ES2182986T5 - Hexosa oxidasa recombinante, procedimiento para su produccion y utilizacion de dicha enzima. - Google Patents

Hexosa oxidasa recombinante, procedimiento para su produccion y utilizacion de dicha enzima. Download PDF

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Abstract

UN METODO PARA LA PRODUCCION DE OXIDASA DE HEXOSA MEDIANTE TECNOLOGIAS DEL ADN RECOMBINANTE, UNA OXIDASA DE HEXOSA RECOMBINANTE Y EL USO DE TAL ENZIMA, EN PARTICULAR EN LA PRODUCCION DE PRODUCTOS ALIMENTICIOS TALES COMO PASTAS Y PRODUCTOS LACTEOS, ALIMENTOS PARA ANIMALES, COMPOSICIONES FARMACEUTICAS, COSMETICOS, PRODUCTOS PARA EL CUIDADO DENTAL Y EN LA FABRICACION DE LACTONAS. FUENTES ADECUADAS DE DNA QUE CODIFICAN LA ENZIMA SON LAS ESPECIES DE ALGAS MARINAS QUE COMPRENDEN CHONDRUS CRISPUS, IRIDOPHYCUS FLACCIDUM Y EUTHORA CRISTATA. EN REALIZACIONES UTILES DE LA INVENCION, LA OXIDASA DE HEXOSA SE PRODUCE CON PICHIA PASTORIS, SACCHAROMYCES CEREVISIAE O E. COLI.

Description

Hexosa oxidasa recombinante, procedimiento para su producción y utilización de dicha enzima.
Campo de la invención
La invención provee un método para producir hexosa oxidasa por tecnología de ADN recombinante y la enzima producida por el método y su uso en la industria alimentaria y otros campos.
Antecedentes de la técnica y técnica anterior
La hexosa oxidasa (D-hexosa: O_{2}-oxidoreductasa, EC 1.1.3.5) es una enzima que en presencia de oxígeno es capaz de oxidar la D-glucosa y varios otros azúcares reductores incluyendo maltosa, lactosa y celobiosa a sus correspondientes lactonas con hidrólisis subsiguiente a los ácidos aldobiónicos respectivos. Por consiguiente, la hexosa oxidasa difiere de otra oxidorreductasa, la glucosa oxidasa que sólo puede convertir D-glucosa, por cuanto esta enzima puede utilizar un rango más amplio de substratos de azúcar. La oxidación catalizada por hexosa oxidasa puede ser ilustrada, por ej., como sigue:
D-Glucosa + O_{2} \rightarrow \delta-D-gluconolactona + H_{2}O_{2}, ó
D-Galactosa + O_{2} \rightarrow \gamma-D-galactogalactona + H_{2}O_{2}
Hasta ahora, se ha provisto la hexosa oxidasa (denominada a continuación HOX) aislando la enzima de varias especies de algas rojas tales como Iridophycus flaccidum (Bean y Hassid, 1956) y Chondrus crispus (Sullivan et al., 1973). Adicionalmente, la especie de alga Euthora cristata ha demostrado producir hexosa oxidasa.
Se ha informado que la hexosa oxidasa aislada de estas fuentes naturales puede ser usada potencialmente en la preparación de ciertos productos alimenticios Así, la hexosa oxidasa aislada de Iridophycus flaccidum ha demostrado ser capaz de convertir la lactosa en leche con la producción del ácido aldobiónico correspondiente y ha demostrado ser de potencial interés como un agente acidificante en la leche, por ej., para reemplazar los cultivos microbianos acidificantes para tal propósito (Rand, 1972). A este respecto, la hexosa oxidasa ha sido mencionada como una enzima más interesante que la glucosa oxidasa, ya que esta última enzima sólo puede ser utilizada en la leche o en los productos alimenticios que no contienen glucosa con la adición concomitante de glucosa o, en el caso de un producto lácteo, la enzima lactasa que degrada la lactosa, por lo cual la lactosa es degradada a glucosa y galactosa. Aún si se puede obtener glucosa de esta manera como un substrato para la glucosa oxidasa, es evidente que sólo 50% de los productos finales de lactasa pueden ser utilizados como substrato por la glucosa oxidasa, y por consiguiente la glucosa oxidasa no es un agente acidificante eficiente en la leche natural o los productos lácteos.
La capacidad de las oxígeno oxidorreductasas, incluyendo la de hexosa oxidasa para generar peróxido de hidrógeno, que tiene un efecto antimicrobiano, ha sido utilizada para mejorar la estabilidad de almacenamiento de ciertos productos alimenticios incluyendo queso, manteca y jugo de frutas como se revela en la JP-B-73/016612. También se ha sugerido que las oxidorreductasa pueden ser potencialmente útiles como depuradores de oxígeno o antioxidantes en productos alimenticios.
Dentro de las industrias de la panificación y de los molinos se conoce el uso de agentes oxidantes tales como por ej., iodatos, peróxidos, ácido ascórbico, K-bromato o azodicarbonamida para mejorar la prestación de horneado de la harina para lograr una masa con estirabilidad mejorada y que tiene por lo tanto una resistencia y estabilidad conveniente. El mecanismo detrás de este efecto de los agentes oxidantes es que las proteínas de la harina, tales como por ej., el gluten en la harina de trigo, contienen grupos tiol, los que, cuando se oxidan, forman enlaces disulfuro por lo que la proteína forma una matriz más estable dando por resultado una mejor calidad de masa y mejoras del volumen y de la estructura de la miga de los productos horneados.
Sin embargo, tal uso de varios de los agentes oxidantes que se pueden obtener corrientemente son objetados por los consumidores o no están permitidos por los organismos competentes y por consiguiente, se ha intentado encontrar alternativas a estos aditivos convencionales para la harina y la masa y la técnica anterior ha sugerido el uso de glucosa oxidasa para el propósito indicado más arriba. Así, la US 2.783.150 revela la adición de glucosa oxidasa a la harina para mejorar las características reolóqicas de la masa. La CA 2.012.723 revela el uso de agentes mejoradores del pan que comprenden enzimas celulolíticas y glucosa oxidasa y la JP-A-084848 sugiere el uso de una composición mejoradora del pan que comprende la glucosa oxidasa y la lipasa.
Sin embargo, el uso de la glucosa oxidasa como un aditivo mejorador de masa y pan tiene la limitación de que esta enzima requiere la presencia de glucosa como substrato para ser efectiva en un sistema de masa y generalmente, el contenido de glucosa en las harinas de cereales es bajo. Así, en la harina de trigo la glucosa está presente en una cantidad que está en el rango de 0-0,4% p/p, es decir, las harinas pueden no contener glucosa en absoluto. Por lo tanto, la ausencia o el bajo contenido de glucosa en masas será un factor limitativo para el uso de glucosa oxidasa como un agente mejorador de masa. Por el contrario, el contenido de maltosa es significativamente mayor en la masa recién preparada y se forma maltosa adicional en la masa debido a la actividad de \alpha-amilasa que o bien se encuentra presente inherentemente en la harina o es agregada.
La fuente corriente de hexosa oxidasa son preparados de enzima purificados parcialmente o crudos aislados por extracción de la especie de.. alga marina que ocurre naturalmente indicada más arriba. Sin embargo, como la cantidad de hexosa oxidasa en las algas es bajo, es claro que una producción de la enzima de esta manera es demasiado tediosa y costosa para garantizar una producción comercial efectiva con respecto al costo de la enzima de estas fuentes naturales. Además, la provisión de un producto de enzima suficientemente puro a un nivel efectivo con respecto al costo no se puede lograr fácilmente de esta manera.
Existe por lo tanto una considerable necesidad industrial de proveer una fuente alternativa y más efectiva con respecto a los costos de esta enzima industrialmente valiosa sin depender de una fuente natural y también para proveer la enzima en una forma pura, es decir, sin actividades contaminantes de la enzima o cualquier otra substancia contaminante no deseada incluyendo pigmentos de algas indeseados y contaminantes ambientales que pueden estar presentes en las áreas marinas en donde crecen las especies de algas que producen la hexosa oxidasa.
Además, la disponibilidad industrial de una calidad de grado alimentario de la hexosa oxidasa en cantidades suficientes y a precios efectivos en cuanto al costo dará paso indudablemente a nuevas aplicaciones de esta enzima no solo en la industria alimentaria, sino también en otras áreas industriales como se discutirá a continuación. Un ejemplo de una nueva aplicación de la hexosa oxidasa en la industria alimentaria es el uso de la misma como un agente mejorador de masa, siendo otro ejemplo el uso de un polipéptido con actividad hexosa oxidasa o un organismo recombinante que produce el polipéptido en la fabricación de las lactonas.
Sumario de la invención
La presente invención hizo posible por primera vez, usando tecnología de ADN recombinante, proveer polipéptidos con actividad hexosa oxidasa en cantidades industrialmente apropiadas y a un nivel de calidad y pureza que hacen al polipéptido con actividad hexosa oxidasa de acuerdo con la invención 4 adecuado para cualquier propósito industrial relevante incluyendo la preparación de productos alimenticios y farmacéuticos.
Por consiguiente, la invención se refiere en un primer aspecto a un método para producir un polipéptido Chondrus crispus que tiene actividad hexosa oxidasa, que comprende aislar o sintetizar un fragmento de ADN que codifica al polipéptido, introducir dicho fragmento de ADN en un organismo huésped apropiado en el cual el fragmento de ADN es combinado con una señal de expresión apropiada para el fragmento de ADN, cultivar el organismo huésped bajo condiciones que llevan a la expresión del polipéptido con actividad hexosa oxidasa y recuperar el polipéptido del medio de cultivo o de la célula recombinante, comprendiendo dicho fragmento de AND por lo menos una secuencia ADN de aminoácidos seleccionada entre el grupo compuesto por:
(i)
Tyr-Glu-Pro-Tyr-Gly-Gly-Val-Pro (SEC ID nº 1),
(ii)
Ala-Ile-Ile-Asn-Val-Thr-Gly-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Tyr-Asp-X-X-X-Gly-Tyr-X-Val-Ser-Ser (SEC ID nº 2),
(iii)
Asp-Leu-Pro-Met-Ser-Pro-Arg-Gly-Val-Ile-Ala-Ser-Asn-Leu-X-Phe (SEC ID nº 3),
(iv)
Asp-Ser-Glu-Gly-Asn-Asp-Gly-Glu-Leu-Phe-X-Ala-His-Thr (SEC ID nº 4),
(v)
Tyr-Tyr-Phe-Lys (SEC ID nº 5),
(vi)
Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Val-Ile-Asp-Val-Asn-Ala-Gly-Thr-X-Asp (SEC ID nº 6),
(vii)
Leu-Gln-Tyr-Gln-Thr-Tyr-Trp-Gln-Glu-Glu-Asp (SEC ID nº 7),
(viii)
X-Ile-Arg-Asp-Phe-Tyr-Glu-Glu-Met (SEC ID nº 8),
en donde X representa un aminoácido seleccionado entre el grupo compuesto por Ala, Arg, Asn, Asp, Asx, Cys, Gln, Glu, Glx, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val; en el que la célula huésped es una especie de levadura.
En otros aspectos, la invención se refiere a una célula recombinante que comprende una codificación de un fragmento de ADN expresible para un polipéptido con actividad hexosa oxidasa, siendo dicho fragmento de ADN aislado o sintetizado tal y como se define anteriormente y a un procedimiento para la preparación de un producto alimenticio en el que una célula recombinante de este tipo se utiliza bajo condiciones en las que se expresa el polipéptido con actividad hexosa oxidasa; en el que la célula recombinante es una célula de levadura.
En todavía otros aspectos se prevé un procedimiento para la preparación de un alimento para animales en el que se utiliza la célula recombinante anteriormente mencionada bajo condiciones en las que se expresa el polipéptido con actividad hexosa oxidasa; un procedimiento para reducir el contenido de azúcar de un producto alimenticio, que comprende añadir a dicho producto una cantidad de la célula recombinante de la invención que es suficiente para eliminar por lo menos parte del azúcar inicialmente presente en dicho producto alimenticio y un procedimiento para la preparación de un producto seleccionado del grupo que consiste en un producto farmacéutico, cosmético y de cuidado dental, en el que se utiliza dicha célula recombinante.
Además, la invención proporciona una composición mejorada de masa como se define en la reivindicación 19, dicho por lo menos un componente convencional de masa incluyendo una celulasa, una hemicelulasa, una xilanasa, una pentosanasa, una amilasa, una lipasa y una proteasa, y un procedimiento para la preparación de un producto cocido a partir de una masa, que comprende añadir a la masa una cantidad eficaz de la composición mejorada de masa según la invención.
En aspectos adicionales, la invención proporciona un procedimiento para el análisis del contenido de un azúcar de una muestra en el que la célula recombinante de la invención se utiliza como un reactivo analítico y un procedimiento para la preparación de una lactona utilizando la célula recombinante, comprendiendo dicho procedimiento aplicar la célula a un reactor que comprende un carbohidrato que puede ser oxidado por el polipéptido con actividad hexosa oxidasa y hacer funcionar el reactor bajo condiciones en las que se expresa el polipéptido con lo cual se oxida el carbohidrato en una lactona.
En otro aspecto la invención se refiere a un fragmento de DNA aislado según se define anteriormente, que codifica un polipéptido Chondrus crispus que presenta actividad hexosa oxidasa.
Asimismo se prevé una preparación que comprende un polipéptido Chondrus crispus derivado de forma recombinante que presenta actividad hexosa oxidasa, sin que la preparación comprenda esencialmente otras proteínas, comprendiendo el polipéptido por lo menos una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en
(i)
Tyr-Glu-Pro-Tyr-Gly-Gly-Val-Pro (SEC ID nº 1),
(ii)
Ala-Ile-Ile-Asn-Val-Thr-Gly-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Tyr-Asp-X-X-X-Gly-Tyr-X-Val-Ser-Ser (SEC ID nº 2),
(iii)
Asp-Leu-Pro-Met-Ser-Pro-Arg-Gly-Val- Ile-Ala-Ser-Asn Leu-X-Phe (SEC ID nº 3),
(iv)
Asp-Ser-Glu-Gly-Asn-Asp-Gly-Glu-Leu-Phe-X-Ala-His-Thr (SEC ID nº 4),
(v)
Tyr-Tyr-Phe-Lys (SEC ID nº 5),
(vi)
Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Val-Ile-Asp-Val-Asn-Ala-Gly-Thr-X-Asp (SEC ID nº 6),
(vii)
Leu-Gln-Tyr-Gln-Thr-Tyr-Trp-Gln-Glu-Glu-Asp (SEC ID nº 7)
(viii)
X-Ile-Arg-Asp-Phe-Tyr-Glu-Glu-Met (SEC ID nº 8)
donde X representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala, Arg, Asn, Asp, Asx, Cys, Gln, Glu, Glx, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val, y procedimientos para la preparación de un producto alimenticio o un alimento para animales en el que se utiliza la preparación anterior.
Otros aspectos de la invención comprenden un procedimiento para reducir el contenido de azúcar de un producto alimenticio, que comprende añadir a dicho producto una cantidad de la preparación de la invención, que es suficiente para eliminar por lo menos parte del azúcar inicialmente presente en dicho producto alimenticio; un procedimiento para la preparación de un producto seleccionado del grupo que consiste en un producto farmacéutico, cosmético y de cuidado dental en el que se utiliza dicha preparación; un procedimiento para la preparación de un producto cocido a partir de masa, que comprende añadir la preparación de la invención a la masa, una composición mejorada de masa que comprende la preparación y por lo menos un componente convencional de masa; un procedimiento para analizar el contenido de un azúcar de una muestra en el que la preparación de la invención se utiliza como reactivo analítico y un procedimiento para la preparación de una lactona utilizando la preparación, comprendiendo dicho procedimiento aplicar la preparación a un reactor que contiene un carbohidrato que puede ser oxidado por el polipéptido y hacer funcionar el reactor bajo condiciones en las que se oxida el carbohidrato en una lactona.
Descripción detallada de la invención
Las hexosa oxidasas son producidas naturalmente por varias especies de algas marinas. Tales especies se encuentran, entre otros, en la familia Gigartinaceae que pertenece al orden Gigartinales. Ejemplos de especies de algas que producen hexosa oxidasa, que pertenecen a las Gigartinaceae son Chondrus crispus y Iridophycus flaccidum. También las especies de algas del orden Cryptomeniales, incluyendo la especie Euthora cristata son fuentes potenciales del polipéptido con actividad hexosa oxidasa de acuerdo con la invención. Por consiguiente, tales especies de algas son fuentes potencialmente útiles de hexosa oxidasa y de ADN que codifica tales polipéptidos con actividad hexosa oxidasa. Como se usa aquí el término "polipéptido con actividad hexosa oxidasa" denota una enzima que oxida por lo menos D-glucosa, D-galactosa, D-manosa, lactosa y celobiosa.
Cuando se usan tales fuentes naturales para la aislación de hexosa oxidasa nativa, como se realizó en la técnica anterior y en la presente invención con el propósito de identificar material de algas que podría ser usado como una fuente de mARN para usar en la construcción de cADN y como el punto de partida para construir cebadores de oligonucleótidos de ADN sintético, la enzima es aislada típicamente del material de partida de algas por extracción usando un medio de extracción acuoso.
Como material de partida para tal extracción las algas pueden ser usadas en su estado fresco como se cosecharon del área marina de cultivo o pueden ser usadas después de secar las frondas, por ej., por secado al aire a temperatura ambiente o por cualquier método de secado industrial apropiado tal como secado en aire calentado que circula o por secado por congelado. Para facilitar el paso de extracción subsiguiente, el material de partida secado o fresco puede ser triturado, por ej., por molido o mezclado.
Como medio de extracción acuoso son adecuadas soluciones tampón que tienen un pH en el rango de 6-8, tales como tampón de fosfato de sodio 0,1 M, tampón de trietanolamina 20 mM o tampón de Tris-HCl 20 mM. La hexosa oxidasa es extraída típicamente del material de algas suspendiendo el material de partida en el tampón y manteniendo la suspensión a una temperatura en el rango de 0-20ºC tal como a aprox. 5ºC durante 1 a 10 días, preferentemente bajo agitación.
El material de algas suspendido se separa luego del medio acuoso por medio de un método de separación apropiado tal como filtración, tamizado o centrifugación y la hexosa oxidasa se recupera subsiguientemente del filtrado o sobrenadante. Opcionalmente, el material de algas separado es sometido a uno o más pasos de extracción adicionales.
Como varias algas marinas contienen pigmentos de color tales como las ficocianinas, puede requerirse someter el filtrado o sobrenadante a un paso de purificación adicional por el cual se eliminan estos pigmentos. Como ejemplo, los pigmentos pueden ser eliminados tratando el filtrado o sobrenadante con un solvente orgánico en donde los pigmentos son solubles y separando subsiguientemente el solvente que contiene los pigmentos disueltos del medio acuoso.
La recuperación de hexosa oxidasa del medio de extracción acuoso se realiza por cualquier método convencional adecuado que permite la aislación de proteínas del medio acuoso. Tales métodos, ejemplos de los cuales se describirán en detalle a continuación, incluyen métodos tales como cromatografía de intercambio de iones, seguida opcionalmente por un paso de concentración tal como ultrafiltración. También es posible recuperar la enzima agregando substancias tales como por ej. (NH_{4})_{2}SO_{4} que hace que precipite la proteína, seguido por separación del precipitado y someterlo opcionalmente a condiciones que permitan que se disuelva la proteína.
Para el propósito de la invención es conveniente proveer da enzima en una forma substancialmente pura, por ej., como una preparación esencialmente sin otras proteínas o contaminantes que no son proteínas y por consiguiente, la preparación de enzima relativamente cruda que resulta de los pasos de extracción y aislación indicados más arriba es sometida preferentemente a pasos de purificación ulterior tales como pasos de cromatografía adicional, filtración por gel o cromatoenfoque como se describirá también a modo de ejemplo a continuación.
Como se mencionó más arriba, el polipéptido con actividad hexosa oxidasa de acuerdo con la invención se provee por medio de métodos de tecnología de ADN recombinante que permiten producirlo cultivando en un medio de cultivo una célula de un organismo huésped de levadura apropiado que comprende una codificación de gen para la hexosa oxidasa y recuperando la enzima de las células y/o el medio de cultivo.
El método para producir hexosa oxidasa que se provee aquí comprende como un primer paso la aislación o la construcción de un fragmento de ADN que codifica la hexosa oxidasa. Se encuentran disponibles varias estrategias para proveer tal fragmento de ADN. Así, el fragmento de ADN puede ser aislado cono tal de un organismo que produce inherentemente la hexosa oxidasa. Para identificar la ubicación del fragmento de ADN codificador, se requiere disponer de secuencias de sonda de ARN o ADN que bajo condiciones apropiadas se hibriden al fragmento de ADN buscado y aislar subsiguientemente un fragmento de ADN que comprende la secuencia codificadora y clonándolo en un vector de donación adecuado.
Otra estrategia adecuada, que se revela en detalle en los ejemplos más abajo, es aislar mARN de un organismo que produce la hexosa oxidasa y usar tal mARN como el punto de partida para la construcción de una biblioteca cADN que puede ser usada luego para la síntesis de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de ADN basado en cebadores oligonucleótidos que son sintetizados basados en secuencias de aminoácidos de la hexosa oxidasa. Se halló que tal estrategia es adecuada para proveer un fragmento de ADN que codifica la hexosa oxidasa. A modo de ejemplo tal estrategia como se describe en detalle más abajo es descripta en forma resumida.
Se preparan oligonucleátidos sintéticos basados en las secuencias de péptidos HOX-2 y HOX-3 preparados como se describió aquí más abajo por digestión endoLys-C de un polipéptido de 40 kD de hexosa oxidasa extraído de Chondrus crispus. La PCR usando un cADN de primera hebra como molde y con un cebador HOX-2 de sentido y un cebador HOX-3 de sentido contrario produjo un fragmento de ADN de 407 bp. Este fragmento fue insertado en un vector E. coli pT7 Blue y subsiguientemente fue secuenciado. Se halló que además de las secuencias para los péptidos HOX-2 y HOX-3 este fragmento de 407 bp también contenía un marco de lectura abierto que contenía los péptidos HOX-4 y HOX-5 del fragmento de hexosa oxidasa derivado de Chondrus crispus de 40 kD, cuya aislación también se describe a continuación.
Los oligonucleótidos de sentido y antisentido fueron sintetizados basados en el fragmento de 407 bp, y dos fragmentos de 800 y 1400 bp, respectivamente, pudieron ser aislados subsiguientemente por PCR usando cADN como molde. Estos dos fragmentos fueron donados en el vector pT7 Blue y subsiguientemente secuencia. La secuencia de ADN del fragmento 5' mostró un marco de lectura abierto que contenía el péptido HOX-6 que también fue aislado del fragmento de hexosa oxidasa derivado de Chondrus crispus de 40 kD. En forma similar, el fragmento 3' mostró un marco de lectura que contiene el HOX-1, cuya aislación se revela más abajo, y el HOX-7 y el HOX-8, ambos aislados de un polipéptido de hexosa oxidasa derivado de Chondrus crispus de 29 kD obtenido por digestión endoLys-C como también se describirá a continuación.
Basado en las secuencias de ADN combinadas como se mencionó más arriba, se sintetizaron un oligonucleótido correspondiente al extremo 5' del gen hox supuesto y un oligonucleótido correspondiente al extremo 3' de ese gen. Estos dos oligonucleótidos fueron usados en la PCR usando cADN de primera hebra como molde dando por resultado un fragmento de ADN de aprox. 1,8 kb. Este fragmento fue donado en el vector de E. coli indicado más arriba y secuenciado. La secuencia de ADN era idéntica a la secuencia combinada de las secuencias extremo 5', 407 bp y extremo 3' indicadas más arriba y se concluyó que esta secuencia de ADN de aprox. 1,8 kb codifica ambos fragmentos de hexosa oxidasa derivada de Chondrus crispus, de 40 kD y de 29 kD.
Como será evidente para el experto, la estrategia indicada más arriba para aislar un fragmento de ADN que codifica un polipéptido con actividad hexosa oxidasa, incluyendo la aislación caracterización de la hexosa oxidasa, puede ser usada para la construcciones de tales fragmentos que codifican las hexosa oxidasas derivadas de cualquier otra fuente natural distinta de Chondrus crispus incluyendo las especies de algas marinas mencionadas más arriba.
Alternativamente, la secuencia de ADN del fragmento de ADN que codifica el polipéptido con actividad hexosa oxidasa puede ser construido sintéticamente por métodos estándar establecidos, por ej., el método de fosfoamidita descripto por Beaucage y Caruthers (1981) o el método descripto por Matthes et al. (1984). De acuerdo con el método de fosfoamidita los oligonucleótidos son sintetizados, por ej., en un sintetizador de ADN automático, purificados, reasociados, ligados y clonados en un vector apropiado.
Además, el fragmento de ADN puede ser de origen genómico y sintético mixto, sintético y cADN mixto o genómico y cADN mixto, preparado ligando subfragmentos de origen sintético, genómico o cADN como sea apropiado, correspondiendo los subfragmentos a varias partes del fragmento de ADN entero, de acuerdo con técnicas estándar.
En un paso subsiguiente del método de acuerdo con la invención, el fragmento de ADN que codifica el polipéptido con actividad hexosa oxidasa aislado o sintetizado es introducido en un organismo huésped apropiado en donde el fragmento de ADN es combinado en forma operable con una señal de expresión para el fragmento de ADN. Tal introducción puede ser realizada por métodos que son bien conocidos para el experto incluyendo la construcción de un vector que tiene el fragmento insertado y transformando el organismo huésped con el vector. Vectores adecuados incluyen plásmidos que son capaces de replicación en el organismo huésped seleccionado. También se contempla que el fragmento de ADN puede ser integrado en el cromosoma del organismo huésped, por ej., insertando el fragmento en un elemento transportable tal como un transposon, y sometiendo una mezcla del organismo huésped seleccionado y del transposon a condiciones en las cuales el transposon será integrado al cromosoma del organismo huésped y se combinará con una señal de expresión apropiada.
De acuerdo con la invención, un fragmento de ADN que codifica el polipéptido con actividad hexosa oxidasa incluyendo e gen para el polipéptido, que es producido por métodos como los que se describieron más arriba o cualquier método alternativo conocido en la técnica, puede ser expresado en forma enzimáticamente activa usando un vector de expresión. Un vector de expresión incluye generalmente los componentes de un vector de donación típico, es decir, un elemento que permite la replicación autónoma, del vector en el organismo huésped seleccionado y uno o más marcadores fenotípicos para propósitos de selección. Un vector de expresión incluye secuencias de control que codifican un promotor, operador. sitio de ligadura de ribosomas, señal de iniciación de traducción y opcionalmente un gen represor o uno o más genes activadores. Para permitir la secreción del polipéptido expresado, puede insertarse una secuencia de señales en la línea de entrada de la secuencia codificadora del gen. En el presente contexto, el término "señal de expresión" incluye cualquiera de las secuencias de control arriba indicadas, secuencias represoras o activadoras y secuencias de señales. Para la expresión bajo la dirección de las secuencias de control, el gen que codifica la hexosa oxidasa está ligado en forma operable a las secuencias de control de manera adecuada con respecto a la expresión. Las secuencias promotoras que pueden ser incorporadas en los vectores plasmídicos, y que pueden soportar la transcripción del gen de hexosa oxidasa incluyen, pero no están limitados al promotor tac, los promotores derivados del fago lambda, incluyendo los promotores P_{L} y P_{R}.
Un vector de expresión que lleva el fragmento ADN de la invención puede ser cualquier vector que es capaz de expresar el gen de hexosa oxidasa en el organismo huésped seleccionado, y la elección del vector dependerá de la célula huésped en la cual tiene que ser introducido. Así, el vector puede ser un vector que se replica autónomamente, es decir un vector que existe como una entidad extra-cromosómica, cuya replicación es independiente de la replica cromosómica, por ej. un plásmido, un bacteriófago o un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en una célula huésped es integrado en el genoma de la célula huésped y replicado junto con el cromosoma.
\newpage
En el vector, el fragmento de ADN que codifica el polipéptido con actividad hexosa oxidasa debería ser combinado en forma operable con una secuencia promotora adecuada. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que confiere actividad transcripcional al organismo huésped de elección y puede ser derivado de genes que codifican proteínas que son o bien homólogas o heterólogas con respecto al organismo huésped. Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción del fragmento de ADN de la invención en un huésped bacteriano son el promotor del operón lac del E. coli, los promotores del gen de agarasa dagA del Streptomyces coelicolor, los promotores del gen de \alpha-amilasa (amyL) del Bacillus licheniformis, los promotores del gen de amilasa maltogénica (amyM) del Bacillus stearothermophilus, los promotores del gen de \alpha-amilasa (amyQ) del Bacillus amyloliguefaciens, los promotores de los genes xylA y xylB del Bacillus subtilis.
Para la transcripción en una especie fúngica, ejemplos de promotores útiles son aquellos derivados de los genes que codifican la alcohol oxidasa Pichia pastoris, la TAKA amilasa del Aspergillus oryzae, la proteinasa aspártica del Rhizomucor miehei, la \alpha-amilasa neutra del Aspergillus niger, la \alpha-amilasa estable al ácido del A. niger,la glucoamilasa del A. niger, la lipasa del Rhizomucor miehei, la proteasa alcalina del Aspergillus oryzae, la triosa fosfato isomerasa del Aspergillus oryzae o la acetamidasa del Aspergillus nidulans. Como ejemplos de promotores adecuados para la expresión en una especie de levadura pueden mencionarse los promotores Gal 1 y Gal 10 del Saccharomyces cerevisiae.
El vector que comprende el fragmento de ADN que codifica el polipéptido con actividad hexosa oxidasa puede comprender también un marcador seleccionable, por ej., un gen cuyo producto complementa un defecto en el organismo huésped tal como una mutación que confiere un fenotipo auxotrópico, o el marcador puede ser uno que confiere resistencia a los antibióticos o resistencia a iones de metales pesados.
El organismo huésped de la invención que comprende o bien una construcción de ADN o un vector de expresión, como se describió más arriba, se usa ventajosamente como una célula huésped en la producción recombinante de un polipéptido de acuerdo con la invención. La célula puede ser transformada con una construcción de ADN que comprende el gen que codifica el polipéptido de la invención o, convenientemente integrando la construcción de ADN en el cromosoma huésped. Una integración como ésta es considerada generalmente ventajosa ya que el fragmento de ADN es más probable que sea mantenido en forma estable en la célula. La integración de las construcciones de ADN en el cromosoma huésped puede ser realizada de acuerdo con métodos convencionales tales como, por ej., recombinación homóloga o heteróloga o por medio de un elemento transposable. Alternativamente, el organismo huésped puede ser transformado con un vector de expresión como se describió más arriba.
Un organismo huésped de levadura puede ser seleccionado ventajosamente de una especie de Saccharomyces incluyendo Saccharomyces cerevisiae o una especie que pertenece a los Schizosaccharomyces. Organismos huéspedes adecuados entre los hongos filamentosos incluyen especies de Aspergillus, por ej. Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans o Aspergillus niger. Anternativamente, cepas de una especie Fusarium, por ej. Fusarium oxysporum o de una especie Rhizomucor tal como Rhizomucor miehei pueden ser usadas como el organismo huésped. En una forma de realización preferida se usa una cepa de la especie Pichia pastoris como organismo huésped.
Algunos de los organismos huésped útiles indicados más arriba pueden ser transformadas por medio de un procedimiento que incluye la formación de protoplastos y la transformación de tos protoplastos seguida por la regeneración de la pared celular de una manera conocida per se.
Para la producción del polipéptido con actividad hexosa oxidasa, las células del organismo huésped recombinante como se describió más arriba son cultivadas bajo condiciones que conducen a la expresión del polipéptido en una forma recuperable. El medio usado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional adecuado para cultivar las células huésped en cuestión y obtener la expresión del polipéptido. Medios adecuados se pueden obtener de proveedores comerciales o pueden ser preparados de acuerdo con recetas publicadas.
El polipéptido resultante es recuperado típicamente del medio de cultivo por medio de procedimientos convencionales incluyendo la separación de las células del medio por centrifugación o filtración, si es necesario, después de la ruptura de las células, seguido por precipitación de los componentes proteináceos del sobrenadante o filtrado, por ej. por adición de una sal tal como sulfato de amonio, seguido por un paso de purificación.
Un aspecto industrialmente conveniente de la invención es que los cultivos microbianos que se usan en la preparación de productos alimenticios o forrajes pueden ser usados como el organismo huésped que expresa el gen codificador del polipéptido con actividad hexosa oxidasa.
También se considera que los cultivos de levadura tales como la levadura de panificación o los cultivos de levaduras que se usan en la preparación de bebidas alcohólicas incluyendo vino y cerveza pueden ser usados como organismos huéspedes para el gen codificador del polipéptido con actividad hexosa oxidasa de la invención. Por ejemplo, en el caso de tales cepas de levaduras de panificación recombinantes, la hexosa oxidasa que se produce tendrá un efecto mejorador de masa como se describe a continuación.
De lo anterior es evidente que la adición directa de cultivos microbianos recombinantes que expresan la hexosa oxidasa de acuerdo con la invención a un producto alimenticio o cualquier otro producto en donde se desea la actividad hexosa oxidasa, puede ser usada como una alternativa a la adición de la enzima aislada.
En formas de realización adicionales industrialmente importantes, los cultivos microbianos recombinantes que expresan un polipéptido con actividad hexosa oxidasa se usan en un bioreactor para la producción de la enzima o para la producción de lactonas de cualquiera de los carbohidratos arriba mencionados que pueden ser oxidados por la enzima con actividad hexosa oxidasa. Para esta última aplicación, las células de los cultivos microbianos son ventajosamente inmovilizadas sobre un soporte sólido tal como un material polímero, que se encuentra preferentemente en forma de partículas pequeñas para proveer una superficie grande para ligar las células. Alternativamente, la enzima aislada puede ser usada para el propósito indicado más arriba, también preferiblemente unida a un material de soporte sólido. En esta conexión, la ligadura de las células o la enzima puede ser provista por cualquier método convencional para ese propósito.
En otras formas de realización útiles de la invención, el polipéptido que tiene actividad hexosa oxidasa puede ser un producto de fusión, es decir, un polipéptido que además de las secuencias de aminoácidos con actividad hexosa oxidasa comprende secuencias de aminoácidos adicionales que tienen otras actividades útiles. Así, se consideran los polipéptidos de fusión que tienen una o más actividades enzimáticas además de la actividad hexosa oxidasa. Tales actividades enzimáticas adicionales pueden ser elegidas entre las enzimas capaces de degradar carbohidratos, tales como lactasa, amilasas incluyendo glucoamilasas, glucanasas, celulasas, hemicelulasas, xilanasas, lactasas o cualquier otra oxidorreductasa tal como glucosa oxidasa, galactosa oxidasa o piranosa oxidasa, y también entre las proteasas y las peptidasas, lipasas o nucleasas. La(s) secuencia(s) enzimática(s) adicional(es) a ser elegida(s) para integración en un polipéptido con actividad hexosa oxidasa de acuerdo con la invención depende(n) del producto para el cual está previsto el producto de fusión enzimáticamente activo. Así, como ejemplos, se considera que un polipéptido de fusión con actividad hexosa oxidasa para usar en la preparación de un producto lácteo comprende ventajosamente una lactasa, una proteasa o una peptidasa, y que un polipéptido de fusión previsto para mejorar una masa puede comprender como elemento asociado de fusión cualquiera de las enzimas degradantes de carbohidratos. También es evidente que las células microbianas de acuerdo con la invención como se describió más arriba y que expresan un polipéptido de fusión con actividad hexosa oxidasa que tienen actividades enzimáticas adicionales pueden ser usadas para inoculación de otros productos alimenticios y alimento para animales de la manera que también se describió más arriba.
También se considera que un elemento asociado de fusión adecuado puede ser una secuencia que confiere a la hexosa oxidasa características alteradas tales como solubilidad o una secuencia que puede servir como un grupo "agregado" que confiere a la hexosa oxidasa la capacidad de ligarse más fuertemente o más selectivamente a un material sólido particular para propósitos de purificación o inmovilización del polipéptido con actividad hexosa oxidasa.
Además, está dentro del alcance de la invención proveer el polipéptido como un producto quimérico que comprende secuencias parciales de polipéptidos con actividad hexosa oxidasa derivados de diferentes fuentes y que son codificados por un fragmento de ADN que es construido combinando secuencias de ADN que codifican polipéptidos con actividad hexosa oxidasa de estas diferentes fuentes en un fragmento de ADN que codifica todo el polipéptido quimérico.
En una forma de realización útil el método de acuerdo con la invención es uno en donde el fragmento de ADN que codifica el polipéptido con actividad hexosa oxidasa comprende por lo menos una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo compuesto por:
(i)
Tyr-Glu-Pro-Tyr-Gly-Gly-Val-Pro (SEC ID nº 1),
(ii)
Ala-Ile-Ile-Asn-Val-Thr-Gly-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Tyr-Asp-X-X-X-Gly-Tyr-X-Val-Ser-Ser (SEC ID nº 2),
(iii)
Asp-Leu-Pro-Met-Ser-Pro-Arg-Gly-Val-Ile-Ala-Ser-Asn-Leu-X-Phe (SEC ID nº 3),
(iv)
Asp-Ser-Glu-Gly-Asn-Asp-Gly-Glu-Leu-Phe-X-Ala-His-Thr (SEC ID nº 4),
(v)
Tyr-Tyr-Phe-Lys (SEC ID nº 5),
(vi)
Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Val-Ile-Asp-Val-Asn-Ala-Gly-Thr-X-Asp (SEC ID nº 6),
(vii)
Leu-Gln-Tyr-Gln-Thr-Tyr-Trp-Gln-Glu-Glu-Asp (SEC ID nº 7),
(viii)
X-Ile-Arg-Asp-Phe-Tyr-Glu-Glu-Met (SEC ID nº 8),
en donde X representa un aminoácido seleccionado entre el grupo compuesto por Ala, Arg, Asn, Asp, Asx, Cys, Gln, Glu, Glx, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val.
Como se mencionó más arriba, el método de acuerdo con la invención puede incluir, como un paso adicional, una purificación de la preparación de polipéptidos inicialmente recuperados del medio y/o de los microorganismos de cultivo. El propósito de este paso adicional es obtener una preparación enzimática en la cual el polipéptido con actividad hexosa oxidasa se encuentra en forma substancialmente pura. El término "forma substancialmente pura" implica que la preparación no tiene substancias contaminantes indeseadas que se originan en el medio de cultivo, las células del organismo huésped de producción o substancias producidas por estas células durante el cultivo. Así, para muchas aplicaciones es importante que la preparación de polipéptido resultante del paso de purificación no tiene substancialmente ninguna actividad enzimática hexosa oxidasa. Los métodos de purificación dependerán del grado de pureza que se desee, pero serán seleccionados típicamente de los métodos de purificación de proteínas convencionales, tales como desalado, procedimientos de cromatografía de intercambio de iones o de afinidad, incluyendo la cromatografía de interacción hidrófoba y los métodos de filtración en gel, tal como el método descripto en los siguientes ejemplos.
Como se mencionó más arriba, la invención se refiere en un aspecto adicional a un polipéptido en forma aislada que tiene actividad hexosa oxidasa, que comprende por lo menos una de las secuencias de aminoácidos indicadas más arriba, o muteínas y variantes de los mismos como se describen más arriba. Preferentemente, el polipéptido es producido de acuerdo con los métodos que se describieron más arriba.
Dependiendo del método de producción, en particular del organismo huésped en cuestión, el polipéptido de acuerdo con la invención puede ser glucosilado a un grado diverso o puede ser expresado para ciertos propósitos ventajosamente en una forma substancialmente no glucosilada.
En una forma de realización preferida de la invención, el polipéptido es uno que tiene características funcionales idénticas o parcialmente idénticas a las de la hexosa oxidasa que ocurre naturalmente en la especie de alga Chondrus crispus como se describe en la técnica anterior. Se halló que tal hexosa oxidasa extraída de una fuente de algas, cuando se sometió a una PAGE-SDS como se describió aquí puede mostrar bandas de proteínas separadas de 29, 40 y/ó 60 kD.
Para obtener un uso del polipéptido generalmente efectivo con respecto al costa, se prefiere que la enzima tenga una actividad enzimática sobre un amplio rango de pH. Así, se prefiere que la hexosa oxidasa de acuerdo con la invención muestre por lo menos una actividad enzimática a un pH en el rango de 1-9, tal como en el rango de 2-9, incluyendo el rango de 5-9. A este respecto se considera que el rango de pH de actividad o el pH óptimo de una hexosa oxidasa naturalmente derivada puede ser modificado en una dirección deseada y a un grado deseado modificando la enzima como se describió más arriba o por mutagénesis al azar de un replicón o un organismo huésped que comprende la codificación de ADN para la hexosa oxidasa, seguido por la selección de mutantes que tienen las características de pH alteradas deseadas. Alternativamente, tales modificaciones de la enzima pueden ser dirigidas a modificar la termotolerancia y la temperatura óptima para la actividad del polipéptido con actividad hexosa oxidasa, o a cambiar el punto isoeléctrico de la enzima.
Además, el polipéptido de acuerdo con la invención es de preferencia enzimáticamente activo dentro de un amplio rango de temperatura tal como un rango de 10-90ºC, por ej., dentro de un rango de 15-80ºC incluyendo el rango de 20-60ºC. En particular, se prefiere para ciertos propósitos específicos que el polipéptido con actividad hexosa oxidasa mantenga una actividad enzimática residual significativa a temperaturas de 70ºC o mayores, por ej., cuando la enzima está prevista para ser usada en masas en donde puede ser útil tener actividad hexosa oxidasa durante por lo menos parte del paso de horneado subsiguiente.
El alcance de la aplicación de la hexosa oxidasa depende del rango de carbohidratos que pueden usar como substrato. Aunque la hexosa oxidasa parece tener la mayor especificidad de substrato con respecto a las hexosas, tales como glucosa, galactosa y manosa, se ha hallado que el rango de substancias carbohidratos que pueden ser utilizadas como substratos para el polipéptido de acuerdo con la invención no está limitado a las hexosas. Así, un polipéptido preferido es uno que además de una alta especificidad contra las hexosas también tiene una alta especificidad con respecto a otras substancias carbohidratos incluyendo los disacáridos tales como lactosa, maltosa y/o celobiosa e incluso especificidad substancial con respecto a las pentosas incluyendo como ejemplo la xilosa, o desoxipentosas o desoxihexosas tales como rhamnosa o fucosa. Tiene importancia práctica significativa que la hexosa oxidasa además de una alta especificidad con respecto a las hexosas y otros monosacáridos también tiene especificidad substancial con respecto a los disacáridos, en particular lactosa presente en la leche y maltosa que, entre otros, ocurre en las harinas de cereales y masas.
Por consiguiente, en otra forma de realización preferida el polipéptido de acuerdo con la invención es uno que en adición a la D-glucosa oxida por lo menos un azúcar seleccionado entre el grupo compuesto por D-galactosa, maltosa, celobiosa, lactosa, D-manosa, D-fucosa y D-xilosa.
En otra forma de realización preferida el polipéptido con actividad hexosa oxidasa tiene un punto isoeléctrico en el rango de 4-5. Específicamente, el polipéptido puede tener preferentemente un punto isoeléctrico de 4,3 \pm 0,1 o uno de 4,5 \pm 0,1.
Generalmente, el polipéptido de acuerdo con la invención tiene un peso molecular según se determinó por filtración en gel usando Sephacryl S-200 Superfine (Pharmacia) que está en el rango de 100-150 kD. Un peso molecular determinado por éste o métodos equivalentes también es denominado peso molecular aparente. Específicamente, el polipéptido puede tener un peso molecular aparente de 110 kD \pm 10 kD.
En otro aspecto aún, la invención provee una molécula de ADN recombinante que comprende un fragmento de ADN que codifica un polipéptido que tiene actividad hexosa oxidasa. Como se ha descripto más arriba, tal fragmento de ADN puede ser aislado de una fuente natural o puede ser construido, por ej., cono se describe en detalle en los ejemplos más abajo. Además, el fragmento codificador también puede ser sintetizado basado en secuencias de aminoácidos de una hexosa oxidasa que ocurre naturalmente. La molécula recombinante puede ser seleccionada de cualquiera de los tipos de vectores de expresión como se mencionó más arriba. En formas de realización preferidas, la molécula de ADN recombinante comprende un fragmento de ADN que codifica un polipéptido de hexosa oxidasa que comprende por lo menos una de las secuencias de aminoácidos indicadas más arriba (i) a (viii) o una muteína o derivado de tal polipéptido. En una forma de realización específica, la molécula de ADN recombinante comprende la siguiente secuencia de ADN (SEC ID nº 30):
1
Además, la invención provee en otro aspecto una célula de levadura microbiana que comprende la molécula de ADN recombinante indicada más arriba. La descripción general realizada más arriba del organismo huésped que comprende un fragmento de ADN que codifica el polipéptido de acuerdo con la invención comprende una célula microbiana como esa y por consiguiente, tales células pueden ser seleccionadas entre cualquiera de los grupos, familias, géneros y especies microbianos mencionados más arriba, es decir, la célula microbiana puede ser seleccionada de entre una célula de levadura, incluyendo como ejemplos una célula de Saccharomyces cerevisiae y una célula de Pichia pastoris.
La célula microbiana de acuerdo con la invención puede ser provista, si está prevista para la adición directa a un producto en el cual se desea tener actividad hexosa oxidasa, por ej., durante un proceso de fabricación, en forma de un cultivo microbiano, preferentemente en una forma concentrada. Así, un cultivo como éste puede contener ventajosamente la célula microbiana de acuerdo con la invención en una concentración que se encuentra preferentemente en el rango de los 10^{5} a 10^{12} por g de cultivo. El cultivo puede ser un cultivo fresco, es decir, una suspensión no congelada de las células en un medio líquido o puede ser en forma de un cultive congelado o secado, por ej., un cultivo secado por congelado. La célula microbiana puede ser, inmovilizada también para propósitos específicos en un substrato sólido.
Como se mencionó más arriba, la invención se refiere en otro aspecto adicional al uso del polipéptido con actividad hexosa oxidasa de acuerdo con la invención o de una célula de levadura microbiana que expresa tal polipéptido en la preparación de productos alimenticios. En este contexto el término "preparación" debería comprenderse en su sentido más amplio, de modo de comprender la adición de la hexosa oxidasa o la célula de levadura microbiana a los ingredientes para el producto alimenticio en cuestión antes, durante o después de cualquier paso subsiguiente del proceso, durante el envasado y durante el almacenamiento del producto terminado hasta que sea consumido. Los productos alimenticios en donde tal uso es ventajoso pueden ser cualquier producto en donde los productos finales de la hexosa oxidasa confieren efectos ventajosos sobre el producto alimenticio.
Naturalmente, la actividad deseada de la hexosa oxidasa sólo será obtenida si el substrato para la enzima está presente en cantidades suficientes. Los carbohidratos substrato pueden estar presentes inherentemente en el producto alimenticio o los ingredientes para el mismo, o pueden ser agregados o generados durante el proceso de preparación. Un ejemplo de substrato que es generado durante la preparación es la degradación enzimática de di-, oligo- o polisacáridos a substancias de azúcares inferiores que son degradables por la hexosa oxidasa, lo que puede ocurrir como resultado de la actividad enzimática de las enzimas inherentemente presentes en el producto alimenticio agregadas durante la preparación. Además el substrato para el polipéptido con actividad hexosa oxidasa puede ser generado como resultado de la actividad enzimática de un elemento asociado de fusión como se describió más arriba.
Los efectos deseables de la actividad hexosa oxidasa en un producto que contiene substratos para la enzima incluyen la generación de lactonas a partir del substrato de azúcar que pueden ser convertidas subsiguientemente a los ácidos correspondientes, generación de peróxido de hidrógeno y consumo de oxígeno.
Ejemplos típicos de productos alimenticios en donde puede ser ventajosa la actividad hexosa oxidasa incluyen como ejemplos los productos lácteos, los productos alimenticios que contienen almidón y bebidas no lácteas. Por lo tanto, en la preparación de un rango de productos lácteos se desea bajar el pH. Esto se obtiene convencionalmente inoculando la leche con cultivos iniciadores que producen ácido láctico. Como se mencionó más arriba, se contempla que la hexosa oxidasa o los organismos que expresan esta enzima pueden ser usados como un medio alternativo para acidificar leche. El mismo efecto puede ser conveniente en otros productos alimenticios que son acidificados durante la preparación tales como ciertos productos cárnicos o productos vegetales que son acidificados corrientemente por la adición de cultivos iniciadores bacterianos de ácido láctico.
El consumo de oxígeno resultante de la actividad de la hexosa oxidasa tiene varias implicaciones ventajosas en relación con la preparación de productos alimenticios y farmacéuticos. Al causar la depleción o remoción del oxígeno en los alimentos o en los productos farmacéuticos que contienen lípidos que tienden a procesos de descomposición oxidativa, la hexosa oxidasa puede actuar como un antioxidante y adicionalmente, la reducción del contenido de oxígeno puede inhibir los organismos de descomposición, cuyo crecimiento depende de la presencia de oxígeno y por consiguiente, el polipéptido con actividad hexosa oxidasa puede actuar también como un agente antimicrobiano.
Este último efecto puede ser utilizado para extender la vida de estante de los alimentos envasados en donde se puede evitar la descomposición por la incorporación del polipéptido con actividad hexosa oxidasa de acuerdo con la invención o bien en el producto alimenticio mismo o proporcionando una mezcla de la hexosa oxidasa y un substrato apropiado para la misma en el envase, pero separado del contenido del producto alimenticio. En un ejemplo típico, una mezcla como ésta está agregada a la parte interior de un recipiente para alimentos tal como, por ej., una lata o un pote. Por consiguiente, la hexosa oxidasa de acuerdo con la invención puede ser usada como un agente que elimina el oxígeno en un envase para alimentos.
Es evidente que los efectos indicados más arriba del polipéptido de acuerdo con la invención en la preparación de productos alimenticios también será aplicable en la preparación de productos para forraje para animales. En particular, estos efectos son convenientes para la preparación de forraje ensilado hecho de cultivos de forraje tales como asto o maíz, o de productos de desechos animales proteináceos en mataderos o de plantas procesadoras de pescado. Tales productos alimenticios son ensilados corrientemente con la adición de ácidos o bacterias que producen ácidos tales como inoculantes bacterianos de ácido láctico. Para promover el crecimiento de bacterias acidificantes y para prevenir el crecimiento de organismos de descomposición aeróbicos tales como bacterias gram-negativas y levaduras es esencial tener un ajo contenido de oxígeno en el material de ensilado. Se contempla por lo tanto que la hexosa oxidasa de acuerdo con la invención es útil como agente para la remoción de oxígeno y la codificación en el ensilado de forraje para animales, opcionalmente en forma de composiciones que comprenden adicionalmente uno o más aditivos del forraje ensilado convencionales tales como inoculantes bacterianos de ácido láctico o enzimas que generan su de azúcar de bajo eso molecular.
Una aplicación útil adicional del polipéptido de hexosa oxidasa de acuerdo con la invención es el uso de la enzima para reducir el contenido de azúcar de un producto alimenticio, que comprende agregar al producto una cantidad del polipéptido o de una célula microbiana que produce el polipéptido que es suficiente para eliminar por lo menos parte del azúcar inicialmente presente en el producto alimenticio. Una aplicación como ésta puede ser útil, por ej., en la preparación de dietas para pacientes diabéticos en donde se desea un bajo contenido de azúcar, y en la producción de vinos con un contenido de alcohol reducido. En esta última aplicación, la hexosa oxidasa se agrega preferentemente al mosto antes de la inoculación de la levadura.
En un aspecto útil adicional, la invención se refiere al del polipéptido con actividad hexosa oxidasa o de una célula de levadura microbiana que produce la enzima de acuerdo con la invención en la preparación de productos farmacéuticos, cosméticos o productos para el cuidado de los dientes tales como pastas dentífricas o dentífricos. Los efectos deseados de la hexosa oxidasa en tales productos son esencialmente aquellos descriptos más arriba con respecto a los productos alimenticios y a los forrajes para animales.
Un uso particularmente interesante de la hexosa oxidasa de acuerdo con la invención es su uso como un agente mejorador de masa. Se ha hallado que la adición de la hexosa oxidasa a la masa da por resultado una resistencia aumentada de la misma la ruptura cuando se estira la masa, es decir, la enzima confiere a la masa una resistencia aumentada, por lo que se torna menos propensa a la deformación mecánica. Se considera que, basado en los efectos conocidos a este respecto para la glucosa oxidasa, que este efecto de adición de la hexosa oxidasa de acuerdo con la invención a una masa es el resultado de la formación de enlaces cruzados entre los grupos tiol en aminoácidos que contienen azufre en proteínas de harina que ocurre cuando el peróxido de hidrógeno generado por la enzima en la masa reacciona con los grupos tiol que son oxidados de esta manera.
Por consiguiente, la invención provee también un método para preparar un producto horneado a partir de una masa, que comprende agregar a la masa una cantidad efectiva del polipéptido o una levadura de acuerdo con la invención que es capaz de expresar tal polipéptido, y una masa que mejora la composición que comprende el polipéptido o una levadura capaz de expresar tal polipéptido en una masa, por lo menos un componente de la masa convencional. En formas de realización útiles una composición como ésta puede comprender además por lo menos una enzima mejoradora de masa de producto de panificación, por ej., seleccionada entre una celulasa, una hemicelulasa, una pentosanasa, una lipasa, una ilanasa, una amilasa, una glucosa oxidasa y una proteasa.
En otros aspectos de la invención, la hexosa oxidasa es usada como un reactivo analítico en métodos para determinar en muestras biológicas y en otras muestras la concentración de cualquier azúcar que puede ser convertido por la enzima. Típicamente, el contenido de azúcar es medido determinando la cantidad de productos finales resultantes de la conversión enzimática del azúcar substrato presente en la muestra a ser medida. A este respecto, se considera que la hexosa oxidasa puede ser usada directamente como un reactivo en un ensayo analítico in vitro o que puede ser incorporada en un sensor.
La invención se describirá ahora por medio de la ilustración en los siguientes ejemplos (el ejemplo 5 se proporciona como referencia) y los dibujos adjuntos, en los cuales:
la Figura 1 representa un panorama esquemático de la purificación de la hexosa oxidasa (HOX) y las dos estrategias adoptadas para obtener información sobre la secuencia de aminoácidos,
la Figura 2 muestra electroforesis en gel de oliacrilamida no disociante, nativa (PAGE nativa) de reparaciones de hexosa oxidasa en diferentes pasos de la purificación. Las muestras representan la preparación enzimática obtenida después de la cromatografía de intercambio de aniones y la concentración (zona 1), después de filtración gel (zona 2), y después de cromatografía de intercambio de cationes (zona 3) o cromatoenfoque (zona 4). El gel Phast (Pharmacia, gel 8-25% gradiente) fue teñido con plata. Los pesos moleculares de las proteínas estándar (x 10^{-3}) se indican a la izquierda. La banda correspondiente a la hexosa oxidasa, indicada por una flecha, fue identificada por tinción de enzimas de otro gel en paralelo (que no se muestra). Las cuatro zonas fueron corridas en geles separados.
La Figura 3 muestra el perfil UV obtenido durante la purificación de la hexosa oxidasa por filtración en gel sobre Sephacryl S-200 HR como se describe en el texto. Las fracciones que contenían actividad hexosa oxidasa (HOX) se indican por el área llena.
La Figura 4 muestra PAGE-SDS de hexosa oxidasa purificada de Chondrus crispus por cromatografía de intercambio de aniones en DEAE-Sepharose Fast Flow, filtración en gel en Sephacryl S-200 seguido por cromatografía de intercambio de cationes en s-Sepharose Fast Flow (zona 1) o cromatoenfoque en una columna Mono P (zona 2). Los pesos moleculares de las proteínas estándar (x 10^{-3}) son indicados a la izquierda. Los polipéptidos a 60 kD, 40 kD y 29 kD son marcados con flechas. muestras reducidas fueron corridas en un gel de poliacrilamida 12% que fue teñido con Coomassie Brilliant Blue R-250. Las dos zonas fueron corridas en geles separados,
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La Figura 5 muestra el enfoque isoeléctrico (IEF) de la exosa oxidasa. El gel fue teñido con Coomassie Brilliant Blue R-250 (zona 1) o teñido por actividad enzimática como se escribe en el texto (zona 2). Las posiciones de los marcadores de punto isoeléctrico corridos en paralelo se muestran a la izquierda. Las dos zonas fueron corridas en geles separados,
La Figura 6 muestra separación de péptidos por HPLC de fase inversa generada por digestión del polipéptido-HOX de 40 kD con endoproteinasa Lys-C. Los picos marcados 1, 2, 3, 4 y 5 fueron sometidos a secuenciación de aminoácidos,
La Figura 7 muestra separación de péptidos por HPLC de fase inversa generada por digestión del polipéptido-HOX de 29 kD con endoproteinasa Lys-C. Los picos marcados 1 y 2 fueron sometidos a secuenciación de aminoácidos,
La Figura 8 muestra un análisis de transferencia Northern de ARN extraído de Chondrus crispus. El gel de agarosa desnaturalizada fue cargado con 30 \mug (zona 1) y 3 \mug (zona 2), respectivamente de ARN total. La flecha izquierda indica el transcripto especifico de hexosa oxidasa. Las posiciones de los marcadores de peso molecular en kb se muestran a la derecha,
La Figura 9 muestra la construcción de plásmido pUPO153 que hace de intermediario en la expresión de hexosa oxidasa recombinante en Pichia pastoris. Las flechas pequeñas indican cebadores PCR. El cuadro gris indica el gen de hexosa oxidasa,
La Figura 10 muestra purificación de hexosa oxidasa recombinante de Pichia pastoris por cromatografía de intercambio de aniones en columna HiTrap-Q (paso uno). La actividad (\medbullet) alcohol oxidasa (AOX) y la actividad (\medcirc) hexosa oxidasa (HOX) en las fracciones recolectadas fueron ensayadas como se describió en el texto,
La Figura 11 muestra purificación de hexosa oxidasa recombinante de Pichia pastoris por filtración en gel en Sephacryl S-200 200 HR (paso dos) La actividad (\medbullet) alcohol oxidasa (AOX) y la actividad (\medcirc) hexosa oxidasa (HOX) en las tracciones recolectadas fueron ensayadas como se describió en el texto,
La Figura 12 muestra la construcción de plásmido pUPO181 que hace de intermediario en la expresión de hexosa oxidasa recombinante en E. coli. Las pequeñas flechas indican cebadores de PCR (el cuadro gris indica el gen de hexosa),
La Figura 13 muestra PAGE-SDS de hexosa oxidasa: reco producida en E. coli. Se analizaron extractos crudos de células lisadas en un gel desnaturalizante 14%. Los pesos moleculares de las proteínas estándar (x 10^{-3}) se indican a la izquierda. El gel fue teñido con Coomassie Brilliant Blue R-250. La zona 1 muestra extracto de células de E. coli con pUPO181, la zona 2 muestra plásmido-menos control. La flecha muestra la banda de hexosa oxidasa y
La Figura 14 muestra la construcción de plásmido pUPO155 que hace de intermediario en la expresión de hexosa oxidasa recombinante en Saccharomyces cerevisiae. Las pequeñas flechas indican cebadores de PCR. El cuadro gris indica el gen de hexosa oxidasa.
Ejemplo 1 Purificación de hexosa oxidasa de Chrondrus crispus
En la Fig. 1 se muestra un panorama esquemático de la purificación y dos estrategias adoptadas para obtener información de la secuencia de aminoácidos para la enzima.
1.1. Recolección, secado y trituración de Chrondrus crispus
El alga roja Chondrus crispus fue recogida durante abril a setiembre en la costa cerca de Grenå, Jutland, Dinamarca, a una profundidad de 2-5 metros. Las frondas de algas recién recogidas fueron enjuagadas con agua fría y almacenadas en hielo durante el transporte al laboratorio (<24 horas). El alga luego fue o bien secada inmediatamente o almacenada en estado congelado hasta el procesamiento ulterior. Para la purificación de la enzima el material se almacenó a -18ºC, mientras que el material previsto para aislación de mARN fue almacenado en nitrógeno líquido.
Las frondas de Chondrus crispus fueron descongeladas a 4ºC y secadas al aire a temperatura ambiente (20-25ºC) durante 2-3 días. El material secado fue triturado a un fino polvo en un Waring Commercial Blendor (modelo 34BL97, Waring, New Harford, Connecticut, EE.UU.).
1.2. Extracción de la enzima
Aproximadamente 500 g de polvo de Chondrus crispus fueron mezclados con 2,5 l de Tris-Cl 20 mM, pH 7,0. El agua usada en todos los procedimientos de extracción y purificación fue obtenida de un sistema de purificación de agua Milli-Q UF Plus Laboratory (Millipore). El tampón fue enfriado previamente a 4ºC. La mezcla fue mantenida a 4ºC durante 6-8 días. El extracto fue recogido por filtración a través de varias capas de gasa.
El material de alga fue sometido a repetidas extracciones que fueron realizadas como la primera descripta más arriba. El material fue descartado generalmente después de 5-8 extracciones cuando la actividad residual había declinado a un nivel casi insignificante.
El filtrado fue clarificado por centrifugación a 10.000 g en un rotor Sorvall GSA (Sorvall Instruments). El sobrenadante fue filtrado a través de papel de cromatografía Whatman (chr 1) y diluido con agua a una conductividad de 7-8 mS/cm. El pH fue ajustado a 7,5. El extracto estaba listo entonces para la cromatografía de intercambio de aniones como se describe más abajo.
1.3. Ensayo de hexosa oxidasa
El procedimiento usado era esencialmente como el descripto por Sullivan e Ikawa, 1973. Este ensayo está basado en el principio de que el peróxido de hidrógeno formado en la oxidación del azúcar en presencia de la peroxidasa reacciona con la substancia cromógena, o-dianisidina para formar un colorante con absorbancia a 402 nm.
La mezcla de ensayo estaba compuesta por 1-40 \mul de muestra de enzima y 850 \mul de una solución de ensayo que contenía 370 \mul de tampón de fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,0; 462 \mul de D-glucosa 0,1 M en tampón de fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,0; 9 \mul de peroxidasa de rábano picante, 0,1 mg/ml en agua (Sigma Chemicals, cat. nº P 6782 o Boehringer Mannheim, cat. nº 814.393); y 9 \mul de o-dianisidina\cdot2HCl, 3,0 mg/ml en agua (3,3'-dimetoxibencidina, Sigma Chemicals). Después de incubación a temperatura ambiente durante 15 ó 30 minutos el ensayo fue detenido por adición de una gota de HCl al 37% (Merck, p.a.). Muestras de 100 \mul fueron transferidas de los tubos de ensayo a las cavidades de una placa de microtitulación (NUNC, Dinamarca) y la absorbancia a 410 nm fue leída en un lector de placa Titertek Multiskan II PLUS (Labsystems/Flow Laboratories, Finlandia). Para asegurar que la actividad observada se debía a hexosa oxidasa - y no a glucosa oxidasa - el ensayo fue realizado ocasionalmente con D-galactosa como el substrato en lugar de D-glucosa.
1.4. Cromatografía de intercambio de aniones
Este paso fue realizado en un sistema de cromatografía BioPilot (Pharmacia Biotech, Suecia) conectado a un recolector de fracciones SuperRac (LKB-Produkter AB, Suecia).
Este y los siguientes pasos en la purificación fueron realizados a temperatura ambiente (20-25ºC), pero el recolector de fracciones fue colocado en un refrigerador de modo que las fracciones recolectadas fueron almacenadas a 4ºC hasta el ensayo de la enzima. Se registraron la absorbancia a 280 nm y la conductividad. El extracto fue aplicado sobre una columna XK50/30 (Pharmacia, 5,0 x 25 cm) con un volumen de lecho de 500 ml que había sido empaquetado con DEAE-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) y equilibrado con tampón A: Tris-Cl 20 mM, pH 7,5. El caudal fue de 5 ml/min. durante la aplicación de la muestra y 10 ml/min. durante los pasos subsiguientes de la cromatografía. Después de la aplicación de la muestra, la columna fue lavada con 1200 ml de tampón A. Las proteínas adsorbidas fueron eluídas con 2800 ml de un gradiente de 0% a 100% tampón B: Tris-Cl 20 mM, NaCl 500 mM, pH 7,5. Las fracciones de 15 ml fueron recogidas durante la elución del gradiente.
Después de cada corrida cromatográfica la columna fue regenerada con 500 ml de NaOH 0,5 M, neutralizada con 500 ml de Tris-Cl 1,0 M, pH 7,5 y finalmente equilibrada con 1200 ml de tampón A. Las fracciones recolectadas fueron ensayadas con respecto a actividad hexosa oxidasa como se describió más arriba (40 \mul de muestra, 30 min. de tiempo de incubación). Las fracciones de actividad hexosa oxidasa fueron combinadas y almacenadas a 4ºC.
1.5. Concentración de fracciones que contenían actividad hexosa oxidasa
Varios pools de fracciones de cromatografía en DEAE-Sepharose fueron combinadas y concentradas por ultrafiltración en un sistema de cassettes de ultrafiltración de Millipore Lab (cat. nº XX420LCS0). El sistema fue equipado con una célula de membrana de límite de peso molecular nominal (NMWL) de 30.000 (cat. nº PTTKOLCP2) y fue accionado por una bomba peristáltica. Después de concentración a temperatura ambiente a aprox. 50 ml, la preparación enzimática fue concentrada ulteriormente a 10-20 ml por ultrafiltración centrífuga a 4ºC en concentradores Centriprep (Amicon, USA, corte de peso molecular nominal 30.000) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La solución enzimática concentrada fue almacenada a 4ºC.
1.6. Electroforesis en gel de poliacrilamida nativa (PAGE)
La composición de la preparación de hexosa oxidasa obtenida por cromatografía de intercambio de iones y ultrafiltración fue analizada por PAGE nativa en Pharmacia Phast System, ver Fig. 2. Se corrieron los geles de gradiente 8-25% y se tiñeron con plata para determinar proteínas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Un kit que contenía los siguientes marcadores de peso molecular también fue obtenido de Pharmacia: tiroglobulina (669.000); ferritina (440.000); catalasa (232.000); lactato deshidrogenasa (140.000) y albúmina (67.000).
La tinción para determinar la actividad hexosa oxidasa fue realizada como se describió para glucosa oxidasa por Sock & Rohringer (1988). En principio, la reacción redox catalizada por glucosa oxidasa o hexosa oxidasa es acoplada con reducción de sal de tetrazolio a formazan insoluble, coloreado.
Inmediatamente después de electroforesis el gel Phast fue sumergido en 10 ml de solución de tinción recién preparada que contenía: D-glucosa 0,1 M (o D-galactosa); ácido cítrico fosfato de sodio 85 mM, pH 6,5; 0,2 mg/ml de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolio ("azul tiazolilo", MTT, Sigma Chemicals, cat. nº M 2128); y 0,1 mg/ml de sal N-metil-dibenzopirazina metil sulfato ("fenazina metosulfato"), PMS, Sigma Chemicals cat. nº P 9625). El gel fue incubado a temperatura ambiente en la obscuridad hasta que resultó bien visible una banda azul-violeta, coloreada (generalmente 5-90 minutos) y luego fue enjuagada en ácido acético a 10%, glicerol al 5% y secadas al aire.
El gel teñido con plateado se observa en la Fig. 2, zona 1. Como se observa en la figura, estaban presentes numerosas proteínas en este paso de purificación. Por tinción de enzimas, sin embargo, sólo se tiñó la banda marcada con una flecha en la Fig. 2 (los resultados no se muestran).
1.7. Filtración en gel
Este paso en la purificación fue realizado en un sistema FPLC (Pharmacia) equipado con una columna XK26/70 (2,6 x 66 cm, Pharmacia) con un volumen de lecho de 350 ml. La columna fue empaquetada con Sephacryl S-200 HR (Pharmacia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El tampón fue Tris-Cl 20 mM, NaCl 500 mM, pH 7,5 y el caudal fue de 0,5 ml/min. Se registró la absorbancia-UV 280 nm. Las fracciones de 2,5 ml fueron recogidas con un recolector de fracciones FRAC-100 (Pharmacia) que fue colocado en un refrigerador (4ºC) cerca de la FPLC. La preparación concentrada de hexosa oxidasa fue clarificada por centrifugación a 30.000 rpm en un rotor de cubetas oscilante SW60 (Beckman) en una ultracentrífuga L7 (Beckman) durante 60 min. a 4ºC. Una alícuota de 3,0-4,0 ml del sobrenadante fue mezclada con glicerol al 5% (Sigma Chemicals, cat. nº G 7757), filtrada a través de una unidad de filtro descartable con tamaño de poro 0,22 \mum (Millipore, cat. nº SLGV 025 BS) y aplicada sobre la columna usando un aplicador de muestras SA-5 (Pharmacia) conectado a la entrada a la columna. Las fracciones que muestran actividad hexosa oxidasa fueron identificadas usando el método de ensayo descripto más arriba (10 \mul de muestra, 15 min. de tiempo de incubación) y almacenadas separadamente a -18ºC hasta procesamiento ulterior.
El perfil UV y la posición de elución de hexosa oxidasa se muestra en la Fig. 3. Como se observa de esta figura, se eliminó una cantidad substancial de material absorbente de UV en este paso. El análisis electroforético por PAGE nativa y tinción con plata (Fig. 2, zona 2) mostró que sólo unos pocos componentes contaminantes quedaron después de este paso.
1.8. Determinación del peso molecular de hexosa oxidasa nativa por filtración en gel analítica
El peso molecular de la hexosa oxidasa nativa fue determinado por filtración en gel en Sephacryl S-200 Superfine (Pharmacia). Las dimensiones de la columna, el tampón, el caudal y recolección de fracciones fueron como se describió más arriba. El dextrano azul para determinación del volumen vacío (v_{o}) de la columna y las siguientes proteínas estándar para calibración de la columna fueron obtenidas de Pharmacia: Ovalbumin (43.000), albúmina (67.000), catalasa (158.000) y aldolasa (252.000). Una muestra que contenía hexosa oxidasa fue obtenida por cromatografía en DEAE-Sepharose como se describió más arriba. Basado en la determinación de los volúmenes de elución (v_{e}) de las proteínas estándar y de la hexosa oxidasa, se calcularon los valores K_{av} (ve -v_{o}/v_{t}-v_{o}) correspondientes. Finalmente, los valores K_{av} de las proteínas estándar fueron representados en función de los valores de registro correspondientes (peso molecular). La K_{av} de la hexosa oxidasa correspondió a un peso molecular nativo de aprox. 110.000. Esto está de acuerdo con Sullivan & Ikawa (1973), que hallaron un peso molecular de aprox. 130.000. Kerschensteiner & Klippenstein (1978) informaron un peso molecular de 140.000, también determinado por filtración en gel.
1.9. Cromatografía de intercambio de cationes
Este paso fue realizado en un sistema de cromatografía de micropurificación SMART (Pharmacia) equipado con una columna HR5/5 (Pharmacia, 0,5 x 5 cm, volumen del lecho 1,0 ml) empaquetada con S-Sepharose Fast Flow (Pharmacia). La columna fue equilibrada en tampón A: acetato de sodio 50 mM pH 4,5 (preparado ajustando ácido acético 50 mM a pH 4,5 con NaOH) El tampón B usado para elución del gradiente contenía acetato de sodio 50 mM, NaCl 500 mM, pH 4,5. Las fracciones de filtración en gel fueron desaladas en columnas de Sephadex G 25 (PD-10, Pharmacia) descartables, pre-empaquetadas, que eran equilibradas y eluídas con acetato de sodio 25 mM, pH 4,5. Veinte ml de muestra desalada derivada de 6 fracciones de filtración en gel con alta actividad hexosa oxidasa fueron aplicados en la columna de un Superloop de 50 ml (Pharmacia) a un caudal de 250 \mul/min. La columna fue lavada luego con 4 volúmenes de lecho de tampón A al mismo caudal. Las proteínas ligadas fueron eluídas con un gradiente de tampón A a tampón B sobre 5 ml. Las fracciones de 250 \mul fueron recogidas durante la elución del gradiente y ensayadas para determinar la actividad de hexosa oxidasa como se describió más arriba (1 \mul de muestra, 15 min. de tiempo de incubación) y almacenadas a -18ºC hasta uso ulterior.
La preparación resultante de hexosa oxidasa fue analizada por PAGE nativa y tinción con plata (Fig. 2, zona 3). La banda de hexosa oxidasa era ahora la única banda significativa, aunque también se observaron pequeñas cantidades de proteínas contaminantes.
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1.10. PAGE con dodecilsulfato sádico analítica (PAGE-SDS)
Las fracciones de cromatografía en S-Sepharose que mostraron actividad hexosa oxidasa también fueron analizadas por PAGE-SDS de acuerdo con Laemmli (1970). Minigeles de 12,5%- acrilamida/bisacrilamida (mezcla 37,5:1) con un espesor de 0,75 mm fueron corridos en un aparato Mini-Protean II (Bio-Rad). Los geles fueron teñidos con 0,1% de Coomassie Brilliant Blue R-250, 10% ácido acético, 40% etanol y decoloreados en 10% ácido acético, 30% etanol.
El resultado de la electroforesis se muestra en la Fig. 4, zona 1. La preparación purificada de hexosa oxidasa mostró fuertes bandas a pesos moleculares relativos de 40 kD y 29 kD, respectivamente y bandas débiles a 60 kD y 25 kD, respectivamente. Además, se observaron dos bandas doblete fuertes a 55 kD y 57 kD.
1.11. PAGE-SDS seguido por transferencia y tinción para determinar carbohidratos
Se examinó la presencia de carbohidrato en la hexosa oxidasa aislada con el Kit de detección de glucano DIG (Boehringer Mannheim), que está diseñado para la detección de cantidades de azúcares en microgramos en glucoconjugados en transferencias. En principio, los grupos hidroxilo adyacentes en carbohidratos son oxidados a aldehidos. La digoxigenina es unida luego en forma covalente a los grupos aldehido y detectada subsiguientemente con un conjugado de anticuerpo de anti-dig-oxigenina-fosfatasa alcalina.
La hexosa oxidasa purificada de la cromatografía de intercambio de cationes fue corrida en un gel PAGE-SDS al 12% como se describió más arriba, transferida a nitrocelulosa de acuerdo con procedimientos estándar y teñida para determinar carbohidratos con el kit de detección de glucanos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Ninguna de las bandas de hexosa oxidasa a 60 kD, 40 kD, 29 kD y 25 kD fue coloreada. Sólo la banda doblete fuerte a 57 kD-55 kD fue coloreada intensamente (no se muestran los resultados). La banda doblete 57 kD-55 kD fue coloreada intensamente (los resultados no se muestran). La banda doblete 57 kD-55 kD fue identificada más tarde como un contaminante residual como se describió más abajo.
Así, se podría concluir que ninguno de los componentes de la hexosa oxidasa observados en PAGE-SDS fueron glucosilados.
1.12. Enfoque isoeléctrico
Las fracciones de hexosa oxidasa de la cromatografía en S-Sepharose fueron combinadas y concentradas por ultrafiltración centrífuga en concentradores Centricon (Amicon) y analizadas por enfoque isoeléctrico (IEF) en placas de agarosa Isogel, pH 3-10, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (FMC Bioproducts, Rockland, ME, USA). Se corrió una mezcla de marcadores pl (FMC Bioproducts) en paralelo con las muestras de hexosa oxidasa. La mezcla consistió en citocromo C (pI = 10,2), banda mayor/menor de mioglobina (7,4/7,0), anhidrasa carbónica (6,1), \beta-lactoglobulina A/B (5,4/5,5), ovalbúmina (4,8), glucosa oxidasa (4,2) y amiloglucosidasa (3,6). Los geles fueron teñidos con Coomassie Brilliant Blue R-250. Como se muestra en la Fig. 5, zona 1, la preparación purificada de hexosa oxidasa estaba compuesta por dos variantes con pI de 4,3 y 4,5, respectivamente. La hexosa oxidasa purificada también fue analizada por enfoque isoeléctrico en geles de poliacrilamida pre-moldeados, pH 3,5-9,5 (Pharmacia, Ampholine PAGplates) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Estos geles fueron teñidos para determinar la actividad enzimática por incubación en una mezcla de teñido como se describió más arriba para geles de poliacrilamida nativas. Como se muestra en la Fig. 5, zona 2, ambas variantes de pI eran enzimáticamente activos.
1.13. Cromatoenfoque
La observación de varias bandas en PAGE-SDS de hexosa oxidasa purificada en S-Sepharose como el paso final despertó la sospecha de que una o más bandas pueden representar contaminantes residuales. Además, la cromatografía en S-Sepharose dio consistentemente recuperaciones bajas. Por lo tanto, el cromatoenfoque fue introducido como un último paso de purificación en lugar de cromatografía de intercambio de cationes en S-Sepharose.
El cromatoenfoque fue realizado en el sistema de cromatografía SMART equipado con una columna Mono P HR 5/5 (0,5 x 5 cm, Pharmacia) con un volumen de lecho de 1 ml y un Superloop de 50 ml para la aplicación de muestras. El tampón de partida para la separación en el intervalo entre pH 5,0 y 3,5 era piperazina 25 mM ajustada a pH 5,5 con HCl. El eluyente era Polybuffer 74 (Pharmacia) diluido 10 veces con agua y ajustado a pH 3,5 con HCl. La columna fue tratada previamente y equilibrada con tampón de partida como fue recomendado por el fabricante.
La preparación de muestras fue realizada de la siguiente manera: en un experimento típico las mejores fracciones de dos corridas de filtración en gel (fracciones 2 x 4, 20 ml) fueron combinadas y pasadas a través de una columna de 1 ml de Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high sub, Pharmacia) que había sido empaquetada en una columna Poly-prep descartable (Bio-Rad) y equilibrada en el tampón usado para filtración en gel (Tris-Cl 20 mM, NaCl 500 mM, pH 7,5). Este tratamiento eliminó casi completamente las cantidades restantes de la proteína roja ficceritrina y otras substancias coloreadas que fueron adsorbidas a la matriz del gel a esta concentración iónica, y de este modo eliminó contaminantes que solo fueron eliminados parcialmente durante los otros pasos del proceso de purificación. La columna de Phenyl Sepharose fue descartada después del uso. La actividad hexosa oxidasa fue recuperada cuantitativamente en el efluente que fue desalado luego en columnas de Sephadex G-25 descartables, pre-empaquetadas (PD-10, Pharmacia) equilibradas y eluídas con tampón de partida.
Antes de la aplicación de la muestra, se bombeó 1 ml de eluyente sobre la columna. El caudal fue de 0,5 ml/min. Después de la aplicación de la muestra el gradiente de pH fue formado bombeando 11 ml de eluyente a través de la columna. Durante la elución del gradiente de pH se recogieron 44 fracciones de 250 \mul. Se identificaron fracciones que contenían hexosa oxidasa por el método de ensayo descripto más arriba (1 \mul de muestra, 15 min. de tiempo de incubación) y almacenadas a -18ºC hasta uso ulterior.
La hexosa oxidasa purificada por cromatoenfoque fue analizada por PAGE nativa y tinción de plata (Fig. 2, zona 4) y por PAGE-SDS y tinción con Coomassie Brilliant Blue (Fig. 4, zona 2). En la PAGE nativa la banda de hexosa oxidasa era la única banda significativa, y sólo se observaron cantidades muy bajas de contaminantes. Por PAGE-SDS se demostró claramente que este método de purificación fue capaz de eliminar la banda doblete fuerte a 57 kD y 55 kD. La banda a 25 kD observada después de cromatografía en S-Sepharose era muy débil después de cromatoenfoque.
En conclusión, la hexosa oxidasa obtenida por cromatografía DEAE, filtración en gel y cromatoenfoque mostró una banda en PAGE nativa. En PAGE-SDS se observaron bandas fuertes a 40 kD y 29 kD y una banda débil a 60 kD.
Como la intensidad del componente de 60 kD, con respecto a los componentes de 40 kD y 29 kD, varió entre las diferentes preparaciones de la enzima, se planteó la hipótesis de que los polipéptidos de 29 kD y 40 kD pueden originarse en el procesamiento proteolítico de un precursor de aprox. 60 kD. Esto concordaría con la idea de una estructura homo-dímera de la enzima con un peso molecular nativo de 110.000-120.000 como se halló realmente por filtración en gel, como se describió más arriba. Además, esta hipótesis sería consistente con los resultados obtenidos por Kerschensteiner y Klippenstein que hallaron un peso molecular nativo de 140.000 en filtración en gel y un peso molecular de la subunidad de 70.800 en PAGE-SDS (Kerschensteiner y Klippenstein, 1978).
Ejemplo 2 Generación y análisis de secuencia de aminoácidos de fraqmentos de péptidos de hexosa oxidasa 2.1. Digestión de hexosa oxidasa purificada con bromuro de cianógeno
Este procedimiento fue realizado mientras se usaba aún cromatografía de intercambio de cationes en S-Sepharose como el último paso de purificación.
La hexosa oxidasa obtenida por purificación en DEAE Sepharose, Sephacryl S-200 y S-Sepharose fue transferida a un tampón volátil por intercambio de tampón en una columna de desalado rápido PC3,2/10 pre-empaquetada que contenía Sephadex G-25 superfino (Pharmacia, 0,32 x 10 cm, volumen del lecho 0,8 ml) que fue montada en el sistema SMART indicado más arriba. La columna fue equilibrada y eluida con bicarbonato de amonio 200 mM (BDH, AnalaR) Para obtener una recuperación satisfactoria fue necesario agregar cloruro de sodio 500 mM a la muestra de hexosa oxidasa antes de inyección.
La hexosa oxidasa eluida, con intercambio de tampón, fue distribuida en tubos de microcentrifugación de 1,5 ml y liofilizada en un concentrador Speedvac (Savant Instruments). Se agregó bromuro de cianógeno (CNBr, Pierce), 200 \mul de una solución 10 mg/ml en 70% de ácido fórmico v/v (Promega) (Reactivos de Promega fueron componentes de un sistema de separación de péptidos ``Probe Design^{TM} cat. nº V6030). Los tubos fueron incubados durante la noche a obscuras y a temperatura ambiente. Las soluciones fueron secadas luego en el concentrador speed vac, suspendidas nuevamente en 50 \mul de agua y secadas nuevamente.
2.2. Separación de fraqmentos de bromuro de cianógeno por PAGE-SDS de alta resolución y electrotransferencia a membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF)
Los péptidos generados por digestión de bromuro de cianógeno fueron separados por PAGE-SDS de alta resolución de acuerdo con Schägger & von Jagow (1987) Este sistema provee excelente separación de péptidos de bajo peso molecular (20-250 residuos de aminoácidos). El sistema de gel estaba compuesto por un gel de separación 16,5%, un gel espaciador 10% y un gel apilador 4%, todos hechos usando una mezcla de acrilamida/bisacrilamida 29:1 de Promega.
Los minigeles con un espesor de 0,75 mm fueron corridos en un aparato Mini-Protean II (Bio-Rad). Persulfato de amonio y N,N,N',N'-tetrametil-etilendiamina (TEMED) eran de Bio-Rad. SDS era de United States Biochemical (ultrapuro). Tris era de Fluka (cat. nº 93350). Tricina y tioglicato de sodio eran de Promega. Glicina (p.a.), 2-mercaptoetanol (p.a.) y azul de bromofenol era de Merck y glicerol de GIBCO BRL (ultrapuro). Tioglicolato de sodio, 0,1 mM fue agregado al tampón del cátodo justo antes del uso para evitar el bloqueo químico de los términos amino de los péptidos durante la separación. El gel fue corrido previamente durante 60 min. a 30 V para permitir que el tioglicolato depure cualquier substancia amino-reactiva.
Preparación de la muestra: Los fragmentos de péptidos de bromuro de cianógeno secados fueron suspendidos nuevamente en 30 \mul de tampón con carga de gel que contenía Tris-Cl 63 mM, pH 6,8, SDS 1%, 2,5% 2-mercaptoetanol, 10% de glicerol y 0,0012% de azul bromofenol. Las muestras que se volvieron amarillas después del mezclado, debido al contenido de ácido fórmico residual fueron neutralizadas por adición de 1-3 \mul de Tris base 1,0 M hasta que se restauré el color azul. Las muestras fueron desnaturalizadas por calentamiento a 95ºC durante 5 min. antes de la aplicación en el gel. Una mezcla de estándares de peso molecular de proteínas de bajo rango (Promega) con pesos moleculares entre 31.000 y 2.500 se corrieron en paralelo con las muestras de péptidos con actividad hexosa oxidasa. La electroforesis se corrió a 150V de tensión constante.
La transferencia electroforética a la membrana PVDF fue realizada en una célula de transferencia electroforética Mini Trans-Blot (Bio-Rad) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tres capas de membrana Problott (Applied Biosystems) cortadas a la medida del gel fueron mojadas brevemente en metanol (Merck, p.a.) y luego embebidas en tampón de transferencia (Tris 25 mM, glicina 192 mM, pH 8,5, enfriada previamente a 4ºC) hasta que se configuraba el sandwich de transferencia. Después de electroforesis el gel fue incubado en tampón de transferencia durante 5 min. a 4ºC y luego configurado en un sandwich de transferencia que tiene las siguientes capas: una capa de papel Whatman (3MM chr), o dos capas de membrana Plobott, el gel de separación de péptidos PAGE-SDS, la tercera capa de Problott, y una capa final de papel Whatman. El sandwich fue orientado con las dos capas de membrana Problott hacia el electrodo positivo en el conjunto de electrodos. La unidad de enfriamiento fue montada en la cámara de tampón antes de que fuera llenada con tampón de transferencia enfriado previamente y la transferencia fue realizada luego a temperatura ambiente durante 60 min. a 100V y de tensión constante. Durante la transferencia la corriente aumentó de desde aprox. 270 mA a aprox. 400 mA.
Después de la transferencia la membrana fue lavada en agua durante 1 min. y luego coloreada durante 30-45 seg en 100 ml de solución de tinción recién preparada que contenía 0,1% Coomassie Brilliant Blue R-250 (Bio-Rad), 5% ácido acético (Merck, p.a.) y 45% de metanol (Merck, p.a.). La membrana fue descoloreada con 3 cambios de aprox. 80 ml de ácido acético al 5% recién preparado, 45% de metanol durante 30-60 seg. cada uno. La membrana fue lavada finalmente en 3 cambios de agua para eliminar la glicina residual y luego fue secada al aire. Bandas bien resueltas y relativamente abundantes de pesos moleculares de aprox. 2,5 kD, 9 kD y 16 kD, respectivamente fueron retiradas y sometidas a análisis de aminoácidos y análisis de secuencias.
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2.3. Análisis de aminoácidos y secuenciación de un fragmento de bromuro de cianógeno de 9 kD de hexosa oxidasa
El análisis de aminoácidos fue realizado por cromatografía de intercambio de iones y derivación post-columna con o-ftaldialdehido. Las muestras fueron hidrolizadas a 110ºC durante 20 h en HCl 6 M, 0,05% fenol y 0,05% ácido ditiopropiónico (Barkholt y Jensen, 1989). Los péptidos fueron secuenciados en un secuenciador de proteína/ péptido automatizado de Applied Biosystems, modelo 477A, equipado con analizador PTH en línea, modelo 120A y sistema de análisis de datos. Los reactivos de secuenciación de proteínas fueron obtenidos de Applied Biosystems. El análisis de los aminoácidos y el análisis de la secuencia de péptidos fue realizado por Aine L. Jensen, Departamento de Química de Proteínas, Universidad de Copenhague, Dinamarca.
La secuencia de péptidos identificada por análisis del fragmento de 9 kD se muestra en la Tabla 2.1.
El rendimiento inicial de feniltiohidantoina-tirosiiia (PTH-Tyr) en el paso uno era de 22 pmol La composición de aminoácido del fragmento de 9 K se muestra en la Tabla 2.2.
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TABLA 2.1
2
TABLA 2.2
3
2.4. PAGE-SDS preparativa y electrotransferencia de membrana PVDF
El siguiente procedimiento fue realizado para obtener secuencias de aminoácidos que se sabía específicamente que provenían de o bien del polipéptido de 40 kD o del de 29 kD de la preparación de hexosa oxidasa.
Los geles PAGE-SDS preparativos fueron corridos de acuerdo con Laemmli (Laemmli, U.K., 1970). Los minigeles que contenían 12,5% de acrilamida/bisacrilamida (mezcla 37,5:1) con un espesor de 0,75 mm fueron corridos en un aparato Mini-Protean II (Bio-Rad). La solución de acrilamida (BDH, cat. nº 44313) y N,N'-metilen-bis-acrilamida (BDH, cat. nº 44300) fue almacenada sobre resma de intercambio de iones de lecho mixto (Bio-Rad, cat. nº 142-6425). Las fuentes de todos los otros reactivos eran como se describió más arriba.
Preparación de la muestra: se concentraron fracciones de cromatoenfoque por ultrafiltración centrífuga a 4ºC en unidades de filtro Ultrafree-MC con NNWL 10.000 y una capacidad de muestra de 400 \mul (Millipore, cat. nº UFC3 LGC25). La substancia retenida fue mezclada con un volumen de gel que cargaba 2X tampón que contenía Tris-Cl 125 mM, pH 6,8, 2% SDS, 5% 2-mercaptoetanol, 20% glicerol y 0,0025% de azul de brontofenol. Las muestras que se tornaron amarillas después del mezclado, debido al contenido de componentes Polybuffer ácidos, fueron neutralizadas por adición de 1-3 \mul de Tris base 1,0 M, hasta que se restauró el color azul. Las muestras fueron desnaturalizadas calentando a 95ºC durante 5 min. y aplicadas en el gel en alicuotas de aprox. 30 \mul por zona.
Una mezcla de proteínas marcadoras de peso molecular (Bio-Rad) con pesos moleculares que oscilaban entre 97.400 y 14.400 se corrió en paralelo con las muestras de hexosa oxidasa. La electroforesis fue corrida a baja corriente, 10 mA por gel, para minimizar el riesgo de modificación química, inducida térmicamente, de las proteínas de muestra.
La transferencia electroforética a la membrana PVDF fue realizada como se describió más arriba, excepto que se usó una capa de membrana Immobilon P (Millipore, cat. nº IPVH 15150) en lugar de tres capas de Problott. El sandwich fue orientado con la membrana de transferencia hacia el electrodo positivo en el conjunto de electrodos.
Después de la transferencia la membrana Immobilon P fue enjuagada en agua durante 10 seg. y luego coloreada durante 45-60 seg. en 100 ml de solución de tinción recién preparada que contenía 0,025% de Coomassie Brilliant Blue R-250, 5% de ácido acético y 40% de metanol. La membrana fue descoloreada durante 2-3 min. en 250 ml de ácido acético 5% recién preparado, 30% etanol (96% v/v, Danisco, Dinamarca). La membrana fue secada al aire finalmente y almacenada a 4ºC.
El modelo de banda en la transferencia era idéntico al modelo observado en la PAGE-SDS analítica después de la purificación final por cromatoenforque. Mostró bandas fuertes a 40 kD y 29 kD, además de una banda débil a 60 kD.
Las bandas a 40 kD y 29 kD fueron retiradas de la transferencia y usadas para análisis de aminoácidos y para digestión enzimática de polipéptidos ligados a la membrana, como se describió más abajo. La cantidad de material de 60 K era demasiado bajo para permitir todo análisis ulterior de este polipéptido.
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2.5. Análisis de aminoácidos de polipéptidos de 40 kD y 29 kD de hexosa oxidasa
Las composiciones de aminoácidos de los componentes de 40 kD y 29 kD de hexosa oxidasa se presentan en la Tabla 2.3.
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TABLA 2.3
4 
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2.6. Digestión enzimática de polipéptidos de hexosa oxidasa ligados a PVDF
La digestión de polipéptidos de hexosa oxidasa ligados a PVDF y la extracción de los péptidos proteolíticos resultantes fue realizada como describieron Fernandez et al. (1992) y Fernandez et al. (1994).
Digestión del polipéptido de 40 kD de hexosa oxidasa: se retiraron once bandas de 40K con un contenido de proteína total estimado de aprox. 5 \mug (correspondiente a aprox. 125 pmoles) de la membrana PVDF teñida con azul de Coomassie, descoloreada en metanol durante 1-2 min. y enjuagada en agua durante 2-3 min. Las bandas de la membrana fueron cortadas en piezas de 1 x 1 mm y transferidas a tubos de microcentrífuga. Una región testigo de la membrana PVDF sirvió como un control de base. Las piezas de membrana en cubos fueron embebidas en 50 \mul de tampón de digestión que contenía 1% (v/v) Triton X - 100 hidrogenado (RTX-100, Sigma Chemicals, cat. nº X-100R-PC, o Calbiochem, grado proteína, cat. nº 648464), 10% de acetonitrilo (Merck, Lichrosolv grado de gradiente) y Tris-Cl 100 mM, pH 8,0. La enzima proteolítica seleccionada para la digestión era endoproteinasa Lys-C (endoLys-C) que segmenta cadenas de péptidos en el lado C-terminal de los residuos de usina. Una alícuota de 5 \mug de endoLys-C (Boehringer Mannheim, grado de secuenciación, cat. nº 1047 825) fue reconstituida por adición de 20 \mul de agua. Se agregaron dos \mul de solución enzimática correspondiente a 0,5 \mug (relación enzima:substrato 1:10). La digestión fue realizada a 37ºC durante 22-24 h.
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Después de la digestión, las muestras fueron sonicadas en un tanque ultrasónico (Elma transonic) durante 5 min. y centrifugadas a 1700 rpm en una microcentrífuga durante 5 min., y el sobrenadante fue transferido luego a un nuevo tubo. Lavados consecutivos con 50 \mul, de tampón de digestión y 100 \mul de ácido trifluoroacético 0,1% (TFA, Pierce, cat. nº 28902) fueron realizados con sonicación y centrifugación como se describió más arriba. Todos los sobrenadantes fueron combinados, dando por resultado un volumen de extracto de 200 \mul. Los extractos fueron mantenidos a -18ºC hasta la purificación del péptido. La digestión del polipéptido de 29 kD de hexosa oxidasa fue realizada como se describió para el componente de 40 kD, excepto que se usaron cuatro bandas con un contenido de proteína total de 2,4 \mug (aprox. 80 pmoles), de acuerdo con el análisis de aminoácidos.
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2.7. Purificación de péptidos generados con endoLys-C
Los fragmentos de péptidos obtenidos por digestión de polipéptidos de 40 kD y 29 kD fueron separados en el sistema de cromatografía SMART. El sistema fue equipado con un monitor \muPeak de longitud de onda variable y un recipiente recolector de fracciones para 60 ampollas. La columna de fase inversa usada para la separación era una columna de orificio estrecho \muRPC C2/C18 SC2,1/10 basada sílice (Pharmacia, dimensiones de columna 2,1 x 100 mm, tamaño de partícula 3 \mum, tamaño de poro promedio 125 \ring{A}). Los tampones fueron A: 0,1% TFA (Pierce) en agua Milli-Q y B: 0,1% TFA en acetonitrilo (Merck, Lichrosolv grado de gradiente). Los tampones fueron filtrados, y desgasificados por filtración al vacío en un filtro fluoroporo de 0,5 \mum (Millipore, cat. nº FHLP04700). El caudal fue de 100 \mul/min. La absorbancia de UV en el efluente fue monitoreada a 220 nm, 254 nm y 280 nm. El gradiente fue 0-30% B (0-65 min.), 30-60% B (65-95 min.) y 60-80% B (95-105 min.) La columna fue lavada luego a 80% B durante 10 min. a 100 \mul/min.y reequilibrada en el tampón A durante 45 min. a 200 \mul/min. Las fracciones de 50 \mul fueron recolectadas entre t = 15 min. y t = 105 min. (3 x 60 fracciones) y almacenadas a -18ºC hasta el análisis de la secuencia de aminoácidos.
El mapa de péptidos obtenido después de la digestión de endoLys-C del polipéptido de 40 kD se muestra en la Fig. 6. Como se ve en esta figura, la digestión y la separación en HPLC dio por resultado varios picos bien resueltos con una alta relación entre señal y ruido. Un cromatograma correspondiente de una mezcla de digestión testigo (que no se muestra) indicó que los picos que se eluían después de t = 83 min. eran no-péptidos, picos derivados de reactivos, posiblemente contaminantes absorbentes de UV del Triton X-100 hidrogenado o vestigios residuales de colorante de Coomassie. Los picos marcados 1-5 en la Fig. 6 fueron seleccionados para secuenciación de aminoácido de acuerdo con los siguientes criterios: 1) Altura del pico; 2) Pureza aparente; 3) Alta relación A_{280}:A_{220} y/o alta relación A_{254}:A_{220} que indica la presencia de residuos de aminoácidos aromáticos, que son muy útiles para la selección de secuencias de cebador PCR debido a su baja degeneración de código genético; 4) Tiempo de elución tardío, que puede indicar un péptido relativamente largo.
El cromatograma de los péptidos endoLys-C de 29 kD se muestra en la Fig. 7. Evidentemente, este componente de hexosa oxidasa dio lugar a sólo unos pocos fragmentos de péptidos significativos en comparación con el componente de 40 kD en la Fig. 6. Cuando se compararon los cromatogramas, no hubo indicación de que hubiera un fragmento de péptido en ambos substancias digeridas. Este hallazgo sugiere que los componentes de hexosa oxidasa de 40K y 29K no tienen secuencias de aminoácidos en común, lo que hubiera sido el caso si la cadena de 29 kD era generada por conversión proteolítica del polipéptido de 40 kD. (Comparado con el componente digerido de 40 kD el componente digerido de 29 kD contenía sólo pequeñas cantidades de las substancias contaminantes que se elufan más tarde que t = 83 min. La razón para ello puede ser que se usó el Triton X-100 hidrogenado de Calbiochem para la digestión del 29 kD mientras que la digestión del 40 kD fue realizada con Triton X-100 de Sigma Chemicals).
Las fracciones correspondientes a los picos marcados 1 y 2 en el mapa de péptidos de 29 kD (Fig. 7) fueron sometidos a secuenciación de aminoácidos.
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2.8 Análisis de secuencias de aminoácidos de péptidos de hexosa oxidasa generados proteolíticamente
Las secuencias de péptidos identificadas por análisis de fracciones correspondientes a los picos 1-5 en la Fig. 6 (péptidos HOX-2, HOX-3, HOX-4, HOX-5 y HOX-6) y picos 1-2 en la Fig. 7 (péptidos HOX-7 y HOX-8) se presentan en la Tabla 2.4 más abajo. Los rendimientos iniciales de los aminoácidos PTH oscilaron entre 46 pmoles de PTH-Tyr en el paso uno en el péptido HOX-5 y 6 pmoles de PTH-Ile en el paso dos en el péptido HOX-8. Como se esperaba de las absorbancias a 254 nm y 280 nm, respectivamente, de los picos seleccionados todos los péptidos secuenciados contenían por lo menos un residuo de aminoácido aromático.
TABLA 2.4 Secuencias de péptidos obtenidas por análisis de secuencias de péptidos de endoproteinasa Lys-C derivados de polipéptidos de hexosa oxidasa de 40 kD y 29 kD
5
Los residuos identificados tentativamente se muestran entre paréntesis.
1) Residuo nº 15 fue identificado como Asp o Asn.
2) Residuo nº 16 fue identificado como Asp o Ala.
3) Residuo nº 17 fue identificado como Arg o Trp.
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HOX-2 péptido = SEC ID nº 9
HOX-3 péptido = SEC ID nº 10
HOX-4 péptido = SEC ID nº 11
HOX-5 péptido = SEC ID nº 12
HOX-6 péptido = SEC ID nº 13
HOX-7 péptido = SEC ID nº 14
HOX-8 péptido = SEC ID nº 15
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Ejemplo 3 Aislamiento del gen de hexosa oxidasa de Chondrus crispus 3.1. Purificación de ARN de Chondrus crispus
Frondas recién recolectadas de Chondrus crispus fueron enjuagadas con agua fría y almacenadas inmediatamente en nitrógeno líquido hasta uso ulterior. Aproximadamente 15 gramos del talo de Chondrus crispus congelado en nitrógeno líquido fueron homogeneizados a un fino polvo en un mortero. El material homogeneizado, congelado fue transferido a un tubo de 50 ml (Nunc, cat. nº 339497) que contenía 15 ml de tampón de extracción (clorhidrato de guanidinio 8M; ácido 2-(N- morfolino)etanosulfónico (MES) 20 mM, pH 7,0; ácido etilen diaminatetraacético (EDTA) 20 mM; \beta-mercaptoetanol 50 mM).
El tubo fue agitado en torbellino y mantenido frío (0ºC) durante los pasos siguientes a menos que se indiquen otras temperaturas. Luego el tubo fue centrifugado durante 20 minutos a 6.000 x g en un Heraeus Omnifuge 2,0RS y el sobrenadante que contenía ARN (aprox. 15 ml) fue recolectado cuidadosamente y transferido a un tubo de 1,5 ml pre-erifriado. Se agregaron 1,5 ml de acetato de sodio 2 M, pH 4,25, 15 ml de fenol saturado con agua y 3 ml de cloroformo: alcohol isoamílico (49:1) al tubo que contenía el extracto ARN.
El tubo fue agitado en torbellino subsiguientemente enérgicamente durante 1/2 minuto y las fases fueron separadas centrifugando el tubo durante 20 minutos en una Omnifuge a 6.000 x g. La fase acuosa (aprox. 17 ml) fue transferida a un tubo Corex de 30 ml (Sorvall, cat. nº 00156) y se agregó un volumen igual (es decir, aprox. 17 ml.) de isopropanol frío. El tubo fue agitado en torbellino nuevamente e incubado durante por lo menos 1 hora a -20ºC. El ARN precipitado fue transformado en pellet por centrifugación durante 20 minutos a 10.000 rpm usando una centrífuga Sorvall RC-5B provista de un rotor SS34 enfriado previamente. El sobrenadante fue descartado y el ARN en pellet fue suspendido nuevamente en 4 ml de acetato de sodio 0,3 M, pH 5.5 y se agregaron 12 ml de etanol 96%.
El tubo Corex fue agitado luego en torbellino e incubado nuevamente durante por lo menos 1 hora a -20ºC seguido por una segunda transformación en pellet del ARN por centrifugación durante 20 minutos como se describió más arriba. El sobrenadante fue descartado cuidadosamente y los pellets de ARN suspendidos nuevamente en 2 ml de acetato de sodio 0,15 M, pH 5.5. Luego se agregaron 8 ml de acetato de sodio 4 M, pH 5,5, y el ARN fue precipitado en hielo durante 30 minutos y transformado en pellet nuevamente como se describió más arriba. El pellet de ARN fue lavado en etanol 70% y suspendido nuevamente en 500 \mul de agua. El ARN suspendido nuevamente fue transferido a un tubo de microcentrífuga y almacenado a -20ºC hasta uso ulterior.
La pureza y la concentración del ARN fueron analizadas por electroforesis en gel de agarosa y por mediciones de absorción a 260 nm y 280 nm como se describió en Sambrook et al. (1989).
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3.2. Aislamiento de ARN poli-adenilado de Chondrus crispus
ARN poli-adenilado fue aislado de ARN total usando cuentas magnéticas que contenían oligo dT (Dynabeads® Oligo (dT)_{25}, en mARN Purification Kit^{TM}, Dynal). Se mezclaron aproximadamente 100 \mug de ARN total con 1 mg de Dynabeads® Oligo (dT)_{25} y se aisló ARN poli-adenilado como se describió en el protocolo para el mARN Purification Kit^{TM}. El rendimiento de ARN poli-adenilado aislado con Dynabeads® era de entre 1 y 3%.
Se usaron otros métodos en el aislamiento de ARN poli-adelinado de Chondrus crispus incluyendo el uso de columnas empaquetadas con oligo-(dT)-celulosa (Clontech, cat. nº 8832- 2) o columnas pre-empaquetadas (mARN Separator Kit^{TM}, Clontech, cat. nº K1040-1) como se describió en el protocolo para el mARN Separator Kit^{TM}. El rendimiento de ARN poli-adenilado aislado de las columnas oligo-(dT) era de entre 0,1 y 1% del ARN total inicial. El ARN poli-adenilado aislado en columnas de oligo- (dT) fue usado en reacciones de síntesis de cADN como se describió más arriba (3.4), pero el rendimiento del cADN de primera hebra fue muy bajo (menos de 1%).
La razón del bajo rendimiento y la performance más pobre de ARN aislado en columnas de oligo-(dT) en comparación con ARN purificado en Dynabeads® podría ser la presencia de carbohidratos o proteoglucanos en el extracto de ARN total. Los carbohidratos que contaminaban las preparaciones de ARN total han demostrado que impiden la purificación de ARN poli adenilado y que inhiben la síntesis de cADN y por lo tanto se han desarrollado métodos para la purificación de ARN libre de carbohidratos (Groppe et al., 1993; Yeh et al.). Sin embargo, el ARN poli-adenilado purificado con estos métodos no fue tan efectivo en las reacciones de síntesis de cADN como el ARN aislado con Dynabeads®. Por consiguiente, el ARN poli adenilado purificado usando Dynabeads® fue usado como molde en las reacciones de síntesis de cADN de primera hebra (ver 3.4 más abajo).
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3.3. Oligonucleótidos específicos de hexosa oxidasa
Se sintetizaron oligonucleótidos sintéticos (tecnología ADN, ApS, Forskerparken, DK-8000 Aarhus C, Dinamarca) basado en las secuencias de aminoácidos derivados de los péptidos de hexosa oxidasa HOX-2, HOX-3 y HOX-4 (Tabla 2.4). La Tabla 3.1 muestra los oligonucleótidos y sus correspondientes secuencias de aminoácidos. También se muestra en la Tabla 3.1 la secuencia de ADN de los cebadores usados en la secuenciación de ADN o en PCR.
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(Tabla pasa a página siguiente)
6
Cuando Y es C ó T, R es A ó G; cuando W es A, ó T, S es C ó G; cuando D es A, G ó T, N es A, C, G ó T, e I=deoxilinosina.
Hox-2 = SEC ID nº 9
Hox2-3+ = SEC ID nº 16
Hox-3 = SEC ID nº 10
Hox3-2- = SEC ID nº 17
Hox-4 = SEC ID nº 11
Hox4-1+ = SEC ID nº 18
Hox4-2- = SEC ID nº 19
Hox5+ = SEC ID nº 20
Hox5- = SEC ID nº 21
Hox6+ = SEC ID nº 22
Hox7-= SEC ID nº 23
Hox8- = SEC ID nº 24
Hox10- = SEC ID nº 25
Hox11+ = SEC ID nº 26
Hox12- = SEC ID nº 27
Hox13- = SEC ID nº 28
Hox5'-1 = SEC ID nº 29
3.4. Síntesis de cADN y reacción en cadena de polimerasa (PCR)
El ARN poli-adenilado fue usado como molde en las reacciones de síntesis de cADN de primera hebra con kits que se pueden obtener comercialmente. Aproximadamente 1 \mug de ARN poli-adenilado fue transcripto en forma inversa como se describió en el protocolo para el kit de amplificación de cADN Maraton^{TM} (Clontech, cat. nº K1802-1) con Hox3-2- o Hox4-2- como cebadores. En la amplificación PCR subsiguiente el cebador de anclaje o adaptador del kit fue usado además de los cebadores específicos de hexosa oxidasa Hox3-2- o Hox4-2-, respectivamente. Los tampones usados y las condiciones para la amplificación fueron esencialmente como se describió en el protocolo para el kit de amplificación de cADN Maraton^{TM}. La amplificación PCR fue realizada con AmpliTaq (Perkin-Elmer Cetus) usando un Perkin-Elmer Thermalcycler 480^{TM} programado a 30 ciclos a 1 min. a 94ºC, 2 min. a 55ºC y 2 min. a 72ºC. La electroforesis en gel de 5 \mul de la mezcla de reacción en un gel de agarosa 1% (SeaPlaque® GTG, FMC) mostró fragmentos de ADN con tamaños aproximados de 600 pares de bases (bp) con el cebador Hox4-2- y de 700 bp con el cebador Hox3-2-.
Estos fragmentos de ADN fueron purificados del gel de agarosa usando un kit que se puede obtener comercialmente (kit de extracción en gel QIAEX^{TM} cat. nº 20020, QIAGEN^{TM}) y aprox. 100 ng de fragmento fueron ligados a 50 ng de plásmido pT7 Blue como se describió en el para el kit T-Vector de pT7 Blue (Novagen, cat. nº 69829-1). Escherichia coli DH5\alpha (Life Technologies, cat. nº 530-8258SA) o E. coli NovaBlue (Novagen) fueron transformados con la mezcla de ligadura y se analizaron adicionalmente colonias recombinantes, blancas.
ADN plasmídico de tales colonias fue purificado usando el kit Midi de plásmidos QIAGEN (QIAGEN, cat. nº 12143) y sometido a análisis de secuencia de ADN usando Sequenase (kit de secuenciación de ADN Sequenase, Versión 2.0, USB). Las reacciones de secuenciación de ADN fueron sometidas a electroforesis en gel de acrilamida (Gel-Mix®6 de secuenciación, Life Technologies). El análisis de secuencia de ADN del fragmento de 700 bp mostró un marca de lectura abierto con una capacidad de codificación de 234 aminoácidos.
La Tabla 3.2 más abajo muestra que todas las secuencias de péptidos del polipéptido de 40 kD, es decir HOX-2, HOX-3, HOX-4, HOX-5 y HOX-6, fueron halladas en la secuencia de 234 aminoácidos derivada de este marco de lectura abierto. Así, se concluyó que el fragmento de 700 bp codificaba parte del gen de la hexosa oxidasa. La secuencia de ADN del fragmento de 600 bp demostró ser idéntica a la de 600 bp proximal del fragmento de 700 bp (ver Tabla 3.2).
Los cebadores Hox2-3+ y Hox3-2- fueron usados en forma similar en la síntesis de cADN y los experimentos de amplificación PCR. Aproximadamente 50 ng de ARN poli-adenilado fueron transcriptos en forma inversa con Hox3-2- como cebador como se describió en el protocolo para el kit RACE 3'- Amplifinder^{TM} (Clontech, cat. nº K1801-1). En la amplificación PCR subsiguiente se usaron los cebadores Hox2-3+ y Hox3-2-. Los tampones usados y las condiciones para la amplificación fueron esencialmente como se describió para la polimerasa AmpliTaq (Perkin-Elmer Cetus) y en el protocolo para el kit RACE 3'-Amplifinder^{TM}. La electroforesis en gel de 5 \mul de la mezcla de amplificación PCR mostró un fragmento con un tamaño de 407 bp.
Este fragmento fue purificado, insertado en el plásmido pT7 Blue y secuenciado como se describió más arriba. La secuencia de ADN de este fragmento demostró ser idéntica a la de 407 bp distal del fragmento de 700 bp.
La secuencia de ADN en la línea de salida de los fragmentos de 700 y 407 bp fue amplificada con el kit RACE 3'- Amplifinder^{TM}(Clontech) usando el cebador de anclaje del kit como cebador 3' y los cebadores específicos dehexosa oxidasa Hox5+ y Hox4+ como cebadores 5' específicos de los genes. Los tampones y las condiciones para la amplificación fueron como se describió más arriba. PCR y el análisis de la mezcla de reacción en geles de agarosa mostraron un fragmento con el tamaño de aprox. 1,3 kb. El fragmento fue aislado y sometido al análisis de secuencia de ADN como se describió más arriba. La secuencia de ADN de este fragmento de 1,3 kb mostró un marco de lectura abierto de 357 aminoácidos. Este marco de lectura de 357 aminoácidos contenía las secuencias de aminoácidos de los péptidos HOX-1, HCX-3, HOX-4, HOX-5, HOX-7 y HOX-8. Por lo tanto, se concluyó que el fragmento de ADN de 1,3 kb codificaba el fragmento de CNBr de 9 kD, el polipéptido de 29 kD y parte del polipéptido de 40 kD de hexosa oxidasa.
Un cebador específico para el extremo 5' de hexosa oxidasa, Hox5'-1, fue usado junto con un cebadar oligo-(dT) para amplificar el marco de lectura abierto de hexosa oxidasa completo supuesto. El gen fue amplificado usando PCR, insertado en pT7 Blue y secuenciado como se describió más arriba. La secuencia de ADN de este fragmento de 1,8 kb era idéntica a las secuencias de ADN de los fragmentos descriptos más arriba con diferencias menores. Como estas diferencias podrían ser causadas por incorporaciones erróneas durante las amplificaciones PCR, todo el gen de hexosa oxidasa fue amplificado y aislado de por lo menos tres amplificaciones de la PCR independientes. Por lo tanto, la secuencia de ADN presentada en la Tabla 3.2 presentada más abajo está compuesta por lo menos por tres secuencias de ADN derivadas independientemente para excluir errores de PCR en la secuencia.
La secuencia de aminoácidos derivada del marco de lectura abierto en la secuencia de ADN de 1,8 kb ha demostrado contener todos los péptidos HOX indicados más arriba, es decir HOX-1 a HOX-8. Por consiguiente, la secuencia de ADN de 1,8 kb codifica los fragmentos de hexosa oxidasa derivados de Chondrus crispus de 9 kD, 29 kD y 40 kD indicados más arriba. El peso molecular de este polipéptido de marco de lectura abierto derivado concuerda con la presunción de que el polipéptido es una subunidad (posiblemente un fragmento monómero) de una molécula de enzima hexosa oxidasa dímera.
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3.5. Análisis de transferencia Northern de ARN de Chondrus crispus
Un ARN total aislado de Chondrus crispus fue sometido a análisis de transferencia Northern. El ARN fue purificado como se describió más arriba (3.1) y fraccionado en un gel de agarosa formaldehido desnaturalizado y transferido a un filtro HybondC (Amersham) como describieron Sambrook et al. (1989). Usando los cebadores Hox2-3+ y Hox3-2- se sintetizó un fragmento de ADN de 400 bp por PCR como se describió más arriba (3.4). Este fragmento fue purificado de un gel de agarosa 1,2% (SeaPlaque® GTG, FMC) y marcado con ^{32}P como describieron Sambrook et al. (supra). Esta sonda de hibridación específica para hexosa oxidasa radioactiva fue usada para el sondeo en la transferencia Northern. Las condiciones para la hibridizacióri eran:
3.5.1. Prehibridación a 65ºC durante dos horas en un tampón que contiene 10 x solución de Denhardt (0,1% Ficoll, 0,1% polivinilpirrolidona, 0,1% albúmina sérica bobina), 2 x SSC (1x SSC es cloruro de sodio 0,15 M, citrato de sodio 0,015 M, pH 7,0), dodecilsulfato de sodio 0,1% (SDS), y 50 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado.
3.5.2. Hibridación a 65ºC durante por lo menos 14 horas en un tampón que contiene 1 x solución de Denhardt, 2 x SSC, sulfato de dextrano 0,1%, 50 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, y ^{32}P sonda marcada (aprox. 10^{6} dpm/ml) El filtro fue lavado dos veces a 65ºC durante 10 minutos en 2 x SSC, SDS 0,1% seguido por dos lavados a 65ºC durante 10 min. en 1 x SSC, SDS 0,1%. Después del lavado final durante 10 minutos a 65ºC en 0,2 x SSC, SDS 0,1%, el filtro fue envuelto en Saran Wrap y expuesto a una película de rayos X (Kodak XAR2) durante dos días a -80ºC usando una pantalla intensificadora Siemens-Titan HS. El autoradiograma resultante (Fig. 8) muestra que se iluminó una banda con el tamaño aproximado de 2 kb.
TABLA 3.2 Secuencia nucleótida de la secuencia de ADN de 1,8 kb (SEC ID nº: 30) y el marco de lectura abierto para una secuencia de 1 aminoácidos de hexosa oxidasa de 546 aminoácidos derivados de la secuencia de ADN (SEC ID nº:31)
7
8
9
En la secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 3.2 los péptidos HOX-1 a HOX-8 se muestran con códigos en negrita o subrayados. Los códigos en negrita indican residuos amino que han sido confirmados por secuenciación de aminoácidos de péptidos. Los códigos subrayados indican residuos de aminoácidos que se derivan de la secuencia de nucleótidos, pero que no han sido confirmados por secuenciación de péptidos HOX relevantes.
HOX-1 son los residuos de aminoácidos 461-468, HOX-2 residuos 92-114, HOX-3 residuos 219-234, HOX-4 residuos 189- 202, HOX-5 residuos 215-218, HOX-6 residuos 8-22, HOX-7 residuos 434-444 y HOX-8 residuos 452-460.
Ejemplo 4 Producción de hexosa oxidasa recombinante en Pichia pastoris 4.1. Construcción de un vector para la expresión de hexosa oxidasa recombinante en Pichia pastoris
El marco de lectura abierto que codifica la hexosa oxidasa de Chondrus crispus como se muestra en la Tabla 3.2. fue insertado en un vector de expresión de Pichia pastoris, pPIC3 (Research Corporation Technologies, Inc., Tucson, Arizona 85711-3335). El plásmido contiene el promotor de oxidasa (promotor aox1) y la señal de terminación transcripcional de Pichia pastoris (en la Fig. 9, aoxp y aoxt, respectivamente). Un gen his4^{+} en el vector posibilita la selección de células de Pichia pastoris recombinante His^{+}. Cuando este cassette de expresión es transformado en Pichia pastoris se integra en el ADN cromosómico. Las células de Pichia pastoris que albergan un cassette de expresión con un gen de hexosa oxidasa de Chondrus crispus insertado en la línea de salida del promotor aoxl pueden ser inducidas a producir hexosa oxidasa por la adición del inductor del promotor aoxl metanol. Un mutante de Pichia pastoris, KM71, que es defectuoso en el gen de alcohol oxidasa principal, aox1, puede ser usado como receptor del gen de hexosa oxidasa (Cregg y Madden, 1987; Tschopp et al., 1987). Sin embargo, Pichia pastoris contiene otro gen alcohol oxidasa, aox2, que también puede ser inducido por metanol. Así, la Pichia pastoris recombinante con un cassette de expresión de hexosa producirá dos oxidasas, la hexosa oxidasa y la alcohol oxidasa, después de la adición de metanol.
Antes de la inserción del gen de la hexosa oxidasa en el vector de expresión pPIC3, se modificaron las secuencias 5' y 3' del marco de lectura abierto. El cADN de primera hebra fue usado como molde en PCR. El oligonucleótido sintético específico para el extremo 5' del marco de lectura abierto, Hox5'-1 (Tabla 3.1) fue usado como cebador de PCR junto con un cebador (Hox3'-1) específico para el extremo 3' de la secuencia que codifica la hexosa oxidasa de Chondrus crispus. El cebador Hox3'-1 tenía la secuencia 5'-ACCAAGTTTATAAAAAGCAACCATCAC-3' (SEC ID nº 32). La amplificación de la PCR se realizó usando el kit de reactivos de PCR GeneAmp® con ADN polimerasa AmpliTaq® (Perkin-Elmer Cetus). El programa de PCR era 30 ciclos a 30 seg a 94ºC, 30 seg a 55ºC y 2 min. a 72ºC. La electroforesis en gel de la mezcla de reacción mostró una banda con el tamaño aproximado de 1,7 kb. Este fragmento de 1,7 kb fue insertado en el vector pT7 Blue (Novagen) (plásmido pUPO150) y sometido a secuenciación de ADN.
El fragmento que codifica la hexosa oxidasa de Chondrus crispus fue subclonado adicionalmente en el vector de expresión de Pichia pastoris pPIC3 (Clare et al., 1991) como se muestra en la Fig. 9. El plásmido pT7 Blue que alberga el gen de la hexosa oxidasa fue restringido con la endonucleasa de restricción NdeI y los extremos fueron pulidos con ADN polimerasa de Klenow esencialmente como describieron Sambrook et al., (1989). Después de la inactivación por calor de la ADN polimerasa (Sambrook et al., 1989) el ADN fue restringido adicionalmente con EcoRI y el fragmento de ADN que contenía el gen de hexosa oxidasa fue purificado en un gel de agarosa como un fragmento de ADN de EcoRI - extremo romo (QIAEX^{TM}, QIAGEN).
El vector de expresión de Pichia pastoris pPIC3 fue restringido con las enzimas de restricción SnaBI y EcoRI y purificado en un gel de agarosa. El vector purificado y el fragmento que codifica la hexosa oxidasa fueron ligados y la mezcla de ligadura fue transformada en E. coli DH5\alpha (Life Technologies), esencialmente como describieron Sambrook et al. (1989). El vector de expresión resultante que contiene el gen de hexosa oxidasa de Chondrus crispus, plásmido pUPO153, fue sometido a secuenciación de ADN para asegurar que no habían ocurrido mutaciones en el gen de hexosa oxidasa durante el procedimiento de subclonación.
El plásmido pUPO153 fue purificado de E. coli DH5\alpha e introducido en Pichia pastoris usando electroforación (The Pichia Yeast Expression System, Phillips Petroleum Company) o usando The Pichia Spheroplast Module (Invitrogen, San Diego, USA cat. nº K1720-01). El mutante defectuoso por utilización de metanol de Pichia pastoris, KM71 (genotipo his4, aox1::ARG4), (Cregg y Madden, 1987; Tschopp et al., 1987) fue usado como receptor. Las colonias de Pichia pastoris recombinante seleccionadas en placas de agar sin histidina fueron exploradas para determinar la presencia del gen de hexosa oxidasa usando PCR. Se usaron cebadores específicos para hexosa oxidasa (Tabla 3.1) además de los cebadores específicos para el promotor de la alcohol oxidasa de Pichia pastoris y la señal de terminación de transcripción (Invitrogen, cat. nos. N710-02 y N720-02, respectivamente).
Una muestra de KM71 de Pichia pastoris que contenía pUPO153 fue depositada en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) (Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania el 23 de mayo de 1996 bajo el número de acceso DSM 10693.
4.2. Expresión de hexosa oxidasa recombinante en Pichia pastoris
La cepa KM71 de Pichia pastoris que contenía el cassette de expresión con el gen de hexosa oxidasa insertado entre el promotor aoxIy la señal de terminación de transcripción fue cultivada en matraces de agitación en MD (1,34 gramos por litro de base nitrógeno de levadura (Difco, cat. nº 0919-15-3), 0,4 mg/l de biotina, 0,1% de arginina, y 20 g/l de glucosa). Matraces de agitación de un litro que contenían 150 ml de cultivo fueron incubados en un agitador giratorio a 30ºC, 300 rpm. Cuando las células alcanzaron una densidad de OD_{600}= 15-20 las células fueron cosechadas por centrifugación a 6.000 x g durante 10 min. y suspendidas nuevamente en un similar (150 ml) de medio de inducción, MM (1,34 g/l de base de nitrógeno de levadura, 0,4 mg/l de biotina, 0,1% de arginina y 1% de metanol). Después de cultivar durante dos días, se agregó metanol adicional (0,5%) para compensar el consumo y evaporación de metanol.
Tres o cuatro días después de la inducción las células fueron cosechadas por centrifugación (6.000 x g, 10 min.) y suspendidas nuevamente en aprox. 1/5 del volumen de crecimiento de Tris-Cl 50 mM, pH 7,5. Las células suspendidas nuevamente fueron mantenidas frías hasta la ruptura en una prensa FRENCH® (SLM Instruments, Inc., Rochester, N.Y.).
Las células se abrieron en una celda de presión FRENCH® 20K a una presión interna de 20.000 psi. El extracto de células fue aclarado por centrifugación a 10.000 x g durante 10 min. a 5ºC. La hexosa oxidasa que contenía el sobrenadante fue retirada cuidadosamente y sometida a purificación como se describió más abajo.
4.3. Purificación de hexosa oxidasa recombinante de Pichia pastoris 4.3.1. Primer paso, cromatografía de intercambio de aniones
Un homogeneizado clarificado de la homogeneización en la prensa FRENCH (100-150 ml) fue sometido a cromatografía de intercambio de aniones en un sistema FPLC equipado con dos columnas de 5 ml HiTrap-Q pre-empaquetadas con Q-Sepharose High Performance (Pharmacia). Las columnas fueron conectadas en serie y la cromatografía se realizó a temperatura ambiente. La columna fue equilibrada en tampón A: Tris-Cl 20 mM, pH 7,5. El caudal fue de 1,25 ml durante la aplicación de la muestra 2,5 ml durante el lavado y la elución. Después de la aplicación de la muestra la columna fue lavada con 30 ml de tampón A. Las proteínas adsorbidas fueron eluidas luego con 200 ml de un gradiente de tampón A al tampón B: Tris-Cl 20 mM, NaCl 750 mM, pH 7,5. Fracciones de 2 ml fueron recogidas durante el lavado y la elución del gradiente. Las fracciones fueron ensayadas para determinar actividad hexosa oxidasa como se describió más arriba en el Ejemplo 1.3 (10 \mul de muestra, 15 min. de tiempo de incubación). Las fracciones también fueron ensayadas con respecto a actividad alcohol oxidasa (AOX) en un ensayo que fue idéntico al ensayo de hexosa oxidasa excepto que se usó 0,5% de metanol en lugar de 0,05 M de glucosa como substrato. Como se observa en la Figura 10, los perfiles de actividad mostraron que AOX y HOX co-eluyeron a una concentración de sal de aprox. 400 mM NaCl. Las fracciones que contenían hexosa oxidasa fueron combinadas y almacenadas a 4ºC.
4.3.2. Segundo paso, filtración en gel
El pool del paso uno en la purificación (20-30 ml) fue concentrado a aprox. 3,5 ml por ultracentrifugación centrífuga a 4ºC en concentradores Centriprep (Amicon, USA, corte de peso molecular nominal 30.000). La preparación concentrada de hexosa oxidasa fue clarificada por centrifugación y el sobrenadante fue mezclado con glicerol a una concentración final de 5%. La muestra fue aplicada a la columna usando un aplicador de muestra SA-5 (Pharmacia) conectado a la entrada de la columna. Se realizó filtración en gel a 4ºC en una columna XK 26/70 (2,6 x 66 cm, Pharmacia) con un volumen de lecho de 350 ml. La columna fue empaquetada con Sephacryl S-200 HR (Pbarmacia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El tampón era Tris-Cl 20 mM, NaCl 500 mM, pH 7,5 y la bomba peristáltica P1 (Pharmacia) fue fijada a 0,5 ml/min. Se registró la absorbancia UV a 280 nm. Las fracciones de 2,5 ml fueron recolectadas y ensayadas con respecto a actividad hexosa oxidasa y glucosa oxidasa como se describió más arriba (10 \mul de muestra, 15 min. de tiempo de incubación). Los perfiles de actividad mostraron claramente que las actividades AOX y HOX fueron separadas, ver Fig. 11. Este resultado de la filtración en gel se esperaba ya que la alcohol oxidasa de las levaduras metilotróficas como Pichia pastoris tienen un peso molecular nativo de aprox. 600.000 (Sahm & Wagner, 1973), mientras que HOX tiene un peso molecular nativo de aprox. 110.000-130.000, como se describió en la sección 1.8. El volumen de elución del HOX recombinante era idéntico al volumen de elución observado antes en la misma columna para HOX nativo aislado directamente de Chondrus crispus (sección 1.7 y 1.8). Así, la HOX recombinante pareció tener el mismo peso molecular que la HOX nativa aislada directamente de Chondrus crispus. Las fracciones que contienen hexosa oxidas fueron combinadas y almacenadas a 4ºC.
4.3.3. Tercer paso, cromatografía de intercambio de aniones en columna Mono Q
El pool del segundo paso indicado más arriba fue purificado adicionalmente por cromatografía de intercambio de aniones en un sistema FPLC equipado con una columna Mono Q HR 5/5 (volumen del lecho 1 ml). La columna fue equilibrada en tampón A: Tris-Cl 20 mM, pH 7,5. El caudal era de 1 ml/min. El pool del paso dos fue desalado por filtración en gel en tampón A en columnas de Sephadex G-25 pre-empaquetadas (PD-10, Pharmacia). Después de la aplicación de la muestra la columna fue lavada con 30 ml de tampón A. Las proteínas adsorbidas fueron eluidas con 20 ml de un gradiente de 0% a 100% de tampón B: Tris-Cl 20 mM, NaCl 500 mM, pH 7,5. Las fracciones de 0,5 ml fueron recolectadas y ensayadas con respecto a la actividad hexosa oxidasa como se describió más arriba (10 \mul de muestra, 15 min. de tiempo de incubación). Las fracciones que contenían hexosa oxidasa fueron combinadas y almacenadas a 4ºC.
4.3.4. Cuarto paso, cromatoenfoque
El pool del tercer paso indicado más arriba fue purificado por cromatoenfoque en una columna Mono P HR 5/5 como se describió más arriba en el Ejemplo 1.13, excepto que se omitió el paso de adsorción en Phenyl Sepharose. Cuando se comparan la hexosa oxidasa nativa y la recombinante - ambas formas obtenidas por una purificación final por cromatoenfoque - se halló que la actividad específica de la hexosa oxidasa recombinante de Pichia pastoris era similar a la de la forma nativa aislada de Chondrus crispus. Las fracciones que contenían hexosa oxidasa fueron analizadas por PAGE-SDS y teflidas del gel con Coomassie Brilliant Blue R-250 como se describió más arriba. La preparación purificada de hexosa oxidasa recombinante estaba compuesta por dos bandas que migraban a 40 kD y 29 kD, respectivamente.
En conclusión, la hexosa oxidasa recombinante podría ser aislada y purificada del organismo huésped Pichia pastoris. En PAGE-SDS la enzima purificada, recombinante, presentó las mismas bandas a 40 kD y 29 kD que la enzima nativa correspondiente de Chondrus crispus.
4.4. Propiedades de hexosa oxidasa recombinante de Pichia pastoris
Generación y análisis de la secuencia de aminoácidos de los fragmentos de péptidos de hexosa oxidasa recombinante (rHOX).
La rHOX purificada fue usada para PAGE-SDS preparativa y electrotransferencia a membrana PVDF, como se describió más arriba en el Ejemplo 2.4.
Las bandas de 40 kD y 29 kD resultantes fueron sometidas a digestión enzimática de polipéptidos de hexosa oxidasa ligados a PVDF, como se describió más arriba en el Ejemplo 2.5. Los fragmentos de péptidos fueron separados por cromatografía líquida de fase inversa como se describió más arriba en el Ejemplo 2.7. Se seleccionaron péptidos bien resueltos y abundantes de los análisis de secuencias de aminoácidos por degradación de Edman automatizada (10 pasos),
como se describió más arriba en el Ejemplo 2.3. Las secuencias de aminoácidos obtenidas se muestran en la Tabla 4.1.
TABLA 4.1
10
La secuencia de péptidos HOX-9 del polipéptido 40 kD recombinante mostró una secuencia idéntica a Aspx_{8} hasta Asn_{17} en la secuencia de aminoácidos de hexosa oxidasa de Chondrus crispus como se muestra en la Tabla 3.2 (SEC ID nº 30). El análisis de secuencia de una muestra de péptidos obtenida del polipéptido de 29 kD recombinante mostró dos residuos en cada paso. Las identificaciones de aminoácidos mostraron que dos péptidos presentes en la muestra corresponden a Leu_{434} hasta Glu_{443} y Tyr_{388} hasta Thr_{397} respectivamente, en la secuencia de aminoácidos de hexosa oxidasa de Chondrus crispus, ver Tabla 3.2 (SEC ID nº: 30).
Se podría concluir por lo tanto que las secuencias de péptidos obtenidas de hexosa oxidasa recombinante eran idénticas a la correspondiente secuencia de aminoácidos de la hexosa oxidasa nativa de Chondrus crispus.
Además, se podría concluir que Pichia pastoris transformada con el gen de hexosa oxidasa de Chondrus crispus era capaz de producir hexosa oxidasa recombinante.
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4.4.1 Especificidad del substrato
La especificidad del substrato de la hexosa oxidasa recombinante de Pichia pastoris y hexosa oxidasa nativa de Chondrus crispus fue comparada usando un número de azúcares a una concentración final de 0,1 M en el ensayo descripto más arriba. Las proporciones relativas se muestran en la Tabla 4.2.
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TABLA 4.2
11 
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Como se muestra en la Tabla 4.2., la especificidad del substrato de la hexosa oxidasa recombinante fue casi idéntica a la de la enzima nativa. Sin embargo, aunque la proporción relativa entre los disacáridos disminuyó para ambas formas enzimáticas en el orden maltosa, celobiosa y lactosa, la enzima recombinante pareció ser menos selectiva en su capacidad de oxidar estos disacáridos. Los resultados para la enzima nativa fueron casi idénticos a los datos informados antes por Sullivan et al. (1973).
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4.4.2. Inhibición por dietilditiocarbamato sádico
Sullivan e Ikawa (1973) informaron que la hexosa oxidasa de Chondrus crispus es inhibida fuertemente por el dietilditiocarbamato sádico. La hexosa oxidasa recombinante de Pichia Pastoris fue comparada con la enzima nativa de Chondrus crispus con respecto a la inhibición por este compuesto ligante de cobre. El inhibidor estaba incluido en el ensayo enzimático en dos concentraciones, 0,1 mM y 0,01 mM, como describieron Sullivan e Ikawa (1973). Los resultados se resumen en la Tabla 4.3.
TABLA 4.3
12
De la Tabla 4.3. se observa que la hexosa oxidasa recombinante y la nativa eran igualmente sensibles cuando eran sometidas a inhibición por dietilditiocarbamato sódico. Además, los resultados eran similares a los datos para la hexosa oxidasa nativa informados por Sullivan e Ikawa (1973).
Ejemplo 5
Como referencia
Producción de hexosa oxidasa recombinante en Escherichia coli 5.1. Construcción de un vector para la expresión de hexosa oxidasa recombinante en Escherichia coli
El marco de lectura abierto que codifica la hexosa oxidasa de Chondrus crispus que se presenta en la Tabla 3.2. (SEC ID nº 30) fue insertado en un vector de expresión de Escherichia coli pET17b (Novagen, cat. nº 69726-1). El plásmido contiene un promotor T7 de bacteriófago fuertemente inducible y una señal de terminación de transcripción T7. Los genes insertados entre estos elementos de control pueden ser expresados por la adición de isopropil \beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) si el plásmido es propagado en células huésped de E. coli especiales, por ej., la cepa BL21 (DE3) (Novagen, cat. nº 69387-1).
El gen de la hexosa oxidasa fue modificado en los extremos 5' y 3' para insertar el gen en el vector de expresión pET17b. El gen de la hexosa oxidasa fue aislado por PCR con cebadores específicos para los extremos 5' y 3' del gen de la hexosa oxidasa. El cebador 5' (Hox5'-2) tenía la secuencia de ADN 5'-ATGAATTCGTGGGTCGAAGAGCCC-3' (SEC ID nº 33) y el cebador específico para el extremo 3' era Hox3'-1. El cADN de primera hebra de Chondrus crispus fue usado como molde. La amplificación de la PCR fue realizada con ADN polimerasa AmpliTaq® (Perkin-Elmer Cetus) como se describió en el ejemplo 4.1. La electroforesis en gel de la mezcla de reacción mostró una banda con el tamaño aproximado de 1,7 kb. Este fragmento de 1,7 kb fue insertado en el vector pT7 Blue (Novagen) dando lugar al plásmido pUPO161.
La modificación del extremo 5' del gen de la hexosa oxidasa y la subclonación ulterior del gen en el vector de expresión de E. coli se muestra en la Figura 12. El extremo 5' fue modificado por PCR para insertar un sitio NdeI justo en el comienzo de la traducción ATG. Se usó el oligonucleótido, Nox5'-4' con secuencia 5'-CAGGAATTCATATGGC
TACTCTTCCCCAGAAAG-3' (SEC ID nº 34), junto con el oligonucleótido Hox13- (SEC ID NO: 28) (Tabla 3.1). La amplificación de la PCR fue corno se describió más arriba en el Ejemplo 4.1. La mezcla de reacción fue fraccionada en un gel de agarosa 2% y el fragmento de 180 bp específico de la hexosa oxidasa fue purificada como se describió en el Ejemplo 3.4. El fragmento de 180 bp fue restringido con la endonucleasa de restricción ClaI y EcoRI y ligada a pUPO161 restringido con las mismas enzimas dando lugar al plásmido pUPO167.
El gen de la hexosa oxidasa en el plásmido pUPO167 fue subclonado adicionalmente para construir un vector de expresión de hexosa oxidasa para E. coli. El plásmido pUPO167 fue restringido con las enzimas NdeI y BamI y con las enzimas BamHI y SalI. La primera reacción dio lugar a un fragmento de 1,6 kb que codifica el extremo 5' y la parte media del gen de la hexosa oxidasa mientras que la reacción con las enzimas BamHI y SalI dio un fragmento de 200 bp que codifica el extremo 3' del gen de la hexosa oxidasa. Los dos fragmentos específicos de la hexosa oxidasa fueron purificados en geles de agarosa como se describió en el Ejemplo 3.4 y ligados al plásmido pET17b restringido con las endonucleasas de restricción NdeI y XhoI. El plásmido pET17b que albergaba el gen de la hexosa oxidasa fue denotado pUPO181. La secuenciación de ADN mostró que no se introdujo ninguna mutación en el gen de la hexosa oxidasa durante el procedimiento de aislación y donación.
5.2. Expresión de hexosa oxidasa recombinante en Escherichia coli
El plásmido pUPO181 fue introducido en la cepa BL21 (DE3) de E. coli (Novagen) por medio de un procedimiento de transformación estándar (Sambrook et al., 1989). Las células fueron cultivadas en matraces de agitación en medio LB (Sambrook et al., supra). A una densidad celular de OD_{600}=0,5 las células fueron inducidas para expresar hexosa oxidasa recombinante por la adición de 10^{-3} M IPTG. Una hora después de la adición de IPTG las células fueron cosechadas por centrifugación y suspendidas nuevamente en tampón de muestra y sometidas a PAGE-SDS como se describió más arriba en el Ejemplo 1.10.
El resultado de la electroforesis se muestra en la Figura 13. El extracto crudo de E. coli expresando la enzima hexosa oxidasa recombinante del plásmido pUPO181 mostró una banda de proteína prominente a Mr 62 kD. Esta banda de 62 kD tenía el mismo peso molecular que el producto de traducción predicho por el marco de lectura abierto. Las células de E. coli no transformadas no mostraron tal proteína de 62 kD.
Una muestra de BL21 (DE3) de E. coli que contenía pUPO181 fue depositada en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania, 23 de mayo de 1996 bajo el número de acceso DSM 10692.
Ejemplo 6 Producción de hexosa oxidasa recombinante en Saccharomyces cerevisiae 6.1. Construcción de un vector para la expresión de hexosa oxidasa recombinante en Saccharomyces cerevisiae
El marco de lectura abierto que codifica la hexosa oxidasa de Chondrus crispus que se muestra en la Tabla 3.2 (SEC ID nº 30) fue insertado en un vector de expresión de levadura, pYES2 (Invitrogen, cat. nº V825-20). El plásmido pYES2 es un vector episómico de alto número de copias designado para la expresión inducible de proteínas recombinantes en Saccharomyces cerevisiae. El vector contiene en la línea de entrada secuencias promotoras y activantes del gen de S. cerevisiae Gal1 para transcripción estrechamente regulada, de alto nivel. La señal de terminación de transcripción es del gen CYC1.
El gen de la hexosa oxidasa de Chondrus crispus fue modificado en los extremos 5' y 3' para insertar el gen en el vector de expresión pYES2. El gen de la hexosa oxidasa fue aislado del plásmido pUPO150 como se describió en el Ejemplo 4.1 (Figura 9). El gen de la hexosa oxidasa fue aislado en un fragmento de ADN de EcoRI - extremo romo como se describió, y se insertó en el plásmido pYES2 restringido con las enzimas PvuII y EcoRI (Figura 14). El plásmido resultante, pUPO155, fue sometido a secuenciación de ADN para mostrar que no había ocurrido mutación durante el procedimiento de donación.
El plásmido pUPO155 fue purificado de DH5\alpha de E. coli y transformado en S. cerevisiae por electroporación (Grey y Brendel, 1992). La cepa PAP1500 (genotipo \alpha, ura3-52, trp1.: GAL10-GAL4, lys2-801, leu2\Delta1, his3\Delta200, pep4:: HIS3, prb1\Delta1.6R, can1, GAL) (Pedersen et al., 1996) fue usada como un receptor.
6.2. Expresión de hexosa oxidasa recombinante en Saccharomyces cerevisiae
La cepa 1500 de S. cerevisiae que contenía el plásmido pUPO155 fue cultivada e inducida con galactosa al 2% como describieron Pedersen et al. (1996). Tres días después de la inducción las células fueron cosechadas por centrifugación y lisadas como se describió más arriba en el Ejemplo 4.2. El extracto crudo fue ensayado con respecto a la actividad hexosa oxidasa usando el ensayo de o-dianisidina descripto más arriba en el Ejemplo 1.3. La Tabla 6.1 muestra que las células de S. cerevisiae que albergaban el gen de la hexosa oxidasa eran capaces de expresar la hexosa oxidasa activa.
TABLA 6.1
13
Una muestra de la cepa 1500 de S. cerevisiae que contenía el plásmido pUPO155 fue depositada en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania, el 23 de mayo de 1996 bajo el número de acceso DSM 10694.
Referencias
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2. Bean, R.C. y W.Z. Hassid 1956, J. Biol. Chem. 218: 425-436.
3. Clare, J.J., F.B. Rayment, S.P. Ballantine, K. Sreekrishna y M.A. Romanos 1991. High-level expression of tetanus toxin fragment C in Pichia pastoris strains containing multiple tandem integrations of the gene. Bio/Technology 9: 455-460.
4. Cregg, J.M. y K.N. Madden 1987. Development of transformation systems and construction of methanol-utilisation-defective mutants of Pichia pastoris by gene disruption. In: Biological Research on Industrial Yeast, Vol III. Stewart, G.G. et al. (Eds). pág. 1-18. CRC Press, Boca Raton, FL.
5. Fernandez, J. et al. 1992. Internal Protein Sequence Analysis: Enzymatic Digestion for Less Than 10 \mug of Protein Bound to Polyvinylidene Difluoride or Nitrocellulose Membranes. Analytical Biochemistry. 201: 255-264.
6. Fernandez, J. et al. 1994. An Improved Procedure for Enzymatic Digestion of Polyvinylidene Difluoride-Bound Proteins for Internal Sequence Analysis. Analytical Biochemistry, 218: 112-117.
7. Groppe, J.C. y D.E. Morse 1993. Isolation of full-lenght RNA templates for reverse transcription from tissues rich in RNase and proteoglycans, Anal. Biochem, 210:337-343.
8. Kerschensteiner, D.A. y G.L. Klippenstein 1978. Purification, Mechanism, and State of Copper in Hexose Oxidase, Federation Proceedings 37: 1816 resumen.
9. Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature (London) 227:680-685.
10. Pedersen P.A., J.H. Rasmussen, and P.L. Jørgensen. 1996. Expression in high yield of pig \alpha1\beta1 Na, K-ATPase and inactive mutants D369N and D807N in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 271: 2514-2522.
11. Rand, A.G. 1972. Direct enzymatic conversion of lactose to acid: glucose oxidase and hexose oxidase. Journal of Food Science 37:698-701.
12. Sahm, H. y Wagner, F. 1973. Microbial assimilation of methanol. Eur. J. Biochem. 36: 250-256.
13. Sambrook, J., E.F. Fritsch and T. Maniatis 1989. Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2^{nd} Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
14. Schägger, H. y G. von Jagow 1987. Tricine-Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis for the Separation of Proteins in the Range from 1 to 100 kDa. Analytical Biochemistry 166:368-379.
15. Sock, J. and R. Rohringer 1988. Activity Staining of Blotted Enzymes by Reaction Coupling with Transfer Membrane-Immobilized Auxiliary Enzymes. Analytical Biochemistry 171:310-319.
16. Sullivan, J.D. y M. Ikawa 1973. Purification and Characterization of Hexose Oxidase from the red Alga Chondrus crispus, Biochemica et Biophysica Acta 309:11-22.
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18. Yeh, K-W, R.H. Juang y J-C. Su. A rapid and efficient method for RNA isolation from plants with high carbohydrate content. Focus 13: 102-103
14
16
18
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Bioteknologisk Institut
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Anker Engelunds Vej 1
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Lyngby
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PAÍS: Dinamarca
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): 2800
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TITULO DE LA INVENCIÓN: Hexosa oxidasa recombinante, procedimiento para su producción y utilización de dicha enzima
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 34
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PROGRAMA: PatentIn Edición #1.0, Versión #1.25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocido
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocido
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocido
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocido
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 4 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocido
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
\hskip1cm
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocido
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
25 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocido
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocido
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocido
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocido
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocido
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 4 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocido
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocido
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
32 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocido
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocido
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
34 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/LLAVE: base modificada; N=inosina
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: pares de base 3, 6 y 12
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN: disponible en el comercio
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
35 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/LLAVE: base modificada; N=inosina
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 6 y 12 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN: disponible en el comercio
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
36 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/LLAVE: base modificada; N=inosina
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 6 y 15 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN: disponible en el comercio
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
37 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/LLAVE: base modificada; N=inosina
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 3 y 9 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN: disponible en el comercio
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
38 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
39 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
40 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
41 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
42 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
43 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
44 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
45 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
46 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
47 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
48 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1801 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/LLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 84..1721
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 30:
49
50
51 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 546 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
52
53
54 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
55 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
56 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
57

Claims (44)

1. Método para la preparación de un polipéptido Chondrus crispus con actividad hexosa oxidasa, comprendiendo dicho método aislar o sintetizar un fragmento de ADN que codifica al polipéptido, introducir dicho fragmento de ADN en un organismo huésped en el cual el fragmento de ADN es combinado con una señal de expresión para el fragmento, cultivar la célula recombinante resultante en un medio de cultivo bajo condiciones que llevan a la expresión del polipéptido con actividad hexosa oxidasa y recuperar el polipéptido del medio de cultivo o de la célula recombinante, comprendiendo dicho fragmento de ADN por lo menos una codificación de secuencia de ADN para una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en:
(i)
Tyr-Glu-Pro-Tyr-Gly-Val-Pro (SEC ID nº 1),
(ii)
Ala-Ile-Ile-Asn-Val-Thr-Gly-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Tyr-Asp-X-X-X-Gly-Tyr-X-Val-Ser-Ser (SEC ID nº 2),
(iii)
Asp-Leu-Pro-Met-Ser-Pro-Arg-Gly-Val-Ile-Ala-Ser-Asn Leu-X-Phe (SEC ID nº 3),
(iv)
Asp-Ser-Glu-Gly-Asn-Asp-Gly-Glu-Leu-Phe-X-Ala-His-Thr (SEC ID nº 4),
(v)
Tyr-Tyr-Phe-Lys (SEC ID nº 5),
(vi)
Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Val-Ile-Asp-Val-Asn-Ala-Gly-Thr-X-Asp (SEC ID nº 6),
(vii)
Leu-Gln-Tyr-Gln-Thr-Tyr-Trp-Gln-Glu-Glu-Asp (SEC ID nº 7)
(viii)
X-Ile-Arg-Asp-Phe-Tyr-Glu-Glu-Met (SEC ID nº 8)
en el que X representa un aminoácido seleccionado de entre el grupo que consiste en Ala, Arg, Asn, Asp, Asx, Cys, Gln, Glu, Glx, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val;
en el que el organismo huésped es una especie de levadura.
2. Método según la reivindicación 1, en el que el organismo huésped es seleccionado entre el grupo que consiste en una célula S. cerevisiae y una célula P. pastoris.
3. Método según la reivindicación 1, que comprende como etapa adicional una purificación de la preparación de polipéptido que se recupera inicialmente del medio de cultivo y/o de las células recombinantes para obtener una preparación en la que el polipéptido está presente en una forma substancialmente pura.
4. Método según la reivindicación 1, en el que el polipéptido que tiene actividad hexosa oxidasa es un producto de fusión.
5. Método según la reivindicación 1, en el que el fragmento de ADN comprende la región codificadora de hexosa oxidasa de SEC ID nº: 30.
6. Método según la reivindicación 1, en el que el fragmento de ADN está comprendido en una molécula recombinante ADN en la cual el fragmento de ADN está vinculada de forma funcional a una señal de expresión no asociada de forma nativa a dicho fragmento de ADN.
7. Método según la reivindicación 6, en el que la molécula recombinante ADN es un plásmido.
8. Célula recombinante que comprende una codificación de fragmento de ADN expresible para un polipéptido con actividad hexosa oxidasa, siendo dicho fragmento de ADN aislado o sintetizado según se define en la reivindicación 1, en la que dicha célula es una célula de levadura.
9. Célula según la reivindicación 8, que se selecciona entre el grupo que consiste en una célula S. cerevisiae y una célula P. pastoris.
10. Célula según la reivindicación 8, que comprende la región codificadora de hexosa oxidasa de SEC ID nº: 30.
11. Método para la fabricación de un producto alimenticio, en el que la célula de la reivindicación 8 se utiliza bajo condiciones en las que se expresa el polipéptido con actividad hexosa oxidasa.
12. Método según la reivindicación 11, en el que el producto alimenticio se selecciona entre el grupo que consiste en un producto lácteo, un producto alimenticio que comprende almidón y una bebida no láctea.
13. Método según la reivindicación 11, en el que el polipéptido actúa como agente antimicrobiano o antioxidante.
14. Método según la reivindicación 11, en el que el polipéptido actúa como agente eliminador de oxígeno en un envasado para productos alimenticios.
15. Método para la fabricación de un alimento para animales en el que la célula de la reivindicación 8 se utiliza bajo condiciones en las que se expresa el polipéptido con actividad hexosa oxidasa.
16. Método según la reivindicación 15, en el que el alimento para animales es forraje.
17. Método para la reducción del contenido de azúcar de un producto alimenticio, que comprende añadir a dicho producto una cantidad de la célula de la reivindicación 8 que es suficiente para eliminar por lo menos parte del azúcar inicialmente presente en dicho producto alimenticio.
18. Método para la preparación de un producto seleccionado entre el grupo que consiste en un producto farmacéutico, cosmético y un producto de cuidado dental en el cual se utiliza la célula de la reivindicación 8.
19. Composición mejorada de masa que comprende la célula recombinante de la reivindicación 8 que es capaz de expresar el polipéptido con actividad hexosa oxidasa en masa y por lo menos un componente convencional de masa, en la que dicho polipéptido que presenta actividad hexosa oxidasa es un polipéptido en forma aislada que presenta actividad hexosa oxidasa y que comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por:
(i)
Tyr-Glu-Pro-Tyr-Gly-Gly-Val-Pro (SEC ID nº 1)
(ii)
Ala-Ile-Ile-Asn-Val-Thr-Gly-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Tyr-Asp-X-X-X-Gly-Tyr-X-Val-Ser-Ser (SEC ID nº 2)
(iii)
Asp-Leu-Pro-Met-Ser-Pro-Arg-Gly-Val- Ile-Ala-Ser-Asn Leu-X-Phe (SEC ID nº 3)
(iv)
Asp-Ser-Glu-Gly-Asn-Asp-Gly-Glu-Leu-Phe-X-Ala-His-Thr (SEC ID nº 4)
(v)
Tyr-Tyr-Phe-Lys (SEC ID nº 5)
(vi)
Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Val-Ile-Asp-Val-Asn-Ala-Gly-Thr-X-Asp (SEC ID nº 6)
(vii)
Leu-Gln-Tyr-Gln-Thr-Tyr-Trp-Gln-Glu-Glu-Asp (SEC ID nº 7)
(viii)
X-Ile-Arg-Asp-Phe-Tyr-Glu-Glu-Met (SEC ID nº 8)
en la que X representa un aminoácido seleccionado de entre el grupo constituido por Ala, Arg, Asn, Asp, Asx, Cys, Gln, Glu, Glx, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val.
20. Composición según la reivindicación 19, que comprende además por lo menos una enzima seleccionada entre el grupo que consiste en una celulasa, una hemicelulasa, una xilanasa, una pentosanasa, una amilasa, una lipasa y una proteasa.
21. Método para la preparación de un producto cocinado a partir de una masa, que comprende añadir a la masa una cantidad eficaz de la composición según la reivindicación 19 ó 20.
22. Método para el análisis del contenido de un azúcar en una muestra en el que la célula de la reivindicación 8 se utiliza como reactivo analítico.
23. Método para la preparación de una lactona utilizando la célula de la reivindicación 8, comprendiendo dicho método aplicar la célula a un reactor que contiene un carbohidrato que puede ser oxidado por el polipéptido con actividad hexosa oxidasa y hacer funcionar el reactor bajo condiciones en las que se expresa el polipéptido con lo cual se oxida el carbohidrato en una lactona.
24. Fragmento de ADN aislado que codifica un polipéptido Chondrus crispus con actividad hexosa oxidasa, codificando dicho fragmento un polipéptido que comprende por lo menos una secuencia de aminoácido seleccionada entre el grupo que consiste en:
(i)
Tyr-Glu-Pro-Tyr-Gly-Gly-Val-Pro (SEC ID nº 1)
(ii)
Ala-Ile-Ile-Asn-Val-Thr-Gly-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Tyr-Asp-X-X-X-Gly-Tyr-X-Val-Ser-Ser (SEC ID nº 2)
(iii)
Asp-Leu-Pro-Met-Ser-Pro-Arg-Gly-Val- Ile-Ala-Ser-Asn Leu-X-Phe (SEC ID nº 3)
(iv)
Asp-Ser-Glu-Gly-Asn-Asp-Gly-Glu-Leu-Phe-X-Ala-His-Thr (SEC ID nº 4)
(v)
Tyr-Tyr-Phe-Lys (SEC ID nº 5)
(vi)
Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Val-Ile-Asp-Val-Asn-Ala-Gly-Thr-X-Asp (SEC ID nº 6)
(vii)
Leu-Gln-Tyr-Gln-Thr-Tyr-Trp-Gln-Glu-Glu-Asp (SEC ID nº 7)
(viii)
X-Ile-Arg-Asp-Phe-Tyr-Glu-Glu-Met (SEC ID nº 8)
en donde X representa un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en Ala, Arg, Asn, Asp, Asx, Cys, Gln, Glu, Glx, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val.
25. Fragmento de ADN según la reivindicación 24, que comprende la zona codificadora de hexosa oxidasa de la secuencia (SEC ID nº 30):
58
26. Molécula ADN recombinante que comprende el fragmento de ADN de cualquiera de las reivindicaciones 24 a 25.
27. Molécula ADN recombinante según la reivindicación 26, en la que el fragmento de ADN está vinculado de forma funcional a una señal de expresión no asociada nativamente con dicho fragmento de ADN.
28. Preparación que comprende un polipéptido Chondrus crispus con actividad hexosa oxidasa derivado de forma recombinante, sin que la preparación comprenda otras proteínas, comprendiendo el polipéptido por lo menos una secuencia de aminoácido seleccionada entre el grupo que consiste en:
(i)
Tyr-Glu-Pro-Tyr-Gly-Gly-Val-Pro (SEC ID nº 1)
(ii)
Ala-Ile-Ile-Asn-Val-Thr-Gly-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Tyr-Asp-X-X-X-Gly-Tyr-X-Val-Ser-Ser (SEC ID nº 2)
(iii)
Asp-Leu-Pro-Met-Ser-Pro-Arg-Gly-Val- Ile-Ala-Ser-Asn Leu-X-Phe (SEC ID nº 3)
(iv)
Asp-Ser-Glu-Gly-Asn-Asp-Gly-Glu-Leu-Phe-X-Ala-His-Thr (SEC ID nº 4)
(v)
Tyr-Tyr-Phe-Lys (SEC ID nº 5)
(vi)
Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Val-Ile-Asp-Val-Asn-Ala-Gly-Thr-X-Asp (SEC ID nº 6)
(vii)
Leu-Gln-Tyr-Gln-Thr-Tyr-Trp-Gln-Glu-Glu-Asp (SEC ID nº 7)
(viii)
X-Ile-Arg-Asp-Phe-Tyr-Glu-Glu-Met (SEC ID nº 8)
en el que X representa un aminoácido seleccionado de entre el grupo que consiste en Ala, Arg, Asn, Asp, Asx, Cys, Gln, Glu, Glx, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val.
29. Preparación según la reivindicación 28, en la que se obtiene el polipéptido mediante el procedimiento de la reivindicación 1.
30. Preparación según la reivindicación 28, que comprende el polipéptido en una forma no glicosilada.
31. Preparación según la reivindicación 28, en la que el polipéptido presenta características funcionales que son idénticas a las de hexosa oxidasa que ocurre naturalmente en Chondrus crispus.
32. Método para la preparación de un producto alimenticio en el que se utiliza la preparación de la reivindicación 28.
33. Método según la reivindicación 32, en el que el producto alimenticio se selecciona del grupo que consiste en un producto lácteo, un producto alimenticio que contiene almidón y una bebida no láctea.
34. Método según la reivindicación 32, en el que el polipéptido actúa como agente antimicrobiano o como antioxidante.
35. Método según la reivindicación 32, en el que el polipéptido actúa como agente eliminador de oxígeno en un envasado para productos alimenticios.
36. Método para la preparación de un alimento para animales en el que se utiliza la preparación de la reivindicación 28.
37. Método según la reivindicación 36, en el que el alimento para animales es forraje.
38. Método para la reducción del contenido de azúcar de un producto alimenticio, que comprende añadir a dicho producto una cantidad de la preparación de la reivindicación 28, que es suficiente para eliminar por lo menos parte del azúcar inicialmente presente en dicho producto alimenticio.
39. Método para la preparación de un producto seleccionado entre el grupo que consiste en un producto farmacéutico, cosmético y de cuidado dental, en el que se utiliza la preparación de la reivindicación 28.
40. Método para la preparación de un producto cocinado a partir de una masa, que comprende añadir la preparación de la reivindicación 28 a la masa.
41. Composición mejorada de masa que comprende la preparación de la reivindicación 28, y por lo menos un componente convencional de masa.
42. Composición según la reivindicación 41, que comprende además por lo menos una enzima seleccionada entre el grupo que consiste en una celulasa, una hemicelulasa, una xilanasa, una pentosanasa, una amilasa, una lipasa y una proteasa.
43. Método para el análisis del contenido de un azúcar de una muestra en el que se utiliza la preparación de la reivindicación 28 como reactivo analítico.
44. Método para la preparación de una lactona utilizando la preparación de la reivindicación 28, comprendiendo dicho método aplicar la preparación a un reactor que contiene un carbohidrato que puede ser oxidado por el polipéptido y hacer funcionar el reactor bajo condiciones en las que se oxida el carbohidrato en una lactona.
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