JPH07506573A - プロテインｌおよびそのハイブリッドプロテイン類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 プロティンＬおよびそのハイブリッドプロティン類本発明は免疫グロブリン類の 軽鎖に結合するプロティンＬの配列に関する。また本発明は、全Ｉｇの軽鎖に結 合する性能および免疫グロブリンＧの軽鎖と重鎮に結合する性能を有するプロテ ィンＬのハイブリッドプロティン類、これらのプロティン類をコードするＤＮＡ 配列、かようなりＮＡ配列を含有するベクター、これらのベクターで形質転換さ れた宿主細胞、これらプロティン類の製造方法、免疫グロブリンを分離し同定す るのに用いる試薬用具（ｒｅａｇｅｎｔ　ａｐｐａｒａｔｕｓ）　、これらのプ ロティン類を含有する組成物および医薬組成物に関する。

本発明は特に、プロティンＬの軽鎖形成領域のＮＤＡ配列とアミノ酸配列に関す る。

免疫グロブリン類（Ｉ　ｇ）の（高親和性の）定常部に結合するプロティン類は 公知である。すなわちプロティンＡ［スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａ ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）由来］　（Ｆｏｒｓｇｒｅｎ　、　Ａ 、および５ｊｏｅｑｕｉｓｔ　、　Ｊ、、“Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ　ｆｒｏｍ　５ ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ、　１．　Ｐｓｅｕｄ。

−１ａｖ＋ｕｎｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｈｕｍａｎ　ｇａｍｍａ−ｇ ｌｏｂｕｌｉｎ″。

Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、　９７巻、８２２〜８２７頁、１９６６年）は、種 々の哺乳類の種由来のＩｇＧに結合する。プロティンＡのＩｇＧとの結合は、Ｉ ｇＧ−分子の重鎮のＦｃフラグメントの表面を介して本質的に結合されるが、ま たある種の結合はＩｇＧのＦａｂフラグメントの表面で行れる。

プロティンＡは、ヒトＩ　ｇＧ３に結合する性能を欠いておリ、かつ例えばラッ トおよびヤギのような重要な実験動物のごときいくつもの他の動物種由来のＩｇ Ｇにも結合しないので、プロティンＡの用途は制限されている。

プロティンＧ　（Ｂｊｏｅｒｃｋ　、　Ｌ、およびＫｒｏｎｖａｌｌ　、　Ｇ、 　、　′Ｐｕｒｉｆｉｃａｔ、ｉｏｎ　ａｎｄ　５ａＬ１ｅ　ｐｒｏｐｅｒｔｉ ｅｓ　ｏｆ　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇ　、　ａ　ｎｏ ｖｅｌ　ＩｇＧ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｒｅａｇｅｎｔ″。

Ｊ、ｒｖｍｕｎｏｌ、、１３３巻、９６９〜９７４頁、１９８４年；　Ｒｅ１ｓ 、に１．＾ｙｏｕｂ　、　Ｅ、およびＢｏｙｌｅ　、Ｍ、、　−５ｔｒｅｐｔｏ ｃｏｃｃａｌ　Ｆｃ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、１．１ｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　 ｐａｒｔｉａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｔｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｃｅ ｐｔｏｒ　ｆｒｏｍ　ａ　ｇｒｏｕｐＣ５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、　＋、　 Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、１３２巻、３０９１−３０９７頁、１９８４年）は 、ヒトＩｇＧおよびその４個のザブクラスすべてに結合し、かつラットおよびヤ ギを含むほとんどの晴乳動物由来のＩｇＧにも結合する。

プロティンＨ（入ｋｅｓｓｏｎ　、　Ｐ、　、　Ｃｏｏｎｅｙ　、　Ｊ、　、　 Ｋｔｓｈｉｍｏｔｏ　、　Ｆ、およびＢｊｏｅｒｃｋ　、　Ｌ、　、−Ｐｒｏｔ ｅｉｎ　Ｈ−ａ　ｎ。

ｖｅｌ　ＴｇＧ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｂａｃｔ、ｅｒｉａｌ　ｐｒｏｔ、ｅｉｎ　 −、Ｍｏ１ｅｃ、　Ｉｎｍｕｎ、、２７巻、５２３〜５３１頁、１９９０年）は ヒト、サルおよびウサギ由来のＩｇＧのＦｃフラグメントに結合する。しかしこ の結合はプロティンＧおよびＡの場合より弱い。このことは、例えば抗体によっ て容易に変性されるタンパク質を精製する場合、上記結合を弱い試薬で切断した い時に有利であろう。

プロティンＭ（本願の出願人の国際特許願第ＰＣＴ／ＳＥ９１１００４４７号） は、ヒト、サル、ウサギ、ヤギ、マウスおよびブタ由来のＩｇＧのＦｃフラグメ ントに結合する。

プロティンＬ　（Ｂｊｏｅｒｃｋ　、　Ｌ、　、　”　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌ　、 　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｂａｃｔ、ｅｒｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｗａｌｌ　ｐｒｏｔｅｉ ｎ　ｗｉｔｈ　ａｆｆｉｎｉｔｙしｏ　Ｔｇ　Ｌ　Ｃｈａｉｎｓ　”　、Ｊ、Ｉ ｍｍｕｎｏｌ、、　１　４０　巻、１１９４〜１１９７頁、１９８８年）は、ク ラスＧ、Ａ、Ｍ、ＤおよびＥのすべての免疫グロブリンの軽鎖に結合することが 知られている（米国特許第４８７６１９４号）、シかしこのプロティンのアミノ 酸配列と結合領域はまだ分がっていない。

上記プロティン類は、抗体類の分析、精製および製造、ならびに診断および生物 学の研究に使用できる。

血漿分離交喚法によって免疫グロブリン類を除くと、いくつもの自己免疫疾患に 対して好ましい効果を与えることができる。広範囲にわたって結合するプロティ ンは、この点について、すべてのクラスの抗体を除きたい場合に有利であろう。

感染症は、免疫血清すなわち関連生物もしくはその有害な可能性のある生成物に 対する抗体が豊富な血清を導入することによって予防もしくは治癒することがで きることは永年にわたって知られている。その例は、流行性黄痘、破傷風、ジフ テリア、狂犬病および全身性帯状ヘルペスである。また毒性生成物に対する抗体 類は非感染性疾患の場合に有効である。各種の蛇の毒液に対して動物中に生成す る血清は上記の場合の最も普通の用途である。しかし、血清もしくは抗体の製剤 を投与することは、危険が全くないわけではない。いくつかの症例では重い免疫 反応が起こることがある。これらの製品の作用によって、ＨＩＶおよび肝炎のよ うな接触伝染性疾患が伝播するというまれに見られる症例も報告されている。こ のような二次作用を避けるために、生体外で治療用抗体を製造することが要望さ れている。近年、生体外で抗体を製造する新規な方法が多数提案されている。こ のような方法の例はハイブリドーマ法、キメラ抗体類の合成および細菌の抗体の 製造である。またこれらの方法によって、抗体を特別に設計して、例＾ばある挿 の腫１疾患の症例の治療剤としてかような分子の用途を広げることができるよう にすることができる。しかしこれらの新規な方法のい（つかの場合に、その製品 が、プロティンＬを除いて、前記のＩｇＧ結合性プロティン類のすべてが結合す るＦｃフラグメントを全く欠いている。また治療に用いるには抗体を精製する必 要があり、治療の用途では、広い結合活性／結合特異性を存するプロティン類が 価値がある。

抗体反応をその高い特異性で利用して、各種の寄生生物による過去のまたは場合 によっては進行中の感染症を診断することが永年にわたって可能であった。感染 因子を示すこの間接的な方法は血清学と呼ばれ、多（の場合、診断法の変形にす ぎない。ある症例では、特異的なＩｇＥ抗体またはＩｇＡ抗体を示すことは興味 深いことである。血清学によって診断する場合、抗原が固体相に固定されること が最も多く、次いで患者から採取した血清をこの抗原とともにインキュベートす る。捕捉された患者由来の抗体は、種々の方法で検出できるが、二次抗体（例え ばヒト抗体の軽鎖に対して生成される抗体）であって、アルカリホスファターゼ 、ビオチン、放射能同位元素、フルオレセインなどのような同定可能な標識をつ けた抗体によって検出される場合が多い、この点については、広いＩｇ結合性を 有するプロティンを二次抗体に対する代替物として使用することができる。

抗体を捕捉する必要がある理由として治療上および診断上の理由ではない多くの 理由がある。抗体は、それらに対する抗原を検出および精製するための研究に用 いることが多い。抗体の精製を容易にするすべての方法、特に異なるクラスを精 製可能にする方法がこの場合興味深い。

したがって、広い結合活性／結合特異性を有しかつ異なる動物種由来のいくつも の異なるクラスの免疫グロブリンに結合するプロティンが強く要求されている。

現在、すべての免疫グロブリンのクラスに結合するプロティンは知られていない 、早くから知られているプロティンＡ、Ｇ、ＨおよびＭはＩｇＧの重鎖にしか結 合しない、公知のプロティンＬ　（Ｂｊｏｅｒｃｋらの１９８８年の文献）は、 すべてのクラスの免疫グロブリンの軽χ鎖と軽γ鎖に結合するが、その結合はそ のに鎖に対しては非常に弱い０本願の出願人はプロティンＬをチャートしくｃｈ ａｒｔ　）　％プロティンＬのアミノ酸配列を決定し、プロティンＬの軽鎖結合 領域を同定し、次いでこれらを用いて、プロティンＧのＩｇＧ−Ｆｃ結合領域を 有するハイブリッドプロティンを製造した。出願人は、広範囲の結合活性／結合 特異性を有するプロティンを製造できるということをプロティンＬＧによって示 すことができる、前記のプロティンＡ、Ｇ、ＨおよびＭは、ＩｇＧ−Ｆｃの同じ 表面かまたはごく近（に位置する表面に結合する。したがって軽鎖に結合するプ ロティンＬは重鎖のＦｃフラグメントに結合する他の儂能が類似しているプロテ ィンと結合することができる。Ｉｇ結合活性の類似の拡大がすべて変形によって 達成される。

すなわち本発明は、Ｉｇの軽鎖に結合し、ならびに図１に開示されているアミノ 酸配列右よび同じ結合特性を有するＢ　１−８５領域の変異体、サブフラグメン ト、マルチプルもしくは混合物を含有するプロティンＬの配列に関する、また本 発明は、このようなプロティンの配列をコードするＤＮＡ配列、例えば図１に示 すＤＮＡ配列に関する。

本発明は、すべてのクラスの免疫グロブリンの軽χ鎖およびλ鎖に結合する領域 を含有しかつ免疫グロブリンＧの重鎮に結合する領域も含有し、軽鎖に結合する これらの領域がプロティンＬのＢｌ−、Ｂ２−、Ｂ３−、Ｂ４−およびＢ５−領 域の中から選択され（請求の範囲ｌ参照）、ならびに免疫グロブリンの重鎮に結 合するこれらの領域がプロティンＧのＣ１−、Ｃ２−およびＣ３−ｆｉｌ域ニブ ロチインＨ由来のＡ−、Ｂ−およびＣ１−領域：プロティンＭｌのＡ−、Ｂｌ− 、Ｂ２およびＳ−領域またはプロティンＡのＥ−、Ｄ−、Ａ−、Ｂ−およびＣ− 領域（図６参照）ならびに免疫グロブリンの重鎮に結合する同じ結合特性を有す るこれらの領域の変異体、サブフラグメント、多量体もしくはフラグメントから 選択されることを特徴とするハイブリッドプロティンに関する。

サブフラグメントという用語は、所定の領域の部分フラグメントまたは互いに同 じ結合特性を有する各種の領域由来の一部分を含有するフラグメントを意味する 。変異体と、付加、置換、反転または排除によって修飾もしくは変更されたが一 方その結合特性が保持もしくは改善されているタンパク質もしくはペプチドを意 味する。また本発明は、結合領域のいくつものアレー（マルチプル）または結合 領域の混合物を含有し、結合特性を保持しているプロティンに関する。また本発 明は、互いに同じ結合特性を有するアミノ酸配列の各種の領域の混合物に関する 。

本発明は特に、ＬＧと命名されたハイブリッドプロティンに関し、このハイブリ ッドプロティンは、免疫グロブリン類の軽鎖に結合するプロティンＬのＳ領域、 および重鎮に結合しかつ図３に開示されているアミノ酸配列を有するプロティン ＧのＣ１−領域と０２−領域を含有しているのを特徴としている。また本発明は これらの領域の変異体、フラグメント、マルチプルもしくは混合物に関する。

プロティンＬＧは、分子量が約５０ＫＤａ　（４３２個のアミノ酸）であり、免 疫グロブリンの軽鎖に各々結合する四つの領域、およびプロティンＧ由来の二つ のＩｇＧ結合領域を含有している。このハイブリッドプロティンは、ＩｇＧの重 鎮のＦｃフラグメントに対するＧプロティンの高い結合活性由来の広範囲のＩｇ Ｇ結合活性と、すべてのクラスの免疫グロブリンの軽鎖に結合するプロティンＬ の性能を兼ね備えている。すなわちプロティンＬＧはポリクローナルヒトＩｇＧ 、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを捕捉する。ヒトポリクローナルＩｇＧ に対するアフィニティーは２　ｘ　ｌ　Ｑ　ｌ　６　Ｍ−１である。四つのヒト 免疫グロブリンのクラスのすべてが捕捉される。ヒトＩｇＧに対する結合はに重 鎖およびλ−鎖の両者で行れる。ＩｇＧのＦｃフラグメントとＦａｂフラグメン トの両者が該ハイブリッドプロティンに捕捉される。またこのプロティンはヒト ＩｇＡ−，ＩｇＤ−，ＩｇＥ−およびＩｇＭ−抗体を捕捉する、その結合は、軽 鎖のλ−同位体を保有するヒト免疫グロブリンに対して結合する場合より、χを 保有するヒト免疫グロブリンに対して結合する場合の方が強い、はとんどの晴乳 類由来のＩｇＧはプロティンＬＧによって捕捉されまたヤギおよび雌ウシ由来の ＩｇＧも捕捉されるがこれらのＩｇＧはプロティンＬには結合しない、しかし、 プロティンＬには比較的弱く結合するウサギのＩｇＧは該融合プロティンにはよ く結合する。マウス、ラットおよびウサギ由来のＩｇＭとＩｇＡの抗体は該プロ ティンに捕捉される。

プロティンＬＧは溶解性が高い、プロティンＬＧは熱に耐えることができ、かつ 高温下でもその結合特性を保持する。またその結合特性は３〜１０という広いｐ Ｈ範囲でも保持される。このプロティンは界面活性剤に対して耐性であり、５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥで分離し次いでエレクトロブロッティングで膜に転移された後にマ ークもしくは標識を付けたタンパク質な捕捉する。このプロティンは固相【ニト ロセルロース、１ｍ＋５ｏｂｉｌｏｎ　（登録商標）、ポリアクリルアミド、プ ラスチック、金属および紙〕上に、その結合性能を失うことなく固定化すること ができる。この結合特性は、放射性物質、ビオチンまたはアルカリホスファター ゼでマークを付けることによって影響を受けない（プロティンＬＧの結合性能は 実施例３に開示する）。

このプロティンは４３２個のアミノ酸を含有し、これから誘導して分子量が５０ ＫＤａである。この配列はプロティンＬのＡ領域の最後の三つのアミノ酸（ｖａ ｔ−ｇｌｕ−ａｓｎ）のａｌａ配列をもっており、このａｌａ配列は上記二つの プロティンには無関係であり、その後に、プロティンＬ由来の四つの相互に高度 に相同性のＳ領域が続く、このＳ領域の最初の部分は７６個のアミノ酸で構成さ れ、そして残りのＢｌ域は各々７２個のアミノ酸で構成されている。第５番目の Ｓ領域由来の最初の９個のアミノ酸が含有され、二つの無関係のアミノＭ（ｐｒ ｏ−ｎｅｔ）がこれに続いている０次にプロティンＧの配列が続く、プロティン Ｇ由来のいわゆるＳ領域の最後のアミノ酸に、プロティンＧ由来のＩＫＧ結合領 域（Ｃ１；５５個のアミノ酸）、中間のＳ領域（１５個のアミノ酸）および第二 のＩｇＧ結合Ｃ領域（Ｃ２；５５個のアミノ酸）が続いている。

最後のアミノ酸はメチオニンであるが、これは天然のプロティンＧではいわゆる Ｗ領域の最初のアミノ酸として生成する。

また本発明は上記プロティンをコードするＤＮＡ配列に関する。

上記ＩｇＧ結合アミノ酸配列をコードする遺伝子は、次のようにして単離できる 。すなわちプロティンＡに対するＤＮＡ配列に関する情報（Ｓ、　Ｌｏｅｆｄａ ｈｌ、　Ｂ、　Ｇｕａｓ　、　Ｍ、　ｔｌｈｉｅｎ　、　Ｌ、　Ｐｈ１ｌｔｐｓ ｓｏｎおよびＭ、　Ｌｉｎｄｂｅｒｇ　、　”Ｇｅｎｅ　ｆｏｒｓｔａｐｈｙｌ ｏｃｏｃｃａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ”　、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ Ａ。

、８０巻、６９７〜７０１頁、１９８３年）および図６に基づいて、スタフィロ コッカス・アウレウス由来の染色体ＤＮＡから単離することができ；またはプロ ティンＧに関する情報（Ｂ、　Ｇｕｓｓ　、　Ｍ、　Ｅｌｉａｓｓｏｎ　、　Ａ 、　０１ｓｓｏｎ　、　Ｍ、　Ｕｈｌｅｎ　、　Ａ、−に、　Ｆｒｅｊ　、　） １．　Ｊｏｅｒｖａｌｌ、　１．　ＦｌｏｃｋおよびＭ。

Ｌｉｎｄｂｅｒｇ＋５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＩｇＧ　−ｂｉｎｄｉ ｎｇ　ｒｅｇｉｏｎｓｏｆ　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇ ″、　ＥＭＢＯ，Ｊ、　、５巻、１５６７〜１５７５頁、１９８６年）および図 ６に基づいて、Ｇ−ストレプトコッカス好ましくは菌株６１４８もしくはＣ−ス トレプトコッカス好ましくは菌株ストレブトコカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅ ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｑｕｌｓｉｍｉｌｉｓ）　Ｃ４０から単離可能であり： またはプロティンＨに対するＤＮＡ配列に関する情報（Ｈ，Ｇｏｍｉ　、　Ｔ、 　Ｈｏｚｕｍｉ　、　Ｓ、　Ｈａｔ、ｔ。

ｒｉ、　Ｃ，Ｔａｇａｗａ　、　Ｆ、　Ｋｉｓｈｉｗｏｔｏおよび１．、　Ｂｊ ｏｅｒｃｋ　、−Ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　！１０＋６ｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎＨ−ａ　ｎｏｖｅｌ　ＩｇＧ　ｂ ｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　”　、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１４４巻、 ４０４６〜４０５２頁、１９９０年）および図６に基づいて、グループＡ−スロ レブトコツカスの例久ばニス・ピオゲネス（Ｓ、　Ｐｙｏｇｅｎｅｓ　）　（タ イプＭｌ）から単離可能であり；またはプロティンＭに対するＤＮＡ配列に関す るｉＲ報（本願出願人の国際特許願第Ｐ　ＣＴ／Ｓ　Ｅ９１１００４４７号）お よび図６と７に基づいてグループＡ−ストレプトコッカスタイプＭ１の染色体Ｄ ＮＡから単離できる。軽鎖に結合するプロティンをコードする遺伝子は、請求の 範囲２におけるプロティンＬのＤＮＡ配列に関する情報に基づいて、ベブトコッ カス・マグヌス（Ｐｅｐｔｏｅｏｃｃｕｓ　ｍａｇｎｕｓ　）　３１２由来の染 色体ＤＮＡから単離することができる。

上記細菌類から得た染色体ＤＮＡ’　ｔを鋳型として用いることによって、二つ の合成オリゴヌクレオチドによって形成されたＤＮＡフラグメントはＰＣＲ（ポ リメラーゼ連鎖反応）によって特異的に増幅させることができる。またこの方法 によって、増幅されたフラグメントの末端に、制限酵素に対する認識部位を組込 むことができる（“ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎ ｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ＤＮＡ＾ｍｐｌｉｆｉｃａＬｉｏｎ　 ”　、　１ｌｅｎｒｙ　Ｅｒｌｉｃｈ編集、５ｔｏｃｋｔｏｎ　ＰｒｏｓＳ社、 米国、ニューヨーク、１９８９年）、認識配列の選択は、該フラグメントを発現 させるために選択されたベクターまたは増幅されたフラグメントを結合させる単 一のＤＮＡフラグメントもしくは複数の他のＤＮＡフラグメントに適応して行う ことができる。増幅されたフラグメントは、単一もしくは複数の関連する制限酵 素で開裂され、次いで関連する単一のフラグメント／複数の他のフラグメントに 結合され、次にこれらのフラグメントは選択されたベクター内で（この場合は発 現ベクター）でクローン化される（　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　、　Ｊ、　Ｅ、　Ｆｒ １ｔｓｃｈおよびＴ、　Ｍａｎｊａｔｉｓ　、　”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏ ｎｔｎｇ：＾　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ａ＋ａｎｕａｌ″、第２版１９８９年、 Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　、米国、 ニューヨーク州、コールド・スプリング・ハーバ−）、プラスミドベクターｐＨ Ｄ３１３を使用できるしく　Ｄａｌｂｏｅｇｅ、Ｉｌ、Ｅ、Ｂｅｃｈ　Ｊｅｎｓ ｅｎ　、Ｉｌ、丁ｏｅｔｔｒｕｐ　、Ａ、Ｇｒｕｂｂ　、Ｍ。

Ａｂｒａｈａｉｓｏｎ　、　１．０１ａｆｓｓｏｎおよびＳ、　Ｃａｒｌｓｅｎ 　、ｔｌ　ｉ　ｇ　ｈ−１ｅｖｅｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａｃｔｉｖ ｅ　ｈｕｍａｎ　ｃｙｓｔａｔｉｎ　Ｃ４ｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ ｉ”　、　Ｇｅｎｅ、　７９巻、３２５〜３３２頁、１９８９年）、あるいはＮ ｏｖａｇｅｎ社（米国、ウィスコンシン州、マディスン）が販売しているいわゆ るＰ　Ｅ　’ｒシリーズ（ＰＥ７２０，２１，２２．２３）のベクターの中の一 つを使用できる。

上記ハイブリッドプロティンは次に適切な宿主好ましくはイー・コリ（Ｅ、　ｃ ｏｌｉ　）に組込まれる。また本発明は上記ハイブリッドプロティンが組込まれ ている宿主に関する所望のプロティンを産生ずるクローンは、公知の方法で得ら れた形質転換体から選択することができる（　Ｆａｈｎｅｇｔ。

ｃｋら、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１６７巻、８７０頁、１９８６年）。

免疫グロブリンの軽鎖およびＩｇＧの重鎖に結合できるプロティンを、従来の方 法によって、得られた陽性クローンから精製したならば、これらプロティンの結 合特異性を測定して、免疫グロブリンの軽鎖およびＩｇＧの重鎖に結合するプロ ティンを産生ずるクローンを選択する。

前記クローン中のプラスミドＤＮＡ’　ｔを従来法で単離した後、挿入された物 質のＤＮＡ配列を公知の方法（Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　、７４巻、５４６３頁、１９７７年）で決定する。

また本発明は、通常の条件下で前記ＤＮＡ配列とハイブリッドを形成し、かつ所 望の結合特性を有するプロティンをコードするＤＮＡＥ列に関する。絶対的なハ イブリッド形成条件が好ましい。

上記遺伝子類の発現は、必須の発現制御領域を有する発現ベクターを用いて行う ことができる。なおその構造遺伝子は前記制御領域の後に導入される０図１と請 求の範囲２に示すように、その構造遺伝子を使用して、プロティンＬＧ、または プロティンＬを有する他のハイブリッドプロティンを得ることができる。

発現ベクターについては、各種の宿主−ベクター系が開発されており、それらの 系のうちで最も適切な宿主−ベクター系が本発明の遺伝子を発現させるために選 択することができる。

また本発明は、本発明のプロティンをコードするＤＡＮ′　ｔを挿入されている 発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養することによる本発明のハイブリ ッドプロティンの製造方法に関する。

この水沫は以下のステップで構成されている。すなわち（１）ハイブリッドプロ ティンをコードするＤＮＡフラグメントをベクターに挿入し； （２）得られたベクターで適切な宿主細胞を形質転換し；（３）得られた形質転 換細胞を培養して所望のハイブリッドプロティンを製造し：次いで （４）上記プロティンを培養物から抽出するニステップで構成されている。

第１ステツプでは、ハイブリッドプロティンをコードするＤＮＡフラグメントが 、ハイブリッドプロティンを発現させるのに使用すべき宿主に対して適切なベク ターに挿入される。遺伝子は、該ベクターを適当な制限酵素で開裂させ次にその 遺伝子をベクターに連結することによって挿入することができる。

第２ステツプでは、ハイブリッドプラスミドを有するベクターが宿主細胞中に挿 入される。その宿主細胞は、エシェリキア・コリ（ＥｓｃｈｅｒｉｃｈＬａ　ｃ ｏｌｉ　、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）または サツカロミセスφセレビシｚ　（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓ ｉａｅ　）などの適切細胞である０発現ハイブリッドベクターによる宿主細胞の 形質転換は従来の方法で行うことができ、次いで形質転換されたクローンを選択 することができる。

第３ステツ゛プでは、得られた形質転換体を適当な培地内で培養して、ハイブリ ッドプロティンをコードする遺伝子を発現させることによって所望のプロティン を製造する。

第４ステツプでは、所望のプロティンを培養物から抽出し、次いで精製する。こ のステップは公知の方法で達成することができる０例えば細胞は、超音波、酵素 で処理するかまたは機械的破壊による公知の方法で溶解することができる。細胞 から放出されるかまたは培地中に分泌されるプロティンは、生化学の技術分野で しばしば使用される通常の方法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾 過法、免疫グロブリン類をリガンドとして用いるアフィニティークロマトグラフ ィー、疎水性クロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィーによって回収し 精製することができる。これらの方法は、個々にもしくは適切に組み合わせて利 用できる。

先に述べたように、本発明のプロティンは、免疫グロブリン類を捕捉、同定もし くは精製するのに使用できる。また本発明のプロティンは、医薬に結合させ遅延 放出特性を有する配合物に使用できる。この目的のために、本発明のプロティン は、適切な試薬、添加物または担体と組み合わせて医薬組成物用の試薬用具中に 入れてもよい。

本発明のプロティンは、凍結乾燥状態または０．０２％のＮ　ａ　Ｎ　ｓを含有 するｐＨ７，２のＰＢＳ溶液（リン酸緩衝生理塩溶液）中で扱うことができる。

また本発明のプロティンは次のような固相に接続して使用できる。固相としては １例えばＣＮＢｒ−活性化セファロースのような炭水化物ベースの固相、アガロ ース、プラスチックの表面、ポリアクリルアミド、ナイロン、紙、磁気法、フィ ルター、フィルムがある０本発明のプロティンは、ビオチン、アルカリホスファ ターゼ、放射性同位元素、フルオレセインなどの型光物質、金粒子、フェリチン 、およびルミネセンスを測定可能にする物質で標識をつけることができる。

また他のプロティンな担体として使用できる。これらの担体は、本発明にしたが って本発明のプロティンに結合させるかまたは該プロティン中に組込むことがで きる０例えば、プロティンＡ、Ｇ、Ｈ，Ｍはすべて、軽鎖に結合するプロティン Ｌの挿入配列に対する担体として考えることができる０次いでこれらの担体は前 記の担体に結合させることができる。

使用できる医薬添加物はこの技術分野で通常使用されている添加物であり、例え ば医薬品質のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム 、サッカリン酸ナトリウム、タルカム、セルロース、グリコース、ゼラチン、サ ッカロース、炭酸マグネシウムおよび類似の増量剤例えばラクトース、リン酸二 カルシウムなど；崩壊性物質（ｂｕｒｓｔｉｎｇ　５ｕｂｓｔａｎｃｅ　）例え ばデンプンもしくはその誘導体；ステアリン酸マグネシウムなどのような滑沢剤 ：デンプン、アラビアゴム、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、セルロースおよ びその誘導体などのような結合剤がある。

ここで本発明を以下の添付図面を参照してさらに詳細に説明する。

図１はプラスミドｐＨ０３８９を示す、そしてそのリポソーム結合配列、ｏｍｐ Ａ由来のシグナルペプチドの配列、およびいくつもの制限酵素の認識配列が示さ れている。

図２はプロティンＬＧのアミノ酸および核酸の配列を示す。

図３はプロティンＬの産生を示す概略全体図である。

図４はプロティンＬＧの産生な示す概略全体図である。

図５ａ、５ｂおよび５ＣはそれぞれハイブリッドプロティンのＬＡ、ＬＭおよび ＬＨの産生な示す概略全体図である。

図６はプロティンＡ、Ｇ、ＨおよびＭｌの概略全体図である。ＩｇＧＦｃ結合領 域は、プロティンＡについてはＥ、Ｄ、Ａ、ＢおよびＣであり；プロティンＧに ついてはＣ１、Ｃ２，およびＣ３であり；プロティンＨについてはＡおよび／ま たはＢであり；ならびにプロティンＭｌについてはＡ、Ｂｌ、Ｂ２．Ｂ３および Ｓである。

図７はプロティンＭ１のアミノ酸と核酸の配列を示す。

図８はある種の免疫グロブリンおよび免疫グロブリンフラグメントを用いて行っ たプロティンＧ、Ｌ、およびＬＧのウェスタンプロットを示す、および 図９はＩＫＧ、ＩｇχおよびＩ　ｇＦｃを用いて行ったプロティンＬ、Ｇおよび ＬＧのスロットプロットを示す。

プロティンＬの軽鎖結合領域のアミノ酸と核酸の配列はそれぞれ請求の範囲１と ２に示す。

これらの図面の縮尺率は一定ではないことは分かるであろう。

叉ＪＪＬ−１ プロティンＬのＩＧ　＝ｂのクローン プロティンＬのＢ１−８４領域をコードする配列を増幅するのに用いる合成オリ ゴヌクレオチド（プライマー）の構築 配列ａｌａ−ｖａｌ−ｇｌｕ−ａｓｎ−領域Ｂｌ（プロティンＬ由来）で構成さ れているプロティン上ペプチド（イー・コリ内で発現する）は免疫グロブリン類 の軽鎖に結合することが見出されたのである（Ｗ、　Ｋａｓｔｅｒｎ　、υ、　 Ｓｊｏｅｂｒｉｎｇおよびり、　Ｂｊｏｅｒｃｋ、”５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ 　ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌ　ａｎｄ　１ｄ ｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｒｅｐｅａｔｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏ ｂｕｌｉＩＩｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎ　−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｄｏｍａｉｎ　”　 、　Ｊ、　Ｂｊｏｌ、　Ｃｈｅｌｌ、印刷中）、この簡単なプロティンＬの領域 はＩｇに対するアフィニティーが比較的低く（１×１０’Ｍ−’）かついくつか の相互に類似している領域（Ｂ１−Ｂ５）で構成されている天然産生のプロティ ンＬはＩｇに対するアフィニティーが高い（１ｘ　１０　”Ｍ−’）ので、これ ら領域のうちの四つは以下のようにしてともに発現された。

ＰＬ−ＮとＰＬ−ＣＩは本願出願人の指示にしたがってＬｕｎｄ大学（スエーデ ン）のＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｕｎｉｔで製造された合成オリゴヌクレオチ ドであり、これらのオリゴヌクレオチドを使用して、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖 反応）で増幅されかつプロティンＬの四つのＩｇ結合領域（ａｌａ−ｖａｌ−ｇ ｌｕ−ａｓｎ−Ｂｌ−Ｂ２−Ｂ３−Ｂ４−１ｙｓ−１ｙｓ−ｖａｌ−ａｓｐ−ｇ ｌｕ−１ｙｓ−ｐｒｏ−ｇｌｕ−ｇｌｕ）をコードするクローン化可能な遺伝子 フラグメントを増幅した。プロティンＬ配列のアミノ酸を、コードされたストラ ンドに対応するプライマー（ＰＬ−Ｎ）に対して示す。

このオリゴヌクレオチドの５′末端は、プロティンＬの遺伝子中のコードされた ストランドと相同である（強調）、すなわち八−領域中の最後の３個のアミノ酸 （ｖａｌ−ｇｌｕ−ａｓｎ）をコードするコドンに、プロティン■７の最初のＩ ｇ結合領域（Ｂ１）中の最初の６個のアミノ酸のコドンが続（。

このオリゴヌクレオチドはプロティンＬの遺伝子中の反対側の非コーディングス トランドと相同である（その配列はＢ−５領域中の最初の９個のアミノ酸に対応 する）。

ＰＬ−Ｎによって増幅されたＤＮＡフラグメントは、発現されるプロティントフ ラグメント中の最初のアミノ酸（ｖａｔ）をコードしていると考えられるコドン の直前に制限酵素ＨｐａＩＩの認識配列（強調）を含有している。ＨｐａＩＩで 開裂されるフラグメントは、制限酵素Ｎａｒ　Ｉで開裂されたＤＮＡ　（この場 合、使用された発現ベクターｐＨＤ３８９で構成されている）と連結させること ができる。

Ｈｐ　ａ　１１で開裂され、次いでＮａｒ　Ｉで開裂されたベクターｐＨＤ３８ ９と連結されたＤＮＡ配列は正しい読取り枠に翻訳される。この構築によって、 プロティンＬの最初のアミノ酸の直前の追加のアミノ酸（ａ　ｌ　ａ）が翻訳さ れるＰＬ−Ｃ１によって増幅されたＤＮＡフラグメントは、発現されるプロティ ンＬのフラグメント中の最後のアミノ酸（ｇ　１　ｕ）をコードする配列の直後 に制限酵素Ｂ　ａｍＨＩの認識配列（その配列の上方に直線が引いである）を含 有している。ベクターｐＨＤ３８９は、Ｎａｒ　Ｉの認識配列に続くそのいわゆ る多重クローニング配列の一部分として、ＢａｍＨＩのユニーク認識配列を含有 している。ＰＬ−ＣＩによって増幅されたＤＮＡフラグメントは、該ベクターに 挿入されたフラグメントの翻訳を終止させるいわゆる終止コドン（強調）を二つ 含有している。

増幅されると考えられた配列は、制限酵素Ｈｐ　ａ　ＩＩもしくはＢａｍＨＩの 内部認識配列を含有していない。

増幅およびクローニング法 ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）は、５ａｉｋｉ　、　Ｒ，Ｄ、　ＧｅＩｔａｎ ｄ　、　Ｓ、　５ｔｏｆｆｅｌ　、　Ｓ、　５ｃｈａｒｆ　、　Ｒ，旧ｇｕｃｈ ｉ　、　Ｇ、　Ｈｏｒｎ　、　Ｋ、　Ｍｕｌｌｉｓおよびｔｌ、　Ｅｒ１ｉｃｈ 　、　”　Ｐｒｉｍｅｒ　−ｄｉｒｅｃｔｅｄｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ａｍｐｌｉ ｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｗｉｔｈ　ａ　ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ　 ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−、５ｃｉｅｎｃｅ、　２３９巻、４８７〜４９ １．２７頁、１９８８年に報告されたプロトコルで行った。すなわちＰＣＲは） ｌｙｂａｉｄ　Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ　Ｈｅａｔｉｎｇｂｌｏｃｋ　（英国、 Ｔｅｄｄｉｎｇｔｏｎ社）で行った。すなわち反応混合物１００ｕ１２は、５０ ｍＭのＫＣＪ２．１０ｍＭのトリス−ＨＣｊ２　ｐＨ８，３，１，，５ｍＭのＭ ｇＣＪ２ｉ　、１００μ／ｍβのゼラチン、各々３００ｕＭのデオキシヌクレオ チド（ｄ　Ａ　Ｔ　Ｐ　、ｄ　ＣＴ　Ｐ　、　ｄ　Ｇ　Ｔ　Ｐ　、　ｄ　Ｔ　Ｔ 　Ｐ　）　（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉ　ａ社）、各々２０　ｐｍｏβのオリゴヌクレ オチドＰＬ−ＮとＰＬ−Ｃ℃、ペブトストレブトコッカス・マグヌスの種３１２ 由来の染色体ＤＮＡを０．１ｍｇ／ｍＩ２含有する櫟的（鋳型）ＤＮＡ溶液１０ μβを含有していた。この混合物を鉱油（Ｓｉｇｍａ社）で覆い、次いで９８℃ で１０分間加熱することによってＤＮＡ’　ｔを変性させた。２．５単位のＡｍ ｐｌｉｔａｇ　（米国、コネティカット州、ノーウオーク所在のＰｅｒｋｉｎ　 Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ社）を添加し、次いでＰＣＲを、９４℃で１分間の変性 ステップ、続いて５６℃で１分間の雑種形成ステップおよび最後に７２℃で１分 間の拡張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ステップで構成されているサイクルを２５サイ クル行って実施した。増幅されたＤＮＡをアガロースゲルの電気泳動で分析した 。増幅されたＤＮＡ′ｔを、制限酵素Ｈｐ　ａ　ＩＩ　（Ｐｒｏｍｅｇａ社）（ ８単位／ｕｇ増幅ＤＮＡ）およびＢ　ａ　ｍ　ＨＩ　（Ｐｒｏｍｅｇａ社）　（ １０単位／ｕｇ増幅ＤＮＡ）を用い３７℃で開裂させた。このようにして増幅し 次いで開裂されたＤＮＡ生成物を、ＴＡＥ緩衝液（４０Ｍｍトリス、２０Ｍｍ酢 酸ナトリウム、２　Ｍ　ｍ　Ｅ　Ｄ　ＴＡ、ｐＨ８，ＯＪ中の２％（ｗ／ｖ）の アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ　ａｇａｒｏｓｅ　、　ＦＭＣＢｉｐｒｏｄｕ ｃｔｓ社）による電気泳動法で単離した。得られた９３０個の塩基対の大きなフ ラグメントを上記のゲルから切り取った。この取り出したゲル片中のＤＮＡ４１ １度は０．０５ｍｇ／ｍβと推定した。上記の開裂され増幅されたフラグメント を含有するアガロース片を６５℃の湯浴中で融解させ次いでそのフラグメントを ３７℃まで冷却させた。このＤＮＡ　１０μｌ２（０，５μｇ）を予め３７℃に 加熱した半微量試験管（ｓｅｍｉ＋ｍ１ｃｒｏｔｕｂｅ）　（５ａｒｓｔｅｄｔ 社）に移し、次いで直ちにｌμβのベクターｐＨＤ３８９を添加し、次いでＮ　 ａ　ｒ　Ｉ　（Ｐｒｏｍｅｇａ社）とＢａｍＨＩ、１ｕ１２の１０　Ｘ　ｌｉｇ ａｓ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ社）と１μβのＴ４ＤＮＡ−リガーゼ（Ｐｒｏｍｅ ｇａ社）；１単位／μρで開裂した。この連結反応混合物を使用してイー・コリ の菌株ＬＥ３９２を形質転換させた。なおこの菌株は、ｋｕｓｈｎｅｒの１９７ ８年の文献に記載されているルビジウム／塩化カルシウム法で予めコンピテント にした０分子生物学の標準の方法を用いてＤＮＡ操作を行った（　Ｓａ■ｂｒｏ ｏｋ　、　Ｊ、ε、　ｆｒｉｔｓｃｈおよびＴ、　ＭａｎｉａｔＬｓ　、　Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ　：＾ｔａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ　、 第２版、１９８９年Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒＬｔｓ　、米国、ニューヨーク州コールドスプリングハーバ−）、他の点につ いては、ＤＮＡリガーゼと制限酵素のメーカーが推奨する開裂と連結の条件にし たがった。

発現系 ベクターｐＨＤ３８９　（図２参照）はプラスミドｐＨＤ３１３の修飾変異体で ある（　Ｄａｌｂｏｅｇｅ　、Ｈ，ε、　Ｂｅｃｈ　Ｊｅｎｓｅｎ　、　Ｈ，Ｔ ｏｅｔｔｒｕｐ　、　Ａ、　Ｇｒｕｂｂ　、　Ｍ、　Ａｂｒａｈａｍｓｏｎ　、 　Ｉ。

０１ａｆｓｓｏｎおよびＳ、　Ｃａｒｌｓｅｎ　、″）ｌｉｇｈ　−１ｅｖｅｌ 　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａｃｔｉｖｅ　ｈｕｍａｎ　ｃｙｓｔａｔｉｎ 　Ｃｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ”　、　Ｇｅｎ’ｅ　、　７９巻、 ３２５〜３３２頁、１９８９年）、このベク゛ターは、イー・コリ中で複製され るが（ｏｒｉ＝プラスミドｐｕｃ　ｌ　９由来の複製開始点を含有している）、 ＮａｒＩの開裂部位中にクローン化されたＤＮＡフラグメントが、イー・コリ由 来のエンベロープタンパク質ｏｍｐＡ由来のシグナルペプチド（２１個のアミノ 酸）の下流のそのすぐ近くで転写され翻訳されるように構築されている。翻訳は 、シグナルペプチドの最初のアミノ酸（メチオニン）をコードするコドンＡＴＧ から開始される。この構築によって上記の翻訳されたペプチドを、イー・コリの 細胞周辺腔に送ることができる。このことは、イー・コリの細胞内で生成する望 ましい生成物の酵素が分解する危険が減少するからである。さらに、細胞周辺腔 に送られたペプチドを精製することは容易である。いくつかの他の制限酵素とり わけｅｃｏＲＩ、Ｓａｌ　ＩおよびＢａｍＨＩのユニーク認識配列（多重クロー ニング配列）がＮａｒＩ開裂部位の直後に認められる。最適化されたいわゆるシ ャイン・ダルガルノ配列（リポソーム結合部位、ＲＢＳとも呼称される）が、ｏ ｍｐＡ由来のシグナル配列中のＡＴＧコドンから７個のヌクレオチド上流にみと められ、この最適化された配列は、リポソーム中の１６ｓ　ｒＲＮＡの相補的配 列に結合し、正しい位置で開始される翻訳に関与している。ｏｍｐＡのシグナル 配列と共転写される（ｃｏ　−ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ）ようなりＮＡの転写は コリファージλ由来のＰ、プロモータで制御される。また該ベクターはコリファ ージλ由来のｃＩ８５７の遺伝子を含有し、その産物はＰ。

からの転写をダウンレギュレートする（かつその産物は構成的に発現される）、 ｐ、からの転写のこのｃＩ８５７によるダウンレギュレーションは熱感受性であ る。調節されたこのプロモータからの転写はいわゆるｒｈｏ−独立転写終止配列 ［ＤＮＡストランドをリーブ（ｌｅａｖｅ　）するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ ーゼをもたらす構造をＤＮＡ’　を中に形成する］によって終止され、この配列 は該ベクター中、多重クローニング配列のすぐ下流に配置されている。

またこのプラスミドはβ−ラクタマーゼ遺伝子（プラスミドｐＵｃ　ｔ　９由来 ）を含有し、その産物によって、該ベクターで形質転換されたイー・コリのクロ ーンのアンピシリン選択を行うことができる。

プロティンＬ産生クローンの選択 形質転換された細菌を、１１００ｕ／ｍρの濃度のアンピシリンを含有するＬＢ 培地を有する培養プレート上で培養する。この細菌の培養を３０℃で一夜行い、 次いでその細菌をインキュベートに移し、さらに４時間４２℃で培養した。これ らのプレートを冷蔵庫内に一夜保管した。翌日、コロニーをニトロセルロースフ ィルターに転移させた。

フィルターと培養プレートは、転移させたコロニーがそれぞれの培養プレートに 対して容易に確認できるようにマークを付けた。その培養プレートを再度３０℃ で一夜インキユベートし、て、転移された細菌コロニーの残留部分を再び増殖さ せた。これらのプレートを冷蔵庫に保管した。ニトロセルロースインプレッショ ン（ｎ１ｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　−ｉｗｐｒ２ｓｓｉｏｎ）上のコロニー中 の細菌を、該フィルターを１０％ＳＤＳ中で１０分間インキュベートすることに よって溶解させた。溶解細菌を含有するフィルターを、０．２５％ゼラチンおよ び０．２５％Ｔｗｅｅｎ　−２０を含有するＰＢＳ　（ｐＨ７，２）からなるブ ロッキング緩衝液ですすぎ（４個の浴、２５０ｍＩ２ずつ、３７℃）、次いでそ のフィルターを放射性標識をつけた（クロラミンＴ法によって　＋ｓｓｌで標識 を付けた）Ｉｇ−に連鎖（０，１％ゼラチン含有ＰＢＳ中２０ｎｇ／ｍｊ２）と ともにインキュベートした。このインキュベーションは室温で３時間行い、捕捉 されなかった放射性標識タンパク質を０．５ＭのＮａＣｌ２．０．２５％のゼラ チンおよび０．２５％のＴｗｅｅｎ　−２０を含有するＰＢＳ　（ｐＨ７，２） で洗い流した（４個の浴、２５０ｍρずつ、室温）、全フィルターに対してＸ線 フィルムを露光させた。陽性のコロニーを元の培養プレートについて確認した。

Ｉｇ−に連鎖と反応したクローンを選択し、ベクターに導入されたＤＮＡフラグ メントのサイズについて分析した。これらのクローンのうち一つをプロティンＬ を産生ずるのに選択した（クローンｐＨＤＬ）、このクローンからプラスミドｐ ）（Ｄ３８９に導入されたＤＮＡ’　ｔの配列を決定した。そのＤＮＡ配列は、 ベプトストレブトコツカス・マグヌスの菌株３１２由来のプロティンＬの遺伝子 の対応する配列（Ｂｌ−Ｂ４およびＢ５中の２１個の塩基）に完全に一致してい ることが分かった。クローンｐＨＤＬが産生ずるプロティンのサイズと結合特性 を、５ＤＳ−ＰＡＧＥ法（図８参照）、ドツト−プロット試験法（図９参照）お よび競合結合試験法で分析した。

プロティンＬの産生 イー・コリｐＨＤＬを有する培養プレート由来のいくつかのコロニーを使用して 、プレカルチャー（ｐｒｅｃｕｌｔｕｒｅ　：１００ｍｇ／Ｉ２のアンピシリン を添加したＬＢ培地）に接種し、２８℃で一夜培養した。翌朝、そのプレカルチ ャーを、大容積の（プレカルチャーの１００倍の容積）新しいＬＢ培地（ｌｏＯ ｍｇ／４２のアンピシリンを含有）に移し、振盪フラスコ（２００ｒｐｍ）（ま たは発酵槽）中２８℃で培養した＊　６２０　ｎ　ｍにおける吸光度値が０．５ に到達したとき、上記の培養温度を４０℃まで上昇させた（転写の誘発）０次い で培養を４時間続けた（単に振盪フラスコ内での培養を行った）、培養工程を完 了してから細菌な遠心分離した。その細菌を、浸透圧ショック法を用い４℃で溶 解した（　Ｄａｌｂｏｅｇｅらの１９８９年の前記文献）、得られた治解物のｐ Ｈを７に調節した。残留している細菌を遠心分離し、次いでその上澄み液を、プ ロティンＧとプロティンＬについてすでに報告されているプロトコルにしたがっ てＩｇＧｇファロースで精製した（Ｕ、　Ｓ、ｊｏｅｂｒｉｎｇ　、　Ｌ。

Ｂ、１ｏｅｃｋおよびＩ！、　Ｅａｓｔｅｒｎ　、”　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ ａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎＧ　：　Ｇｅｎｅ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｐｒｏ ｔｅｉｎ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｐｅｒｔ。

ｉｅｓ　”　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　、２２６巻、３９９−４０５ 頁、１９９１年；　Ｗ、　Ｋａｓｔｅｒｎ　、　Ｕ、　Ｓｊｏｅｂｒｉｎｇおよ びり、　Ｂｊｏｅｒｃｋ　、＋５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｐｅｐｔｏｓｔｒｅ ｐｔｏｃｏｃｃａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎＬ　ａｎｄ　１ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏ ｎ　ｏｆ　ａ　ｒｅｐｅａｔｅｄ　ｉｍ＋ｉｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｌｉｇｈ ｔ　ｃｈａｉｎ　−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｄｏｍａｎ　−、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ ｅ順、１９９２年印刷中）。

該発現系は塩１フラスコで培養したところ約２０ｍｇ／！のプロティンＬを生成 した。その培養物は、認識記号＝ＤＳＳＭイー・コリＬ　Ｅ　３９２　／　ｐ　 ＨＤ　ＬでＤＳＳＭに寄託した。

見立！−１ プロティンＬＧのクローニングと プロティンＬＧをコードする配列を増幅するのに用いるオリゴヌクレオチド（プ ライマー）の構築プロティンＬ 配列ａｌａ−ｖａｌ−ｇｌｕ−ａｓｎ−領域Ｂｌ（プロティンＬ由来）で構成さ れているプロティント−ペプチド（イー・コリ中で発現される）が免疫グロブリ ン類の軽鎖に結合することが見出されたのである（　ｋａｓｔｅｒｎ　、　ＳＪ ｏｅｂｒｉｎｇおよびＢｊｏｅｒｃｋ　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ｃｈｅｗ、１９ ９２年印刷中）、この単純な領域のＩｇに対するアフィニティーは比較的低く　 （Ｉ　Ｘ　Ｉ　Ｏ−’Ｍ−’）　、そして天然産のプロティンＬは互いに類似の 領域（Ｂｌ−８５）で構成されているがＩｇに対するアフィニティーが高い（Ｉ 　Ｘ　１０　ＩＯＭ−’）ので、これらの領域のうちの四つが次のようにして発 現されたＰＬ−ＮとＰＬ−Ｃ２は、本願出願人の指示によってＬｕｎｄ大学（ス エーデン）のＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｕｎｉｔで製造された合成オリゴヌク レオチドであり、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）に使用してＢ１−４と命名さ れたクローン化可能な遺伝子フラグメントを増幅させた。このＢ１−４７ラグメ ントは四つのＩｇ結結合性プロティン領領域ａｌａ−ｖａｌ−ｇｌ　ｕ−ａｓｎ −Ｂｌ−Ｂ２−Ｂ３−Ｂ４−１ｙｓ−１ｙｓ−ｖａｌ−ａｓｐ−ｇｌｕ−１ｙｓ −ｐｒ。

−ｇｌｕ−ｇｌｕ）をコードしている。

ＰＬ、−Ｎ　：　５１−ＧＣＴＣＡＧＧＣＧＧＣＧＱＱ７ＴＡＧＡＡＡＡＴＡＡ ＡＧＡＡＧＡＡＡＣＡＣＣＡＧＡＡＡＣ−：１１ｙｓ１ｇｌｕａｓｎｌｙｓｇｌ ｕｇｌｕｔｈｒｐｒｏｇｌｕアミノ酸は、コードされているストランド中の対応 するトリブレットに基づいて示した。ＰＬ−Ｎで増幅されたＤＮＡフラグメント は、発現されるプロティン上フラグメントの最初のアミノ酸（ｖａｌ）をコード するトリプレットのすぐ上流に制限酵素Ｈｐａ■の認識配列を含有している。Ｈ ｐａＨで開裂されたフラグメントは、Ｎａｒ　Ｉで開裂されたＤＮＡ　（この場 合、使用された発現ベクターｐＨＤ３８９）と連結させることができる。このよ うに構築することによって、プロティン上フラグメントの最初のアミノ酸のすぐ 上流のエキストラアミノ酸（ａ　１　ａ）が翻訳される。ＰＬ−Ｃ２によって増 幅されたＤＮＡフラグメントは、発現されるプロティン上フラグメントの最後の アミノ酸（ｇ　１　ｕ）をコードする配列のすぐ下流に制限酵素Ｎｃ。

Ｉの認識配列（強調）を含有している。ＮｃｏＩで開裂された増幅フラグメント は、ＮｃｏＩで開裂されＰＣＲで生成したプロティン−ａ　ｓ　ｐ−ＣＤＣ−ｍ ｅ　ｔ−フラグメントに連結させることができる（下記参照）。

プロティンＧ プロティンＧ由来の単純なＣ−領域がＩｇＧに結合することは公知である（Ｂ、 　Ｇｕｓｓ　、　Ｍ、　Ｅｌｉａｓｓｏｎ　、　Ａ、　０１ｓｓｏｎ、　Ｍ、　 Ｕｈｌｅｎ　、　Ａ、　−に、　Ｆｒｅｊ　、　Ｈ，Ｊｏｅｒｎｖａｌｌ　、　 １．　ＦｌｏｃｋおよびＭ、　Ｌｉｎｄｂｅｒｇ　、　”　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ 　ｏｆ　ｔｈｅ　ＩｇＧ　−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎｓ　ｏｆ　５ｔｒｅ ｐｔｏｃｏｃｃａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇ、　＋、　ＥＭ８０、　Ｊ、　、５巻 、１５６７〜１５７５頁、１９８６年）、単純なＣ領域がＩｇＧに結合する強度 は比較的低い（５Ｘ１０’　Ｍ−’）、Ｌかし、１５個のアミノ酸の長さを存す る中間のＤ領域を有する二つのＣ領域で構成されているフラグメントは、ＩｇＧ に対するアフィニティーがかなり高い（Ｉ　Ｘ　１０”　Ｍ−’）、ＣＤＣ−Ｎ とＣＤＣ−Ｃは、ＣＤＣと命名されたクローン化可能なりＮＡフラグメントを増 幅させるためＰＣＲプライマーとして使用したオリゴヌクレオチドであり、二つ のＩｇＧ結合性プロティンＧ領域（ｐｒｏ−ｍｅｔ−ａｓｐ−ＣＤＣ−ｍｅｔ） をコードしている得られた配列のアミノ酸はコーディングストランドのプライマ ーの下側に示した。ＣＤＣ−Ｎによって増幅されたＤＮＡフラグメントは、制限 酵素ＮｃｏＩの認識配列（配列の上に線を引いてマークをつけた）を含有してい る。開裂して増幅させたフラグメントは、ＰＬ−Ｃ２によって増幅され次いでＮ ｃｏ　Ｉで開裂されたフラグメントと連結させることができる１次いでそのフラ グメントは正しい読取り枠に翻訳される。ＣＤＣ−Ｃによって増幅されたＤＮＡ フラグメントは、翻訳を終止するいわゆる終止コドンな二つ（強調）を含有して いる。制限酵素５ａｌＩの認識配列（配列の上に線を引いてマークをつけた）が すぐ後に続き、またこの配列は発現ベクターｐＨＤ３８９中にみとめられる（図 １参照）。

プロティンＬ（Ｂｌ−Ｂ５）およびプロティンＧ（ＣＤＣ）の結合特性をコード する配列はそれぞれ制限酵素Ｈｐａｌｌ、５ａｉｌまたはＮｃｏＩの内部認識配 列を含有していない。

増幅とクローニングの手順 ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を５ａｉｋｉらの１９８８年の報告に記載され ているプロトコルにしたがって実施した。すなわちＰＣＲはＨｙｂａｉｄ　Ｉｎ ｔｅｌｌｉｇｅｎｔ　）ｌｅａｔｉｎｇ−ｂｌｏｃｋ　（英国、Ｔｅｄｄｉｎｇ Ｌｏｎ社）で行い、その反応混合物は１００μＡ中に、５０ｍＭのにＣ１１，１ ０ｍＭ）リス−ＨＣＪ％ｐＨｓ、３．１．５ｍＭのＭｇＣＡｓ、１１００ｕ／　 ｍ　Ｑのゼラチンおよび各デオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ　、　ｄ　ＣＴ　Ｐ 　、　ｄ　Ｇ　Ｔ　Ｐ　、　ｄ　Ｔ　Ｔ　Ｐ　）　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に ついて３００μＭを含有していた。プロティンＬの軽鎖結合部分をコードする配 列を増幅するために、オリゴヌクレオチドＰＬ−ＮとＰＬ−Ｃ２を各々２０ｐｍ ｏＪおよびペプトストレブトコッカス・マグヌスの菌株３１２由来の染色体ＤＮ Ａ　（０，１ｍｇ／ｍｌ２）を含有するＤＮＡ溶液１０ｕβを添加した。あるい は、オリゴヌクレオチドのベアＣＤＣ−ＮとＣＤＣ−Ｃを各々２０ｐｍｏ！およ びグループＣのストレプトコツカス属の菌株（ストレプトコッカス・エクイシミ リス）（Ｃ４０と呼ばれている）　（Ｕ、　ＳＪｏｅｂｒｉｎｇ　、　Ｌ、　Ｂ ｊｏｅｒｃｋおよびＷ、　Ｋａｓｔｅｒｎ　、５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ　ｐ ｒｏｔｅｉｎ　Ｇ　：　Ｇｅｎｅ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉ ｎ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｇ”　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ ｗ、　、２６６巻、３９９〜４０５頁、１９９１年）を含有するＤＮＡ溶液１０ ｕｒ、またはＮｃｏ　ＩとＳａｌ　ｌ　（ＩＯＵ／μｇ　ＰＣＲ生成物＞（ＣＤ Ｃに対して）をともに３７℃で添加した。このように増幅され次いで開裂された ＤＮＡフラグメントは、ＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭのトリス、２０ｍＭの酢酸ナト リウム、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８，０）中の２％（ｗ　／　ｖ　）のアガロー スゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ　ａｇａｒｏｓｅ　、　ＦＭＣＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔＳ 社）による電気泳動によって分離した。得られたフラグメント９３０ｂｐ　（Ｂ ｌ−４に対するフラグメント）および３９０ｂｐ　（ＣＤＣに対するフラグメン ト）をゲルから切取った。このようにして分離したゲル片中のＤＮＡの濃度は０ ．０５ｍｇ／ｍｇと推定した。ゲルから切取られ。

開裂・増幅されたフラグメント（Ｂ　ｌ−４およびＣＤＣ）を含有するアガロー ス片を６５℃の湯浴中で融解させ、次いで３７℃まで冷却した。このＤＮＡｌ０ ｇ℃（０，５μｇ）を半微量試験管（５ａｒｓｔｅｄｔ社）に移し、３７℃まで 予熱し、次いでＮａｒ　Ｉと５ａｌｌで開裂させたベクターｐＨＤ３８９　１μ ρを添加した。また１０×リガーゼ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ社）ｌｕｉｌおよび Ｔ４ＤＮＡ−リガーゼ（１単位／μｅ）ｌｕ２も添加した。この連結反応は３７ ℃で６時間行った。他の点については、ＤＮＡ−リガーゼおよび制限酵素のメー カー（Ｐｒｏｌｅｇａ社）が推奨する開裂と連結の条件に従った。この連結反応 混合物をイー・コリ菌株ＬＥ３９２を形質転換するのに用いた。なおこの菌株は 、にｕｓｈｎｅｒの１９７８年の報告に記載されている塩化ルビジウム／二塩化 カルシウム法にしたがって予めコンピテントにした。ＤＮＡの操作は分子生物学 の標準の方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋらの１９８９年の報告）にしたがって行った。

発現系 ベクターｐＨＤ３８９　Ｃ図２参照）はプラスミドｐＨ０３１３（Ｄａｌｂｏｅ ｇｅらの１９８９年の報告）の修飾変異体である。イー・コリ内で複製されたベ クター（プラスミドｐＵＣ１９由来の複製開始点を含有している）は、Ｎａｒ　 Ｉの開裂部位にクローン化されたＤＮＡフラグメントが、イー・コリ由来のエン ベロープタンパク賀ｏｍｐＡ由来のシグナルペプチド（２１個のアミノ酸）の直 後もしくは下流で発現されるように構築される。翻訳はシグナルペプチドの最初 のアミノ酸（メチオニン）をコードするＡＴＧコドンから開始される。所望のペ プチドに先行するイー・コリの個々のシグナル配列を有する構造によって、翻訳 されたペプチドをイー・コリの細胞周辺腔に送ることができるようになる。この ことは、それによって、イー・コリの細胞内で生成する酵素によって所望の生成 物が分解する危険が減少するので有利である。その上に、細胞周辺腔に送られた ペプチドを精製するのは一層容易である。いくつかの他の制限酵素とりわけＥｃ ｏＲＩ、Ｓａｌ　ＩおよびＢａｍＨＩのユニーク認識配列（多重クローニング配 列）はＮａｒ■開裂部位のすぐ下流に存在している。最適化されたいわゆるシャ イン・ダルガルノ配列（リポソーム結合部位、ＲＢＳとも呼ばれる）が、ｏｍｐ Ａ由来のシグナル配列のＡＴＧコドンの７個のヌクレオチド上流に見られ、この 最適化されたシャイン・ダルガルノ配列は、翻訳が正しい位置で開始されるのを 決定する方式でリポソーム中の１６Ｓｒ　ＲＮＡ中の相補配列に結合する＠　ｏ ｍｐＡに対するシグナル配列と共転写されるようなりＮＡの転写はコリファージ λ由来のｐＨプロモータによって制御される。また該ベクターはコリファージλ 由来ｃＩ８５７の遺伝子を含有し、その産物は、ＰＩＩからの転写をダウンレギ エレートし。

かつその産物は構成的に発現される。ＰＲからの転写のこのｃ　Ｉ　８５７によ るダウンレギエレーションは熱感受性である。調節もしくは制御されるこのプロ モータからの転写は多重クローニング部位のすぐ下流の位置でベクターに挿入さ れているいわゆるｒｈｏ−独立転写終止配列によって終止される。またこのプラ スミドはβ−ラクタマーゼの遺伝子（プラスミドＰＵＣ１９由来）を保有し、そ の産物によって、該ベクターで形質転換されたイー・コリクローンのアンピシリ ンによる選択を行うことができる。

プロティンＬＧ産生クローンの選択 形質転換された細菌を、ｌｏｏＬＬｇ／ｍＪ！の濃度のアンピシリンを含有する ＬＢ培地を有する培養プレート上で培養する。この細菌を３０℃で一夜培養し、 次いで培養キャビネット（４２℃）に移してさらに４時間培養した。これらのプ レートを冷蔵庫に一夜保管した。翌日、コロニーをニトロセルロースフィルター に移した。移されたコロニーがその後、培養プレートに対して確認できるように 、該フィルターと培養プレートにマークを付けた。培養プレートを再び３０℃で 一夜インキュベートして、プレート上に残留している移された細菌の残りを再度 増殖させた６次いでそのプレートを冷蔵庫に保管した。該フィルターを１０％Ｓ ＤＳ中で１０分間インキュベートして、ニトロセルロースインプレッション上の コロニー中の細菌を溶解させた。

次に溶解された細菌を含有するフィルターを、０．２５％のゼラチンと０．２５ ％のＴｗｅｅｎ　−２０を含有するＰＢＳ（ｐＨ７，２）で構成されているブロ ッキング緩衝液ですすぎ（２５０ｍＪ２ずつの４個の浴、３７℃）、次いで、放 射能の標識をつけたＩｇ−に連鎖（２０％ｇ／ｍε）（クロラミン−Ｔ法にした がって　１１工で標識を付けた）とともに０．１％のゼラチンを含有するＰＢＳ 中でインキュベートした。このインキュベーションを室温で４時間行ってから、 捕捉されていない放射能標識プロティンを、０．５ＭのＮａＣｆｆ、０．２５％ のゼラチンおよび０．２５％のＴｗｅｅｎ　−２０を含有するＰＢＳ　（ｐＨ７ ，２）で洗い流した（２５０ｍｇずつの４個の浴、室温）、すべてのフィルター を、Ｘ線フィルムに対して露光させた０元の培養プレートの陽性コロニーを確認 した。いくつかの陽性コロニーを新しいプレート上で培養し、ＩｇＧＦｃを捕捉 するイー・コリのコロニーを同定するための出発物質としてこれらのプレートを 用いて、新しいコロニープロット試験を実施した。これらの試験は、放射能樟ｍ ｌ（”’Ｉ）をつけた工ｇＧＦｃ　（２０％ｇ／ｍｇ）をプローブとして用いた ことを除いて、Ｉｇ軽鎖結合性プロティンを発現したイー・コリコロニーの同定 について先に述べたのと正確に同じ方式で実施した。両方のプロティンと反応し たクローンを選択して、ベクターに導入されたＤＮＡフラグメントのサイズにつ いて分析した。これらのクローンのうちの一つを、プロティンＬＧを産生させる ために選択した（クローンｐＨＤＬＧ）。このクローンから採取しプラスミドｐ ＨＤ３８９に導入したＤＮＡ’　ｔの配列を決定した。そのＤＮＡの配列は、ベ ブトストレブトコッカス・マグヌスの菌株３１２由来のプロティンＬの遺伝子中 の対応する配列（Ｂ１−Ｂ４およびＢ５中の２１個の塩基）ならびにグループＣ ストレプトコッカス菌株Ｃ４０中のＣＩＤＣ２配列と全く一致することを示した 。クローンｐＨＤＬＧから産生されたプロティンのサイズと結合特性は、５ＤＳ −ＰＡＧＥ法（図８参照）、ドツト−プロット試験法（図１０参照）および競合 結合試験法で分析した。

プロティンＬＧの産生 イー・コリｐＨＤＬＧを保有する培養プレート由来のいくつかのコロニーを使用 して、プレカルチャー（Ｌｏｏｍｇ／４２のアンピシリンを添加したＬＢ培地） に接種し、２８℃で一夜培養した。翌朝、そのプレカルチャーを、アンピシリン （１００ｍｇ／ｊＮを含有する大容積の新しいＬＢ培地（プレカルチャーの１０ ０倍の容積）に移し、振動フラスコ（２０Ｏｒ　ｐｍ）　（または発酵槽）中で ２８℃にて培養した＊　６２０　ｎｍ波長光の吸光度値が０．５に到達したとき に培養温度を４０℃まで上げた（転写の誘発）。

この培養をさらに４時間続けた（振動フラスコ内の培養のみを行う）。培養を終 ったときに細菌を遠心分離した。その細菌を、浸透圧ショック法（Ｄａｌｂｏｅ ｇｅらの１９８９年の報告）に従って、４℃で溶解させた。その溶液のｐＨを７ に調節した。残留している細菌残渣を遠心分離して除き、その上澄み液を、プロ ティンＧとプロティンＬについて先に述べたプロトコルにしたがってＩｇＧセフ ァロースで精製した（　Ｓｊｏｅｂｒｉｎｇらの１９９１年の報告およびＫａｓ ｔｅｒｎらの１９９２年の報告）。

上記発現系は、振動フラスコ内で培養したとき約３０ｍｇ／ＣのプロティンＬＧ を与えた。この培養物は、識別記号ＤＳＳＭイー・コリＬＥ３９２／ｐＨＤＬＧ でＤＳＳＭに寄託した。

支１皿−１ プロティンＬＧの結合特性の分析 ウェスタンプロット法 プロティンＧ（ＣＩＤＣ２フラグメント）、プロティンＬ（四つのＢ領域）およ びプロティンＬＧを５ＤＳ−ＰＡＧＥ法（１０％アクリルアミド濃度）で単離し た。単離されたプロティン類を、ニトロセルロース膜に３個の類似のコピー（３ 個ずつの試料）で移した。これらの膜は各々放射能標識をつけたタンパク質（２ ０ｎ　ｇ　／　ｍβ：膜のコピーの一つはヒトポリクローナルＩｇＧとともにイ ンキュベートされ、もう一つの膜のコピーはヒトＩｇＧＦｃフラグメントととも にインキュベートされ、第３番目の膜のコピーは単離されたヒトＩｇＧχ連鎖と ともにインキュベートされた）。捕捉されなかった放射能標識タンパク質を洗い 流して、すべてのフィルターを、Ｘ線フィルムに対して露光させた。

スロット−プロット法 ヒトポリクローナルＩｇ製剤およびＩｇフラグメントを、スロット−プロット器 具を使用し、ニトロセルロースフィルター上に所定量で（図１０参照）三つの類 似のコピーで塗布した。これらの膜は各々、放射能標識をつけたプロティン類（ ２０％ｇ／ｍβ）とともにインキュベートした、ｉコピーのうちの一つはプロテ ィンＬＧとともにインキュベートし、もう一つの膜コピーはプロティンＬととも にインキュベートし、第三の膜コピーはプロティンＧとともにインキュベートし た。捕捉されなかった放射能ｍ識化プロティン類を洗い流し、すべてのフィルタ ーをＸ線フィルムに対して露光させた。

結果を図９と１０に示す。

他の結合性の試験を行って以下の結果を得た。

プロティンＧ、ＬおよびＬＧの免疫グロブリン類に対する結合性結合性プロティ ン　ＧＫ、　Ｌ　Ｋ、　ＬＧＫ。

免疫グロブリン ポリクローナ）ＩしＩｇＧ”　＋　６７（１０）　＋　９．０　＋２０１ｇＧサ ブクラス ＩｇＧ＋　＋　２．０　＋　＋ ＩｇＧ、　＋　３、ｌ　＋　＋ ＩｇＧｓ　＋　６．１　＋　＋ ＩｇＧ４＋　４．７　＋　＋ ＩｇＧフラグメント Ｆｃ”　＋　６．０（０゜５）−十 Ｆ（ａｂ’　）ａ”　＋　０．４ｉ０．２１　＋　＋他のＩｇ−クラス ＩｇＭ　−＋　１１．６　＋ ＩｇＡ　−＋　１０．４　＋ 他Ω橿： ウサギ　ＩｇＧ　＋　７０　＋　０．０７４　＋１ｇ（ｒＦｃ　＋　３．０　− 　＋ ＩｇＧ−Ｆｆａｂ　’　ｌａ　＋　０．４４　＋マウス　＋　４１　＋　２．６ 　＋ ラット　＋　１．５　＋　０．３９　＋ヤギ　＋　１４−＋ 青（続き） プロティンＧ、ＬおよびＬＧの免疫グロブリン類に対する結合性結合性プロティ ン　ＧＫ、　Ｌ　Ｋ、　ＬＧＫ。

免疫グロブリン マウス ラット に、＝親和定数（Ｍ−’）、”括弧内の数字は２個のＩｇＧ結合領域からなる組 換えプロティンＧのアフィニティーを示す、１λ鎮に対する弱い結合が存在する 。’ＰＬとＰＬＯに対する結合性はＩｇの軽鎖のタイプに依存している。

したがって、合成されたハイブリッドプロティンＬＧは広範囲にわたる結合の活 性／特異性をもっていることが分かる。

配列表 （１）一般情報： （ｉｌ出願人 （Ａ）名称：　）ＩｉｇｈＴｅｃｈ　Ｒｅｃｅｐｔｒｏ　ＡＢ（Ｂ）ストリート ：　ｃｌｏ　Ａｃｔｉｖｅ　５ｋｅｐｐｓｂｒｏｎ　２（Ｃ）市：　ＭＡＬＭＯ （Ｅ＞国：スエーデン （Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）　：　２１１２０（Ｇｌ電話：　０４０／３５０７０ ０ （旧テレファックス：　０４０／２３７４０５（１）テレックス：　３２６３７ 　Ａｃｔｉｖｅ　Ｓ（１、発明の名称：ハイブリッドプロティン（ｉｉｉｌ配列 の数：１ ｆｉｖ）コンピュータが読取り可能な形態（Ａｌ媒体のタイプ：フロッピーディ スク（Ｂ）コンピュータ：　ＩＢＭ　ＰＣコンパチブル（Ｃｌオペレーティング システム：　ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄｌ　ソフトウェア：　Ｐａｔｅｎ ｔｌｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　Ｊｔｌ、０．Ｖｅｒｓｉｏｎｌｔｌ、２５（ＥＰＯ） （Ｖ）本出願のデータ： 出願番号：　ＳＥ　ＰＣＴ／ＳＥ　９３１００３７５（ｖｉ）原出願のデータ： （＾）出願番号：　ＳＥ　９２０１３３１−７（ロ）出願臼：　１９９２年　４ 月２８日（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の情報：（ｉ）配列の特徴 （＾）長さ２３０５個のアミノ酸 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｃｌストランデッドネス：不明 （Ｄ）トポロジー二不明 （ｉｉ）分子のタイプ：タンパク質 （ｆｉｔ）仮説：なし くｖｉｌ起源： （＾）生物：エシェリキア・コリ　ＬＥ　３９２／ｐＨＤＬ、　ＤＳＭ（ｘｉ） 配列の内容：　ＳＥｏ　１０　ＮＯ：１：Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｌ ｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｔ ｈｒ　Ａｓｐ　Ｂａｔｌ　５　１０　１５ Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　’ｒｈｒ　Ｘｌ＠Ｌｙｍ　Ａｌａ　Ａｓｎ　 Ｌ＠ｕ　ｍｌ＠　Ｐｈ＠　Ａ１１ｌ　Ａｇｎ　Ｇｌｙ　Ｂヒ入１ａ　Ｔｙｒ　Ａ ｌａ　Ｔｙｒ　入１ａ　Ａ１１ｐ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｌｙｌｌ　ｂｙｓ　Ａｇｐ 　入ｍｎ　ＧＩＹ　Ｇｌｕ　ＴＦ　Ｔｈ■ Ｉ、Ｙｌｌ　Ｌｙｇ　λｌｌｐ　Ａｋｉｎ　Ｇｌｙ　ＧＬｕ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　 Ｍａｌ　八ｓｐ　ＶａＬ　Ａｌａ　入ｇｐ　Ｌｙｌｌ　Ｇｉ凵@Ｔｙｒ １３０　１３５　１４Ｇ Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　ＬｙｌｌＴｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　 Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ工ｌａ　Ｌｙｓ　Ａｌａ２２５　２コ０　２３ ５　２４０ （２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２の情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：　９２１個の塩基対 ｆＢｌ　タイプ：核酸 ｆｃ）ストランデツドネス：二本鎖 （Ｄ）トポロジー二不明 （０１分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）ｆｉｉｉ）仮説：なし くｖｉ）起源： （＾）生物：エシェリキア・コリ　ＬＥ　３９２／Ｉ）ＨＤＬ、　ＤＳＭ（ｘｌ ）配列の内容：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：２：にｅｌｌ；ＧＴＡＧＡＡＡ　ＡＴＡ ＡＡＧＡＡＧＡ　ＭＣＡＣＣＡＧＡＡ　ＡＣＡＣ（ＪＧＡＡＪＩＩ　ＣＴＧＡＴ ＴＣＡＧＡ　５０ＧＡＡＡＡＡＣ艶ＧＡＪＩ鳳μＴＭＴＡＡ　９２１ｆ２）　Ｓ ＥＱ　１０　ＮＯ：３の情報：（ｉ）配列の特徴： （＾）長さ：　４３４　ｇのアミノ酸 ｆＢｌ　タイプ：アミノ酸 （Ｃ）ストランデッドネス：不明 （１１）分子のタイプ：タンパク質 （ｉｉｉ）仮説：なし くｖｉｌ起源： （Ａｌ生物、エシェリキア・コリ　ＬＥ　３９２／ｐＨＤＬＧ、　ＤＳＭｆｘｉ ）配列の内容：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３：Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　 Ｔｈｒ　Ｉｌａ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｍｎ　Ｘａｕ　Ｉｌａ　Ｐｈ−人１ａ　Ａｓ ｎ　Ｇｌｙ　５ａｒ２０　２５　コ０ ’ｒｈｒ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｐｈａ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ 　Ｐｈａ　Ｇｌｕ　ＬｙｅにＬａ　’ｊｈｒ　Ｂａｒ　Ｇｌ■ 人１ｍ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　’ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｉａｕ　Ｌｙｓ 　Ｌｙａ　Ａｓｐ　＾ｆｉｎ　ＧＩＹ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｔ■■ Ｔｈｒ　Ｐｈａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　ＴＦＵ−Ａｌａ　Ｇｌｕ　ｘｘａ　 Ｔ２ＣＡｒｑ　’ｒｙｒ　Ａｌａ　Ａｓｐ　ＡＬａ　−ｕＬｙｓｓ　Ｌｙｅ　Ａ ｍｐ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　’ｌ’ｙｒ　’ｒｈｒ　Ｖａｌ　入ｓｐ　Ｖａ ｌ　入１ａ　Ａｍｐ　ＬＹ＊　Ｇｌｙ@Ｔｙｒ ｌコ０　１コ５　１４０ ＾１ａ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｔ７１”　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｉａｕ　Ｌａｕ　Ａｌａ 　Ｌｙｅ　Ｇｌｕ　ｋｉｌｎ　Ｇｌｙ　Ｌｙｌｌ　’ｒｙｒ@Ｔｈｒ １９５　２０Ｇ　２０５ Ｖａｌ　ＬＩＰ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｉ、ｙｓ　ｃｌｙ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ 　Ｌ＠ｕ　Ａａｎ　Ｉｌａ　Ｌｙｓ　Ｐｈａ　Ａｌａ　Ｇｌ■ 人ｓｎ　Ｌ＠ｕ　Ａｌａ　！ｙｒ入１ａ　Ａｓ５ｐ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　 Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　入１ａ　Ｇｌｕ　Ｐｈａ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ２４５　２Ｓ０　２ ５５ Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｊｋｍｎ　Ｇｌｙ　Ｌｙｍ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｌｅ 　Ａｍｐ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ａｓ５ｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔ凾■ ２フ５　２！１０　２！１５ Ｇｌｕ　Ｈ＠し く２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４の情報：（ｉｌ配列の特徴： （Ａ）長さ：　１３０１１個の塩基対 （８１タイプ；核酸 （Ｃ）ストランデッドネス二二本鎖 （Ｄ）トポロジー二不明 （ｉｉ）分子のタイプ＝ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし くｖｉ）起源： （Ａ）生物：エシェリキア・コリ　Ｌ　３９２／ｐＨＤＬＧ、　ＤＳＭ（ｘｉ） 配列の内容：　ＳＥＱ　１［Ｉ　ＮＯ：４：ＧｅＧＴＡＴＧＣＡＧ　ＡＴＡＣＴ ＴＴＧＡＡ　ＧＡＡＡＧＡＣＡＡＴ　ＧＧＡＧＡＡＴＡＴＡ　ＣＴＧＴＡＧＡＴ Ｇ’ｉ”　２００’ｆ’ＧｃＡＧＡＴＡＡＡ　ＧＧＴτＡ？ＡＣＴＴ　ＴＷＴＡ ＴＴｊＱ　Ａ’ｌ？Ｊ”ＧＣＴＧＧ＆　ＪｍＧ入Ａ＾入入入’　２５０７Ｇ’ｌ ”Ａ＾τ入入　１ユ０８ ００　０ｏ　ｏｏ　Ｏｏ　ｏｏ　０ｏ　ｏＯ？ＣＯ００ψへ　へ寸　ωψ 寸Ｈマー　いＨψヘ　リへ　さヘ　トヘＦＩＧ３　２゜、イ、ＬｃＤｊｔ’４： １Ｍ□工。３Ｆ＋［３，３（１） ＦＩＧ、４　プロティンＬＧの産生な示す概略全体図ＦＩＧ、４（１） ＦＩＧ、５ａ　プロティン■、への産生を示す概略全体図ＦＩＧ、５ｂ　プロテ ィンＬＭの産生を示す概略全体図ＦＩＧ、　５　ｃ　プロティンＬｌｌの産生を 示す概略全体図プローブ： プロティンＧ −ω■ ０鑓ロ　ＦＩＧ　８ 鳶Ｓ・−１・１１ 平成６年１０月２８日 塾

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．下記のアミノ酸配列： 【配列があります】 および同じ結合特性を有するＢ１−Ｂ５領域の変異体、サブフラグメント、マル チプルもしくは混合物を含有することを特徴とし、免疫グロブリンの軽鎖に結合 する性能を有するプロテインＬ。
2. ２．請求の範囲１記載のプロテインをコードしかつ下記ヌクレオチド配列： 【配列があります】 を有することを特徴とするＤＮＡ配列。
3. ３．すべてのクラスの免疫グロブリンの軽鎖に結合する請求の範囲１記載のＢ１ −Ｂ５領域を一つ以上、および免疫グロブリンＧの重鎖に結合する領域を有する ことを特徴とするハイブリッドプロテイン。
4. ４．免疫グロブリンＧの重鎖に結合する領域が、プロテインＧのＣ１領域および Ｃ２領域から、または免疫グロブリンＧの重鎖に結合する他の機能上類似のプロ テインおよび同じ結合特性を有するその変異体、サブフラグメント、マルチプル もしくは混合物から選択されることを特徴とする請求の範囲３記載のハイブリッ ドプロテイン。
5. ５．下記アミノ酸配列： 【配列があります】 および同じ結合特性を有するＢ１−Ｂ５領域の変異体、サブフラグメント、マル チプルもしくは混合物を有することを特徴とする請求の範囲４記載のハイブリッ ドプロテイン。
6. ６．請求の範囲５に記載のプロテインをコードし、かつ下記のヌクレオチド配列 ： 【配列があります】 を有することを特徴とするＤＮＡ配列。
7. ７．請求の範囲３または４に記載のプロテインをコードすることを特徴とするＤ ＮＡ配列。
8. ８．通常の条件下で請求の範囲２，６または７に記載のＤＮＡ配列とハイブリッ ドを形成し、かつ請求の範囲１および３〜５のいずれか一つに記載のプロテイン と同じ結合特性を有するプロテインをコードすることを特徴とするＤＮＡ配列。
9. ９．請求の範囲２および６〜８のいずれか一つに記載のＤＮＡ配列を有すること を特徴とするプラスミドベクターであって、好ましくはベクターｐＨＤＬＧまた はｐＨＤＬであるプラスミドベクター。
10. １０．請求の範囲９に記載のハイブリッドプラスミドで形質転換されていること を特徴とする、特に、イー・コリの種、特にイー・コリＬＥ３９２、またはバシ ラス・サチリス、サッカロミセス・セレビシエに属する宿主の宿主細胞であって 、それぞれ好ましくは識別記号がＤＳＳＭイー・コリＬＥ３９２ｐＨＤＬおよび ＤＳＳＭイー・コリＬＥ３９２／ｐＨＤＬＧである宿主細胞。
11. １１．請求の範囲１０記載の宿主細胞を適切な条件下で培養し、培養物中にプロ テインを蓄積させるか、または該細胞を溶解させてその細胞からプロテインを抽 出することを特徴とする請求の範囲１および３〜５に記載のプロテインを製造す る方法。
12. １２．請求の範囲１および３〜５のいずれか一つに記載のプロテインが入ってい ることを特徴とする、免疫グロブリンを捕捉し、分離し、次いで同定するのに用 いる試薬用具。
13. １３．請求の範囲１および３〜５のいずれか一つに記載のプロテインおよび任意 に添加剤もしくは担体を含有していることを特徴とする組成物。
14. １４．請求の範囲１および３〜５のいずれか一つに記載のプロテインおよび任意 に医薬として容認可能な担体または増量剤を含有していることを特徴とする医薬 組成物。