JPH07507929A - ３−ヒドロキシフェニル酢酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３−ヒドロキシフェニル酢酸の製造法 本発明は、３−ヒドロキシフェニル酢酸の新規製造法に関する。

微生物の１群が、フェニル酢酸をヒドロキシル化する状態にあることは公知であ る。

この場合、穫々の別のヒドロキシル化生成物とともに、３−ヒドロキシフェニル 酢酸も発生するが、しかし、該３一ヒドロキシフエニル酢酸！士、中間生成物と して、微生物の代謝の場合に更に分解される。

（Ｊ−１，ｋｎｄｅｔｓｏｎ他、Ｊ、Ｂａｃｌｅｒｉｏｌ、第１４１巻、第５３ ４〜５４３頁（１９８０年））。

コラモト　ケイスケ（Ｋｅｉｓｕｋｅ　Ｋｏｈｍｏｔｏ）他（Ｐｈ７１゜ｐｍｌ ｈｏｌｏＨ１第６０巻、第１０２５〜１０２６頁（１９７０年））によって、菌 類のリツオクトニア・ソラニ（Ｐｉｌｗ　Ｒｈ１ｔｏｃｌｏｎｉａ　ｓｏｌ暑ｎ ｉ）は、メタ位でフェニル酢酸をヒドロキシル化できることが記載された。３− ヒドロキシフェニル酢酸の製造のために、まず、菌類が培養され、引続き、バイ オマスが重層され、フェニル酢酸の溶液と一緒に恒温保持される（″置換培養（ Ｒｅｐｌａｃｅ＋ｎｅｎｌ−Ｋｕｌ＋ｕ＋）　’　）　ｍ　この場合、最大濃度 として、３−ヒドロキシフェニル酢酸２．５ｇ／Ｉが保持された。

前記の製造は、僅かな生成物濃度および高価な“置換培養”により、工業的方法 には不適当である。

従って、課題は、フェニル化合物から３−ヒドロキシフェニル酢酸の簡単に実施 され、かつ良好な収量を生じる酵素的製造法を提供することである。

本発明によれば、３−ヒドロキシフェニル酢酸の製造のための冒頭に記載された 方法は、リツオクトニア種、ツノタンシキン種（Ｃｅｒｓｌｏｂ＊ｓｉｄｉｕｍ ＞またはべりクラリア種（ｐｅｌｌｉｃｕｒａ＋ｉａ）の菌類を、一般式Ｉ・〔 式中、置換基は、 Ｘは、Ｃ０ＯＲ，ｃＨｔ○Ｈ、ＣＨｔ　Ｎ　Ｈ＊、Ｒは、メチル基、エチル基、 水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、アンモニウムの意味を有する〕で示 されるフェニル化合物が添加されている常用の栄養培地（Ｎ口ｈ＋ｍｅｄｉｕ＋ ａ）の存在下に培養する場合に、特に有利に進行することが見出された。

リツォクトニア種、ツノタンシキン種およびペリクラリア種の菌類は、公知であ る（Ｄ、Ｌ、Ｈａｖｋｓｖｏｒｌｈ、　Ｂ。

Ｃ，Ｓｕ目ｏｎ　ａｎｄ　Ｇ、Ｃ，＾１ｎｓｖｏ目ｈ・Ａ１ｎ５ｖｏＮｈ　＆　 Ｂ１５ｂ７’５Ｄｉｃｌｉｏｎｉ＋７　ｏｆ　ｌｈｅ　Ｆｕｎｇｉ、第７版、１ ９８３年および本願明細書中に引用された文献）。

本発明による方法のために特に適当な種類は、リツォクトニア・ソラニ種である 。

該菌類の培養に適した栄養培地は、炭素源、窒素源、無機塩および場合によって は微量元素の僅少量およびビタミンを含有するものである。窒素源としては、無 機もしくは有機窒素化合物または前記化合物を含有する材料を使用することがで きる０例えば、アンモニウム塩、硝酸塩、トウモロコシ膨化水（Ｍｓｉｓｑｕｅ ｌｌｖｓｘｓｅｒ）、ビール酵母自己分解物、大豆粉、小麦グルテン、酵母エキ ス、酵母、尿素およびジャガイモ蛋白質である。炭素源としては、例えば糖、例 えばグルコース、ポリオール、例えばグリセリンまたは脂肪、例えば大豆油を使 用することができる。

無機塩の例は、カルシウム、マグネシウム、マンガン、カリウム、亜鉛、銅、鉄 および他の金属の塩である。該塩の陰イオンとしては、特に燐酸塩イオンが記載 される。場合１によっては、該栄養培地に、成長因子、例えばビオチン、リボフ ラビンまたは他のビタミンが添加される。

この方法の良好な結果は、栄養培地の種類に左右されるとは認められない。

該栄養培地には、本発明による方法のためにフェニル化合物が添加される。フェ ニル化合物としては、前記方法の場合、フェニル酢酸化合物、例えば遊離フェニ ル酢酸、その塩、殊に相応するアルカリ塩、この場合、ナトリウム塩およびカリ ウム塩は特に有利であり、またはフェニル酢酸のエステル、有利に、メチルエス テルまたはエチルエステルを使用することができる。

エダクトとしてのエステルの使用の場合、本発明による方法によっては、メタ位 でのヒドロキシル化ばかりでなく、エステルの分解も生じ、その結果、生成物と して、３−ヒドロキシフェニル酢酸が生じる。

他ｔＤ　適当ｆｚフェニル化合物は、２−フェニルエタノール、２−フェニルエ チルアミンおよび酢酸−２〜フエニルエチルエステルである。

前記物質の場合、本発明による方法によって、付加的に、メタ位でのヒドロキシ ル化のためにカルボキシル基も形成され、その結果、生成物として、３−ヒドロ キシフェニル酢酸が生じる。

特に有利なフェニル化合物は、フェニル酢酸のナトリウム塩およびアンモニウム 塩である。

該フェニル化合物は、通常、栄養培地１】当たり、約１〜５ｇ、有利に５〜３０ ｇの濃度が調節されるような程度の量が添加される。

該フェニル化合物は、栄養培地に、菌類の培養の開始時または培養の間に、数回 に分けてかまたは連続的に添加することができる。

更に、培養された菌類を、代謝の完結後に保持し、かつ該菌類を、フェニル化合 物を有する新鮮な栄養培地中で更に培養することは可能である。

バイオマスの再利用の前記の形態は、本発明による方法の特に有利な実施態様で あり、それというのも、この場合、例えばバイオマスのための培養時間が節約さ れるからである。

該菌類の培養は、他の特別な条件を必要としない。

従って、培養温度は、通常、２０〜４０℃であり、有利に、温度は、２５〜３５ ℃の間に選択される。

発酵培地のｐＨ値は、３〜９に保持される。有利に、ｐＨ値は、４〜７の間であ る。

発酵時間は、発酵培地中での生成物の最大の増殖を達成するためには、通例、１ 〜１ｏ日間である。

反応変換は、試料を取出し、かつ例えばガスクロマトグラフィー分析によって容 易に確認することができる。

本発明は、以下の実施例によって詳細に説明される３−ヒドロキシフェニル酢酸 へのフェニル酢酸の変換についての種々の菌株の試験 培地　１ グルコース　１０　ｇ／ｌ トウモロコシ膨化水　４０　ｇ　／　ＩＫＨ！Ｐ０．　１．５ｇ／Ｉ ＫＩＨＰ０．　３．６ｇ／Ｉ ＰＨ６，８ このフェニル酢酸を、僅かに稀釈されたＮａＯＨを添加しながら水に溶解し、か つ滅菌濾過した。

フェニル酢酸１ｇ／ｌを有する培地１それぞれ３０ｍ１を、じゃま板（Ｓｃｈｉ ｋｉｎｅ）を有する滅菌された２５０ｍ１のエルシンマイヤーフラスコ中に充填 した。

このフラスコに、それぞれの菌株が繁殖した寒天板から掘り出されたそれぞれ０ −５Ｘ０．５ｃｍの大きさの寒天片を接種した。このフラスコを、２５℃および １８０ｒ、ｐ、ｍでｔｊｊｔ盪した。３もしくは７日後に、培養基上清１ｍｌを 取出し、５Ｎの塩酸１００μｌおよび酢酸エチルエステル８００μｍを添加し、 かつ１５秒間強力に混合した。酢酸エチルエステル相７００μｍを取出し、５０ ℃で僅かな窒素流下に蒸発濃縮させた。残分を、酢酸エチルエステル７０ｐ　１ 中に溶解し、かつ該酢酸エチルエステルの５０μｍを、ガスクロマトグラフィー 処理用の試料小壜中に移した。これに、Ｎ−メチル−Ｎ−）リメチルシリルトリ フルオルアセトアミド（ＭＳＴＦＡ）　５０μｌを添加し、かつ混合した。該試 料を、ガスクロマトグラフィーにより試験した。比較物として、本物の試料３− ヒドロキシフェニル酢酸を使用した。

この結果は、表中にまとめられている。

表°３−ヒドロキシフェニル酢酸へのフェニル酢酸の変換 菌株　％での変換率 ３日後　７日後 ラフオクトニア・ンラ：　Ｌｕ　６４６７　５０．５　１１．９　”（Ｒｈｉｘ ｏｅｌｏｉｉａ　５ｏｌａｎｉ）ラフオクトニア・ソラニＬｕ６４６４０．００ ．８ヲツオクトニア・ソラニＬｕ６４７４１２．５６．４゜ヲフォクトニトソラ ニ　Ｌｕ　６４７３　２２．３　５５．７ヲツオクトニア・ソラニ　Ｌｕ　６４ ７５　１４．７　８０．２ツフォクト＝トツラ：Ｌｕ６４７６４８．１２８．０ ”リフォクトニγ・ソラニＤＳＭ８４３（＝ＡＴＣＣＩ３２４９）５１．６６３ ．１ヲツォクト；γ・ソラニＡＴＣＣ１０１５９３，０３５，０ツ７ｔクト；１ −ソ５ニーＡＴＣＣ１６１１６２，０９４，０１７ｔ？ｌ二７−ソｙ二　ＡＴＣ Ｃ４８８０４（＝ＣＭ１３４８８６）　５７．０　７９．０ツフオクトニア・ソ ラニ　ＡＴＣＣ６２１５３３２，０８６，０ツツオクトニア・ソラニＡＴＣＣ６ ２１５４０，０２５，０ツ７ｔ９トニＴ−ソ５二ＡＴＣＣ６２１５６８０，０９ ７，，０リツォクトニｙ−ｔレアラスＬｕ６４フ１１．１１３３．５（Ｒｈ、＋ ｎｕｎｕｘｔｉｉ） ペラクラ９Ｔ・フィラメント→　ＡＴＣＣ１３２８９２，０６１，０（Ｐｅｌｌ ｉｃｕｌａ＋ｉａＩｉｌａｍｅｎｔｏｓａ）ペツクラヲトフィラメントーナＡＴ ＣＣ１３２９０２，０６０，０ツノタンノキン・コルニゲル五１３．７１３．３ （Ｃｅｒｓｌｏｂａｓｉｄｉｕｍｃｏｒｎｉｇｅｒｕｍ）ＣＢ５１３７．８２（ ＝ＡＴＣＣ１３２４７）９　生成物の分解 ＬＵで記載された菌株は、ＢＡＳＦ　ＡＧの菌株系に由来する。

例　２ 振盪フラスコ中での３−ヒドロキシフェニル酢酸の製造 ソツォクトニア・ソラニ（ＤＳＭ　８５２）の小さな菌子体片を、じゃま板を有 する２　５０　ｍ　ｌのエルシンマイヤーフラスコ中に次の培地３０ｍ１に接種 した：培地　Ａニゲルコース　２０　ｇ／ｌ 酵母エキス（ＤＩＦＣＯ）　５　ｇ　／　１（ＮＨ４）　ｓ　Ｓ　Ｏａ　５　ｇ 　／　ｌＭｇ５Ｏ４Ｘ７ＨｔＯＯ，５ｇ／ｌ Ｍｎ５ｏ４ｘ４）ｒｆｆｏ　ｏ、０５ｇ／ｌ微量元素溶液　２　ｍ　ｌ　／　Ｉ Ｃａ＋ｂｏｐｏｌ　９４６（登録商標）３　ｇ／ｌ（高分子量のカルボキシ ビニルポリマー） ＫＨ２ＰＯ４１，５ｇ／］ Ｋ、ＨＰＯ４３，６ｇ／ｌ 微量元素溶液： 硫酸鉄（ＩＩ）　−１−水和物　２００ｍｇ／ｌ硫酸亜鉛（ＩＩ）　−４−水和 物　１０ｍｇ／ｌ塩化マンガンー４＝水和物　３　ｍ　ｇ　／　１硼酸　３０ｍ ｇ／ｌ 塩化コバルト（ＩＩ）−６−水和物　２０ｍｇ／ｌ塩化鋼（ＩＩ）−２−水和物 　１ｍｇ／ｌ塩化ニッケル（ＩＩ）　−６−水和物　２ｍｇ／ｌモリブデン酸ナ トリウム−２−水和物　３ｍｇ／ｌエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴ＾）　 ５００ｍｇ／ｌ前記の前培養基（ＶｏｒｋｕＮｕ＋）　５　ｍ　ｌで、主要培養 基に接種した。主要培養基として、Ｃ５ｒｂｏｐｏｌ不含の培地Ａ３０ｍ１を使 用した。付加的に、フェニル酢酸１０ｇ／ｌを添加した。

２５℃で１８Ｏｒ、ｐ、ｍで４日間の振盪後に、フェニル酢酸は完全には変換し ていた。

引続き、バイオマスを、４０００ｒ、ｐ、ｍで５分間の遠心分離によって収穫し 、フェニル酢酸２０ｇ／ｌを有する新鮮な培地Ａに接種した。フェニル酢酸の完 全な変換後（７日後）に前記過程を繰り返し、かつバイオマスをフェニル酢酸３ ０　ｇ　／　］を有する新鮮な培地Ａに移した。１０日後に、フェニル酢酸は完 全に変換していた。こうして、該バイオマスを、４回、認識可能な活性損失なし に再使用した。

変換の完結後直ちに、該培養基は、３−ヒドロキシフェニル酢酸とともに、更に 約０．５％の２−ヒドロキシフェニル酢酸および４％までの４−ヒドロキシフェ ニル酢酸を含有していた。４−ヒドロキシフェニル酢酸の含量は該培養基を、フ ェニル酢酸の消失後に、更に一日継続させることによって、０〜１％に減少させ ることができた。２−ヒドロキシフェニル酢酸および３−ヒドロキシフェニル酢 酸の濃度は、このことによって影響を及ぼされなかった。

例　３ 繰り返された１０】の発酵液による３−ヒドロキシフェニル酢酸の製造 培地　Ｂ、グルコース　２０　ｇ　／　１酵母エキス　７．５ｇ／］ （Ｆｏｕｌｄ　Ｓｐ＋ｉｎｇｅ＋、６５％）（ＮＨ４）　！　Ｓ　Ｏｓ　５　ｇ 　／　］Ｍｇ５Ｏ４Ｘ７Ｈ！０　０．５　ｇ／ｌＭｎ５Ｏ４ＸＨ２００，０５ｇ ／ｌ 微量元素溶液　２　ｍ　Ｉ　／　］ Ｃａ＋ｂｏｐｏｌ　９４６（Ｗ録商標）Ｉｇ／ｌ（高分子量のカルボキシ ＫｚＨＰＯａ　３．６　ｇ／］ 前培養基 じゃま板を存する丸底フラスコ中の培地Ｂ３Ｘ３３０ｍｌに、ウルトラッラック ス（旧１　ｔ　＊　ｌ　ｕ　ｔ　ｒ　ｌ　Ｘ　）　テ細分されたＤＳＭ　８５２ が繁殖した寒天板それぞれ１／３を接種し、３日間２５℃で１８　Ｏｒ、ｐ、ｍ でｔｉｉ盪した。

１０１の発酵液 前培養基を用いて、１０１の発酵槽を、培地Ｂおよヒ付加的にフェニル酢酸１０ ｇ／ｌで接種した。コノ発酵槽を１０Ｏｒ、　ｐ、ｍで撹拌し、かつ毎分反応器 の容量光たり空気容量０．５（ｖｖｍ）でガス処理した。この発酵の間、回転数 を２０Ｏｒ、ｐ、ｍにガス処理をＩＶＶｍに上昇させた。

８８時間後に、全部のフェニル酢酸が変換していた。

発酵槽の内容物の９１を放出し、かつ新鮮な培地Ｂによって代替した。該フェニ ル酢酸濃度を、（水中、Ｎ８０ＨでｐＨ７に調節された）２５重量％のフェニル 酢酸溶液の添加によって１０　ｇ　／　１に調節した。

この発酵の間、２回、フェニル酢酸それぞれ５０ｇを供給した。必要な場合には 、グルコースを供与した。

１６５時間後に、全部のフェニル酢酸が変換していた。

３−ヒドロキシフェニル酢酸の最終濃度は、２６ｇ／ｌであった。

上記のように、該発酵槽を、残量が１１になるまで放出し、かつ新鮮な培地Ｂで 充填した。１６５時間の発酵の間に、フェニル酢酸４Ｘ５０ｇを供給した。３− ヒドロキシフェニル酢酸の最終濃度は、３０．６ｇ／ｌであった。

該発酵槽を、再度、１１までポンプで汲み出した。

第３の発酵の発酵汁３−ヒドロキシフェニル酢酸の単離： ９１の発酵汁を、遠心分離しく５０００ｒ、Ｐ、ｍ。

２０分間）、沈殿物を水１１で洗浄し、もう一度遠心分離した。双方の遠心分離 物（約７１）の上清を、Ｈ友Ｓ　Ｏ４でｐＨ２に調節し、かつ２回、同じ容量の 第三ブチルメチルエーテルで抽出した。この有機相を蒸発させて乾燥物にし、か つ９４％までが３−ヒドロキシフェニル酢酸からなる２５０ｇの残分を生じた。

国際調査報告 フロントページの続き （７２）発明者　ハウアー、ベルンハルトドイツ連邦共和国　Ｄ　−６７０１フ スゲーンハイム　メーロヴインガーシュトラーセ（７２）発明者　ラートナー、 ヴオルフガングドイツ連邦共和国　Ｄ　−６７０１フスゲーンハイム　イン　デ ン　ベレン　５ （７２）発明者　ミュラー、ウルズーラドイツ連邦共和国　Ｄ−６７０１フスゲ ーンハイム　メーロヴインガーシュトラーセ（７２）発明者　プレスラー、ウー ヴエドイツ連邦共和国　Ｄ−６７０１アルトリップ　グローセ　ホルストシュト ラーセ１５（７２）発明者　マイヤー、ヨアヒム ドイツ連邦共和国　Ｄ　−６７０１マックスドルフ　カルミットシュトラーセ　 ４

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １．３−ヒドロキシフェニル酢酸を製造するための方法において、リツォクトニ ア種、ツノタンシキン種およびベリクラリア種の群から選択された菌類を、一般 式Ｉ： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）〔式中、置換基は、 Ｘは、ＣＯＯＲ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＮＨ２、▲数式、化学式、表等があります ▼の意味を有し、Ｒは、メチル基、エチル基、水素原子、ナトリウム原子、カリ ウム原子、アンモニウムの意味を有する〕で示されるフェニル化合物が添加され ている常用の栄養培地の存在下に培養することを特徴とする、３−ヒドロキシフ ェニル酢酸の製造法。