JPH07508166A - 改変クルイベロミセス（Ｋ１ｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）酵母，それらの作製および使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 改変クルイベロミセス（Ｋｌ　ｕｙｖｅ　ｒｏｍｙｃｅｓ）酵母、それらの作製 および使用 本発明は、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する新規な 遺伝的に改変された酵母、およびそれらの使用による有利な組み換えタンパク質 の生産に関する。

分子生物学の分野において達成された進歩は、微生物を改変することを可能にし 、その微生物に、興味あるタンパク質、例えば異種のタンパク質（哺乳動物のタ ンパク質、人工的タンパク質、キメラタンパク質、およびそれに類するもの）を 生産させることを可能にした。特に、様々ｍｙｃｃｓ　５ｅｒｅ、ｖｉｓｉａｅ ）において遂行されてきた。ごく最近ては、遺１云的道具が、組み換えタンパク 質の生産の宿主細胞として酵母クルイベロミセスの使用に関して開発されてきた 。Ｋ、ドロソフィラルム（Ｋ、ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）由来のプラスミド ｐＫＤ１の発見（欧州特許第２４１　４３５号）は、組み換えタンパク質の分泌 に関する特に有利な宿主ベクター系を開発することを可能にした（欧州特許第３ ６１　９９１号、欧州特許第４１３　６２２号）。

しかしながら、この系の生産への応用は、特に、これらの組み換え微生物におけ る遺伝子発現の効率の問題により、プラスミドの安定性の問題により、また生産 物が生成される細胞におけるその組み換え生産物の分解という問題によって、ま だ制約を受ける。タンパク質分解現象は、事実、組み換え酵母の分泌経路におけ る目的のタンパク質の通過の間に、あるいは分泌されたプロテアーゼまたは発酵 の間に起きる望ましくない細胞溶解の結果培地中にもたらされたプロテアーゼに よって、出現する。

今や、本発明者は、該組み換えタンパク質の生産レベルの改良、すなわち、それ らの完全形において、クルイベロミセス酵母において、細胞プロテアーゼ、特に 分泌経路を通して通過するプロテアーゼをコードしている少なくとも１個の遺伝 子を改変することによって、該組み換えタンパク質の生産レベルの改良を可能に する、ことを示した。驚くべきことに、さらに、本発明者は、そのような改変が 、組み換えタンパク質のレベルを増大させることができるので特に有利であり、 そしてこのことが、該改変が、工業的発酵条件下での改変細胞の増殖速度と生存 率に明らかな影響を与えることはないので、一層有利である、ことを示した。

なお驚くべきことに、本発明者は、また、形質転換酵母を使用して特に有利な方 法で組み換えタンパク質を生産することを可能にする該改変が、該酵母の安定性 には影響しない、ことを示した。

それ故、本発明の主題は、プロテアーゼをコードしている少なくとも１個の遺伝 子の一つまたは複数の遺伝的改変をもち、該酵母のタンパク質分解活性を改変す る、タルイベロミセス属の酵母である。好ましくは、一つ以上の遺伝的改変は、 該遺伝子に、部分的にもまた全体的にも天然のプロテアーゼをコードできなくさ せる。本発明のその他の好適な実施態様では、このように遺伝的に改変された遺 伝子（一つまたは複数個）は、非機能的プロテアーゼ、または改変されたタンパ ク質分解活性スベは、該プロテアーゼをコートしている遺伝子（一つまたは複数 個）は、調節的プロモーターの制御下に置かれる。

本発明によるタルイベロミセス属の酵母は、ｖａｎ　ｄｃｒ　Ｗａｌｔ　［ｉｎ ：　ＴｈｅＹｅａｓｔｓ　（１９８７）　ＮＪ、Ｗ、　Ｋｒｅｇｅｒｖａｎ　Ｒ ｉｊ　（ｅｄ）：　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ：　ｐ、２２４コによって定義されたよう な酵母、および好ましくは、酵母に、マルキシアヌス変種ラクチス（Ｋ、ｍａｒ ｘｉａｎｕｓ　ｖａｒ、　Ｉａｃｔｉｓ）（Ｋ　ラクチス）、Ｉり　マルキ／ア ヌス変種マルキノアヌス（Ｋ、ｍａｒｘｉａｎｕｓ　ｖａｒ、ｍａｒｘｉａｎｕ ｓ）（Ｋ　フラジリス（Ｋ。

ロソフィラルム）、１り　ワルチイＣＫ、　ｗａ　Ｉ　Ｌ　ｉ　ｉ）およびそれ に類するもの、を包くむ。

遺伝的改変は、より特別には、関与する遺伝子における１個以上の塩基の抑制、 置換、欠失もしくは付加のいかなるものをも意味すると理解さるべきである。そ のような改変は、試験管内（単離されたＤＮＡ上で）、もしくはそのままの位置 （去旦ｓ　ｉ　ｔ　ｕ）で、例えば、遺伝子工学技術の方法によって、または突 然変異誘発剤による処理に該酵母を曝すことによって得られる。突然変異誘発剤 として、例えば、エネルギー照射（Ｘ、γ、紫外線およびそれに類するもの）の ような物理的因子、またはＤ　Ｎ　Ａ塩基の種々の官能基と反応し得る化学薬剤 、および例えば、アルキル化剤［メタンスルポン酸エチル（ＥＭＳ）　、Ｎ−メ チル−Ｎ’　−ニトロ−Ｎ−ニトロソクアニンン、Ｎ−二１−ロキノリン１−７ ｉキット（ＮＱＯ）ｌ　、ヒアルキル化剤、挿入剤およびそれに類するものが挙 げられる。欠失は、関与する遺伝子のあらゆる抑制をも、會味すると理解される 。

それは、特に、該プロテアーゼをコードしている領域、および／または転写プロ モーター領域の全てもしくは一部の、−足部分に関係している。

また、遺伝的改変は、例えばＲｏｔｈｓｔｃｊｎ　［ＭｃＬｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ 、　１０１　（１９８３）２０２］により最初に記された方法による遺伝子破壊 によっても得ることかできる。この場合には、相同組み換えによって、非機能的 もしくは突然変異体配列による野生型ゲノム配列の置換をさせるために、完全な コード配列が好適に破壊されるであろう。　該遺伝的改変は、例えば該遺伝子の 転写の発現および／または調節に関与する領域において、該プロテアーゼをコー ドしている遺伝子中、または該プロテアーゼをコードしている領域外に、置かれ てもよい。該遺伝子が天然のプロテアーゼをコードできないということは、構造 的もしくは立体配座的改変のために不活性であるタンパク質の生産、または生産 の欠如、または改変された酵素活性をもつプロテアーゼの生産、あるいはまた弱 められたレベルもしくは望ましい調節機作による天然のプロテアーゼの生産、の いずれかによって示すことができる。

さらに、点突然突然変異のようなある種の改変は、例えば、細胞分裂に先立つＤ ＮＡの複製の間に、細胞機構によって、本来、修正もしくは減退させることがて きる。したがって、そのような遺伝的改変は、それからもたらされる表現型の性 質が完全には安定ではないので、工業レベルにおいては有益性が制限される。今 、発明者は、プロテアーゼをコードしている少なくとも１個の遺伝子について一 つまたは複数の遺伝的改変をもち、該改変が分離（ｓｅｇｒｅｇａｔ　１ｏｎ） に安定であり、および／または非可逆的である、クルイベロミセス属酵母の作製 を可能にする方法を開発した。そのような改変をもつ酵母は、組み換えタンパク 質生産のための細胞宿主として特に有用である。また、本発明は、その遺伝子を 、機能性プロテアーゼをほぼ全体的に、または部分的にしか生産し得ないように 改変された酵母を作製することを可能にする。

好ましくは、本発明による酵母は、分離に安定な一つ以上の遺伝的改変を有する 。さらに、好適な実施態様によれば、その遺伝的改変は、非可逆的である。さら に、好適な実施態様によれば、その遺伝的改変は、問題の遺伝子の活性を全（残 していない。

好ましくは、１つまたは複数のプロテアーゼをコードしている遺伝子は、クルイ ベロミセスの分泌経路を通して通過するプロテアーゼをコードしている遺伝子か ら選択される。そのようなプロテアーゼは、小胞体、ゴルジ装置の分画、ボスト ーゴルジ分画、および例えば、細胞液胞、エンドソームの小胞、もしくは細胞外 の培地に存在してもよい。

そのような遺伝子の例として、プロテアーゼＡ１プロテアーゼＢ１もしくはカル ボキシペプチダーゼ（例えば、カルボキシペプチダーゼＹもしくはカルボキシペ プチダーゼＳ）、あるいはまたに、ラクチスのエンドペプチダーゼＫＥＸＩもし くは同様の活性をもつプロテアーゼ、例えば、プロテアーゼＹＡ　Ｐ　３　［Ｅ ｇｅｌ−Ｍｉｔａｎｉ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｙｅａｓｔ　６　（１９９０）１２ ７］、またはある種の分泌タンパク質の成熟に関与するより一般的なすべての他 のプロテアーゼ、を含んでなる群から選ばれるプロテアーゼをコードしているク ルイベロミセス遺伝子を列挙できる。

本発明の好適な実施態様においては、目的の遺伝子は、プレタンパク質の形で発 現される組み換えタンパク質のシグナルペプチドの切断に関与しないプロテアー ゼをコードしている。特に有用な遺伝子の例としては、クルイベロミセスのプロ テアーゼＡ１プロテアーゼＢ１およびカルボキシペプチダーゼＹを挙げることが でき、それらのクローニングは、実施例において記述される。

本発明のその他の実施態様においては、該プロテアーゼが、シグナルペプチダー ゼ活性をもち、そして該遺伝的改変が、それらの過剰発現を許し、それが、場合 により、またはこの段階が分泌経路の制限段階である時には特に有利である。

また、本発明の主題は、すべてのクルイベロミセス酵母であって、その酵母中に は、該酵母中で発現および／または分泌することが望まれる興味あるタンパク質 をコードしている１つまたは複数の遺伝子を含んでなる外来のＤＮＡ配列が、導 入される。

本発明の目的のために、外来ＤＮＡ配列は、酵母中に人工的に導入され、興味あ る１種または複数のタンパク質をコードしているいかなるＤＮＡ配列をも意味す ると理解される。特に、これは、相補的ＤＮＡ　（ＣＤＮＡ）配列、人工的もし くはハイブリッド配列、あるいはまた合成もしくは半合成配列であってもよく、 それらは、目的の該タンパク質の該酵母中での合成を許す発現カセットに含まれ る。例えば、この外来ＤＮＡ配列は、必要ならば、目的の該タンパク質を導くた めに、転写の開始、調節またはクルイベロミセスにおけるその他のものの領域を 含んでもよい。

好ましくは、外来ＤＮＡ配列は、目的の酵母中で自律的複製ができるか、組み込 みタイプのベクター中に含有される。さらに特別には、自律的に複製するベクタ ーは、クルイベロミセスにおける自律的に複製する配列から作製でき、例えば、 これは、特に種々のに、マルキシアヌスの変種中で高い分離安定性を特徴とする 、プラスミドｐ　Ｋ　Ｄ　１　［Ｆａｌｃｏｎｅｅｔ　ａｔ、、Ｐｌａｓｍｉｄ ｓ　１５　（１９８６）　２４８；　Ｃｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌ、八ｃ ｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１４（＋９８６）　４４７１］　、あるいはに、ワルチイで 単離されたプラスミドｐＫＷ１　［Ｃｈｅｎ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　Ｇｅｎｅ ｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１３８　（１９９２）　３３７］であってもよ い。また、自律複製ベクターは、染色体塩基配列（ＡＲ８）からも作製すること ができる。組み込み型ベクターに関しては、これらは、目的の該タンパク質をコ ードしている遺伝子配列および遺伝的選択マーカーに隣接するように、相同組み 換えによって全体の組み込みの方向を定めるように、該宿主酵母に相同な染色体 塩基配列から作製される。特殊な実施態様においては、該相同塩基配列は、該プ ロテアーゼのコード領域から得られる遺伝子配列に対応し、それは、相同組み換 えによって該プロテアーゼの元の配列を選択マーカーと外来ＤＮＡ配列とにより 置換することを可能にするが、一方該プロチアーゼの遺伝子破壊を許す。その他 の実施態様においては、発現カセットは、該発現カセットの遺伝子増幅を可能に するリポソームＲＮＡ　（ｒＲＮＡ）をコードしている位置に組み込まれる［Ｂ ｅｒｇｋａｍｐ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｕｒｒ、　Ｇｅｎｅｔ、　２１　（１９９ ２）　３６５コ。

さらにその他の実施態様においては、該宿主酵母の染色体中に、非相同組み換え によって組み込まれる。

外来ＤＮＡ配列は、当業者により実施される技術、例えば、組み換えＤＮＡ技術 、遺伝的交雑、プロトプラスト融合およびそれに類するものによって、酵母中に 導入することができる。特殊な実施態様においては、外来ＤＮＡ配列は、形質転 換、エレクトロポレーション、接合、または文献記載の他のいかなる技術によっ ても、クルイベロミセス酵母中に導入される。クルイベロミセス酵母の形質転換 に関しては、Ｉｔｏ　ｅｔ　ａｌ、　［Ｊ。

ングリコールおよびジメチルスルホキシドを用いるＤｕｒｒｅｎｓ　ｅｔ　ａｌ 、　［Ｃｕｔロポレーションによって酵母を形質転換することもできる。その他 の方法も、また、欧州特許第３６１９９１号に記載されている。

前記技術によってプロテアーゼ含量を改変された該クルイベロミセス酵母は、組 み換えタンパク質、例えば、医薬もしくは食物用の異種タンパク質を生産するた めの宿主細胞として有利に使用される。該宿主酵母は、それが生産および／また は分泌を期待される組み換えタンパク質の貫および量を増大し得るので、そして 該細胞の該遺伝的改変が、遺伝的および有糸分裂の安定性には影響しないで該組 み換えタンパク質を発現するので特に有利である。それ故、本発明のその他の主 題は、前記酵母が、外来ＤＮＡ配列によってコードされたタンパク質を発現する 条件下で培養され、目的のタンパク質が回収される、組み換えタンパク質の生産 方法にある。好適な実施態様においては、目的の該タンパク質は、培地中に分泌 される。例としては、天然に存在するタンパク質、もしくは人工的タンパク質、 例えばハイブリッドタンパク質を挙げることができる。この場合、改変されたプ ロテアーゼ内容物をもつ酵母細胞の使用は、キメラの種々のタンパク質ドメイン 間のヒンジ領域が露出されるので特に有利である。特殊な実施態様においては、 該人工的タンパク質は、キメラの端の一つに融合されたペプチドを含有し、例え ば、分泌経路の通過の間には、Ｎ−もしくはＣ末端エキソプロテアーゼ、例えば カルボキンペプチダーゼによるタンパク分解的分解に対して、特に敏感である。

目的のタンパク質のタンパク分解的分解は、また、いかなる細胞プロテアーゼに よっても、例えば、該組み換え酵母の発酵過程での望ましくない細胞溶解により 外の培地中に放出される細胞質プロテアーゼによっても起きる。それ故、そのよ うなプロテアーゼをコードしているヌクレオチド配列の遺伝的改変は、また、目 的の該タンパク質の特に有利な生産方法となり、そしてまた特許請求される。

好ましくは、本発明による方法は、医薬もしくは食物用のタンパク質の生産を可 能にする。例として、酵素類（例えば、特にスーパーオキシドジスムターゼ、カ タラーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、アミダーゼ、キモシンおよびそれに類するも の、またはそれらのすべての断片もしくは誘導体）、血液誘導物（例えば、血清 アルブミン、α−もしくはβ−グロブリン、凝血因子、例えばファクターＶ［Ｉ ｒ、ファクターＩＸ、フォンビルブランド因子、フィブロネクチン、α−１−ア ンチトリプシンおよびそれに類するもの、またはそれらのすべての断片もしくは 誘導体）、インシュリンおよびその突然変異体、リンホカイン［例えば、インタ ーロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子（Ｇ−Ｃ３Ｆ、ＧＭ−Ｃ５Ｆ 、Ｍ−Ｃ５Ｆおよびそれに類するもの）、ＴＮＦおよびそれに類するもの、また はそれらのすべての断片もしくは誘導体］、増殖因子（例えば、成長ホルモン、 エリスロポイエチン、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ。

ＴＧＦおよびそれに類するもの、またはそれらのすべての断片もしくは誘導体） 、アポリポタンパク質およびそれらの分子突然変異体、ワクチン（肝炎、サイト メカロウィルス、エプスタイン・バール、ヘルペスおよびそれに類するもの）生 産のための抗原ポリペプチド、あるいはまた、安定化部分と融合された生物学的 に活性部分を含有する特別な融合体のようなポリペプチド融合体を挙げることが できる。

本発明のその他の主題は、プロテアーゼをコードしているクルイベロミセスＤＮ Ａ断片にある。本発明者は、実際に、ある種のクルイベロミセス・プロテアーゼ および特に分泌経路を通して通過するプロテアーゼを、検出し、単離し、そして 同定した。さらに好ましくは、本発明の主題の一つは、特に、プロテアーゼΔ、 Ｂ１カルボキシペプチダーゼＹ１同じくズブチリシンタイプおよびその代表的一 つかに、ラクチスＫＥＸ１プロテアーゼ［ｆｇｓｏｌｏｗｓｋｉ−Ｌｏｕｖｅｌ 　ｅｔ　ａｔ、、　Ｙｅａｓｔ　４　（１９８ｇ）　７１］であるセリンプロテ アーゼの群から選ばれるクルイベロミセス・プロテアーゼに関する。例としては 、プロテアーゼＡ、ＢおよびカルボキシペプチダーゼＹをコードしているに、ラ クチス遺伝子のヌクレオチド配列が、発明者により決定され、配列番号：３，１ および２にそれぞれ示される。

また、Ｋ、ラクチスのプロテアーゼをコードしている染色体断片の制限酵素地図 は、図１０に示される。これらのプロテアーゼ遺伝子のすべての遺伝的突然変異 体、およびそれらを有利に使用して興味あるタンパク質を生産することは、また 、本発明の一部を構成することを理解すべきである。該改変は、天然の起源のも のでもよいが、また遺伝子工学的技術によって、または突然変異誘発剤で細胞を 処理した後、その場でもしくは試験管内で得ることもでき、特定の点もしくは多 重突然変異において、欠失、付加、挿入、ハイブリッドプロテアーゼおよびそれ に類するものを含む。さらになお特別な実施態様においては、また、遺伝的改変 は、例えば、発現レベルもしくは調節の機作を変えるために、該プロテアーゼの 発現を調節する領域にも関する。

また、本発明の主題は、前記のような外来ＤＮＡ断片の発現から得らまた、本発 明の主題は、遺伝的に改変されたクルイベロミセス酵母の作製方法およびその有 利な使用による興味あるタンパク質の生産である。

好ましくは、本発明の方法は、試験管内で改変されたものにより目的の染色体遺 伝子を置換することにある。

本発明は、次の実施例によってより完全に記述されるであろうが、これは、例示 であり、制約されないものとして考慮されるべきである。

図の説明 次の図で示されるプラスミドの表示は、ラフスケールで書かれ、実施されたクロ ーニングを理解するために重要な制限酵素部位のみが示される。

図１　プラスミドｐ　Ｆ　Ｐ　８のゲノム挿入断片の制限酵素地図。次の工ｍ　 ＲＮ　Ａと同様に表される。

図２．８．セレヒンエＰＲＢ１プローブとＩく　ラクチス・ゲノムＤＮＡとのハ イブリダイゼーシヨン。上図、臭化エチジウムにより染色され、ナイロンフィル ターに転移する前のアガロースゲル（１％）の写真、下図、放射性プローブとそ のフィルターのハイブリダイゼーション後に得７一旦王杏１＋ＥｃｏＲＩ：　８ ＝Σ見±■；　９＝旦Ａ↓Ｉ十旦旦０クローンの混合物）とのハイブリダイゼー ション。Ａ図、臭化エチジウムにより染色され、ナイロンフィルターに転移する 前のアガロ−スゲのに、ラクチスのゲノムＩ）　Ｎ　Ａ断片の一部分に対応する サブ分画“ｄ”。

”ｅ”および“ｒ“が示される。

図４・ポジティブクローン１８−３および３１−■の対照ハイブリダイゼーショ ン。Ａ図、クローン３１−１　（列番号１）１８−３　（列番号ゲルに対応する ナイロンフィルターのオートラジオグラフィー。Ｐは、未消化プラスミド（ｐＹ Ｇ１２２４）の位置に対応する；放射性プローブとハイブリダイズする約０．７ ｋｂのＢｇ±ＩＩ−ＥｃｏＲＩ制限酵素断片の位置が示される。

図５Ｉり　ラクチスのゲノムＤＮＡのＢｇｌ　Ｉ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ断片のタンパ ク質配列（ペプチド配列・配列番号　１のＡｒｇ”８〜ｐ　ｈｅ３３１残基）と 、Ｓ　セレビシェＰＲＢ１遺伝子の対応する部分（Ａｒｇ１０５〜Ｌ　ｅ　ｕ　 ”）との比較。星印は、二つの配列間に保存されるアミノ酸を示す。

図６　プラスミドｐＹＧ１２２４、ｐＹＧ１２２６およびｐＹＧ１２２７（Δ図 ）：ｐＹＧ１２３１　（Ｂ図）：ｐＹＧ１２３７、ｐＹＧ１２３８、ｐＹＧ１２ ３９、ｐＹＧ１２４０、ｐＹＧ１２４１およびｐＹＧ１２４２（Ｃ図）のゲノム 挿入断片の制限酵素地図。次のエンドヌクレ末端の大凡の位置を示す。翻訳開始 のためにあると推定されるコドンの位置および關訳停止コドンの位置は、星印で 示される。

オリゴデオキシヌクレオチド５Ｑ２１０１に対応する配列と同様に下線で示す。

図８．プラスミドｐＣ３４の挿入断片の制限酵素地図。囲み部分は、Ｋ　ラクチ ス・ゲノム挿入断片に対応し、線は、ベクターＫＥｐ６の配しオチド配列。

図１０ニブラスミドｐＡ２５／１の挿入断片の制限酵素地図。囲み部分は、Ｋ　 ラクチスのゲノム挿入断片に対応し、線は、ベクターＫＥｐ６の配列に対応する 。矢印は、特異的３′および５“プローブによるササンブロットハイブリダイゼ ーションによって示されるように、ＰＲＡ見±１．Ｐ＝旦王↓１．Ｇ＝且及±Ｉ Ｉ；　ｘｂ＝ｘ互見Ｉ：５ｎ＝ｓｎａＢＩ　；　Ｅ＝ＥｃｏＲＩ。

図１１：Ａ図・プラスミドｐＹＧ１２３２のｆＴｉｎｄｌｌｌ−Ｅｃ。

Ｒ１制限酵素断片の制限酵素地図。次のエンドヌクレアーゼの切断部位の位置が 示される：Ｇ＝旦呈↓ＩＩ；　Ｓ＝旦ａｌｌ；　Ｅ＝ＥｃｏＲＴ：　）（＝Ｉｒ ｉｎｄｌ［Ｉ；　Ｋ＝Ｋｐｎｌ：　Ｘ＝Ｘｈｏｌ；ＩＩ工旦ｄｌｌ！クローニン グ部位は、そのベクターから得られ、下線で示す。

Ｂ図、Ｓ、セレビシェからの選択マーカーＵＲＡ３によるに、ラクチス〜３：Ｂ ｇｌユＴ　Ｉ＋ＥｃｏＲに重制限酵素消化後の３種の形質転換体のゲノムＤＮＡ 　：列３の菌株は、Ｋ、ラクチスＹ７５０である；列４：Ｂｇ↓Ｉ　ｒ＋Ｅｃｏ Ｒに重制限酵素消化後の菌株ＣＢ５２９４．９１のゲノムＤＮＡ０使用された放 射性プローブは、プラスミドｐＹＧ１２２４の旦盈±Ｉ　Ｉ＋ＥｃｏＲＩ断片に 対応する（図６Ａ）。

図１２　プラスミドｐＣ３４［ベクターＫＥｐ６　；　ａ）図］、ｐＹＧ■５４ 　［ベクターｐ　ｌ　Ｃ−２０Ｒ：　ｂ）図コおよびｐＹＧ１５５　［ベクター ｐｌｃ−２０Ｒ：ｃ）図］の挿入断片の制限酵素地図。ｄ）図二破壊のために使 用された断片。括弧内の制限酵素部位は、本明細書に示されたようにフレノウ酵 素もしくはＴ４ＤＮＡポリメラーゼによって破壊された。囲み部分は、Ｋ、ラク チスゲノム挿入断片に対応し、線は、べ図１３ニブラスミドｐＹＧ１０５の制限 酵素地図およびプラスミドｐＹＧ　１２１２構築の手順。使用された略語・ｒ’ ＳＫ、　ラクチスしΔＣ４プロモーター二Ｔ、転写ターミネータ−、ＩＲ，プラ スミドｐＫＤ１の逆方向反１ｖ配列：ＬＰ、ｌｌ５Ａのプレプロ領域：Ａｐ’お よびＫｍ’は、それぞれアンピシリン（Ｅ、　コリ）およびＧ４１８（クルイベ ロミセス）に対する耐性遺伝子を表す。

図１４・プラスミドｐＹＧ１２１２により形質転換後、Ｋ、ラクチスＣＢ５２９ ３．９１菌株（列２．　４．　６．　８および１０）もしくはそのプロテアーゼ Ｂの遺伝子を破壊された突然変異株（菌株Ｙ７５０；列１゜３、　５．　７およ び９）において、ヒトアルブミンの端を切り取った改変体の分泌能の比較。形質 転換細胞は、エーレンマイヤーフラスコにおいて、Ｇ４１８　（２００ｍｇ／ｌ ）存在下で、２日間（列１．　２．　７および８）、４日間（列３．　４．９お よび１０）もしくは７日間（列５および６）培養される１列１〜６は、’ｌ’　 Ｐ　Ｄ培地における増殖に対応し、列７〜１０は、ＹＰＬ培地における増殖に対 応する。スポットは、培養土澄液５Ｑｍｌに相当する。

配列番号　３　：Ｋ　ラクチスＰＲＡＩ遺伝子を含む旦±ａｌ−Ｅｃ分子生物学 において使用される慣例の方法、例えば、プラスミドＤＮＡの調製的抽出、塩化 セシウム浸度勾配におけるプラスミドＤＮＡの遠心、アガロースもしくはアクリ ルアミドゲルにおける電気泳動、電気溶出によるＤＮＡ断片の精製、フェノール もしくはフェノール−クロロホルムによるタンパク質の抽出、エタノールもしく はイソブロノ（ノールによる生理食塩水中でのＤＮＡ沈殿、エシェリヒア・コリ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）における形質転換、およびそれに類する 方法は、当業者にとって周知であり、広（文献に記述されている［Ｍａｎｉａｔ ｉｓ　Ｔ。

ｅｔ　ａｌ、、＋Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　ａ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ　１ｌａｎｕａｌ”、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１撃■ ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎ、Ｙ、、　１９８２；＾ｕｓｕｂｅｌ　 Ｆ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　（ｅｄｓ、）、　“Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃ ｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ”、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅ ｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ１９８７　］。

制限酵素は、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　（Ｂｉｏｌａｂｓ）、 　Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｉｅｓ　（ＢＲＬ） もしくは＾ｍｅｒｓｈａｍによって供給され、供給先の指示に従って使用された 。

ｐＢＲ３２２およびｐＵＣタイプのプラスミド、およびＭ１３１００７７−ノは 、市販のものである（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｉｅｓ）。

ｐｌｃタイプのプラスミドは、Ｍａｒｓｈ　ｅｔ　ａｌ、　［、Ｇｅｎｅ　３２ 　（１９８４）　４８１コにより記載されている。

連結反応のためには、ＤＮＡ断片が、アガロースもしくはアクリルアミドゲルの 電気泳動によってそれらのサイズに従って分別され、フェノールもしくはフェノ ール／クロロホルム混合液を用いて抽出され、エタノールを用いて沈殿され、次 いで供給先の指示に従ってファージＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存 在でインキュベートされる。

突き出ている５′末端のフィリング（ｒ　ｉ　Ｉ　Ｉ　ｉｎｇ）は、供給先の指 示に従ってＥ、コリのＤＮＡポリメラーゼＩ　（Ｂｉｏｌａｂｓ）のフレノウフ ラグメントを用いて行われる。突き出ている３′の末端の破壊は、供給先の指示 に従って使用されるファージＴ４ＤＮΔポリメラーゼ（ＢｉｏｌａｂＳ）の存在 で行われる。突き出ている５°末端の破壊は、Ｓ１ヌクレアーゼを用いるコント ロール処理によって実施される。エキソヌクレアーゼＢａ１３１は、供給先の指 示に従って使用される（Ｂｉｏｌａｂｓ）。

オリゴデオキシヌクレオチドは、β−シアノエチル保護基を用いるホスホルアミ ド法により化学的に合成される［５ｉｎｈａ　ｃｌ　ａｔ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ 　ａｃｉｄｓ　Ｒｃｓ、　１２　（１９８４）　４５３９］　。合成の後、保護 基が、水酸化アンモニウムによる処理によって除去され、オリゴデオキシヌクレ オチドを、ブタノールで２回沈殿させて精製し、濃縮する［Ｓａｗａｄｏｇｏ　 ａｎｄ　Ｖａｎ　Ｄｙｋｅ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１９　 （１９９１）　６７４］　。ＤＮＡ！縮物は、２６０ｎｍでの光学濃度を測定し て定量される。

合成オリゴデオキシヌクレオチドを用いる試験管内での部位特異的突然変異誘発 は、Ｔａｙｌｏｒ　ｅｔ、　ａｌ、　［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、 　１３　（１９８５）　８７４９］により開発された方法に従って、へｍｅｒｓ ｈａｍ市販のキットを用いて実施される。

Ｋ　ラクチス　ゲノムＤＮＡにおいて分子プローブとして用いるためｏｌｙｍｅ ｒａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏ　ｎ　、　５ａｉ ｋｊ　Ｒ，に、　ｃｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３０　（１９８５）　１ ３５０；　Ｍｕｌｌｉｓ　Ｋ、Ｂ、　ａｎｄ　Ｆａｌｏｏｎａ　Ｆ、＾、、　Ｍ ｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍ、　１５５　（１９８７）　３３５］によって試験管内で 増幅される。増幅は、自動化され（４０増幅サイクル）　、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅ１ ｍｅｒ社によって供給されるＴａｑポリメラーゼ（古細菌類・サーモフィルスー アクヮチクス（Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ））を用いて、 パーキン・エルマー・シータス装（ｉｆ（ＤＮＡ　ｔｈｅｒｍａＩ　ｃｙｃｌｅ ｒ）において実施される。各増幅サイクルは、１）９１℃でのＤＮＡ変性段階： ２）鋳型ＤＮＡ上へのオリゴデオキシヌクレオチド　プライマーのハイブリダイ ゼーション段階であって、ハイブリダイゼーション温度は、オリゴデオキシヌク レオチドの融解温度（Ｔ　Ｉ／２）以下の５〜１０度を選択され、サイズ約２０ ｍｅｒのオリゴデオキシヌクレオチドについて、ＴＩ／２＝２Ｘ　（Ａ＋Ｔ）　 ＋４ｘ　（Ｃ十Ｇ）である［Ｉｔａｋｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎｎ。

Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５３　（１９８４）　３２３３　；３）７２℃で のＴａｑポリメラーゼによる相補的ＤＮＡの合成段階、の３段階を含む。

放射性ヌクレオチドプローブの調製は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社市販の“ランダ ムプライムＤＮＡラベリング（Ｒａｎｄｏｍ　Ｐｒｉｍｅｄ　ＤＮＡＬａｂｅ　 Ｉ　ｉｎｇ）”キットを用いて、ＤＮＡ２０ｎｇから新たに合成される分子の長 さに沿って放射性ａｄＣＴＰ　（リン３２）の取り込みによって実施される。

ナイロン膜（Ｂｉｏｄｙｎｅ、　Ｐａ１１．　Ｓｔ　Ｇｅｒｍａｉｎ　ｅｎ　Ｌ ａｙｅ）もしくはニトロセルロース（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌ ｌ、　Ｄａｓｓｅｌ）上へのＤＮＡの転移は、５ｏｕＬｈｃｒｎ［Ｊ、　Ｍｏ１ ．　Ｂｉｏｌ、　９８　（＋９７９）　５０３コにより最初に開発された方法に より実施される。使用されるハイブリダイゼーションと洗浄条件は、使用される プローブの性質に依存する：非相同の条件（例えば、Ｓ、セレビシェからのプロ ーブとハイブリダイズされるＩ（ラクチスのゲノムＤＮＡ）下では、ハイブリダ イゼーションおよび洗浄は、あまり厳しくない条件（５Ｘ　５ＳＣ１５Ｘデンハ 　ｈ（Ｄｅｎｈａｒｔ）中ホルムアミドなしで、４０℃１５時間ハイブリダイゼ ーション、次いでフィルターを４０℃１５分間、５Ｘ　ＳＳＣ／１％ＳＤＳ中で ３回、次いで１０分間領　２５Ｘ　ＳＳＣ／１％ＳＤＳ中で１回洗浄）下で実施 され：相同条件（例えば、Ｋ、ラクチスからのプローブと／Ａイブリダイズされ るＫ　ラクチスのゲノムＩ）　Ｎ　Ａ　）下では、ハイブリダイゼーションおよ び洗浄は、より厳しい条件（５Ｘ　５ＳＣ１５Ｘデンハ一ト１５０％ホルムアミ ド中で、４０°Ｃ１５時間ハイブリダイゼーション、次いでフィルターを４０° Ｃ１５分間、５Ｘ　ＳＳＣ／１％ＳＤＳ中で３回、次いで１０分間０．２Ｘ　Ｓ ＳＣ／１％ＳＤＳ中て１回洗浄）下で実施される。

ヌクレオチド配列の確認は、Ｔａｂｏｒ　ａｎｄ　Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ　［１ ”ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４　（１９８７） 　、１７６７］による方法に従い、υｎ１ｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉ。

ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製＋５ｅｑｕｅｎａｓｅ　ｖｅｒｓ ｉｏｎ　２０”を用いてプラスミドＤＮＡについて実施される。この技術は、Ｓ ａｎｇｃｒ　ｃｔ　ａｌ、［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、 ７４　（１９７７）　５４６３コ１こより最初に報告された方法の変法である。

本発明のタンパク質の発現のために、プラスミドのＤＮＡを用いるにラクチスの 形質転換は、当業者に既知のいかなる技術によっても実施され、その実施例は本 明細書中に示される。

別に述べられる場合以外は、使用される細菌菌株は、Ｅ、コリＭＣＩ（１９８１ ）　３０９コである。

使用される酵母菌株は、出芽酵母、そしてより特別には、クルイベロｋｉ　ｃｔ 　ａｌ、、　Ｙｅａｓｔ　４　（１９８８）　７１］　ｌｖＪ株が、特に使用さ れた；菌株ＭＷ９８−８Ｃのサンプルは、Ｂａａｒｎ（Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌ ａｎｄｓ）にあるＣｃｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｋ ｕｌｔｕｒｅｎ　（ＣＢＳ）に、１９８８年９月１６日に寄託され、それは寄託 番号ＣＢ５５７９．８８として登録された。

酵母ゲノムＤＮＡの調製は、本質的にｌｌｏｆｆｍａｎ　ａｎｄ　ｆｊｎｓｔｏ ｎ　［Ｇｅｎｅ　５７（１９８７）　２６７］による技術から得られ、詳細は、 本明細書に記述される。

本発明のタンパク質をコードしている発現プラスミドを用いて形質転換された酵 母菌株は、エーレンマイヤーフラスコもしくは２１容パイロットファーメンタ− （ＳＥＴＲＩＣ，Ｆｒａｎｃｅ）中で、２８℃で定常的な撹拌をしつつ高栄養培 地（ＹＰＤ：１％酵母エキス、２％バタトペブトン、２％グルコース、またはＹ ＰＬ：１％酵母エキス、２％バクトベプトン、２％ラク）・−ス）において培養 される。

Ｅ、１．　１．　ＤＮＡ配列の試験管内酵素的増幅によるプローブの作ＰＣＲに よる酵素的増幅は、プラスミドｐ　Ｆ　Ｐ　８　［Ｍｏｅｌｅ　ｅｔ　ａｌ、　 、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１１５　（１９８７）　２５５＋図１］、ＹＥｐ１３山 来Ｅ、コリ／Ｓ、セレビＴＡＧＣＧ−３’　（Δｓ　ｐ　３残基に対応するコド ンは、下線で示す）と５’−ＡＡＴＡＴＣＴＣＴＣΔＣＴＴＧΔＴ−３’　（残 基１１　ｅ３４Ｂに対応する相補的鎖のコドンは、下線で示す）を担持して実施 される。オリゴデオキシヌクレオチドのハイブリダイゼーションの温度は、４５ ℃であり、反応液１００ｍ１はニブラスミドｐＦＰ８　Ｌｏｎｇ：オリゴデオキ シヌクレオチドブライマー、１０ｘ　ＰＣＲパンファー［トリス−ＨＣｌ　ｐＨ ＝８．５　（１００ｍＭ）；ＭｇＣｌ’ｚ（２０ｍＭ）；ＫＣｌ　（１００ｍＭ ）；ゼラチン（０，０１％）］　１０ｍＬ　ｄＮＴＰ　（ｄＡＴＰ＋ｄＣＴＰ＋ ｄＧＴＰ＋ｄＴＴＰ、各濃度１０ｍＭ）１０ｍｌおよびＴａｑポリメラーゼ２． ５ｕｎｉｔ、を含有する。パラフィンオイル１滴の添加により、増幅サイクルの 間の温度上昇時の蒸発を防げる。

１．０３９塩基対のＤＮＡ断片が得られ、その同一性は、ある制限酵素部位の位 置の分析によって確認され、実質的に、プロテアーゼＢの成熟形の完全なアミノ 酸配列（Ａｓｐ３〜ｌ　ｌ　ｅ３４８）に対応する。次に、この断片は、０８％ アガロースゲルで泳動した後、電気溶出によって精製し、“ランダムプライミン グ法により放射性プローブを調製するのに使用される。

定常増殖期の酵母（菌株に、ラクチスＭＷ９８−８Ｃ）を遠心分離する。滅菌水 でそのペレットを洗浄後、それを２％トリトンＸ１００　（ｖ／ｖ）；１％ＳＤ Ｓ　（ｗ／ｖ）：　１００ｍＭＮａＣ１；　１０ｍＭ）リス−ＨＣ１（ｐＨ＝８ ）；　１ｍＭＥＤＴＡ、含有溶液に採取する。次イテ、その酵母を、フェノール −クロロホルム存在下で、ガラスピーズを添加された混合液を２分間回転させて 、その機械的作用により摩砕する。次いで、水相を遠心後回収し、２．５容のエ タノールを添加して沈殿させる。ＤＮＡは、ＴＥに取られて、セシウムの濃度勾 配での精製に懸けられる。培養液１リツトルから、高分子量のゲノムＤＮＡ　（ ＞＞２０ｋｂ）１ｍｇを得る。

Ｅ、１．　３．低い厳密条件下でのハイブリダイゼーションによる遺伝チ珠直 ゲノムＤＮＡ調製物は、切断部位がベクターｐｌｃ−２０１１の多重クローニン グ部位に存在する制限酵素により全消化される。予備的結果は、あまり厳しくな い条件（５Ｘ　５ＳＣ１５Ｘデンハート中ホルムアミドなしで、４０°Ｃ１５時 間ハイブリダイゼーション、次いで４０℃１５分間、５Ｘ　ＳＳＣ／１％ＳＤＳ 中で３回洗浄、次いで１０分間０．２５Ｘ　ＳＳＣ／１％ＳＤＳ中で１回洗浄） でのみ、Ｓ、セレビシェ−片に膜上プローブとハイブリダイズする１、８ｋｂの ＥｃｏＲＩ断片を認めることができる、ことを示している。第２のササンブロツ テイングは、各ウェル（ｗｅｌｌ）中に、ＥｃｏＲＩ２０ユニットおよび第２の 制限酵素２０ユニツトにより１５時間切断されたゲノムＤＮＡ１２ｍｇを含んで 実施される（図２）。先に定めたハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、 約７００ｂｐの、ＥｃｏＲＩ＋Ｂｇｌ　Ｉ　Ｉの二重消化から得られたゲノム断 片は、Ｓ　セレビシェＰＲＢ１プローブとハイブリダイズする（図２、列３）。

同様に、より大きいサイズ（約１．３ｋｂ）の８ｋｂ）の断片か、いずれかを生 じるので、あまり重要ではないと思われる。

それが、その遺伝子のミツソング（ｍｉｓｓｉｎｇ）部分をクローニングするた めの相同プローブとして役立つ。この断片をクローニングするために、ゲノムＤ ＮＡが、ＥｃｏＲＴおよび旦（↓ＩＩエンドヌクレアーゼの１００ｍｇにより１ ５時間処理され、次いで、調製用アガロースゲル（１％）で展開される。次いで 、サイズが５００〜１，０００ｂｐである断片を含んでなるゲルのフラクション が、３種のサブフラクション（サブフラクション”ｆ”　・５００／７００ｂｐ ：サブフラクション“ｅ”　：　７００／８００ｂｐ　：サブフラクション“ｄ ”　：８００／１０００ｂｐ　；図３）に分けられる。これらのサブフラクショ ンの一部分の展開およびＳ　セレビシェＰＲＢ１プローブとのハイブリダイゼー ションの後、実施されたササンブロソティングは、期待されるサイズ（７００ｂ ｐ）および特にサブフラクション“ｅ”　（７００／８００ｂｐ）による強いハ イブリダイゼーションシグナルを示す。それ故、このサブフラクションの旦（↓ ＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片に限定されたゲノムライブラリー（ミニ−ゲノムライブラ リー）が、ベクターｐｌｃ−２０Ｈの対応する部位中に、Ｂｇ　Ｉ　Ｉ　Ｉ−Ｅ ｃｏＲＩ制限酵素断片をクローニングすることによって構築される。Ｅ、コリに おける連結物の形質転換体は、アンピシリンおよびＸ−ｇａｌを追加されたＬＢ ディツシュにおける白色コロニーの９０％になる。次いで、３４０クローン（約 ３０の青色クローンを含む）が、それらを単離するために同じ培地で継代培養さ れる。

次に、限定されたライブラリーの３４０クローンは、各々が異なる１０クローン に対応する３４混合物に分けられ、それらのＤＮＡが、Ｅｃ。

ＲＩ＋ＢｇｌユＩＩにより消化され、アカロースゲルで展開され、膜上に転移さ れて、次いであまり厳しくないハイブリダイゼーションと洗浄条件下で、Ｓ、セ レビンエＰＲＢｌプローブとハイブリダイズされる。図３は、このササンブロツ ティングを示していて、ここでは、２種の混合物（１８および３１）が９期待さ れるサイズ（約７００ｂｐ）のハイブリダイゼーションシグナルを示す。同じ操 作が、混合物１８および３１の１０クローンを別々に分析するために行われる： クローン３が、期待されるサイズにおいてハイブリダイゼーションングナルをも つので、その混合物１８の唯一のクローンである（クローン１８−３）；同様に して、混合物３１の唯一のクローン■が、期待されるサイズにおいて／％イブリ ダイゼ−７ヨンングナルを与える（クローン３ｌ−１）。最後のササンブロソテ ィングが、クローン１８−３および３１−ｒ　（ポジテイブングナル）、ならび にネガティブクローン（混合物３１のクローンＫ）のＤＮＡを用いて出発して実 施される。前記の！−イブリダイゼーンヨンおよび洗浄条件下で、クローン１８ −３および３１−１のみが、Ｅｃ。

ＲＩ＋Ｂｇｌｌｌ二重消化後のポジティブシグナルの存在を確認し、そのサイズ は厳密に等しいと考えられる（図４）。

Ｅ　１．４　遺伝子の同定 この断片が、実際にに、ラクチスＰＲＩ３１遺伝子のフラクションに対応してい ることを示すために、クローン１８−３の御粘３」工１１−Ｅｃ。

Ｒ１断片のヌクレオチド配列が、作製される。

クローン１８−３からのプラスミドｐＹＧ１２２４の大体の制限酵素地図が、初 めて作製され、Ｂｇｌ　Ｉ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ断片の中心に、明らかなユニークＳ ａ↓■部位の存在を現す。次に、プラスミドｐＹＧ１２２４の旦又↓ＩＩ一旦且 ↓Ｉ　（約３５０ｂｐ）　およびｓ見↓■一旦旦旦旦Ｉ　（約３００ｂｐ）断片 が、ベクターｐＵｃ１９中にクローン化され、それぞれｐＹＧ１２２６およびｐ ＹＧ１２２７を生じる（図６ａ）、次いで、これらのプラスミドの挿入断片が、 “ユニバーサルブライマー”を用いて全部、配列決定される。図５に示したよう に、プラスミドｐＹＧ１２２４のＢｇｌ　Ｉ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ断片は、Ｓ、セレ ビシェＰＲＢ１遺伝子の断片（Ａ　、　ｇ１０５〜Ｌｅｕ３２ｇ）と配列相同性 を示すオーブンリーディングフレーム（２２５残基）を含有する。そのような相 同性の存在、同じくズブチリンン族のセリンプロテアーゼに一定不変に見いださ れるアミノ酸の厳格な保存は、プラスミドｐＹＧ１２２４によって担持されるゲ ノムＩ）　Ｎ　Ａ断片が、実際に、Ｋ、ラクチスＰＲＢ１遺伝子の断片に対応す る、ことを示している。

Ｅ　１．５　遺伝子の３′部分のクローニングプラスミドｐＹＧ１２２４のＢｇ ↓ＴＩ−ＥｃｏＲＩ断片は、ＢｇｌユＩ■部位の下流に位置するユニークＫｐｎ ｌ制限酵素部位を含有する（図６Ａ）。それ故、約６６５ヌクレオチドのＫｐｎ 　Ｉ−ＥｃｏＲＩ制限酵素サブフラグメントが、この断片から得られ、１％アガ ロースゲルでの展開ｉ＆電気溶出により単離され、”ランダムブライミング法に よって放射能標識される。次に、この放射性プローブが、それを含むに、ラクチ スのゲノムＤＮＡの制限酵素断片のサイズを決定するために使用される。このよ うにして、約１．２ｋｂのＫｐｎ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ断片が、厳密な条件（５Ｘ　 ５ＳＣ１５Ｘデンハ一ト１５０％ホルムアミド中で、４０℃１５時間ハイブリダ イゼーション、次いで４０℃１５分間、５ＸＳＳＣ／１％ＳＤＳ中で３回、次い で１０分間０．２Ｘ　ＳＳＣ／１％ＳＤＳ中で１回洗浄）下でのハイブリダイゼ ーションおよび洗浄の後に検出される。次に、Ｋ、ラクチスのゲノムＤＮＡの限 定されたライブラリー（サイズが１〜］、、５に、ｂのＫｐｎｌ−１３ｇ±Ｉｆ 制限酵素断片）が、実施例Ｅ、１．　３　に従い構築され、プローブとハイブリ ダイズする制限酵素断片が、ベクターｐｌｃ−２０ＨのＫｐｎｌおよびＢａｍＨ ■部位の間にクローン化され、プラスミドｐＹＧ１２３１が得られる（図６Ｂ） 。次いで、このプラスミドのゲノム挿入断片は、プライマーとしてオリゴデオキ シヌクレオチドＳ　ｑ２１０１　（５’−ＧＡＣＣＴＡＴＧＧＧＧＴＡＡＧＧＡ ＴＴＡＣ−３’）を用いて配列決定される。この部位からの約３０ヌクレオチド に置かれる。それ故、それは、この制限酵素部位の３′に配置されるヌクレオチ ド配列、特に、ＥｃｏＲＩ部位と、Ｋ、ラクチスＰＲＢ１遺伝子に対応するメツ センジャーＲＮＡの翻訳停止コドンとの間に位置する配列を決定することを可能 にする。

Ｅ、］、６．遺伝子の５′部分のクローニングＥ１．５　において作製されたヌ クレオチド配列は、ＥｃｏＲ１部位と翻訳停止コドンとの間に位置するｌ１ｉｎ ｄｌｌｌ制限酵素部位の存在を示している。ｌｌ１ｎｄＴＩＩと第２の酵素によ り消化されたＫ　ラクチスのゲノムＤＮＡにおける放射性プローブとして、Ｋ、 ラクチスＰＲＢ↓遺伝子のＣ末端部分に対応するＫｐｎ　Ｉ−ＥｃｏＲＴ制限酵 素断片を使用して、ササンブロッティングによって、このプローブとハイブリダ イズする約１．７ｋｂのｌ１ｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ−ＥｃｏＲＶ断片を同定するこ とができる。この制限酵素断片は、ベクターｐＩＣ−２ＯＲのＥｃ９」＼ｒとｌ ｌｉｎｄｌｌｌ部位の間に先ずクローン化され、それによってプラスミドｐＹＧ Ｉ２３７が生じる。プラスミドｐＹＧ１２３７に含まれるゲノムＤＮＡ挿入断片 の制限酵素地図が作製され（図６０）、次のプラスミドが生成される：ｐＧＹ１ ２３８　（そのＰ　ｓ　ｔ　Ｉ断片に関して欠失されたプラスミドｐＹＧ１２３ ７）　、ｐＹＧ１２３９　（ベクターｐＵＣ１９中のｌ０ＹＧＩ−２３７のＰｓ 　ｔ　Ｉ断片）、ｐＹＧ１２４０　（＋（７）Ｋｐｎｌ断片に関して欠失された プラスミドｐＹＧ　１．２３７）　、ｐｙｃ１２４１（その９±ＡＩ断片に関し て欠失されたプラスミドｐＹＧ１２３７）およびｐＹＧｌ、２／１２（その５ａ ｌｌ断片に関して欠失されたプラスミドｐＹＧｌ２３７：図６Ｃ）。次いで、こ れらの種々のプラスミドのゲノム挿入断片が、ユニバーサルプライマーと、Ｂｇ ｌユ１１部位の５°側に隣接して置かれる領域を配列決定することができるオリ ゴデオキシヌクレオチド５ｑ２１４８　（５′−ＧＣＴＴＣＧＧＣＡＡＣＡＴＡ ＣｌａｌおよびＰｓ↓！制限酵素部位のユニークネス（ｕｎｉｑｕｅｎｅｓｓ） を示す重複配列を得ることを可能にし、モしてに、ラクチスＰＲ１３１遺伝子の 翻訳の開始についてありそうなＡＴＧを同定することを可能にする。

Ｅ、１．　７．　Ｋ、ラクチスＰＲＩ３１遺伝子のヌクレオチド配列Ｅ、１．　 ４．　、Ｅ、１．　５．およびＥ、１．　６．において決定された配列の編纂に より、Ｋ、ラクチスＰＲＢ１遺伝子の完全なコーディング相をカバーする（図６ Ｄ）。この配列は、配列番号１を与えられ、Ｋ。

ラクチス　プロテアーゼＩ３に対応する５６１残基のタンパク質をコードしてい る。

（実施例２．Ｋ　ラクチス　カルボキシペプチダーゼＹ遺伝子のクローニング） 　実施例１に記載の一般的手順が、Ｋ、ラクチスＣＢ５２３５９／１５２のカル ボキンペプチダーゼＹ遺伝子のクローニングについて繰り返される。

Ｅ　２１．プローブの作製 菌株Ｓ　セレビシｘｓ　２８８　Ｃ［Ｍｏｒｔｉｍｅｒ　ａｎｄ　Ｊｏｈｎｓｔ ｏｎ、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ世（１９８６）　３５コのゲノムＤＮＡの作製は、実 施例Ｅ、１．　２．に従い最初に実施される。次いで、このゲノムＤＮＡ調製物 のＰＣＲ増幅が、ＰＲＣ１遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチド５’−ＣＴＴＣ ＴＴＧＧＡ　Ｇ　Ｔ　Ｔ　Ｇ　Ｔ　Ｔ　ＣＴ　Ｔ　ＣＧ　−３’および５’−Ｔ ＧＧＣＡＡＧＡＣＡＴＣＣＧＴＣＣＡＣＧＣＣＴＴＡＴＴ−ＡＣＣ−３’を用い て実施される。

かクシテ、Ｓ、セレビシｘＰＲｃ１遺伝子［Ｖａｌｌｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ １ｌ　４８　（１９８７）　８８７］のオープンリーディングフレームの位置６ ９６−１３９５　（ＡＴＧ開始コドンは＋１して数えられる）に対応する、期待 されるサイズ（６９９ｂ　ｐ）の増幅された断片が得られる。次いで、この断片 は、電気溶出によって精製され、“ランダムブライミング技術により放射能標識 される。

９／１５２からＷ６ｓｏｌｏｗｓｋｉ−Ｌｏｕｖｅｌ［Ｙｅａｓｔ　４　（１９ ８８）　７１１によって構築されたに、ラクチスのゲノムライブラリーをスクリ ーニングすることによって得られる。菌株Ｅ　コリＪＭＩＯＩは、ライブラリー からのＤＮＡを用いて形質転換され、形質転換菌は、アンピシリン（５０ｍｇ／ ｍｌ）を追加されたＬＢ培地にブレーティングされる。次いで、１５，０００ク ローンが、ニトロセルロースフィルター上に転移され、そのフィルターは、実施 例Ｅ、２．　１．記載のプローブによりハイブリダイズされる。ハイブリダイゼ ーションおよび洗浄条件は、実施例Ｅ、１．　３゜の条件である。このようにし て、１２ポジテイブクローンが単離され、ｐＣ３４と命名されたそれらの１つが 、以後の研究のために選択される。

最初の例においては、Ｓ、セレビシェＰＲＣ１遺伝子に対応するプローブとのプ ラスミドｐＣ３４のハイブリダイゼーションは、ササンブロッティングによって 確認される。プラスミドｐＣ３４のゲノム挿入断片（約６．９ｋｂ）の制限酵素 地図は、図８に示される。次に、Ｋ、ラクチスＰＲＣＩ遺伝子を含む２．５ｋｂ のＥｃｏＲＩ一旦見↓Ｉ断片の配列は、２本の鎖について決定される。この配列 は、配列番号２に示される。

（実施例３．に、ラクチス・プロテアーゼＡ遺伝子のクローニング）前記実施例 に記載の一般的手順が、Ｋ、ラクチスＣＢ５２３５９／１５２のプロテアーゼＡ 遺伝子のクローニングについて繰り返される。

Ｅ　３１．プローブの作製 Ｓ　セレビシェからのＰＲΔ１遺伝子（もしくはＰＥＰ４遺伝子）の４４９ｂｐ の内部断片が、Ｄｒ、　Ｅ、　Ｊｏｎｅｓ　（Ｃａｒｎｅｇｉｅ−Ｍｅｌｌｏｎ 　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ。

Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、　Ｐｃｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ、　ＵＳＡ）によって提供 されたプラスミドＣＢＺ　Ｉ　Ｂ　１　［Ｗｏｏｌｆｏｒｄ　ｅｔ　ａｌ、、　 Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　６　（１９８６）　２５００］　、ならび にオリゴデオキシヌクレオチド ５’−ＣＴＧＴＴＧＡＴＡＡＧＧＴＧＧＴＣＣ−３’および５’ＣＡＡＧＣＧＴ ＧＴＡＡＴＣＧＴＡＴＧＧＣ−３’を用いて出発するＰＣＲ技術によって最初に 増幅される。得られた増幅断片は、Ｓ、セレビシェ旦旦Δ１遺伝子のオープンリ ーディングフレームの位［６１７−１０６６に対応する（ＡＴＧ開始コドンは＋ １して数えられる）。次いで、この断片は、電気溶出によって精製され、“ラン ダムプライミング技術により放射能標識される。

Ｅ、３．　２．　Ｋ、ラクチスＰＲＡＩ遺伝子のクローニングり出発するＷ６ｓ ｏｌｏｗｓｋｉ−Ｌｏｕｖｅｌ［Ｙｅａｓｔ　４　（１９８８）　７１］によっ て構築されたＫ　ラクチスのゲノムライブラリーをスクリーニングすることによ って得られる。Ｅ、コリＪＭＩＯＩにおけるライブラリーを形質転換し、アンビ ンリン（５０ｍｇ／ｍｌ）の存在かで選択した後、次いで、１５゜０００クロー ンが、ニトロセルロースフィルター上に転移され、そのフィルターは、実施例Ｅ 、３．　１．記載のプローブによりハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーシ ョンおよび洗浄条件は、実施例Ｅ、１．　３゜の条件である。このようにして、 ただ１つのポジティブクローンが単離され、ｐＡ２５／１と命名された。最初の 例においては、Ｓ、セレビシェＰＲＡＩ遺伝子に対応するプローブとプラスミド ｐＡ２５／１のハイブリダイゼーションが、ササンブロツティングによって確認 される。このプラスミドのゲノム挿入断片（約７．５ｋｂ）の制限酵素地図は、 図この配列は、配列番号３に示される。

（実施例４：酵母の形質転換） クルイベロミセス属に属する酵母、特に、菌株に、ラクチスＭＷ９８−８Ｃ，Ｃ Ｂ５２９３．９１およびＣＢ５２９４．９１　（ｕｒａＡ）の形質転換が、例え ば、次のように改変された酢酸リチウムを用いて細胞全体を処理する技術［Ｉｔ ｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５３　（１９８３）　１ ６３−１６８］によって実施される。細胞の増殖は、２８℃で撹拌しっつＹＰＤ 培地５０ｍ１中で、６００　ｎ　ｍ　（ＯＤｓｏｏ）の光学濃度領　６〜０．８ まで行われ；次いで、細胞は、低速遠心分離によって回収され、ＴＥ　（１０ｍ 〜１トリスＨＣＩ　ｐＨ７，４：　１ｍＭ　ＥＤＴＡ）の滅菌溶液中で洗浄され 、酢酸リチウムＣＴＥ中０．１Ｍ）３−４ｍｌに懸濁されて、細胞濃度約２ｘｌ Ｏ’細胞／ｍｌを得、次いで穏やかに撹拌しつつ３０℃で１時間インキュベート される。得られる受容能のある細胞の懸濁液の一部０．１ｍｌが、ＤＮＡ存在下 、最終濃度３５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、。。。、　Ｓｉｇｍａ）に おいて、３０℃１時間インキュベートされる。４２℃で５分間のヒートショック の後、細胞は２回洗浄され、次いで、滅菌水Ｑ、２ｍｌに再懸濁される。その場 合もしくは選択マーカーがＳ、セレビシェＵＲＡ３遺伝子である場合には、細胞 は、直接ＹＮＢ（Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａ５ｅ；Ｄｉｆｃｏ）／グ ルコース（２０ｇ／Ｉ）／寒天にブレーティングされる。その場合もしくは選択 マーカーが、トランスポゾンＴｎ９０３のａｐｈ遺伝子である場合には、細胞は 、最初にＹＰＤ２ｍｌ中で２８°０１６時間インキュベートされて、Ｐ、プロモ ーターの制御下で発現されるＧ４１８耐性遺伝子の表現型を発現させ（欧州特許 第３６１９９１号、参照）；次に、細胞懸濁液２００μｍが、選択ＹＤＰディツ シュ（Ｇ４１８．２００μｇ／ｍｌ）にブ　ル−ティングされる。そのディツシ ュは、２８℃でインキュベートされて、細胞増殖２〜３日後に、ディスラブタン ト（ｄｉｓｒｕｐｔａｎｔ）および形質転換体が出現する。

（実施例５・Ｋ、ラクチスにおけるプロテアーゼ遺伝子の破壊）Ｅ、５．１．Ｐ ＲＢＩ遺伝子を破壊された■く　ラクチス菌株プラスミドｐＹＧ１２２９は、プ ラスミドｐＹＧ１２２４のＨｉ　ｎ　ｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約７００ｋｂ のＢｇｌ　１１−ＥｃｏＲＩ断片を含み、Ｋ、ラクチスＰＲＢ１遺伝子のＣ末端 部分に対応する）を、プラスミドｐＵＣ９の対応する部位の間にクローニングす ることによって構築される。プラスミドｐＹ０１２２８は、１．１ｋｂのＨｉｎ ｄｌｌＩ断片をクローニングし、プラスミドｐ　ＩＣ−２ＯＲのＨｉｎｄｌＩＩ 部位中のプラスミドｐ　ＣＧ　３　［Ｇｅｒｂａｕｄ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｕｒ ｒ、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　３　（１９て構築される。それ故、プラスミドｐＹＧ １２２８が、約１．１ｋｂで、で、この制限酵素断片は、プラスミドｐＹＧ１２ ３２　（二つの可能な方断片を生成することを可能にする（図１１Δ）。プラス ミドｐＹＧ１２３２のＢｇ　Ｉ　Ｉ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ断片によるに、　ラクチス ｕｒａＡ突然変異株の形質転換は、染色体中へのこの断片の組み込みに対応する 形質転伝子中への相同的組み換え（列３、このディスラプタントはＹ７５０と立 遺伝子の破壊は、菌株の増殖特性を改変しない。

フタ−ｐｌｃ−２０Ｒの対応する部位中に、最初にサブクローン化され、プラス ミドｐＹＧ１５４を生じる（図１２、ｂ図）。次に、このプラスミドは、Σ旦九 １酵素により消化され、次いで、コウジ腸ホスファターゼ（ＣＩ　Ｐ）の存在で ファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ■を用いて処理される。次いで、得られたプラ スミドが、前辺てＥ、コリのＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウフラグメントで処 理された、プラスミドｐＫａ　ｎラスミドは、ｐＹＧ１５５と命名される（図１ ２、Ｃ図）。次に、ブラ転換に使用される。

形質転換体は、Ｕｒａ”表現型について選択され、次いで、い（つかの遺伝子が 、相同組み替えによって、試験管内で構築される破壊されたアレーによって置換 されたクローンＹ７９７が同定される。ＰＲＣＩ遺伝子の野生型アレレの破壊は 、その菌株の増殖特性を改変しない。

（実施例６：発現プラスミド） Ｅ、６．１．　プラスミドｐＹＧ１２１２分泌および／または発現することが期 待される興味あるタンパク質の州特許出願第３６１９９１号に記載のようなハイ ブリッドプロモーターに存在するプロモーター、のような調節的もしくは構成的 な機能性プロモーターの制御下で、“生産的な方向づけにおいて”　（転写プロ モーターに関して近傍のタンパク質のＮ末端領域に置かれる方向づけとして定義 される）最初に挿入される。Ｋ、ラクチスにおいて機能性のある調節的（ｐＹＧ １０５）もしくは構成的（ｐＹＧ１０６）プロモーターからのＨｉ　ｎ　ｄ　Ｉ 　Ｉ　Ｉ制限酵素断片に含まれる遺伝子の発現を許すので、プラスミドｐＹＧ１ ０．５およびｐＹＧ１０６が、特に有用である。

プラスミドｐＹＧ１０５は、欧州特許第３６１．９９１号に記載のプラスミドｐ Ｋａｎ７０７に対応し、そのプラスミドでは、ゲネチシン（Ｇ４１８）耐性の遺 伝子に位置するユニークＨｉｎｄＴＩＩ制限酵素部位が、部位特異的突然変異誘 発によって破壊されており、不変のタンパク質（オリゴデオキシヌクレオチド５ ’ＧＡＡＡＴＧＣＡＴＡＡＧＣＴＣＴＴＧＣＣＡＴＴＣＴＣＡＣＣＧ−３’）を 保存している。このようにｐＹＧ１０７山来のＳａ　ｌ　ｌ−１１ｉｎｄ　Ｉ　 Ｉ　Ｉ断片の形で；　Ｆｌｅｅｒ　Ｃｔ　Ｇ０５は、クルイベロミセス酵母にお いて有糸分裂にも非常に安定であり、そして制限酵素地図は、図１３に示される 。プラスミドｐＹＧ１０５およびｐＹＧ１０６は、旦見ユＩ−）１ｉｎｄｌｌＩ 断片によってコードされる転写プロモーターの性質において互いに相違する。

プラスミドｐＹＧ１２１２によってコードされるタンパク質は、ヒト血清アルブ ミン（Ｈ５Δ）の最初の２ドメインにほぼ対応している。こ末端の消化によって 得られるが、それは、欧州特許第４１３６２２号記載のプラスミドＹＰ４０から 得られる。簡単には、プラスミドＹＰ４０開始に関するＡＴＧは＋１を付される ）に対応するものであって、プラスミドｐ　ＹＧ　２２１　［Ｙｅｈ　ｃｔ　ａ ｔ、、　Ｐｒａｃ、Ｎａｔｌ、　＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８９　（１９ ９２）　１９４０］のＭｓｔｌｌ−ＨｉｎｄｌＩＩ断片に連結され、ＩＳＡの最 後の３残基（残基Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ）および翻訳停止コドン［Ｈ５Ａ　Ｂ −４０３１と記した端を切り取られた改変体］が続＜ＩＳＡの４０３Ｎ末端残基 を含むＨ４ｎｄｌＩＩ断片を生じる。次いで、Ｈｉｎｄｌｌ■末端は、プラスミ ドｐＹＧ１０５中に、生産的な方向づけでクローン化され、プラスミドｐＹＧ１ ２１２を生じる（図１３）。

（実施例７　ディスラブタントの分泌能）第１段階において、酵母Ｋ　ラクチス Ｃｌ５Ｓ２９３．９１およびＹ７５０が、プラスミドｐＹＧ１２１２により形質 転換される。Ｇ４１８を追加した高栄養培地での選択後、組み換えクローンが、 それらのタンパク質ＨＳ　Ａ　Ｌ！−４０３３分泌能について試験される。いく つかのクローンが、ＹＰＤもしくはＹＰＬ培地において２８℃で培養される。細 胞が定常増殖期に達した時、培養上澄液が、遠心分離によって回収され、最終濃 度６０％エタノールにおいて、−２０６Ｃ３０分間の沈殿によって１０倍に濃縮 され、次いて、８．５％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動し、クーマン−ブルー でゲルを染色後、試験される。図１４に示された結果は、ディスラブタントＹ７ ５０　（ｐｒｂｌｏ）が、破壊されなかった同類のものによって分泌される看よ りもずっと多くの量のタンパク質を分泌することを示している。このことは、使 用された炭素源（グルコースもしくはラクトース）のいかんにかかわらず、増殖 ２゜４もしくは７日後に確認される。

配列表 （１）　一般情報： （ｉ）　出願人・ （Ａ）名称：ローン・ブーラン　ローラー　ニス・ニー（Ｂ）通り・２０．アベ ニュー　レイモン　アローン（Ｆ）郵便コード　９２１６５ （１、発明の名称　改変クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）酵母 、それらの作製および使用 （ｉ　ｉ　ｉ）配列の数　３ （ｉｖ）コンピューター読み取り可能な形塘（Δ）媒体の種類：フロッピーディ スク（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣコンバーチプル（Ｃ）操作システム　Ｐ Ｃ−ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）ソフトウェア−１’ａｔｅｎｔｌｎ　Ｒｅ１ｅ ａｓｅ　＃１．０．バージョン＃１．２５（エポ）（２）　配列番号　１ （１）配列の特徴 （Ａ）長さ　１６８６　塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖の数・　二本鎖 （Ｄ）トポロノー　直鎖状 （ｉｊ）配列の種類−ｃＤＮΔ （ｖｉ）起源・ （Ｂ）法名、クルイベロミセス・ラクチス（ｉｘ）特徴 （Ａ）　ＮＡＭＥ／ＫＥ’！’　：　ＣＤ５（Ｂ）位置：ｌ、、１６８６ （Ｃ）他の情報　／ｐｒｏｄｕｃｔ＝ ゛プロテアーゼ　Ｂ　遺伝子”／遺（云子＝“Ｋ１．Ｔ’ＲＢ１”（Ｘり配列 （２）　配列番号　２ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ　２５０３　塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖の数　二本鎖 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （１ｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｖｉ）起源 （Ｂ）株名：クルイベロミセス・ラクチス（１ｘ）特徴・ （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：　ＣＤ５ （Ｂ）位置　３８７．．１８６２ （Ｃ）他の情報　／　ｐｒ□ｄｕｃ　ｔ　＝“Ｋ“ラクチスプロテアーゼ　Ｃ遺 伝子”／遺伝子＝“ＫトＰＲＢＩ”（ｘｌ）配列 Ｇごｒ７−−−＆ＡＴ　ＡＣＴＧＡＡＴＡＡＡ　ＴＴ０Ｔ７ＴＣＡＧＣＴ’ＴＧ ＴＴＣＴＣＴＴ　ＣにＡＧＧＴ’ＴＧＧＴ　ＣＧＡＣ（２）　配列番号　３・ （１）配列の特徴・ （Ａ）長さ：１６１５　塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖の数、　二本鎖 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （ｉｉ）配列の種類・ｃ　ＤＮＡ （ｖｉ）起源 （Ｂ）法名。クルイベロミセス・ラクチス（ｉｘ）特徴 （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：　ＣＤ５ （Ｂ）位置　１８８．．１．４１７ （Ｃ）他の情報　／ｐｒｏｄｕｃｔ＝ ゛プロテアーゼ　Δ　遺伝子”／遺伝子＝”ＰＲＡＩ”（ｘｉ）配列 Ｃｌ６１５ □ 品＝＝呂　によって得られるプローブ 「ゴｃＵＲＥ　１ Ａ　Ｂ ＡｒｇＳｅｒムｓｒ、Ｇ：ｙ５ｅｒＧり゛丁、−ｊｌｅｅ：５４ｒ人Ｓｐｖとユ ＼’１１Ｌ、Ｈ５ＧコｙｖａｌＧｌｕゴ’ｙｒνｂ】入１ａf）ｕＫ、ｌ。

−＋ｔφ−争・曽９・・―・・Ｔ””Ａｌａ・Ｌ、ｙｓ−五人１°Ｈ１！Ｌｙｓ ＬＹＳｋ：ｌ’＋′１ＩＧ４ｕＧｌ’ＪＣ’４ｎＬＹＥＬｙｓＧＩ）’Ｐ：、ｅ ＬｙｓＧＡＹ５？ｒＴ：Ｊ入３ａＡ５ｎ凵A２ｔＨ÷ ’”Ｇｉ＋、’Ｇｌｕ＾！ａＧ１ｎ’Ｌｙｓ’・５ｅｒＩＡｕＣｒｙＧコ）Ｃｒ ｙＬｙｓＳａｒＰｒｏＡ！ａＬｅｕ人ｘｐＬａ−ム１ａＶａｌ＾ｉｎ＾ｌａ入ｌ ５ＶａｌＬｙｅ入１ａＫ、！B ＋　１　１　＋　０　＋　＋　＋　９　◆　＋　１　０　０　ｅ　８　・　ψ　 Ｏｌｕ　νａｌ　ｉｅ。

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・　・　・　・　・　ＳＧｒ　入）ａ　ＦＷｅ　’　）ｓ５ｎ　’　丁ｎ１°　 Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｈｘｓ　５ｅｒ　５ｅｒ　Ｇｌｙ@ｓ、ａ。

国際調査報告 、、、Ｉｌ、−、Ｎ、ＰＣＴ／ＦＲ９３１００６２３＝、−＋Ｎ＋ＰＣＴ／ＦＲ ９３１００６２３

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. １．プロテアーゼＫＥＸ１遺伝子を除いては、プロテアーゼをコードしている少 なくとも１個の遺伝子の一つまたは複数の遺伝的改変をもち、該酵母のタンパク 質分解活性を改変する、クルイベロミセス（Ｋ１ｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属の 酵母。
2. ２．遺伝的改変（一つまたは複数）が、該遺伝子に、部分的にもまた全体的にも 天然のプロテアーゼをコードできなくすることを特徴とする、請求の範囲１記載 の酵母。
3. ３．このように遺伝的に改変された遺伝子（一つまたは複数個）が、非機能的タ ンパク質、または改変されたタンパク質分解活性スペクトルをもつ突然変異体を コードしていることを特徴とする、請求の範囲１記載の酵母。
4. ４．該遺伝的改変が、分離において安定であることを特徴とする、請求の範囲１ 〜３記載の酵母。
5. ５．該遺伝的改変（一つまたは複数）が、非可逆的であることを特徴とする、請 求の範囲１〜４記載の酵母。
6. ６．該改変が、目的の遺伝子の活性を全く残していないことを特徴とする、請求 の範囲１〜５記載の酵母。
7. ７．該改変が、プロテアーゼ活性をもつタンパク質、および／または該遺伝子の 発現および／または転写調節に関与している領域をコードしている部分に影響を 与えることを特徴とする、請求の範囲１〜６記載．の酵母。
8. ８．該遺伝的改変が、点もしくは多重突然突然変異および／または付加および／ または欠失および／または破壊であることを特徴とする、請求の範囲１〜７の一 つに記載の酵母。
9. ９．プロテアーゼをコードしている遺伝子が、液胞プロテアーゼをコードしてい る遺伝子であることを特徴とする、請求の範囲１〜８の一つに記載の酵母。
10. １０．該遺伝子が、プロテアーゼＡ、プロテアーゼＢおよびカルボキシペプチダ ーゼＹから選ばれるプロテアーゼをコードしているクルイベロミセスの遺伝子で あることを特徴とする、請求の範囲９記載の酵母。
11. １１．該酵母が、Ｋ．ラクチス（Ｋ．１ａｃｔｉｓ），Ｋ．フラジリス（Ｋ．ｆ ｒａｇｉｌｉｓ）、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ） およびＫ．ワルチイ（Ｋ．ｗａＩｔｉｉ）種に属する酵母から選ばれることを特 徴とする、請求の範囲１〜１０のいずれか一つに記載の酵母。
12. １２．該酸母が、プロテアーゼをコードしている少なくとも１個の遺伝子の一つ または複数の遺伝的改変をもち、該酵母のタンパク質分解活性を改変すること、 および場合によって、それが、興味ある少なくとも１種のタンパク質をコードし ている外来ＤＮＡ配列を含有することを特徴とする、クルイベロミセス属の酵母 。
13. １３．外来ＤＮＡ配列が、興味あるタンパク質をコードしている配列の５′末端 に連結された転写および翻訳の開始に関する領域を含有することを特徴とする、 請求の範囲１２記載の酵母。
14. １４．興味あるタンパク質をコードしている配列が、分泌経路におけるタンパク 質を導く輸出配列を含むことを特徴とする、請求の範囲１２および１３のいずれ かに記載の酵母。
15. １５．外来ＤＮＡ配列が、自律的に複製するベクターの部分であるか、または染 色体中に組み込まれることを特徴とする、請求の範囲１２〜１４の一つに記載の 酵母。
16. １６．興味あるタンパク質が、医薬もしくは食物用であることを特徴とする、請 求の範囲１２〜１５の一つに記載の酵母。
17. １７．タンパク質が、人工的タンパク質および例えばハイブリッドタンパク質で あることを特徴とする、請求の範囲１６記載の酵母。
18. １８．組み換えタンパク質の生産のための、請求の範囲１〜１７の一つに記載の 酵母の使用。
19. １９．請求の範囲１２〜１７記載の酵母が、外来ＤＮＡ配列によってコードされ たタンパク質を発現するための条件下で培養されること、および興味あるタンパ ク質が回収されることを特徴とする、組み換えタンパク質を生産する方法。
20. ２０．医薬もしくは食物用の興味あるタンパク質を生産する、請求の範囲１９記 載の方法。
21. ２１．人工的タンパク質および特にハイブリッドタンパク質を生産する、請求の 範囲２０記載の方法。
22. ２２．プロテアーゼＫＥＸ１を除いては、タンパク質分解活性をもつタンパク質 をコードしているクルイベロミセスのＤＮＡ断片。
23. ２３．液胞プロテアーゼをコードしている請求の範囲２２記載のＤＮＡ断片。
24. ２４．プロテアーゼＡ、プロテアーゼＢおよびカルボキシペプチダーゼＹから選 ばれるタンパク質をコードしている請求の範囲２３記載のＤＮＡ断片。
25. ２５．該ＤＮＡ断片が、配列番号１および配列番号２から選ばれる配列の全部も しくは一部を含むことを特徴とする、請求の範囲２４記載のＤＮＡ断片。
26. ２６．すべての部分もしくは誘導体を含み、改良され、保存され、廃棄され、ま たは改変されたタンパク質分解活性をもつタンパク質ならびにすべての天然の突 然変異体をコードしている、請求の範囲２２〜２５の一つに記載のＤＮＡ断片の 遺伝的突然変異体。
27. ２７．請求の範囲２２〜２６の一つに記載のＤＮＡ断片の発現から得られるペプ チド。
28. ２８．目的の染色体遺伝子の全部もしくは部分が、試験管内で改変されたものに よって置換されることを特徴とする、請求の範囲１記載のクルイベロミセス酵母 を作製する方法。