｂ、）と７７０−す（Ｆａｌｏｏｎａ。

Ｆ、Ａ、）、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１５５　（１９８７ ）　３３５−３５０）によって除去してＤＮＡリンカ−（多クローニング部位、 ＭＣ３）と置き換えた。

これを行うために、プラスミドＹＥｐ／ＫＬ−６ｂ３ＭからのＧＬＵＣＰ　Ｉプ ロモーター配列を、次のプライマー対（配列番号＝１及び配列番号：２を参照の こと）を用いるＰＣＲによって増幅して約４１０Ｂｐ長のＰＣＲ産物をアガロー スゲル電気泳動によって単離した。

プライマー（１）　：　５°−ＡＴＴＴＣＴＣＣＴＴＡＴＴＧＣＧＣＧＣＴＴ− ３゜プラスミドＹＥｐ／ＫＬ−６ｂ３ＭからのＧＬＵＣＰ　Ｉターミネータ−配 列を、次のプライマー対（配列番号：３及び配列番号＝４を参照のこと）を用い る第２ＰＣＲ反応で増幅して約８６ＯＢｐ長のＰＣＲ産物をアガロースゲル電気 泳動によって単離した。

プライマー（３）： ５°−ＡＧＡＴＣＴＡＴＧＴＣＧＡＣＡＧＣＴＧＡＡＴＡＧＡＴＡＡＡＡＴＴＡ ＧＴＧＣＧＧＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＡ−３’プライマー　（４）　：　５’　− ＧＴＣＡＴＴＴＧＴＡＡＡＧＴＡＡＡＡＴＴＣＣＡＡ−３゜そのあと、等モル量 のこれら単離ＰＣＲ断片（それぞれ約５゜ｐｇ）を混合してＰＣＲ反応混合物に し、９５℃で５分間インキュベートしてこれら二本鎖Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｄｓ−ＤＮ Ａ）を変性し、その反応混合物を６０℃に冷却してＭＣ３を含有する相補的−水 路ＤＮＡにアニーリングし、そのハイブリダイゼーション産物をＴａｑポリメラ ーゼを用いてｄｓ−Ｄ　Ｎ　Ａに転化し、そして次のプライマー対（配列番号＝ １及び配列番号＝４を参照のこと）を用いる第３ＰＣＲ反応で増幅した。

プライマー（１）　：　５°−ＡＴＴＴＣＴＣＣＴＴＡＴＴＧＣＧＣＧＣＴＴ− ３′プライマー（４）　：　５’　−ＧＴＣＡＴＴＴＧＴＡＡＡＧＴＡＡＡＡＴ ＴＣＣＡＡ−３’そのあと、約１．２７ｋＢｐ長のＰＣＲ産物を制限エンドヌク レアーゼＭ　ｒ　ｏ　Ｉ及びＭｌｕｌて消化し、約０．９２ｋＢｐ長のＭｒｏ　 Ｉ／Ｍ　ｌ　ｕ　Ｉ−ＧＬＵＣＰ　Ｉ−プロモーター／ＭＣ３／ＧＬＵＣＰＩタ ーミネータ−断片をアガロースゲル電気泳動により単離し、そして約８．５５　 ｋ　Ｂ　ｐ長のＭｒｏ　Ｉ／Ｍｌ　ｕ　Ｉ−ＹＥｐ／ＫＬ−６ｂ３〜１ヘクタ一 断片内に連結した。所期のプラスミドＹＥｐ／ＫＬ−６ｂ３Ｍ−ＭＣ３を制限酵 素地図作成によって同定し、そしてＰＣＨにより合成したＤＮＡ領域をＤＮＡ配 列決定によって点検した。

１．４　プラスミドＹＥｐＬの構築 次のプラスミド構築では、ＬＥＵ２ｄ遺伝子をプラスミドＹＥｐ／ＫＬ−６ｂ３ Ｍ−ＭＣ８内に挿入した。これを行うために、プラスミドＹＥｐ／ＫＬ−６８３ Ｍ−ＭＣＳをＣｅ１ｌｌ及び５ｎａＢＩて消化して、８．４ｋＢＩ）長のＣｅ　 ＩＩＩ／５ｎａＢＩ−ＹＥｐ／ＫＬ−６ｂ３Ｍ−ＭＣＳベクター断片を単離した 。ＬＥＵ２ｄ遺伝子は、プラスミドＥ）ＡＤＨＯ４０−２（エルハート（Ｅｒｈ ａｒｔ、　Ｅ、）とホーレンベルグ（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、　Ｃ，Ｐ、）、　 Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５６　（１９８３）　６２５−６３５）からの約２． ３２ｋＢｐ長のＣｅ１ｌｌ／５ｎａＢＩ断片として単離し、この８．４　ｋ　Ｂ 　ｐ長のＣｅ１１１／Ｓ　ｎ　ａ　Ｂ　Ｉ−ＹＥｐ／ＫＬ−６ｂ　３Ｍ−ＭＣ５ ベクタ一断片と連結した。所期のプラスミド構築物ＹＥｐＬ　（ＤＳＭ７０３８ ）を制限酵素地図作成によって同定した（図２）。

１．５　プラスミドＹＥｐＬ／ＧＯＤの構築用いたグルコースオキシダーゼ遺伝 子（株：ＮＲＲＬ−３，ＡＴＣＣ９０２９）のクローニング、ｐ　Ｂｌｕｅｓｃ ｒｉｐｔ　ＳＫ（＋）ベクター内でのサブクローニング、ＤＮＡ配列決定及びＣ ＯＤタンパク質配列配列定は、クリークバウム（Ｋｒｉｅｃｈｂａｕｍ、　Ｍ） らの刊行物（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　２５５　（１９８９）　６３−６６）に記 載されている。このＣＯＤ遺伝子は、２つの部分領域（Ｓａｉｌ制限断片）にｐ 　ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）内にクローン化した。

プラスミドｐＳＫ／Ｃ０Ｄ−１，８は、５゛−非翻訳領域とＢｐ位置＋６４にお ける５ａｉｌ開裂部位までのＣＯＤ構造遺伝子のＮ−末端領域をコードする約１ ．８　ｋ　Ｂ　ｐ長の５ａｌＩ断片を含有する（Ｂｐ位置はクリークバウム（Ｋ ｒｉｅｃｈｂａｕｍ、　Ｍ）らによる番号付けに対応する）。プラスミドｐＳＫ ／Ｃ０Ｄ−２，０は、Ｂｐ位ｉ？ｆｆ１１６５から１８５３までのＣＯＤ構造遺 伝子の残りの部分並びにＣＯＤ構造遺伝子の下流の３゛−非翻訳領域をコードす る約２゜０ｋＢｐ長の５ａｌＩ断片を含有する。

ＣＯＤ遺伝子の５゛−及び３°−非翻訳領域をＰＣＲ法によって除去し、ＣＯＤ 構造遺伝子の両末端に単一制限エンドヌクレアーゼ開裂部位（Ｂｇｌｌ＋及びＰ ｖｕｌりを生成させ、そして天然ＣＯＤタンパク質をコードするＤＮＡ配列を維 持しながら、更に単−ｓｐｈ　＋及びＮｈｅｌ開裂部位をＣＯＤ構造遺伝子のＣ −末端コーディング領域に導入した。続いて、ＣＯＤ構造遺伝子をこれら２つの ＰＣＲ断片から３断片連結で組み立ててベクターＹＥｐＬ内に挿入した。Ｎ−末 端ＣＯＤ構造遺伝子を増幅するために、次のプライマー対（配列番号：５及び配 列番号＝６を参照のこと）を用い、プラスミドｐＳＫ／Ｃ０Ｄ−１，８を鋳型Ｄ ＮＡとして用いた。

残りのＣＯＤ構造遺伝子を増幅するために、次のプライマー対（配列番号　７及 び配列番号　８を参照のこと）を用い、プラスミドｐＳＫ／Ｃ０Ｄ−２，０を鋳 型ＤＮＡとして用いた。

プライマー（７）　：　５’　−ＧＣＣＧＧＣＧＡＡＣＧＴＧＧＣＧＡＧＡ八− ３゛第１応の約２２０Ｂｐ長のＰＣＲ産物をＢｇｌｌ！及び５ａｌＩで再開裂し て約１３０Ｂｐ長のＢｇｌｌｌ／５ａｉｌ断片を単離した。第２反応の約２．０ ５ｋＢｐ長のＰＣＲ産物を５ａｌｌ及びＰｖｕｌｌて消化して約１．７　ｋ　Ｂ 　ｐ長のＤＮＡ断片を単離した。そのあと、これらＰＣＲ断片を約１０．７　ｋ 　Ｂ　＋）長のＢｇｌｌｌ／Ｐｖｕｌｌ−ＹＥｐＬベクター断片内に連結した（ ３断片連結）。所期のプラスミドＹＥｐＬ／ＣＯＤ　（図３）を制限酵素地図作 成によって同定し、そして部分的に配列決定した（クローニング接合（ｃｌｏｎ ｉｎｇ　ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ））。

１．６　プラスミドＹＥ　ｐ　Ｌ／ＣＯＤ　−（Ｈｉ　ｓ）　、の構築このプラ スミドは、４つの追加のヒスチジン残基をＣ−末端に有するＣＯＤ酵素変異体を コードする修飾ＣＯＤ遺伝子を含有する。ＹＥｐＬ／Ｃ０Ｄ−（Ｈｉ　ｓ）、を プラスミドＹＥｐＬ／ＣＯＤから作った。

これを行うために、プラスミドＹＥｐＬ／ＧＯＤを５ｐｈＩで部分的に開裂して Ｐ　ｖ　ｕ　ＩＩで完全に開裂し、約１０．７ｋＢ＋）長の５ｐｈｌ／Ｐｖｕｌ ｌ断片を単離して、２つのオリゴヌクレオチド（配列番号：９及び配列番号：ｌ Ｏを参照のこと）から／％イブリダイゼーンヨジンより調製した次のＤＮＡリン カ−と連結した。

プライマー　（９）　：５°−ＣへＧＣへＣＣＡＣＣＡＣＣへＣＴＧＡＣＡＧ− ３’プライマー（１０）：５°−ＣＴＧＴＣ八ＧＴＧへＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＧ ＣＡＴＧ−３゜−−−−Ｇｌｎｌｌｉｓｌｌｉｓｌｌｉｓｌｌｉｓ停止所期のプ ラスミドＹＥｐＬ／Ｃ０Ｄ−（ｆ［ｉ　ｓ）　、を放射性標識プライマーＩＯを プローブとして用いるコロニーハイブリダイゼーノヨンによって同定し、更に制 限酵素地図作成及び部分的配列決定（ＣＯＤ構造遺伝子のＣ−末端領域）により 分析した。

実施例２ 一突然変異誘発（出発株：Ｘ２１８０−ＩＡ、遺伝子型：　ＳＬＩＣ２ｍａｔ　 ｍｅｌ　ｇａ１２ｃＵｒ’ｌ；ＡＣＴＴ２６７８６）−［”Ｈ）−マンノースと のインキュベーション−細胞の生存率が１０”〜１０″倍に低下するまで（２〜 ４力月）それら細胞を一８０°Ｃで保存することによる高グリコジル化能欠損突 然変異株の蓄積 Ｘ２１８０−　ＩＡ　（ＡＣＴＴ２６７８６）の如き酵母株をＹＥＰＤ培地（２ ％ハクトペプトン、１％酵母エキス（ディフコ（Ｄｉｒｃｏ））及び４％グルコ ース）中で培養し、対数増殖期に採取しく約５Ｘ１０”の細胞）　、０．１モル ／１リン酸ナトリウム（ｐ［Ｉ７）で洗浄し、そして１．５　ｍ　ｌの０．１モ ル／ｌリン酸ナトリウム（ｐＨ７）中に再懸濁する。これら細胞をＯ，１ｍｌの メタンスルホン酸エチルの添加によって２５°Ｃて１時間突然変異誘発する。

このようにして処理した０、　２　ｍ　ｌの細胞をｌ　Ｏｍｊ！のチオ硫酸ナト リウム（５％Ｗ／Ｖ）と１０分間インキュベートし、Ｏ，１モル−／１リン酸ナ トリウム（１）Ｈ７，０）で洗浄し、そしてＹＥＰＤ培地（２％バクトペプトン 、１％酵母エキス（ディフコ）及び４％グルコース）中に再懸濁する。

これら細胞を農産しながら２８℃で、５７８ｎｍにおけるＯＤが０．６になるま でインキュベートする。１０’個の細胞をＹＥＰ培地（２％バクトペブトン、１ ％酵母エキス（ディフコ））で洗浄し、０．１％グルコースを含有するＯ、　ｌ 　ｍ　ｌのＹ　Ｅ　Ｐ中に再懸濁する。２ｍＣ１（’旧−マンノース（比活性１ ８．５ｃｉ／ミ１ノモル）を添加してその培養液を２８℃で６０分間インキュベ ートする。細胞を遠心分離にかけ、水で洗浄し、２５％グ１ノ七ロールを含有す るＹＥＰＤ中に再懸濁し、そして放射能が作用を発揮するまで一７０℃で保存す る。細胞の生存率が１．５〜０．２％に低下する約４５〜５０日後に、それら細 胞のアリコートを２％マンノースを含有するＹＥＰアガー上にプレートＬ、３０ ℃でインキュベまず、タンパク質グリコジル化能が欠損した突然変異株を〔月１ 〕−マンノースを取り込まないて［３′Ｓ）−メチオニンを取り込むそれらの能 力について選択する。これを行うために、細月包をＹ　Ｅ　Ｐ　Ｄアガープレー ト上で増殖させ、それら酵母コロニーを２枚のロットバンドフィルター（Ｒｏｔ ｂａｎｄ　ｆｉｌｔｅｒ）　（シュレイノへ−・アンド・シュエル（Ｓｃｈｌｅ ｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｉｉｅｌｌ）、ダーセル、ドイツ）上に写し、そしてそ れらフィルターを再度ＹＥＰＤプレート上で６時間インキュベートする。次いで 、１枚のフィルターを０゜０１　ｍＣｉ／ｍＡ’　（’″Ｓ〕Ｓ〕−メチオニン するＹＥＰＤの溶液（その量はフィルターを湿らすのにちょうど足る量）中でイ ンキュベートする。もう１つのフィルターは、０．２ｍＣ１／ｍ／〔１Ｈ〕−マ ンノースを含有するＹＥＰを滲み込ませて３０分間インキュベートする。これら 細胞／コロニーを５％トリクロロ酢酸でそのフィルター上に固定化し、水及びア セトンで洗浄し、そしてオートラジオグラフィーによって分析する。

（本頁以下余白） ２．３　外部インベルターゼの天然ゲル電気泳動による陽性クローンの特徴付け Ｓ、セレビシェからの５ＵＣ２遺伝子は、調節されかつ区分された２種の異なる インベルターゼ型、っまり　ｉ）主として周縁細胞質内に分泌されるグリコジル 化インベルターゼ及びＩｉ）僅かに切形の（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）細胞内非グリ コジル化型をコードする（カールソン（Ｃａｒｌｓｏｎ、　Ｍ、）ら、　Ｍｏ１ ．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、３　（１９８３）　４３９−４４７）。インベルタ ーゼは、分泌された形で平均でインベルターゼサブユニット当たり１４の潜在的 Ｎ−グリコジル化部位を含有しており、そのうちの９〜ＩＯがグリコジル化され ている。外部野生型インベルターゼは、不均一な外路グリコジル化のために天然 ゲル内では広がったバンドとして移動する。対照的に、細胞質性非グリコジル化 型は活性染色後に鮮明なバンドを生じる。従って、Ｎ−グリコジル化の変化は、 天然ゲル中での外部インベルターゼの移動速度及びバンドの鮮明度によって大ま かに分析することができる。

これら酵母株（Ｘ２１８０−ＩＡ野生型株及び陽性クローン）を５ｍｌのＹＥＰ Ｄ培地（１％酵母エキス、２％バクトペプトン（ディフコ）及び２％スクロース ）中で一晩培養し、後期対数増殖期に採取し、２０ミリモル／ｌナトリウムアジ ドで１度洗浄し、そしてホイールミックスでの均質化によりガラスピーズで溶解 した。細胞溶解産物の調製、天然ゲル電気泳動、及びスクロースと２．３．４− トリニトロフェニルテトラゾリウム・クロリドを基質／グルコース試薬とするイ ンベルターゼの活性染色は、バルー（Ｂａｌｌｏｕ、　Ｃ，Ｅ、）の方法（Ｍｅ ｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１８５　（１９９０）　４４０−４７０）に従 って行った。

陽性クローンは、インベルターゼ活性染色に基づいて４クラスに分けることがで きる： ■、野生型インベルターゼ移動度を有する突然変異株２、非グリコジル化インベ ルターゼもグリコジル化インベルターゼも合成しない突然変異株 ３、外路グリコジル化能を欠損した突然変異株（３〜４バンドの明確に異なるオ リゴマー性バンドパターン）４、かなり不十分なインベルターゼのグリコジル化 をもたらす突然変異株（野生型インベルターゼよりも大きな移動度）。

稜工 以下においてｎ　ｇｄ　２９　（ＤＳＭ７０４２／７３３８）及びｎｇｄ６２　 （ＤＳＭ７１６０／７３４０）（ｎｇｄは、Ｎ−ｇｌＹｃＯｓｙｌａｌｉｏｎ− ｄｅｆｅｃｔｉＶｅ”　（Ｎ−グリコジル化能欠損）を表す）と名付けたクラス ４の突然変異株は、出発株Ｘ２１８０−ＩＡに比較して、均一にグリコジル化さ れたダイマー性外部インベルターゼ（活性染色後の天然ゲルにおける鮮明なバン ドと増加した移動度）を合成する。これらｎｇｄ突然変異株は浸透圧的に安定で あり、３０℃で培養することができ、かつ培養中に凝集しなかった。

実施例３ 同種及び異種タンパク質発現用グリコジル化能欠損酵母宿主株の構築 形質転換によって補足され得るｌ又は幾つかの栄養素要求性を導入するために、 ｎｇｄ突然変異株を、ジャーマン（Ｆ。

Ｓｈｅｒｍａｎ）らにより記載された方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　 Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ 　１ｌａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８１））に従って、適当な実験 室用株と掛は合わせ、顕微操作により二倍体株を単離した。続いて、これら二倍 体株に胞子を形成させて適当な栄養素要求性（例えば、ｕｒａ３．１ｃｕ２）及 びｎｇｄ突然変異を有する分離個体を単離した。

これを行うために、ｎｇｄ２９突然変異株をＤＢＹ７４６株（ＭＡＴａ　ｕｒａ ３−５２　１ｅｕ２−３、−１１２　ｔｒｐｌ−２８９α　ｈｉｓ３−Δｌ；Ａ ＴＣＣ４４７３３に相当する（０３Ｍ４３１　（＋３）と−緒にインキュベート し、ｎｇｄ０２突然変異株をＪＭ１９３５株（ＭＡＴａ　ｕｒａ３　１ｅｕ２　 ｈｉｓ４、ＤＳＭ７１５６）と−緒に３０℃で６時間、ＹＥＰＤ（１％酵母エキ ス、２％バクトペブトン（ディフコ）及び２％グルコース）中でインキュベート した。続いて、顕微操作器（ドイツ、ロイトリンケンのバクホファー（Ｂａｃｈ ｈｏｆｅｒ）社からのデ・フォンブルーネ（Ｄｅ　Ｆｏｎｂｒｕｎｅ）に適合す るモデル）を用いて接合子を単離し、５ｍｆのＹＥＰＤ中で一晩増殖させた。そ れら細胞を簡単に遠心分離し、培地をデカンテーションして約０．２　ｍ　ｌを 残し、そして細胞ペレットを残留培地中に再懸濁した。この細ガー）上にプレー トした。はぼ５日経過した後、このようにして得られた子嚢を接種ループを用い て０．５　ｍ　ｌの滅菌水中に再懸濁し、ｌＯμｌのβ−グルクロニダーゼ／ア リールスルファターゼ混合物（ベーリンガー・マンハイム）を添加し、そしてそ れを室温で１０分間インキュベートした。続いて、１０ｍ１の水を添加し、この 子嚢懸濁液を遠心分離し、そしてその上澄み液をデカンテーンジンした。幾つか の子嚢の胞子を顕微操作器で単離してＹＥＰＤプレート（１，５％アガーを含有 するＹＥＰＤ）上で３０℃で３日間インキュベートした。生育し始めた胞子から レプリカプレートを調製し、それらコロニーを合成最小培地（アミノ酸を含まな い０．６７％酵母窒素原基礎培地（ディフコ）；２％グルコース：■、５％アガ ー十添加物：　２０ｍｇ／ｆＴｒｐ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｍｅ　ｔ　；　３０ｍｇ ／ＩＬｅｕ、Ｉ　Ｉｅ、Ｌｙｓ　；　５０ｍｇ／１Ｐｈｅ；　１００ｍｇ／ＩＧ ｌｕ、Ａｓｐ；４００ｍｇ／ｆＶａ１、Ｔｈｒ、Ｓｅｔ並びに２０ｍｇ／ｌアデ ニン及びウラシル；これら添加物のうち１種が個々の最小培地のそれぞれにおい て省略されている）上に押し当て、３０℃で３日間インキュベートした。ウラノ ル及びロイシンに対して栄養素要求性を有するｎｇｄ２９表現型を有する分離個 体を実施例２，２に記載した通りに分析／単離した。このｎｇｄ２９表現型（並 びにｎｇｄ６２表現型）は、検査した全ての四分子において２：２に分離した。

これは、１個の核遺伝子座中の１個の突然変異を示している。

ＢＭＹ　３−９　Ａ及びＮ−ＢＭＹ３−９Ａ株（ＭＡＴ（Ｚ　１ｅｕ２−３、− １１２　ｕｒａ３−５２　ｈｉｓ３−ΔＩ　ｎｇｄ２９、ＤＳＭ７０４２及び０ ３Ｍ７３３８）及びＢＭＹ３−９Ｃ及びＮ−ＢＭＹ３−９Ｃ株（ＭＡＴａ　Ｉｅ ｕ２−３、−１１２ｕｒａ３−５２　ｎｇｄ２９；ＤＳＭ７１９３及び０３Ｍ７ ３４１）をここに記載したＤＢＹ７４ＧＸｎｇｄ２９の掛は合わせから得た。

ＢＭＹＩ２−２０Ｄ及びＮ−ＢＭＹＩ　２−２０Ｄ株（ＭＡＴａＩｅｕ２　ｕｒ ａ３　ｈｉｓ４　ｎｇｄ６２；ＤＳＭ７１６０及び０３Ｍ７３４０）を同じよう にしてＪＭＩ　９３５Ｘｎｇｄ６２の掛は合わせから得た。

実施例４ Ａ、ニガーからのＧＯＤは、天然に分泌されるグリコジル化ダイマー性酵素であ る。サブユニット当たり８つの潜在的Ｎ−グリコツル化部位（シークオン（ｓｅ ｑｕｏｎ））と２つがジスルフィド橋を形成している３つのシスティン残基が存 在している。Ｓ、セレビンエ野生型株内で発現されるＣＯＤは培地中に分泌され 、不拘−外路グリコシル化（高グリコジル化）のために分子量に関して非常に雑 多な成分からなる（フレデリックら（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、　Ｋ、Ｒ，）。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６５　（１９９０）　３７９３−３８０２　 ；デ・バエトセリアー（Ｄｅ　Ｂａｅｔｓｅｌｉｅｒ、Ａ、）　ら、Ｂｉｏｔｅ ｃｈｎｏｌｏｇｙ　９　（１９９１）　５５９−５６１　：ライティンテン（Ｗ ｈｉｔｔｉｎｇｔｏｎ、　Ｈ，）ら、　Ｃｕｒｒ、　Ｇｅｎｅｔ、　１８　（１ ９９０）５３１−５３６）。切断（２２アミノ酸長のシグナル配列の開裂）され たＡ、ニガーＣＯＤタンパク質は、６３，２７３Ｄａの潜在的分子量を有する５ ８３アミノ酸からなる（フレデリック（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ。

Ｋ、　Ｒ，）　ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６５　（１９９０）　３７９３ −３８０２）。

プラスミドＹＥｐＬ／Ｃ０Ｄ（実施例１．５）及びＹＥｐ／Ｃ０Ｄ−（Ｈｉｓ） 、（実施例１．６）を野生型株ＪＭＩ　９３５　（ＭＡＴａ　１ｃｕ２　ｕｒａ ３　ｈｉｓ４　ＭＡＬ４）ＤＳＭ７１５６　Ｎ−ＢＭＹ３−９Ａ又はＢＭＹ３− ９Ａ　Ｃ実施例３を参照のこと）内に形質転換して、それら形質転換体を、１． ５％アガロース、０．６７％ＹＮＢ　（酵母窒素源基礎培地、塩−ビタミン混合 物（ディフコ）　）　、０．５％ＣＡＡ　（カザミノ酸、タンパク質加水分解物 （ディフコ））及びＣ供給源として２％フルクトースを含有する最小培地アガー プレート上で選択した（ウラジル選択）。

４．１　ＣＯＤ形質転換体の培養 プラスミドコピー数を増幅（プラスミドコード化ＬＥＵ２ｄ対立遺伝子の選択； ベッグス（口ｅｇｇｓ、　Ｊ、Ｄ、）、　Ｎａｔｕｒｅ　２７５　（１９７８） ＋０４−＋０９　；エルハート（Ｅｒｈａｒｔ、　Ｅ、）とホーレンベルグ（ｌ ｌｏｌｌｃｎｂｃｒｇ、　Ｃ，Ｉ’、）、　Ｊ、　１ｌａｃＬｃｒｉｏ１．　１ ５Ｇ　（１０８３）　０２５−Ｇ３５）するために、形質転換体をロイシンを含 まない最小培地プレート（１゜５％アガロース、０．６７％ＹＮＢ　（ダイマ： ｌ）　、６０ｍｇ／ｌアデニン及び２％フルクトース）上に塗った。

０．６７％ＹＮＢ及び４％フルクトースを含有する農産フラスコ内のロイシン選 択培地中で３０℃で４８時間予備培養を行い、発現培養物を接種するのに用いた （接種物＝１〜２％）。主培養物（］　ＰＮ盪培養物）を、２％酵母エキス、４ ％バクトペブトン（ディフコ）　、０．１モル／ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７，０） 、１％フルクトース及び６％マルトースを含有する完全培地中で３０℃で３〜４ 日間震盪農産がらインキュベートした。４８時間及び７２時間後にサンプルを取 り、細胞溶解後の粗製抽出物中の細胞増殖（６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ 、、。）の測定）、培地中に分泌されるＣＯＤ活性、及び細胞内の残存ＣＯＤ活 性を測定した。

野生型株ＤＳＭ７１５６及びグリコジル化能欠損宿主株ＤＳＭ？プラスミド：Ｙ ＥｐＬ／ＧＯＩ） 細胞外　８　１３　１２　１７ 細胞内　４６ 合計　１２　１８ 分泌（％）　ＧＧ　０Ｇ プラスミド：ＹＥｐＬ／ＣＯＤ 細胞外　＋１９　１８１４ 細胞内　１２ 合計　１２　２０ 分泌（％）　８７　９０ 野生型株ＤＳＭ７１５６及びグリコジル化能欠損宿主株ＤＳＭ７０４２／ＤＳＭ ７３３８内でのＣ０Ｄ−（Ｈｉ　ｓ）　４の発現／分泌分析 プラスミド：　ＹＥｐＬ／Ｃ０Ｄ−（Ｈｉ　ｓ）。

細胞内　５６ プラスミド：　ＹＥｐＬ／ＣＯＤ 細胞内　］’　１ 発現及び分泌に関してＣＯＤとＣＯＤ　−（Ｈｉ　ｓ）　、変異体の間には有意 な差は見出されなかった。

４．２　分泌ＣＯＤの５ＤＳ−ＰＡＧＥグリコジル化能欠損宿主株ＤＳＭ７０４ ２／７３３８　（ｎｇｄ２９）及びＤＳＭ７１６０／７３４０　（ｎｇｄ６２） 内で発現（培地内に分泌）されたＣＯＤ　−（Ｈｉ　ｓ）　、酵素を野生型株Ｄ ＳＭ７１５６内で発現（分泌）された酵素及びＡ、ニが−からの精製ＧＯＤ　Ｃ ベーリンガー・マンハイム、ＧＦＲ）の特徴を５Ｏ３−ｆ”ＡＧＥ及びそに続く タンパク質染色により更に明らかにした。ＣＯＤを含有する野生型株からの培地 上澄み液をＴＣＡ沈降によって１０倍に濃縮して電気泳動に付した。炭水化物を 含まな１、＋に　ＯＤ　（Ｈｌｓ　）　＊酵素をＮ−グリコシダーゼＦを用いて 酵素的に調製してサイズ用スタンダードとして用いた。

Ｎ−グリコシダーゼＦでの酵素的脱グリコジル化脱グリコジル化をハーゼルベツ ク（Ｈａｓｅｌｂｅｃｋ、　Ａ、）とフーゼル（ｌｌｏｓｅｌ、　Ｗ、）により 公表された方法（Ｔｏｐｉｃｓ　１ｎＢｉｏｃｈｅ＋＋＋１ｓｔｒｙ　８　（ｉ ９８８）　１−４）に従って行った。０．１ｍｆ培地上澄み液中に含まれるＣＯ Ｄ　（Ｈ４ｓ）　＋をトリクロロ酢酸（最終濃度＝ｌθ％）で沈降させ、沈降し たタンパク質を遠心分離し、そのタンパク質ペレットを７０％エタノールで洗浄 し、減圧乾燥し、１％ＳＤＳを含有するｌＯμｌの２０ミリモル／ｌリン酸カリ ウム緩衝液（ｐＨ７，２）中に吸収させて９５℃に３分間加熱した。室温に冷却 したあと、そのサンプルを２０ミリモル／７！リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７， ２）、オクチルグルコシド（最終濃度＝０．５％）及び５ユニツトのＮ−グリコ シダーゼＦで０．１ｍｌに希釈し、３７℃で１〜１２時間インキュベートし、続 いて２５Ｊ１ｅの５ＸＳＤＳ緩衝液（上記を参照のこと）を添加した。

結果 グリコリル化能欠損ｎｇｄ突然変異株内で発現されたＣＯＤ酵素（ＣＯＤ及びＧ ＯＩ）　−（Ｈｉ　ｓ）　、）が、タンパク質染色後は５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル中 で約８０ｋＤａの分子量を有する優勢な均一バンドとして目視てきる。この実験 は、これらＣＯＤ酵素酵素外路グリコジル化が存在しないことを示すと共に均一 なコア様グリコジル化を示唆している。グリコジル化に関し、これらｎｇｄ突然 変異株はｍｎｎ０様表現型を有している。対照的に、野生型株内で発現されたＣ ＯＤ酵素は、約８０〜２００　ｋＤａの分子量範囲に跨がる非常に広いバンドと して認識可能であるに過ぎない。

実施例５ オルトバナジウム酸塩又はヒグロマイシンＢを含有するＹＥＰＤアガープレート 上での増殖に基づくＮ−グリコジル化能欠損ｎｇｄ突然変異株の特徴付は 例えば、ｍｎｎ８、ｍｎｎ９及びｍｎｎ１Ｏの如きグリコジル化能欠損突然変異 株は、オルトバナジウム酸塩に対する増加した耐性と抗生物質ヒグロマインンＢ に対する増加した感受性とを示す。この耐性／感受性表現型により、Ｎ−グリコ ジル化能欠損突然変異抹の区分／分類が可能になる（バルー（Ｂａｌｌｏｕ、　 Ｌ、）ら。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｊｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ、８Ｂ　（１９９１）　３２０９−３２ １２）　。

検査する株を’Ｉ’　Ｅ　Ｐ　Ｄ培地中で一晩培養（５ｍｌの回転培養）して、 株、／培養物をＹＥＩ’Ｄ培地で正確に０．０５の光学密度ＯＤ７．）に調節し た。そのあと、それぞれ２０μｌの細胞懸濁液を２〜１５ミリモル／１オルトバ ナジウム酸ナトリウム又はｌＯ〜２００μｇ　／　ｍ　１ヒグロマイシンＢを含 有するＹＥＰＤアガープレート」二にスポツティングした。細胞スポットの増殖 は、３０℃での２日間のインキュベーション後に評価した（表を参照のこと）。

オルトバナジウム酸ナトリウム又はヒグロマイシンＢを含有するＹ　Ｅ　Ｐ　Ｄ アガープレート上での酵母細胞の増殖表現型ＤＩＩＹ７４Ｇ　（Ｗ）　＋　＋　 ＋　４　−　−　−　−　＋　＋　−−Ｘ２１８０−１八　（Ｗ）　＋　＋　＋ 　＋　−−−−＋　＋　−−Ｌ口３４７−ＩＣ（ｍｎｎ９）”　＋　＋　＋　＋ 　＋　＋　ｉ　＋　−−−−ＢＭＹ３−９Ａ（ｎｇｄ２９）　＋　＋　＋　＋　 ＋　−−−十　±　−−ＢＭＹ１２−２０Ｄ　（ｎｇｄ６２）　＋　＋　十　± −−−−十　±　−−Ｎ−ＢＭＹ３−９Ａ　（ｎｇｄ２９）　＋　＋　＋　＋　 ＋　−−−十　±　−−Ｎ−ＢＭＹ１２−２０Ｄ　（ｎｇｄ６２）　＋　＋　十 　±−−−一　十　±　−−＋　増殖 ±　非常に遅い増殖 −増殖しない １）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５９　（１９８４）　３８０５−３８ １１Ｗ　野生型 結果 これらｎｇｄ突然変異株間には耐性パターンに関してｍｎｎ９突然変異株と野生 型株のものとは異なる相違がある。

実施例６ ｎｇｄ突然変異株の特徴付け／同定（対立性試験）対立性試験は、遺伝子と遺伝 子欠損（突然変異）を同定（区別）するのに役立つ。この方法で、２つの突然変 異株が対立性（同じ遺伝子内に突然変異を有する）であるか否かを分析すること が可能である。これらｎｇｄ突然変異株を互いの間の対立性及びｍｎｎ９突然変 異株に対する対立性について検査した。

遺伝的標準方法によって対立性試験を行った（ジャーマン（Ｓｈｅｒｍａｎ、　 Ｆ、）　；フィフク（Ｆｉｎｋ、　Ｇ、Ｒ，）　；ヒックス（旧ｃｋｓ、　Ｊ。

Ｂ、）、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：　Ａ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙ ｏｒｋ（＋９８１）　；ブチリ−（ＧｕＬｈｒｉｅ、　Ｃ，）とフィフク（Ｆｉ ｎｋ、　Ｇ、Ｒ，）編。

Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ ｒ　Ｉｌｉｏｌｏｇｙ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎＥｎｚｙ＋＋ｏ１．１９４　（ １９９１））。

原理： 互いに補い合う栄養素要求性を有する異なる対合型（ｐａｉｒｉｎｇｔｙｐｅ） の２種の被分析−培体突然変異株を掛は合わせて、最小培地を育するプレート上 でその二倍体株を選択する。単離した株の二倍体性は、フクシレイ（ｌｌｕｘｌ ｅｙ、　Ｃ，）らの方法（Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ。

６　（１９９０）　２３６）に従うＰＣＲ分析を用いて、ａ及びα対合型に特異 的なりＮＡ配列の存在により確認される。

突然変異が二倍体細胞内で互いに補い合わないときは、２つの突然変異株は対立 性である、即ち、同じ遺伝子内に突然変異を有する。

突然変異が二倍体細胞内で互いに補い合いかつ野生型の表現型を生しるときは、 ２つの突然変異株は対立性ではない、即ち、異なる２つの遺伝子内に突然変異を 有する。

用いた株： ＢＭＹ３−９Ｃ（ＭＡＴａＩｅｕ２−３．−１１２　ｕｒａ３−５２　ｎｇｄ２ ９）　ＤＳＭ　７１９３ＢＭＹ８−１２Ａ　（ＭＡＴａ　ｔｒｐｌ−２８９”　 ｈｉｓ３−Δｌ　ｎｇｄ６２）　ＤＳＭ　７１５７ＢＭＹＩ３−１ｃ　（ＭＡＴ ａｕｒａ３−５２１ｅｕ２−３．−１１２　ｈｉｓ３−Δｌ　ｍｎｎ９）ＤＳＭ 　７１５９ ＢＭＹ１３−７Ｂ　（ＭＡＴａ　１ｅｕ２−３．　−１１２　ｈｉｓ３−Δ１　 ｍｎｎ９）　ＤＳＭ　７１５８ＢＭＹＩ２−２００　（ＭＡＴａＩｅｕ２　ｕｒ ａ３　ｈｉｓ４　ｎｇｄ６２）　ＤＳＭ　７１６ＯＮ−ＢＭＹ３−９Ｃ（ＭＡＴ ａＩｅｕ２−３．−１１２　ｕｒａ３−５２　ｎｇｄ２９）　ＤＳＭ　７３４１ Ｎ−ＢＭＹ１３−１ｃ　（ＭＡＴａ　ｕｒａ３−５２１ｅｕ２−３．−１１２　 ｈｉｓ３−Δｌ　ｍｎｎ９）ＤＳＭ　７３３９ ＢＭＹ１２−２００　（ＭＡＴα１ｅｕ２　ｕｒａ３　ｈｉｓ４　ｎｇｄ６２） 　ＤＳＭ　７３４０（本頁以下余白） 口ＭＹ３−４１Ｃｘ　［１ＭＹ８−１２八　ｎｇｄ２９　Ｘ　ｎｇｄ［ｉ２　ｈ ｉｓ　ｌｃｕ　野生型口ＭＹ３−！ＩＩｃ　Ｘ　ロＭＹ１３−７８　ｎｇｄ２９ 　Ｘ　ｍｎｎり　ｈｉｓ　ｕｒａ　野生型口ＭＹＩ３−１ｃＸ　ＢＭＹ８−＋２ 八　ｍｎｎ９　ｘ　ｎｇｄ６２　Ｌｒｐ　ｕｒａ　野生型ＩＩＭＹＩ２−２０Ｄ 　Ｘ　ＢＭＹ１３−７１１　ｎｇｄ６２　ｘ　ｍｎｎ９　ｈｉｓ　野生型Ｎ−Ｂ ＭＹ３−９ＣＸ　ＢＭＹ８−１２Ａ　ｎｇｄ２９　ｘ　ｎｇｄ６２　ｈｉｓ　ｌ ｅｕ　野生型Ｎ−ＢＭＹ３−９ＣＸ　ＢＭＹＩ３−７Ｂ　ｎｇｄ２９　ｘ　ｍｎ ｎ９　ｈｉｓ　ｕｒａ　野生型Ｎ−ＢＭＹ１３−ＩＣＸ　Ｂ）１１Ｙ８−１２八 　ｍｎｎ９　Ｘ　ｎｇｄ６２　ｔｒｐ　ｕｒａ　野生型Ｎ−ＢＭＹＩ２−２００ 　Ｘ　ロＭＹＩ３−７０　ｎｇｄ０２　Ｘ　ｍｎｎＱ　ｈｉｓ　野生型ＳＣ＝合 成完全培地（アミノ酸を含まない０．６７％酵母窒素原基礎培地（ディフコ）： ２％グルコース：１．５％アガー十添加物＝２０ｍｇ／ｆｆＴｒｐ、Ｈｉ　ｓ、 Ａｒｇ、Ｍｅ　ｔ　；　３０ｍｇ／ＩＬｅｕ、Ｉ　ｌ　ｅ、Ｌｙｓ　；　５０ｍ ｇ／１Ｐｈｅ　；　１００ｍｇ／ｆＧＩｕ、Ａｓｐ＋４００ｍｇ／ｊ！Ｖａ１． Ｔｈｒ、Ｓｅｒ並びに２０　ｍ　ｇ　／　ｌアデニン及びウラシル；この表にお いて“二倍体の選択”と見出しを付けた欄に記載したように、個々の最小培地に おいてアミノ酸Ｕｒａ、Ｈｉｓ及びＴｒｐを省略した）結果： 突然変異株ｎｇｃ１２９とｎｇｄ６２は互いに相違しかつｍｎｎ９とも相違して いる（非対立性）。

実施例７ 野生型及び高グリコノル化能欠損酵母株からのＣＯＤ及びＣ０Ｄ（＋（＋ｓ）＋ の単離 ７．１　金属キレートクロマトグラフィーによるＣ　ＯＤ　−（ｌｌｉｓ）、の 単離 ＣＯＤ変異体であるＣＯＤ　−（Ｈｉ　ｓ）　、をこの単離法を用いてＢＭＹ　 ３−９　Ａ／ＣＯＤ　−（Ｈｉ　ｓ）　、細胞及びＢＭＹ１２−２０　Ｄ／Ｃ０ Ｄ−（Ｈｉ　ｓ）　、細胞（高グリコジル化能欠損宿主株）の培養濾液から単離 した。

培養濾液を水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７，５まで滴定して１０ミリモル／ｌリ ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，５）で平衡にしたＮＴＡカラム（カラム容量２５ ｍ１；ジュッセルドルフのダイヤケン（Ｄｉａｇｅｎ）社からのＮＴＡゲル；ホ フリ　（ｔ（ｏｃｈｌｉ、　Ｅ、）ら、Ｊ。

Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　４１１　（１９８７）　１７７−１８４；ホフ リら。

Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６　（１９８８）　１３２１−１２３５　）に適 用した。このカラムをｌＯモミ９モルｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，５）中 の５〜１０カラム容量の１モル／ｌ塩化ナトリウム及び５〜１０カラム容量のＩ Ｏミリモル／ｐリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，５）で再洗浄した。そのあと、 ＣＯＤ　−（Ｈｉ　ｓ）　、酵素を平衡用緩衝液（ｐＨ７，５）中の０．１モル ／ｌイミダゾールで溶出させ、Ｃ０Ｄ（Ｈ＋ｓ）ｔを含有する画分（黄色）を１ ０ミリモル／１リン酸カリウム緩衝液（１）Ｈ７，５）に対して透析した。

７．２　濃縮及び透析後のＱ−セファロースｆｆでのイオン交換クロマトグラフ ィーによるＧＯＤ及びＧＯＤ変異体の単離天然ＣＯＤ及び高グリコノル化ＧＯＤ をこの方法に従って精製した。

３３ｇの固体硫酸アンモニウム（ＡＳ飽和濃度５５％）をゆっくり攪拌しながら １００ｍｌ滅菌濾過培養濾液に添加し、室温で１〜２時間インキュベーションし た後に沈降したタンパク質を遠心分離し、２５ｍｆの２５ミリモル／ｌリン酸カ リウム緩衝液（ｐＨ７，５）中に溶解させて同緩衝液に対して透析した（４Ｘｌ Ｏｐ、２４時間、４℃）。

続いて、この透析物を２５ミリモル／ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，５）で 平衡にしたＱ−セファロースｆｆカラム（カラム容ＪＩＩ２ｒｒ＋１）に適用し て５〜ＩＯカラム容量の平衡用緩衝液で再洗浄した。結合したＣＯＤ酵素を０〜 １モル／Ｉ　ＫＣｌの濃度勾配の平衡用緩衝液（約ＩＯカラム容量）により溶出 させ、Ｇ。

Ｄ（黄色）を含有する両分をプールした。

ＣＯＤ活性の測定は“一般的方法”の章に記載した通りの行われる。

（本頁以下余白） Ａ、ニガー、Ｓ、セレビシェ（野生型）及びＳ、セレビシェ（高グリコジル化能 欠損突然変異株）内で発現されたＣＯＤ及びＧＯＣＯＤ　（ＷＴ）　２３０　６ ９ ＣＯＤ　（ｎｇｄ２９）　２２８　１９６ＣＯＤ　（ｎｇｄ０２）　２１３　２ ２０ＣＯＤ−（ｌｌｉｓ）、（ＷＴ）　２２０　６８ＣＯＤ−（Ｉｌｉｓ）ｌ　 （ｎｇｄ２９）　２２３　２００ＣＯＤ−（Ｉｌｉｓ）、（ｎｇｄＧ２）　２３ ０　２２５Ａ、ニガー、Ａ、ニガーからのＧＯＤ、純度Ｉ＋（ベーリンガー・マ ンハイム） ＷＴ、　Ｓ、セレビシェ野生型 ｎｇｄ２９．Ｓ、セレビシェ高グリコジル化能欠損ｎｇｄ２９突然変異株 ｎｇｄ６２．Ｓ、セレビシェ高グリコジル化能欠損ｎｇｄ６２突然変異株 ８．２　３ＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分 子量の測定 精製ＣＯＤ酵素を１１５容量の５ＸＳＤＳサンプル緩衝液（ｌＸＳＤＳサンプル 緩衝液：５０ミリモル／ｌトリスーＨＣ１（ｐＨ６，８）、１％ＳＤＳ、１％メ ルカプトエタノール、１０％グリセロール、０．００１％ブロモフェノールブル ー）と混合して９５℃で５分間インキュベートした。そのあと、これらタンパク 質を５ＤＳ−ｒ’ＡＧＥ　（ラエムリ　（Ｌａｃｍｍｌｉ）、　Ｕ、Ｋ１．　Ｎ ａｔｕｒｅ　２２７（１！１７０）　（＋８Ｏ−６８５）によって分離してクマ シーブリリアントブルー色素で染色した。

Ａ、ニガー、Ｓ、セレビシェ（野生型）及びＳ、セレビシェ（高グリコノル化能 欠損突然変異株）内で発現されたＣＯＤ及びＧ。

Ｄ　（Ｈ＋　Ｓ）　！の５ＤＳ−ＰＡＧＥ後の分子量／サブユニットＣＯＤ　（ ＷＴ）　８０−１４０ ＣＯＤ　（ｎｇｄ２９）　約８０ ＣＯＤ　（ｎｇｄ６２）　約８０ ＣＯＤ−（ｔ（ｉｓ）、（ＷＴ）　８０〜Ｉ　４０ＣＯＤ−（ｌｌｉｓ）、（ｎ ｇｄ２９）　約８０Ａ、二カー、Ａ、二カーからのＣＯＤ、純度１］（ベーリン ガー・マンハイム） ＷＴ　、　Ｓ、セレビシェ野生型 ｎｇｄ２９．Ｓ、セレビシェ高グリコリル化能欠損ｎｇｄ２９突然変異株 ｎｇｄ６２．Ｓ、セレビンエ高グリコノル化能欠損ｎｇｄ６２突然変異株 ８．３　炭水化物部分の測定（アンスロン反応）異なる微生物及び酵母株からの ＣＯＤ酵素の炭水化物部分をアノユベル（Ａｓｈｗｃｌｌ、　Ｇ、）の方法（Ｍ ｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　３　（１９５７）８・１）に従って測定した 。

これを行うために、０．５　ｍ　ｌの精製ＣＯＤ酵素（水中濃度２０〜１００Ｕ ／ｍｆ）を５ｍｆｆのアンスロン試薬と混合し、その溶液を２５℃で５分間イン キュベートした後、沸騰水浴中で１５分間加熱した。サンプルを２５℃に冷却し た後、６３０ｎｍの吸光度をブランク試薬に対して測定した。このＣＯＤサンプ ル中の炭水化物部分を、同時に作った５、２５．７５及び１００μｇ／ｍｒマン ノースのマンノーススタンダード溶液でのマンノース検量線によって測定した。

アンスロン試薬の調製 ６６ｍ１の濃硫酸を３４ｍ１の水で注意して希釈する。８０℃に冷却後、５０ｍ ｇのアンスロンと１ｇのチオ尿素をこの硫酸中に溶解する。このアンスロン試薬 は４℃で２週間保存できる。

（本頁以下余白） Ａ、ニガー、Ｓ、セレビシェ（野生型）及びＳ、セレビシェ（高グリコジル化能 欠損突然変異株）内で発現されたＣＯＤ及びＧ。

Ｇ　Ｏ＋）　（＾、ニガー）１３ ＣＯＤ　（ＷＴ）　７１ ＣＯＤ　（ｎｇｄ２９）　１２．５ ＣＯＤ　（ｎｇｄ６２）　Ｉ　３ ＣＯＤ−（ｌｌｉｓ）、（ＷＴ）　６５ＣＯＤ−（Ｈｉｓ）、（ｎ　ｇｄ　２９ ）　Ｉ　１ＣＯＤ−（Ｉｌｉｓ）４　（ｎｇｄＧ２）　１２八、ニカー、Ａ、ニ ガーからのＧＯＤ、純度１１（ベーリンガー・マンハイム） ＷＴ、　Ｓ、セレビシェ野生型 ｎｇｄ２９．Ｓ、セレビシェ高グリコジル化能欠損ｎｇｄ２９突然変異株 ｎｇｄ６２．Ｓ、セレビシェ高グリコジル化能欠損ｎｇｄ６２突然変異株 ８．４　Ｋｍ値の測定 種々のＣＯＤ酵素のＫｍ値をマイケル（Ｍｉｃｈａｌ、　Ｇ、）の説明書（Ｍｅ ｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ、　Ｖｏｌ、Ｉ、ベ ルグマイヤ−（Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ、　Ｉｌ、　Ｕ、　）編“Ｖｅｒｌａｇ　Ｃ ｈｅｍｉｅ　Ｗｅｉｎｈｅｉｍ”、　ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　 Ｙｏｒｋ及びＬｏｎｄｏｎ、　ｐｐ、１４４−１５６　（１９７４）に従って測 定した。

Ａ６ニガー、Ｓ、セレビシェ（野生型）及びＳ、セレビシェ（ｎｇｄ２９突然変 異株）内で発現されたＣＯＤ及びＣ０Ｄ−（ＨｉＧＯＤ　（Ａ、ニガー）　０． ０３ ＣＯＤ　（ＷＴ）　０．０３ ＣＯＤ　（ｎｇｄ２９）　０．０３ ＣＯＤ−（Ｉｌｉｓ）ｌ（ＷＴ）　０．０３＾、ニガー、Ａ、ニガーからのＧＯ Ｄ、純度１１（ベーリンガー・マンハイム） ＷＴ、　Ｓ、セレビシェ野生型 ｎｇｄ２９．Ｓ、セレビシェ高グリコジル化能欠損ｎｇｄ２９突然変異株 （本頁以下余白） ８．６　Ａ、ニか−、Ｓ、セレビシェ（野生型）及びＳ、セレビシェ（ｎｇｄ２ り突然変異株）内で発現されたＣＯＤ及びＣ０Ｄ−（Ｉｌｉｓ）、の熱安定性の 測定 種々のＣＯＤ酵素の熱安定性を示差走査熱量分析（ＤＳＣ）によって測定した。

これを行うために、ＣＯＤ酵素の変性点（Ｔｍ）を、規定溶媒（１１□０）中、 規定ＣＯＤタンパク質濃度（２０ｍｇ／ｍｎ）及び規定加熱速度（１０°Ｃ／分 ）で測定した（表を参照のこと）。

Ａ、ニガー及びＳ、セレビ／工（ｎｇｄ２９突然変異株）内で分圧・されたＣＯ Ｄ及びＣＯＤ　−（ＩＩ　ｉ　ｓ）　、の（ＤＳＣスペクトルＣＯＤ　（ｎｇｄ ２９）　７４．７ Ａ、二カー、Ａ、ニガーからのＧＯＤ、純度ＩＩ（ベーリンガー・マンハイム） ｎｇｄ２９．Ｓ、セレビンエ高グリコジル化能欠損ｎｇｄ２９突然変異株 Ａ、ニガー及びＳ、セレビシェ（ｎｇｄ２９突然変異株）内で発現されたＣＯＤ 及びＣＯＤ　−（ｌ−１ｉ　ｓ）　、の５５℃での熱ストレス後の残留ＣＯＤ活 性 熱安定性を測定するために、種々のＣＯＤ酵素を５５℃で０．２モル／ｅリン酸 ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，５）中２５Ｕ／ｍｉ＋の濃度でインキュベートし、 ２時間後に残留ＣＯＤ活性を一般的方法の章に記載した通りに測定した。

Ａ、ニガー、Ｓ、セレビシェ（野生型）及びＳ、セレビシェ（ｎｇｄ２９突然変 異株）内で発現されたＣＯＤ及びＣ０Ｄ−（ＩｌｉＳ）＋の鴫ストレス後の残留 ＣＯＤ活性ＣＯＤ　（ＷＴ）　４０ ＣＯＤ　（ｎｇｄ２９）　４０ Ａ、ニガー、Ａ、ニガーからのＣＯＤ、純度ＩＩ（ベーリンガー・マンハイム） ＷＴ、　Ｓ、セレビシェ野生型 ｎｇｄ２９．Ｓ、セレビシェ高グリコジル化能欠損ｎｇｄ２９突然変異株 ８．７　Ａ、ニガー及びＳ、セレビシェ（ｎｇｄ２９突然変異株）内で発現され たＣＯＤ及びＣＯＤ　−（Ｈｉ　ｓ）　、のｐｌ−１安定性の測定 種々のＣＯＤ酵素のＩ）　Ｈ安定性をＤＳＣによって測定する。これを行うため に、ＣＯＤ酵素の変性点（Ｔｍ）を、ｐＨ値に関連させて規定溶媒（ｐ　Ｈ値３ ．５〜６．５用の１００ミリモル／ｌクエン酸緩衝液及びｐ　ＩＩ　Ｉｐ′ｔ７ ．５〜９．５用の１００ミリモル／ｌホウ酸緩衝液）中、規定ＣＯＤタンパク質 濃度（２５ｍｇ／ｍｌ）及び規定加熱速度（１０℃／分）で測定した。

結果： 高グリコノル化能欠損ｎｇｄ２９突然変異株から単離したＧ。

Ｄ及びＣ０Ｄ−（１１ｉ　ｓ）　、は、ｐｔｔ安定性に関して天然アスペルギル ス・ニガーＧＯＤのように挙動する。

ｒ（１行物。

ベノカース（Ｂｅｋｋｅｒｓ、　Ａ、Ｃ，Ａ、Ｐ、Ａ、）：フランケン（Ｆｒａ ｎｋｅｎ、　Ｐ、Ａ。

Ｐ、）：’７７：／−デン・ベル７（Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｅｒｇｈ、　Ｃ，Ｊ、 ）　；バーバラケル（Ｖｅｒｂａｋｅｌ、　Ｊ、　Ｍ、　Ａ：　）　；バーヘイ （Ｖｅｒｈｅｉ　ｊ、　１１．　Ｍ、　）　：デ＋＋ハース（Ｄｃ　ｌ１ａａｓ 、　Ｇ、１１．）　：サツカロミセス・セレビシェによるブタ膵臓ホスホリパー ゼＡ２の効率的産生を得るための遺伝子工学の使用。旧ｏｃｈｃｍ、　Ｂｉｏｐ ｈｙｓ、　Ａｃｔａ　１０８９．３４５−３５１　（１９９１）。

バルー（Ｂａｌｌｏｕ、　Ｌ、　）　；コーエン（Ｃｏｈｅｎ、　Ｒ，Ｅ、　） 　；バルー（［１ａｌｌｏｕ、　Ｃ，Ｅ、）：切形の炭化水素外路を有するマン ノタンパク質を作るサツカロミセス・セレビシェ突然変異株。Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｎ＋、　２５５．５９８６−５９９１　（１９８０）。

バルー（Ｂａｌｌｏｕ、　Ｃ，Ｅ、　）　：酵母細胞壁及び細胞表面。ストラサ ーン（Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ、　Ｊ、Ｎ、）　；ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ、　Ｅ、 　Ｗ、　）　；ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ、　Ｊ、Ｒ，）編、　Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅ ｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＹｅａｓｔＳａｃｃｈａｒｏｍｙ ｃｅｓ、　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅ　［！ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ 、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　 Ｙｏｒｋ、　ｐｐ、３５５−３６０　（１９８２）において。

バルー（Ｂａｔ　ｔａｕ、　Ｌ、　）　；アルバラード（Ａｌｖａｒａｄｏ、　 Ｅ、　）　；ツァイ（Ｔｓａｉ、　Ｐ、）　；デル（Ｄｅｌｌ、　Ａ、）　；バ ルー（Ｂａｌ　ｌｏｕ、　Ｃ，Ｅ、　）　：サツカロミセス・セレビンエｍｎｎ ７突然変異株クラス内のタンパク質グリコジル化能欠損。Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ ｈｅｍ、　２６４．１１８５７−１１８６４（＋９８９）。

バルー（Ｂａｌｌｏｕ、　Ｃ，Ｅ、）・非条件タンパク質グリコジル化能欠損を 有するサツカロミセス・セレビシェｍｍｎ突然変異株の単離、特徴付け、及び特 性。Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＩＥｎｚｙｍｏｌ、　１８５．４４０−４７０　（１９９ ０）。

バルー（口ａｌｌｏｕ、　Ｉｌ、）；ヒッツエマン（ｌｌｉＬｚｅｍａｎ、　Ｒ ，Ａ、）；ルイス（ｌｅｗｉｓ、　Ｍ、　Ｓ、　）　；バルー（Ｂａｌｌｏｕ、 　Ｃ，Ｓ、　）　：バナジウム酸塩耐性酵母突然変異株はタンパク質グリコリル 化能が欠損している。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８８．３２０９−３２１２　 （１９９１）。

ベノグス（Ｂｃｇｇｓ、　Ｊ、Ｄ、）　：ハイブリッドプラスミドを複製するこ とによる酵母の形質転換。Ｎａｔｕｒｅ　２７５．１０４−１０９　（１９７Ｂ ）。

カールソン（Ｃａｒｌｓｏｎ、　Ｍ、）　：　）ラン（Ｔａｕｓｓｉｇ、　Ｒ， ）　；クスツ（Ｋｕｓｔｕ、　Ｓ、　）　；ポツンユタイン（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ 、　Ｄ、）　：サツカロミセス・セレビシェ内でのインベルターゼの分泌型は、 シグナル配列をコートするｍＲＮＡから合成される。Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　ロ ｉｏ１．３゜４３９−４４７　（１９８３）。

ノリアノイ（Ｃｉｒｉａｃｙ、　Ｍ、）　：サツカロミセス・セレビシェ内のア ルコールデヒドロゲナーゼの遺伝学。１．ａｄｈ−突然変異株の単離と遺伝子分 析。Ｍｕｔ、　Ｒｅｓ、　２９．３１５−３２６　（１９７５）。

デ・ハエトセリア−（Ｄｅ　Ｂａｅｔｓｅｌｉｅｒ、　Ａ、）　；バサバダ（Ｖ ａｓａｖａｄａ。

Ａ、）、ドエット（Ｄｏｈｃｌ、　ｐ、　）　；　ハ、チ（Ｉｌａ−Ｔｉ、　Ｖ 、）；デ・ボイケラー（Ｄｅ　Ｂｅｕｋｅｌａｅｒ、　Ｍ、）　；　ｘルビカム （Ｅｒｐｉｃｕｍ、　Ｔ、　）　；デ・クラーク　（Ｄｅ　Ｃ１ｅｒｋ、　Ｌ、 ）　；　ハノチアー（Ｈａｎｏｔｉｅｒ、　Ｊ、）　；　ローゼンベルグ（Ｒｏ ｓｅｎｂｅｒｇ、　Ｓ、）　＋　Ａ、ニガーグルコースオキシダーゼを産生ずる 酵母の発酵ニスケールアップ、精製及び組換え酵素の特徴付け。［ｌｉｏｔｅｃ ｈｎｏｌｏｇｙ　０．５５９−５Ｃｉｌ　（１９９１）。

デローメ（Ｄｅｌｏｒｍｅ、　Ｅ、）　：エレクトロポレーションによるサツ力 ロミセ７．−セレビシェの形質転換。Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎ ｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　５５．２２４２−２２４６　（１９８ ９）。

デュケン・ファン（Ｄｉ　ｊｋｅｎ、　Ｊ、　Ｐ、　Ｖａｎ）　；ビーニスイス （ＶｅｅｎｈｕｉｓＭ、）：アスペルギルス・ニガーのベルオキシソーム内のグ ルコースオキシダーゼの細胞化学的局在性。［！ｕｒｏｐｅａｎ　Ｊ、　Ａｐｐ ｌ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、９．２７５−２８３　（１９８ ０）。

エルハート（Ｅｒｈａｒｔ、　Ｅ、）；　とホーレンベルグ（Ｈａ　Ｉ　Ｉｅｎ ｂｅｒｇｌＣｏＰ、）：サツカロミセス・セレビシェの２μＤＮＡ組換えプラス ミド上の欠損ＬＥＵ２遺伝子の存在が、キユアリングと高コピー数の原因となっ ている。Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５６．６２５−６３５　（１！１８３ ）。

フレデリック（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、　Ｋ、Ｒ，）　：ラング（Ｔｕｎｇ、　Ｊ 、）　；　エメリツク（Ｅｍｅｒｉｃｋ、　Ｒ，Ｓ、　）　；マジアーツ（Ｍａ ｓｉａｒｚ、　Ｆ、　Ｒ，）　；チェノＩくレン（Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ、　 Ｓ、Ｉｌ、）　；バサバダ（Ｖａｓａｖａｄａ、　Ａ、）　；　ｏ−ゼンベルグ （Ｒｏｓｅｎｕｅｒｇ、　Ｓ、）　；チャクラボーティ（Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔ ｙ。

Ｓ、）、ンヨブタ−（Ｓｃｈｏｐｔｃｒ、Ｌ、Ｍ、）　；　７　ッセイ　（Ｍａ ｓｓｅｙ、　Ｎ、）アスペルギルス・ニガーがらのグルコースオキシダーゼ。Ｊ 。

旧ｏｆ、　Ｃｈｃ＋ｎ、　２Ｇ５．３７９３−３８０２　（１り９０）。

ハトウィック（ｌｌａｄｗｉｃｋ、に、Ｇ、）；ルイス（Ｉｅｗｉｓ、　Ｍ、Ｊ 、）　；　セ）　ンザ（Ｓｅｍｅｎｚａ、　Ｊ、　）　；ディーン（Ｄｅａｎ、 　Ｎ、　）　；ペルハム（Ｐｅｌｈａｍ。

Ｈ，Ｒ，Ｂ、）：　ＥＲＤ　ｌ、っまり管腔小胞体タンパク質の保持に要求され る酵母遺伝子は、ゴルジ体内での糖タンパク質プロセシングを害する。ＥＭＢＯ Ｊ、　９．６２３−６３０　（１９９０）。

ハーゼルベック（ｔ（ａｓｅｌｂｅｃｋ、　Ａ、）　；フーゼル（ｌｌｏｓｅｌ 、　Ｗ、）　：　Ｎ　−グリコンダーゼＦ（グリコペプチダーゼＦ）及びエンド グリコシダーゼＦの酵素活性へのインキュベーション条件、種々の界面活性剤及 びタンパク質濃度の作用に関する研究。Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ　８．１−４　（１９８８）。

ホフリ　（Ｈｏｃｈｌｉ、　Ｅ、）；デベリ　（Ｄｏｅｂｅｌｉ、　１１．　） 　；シャバー（Ｓｃｈａｃｈｅｒ、　Ａ、　）　：隣接するヒスチジン残基を含 有するタンパク質及びペプチドに対して選択的な新規な金属キレート吸着剤。Ｊ 。

Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　４１１．　１７７−１８４　（＋９８７）。

ホフリ（ｌｌｏｃｈｕｌｉ、　Ｅ、）　；バーンワース（Ｂａｎｎｗａｒｔｈ、 　Ｗ、　）　；デベリ（Ｄｏｅｂｅｌｉ、　ｌ（、）　：ガンッ（Ｇｅｎｚ、　 Ｒ，）　；ストウーバ−（Ｓｔｕｅｂｅｒ。

Ｄ、）、新規な金属キレート吸着剤を用いた組換えタンパク質の精製を容易にす る遺伝的アプローチ。Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６．１３２１−１２３５（ ＋９８８）　。

ホファカー（ｌｌｕｆｆａｋｅｒ、　Ｔ、Ｃ，）　；　ロビンス（Ｒｏｂｂｉｎ ｓ、　Ｐ、　Ｗ、　）　：タンパク質グリコリル化能を欠く酵母突然変異株。Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８０．７４Ｇ６−７４７０　（＋９８３）。

イニス（ｌｎｎｉｓ、　Ｍ、Ａ、）　：サッカロミセス・セレビシェ内での異種 タンパク質のグリコジル化。バー（Ｂａｒｒ、　Ｐ、　Ｊ、　）　；ブラーケ（ Ｂｒａｋｅ、　Ａ、　Ｊ、　）　；バレンズエラ　（Ｖａｌｅｎｚｕｃｌａ、　 Ｐ、）編、　Ｙｅａｓｔｇｅｎｅｔｉｃ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、　Ｂｕｔｔ ｅｒｗｏｒｔｈｓ、　Ｓｔｏｎｅｈａｍ、　Ｍａｓｓ、　ｐｐ、２３３−２４６ 　（１９８９）において。

イトウ（ｌｔｏ、　Ｉｔ、）；ユクダ（Ｊｕｋｕｄａ、　Ａ、　）　；ムラタ（ Ｍｕｒａｔａ。

Ｋ、）；キムラ（にｉｍｕｒａ、　Ａ、）：アルカリカチオンで処理した無傷酵 母細胞の形質転換。Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５３．１６３−１６８　（ １９８３）。

コベツキ（にｏｐｅｔｚｋｉ、　Ｅ、　）　ニブケル（Ｂｕｃｋｅｌ、　Ｐ、　 ）　；シュマハ−（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ、　Ｇ、　）　：パン用酵母αグルコ シダーゼのクローニングと特徴付け：空胞ブロティナーゼが欠けている酵母株内 での過剰発現。Ｙｅａｓｔ　５．　ｌｌ−２４（１９８９）。

コーンフェルト（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ、　Ｒ，）　；コーンフェルト（Ｋｏｒｎｆ ｅｌｄ。

Ｓ、）：アスパラギン結合オリゴサツカライドの集合。Ａｎｎ　Ｒｅｖ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５４．６３１−６６４　（１９８５）。

ククルジンスカ（にｕｋｕｒｕｚｉｎｓｋａ、　Ｍ、八、）；ベルレフ　（Ｂｅ ｒｇｈ。

Ｍ、Ｌ、Ｅ、）；：Ｌ；’ヤクノン（Ｊａｃｋｓｏｎ、口、Ｊ、）：酵Ｌｊ内で のタンパク質グリコノル化。Ａｎｎ　Ｒｃｖ、　Ｉｌｉｏｃｈｃｍ、　５（ｉ、 　り１５−９４４　（１９８７）。

クリークバウム（Ｋｒｉｃｃｈｂａｕｍ、　Ｍ、）；バイルマン（ｌｌｅ　ｉ　 Ｉｍａｎｎ。

Ｉｌ、Ｊ、）：ビエンチェス（Ｗｉｃｎｔ　ｊｅｓ、　Ｆ、　Ｊ、　）　；　バ ーン（ｌｌａｈｎ、　Ｍ、　）：ジャニイ　（Ｊａｎｙ、　Ｋ、　Ｄ、　）　； ガーゼン（Ｇａｓｓｅｎ、　Ｈ，Ｇ、　）　；ジャリフ（Ｓｈａｒｉｆ、　Ｆ、 　）　；アラエヂノグル（Ａｌａｅｄｄｉｎｏｇｌｕ、　Ｇ、　）　：アスペル ギルス・ニガーＮＲＲＬ−３からのグルコシダーゼオキシダーゼ遺伝子のクロー ニング及びＤＮＡ配列分析。ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ。

２５５、（ｉｎ−Ｇ（ｉ　（１０８０）。

ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｕ、に、）　：バクテリオファージＴ４の頭部の 組み立て中における構造タンパク質の開裂。Ｎａｔｕｒｅ　２２７．６８０−６ ８５（１９７０）。

マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、）ら、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎ ｉｎｇ：　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ 　ｌ１ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８９）に おいて。

モイヤ（Ｍｏｉｒ、　Ｄ、Ｔ、）：増加した分泌効率を有する酵母突然変異株゛ バー（Ｂａｒｒ、　Ｐ、　Ｊ、　）　；ブラーケ（Ｂｒａｋｅ、　Ａ、Ｊ、）　 ；バレンズエラ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ、Ｐ、）編、Ｙｅａｓｔ　ｇｅｎｅｔｉ ｃ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ。

ＢｕＮｅｒｗｏｒｔｈｓ、　Ｓｔｏｎｅｈａｍ、　Ｍａｓｓ、　ｐｐ、２＋５− ２３１　（１９８９）において。

ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ、　Ｋ、［１，）；フ７０−す（Ｆａｌｏｏｎａ、　Ｆ、 Ａ、）　：ボリメラーセ触媒連鎖反応を介するｉｎ　ｖｉｔｒｏでのＤＮＡの特 異的合成。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１５５．３３５−３５０　（１９８７）。

ナカノ　（Ｎａｋａｎｏ、　Ａ、）　；ムラマツ（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ、　Ｍ、 ）　：新規なＧＴＰ結合結合性タンパ石質る５ａｒｐｌは、小胞体からゴルジ体 への輸送に閉りしている。Ｊ、　Ｃｃｌｌ、旧ｏｆ、　１００．２０７７−２０ ０１　（１０８０）。

＝　ｘ−７ン（Ｎｅｗｍａｎ、　Ａ、　Ｐ、　）　：フェ０−ノビク（Ｆｅｒｒ ｏ−Ｎｏｖｉｃｋ。

Ｓ、）：　（１１１）−マンノース自殺選択により単離された酵母分泌経路の初 期部分における新規な突然変異株の特徴付け。Ｊ、　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、　１０５．１５８７−１５９４　（＋９８７）。

ノビク　（Ｎｏｖｉｃｋ、　Ｐ、　）　；フィールド（Ｆｉｅｌｄ、　Ｃ，）； シエツクマン（Ｓｃｈｅｋｍａｎ、　Ｒ，）　：酵母分泌経路内での翻訳後の事 柄に要求される２３の相浦基の同定。Ｃｅ１ｌ　２１．２０５−２１５　（１９ ８０）。

ポールノン（Ｐａｕｌｓｏｎ、　Ｃ，Ｐ、）　：糖タンパク質：糖鎖は何のため にあるのか。ＴｌＢ５１４．２７２−２７６　（１９８９）。

ルドルフ（Ｒｕｄｏｌｐｈ、　Ｈ，Ｋ、　）　；アンテビ（Ａｎｔｅｂｉ、　Ａ 、　）　；フィフク（Ｆｉｎｋ、　Ｇ、　Ｒ，）　：バクレイ　（Ｂｕｃｋｌｅ ｙ、　Ｃ，Ｍ、）；ドルマン（Ｄｏｒｍａｎ。

Ｔ、　Ｅ、　）　：レビトレ（ＬｅＶｉ　ｔｒｅ、　Ｊ、　）　；デビドウ（Ｄ ａｖｉｄｏｗ、　Ｌ、　Ｓ、　）　；マオ（Ｍａｏ、　Ｊ、　）　；モイヤ（Ｍ ｏｉｒ、　Ｄ、　Ｔ、　）　：酵母分泌経路は、ＰＭＲｌ、つまりＣａ’“ＡＴ Ｐアーゼファミリーのメンバー内の突然変Ｕによって動揺する。Ｃｅ１ｌ　５８ ．１３３−１４５　（１９８９）。

レディ（Ｒｃｄｄｙ、　Ｖ、　Ａ、　）　；ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ｒ ，Ｓ、　）　；ピーマン（Ｂｉｃｍａｎｎ、　Ｋ、　）　；ウィリアムス（Ｗｉ 　ｌ　ｌ　ｉａｍｓ、　Ｒ，Ｓ、　）　；チーグラー（Ｚｉｅｇｌｅｒ、　Ｆ、 　Ｄ、　）　；　トリンブル（Ｔｒｉｍｂｌｅ、　Ｒ，Ｂ、）　；　マレイ（Ｍ ａｌｃｙ、　Ｆ、　）　：酵母外部インベルターゼ中のグリコジル化部位の特徴 付け。■１個々のンークオンのＮ−結合オリゴサツカライド含有量。Ｊ、　Ｂｉ ｏｌ、　Ｃｈｅｎ＋、　２６３．６９７８−６９８５　（１９８８）。

ルンゲ（Ｒｕｎｇｅ、に、Ｗ、）Ｈロビンス（Ｒｏｂｂｉｎｓ、　Ｐ、Ｗ、）： タンパク質グリコジル化の初期段階におけるサツカロミセス・セレビンエ突然変 異株。ボンベントレ（口０ｎＶｅｎｔｒｅ、　Ｐ、　Ｆ、　）　；モレ口（Ｍｏ ｒｅｌｌｏ。

Ｊ、八、Ｍ、）；ンルバー（Ｓｉ　１ｖｅｒ、　Ｓ、　Ｄ、　）　；つ（Ｗｕ、 　Ｉｌ、　Ｃ，）編。

帽ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　１９ＢＧ、Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　Ｆｏ ｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ。

Ｗａｓ旧ｎｇｔｏｎ、　Ｄ、Ｃ，ｐｐ、３１２−３１６　（１９８６）において 。

シエツクマン（Ｓｃｈｅｋｍａｎ、　Ｒ，）　Ｈノビク（Ｎｏｖｉｃｋ、　Ｐ、 　）　：分泌プロセス及び酵母細胞表面集合。ストラサーン（Ｓｔｒａｔｈｅｒ ｎ、　Ｊ、Ｎ、）　；ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ、　Ｅ、　Ｗ、　）　；ブローチ （Ｂｒｏａｃｈ、　Ｊ、Ｒ，）編、　ＴｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒ旧ｏｌｏｇｙ　 ｏｒ　ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、　Ｍｅｔａｂｏｌｉ ｓｍａｎｄ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮｅｗＹｏｒｋ、　ｐｐ、３６１−３９８　 （１９８２）において。

ツユミツト　（Ｓｃｈｍｉｔｌ、　１１．Ｄ、）；ワグナ−（Ｗａｇｎｅｒ、　 Ｐ、　）　；プファフ＜Ｐｒａ（ｒ、　Ｅ、　）　；ガルビッツ（Ｇａｌｌｗｉ ｔｚ、　Ｄ、　）　：酵母内のｒａｓ−関連ＹＰＴＩ遺伝子産物：微小管構築に 関与するかも知れないＧＴＰ結合性タンパク質。Ｃｅ１ｌ　４７．４０１−４１ ２　（Ｈ）８（ｉ）。

ツユミツト（Ｓｃｈｍｉ　ｔ　１．　ＩＩ、Ｄ、）；ブジキア（Ｐｕｚｉｃｈｉ ａ、　Ｍ、）　：ガルビソツ（Ｇａｌｌｗｉｔｚ、　Ｄ、）：酵母内のｒａｓ− 関連ＹＰＴＩ遺伝子産物のＭ度感受性突然変異株の研究は、細胞内カルシウムの 調節における役割を示唆している。Ｃｅ１ｌ　５３．６３５−６４７　（１９８ ８）。

シャー　７　ン（Ｓｈｅｒｍａｎ、　Ｆ、　）　；フィンク（Ｆｉｎｋ、　Ｇ、 Ｒ１）；ヒックス（ｆｌｉｃｋｓ、　Ｊ、［１，）　：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ 　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、 Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）Ｉａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　 Ｓｐｒｉｎｇ　）Ｉａｒｂｏｒ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８１）。

フナ−（Ｔａｎｎｅｒ、　Ｌ）　；レール（Ｌｅｈｌｅ、　Ｌ、）　：酵母内で のタンパク質グリコジル化。Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　 ９０６．８１−９９　（１９８７）。

ワーレン（Ｗａｒｒｅｎ、　Ｃ，Ｆ！、　）　：グリコモル化−タンパク質工学 のための考察。ＢＰ２７．３９２−３９５　（１９９０）。

ライティンテン（Ｗ旧ｔｔｉｎｇｔｏｎ、　Ｉｌ、　）　；ケリー・ウィリアム ス（Ｋｅｒｒｙ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ、　Ｓ、）　；ビドグッド（Ｂｉｄｇｏｏｄ 、　Ｋ、）　；　ド゛シスワース（Ｄｏｄｓｗｏｒｔｈ、　Ｎ、　）　；ペパー ディ（Ｐｅｂｅｒｄｙ、　Ｊ、　）　；ドブノン（Ｄｏｂｓｏｎ、　Ｍ、　）　 ；ヒンクリフ　（ｌｌｉｎｃｈｌｉｆｆｅ、　Ｅ、　）　；バランス（Ｂａｌｌ ａｎｃｅ、　Ｄ、Ｊ、）　：　Ａ、ニガー、Ａ、ニデユランス及びサツカロミセ ス・セレビシェ内てのアスペルギルス・ニガー　グルコースオキシダーゼの発現 。Ｃｕｒｒ、　Ｇｃｎｃｔ、１８．５３１−５３Ｃｉ　（１９９０）。

ザメンポフ（Ｚａｍｃｎｈｏｆ、　Ｓ、　）　：動物組織からのデオキシリボ核 酸の調製及びアッセイ。Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｃｎｚｙｍｏｌ、　３．６！Ｊ［＋− ７０４（１９５７）。

チーグラー（Ｚｉｅｇｌｅｒ、　Ｆ、Ｄ、）　；　７レイ（Ｍａｌｃｙ、　Ｆ、 ）　；　トリンブル（Ｔｒｉｍｂｌｃ、　Ｒ，［］、）　：酵母外部インベルタ ーゼ中のグリコジル化部位の特徴付け。Ｉｔ、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコ サミニダーゼ１１−耐性ンークオンの位置。Ｊ、旧ｏｆ、　Ｃｈｃｍ、　２６３ ．６９７８−６９８５（＋９８８）。

デュンカン（Ｄｕｎｃａｎ、　Ｍ、　Ｊ、　）　；スミス（Ｓｍｉ　ｔｈ、　Ｒ ，Ａ、　）　：サツカロミセス・セレビンエの超分泌性突然変異株。ＢＰ−Ａ　 ０２０１２０８．カラーボラティブ・リサーチ（Ｃｏｌｌａｒｂｏｒａｔｉｖｅ 　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）社。

フィンク（Ｆｉｎｋ、　Ｇ、Ｒ，）　：サツカロミセス・セレビンエの改良され た超分泌性突然変異株。ＥＰ−Ａ　０３８２３３８．カラーボラティブ・リサー チ社。

クニスカー（Ｋｎｉｓｋｅｒ、　Ｐ、　Ｊ、　）　；　ハゴピアン（ｔｌａｇｏ ｐｉａｎ、　Ａ、）　：ミラー（Ｍｉ　Ｉ　Ｉｅｒ、　Ｗ、　Ｊ、　）　；ヤマ ブキ（Ｙａｍａｚａｋｉ、　Ｓ、　）　：エリス（Ｅｌｌｉｓ、　Ｒ，Ｗ、）： 非高グリコジル化Ｂ型肝炎つィルスタンパク質を製造する方法。ＥＰ−Ａ　０３ ４４８Ｇ４．　メルク＆ＣＯ９社。

コペツキ（ＫｏｐｃＬｚｋｉ、　Ｅ、　）　；ツユマッ／％　−（Ｓｃｈｕｍａ ｃｈｃｒ、　Ｇ、）　；チマーマン（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ、　Ｆ、に、）　： 真核生物内でのタンパク質の産生を調節するための発現用ベクター及び方法。Ｅ Ｐ−Ａ　０３２３８３８．べ一リンカー・マンハイム社。

マツケイ（ＭａｃＫａｙ、　Ｖ、　Ｌ、　）　；ウエルフ（Ｗｅｌｃｈ、　Ｓ、 に、）；ライ、ツブ（Ｙｉｐ、　Ｃ，Ｌ、　）　：タンパク質グリコジル化を調 節する方法。ＥＰ−＾０３１４０９６、ザイモジエネチック（Ｚｙｍｏｇｅｎｅ ｔｉｃｓ）社。

ローゼンベルグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、　Ｓ、）　：組換え系内でのグルコース オキシダーゼの産生。

配列表 （ｉｉｉ）配列の数：１Ｏ （２）配列番号：１の情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：２１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列：配列番号：Ｉ： ＡＴＴＴＣＴＣＣＴＴ　ＡＴＴＧＣＧＣＧＣＴ　Ｔ　２１（２）配列番号＝２の 情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：４８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （ｘｉ）配列：配列番号：２： ＴＣＴＡＴＴＣＡＧＣＴＧＴＣＧＡＣＡＴＡ　ＧＡＴＣＴＴＡＴＧＴ　ＡＡＴＴ ＴＡＧＴＴＡ　ＣＧＣＴＴＧＡＣ４８（２）配列番号：３の情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ＝５０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列；配列番号：３： ＡＧＡＴＣＴＡＴＧＴ　ＣＧＡＣ八ＧＣへＧＡ　ＡＴ八へＡＴＡＡＡＡ　ＴＴＡ ＧＴＧＣＧＧＡ　ＣＴＴＴＴＴＴＴＴＡ　５０（２）配列番号：４の情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：２４塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列；配列番号＝４： ＧＴＣ八ＴへＴＧＴ八　へへＧＴＡへＡＡＴＴ　ＣＣＡＡ　２４（２）配列番号 ＝５の情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：３８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列；配列番号：５： ＧＣＣＣＧＧＴＡＣＣＡＧＡＴＣＴＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴ　ＴＧＴＧＡ ＧＣＴ　３８（２）配列番号＝６の情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ＝２１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｌ）配列；配列番づ：Ｏ： ＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡ　ＧＴＧＧＡＴＣＣＣＣＣ２１（２）配列番号、７の情報 ： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：２０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列：配列番号ニア： ＧＣＣＧＧＣＧＡＡＣＧＴＧＧＣＧＡＧＡＡ　２０（２）配列番号、８の情報： （１）配列の特性： （Ａ）長さ：４５塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロンー：直鎖状 （ｘｉ）配列：配列番号＝８＝ ＡＴＡＴＡＴＣＡＧＣＴＧＴＣＡＣＴＧＣＡ　ＴＧＣＴＡＧＣＡＴＡ　ＡＴＣＴ ＴＣＣＡＡＧ　ＡＴＡＧＣ４５（２）配列番号＝９の情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ：２Ｉ塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列：配列番号：９： ＣへＧＣへＣＣへＣＣＡＣＣ八ＣへＧ八Ｃへ　へ　２１（２）配列番号：ｌＯの 情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ＝２５塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列：配列番号＝ｌＯ： ＣＴＧＴＣＡＧＴＧＧ　ＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴ　ＧＣＡＴＧ　２５Ｆｉｇ、　１ Ｆｉｇ、　２ Ｆｉｇ、　３ 補正書の写しく翻訳文）提出書 （特許法　第１８４条の８） 平成７年２月７日 くシー

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. １．６８〜８０ｋＤａの分子量、単位重量あたり約２００Ｕ／ｍｇの比活性、約 １２％の炭水化物部分を有する低グリコシル化組換えグルコースオキシダーゼ（ ＧＯＤ）であって、アスペルギルス属からのＧＯＤ遺伝子を含有する組換えＤＮ ＡのＮ−グリコシル化能欠損酵母突然変異株ＤＳＭ７０４２、ＤＳＭ７３３８、 ＤＳＭ７１６０若しくはＤＳＭ７３４０又はその対立性突然変異株内での発現、 発酵及びその培養上澄み液又はその細胞からの単離によって得ることができるグ ルコースオキシダーゼ。
2. ２．６８〜８０ｋＤａの分子量、単位重量あたり約２００Ｕ／ｍｇの比活性、約 １２％の炭水化物部分を有する低グリコシル化組換えグルコースオキシダーゼを 製造する方法であって、ＧＯＤ遺伝子を含存する組換えＤＮＡのＮ−グリコシル 化能欠損酵母突然変異株ＤＳＭ７０４２、ＤＳＭ７３３８、ＤＳＭ７１６０若し くはＤＳＭ７３４０又はその対立性突然変異株内での発現、発酵及びその培養上 澄み液又はその細胞からの該酵素の単離によって得ることができる方法。
3. ３．診断検査における請求項１記載のグルコースオキシダーゼの使用。