JPH07508416A - Ｃ．アンタルクチカのリパーゼ及びリパーゼ変異体 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 Ｃ，アンタルクチ力のリパーゼ及びリパーゼ変異体発明の分野 本発明は改良された特性を有する新規リパーゼ酵素変異体、前記変異体の発現に ついてコードするＤＮＡ構築体、このＤＮＡ構築体由来の変異体を発現できる宿 主細胞、及び前記宿主細胞の培養によりかかる変異体を製造する方法に関する。

更に、本発明は組換えられた本質的に純粋なカンジダ　アンタルクチ力（Ｃａｎ ｄｉｄａ　ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）及びその変異体、並びに前記リパーゼ又はそ の変異体をエンコードするＤＮＡ配列に関する。

発明の背景 微生物及び哺乳動物起源の広範囲にわたる様々なリパーゼが公知である。数多く のこれらのリパーゼのアミノ酸配列が推定され、そしてその触媒的機能にとって 重要な構造及び機能要素に関して分析されている。例えば、Ｗｉｎｋｌｅｒら、 １９９０及びＳｃｈｒａｇら１９９１を参照のこと。リパーゼ酵素は脂質基質の 結合及び活性化に基づき、コンホメーション変化を受け、これはとりわけ、基質 に対する活性部位の暴露をもたらすことが見い出されている。このコンホメーシ ョン変化は、酵素と基質との推定の相互作用と共に、とりわけＢｒａｄｙら１９ ９０、　Ｂｒｚｏｚｏｗｓｋｉら１９９＋、　Ｄｅｒｅｗｅｎｄａら１９９２に より述べられている。

数多くのリパーゼの構造の知識に基づき、組換ＤＮＡ技術の利用によって改良さ れた特性を存するリパーゼ変異体を構築することが可能となっている。即ち、Ｗ ｏ　９２１０５２４９号は一定のリパーゼ変異体の構築体を開示しており、それ においてはその脂質接触ゾーンが変更されており、異なる基質特異性を存する、 又は脂質基質に対するそのリパーゼの活性部位の向上した接近性を有する変異体 が供されている。その変更はアミノ酸置換による脂質接触ゾーンの静電荷、疎水 性又は表層コンホメーションの変化を包括する。

リパーゼのこの構造と機能との関係は上記した引用文献に記載の通り数多くの研 究の課題にされているが、その探求は主に基質結合及び活性化に基づくリパーゼ の巨視的な特徴を焦点としており、基質結合及び触媒活性に事実上かかわるアミ ノ酸の同定はあまり考察されていない。

発明の概要 数多くのリパーゼの構造及び活性の分析と組合せた配列整合により、本発明者は 驚くべきことに、リパーゼの重要な位置における一定のアミノ酸、特にトリプト ファンの存在が、最適な触媒活性にとって重要であるようであることをこの度見 い出した。

従って、本発明の目的は、この重要な位置においてかかるアミノ酸残基を含んで 成らないリパーゼを（本明細書においてはこのリパーゼを親リパーゼと呼ぶ）、 その位置あるアミノ酸残基を高められた比活性を有する変異体をもたらしめるア ミノ酸残基に置き換えることによって改良することにある。

より詳しくは、−の観点において、本発明は、このリパーゼ分子の主に疎水性の 長い結合ポケットに位置する活性セリンを含むトリプシン様触媒三つ組残基と、 加水分解の最中に脂質基質と相互作用し、このリパーゼ構造の脂質触媒ゾーンの 重要な位置に位置する、芳香族アミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基とを含んで 成る親リパーゼのリパーゼ変異体に関連し、ここでこのリパーゼ変異体において 前記アミノ酸残基はこの親リパーゼの比活性に比べて高められたそれをその変異 体に授けるために芳香族アミノ酸残基によって置換されている。

本明細書において、「トリプシン様」なる語は、この親リパーゼかその活性部位 においてトリプシンのそれに対応する触媒三つ組残基、即ち、アミノ酸Ｓｅｒ　 、　Ｈｉｓ及びＡｓｐ　、　Ｇｌｕ　、　Ａｓｎ又はＧｌｎのいづれかを含んで 成ることを示唆している。

リパーゼはトリグリセリドを脂肪酸、グリセロール並びにジー及びモノグリセリ ドへと分解する。このリパーゼ作用は基質の表層の存在下でのリパーゼの界面活 性化に依存する。活性化に基づき、リパーゼはそのコンホメーションを、その活 性部位のまわりの領域における界面疎水性か高まるように変化させる。リパーゼ の界面活性化は例えばＴｉｌｂｅｕｒｇｈら（＋９９３）により述べられている 。

研究したリパーゼは全て少な（とも−の表層ループ構造（蓋又はフラップとも呼 ぶ）を含んで成ることが認められ、これはリパーゼが不活性形態におけるときに 活性セリンを覆っている（かかるリパーゼの例はＢｒａｄｙら、１９９０により 述べられている）。リパーゼが活性化されたとき、そのループ構造はシフトして 活性部位残基を露出させ、強められた表層疎水性を存し、且つ加水分解の最中に 脂質基質と相互作用する活性部位Ｓｅｒを囲む表層をもたらしめる。本目的のた め、この表層は「脂質接触ゾーン」と呼び、この表層内又はその構成部に位置す る任意的にループ構造の形態におけるアミノ酸残基を含むことを意図している。

これらの残基は加水分解の最中の基質とのリパーゼ相互作用に関与し得、ここで そのリパーゼは脂質表層との接触により活性化されたときに脂質相からトリグリ セリドを加水分解する。

この脂質接触ゾーンは脂質基質に対する結合領域（いわゆる結合ポケット）を含 み、これは加水分解前に脂質基質が結合する脂質接触ゾーンの一部である。この 結合領域はいわゆる加水分解ポケットも含み、これは活性部位Ｓｅｒのまわりに あり、そしてそこで脂質基質の加水分解が起こるものと信じられている。今日ま で知られるリパーゼ全てにおいて、その接触ゾーンは、例えば適当なコンピュー タープログラムにより作り出されるリパーゼの三次元構造から容易に認識される 。不活性及び活性化リパーゼそれぞれのコンホメーションを図１に示し、これを 以下で更に説明する。

本明細書において、リパーゼ分子の「重要な位置」はリパーゼ分子の脂質接触ゾ ーンにおける位置であり、これは、脂質基質と相互作用し、且つ芳香族アミノ酸 残基とは異なるアミノ酸残基により古賀的に含まず、且つＳｅｑ　ＩＤ　Ｎｏ、 　２に特定するアミノ酸配列を含んで成るＣ、アンタルクチカリパーゼＡ又はそ の変異体に関連し、その変異体は りリパーゼ活性を有し、 ２　）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　２に示すアミノ酸配列を有するＣ、アンタルク チ力リパーゼの少なくとも−のエピトープと反応性の抗体と反応し、及び／又は 、 ３）Ｃ，アンタルクチ力リパーゼＡをエンコードするＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　１ に示す全もしくは部分ヌクレオチド配列を基礎として調製されたオリゴヌクレオ チドプローブとハイブリダイズするヌクレオチド配列によってエンコードされる 。

本発明のＣアンタルクチ力リパーゼＡは高い熱的安定性及び酸性１１Ｈての活性 を含む数多くの所望の性質を有し、そして例えば下記の手順を利用することによ り、組換ＤＮＡ技術の利用を介して好適に製造されうる。従って、本発明のリパ ーゼＡは、ＷＯ８８１０２７７５に記載の野生梨Ｃ，アンタルクチ力から精製し たＣ、アンタルクチカリパーゼへより高い純度及び多い量で獲得されうる。

更に、本発明は、ＳＥＱ　１０　Ｎｏ、　２に規定のアミノ酸配列を有するＤＮ Ａ配列の改変体に関する。

バーゼＡの変異体は「リパーゼＡ変異体」と呼んでいる。

本発明は上記のリパーゼ変異体をエンコードするＤＮＡ配列を又はＣアンタルク チカリパーゼＡをエンコードするＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ構築体、前記Ｄ ＮＡ構築体を保有する組換発現ベクター、このＤＮＡ構築体又はこの発現ベクタ ーで形質転換された細胞、並びにこのリパーゼ変異体の製造を誘発する条件下で 前記細胞を培養し、その後そのリパーゼ変異体をその培養物から回収することに よってリパーゼ変異体を製造する方法にも関連する。

親リパーゼに比して高められた比活性を有する本発明のリパーゼ変異体はその親 リパーゼと同一の目的のために、好都合にはその高めの比活性に基づき、少ない 量で使用されうる。

従って、本発明は、洗剤酵素としての、消化酵素としての：エステル加水分解、 エステル合成もしくはエステル交換における本発明のリパーゼ変異体の利用；又 は例えば機械バルブを製造するためのプロセスにおける及び機械バルブを使用す る製紙プロセスにおいて生ずるピッチの問題を解決するためのこのリパーゼ変異 体の利用に発明の詳細な開示 上記した通り、本発明は、最適触媒活性にとって、このリパーゼ分子の脂質接触 ゾーンに位置する一定の芳香族アミノ酸、特にトリプトファンの存在が重要であ ることを見い出した。

芳香族アミノ酸残基、そして特にトリプトファン残基の存在の重要性は、脂質接 触ゾーンにおける重要な位置において、即ちＥＰ体において、このトリプトファ ン残基はフェニルアラニン、チロシン、ヒスデジ〉、イソロイノン、グルタミン 酸及びグリシンのそれぞれによって１換さねている。これらの突然変異体の比活 性は、野生梨リパーゼの１００％から、フェニルアラニン突然変異体の約１０％ 、そしてグリシン突然変異体についての約２％にまで低下すること（上記の順で ）が見い出された。

何らの理論に拘束されるわけでもないか、この重要な位置、例えば活性セリンの 上部又はその近くに存在するアミノ酸残基は、ａ）リパーゼの活性化の際にリパ ーゼと基質とから形成される四面体中間体の安定化及びｂ）不活性酵素における 活性セリンを覆う蓋領域の移動の活性化において関与しうるものと現状信じられ ている。トリプトファンがこの位置に存在しているときに、上記のａ）及びｂ） に関係する最適性能が得られるものと考えられている。即ち、トリプトファンは もっとも安定な四面体中間体の形成をもたらしめ（このことは、触媒作用が行わ れるのに必要な活性化エネルギーの低下を意味する）、そして更に任意の触媒作 用が行われるのに必須の蓋の開放の活性化に関係するこの酵素の性能を高めるも のと信じられている。

上記のａ）に関連して、最良に活躍するリパーゼ変異体はその側鎖において不飽 和環系を含むことが認められている。最も大きい不飽和系はトリプトファンであ り、次いでチロシン、フェニルアラニン、そしてヒスチジンである。これらの側 鎖はパイ電子系（「不飽和」）を存し、これは触媒作用におけるプロトン輸送に とって重要であり得、それらは、四面体中間体を作り上げるための低めの活性化 エネルギーをもたらす（蓋の活性化及び開放を経て作り上げられたオキシアニオ ンホールに至る活性部位ヒスチジン−セリンからのプロトン輸送が起こる場合） 。

上記の理論的な説明から、この重要な位置、例えば活性セリンの上部又はその近 くに存在する最適のアミノ酸はトリプトファンであろうことが理解される。とこ ろで、親リパーゼがこの位置において芳香族アミノ酸残基を全く含まない又は側 鎖の中に不飽和環系を育しているアミノ酸残基を全く含まないものであるとき、 かかるアミノ酸をこの位置に置換せしめることが好都合でありうる。

従って、この親リパーゼが、その重要な位置において、側鎖の中に不飽和環系を 含んで成らないアミノ酸残基を有するとき、かかる不飽和環系を有するアミノ酸 残基、例えば芳香族アミノ酸（トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン又 はヒスチジン）をその重要な位置に置換せしめてよい。この親リパーゼの重要な 位置におけるアミノ酸残基かヒスチジンであるとき、それは好都合にはフェニル アラニン、千ロジンそして最も好適にはトリプトファンによって置換せしめてよ く、そのアミノ酸残基がチロシンであるとき、それは好都合にはフェニルアラニ ン、そして最も好適にはトリプトファンによって置換せしめてよく、そしてその アミノ酸残基がフェニルアラニンであるとき、それは好都合にはトリプトファン によって置換せしめてよい。

いくつかのリパーゼにおけるこの重要な位置はその脂質接触ゾーンの中の全ての 位置であると考えられているが、この重要な位置は通常リパーゼ分子の結合ポケ ットの中、そして好ましくはその加水分解ポケットの中に位置するであろう。は とんどのリパーゼにとっては、この重要なアミノ酸残基は活性部位の上部又はそ の近くに位置するものと信じられている。

この位置を占めているアミノ酸残基は、任意のリパーゼにおいて、ｌ）課題のリ パーゼのアミノ酸配列を、活性部位の上部もしくはその近くに位置するアミノ酸 残基が同定されている別のリパーゼのアミノ酸配列と整合させて、前記アミノ酸 残基の推定位置を同定する配列整合研究、及び／又は活性セリンの上部もしくは 近くのアミノ酸配列を同定するためのｌＮ５ＩＧＨＴ　（Ｂｉｏｓｙｍ　Ｔｅｃ ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ、、　ＳａｎＤｉｅｇｏ、　ＵＳＡ）の如きの標準 ディスプレープログラムを利用する課題のリパーゼの三次構造の分析、によって 同定されつる。

より詳しくは、周知の技術に従ってリパーゼ対等物を表示するＩＮｓ　ＩＧＨＴ の如きのコンピュータープログラムを基礎として、このリパーゼのとの部分か脂 質接触ゾーンを含んでいるかを指摘することは簡単である。１）もしリパーゼの 構造が不活性形態にあるとき、この脂質接触ゾーンは活性部位Ｓｅｒの側鎖の誘 導によって同定される。２）もしくはこの構造が活性形態にあるなら、他の残基 とは異なる色て全ての疎水性残基を着色することに基づく同定を更なる基準とす ることかできうる。この構造のｃｐｋモデルを作成するこの手順により、その脂 質接触ゾーンに特異的な疎水性表層が同定されうる。活性部位Ｓｅｒはこの分子 のこのより疎水性な部分の中に位置している。

いくつかのリパーゼにおいては、重要なアミノ酸残基は活性部位を覆っている表 層ループ構造の中に位置しているいか、又は結合ポケットもしくは加水分解ポケ ットの如きの脂質接触ゾーンの表層の一部を構成することが認められているｌも しくは複数の表層ループ構造の中に位置している。

この重要な位置は通常１個のみのアミノ酸残基より成ると考えられるが、更に高 められた比活性を得るため、２個以上の残基を、好ましくは上記で説明した通り トリプトファン残基で置換することが好都合でありうる。

本明細書に開示の改変により、重要な位置の中にトリプトファン残基を有さない 親リパーゼの比活性を２倍以上、例えば３倍以上、そして好ましくは４倍以上、 又は５，６もしくは７倍以上にさえも高めることが可能であると考えられる。

高められた基質特異性を有する本明細書で定義するリパーゼ変異体は様々な起源 の親リパーゼを基礎に調製されうるものと考えられている。即ち、この親リパー ゼの微生物性リパーゼ又は哺乳動物性リパーゼでありうる。

のりパーゼＡであるもの、好ましくはＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　２に示すアミノ酸 配列を存するもの、又は本明細書に定義するそのリパーゼＡ変異体である。この Ｃ，アンタルクチカリパーゼへのリパーゼ変異体は好ましくはＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ ｏ、　２に示すアミノ酸配列を有し、それにおいては親リパーゼのフェニルアラ ニン１３９はトリプトファン残基により置換されている。この変異体の構築及び その性質の分析は実施例３゜５及び６に説明している。

本発明のリパーゼ変異体は、前述した通り、シュードモナス株、例えばＰｓ、フ ラギ（Ｐｓ、　ｆｒａｇｉ）の株に由来する親リパーゼを基礎に調製されつる。

活性セリンの上部又はその近くに位置するトリプトファンとは異なるアミノ酸残 基を有する適当なＰｓ、フラギの例はＡＯＹａｍａら、１９８８に記載されてい る。本発明にかかわるリパーゼ変異体はＳＥＱ　１０　Ｎｏ、　３に示す前記リ パーゼのアミノ酸配列におけるフェニルアラニン残基２９をトリプトファン残基 によって置換することにより構築されうる。

本発明の親リパーゼの構築にとっての親リパーゼとして適当な菌類リパーゼの例 は、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）　、特にＲ，デレマー（Ｒ。

ｄｅｌｅｍａｒ）又はＲ１二へウス（Ｒ，ｎ１ｖｅｕｓ）に由来するものであり 、その後者のアミノ酸配列は例えばＪＰ　６４−８０２９０の中で開示されてい る。

この親リパーゼから本発明にかかわるリパーゼ変異体を構築するため、位置１１ ７にあるアラニン残基をトリプトファンの如きの芳香族アミノ酸残基に置き換え る。Ｒ，ニベウスリパーゼ配列（ＳＥＱ　ＩＤＮｏ、　５）とりシムコール　ミ ーへイリバーゼ配列（トリプトファン残基を含む）　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　 ４）との配列整合を以下に示す。この整合から、Ｒニへウスリパーゼの重要な位 置が決定されつる。

ニベウス　ロゴこｙＯズクより　Ｓζズて乙にＶ力υζ１）ρＩＱ　ＣＲＥＶ　 ６０配列　７０　８０　９０　１００　ｕｏ　１２０璽配列　１３０　１４０　 １５０　１６０　１７０　ｘ８０Ｒｅｓ／配列　四〇　２００　２１０　２２０ 　２３０　２４０冒配列　２５０　２６０　２７０　２８０　２９０　コ０ＯＲ ｅｓ／本発明者は驚くべきことに、非膵臓系リパーゼ、例えば胃、舌又は肝臓リ パーゼは、共通の特徴、即ち、リパーゼ分子の重要な位置、通常は活性セリンの 上部又は近くに位置しているものと同定されたアミノ酸かトリプトファンとは異 なっているという特徴を有することを見い出した。これはこの位置の中にトリプ トファン残基を有することか一般的に見い出されている膵臓系リパーゼとは異な る。従って、本明細書において、本発明のリパーゼ変異体の構築にとっての「親 リパーゼ」として非膵臓系補乳動物性リパーゼが好適に利用されつる。

従って、哺乳動物起源である本明細書に開示するリパーゼ変異体は胃、舌又は肝 臓起源の如きの非膵臓系の親リパーゼから好適に調製されうる。哺乳動物性リパ ーゼはヒト、ラット、マウス、ブタ、イヌ又はその他の哺乳動物に由来しうる。

かがる哺乳動物性リパーゼの特定例には、Ａ２３０４５　（Ｄｏｃｈｅｒｔｙら 、＋９８５）として同定されている配列を有するラットの舌リパーゼ、Ａ２７４ ４２　（Ｋｏｍａｒｏｍｙと５ｃｈｏｔｚ。

１９８７）として同定されている配列を存するラットの肝臓リパーゼ、Ａ３３５ ５３　（Ｄａｔｔａら、＋９８８）として同定されている配列を有するヒト肝臓 リパーゼ、５Ｏ７１４５（Ｂｏｄｍｅｒら、＋９８７）として同定されているヒ トの胃リパーゼ及びＡ３７９１６　（Ｂａｂａら、＋９９１）として同定されて いる配列を有するバイオ　ソルト　アクチベーテッド　リパーゼ（ＢＳＡＬ：　 Ｂｉｏ　５ａｌｔ　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｌｉｐａｓｅ）が含まれ、これらは全 て下記に示す配列整合分析において重要な位置に関して分析されている。この配 列整合研究に含まれている膵臓リパーゼはネズミの膵臓リパーゼＡ３４６７１　 （ＧｒｕｓｂＹら、１９９０）　、ブタの膵臓リパーゼＡＯＯ７３２（Ｃａｒｏ ら、＋９８１）　、ヒトの膵臓リパーゼＡ３４４９４　（Ｌｏｗｅら、＋９８９ ）及び配列Ｂ２４３９２を存するネコの膵臓リパーゼ（Ｍｉｃｋｅｌら、１９８ ９）である。上記した各リパーゼのアミノ酸配列は上記の承認番号を存し、そし て公共的に入手てきるデーターベースから入手できる。

Ａ３７９１６　Ｔｉ’ＧＤＥＤｌ：ＬＹＬ　ｑ、　、　、ＱＶＳＲＤＩ＃　Ｍｒ Ｗｒｉ’ＧＧＡＦＬ　罠［Ａ２３０４５　ＥＶＩ屓エロパ■囮瓶鄭Ｎ玉ｑ囚−■ 出り工に心１．廚ｎ−５Ｏ７１４５［ＥＶＮＲＩＰＹＧＫＫ　ＩＪＳＧｍｊＱＲ ＦＶ　＄　ＡＴ、　、ａＢ２４コ９２　Ｑ　ＴｌＰＳＤＰＳＴＩＥ　ＡＳｌｆｆ ＫＫｒ　ＲＦＴＩ）Ｋ；Ｆ工ＮＫＧＥ、ＥＮＷＬＬ口阿Ａ３４４９４　［ＥＶＡ 、ＡＩ）ＳＳＳ工Ｓ　ＧＷ　ＲＦＩコＧＦｍＫ　ＧＥ、ＥＮＷＩＡＮＶＡ３４６ ７１　’ＤａＱ工ＩＳｋｒＤＰｍ）Ｊ　ＡＳＮＦＱＩｆｉＲＫｒ　ｍＫ　ＧＥ、 ＥＧＷｒＪｊＭＡＯＯ７１２’ＩＸＩ榎罹ＱＥ　ＬＶ、ＡＤＰＳＴｎ”　ＮＳ？ ［ｎＫ　ＧＥ、ｆｌＡＤ５５］　（Ｚ工ＮＱ、、ＧＯ：！　工ｚ工Ｅ口）　Ｅｃ ＧＦＮＳＳＬＰＬ　ＶＭ工工）？ｓＶＤ　＃ルｎコ可Ａ２フ４４２　１０ε５０ ＲＬＧＧ：）　ＬＲＰＱＨＰＥｒＬっ　ＥＯゴＦＮＳＳ）（ＰＬ　ＶＭ工工ＨＧ 讐ｓｖｏ　ＧＬＬ２Ｔｗ工ｗｘゴ９０　ＬＩＯ Ｂ２４：１９２　８．、、、、、、、−ＶＮ　ＣＩＯｎ■ｑ。

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本明細書において、「変異体」なる語は、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　２に示すアミ ノ酸配列を有するＣ　アンタルクデカリパーゼＡに由来するリパーゼＡ変異体又 は天然の変異体を意味することを意図している。典型的には、この変異体は、天 然リパーゼＡとは１もしくは複数個のアミノ酸残基によって相違し、その残基は リパーゼのＮ末端もしくはＣ末端のいづれかもしくは両方で付加もしくは欠失さ れているが、リパーゼのアミノ酸配列内の１もしくは複数の位置で挿入もしくは 欠失されているか、又はリパーゼのアミノ酸配列内もしくはいづれかもしくは両 方の末端で１もしくは複数個のアミノ酸で置換されているものであってよい。

更に、本発明の変異体は上記の１）〜３）の１又は複数の特徴的な性質を存する 。性質ｌ）、即ち、この変異体の「リパーゼ活性」は任意の公知のリパーゼアッ セイ、例えば下記の章の「方法」に記載しである標準のＬＵアッセイを利用して 決定されつる。

性質２）、即ち、本発明の変異体と、下記のＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　２に示すア ミノ酸配列を有するＣ、アンタルクデカリパーゼＡの少なくとも−のエピトープ に対して発生させた又はそれと反応性の抗体との反応性は、例えば本発明のＣ， アンタルクデカリパーゼＡによるウサギの免疫による公知の方法で生産されたポ リクローナル抗体によって決定されうる。この抗体反応性は当業界に公知のアッ セイを利用して決定することができ、その例はウェスタンブロッティング又はラ ジアル免疫拡散アッセイである。

調製されたオリゴヌクレオチドプローブを、標準のハイブリダイゼーション条件 のもとて実施するハイブリダイゼーション実験においてハイブリダイゼーション プローブとして使用することにより調べることかてきうる。例えば、かかる条件 は、例えば５ＸのＳＳＣの中での予ｉ浸漬並びに２０％のホルムアミド、５Ｘの デンハーツ溶液、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６，８及び５０μｇの変性 音波処理済修生胸腺ＤＮＡの溶液の中での〜４０°Ｃての１ｈにわたる予備ハイ ブリダイゼーション、それに続＜１００μＭのＡＴＰの補足された同一の溶液の 中での〜４０°Ｃて１８ｈにわたるハイブリダイゼーション、又は例えばＳａｍ ｂｒＯＯｋら、１９８９により述へられているその他の方法を含む特定の条件下 でのハイブリダイゼーションである。

オリゴヌクレオチドプローブを調製する基礎にするヌクレオチド配列はＳＥＱ　 ＩＤ　Ｎｏ、　ｌに示すＤＮＡ配列であることが好都合である。

上記した通り、更なる観点において、本発明はＳＥＱ　［Ｄ　Ｎｏ、　２に示す アミノ酸配列を有するＣ、アンタルクデカリパーゼＡをエンコードするＤＮＡ配 列又はＣ，アンタルクデカリパーゼＡの変異体をエンコードする前記ＤＮＡ配列 の改変体に関連し、この変異体は、１）リパーゼ活性を有する、 ２）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　２に示すアミノ酸配列を有するＣ、アンタルクデ カリパーゼＡの少なくとも−のエピトープと反応性の抗体と反応する、に示す全 又は部分ヌクレオチド配列を基礎にして調製したオリゴヌクレオチドプローブと ハイブリダイズするヌクレオチド配列によってエンコードされる。

ＤＮＡ配列の適当な改変の例は、別のエンコード化酵素のアミノ酸配列をもたら しめないが、そのＤＮＡ配列を導入する宿主生物のコドン用法に対応しつるヌク レオチド置換、又は別のアミノ酸配列をもたらしめるが、しかしながらその酵素 の上記の性質を損うことのないヌクレオチド置換である。可能な改変のその他の 例は、その配列の中への１又は複数個のヌクレオチドの挿入、その配列のいづれ かの末端での１又は複数個のヌクレオチドの付加、及びその配列の末端もしくは その中での１又は複数個のヌクレオチドの欠失である。

本発明のリパーゼ変異体の製造の方法 遺伝子への突然変異の導入のためのいくつかの方法が当業界に公知である。リパ ーゼをエンコードするＤＮＡ配列のクローニングの簡車な説明の後に、リパーゼ をエンコードする配列の中の特定の部位に突然変異を発生させるだめの方法を説 明する。

八をエンコードするＤＮＡ配列は当業界に公知の様々な方法により、課題のリパ ーゼを産生ずる任意の細胞又は微生物から単離することができつる。まず、ゲノ ムＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡライブラリーを、研究すべきリパーゼを産生ずる生 物由来の染色体ＤＮＡ又はメツセンジャーＲＮＡを使用して構築すべきである。

次に、もしリパーゼのアミノ酸配列が公知であるなら、相同性のラベル化オリゴ ヌクレオチドプローブを合成することができ、そしてそれを細菌ＤＮＡのゲノム ライブラリー又は菌類ｃＤＮＡライブラリーからリパーゼをエンコードするクロ ーンを同定するのに利用することができる。他方、別の細菌又は菌類の株に由来 するリパーゼに対して相同性の配列を含むラベル化オリゴヌクレオチドプローブ を、低緊縮のハイブリダイゼーション及び洗浄条件を利用してリパーゼをエンコ ードするクローンを同定するプローブとして使用することができる。

リパーゼ産生クローンを同定するための更なる別の方法は、ゲノムＤＮＡのフラ グメントを発現ベクター、例えばプラスミドに挿入し、得られるゲノムＤＮＡラ イブラリーでリパーゼ陰性細菌を形質転換させ、次いてこの形質転換細菌をリパ ーゼにとっての基質を含む寒天の上で平板培養することを含む。リパーゼ担持プ ラスミドを含むその細菌は、分泌されたリパーゼによる基質の消化に基づき透明 な寒天の輪によって囲まれたコロニーを提供するであろう。

他方、この酵素をエンコードするＤＮＡ配列は樹立されている方法、例えばＳ、 　Ｌ、　ＢｅａｕｃａｇｅとＭ、　Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　（１９８１）によ り述べられているホスホアミジット法又はＭａｔｔｈｅｓら（１９８４）により 述べられている方法によって合成的に調製されうる。ホスホアミジット法に従う と、オリゴヌクレオチドを例えば自動ＤＮＡ合成装置で合成し、精製し、アニー ルし、リゲートし、そして適当なベクターの中にクローンする。

最後に、このＤＮＡ配列は、標準の技術に従い、合成、ゲノム又はｃＤＮＡ起源 （適宜）のフラグメントをリゲートすることによって調製した混合型のゲノム及 び合成、混合型の合成及びｃＤＮＡ又は合成型のゲノム及びｃＤＮＡ起源であっ てよく、それらフラグメントは全ＤＮＡ配列の様々な部分に対応している。この ＤＮＡ配列は例えばＵＳ　４．６８３．２０２又はＲ，Ｋ、　５ａｉｋｉ　ら（ １９８Ｂ）に記載の特異的なプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ ）によっても調製されうる。

リパーゼをエンコードする配列の部位特異的突然変異誘発リパーゼをエンコード するＤＮＡ配列が単離でき、そして突然変異のために所望される部位が同定でき たら、合成オリゴヌクレオチドを利用して突然変異を導入することができつる。

これらのオリゴヌクレオチドは所望の突然変異部位にフランクするヌクレオチド 配列を含む、突然変異ヌクレオチドはオリゴヌクレオチド合成中に挿入する。特 定の方法において、リパーゼをエンコードする配列を橋渡しするＤＮＡの一本鎖 ギャップを、リパーゼ遺伝子を担持するベクターの中で作り上げる。次に、所望 の突然変異を抱える合成ヌクレオチドを一本＠　ＤＮＡの相同性部分にアニール する。次いで残りのギャップをＤＮＡポリメラーゼＩ（フレノウフラグメント） で補完し、そしてその構築体をＴ４リガーゼを用いてリゲートする。この方法の 特定の例はＭｏｒｉｎａｇａら（１，９８４）に記載されている。米国特許第４ ．７６０．０２５号は、カセットの微妙な変更を行うことによる複数の突然変異 をエンコードするオリゴヌクレオチドの導入を開示しているが、しかしながらＭ ｏｒｉｎａｇａの方法によればより大きな様々な突然変異をいつでも一度に導入 することができ、その理由は様々な長さの複数のオリゴヌクレオチドを導入でき るからである。

リパーゼをエンコードする配列への突然変異の導入の別の方法は、Ｎｃｌｓｏｎ とＬｏｎｇ　（１９８９）に記載されている。これは、ＰＣＲ反応における−の プライマーとして化学的に合成されたＤＮＡ　ｉｌｌを利用することにより導入 した所望の突然変異を含むＰＣＲフラグメントの３段階作成を包括している。Ｐ ＣＲ作成フラグメントから、突然変異を担持するＤＮＡフラグメントを制限エン ドヌクレアーゼによる切断によって単離することができ、そして発現プラスミド の中に再挿入することかできる。

リパーゼ変異体の発現 本発明に従い、Ｃ，アンタルクチ力リパーゼＡをコードする配列又は上記の方法 もしくは当業界に知られる任意のその他の方法により製造された突然変異型リパ ーゼをコードする配列は、酵素の形態において、プロモーター、オペレーター、 リポソーム結合部位、翻訳開始シグナル及び任意的にリプレッサー遺伝子もしく は様々なアクチベーター遺伝子をエンコードするコントロール配列を典型的に含 んでいる発現ベクターを用いて発現させることができうる。発現されたタンパク 質の分泌を可能にするため、「シグナル配列」をエンコードするヌクレオチドを リパーゼをコートする配列の前に挿入してよい。コントロール配列の誘発のもと ての発現のため、本発明に従って処理すべき標的遺伝子は適切な読み取り枠の中 のコントロール配列に作動連結されている。プラスミドベクターの中に組込まれ ることかでき、且つ突然変異リパーゼ遺伝子の転写を助けることのできるプロモ ーター配列には、限定することなく、原核系β−ラクタマーゼプロモーター（Ｖ ｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら（１９７８）　”）及びｔａｃプロモーター（Ｄ ｅＢｏｅｒら、１９８３）が含まれる。更なる参考がｒＵｓｅｆｕｌｐｒｏｔｅ ｉｎｓ　ｆｒｏｍ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｂａｃｔｅｒｉａＪ　（１９８０ ）の中に見い出すこを、リパーゼＡ又は突然変異型のＤＮＡを担持する発現ベク ターによ題のＤＮＡ配列の前にあってよい。このシグナル配列は発現産物を細胞 壁まで輸送するのに働き、そこでその配列は分泌に基づきその産物から切り離さ れる。本明細書で定義する「コントロール配列」なる語は、存在しているならシ グナル配列を含むことを意図している。

本発明のリパーゼ又はリパーゼ変異体は宿主細胞として酵母細胞を用いることに よっても製造されうる。適当な酵母宿主細胞の例に本発明のリパーゼＡ又はリパ ーゼ変異体を製造する現状好適な方法において、宿主生物として糸状菌類を使用 する。この糸状菌類宿主生物は便宜上、組換タンパク質を製造するための宿主と して今まリザの利用は例えばＥＰ　２３８，０２３号に詳しく述べられている。

Ａ又はリパーゼ突然変異体についてコードするＤＮＡ配列にプロモーターが先行 している。このプロモーターはアスペルギルスの中で強い転写活性を発揮し、且 つ細胞外又は細胞内タンパク質、例えばアミラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテ アーゼ、リパーゼ、セルラーゼもしくは解糖酵素をエンコードする遺伝子に由来 しうる任意のＤＮＡ配列であってよい。

一ゼをエンコードする遺伝子に由来するものである。

揮するからである。ＴＡＫＡアミラーゼプロモーターの配列はＥＰ　２３８，０ ２３号より明らかとされている。

終止及びポリアデニル化配列はそのプロモーターと同じ起源に由来するものが適 当でありうる。

菌類宿主細胞を形質転換するために用いる技術はＥＰ　２３８，０２３号に適切 に記載されている場合がある。

宿主細胞からのリパーゼＡ又はリパーゼ変異体の分泌を確実なものとするため、 リパーゼ変異体をエンコードするＤＮＡ配列には、天然のシグナル配列もしくは その機能部分又はその細胞からタンパク質を分泌を担う合成配列か先行していて よい。特に、このシグナル配列はアスペルギルス種のアミラーゼもしくはグルコ アミラーゼをエンコードする遺伝子、リゾムコール　ミーヘイのリパーゼもしく はプロテアーゼをエンコードする遺伝子、又はヒュミコラのセルラーゼ、キシラ ナーゼもしくはリパーゼをエンコードする遺伝子に由来しつる。このシグナル配 列は好ましくはＡ、オリザＴＡＫＡアミラーゼ、Ａ、ニガー中性α−アミラーゼ 、Ａ、ニガー酸安定性α−アミラーゼ又はＡ、ニガーグルコアミラーゼに由来す る。

形質転換宿主細胞を培養するために用いた培地は、アスペルギル各細胞を培養す るのに適当な任意の慣用の培地であってよい。この形質転換体は通常安定であり 、そして淘汰圧抜きで培養されつる。

しかしながら、もしその形質転換体が不安定であると認められたら、細胞の中に 導入する選択マーカーを選択のために使用してよい。

宿主細胞から分泌させた成熟リパーゼタンパク質は、遠心又は濾過により培地か ら細胞を分離させる、次いで硫酸アンモニウムの如きの塩によってその培地のタ ンパク質性成分を沈殿させる、それに続いてクロマトグラフィー手順、例えばイ オン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を含む公知 の手順によって、培養培地から好適に回収することかできうる。

本発明のリパーゼ変異体は、向上した比活性を伴って、その親すバーセと同タイ プの基質に対して活性であると考えられる。従って、本発明のリパーゼ変異体は その親リパーゼと同一の目的のために作用であると考えられる。

従って、洗剤酵素として有用な親リパーゼから調製した本発明のリパーゼ変異体 は洗剤添加剤又は洗剤組成物中の活性成分として使用されうる。

本発明のリパーゼ変異体の別の考えられる用途は、例えば嚢胞性繊維症の処置に おける消化酵素としてである。

本発明のリパーゼ変異体、特にＣ，アンタルクチカリバーゼの変異体の第三の用 途は、リパーゼ触媒化工程、例えばエステル加水分解、エステル合成及びエステ ル交換における用途にある。これらの工程の中てのリパーゼの用途は、内容を引 用することで本明細書に組入れるＷＯ８８１０２７７５（Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉ ｓｋ　Ａ／Ｓ）に詳しく述べられている。

更に、Ｃ，アンタルクチ力は非特異的なリパーゼであるため、これは例えばマー ガリンの製造におけるランダム化のために使用されつる。本発明のリパーゼ変異 体は、内容を引用することで本明細書に組入れるＰＣＴ／ＤＫ９２１０００２５ 　（Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ／Ｓ）に記載の通り、機械バルブについての 製造工程又は機械バルブを使用する製紙工程において生じるピッチの問題を解消 するために用いることができうる。

図面の簡単な説明 本発明を添付図面を参考に下記で説明し、ここで図１は、Ｗｏ　９２１０５２４ ９に記載のＨラヌギノーザリバーゼが不活性（閉じた）及び活性（開いた）形態 のそれぞれのときのそのリパーゼの脂質接触ゾーンの三次元構造を示している。

「白色」の残基は疎水性のアミノ酸（Ａｌａ、　Ｖａｌ、　Ｌｅｕ、Ｉｃｅ、　 Ｐｒｏ、　Ｐｈｅ、　Ｔｒｐ、　Ｇｌｙ及びＭｅｔ）を表わし、［黄色ｊの残基 は親水性のアミノ酸（Ｔｈｒ、　Ｓｅｒ。

Ｇｌｎ、　Ａｓｎ、　Ｔｙｒ及びＣｙｓ）を表わし、「青色」の残基は正荷電ア ミノ酸（Ｌｙｓ、　Ａｒｇ及びＨｉｓ）を表わし、そして「赤色」の残基は負荷 電アミノ酸（Ｇｌｕ及びＡｓｐ）を表わしている。

図２及び３は発現プラスミドｐＭＴ１２２９の構築のための図式を示している（ 実施例１参照のこと）。

本発明を下記の実施例で更に説明するか、それらは本発明の範囲を限定すること は意図しない。

材料 プラスミド及び微生物 ｐＢｏｅ　１７７７　（ｐ７７７）　（ＥＰ　Ｏ，４８９，７１８に記載）ｐ７ ７５　（ソ（７）構築はＥＰ　０．２３８．０２３に記載）ｐＩｃＩ９Ｈ（Ｍａ ｒｓｈ　ら、Ｇｅｎｅ　３２　（１９８４）、ｐｐ、４８１−４８５）ｐＴｏｃ ９０　（Ｗｏ　９１／＋７２４３に記載）アスペルギルス　オリサ　Ａ１５６０ 　：　ＩＦＯ４１７７Ｅ　コリＭＴ１７２　（Ｋ１２制限欠陥（７）Ｅ、：＋す ＭＣ１０００誘導体）−膜力法 リパーゼ遺伝子の部位特異的インビトロ突然変異誘発リパーゼ遺伝子の中に突然 変異を導入するために、ＷＯ９２１０５２４９に記載の３通りの異なる手法、即 ち、ＺｏｌｌｅｒとＳｍ１ｔｈのＤＮＡ、　Ｖｏｌ。

３、　Ｎｏ、　６．４７９−４８８　（＋９８４）により述べられているオリゴ ヌクレオチド部位特異的突然変異誘発、Ｎｅ１ｓｏｎとＬｏｎｇのＡｎａｌｙｔ ｉｃａｌ　ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒＹ。

１８０、１４７−１５１　（１９８９）　ｉ：記載（７）　ＰＣＲ法、及びいわ ゆる「カセット突然変異誘発ｊ技術（それにおいては、リパーゼをエンコードす る領域の２つの制限部位の間のセグメントを、所望の突然変異を担持する合成り ＮＡフラグメントによって置換する）を利用してよい。後者の技術の利用を実施 例２に例示している。

リパーゼ比活性の決定 リパーゼの活性は、基質としてグリセリン　トリブチレート（ｔｒｉｂｉｒａｔ ）及び乳化剤としてアラビアゴムを用いてアッセイした。

ＩＬｔＪ（ＩＪハーゼ単位）ハ３０″Ｃ，ｐＨ７，０１１分当り１μｍｏｌの滴 定可能な酪酸を遊離せしめる酵素の量である。リパーゼ活性はＲａｄｉｏｍｅｔ ｅｒ滴定器ＶＩＴ　９０　（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ、　Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ） を用いるｐＨ−スタットによりアッセイした。このアッセイの更なる詳細は注量 に応じて入手できるＮｏｖｏ　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｃｌ　ＡＦ　 ９５１５に示している。

実施例 実施例１ 年９月２９日にＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒ ｇａｎｉｓｍ　（ＤＳＭ）に寄託＝ＤＳＭ　３８５５）の染色体ＤＮＡを、凍結 細胞の石英による粉砕、それに続＜Ｙｅｌｔｏｎら（＋９８４）に本質的に記載 の通りの抽出による開裂によって調製した。精製ＤＮＡをＳａｕ　３Ａで部分的 に切り、そしてアガロースゲル電気泳動の後、３〜９ｋｂの範囲におけるフラグ メントを単離した。サイズ分別したＳａｕ　３ＡフラグメントをＢａｍＨＩ切断 した脱リン酸化プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａ ｂｓ）にリゲートさせた。

のインサートを含んでいた。

標準のコロニーハイブリダイゼーション技術Ｑ１１１ｉａｔｉｓら、１９８２） を利用し、それらのコロニーを３２２−リン酸化オリゴヌクレオチドプローブＮ ＯＲ４４０（ＳＥＱ　１０　Ｎｏ、　７）でスクリーンした。ＮＯＩ？　４４０ は成熟Ｃアンタルクチ力リバーゼＡより決定されたＮ−末端を基礎とする縮重（ ６４）　＋７量体である（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　２）　、低緊縮（４１’Ｃ及 び６Ｘの５ＳＣ）ての洗浄の後に３４のコロニーが陽性であることが認められた 。これらのコロニーからプラスミドを調製し、そしてＢｓｔＮＩによる制限処理 の後にササン分析した。サザン図のプローブはコロニーハイブリダイゼーション （前述）のために用いたＮＯＲ４４０プローブ（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　７）又 は３２１−ラベル化プローブＮＯＲ４３８（ＳＥＱ　ＩＤＮｏ、　６）とした。

ＮＯＲ４３８はオリゴヌクレオチド（推定量体Ｃｇｕｅｓｓｍｅｒ　）　）であ り、１３個の位置において、塩基は酵母及び糸状菌類に利用されているコドンを 基礎として選ばれている。

推定位置を表示 −のプラスミドｐＭＴＩ０７６のみが、低緊縮（前述）においてＮＯＲ４４０に 及び若干高めの緊縮（５５°Ｃ及びＩＸのＳ　Ｓ　Ｃ，）においてＮＯＲ４３８ にハイブリダイズするバンドを含んでいた。

ｐＭＴｌ、０７６を制限地図化し、そしてそのＤＮＡ配列をＭａｘａｍ−Ｇｉｌ ｂｅｒ法により決定した。解放読み取り枠を包括する配列をＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ 、　１に示す。解放読み取り枠は２１個のアミノ酸の推定シグナル配列（ｖａｎ Ｈｅｉｎｅの法則に従う（ｖｏｎ　ｌ１ｅｉｊｎｅ、　Ｇ、　（１９８６））） 　、そして更に成熟リパーゼのＮ−末端に先行する１０個のアミノ酸のプロペプ チドをエンコードする。このプロペプチドの最後の２個のアミノ酸はＡｒｇＡｒ ｇ　、即ち、Ｓ、セレヒジェＫＥＸ−２型の酵素によるエンドタンパク質分解プ ロセスのための典型的な切断部位である。このＤＮＡ配列によりエンコードされ る成熟タンパク質のアミノ酸組成（位置３２で開始）はＣアンタルクチヵリバー ゼへについて決定されたアミノ酸組成と一致する。下記の表を参照のこと：表　 ■ Ｃ，アンタルクチ力　リパーゼＡ　（ｃＡＬＩＰ）のアミノ酸組成りＮＡ配列よ り推定　アミノ酸分析による（ＭＣ）図２及び３に示すいくつかの標準のプラス ミド操作（Ｍａｎｉａｔｉｓら、＋９８２）を介し、Ｃアンタルクチカリバーゼ への解放読み取り枠をルコアミラーゼ転写ターミネータ−との間に適正な配向て 置いた。

得られる発現プラスミドｐＭＴ＋２２９をＥＰ　３０５，２１６号に記載の通り にΔ。

転換体を単離して増殖させ、そして培養土漬物をＣアンタルクチカリバーゼへの 存在について分析した。

実施例２ ラスミドの構築 ２４６　ｂｐのＢａｍＨＩ　／　Ｂｓ５）］　ＩＩフラグメントを、ＰＣＲ反応 においてオリゴヌクレオチドブライマー３１１６及び３１１７を用い、ｐＭＴ　 １２２９のヌクレオチド配列を基礎としてインビトロで合成した。プライマー３ １１７はＢｓ５ＨＩＩ制限部位と、星印で表示している１３５のｐｈｅコドン（ ＴＴＣ）〜ｔｒｐコドン（ＴＧＧ）における突然変異とを含む。

才’Ｊ　コヌ’ｙ　しｔナトｌライマー　３１１６　（Ｆ１３５Ｗ　：　２５６ −２７６）　（ＳＥＱ　１ＯＮｏ、　８） ５’　−ＣＡＧ　ＡＡＣＧＡＧ　ＧＣＧ　ＧＴＧ　ＧＣＣＧＡＣ−３’ｔｌＪ： ｌ）りり、ｉチドブ−７イア　−３１１７（Ｆ１３５Ｗ　：　５６６−４８７） 　（ＳＥＱ　ＩＤＮｏ、　９） ５°−ＴＴＣＴＴＧ　ＡＧＣＧＣＧ　ＣＧＧ　ＡＴＧ　ＣＣＧ　ＴＣＧ　ＡＧＧ 　ＡＴＡ　ＧＣＣＡＴＧ　ＣＣＣＴＣＴＴＣＧ　ＴＡＧ　ＣＣＡ　ＧＣＧ　ＡＴ Ｇ　ＡＡＧ　ＧＣＧ　ＧＣＴ　ＴＴＣ＊　ＣＲＡＧ　ＣＣＴ　ＴＣＧ　ＴＧ−３ ゜ＰＣＲ反応は、下記の成分を混合し、そしてその混合物をＩＩＹＢＡＩＤ（商 標）熱反応器の中でインキュベートすることにより実施した。

得られる３１０　ｂｐのフラグメントを電気泳動後の２％のアガロースゲルから 単離し、そしてＢａｍ１ｌ　ｒ及びＢｓ５ＨＩＩ制限酵素で消化した。得られる ２６４　ｂｐのＢａｍＨＩ　／　Ｂｓ５ＨＩＩフラグメントを同様に２％のアガ ロースゲルから単離した。次にこのフラグメントを以下のものとリゲートさせた 。

ｐＭＴＩ２２９　ＢａｍＨＩ　／Ｘｂａ　Ｉ　Ｏ，３ｋｂｐＭＴＩ２２９　Ｂｓ ５ＨＩＩ　／Ｓｐｈ　Ｉ　０．５　ｋｂｐＭＴ１２２９　Ｓｐｈ　ｒ　／Ｘｂａ 　Ｉ　５．　ＯｋｂリゲートさせたＤＮＡをＥ、コリ株ＭＴ１７２に形質転換さ せた。適正なインサートを含む形質転換体を選び、そしてそのＤＮＡ配列を５ｅ ｑｕｅｎａｓ　（ＩＪｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の利用により決定した。−の得られるプラスミド（ｐＭ Ｅ−１１７８）はアミノ部位１３５における突然変異を含んでいた（　ｐｈｅは ｔｒｐに突然変異していた）。

ｐＭＥ１１７８を、選択マーカーとしてＡ　ニドウランス由来のａｍｄｓ遺伝子 を含むｐＴｏｃ９０と共に、Ａ、オリザＡ１５６０株の中に、ＷＯ９１／１７２ ４３に記載の手順を利用して同時形質転換させた。Ａ、オリザ形質転換体を選択 プレート上で２回再単離し、そして安定な形質転換体は抗−カンジダリパーゼＡ 抗体を使用してロケット免疫電気泳動により特性化した。形質転換体（株ＭＥＡ ６５）により産生されたカンジダリパーゼＡを比活性について更に分析した。

実施例３ カンジダ　アンタルクチ力リバーゼＡのＦ１３９Ｗ変異体を発現するプラスミド の構築 ２４６　ｂｐのＢａｍＨＩ　／　Ｂｓ５ｔｌ　ＩＩフラグメントを、ＰＣＲ反応 においてオリゴヌクレオチドブライマー３１１６及び３８２６を使用して、プラ スミドｐＭＴＩ２２９のヌクレオチド配列を基礎としてインビトロで合成した。

プライマー３８２６はＢｓ５ｌｉＩ［制限部位と、星印で表示している１３９　 ｐｈｅコドン（ＴＴＣ）〜ｔｒｐコドン（ＴＧＧ）における突然変異とを含む。

オリゴヌクレオチドブライマー３１１６は実施例２に示している。

オリゴヌクレオチドブライマー３８２６　（Ｆ１３９Ｗ　：　５６６−４８７） 　（ＳＥＱ　ＩＤＮｏ、　１０） ５’　−ＴＴＣＴＴＧ　ＡＧＣＧＣＧ　ＣＧＧ　ＡＴＧ　ＣＣＧ　ＴＣＧ　ＡＧ Ｇ　ＡＴＡ　ＧＣＣＡＴＧ　ＣＣＣＴＣＴＴＣＧ　ＴＡＧ　ＣＣＡ　ＧＣＧ　Ａ ＴＣ＊　Ｃ本ＡＧ　ＧＣＧ　ＧＣＴ　ＴＴＧ　ＡＡＧ　ＣＣＴ　ＴＣＧ　ＴＧ− ３’ＰＣＲ反応は実施例２記載の方法により実施した。３１０　ｂｐのフラグメ ントを、電気泳動後の２％のアガロースゲルから単離し、そしてＢａｍＨＩ及び Ｂｓ５ｔ（Ｉ［制限酵素により消化した。得られる２６４　ｂｌ）のＢａｍＨＩ ／Ｂｓ５ＨＩ［フラグメントを同様に２％のアガロースゲルから単離した。

次にこのフラグメントを下記のものとリゲートさせた；ｐＭＴ１２２９　Ｂａｍ ＨＩ　／χｂａＩ　０．３ｋｂｐＭＴ１２２９　Ｂｓ５ＨＩ［／Ｓｐｈ　Ｉ　０ ．５　ｋｂｐＭＴＩ２２９　Ｓｐｈ　Ｉ　／Ｘｂａ　Ｉ　５．　Ｏｋｂリゲート したＤＮＡをＥ、コリ株ＭＴ１７２に形質転換させた。適正なインサートを含む 形質転換体を選択し、そしてそのＤＮＡ配列を５ｅｑｕｅｎａｓ　（Ｕｎｉｔｅ ｄ　５ｔａｔｅｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の利用 により決定した。−の得られるプラスミド（ｐＭＥ−１２２９）はアミノ部位１ ３９において突然変異を含んでいた（　ｐｈｅはｔｒｐに突然変異していた）。

ｐＭＥ１２２９を、選択マーカーとしてＡ　ニドウランス由来のａｍｄｓ遺伝子 を含むｐＴｏｃ９０と共に、Ａ、オリザＡ１５６０株に同時形質転換させた。Ａ ６オリザ形質転換体を選択プレート上で２回再単離し、そして安定な形質転換体 （！、ｌＥＡ　１５５）の酵素活性を実施例５に記載の通りに基質としてトリブ チレンを使用することにより分析した。

実施例４ カンジダ　アンタルクチ力リパーゼＡのＦ１３５Ｗ／Ｆ１３９Ｗ変異体を発現す るプラスミドの構築 ２４６　ｂｐのＢａｍＨＩ　／　Ｂｓ５ＨＩＩフラグメントを、ＰＣＲ反応にお いてオリゴヌクレオチドブライマー３１１６及び４２２４を使用して、インビト ロで合成した。プライマー４２２４はＢｓ５ｌｌＩ［制限部位と、星印で表示し ている＋３５及び１３９のｐｈｅコドン（ＴＴＣ）〜ｔｒｐコドン（ＴＧＧ）に おける突然変異とを含む。

オリゴヌクレオチドブライマー３１１６は実施例２に示している。

オリゴヌクレオチドブライマー４２２４　（Ｆ１３５Ｗ　：　５６６−４８７） 　（ＳＥＱ　ＩＤＮｏ、ＩＩ） ５“−ＴＴＣＴＴＧ　ＡＧＣＧＣＧ　ＣＧＧ　ＡＴＧ　ＣＣＧ　ＴＣＧ　ＡＧＧ 　ＡＴＡ　ＧＣＣＡＴＧ　ＣＣＣＴＣＴＴＣＧ　ＴＡＧ　ＣＣＡ　ＧＣＧ　ＡＴ Ｃ＊　（ＪＡＧ　ＧＣＧ　ＧＣＴ　ＴＴＣ＊　（ＪＡＧ　ＣＣＴ　ＴＣＧ　ＴＧ −３゜ＰＣＲ反応は実施例２記載の方法により実施した。３１０　ｂｐのフラグ メントを、電気泳動後の２％のアガロースゲルから単離し、そしてＢａｍ１ｉ　 Ｉ及びＢｓ５ＨＩ［制限酵素により消化した。得られる２６４１）ｐのＢａｍＨ Ｉ／Ｂｓ５ＨＩＩフラグメントを同様に２％のアガロースゲルから単離した。

次にこのフラグメントを下記のものとリゲートさせた：ｐＭＴ１２２９　Ｂａｍ ｔｌ　Ｉ　／Ｘｂａ　Ｉ　０．３　ｋｂｐＭＴ＋２２９　８ｓｓＨＩ［／Ｓｐｈ 　Ｉ　Ｏ，５ｋｂｐＭＴ１２２９　Ｓｐｈ　Ｉ　／Ｘｂａ　Ｉ　５．０　ｋｂリ ゲートしたＤＮＡをＥ、コリ株ＭＴＩ７２に形質転換させた。適正なインサート を含む形質転換体を選択し、そしてそのＤＮＡ配列を５ｅｑｕｅｎａｓ　（Ｌｌ ｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ）の利用により決定した。−の得られるプラスミド（ｐＭＥ−１２３０）はアミ ノ部位１３５及び１３９において突然変異を含んでいた（　ｐｈｅはｔｒｐに突 然変異していた）。

ｐＭＥ＋２３０を、選択マーカーとしてＡ　ニドウランス由来のａｍｄｓ遺伝子 を含むｐＴｏｃ９０と共に、Ａ、オリザＡ１５６０株に同時形質転換させた。Ａ 　オリサ形質転換体を選択プレート上で２回再単離し、そして安定な形質転換体 の酵素活性を実施例５に記載の通りに基質としてトリブチレンを使用することに より分析した。

実施例５ Ｃアンタルクチ力リバーゼＡ変異体Ｆ１３９Ｗ及びＦ１３５Ｗ／Ｆ１３９Ｗの精 製、並びにその親好生型Ｃ，アンタルクチ力リバーゼＡとの比活性の比較 実施例３，４及び１のそれぞれに記載の通りに製造したリパーゼ変異体及び親リ パーゼを下記の４段標準精製手順を利用して精製した。

段階１．上記の実施例１及び３に記載の形質転換Ａ　オリザ細胞を培養すること により得られるリパーゼ及びリパーゼ変異体のそれぞれを含む発酵培地を遠心し 、そしてその上清液をｐＨ７に合わせた。

イオン強度は２ｍＳｉに合わせた。ＤＥＡＥ−３ｅｐｈａｄｅｘ　Ａ−５０（Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ）ゲルを膨潤させ、そして２５ｎ＋ＩＪのトリス酢酸バッファ ーｐ１１７で平衡にした。その発酵上清液を焼結ガラスろう斗上のＤＥＡＥ−３ ｅｐｈａｄｅｘ　Ａ−５０に通した。リパーゼ活性を含む溶出物を集め、そして ０．８Ｍの酢酸アンモニウムに合わせた。

段階２．適当なカラムにＴＳＫゲルブチル−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　６５０Ｃを充 填し、そして０．８Ｍの酢酸アンモニウムで平衡にした。リパーゼ活性を含む溶 出物をそのカラムに適用した。結合物質を水で溶離させた。

段階３：リパーゼ含有溶離液を次に高性能Ｑ　−５ｅｐｈａｒｏｓｅカラムに載 せた。リパーゼ活性物を溶出物として集めた。この方法により精製したリパーゼ を２８０　ｎｍて光学密度１に濃縮した。

リパーゼの純度を５ＤＳ−ＰＡＧＥによりチェックし、約４５ｋＤの分子量を存 する一本のバンドが示された。リパーゼ活性は「−膜力法」の章に概略した方法 の利用により決定した。

親野生童リパーゼのリパーゼ活性は３００　ＬＵ１０Ｄ２．。であり、それｔ、 対してリパーゼ変異体ＦＩ３９Ｗについては１２００ＬＵ／　ＯＤ　、、。てあ った。

挿入したトリプトファンについての補正抜きでのＯＤｔ＊。吸収に基づき、この 突然変異体の比活性は利用したアッセイでは少なくとも４倍高かった。リパーゼ 変異体Ｆ１３５Ｗ／Ｆ１３９Ｗのリパーゼ活性は１４００ＬＵ１０Ｄ、。であっ た（２つの追加のトリプトファンについての補正抜き）。

実施例６ カンジダ　アンタルクチカリバーゼＡ及びその突然変異体Ｆ１３９Ｗの熱安定性 Ｃ，アンタルクチ力リバーゼＡ及びＣ，アンタルクチカリパーゼム変異体の熱安 定性を、様々なｐＨにおいて示差走査熱量計（ＤＳＣ）により調べた。この技術 を利用し、熱変性温度Ｔｄを一定のプログラム率で酵素溶液を熱することにより 決定した。

より詳しくは、この調査のためにＭｉｃｒｏＣａｌ　Ｉｎｃ、由来の示差走査熱 量計ＭＣ−２Ｄを使用した。酵素溶液は５０ｍＭのバッファー溶液の中で調製し た。下記の表を参照のこと。酵素濃度は０．６〜０．９　ｍｇ／ｍｌの範囲にし 、そして各実験について約１．２ｍｌの総容量を使用した。全てのサンプルを９ ０°Ｃ／ｈｒのスキャン速度で２５°Ｃから９０°Ｃまで熱した。

この分析から得られた結果を下記の表に示す：ｃ；ａｎ＋　リパーゼ　Ａ　（Ｗ Ｔ） Ｃ，ａｎｔ　リパーゼ　Ａ　突然変異体（ＦＩ３９Ｗ）０存在する酵素分子の約 半分が加熱中に熱変性した温度の熱安定性にとってのｐｌ（最適性が異常に低く 、そして両酵素が１）Ｈ７より下で非常に熱安定性であることを示す。調べた範 囲内では、野生型及び突然変異体ＦＩ３９Ｗの両者の熱安定性はｐＨが低まるほ ど高まっていた。このことは、両リパーゼが比較的低いｐＨ値での異常なほどの 高温での加水分解／合成に非常によく適するものとする。

本願における引用文献 Ｗｉｎｋｌｅｒ、Ｆ、Ｋ、ら、（１９９０）、５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｈｕ ｍａｎ　ＰａｎｃｒｅａｔｉｃＬｉｐａｓｅ、　Ｎａｔｕｒｅ、　Ｖｏｌ、　３ ４３．７７１−７７４　；Ｓｃｈｒａｇ、Ｊ、Ｄ、ら、（１９９１）、５ｅｒ− Ｈｉｓ−Ｇｌｕ　ｔｒｉａｄ　Ｆｏｒｍｓ　ｔｈｅＣａｔａｌｙｔｉｅ　５ｉｔ ｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｌｉｐａｓｅ　ｆｒｏｍＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍ　ｃａｎｄｉ ｄｕｍ。

Ｎａｔｕｒｅ、　ｖｏｌ、　３５１．７６１−７６４、Ｂｒａｄｙ、Ｌｅｏら、 （１９９０）、　Ａ　５ｅｒｉｎｅ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ｔｒｉａｄ　Ｆｏｒｍ ｓ　ｔｈｅＣａｔａｌｙｔｉｃ　Ｃｅｎｔｒｅ　ｏｆ　ａ　Ｔｒｉａｃｙｌｇｌ ｙｃｅｒｏｌ、　Ｌｉｐａｓｅ、　Ｎａｔｕｒｅ、　ｖｏ１３４３、７６７−７ ７０　； Ｂｒｚｏｚｏｗｓｋｉ、Ａ、Ｍ、ら、（１９９１）、Ａ　Ｍｏｄｅｌ　ｆｏｒ　 ＩｎｔｅｒｆａｃｉａｌＡｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｌｉｐａｓｅｓ　ｆｒｏ ｍ　ｔｈｅ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ａ　ＦｕｎｇａｌＬｉｐａｓｅｉｎｈ ｉｂｉｔｏｒ　Ｃｏｍｐｌｅｘ、　Ｎａｔｕｒｅ、　ｖｏｌ、　３５Ｌ　４９１ −４９４　；Ｄｅｒｅｗｅｎｄａ、　１Ｊｒｓｚｕｌａら、（１９９２）、Ｃａ ｔａｌｙｓｉｓ　ａｔ　ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　：Ｔｈｅ　Ａｎａｔｏｍ ｙ　ｏｆ　ａ　Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ　Ｃｈａｎｇｅ　ｉｎ　ａ　Ｔｒ ｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅＬｉｐａｓｅ、　Ｂｉｏｅｈｅｍ、、　３１．１５３２− １５４１　；Ｔｉ　Ｉｂｅｕｒｇｈ　ら、Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ、３６２．　８ １４−８２０．　（１９９３）　；Ｋｏｍａｒｏｍｙ、　Ｍ、Ｃ，ら、（１９８ ７）、Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　Ｒａｔ　ｔ（ｅｐａｔｉｃ　ＬｉｐａｓｅｃＤＮ Ａ　：　Ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ａ　Ｌｉｐａｓｅ　Ｇｅｎｅ　Ｆａｍｉｌ ｙ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、　８４．１５２６−１５３０　；Ｄａｔｔａ、Ｓ、　Ｉろ、　（１９ ８８）　Ｈｕｍａｎ　Ｈｅｐａｔｉｃ　Ｌｉｐａｓｅ、、１．　Ｂｉｏｌ、Ｃｈ ｅｍ、。

２６３、１１０７−１＋１０　； Ｂｏｄｍｅｒ、Ｍ、Ｗ、ら、（１９８７）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ ｇ　ｏｆ　ａ　Ｈｕｍａｎ　Ｇａ５ｔｒｉｅＬｉｐａｓｅ　ａｎｄ　Ｅｘｐｒｅ ｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ、Ｂｉｏｃｈｉｍ ｉｃａ　ｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ、９０９．　２３７−２４４　； Ｂａｂａ、　Ｔ、ら、（１９９１）、５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　 Ｍｉｌｋ　Ｂ１１ｅ　５ａｌｔＡｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｌｉｐａｓｅ、Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｓｔｒｙ、３０．　５００−５１０　；Ｇｒｕｓｂｙ、Ｍ、Ｊ。　ら、　 （１９９０）、Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ａｎ　Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４Ｉｎ ｄｕｃｉｂｌｅ　Ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｔ　Ｌｙｍｐｈｏ ｃｙｔｅｓ　ａｎｄ　１ｔｓＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｓ　ａ　１ｉｐ ａｓｅ、Ｃｅ１ｌ　１３０．　４５＋−４５９；Ｃａｒｏ、Ｊ、　Ｄｅ、ら、（ １９８１）　Ｐｏｒｃｉｎｅ　Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　Ｌｉｐａｓｅ、　Ｃｏｍ ｐｌｅｔｉｏｎｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｒｉｍａｒｙ　Ｓけｕｃｔｕｒｅ、　Ｂｉｏｃ ｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　６７１．　１２９−１３８　；Ｌｏｗ ｅ、Ｍ、Ｅ、ら、（１９８９）、Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒ ｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＨｕｍａｎＰａｎｃｒｅａｔｉｃ　Ｌｉｐａｓｅ　ｃＤ ＮＡ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６４．２００４２−２００４８　 ；Ｍｉｃｋｅｌ、Ｆ、Ｓ、ら、（＋９８９）、５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｈ ｅ　Ｃａｎ１ｎｅ　ＰａｎｃｒｅａｔｉｃＬｉｐａｓｅ　Ｇｅｎｅ、Ｊ、Ｂｉｏ ｌ、Ｃｈｅｍ、、２６４．　１２８９５−１２９０１　；Ｓ、Ｌ、Ｂｅａｕｃａ ｇｅとＭ、Ｉｌ、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒ ｓ　２２．　１９８１゜ｐｐ、１８５９−１８６９　； Ｍｏｒｉｎａｇａら、１９８４．　８ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２　：　６４ ６−６３９　；Ｎｅ１ｓｏｎとＬｏｎｇ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ　１８０．　１９８９．　ｐｐ、１４７−１５１Ｖｉ　ｌ　Ｉａ− Ｋａｍａｒｏｆ　ｆ、ら、１９７８．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、Ｕ、Ｓ、　Ａ、７５″Ｕｓｅｆｕｌ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｆｒｏｍ　ｒｅ ｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｂａｃｔｅｒｉａ　″　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃへｍｅｒｉ ｃａｎ、　＋９８０．　２４２　：　７４−９４　；Ｍａｒｓｈ　ら、Ｇｅｎｅ 　３２　（＋９８４）、１）ｔｌ、−１８１−４８５）　；Ｄｏｃｈｅｒｔｙ、 Ａ、Ｊ、　Ｐ、ら、（１９８５）、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａ ｎｄ　ＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｒａｔ　Ｌｉｎｇｕａｌ 　Ｌｉｐａｓｅ　ｃＤＮＡ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。

１３、　１８９１−１．９０３　； Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、１９８２　；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏ１ｅｃ ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　 ２ｎｄ　Ｅｄ、。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ、１９８９　；Ｚｏｌｌｅｒ　＆　Ｓ ｍ１ｔｈ、ＤＮＡ、Ｖｏｌ、３．　Ｎｏ、６．　４７９−４８８　（１９８４） 　；Ｎｅ１ｓｏｎ　＆　Ｌｏｎｇ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ、１８０．　１４７−１５１　（１９８９）　；Ａｏｙａｍａ、Ｓ、ら、 （１９８８）、Ｃｌｏｎｉｎｇ、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓ ｓｉｏｎ　ｏｆｔｈｅ　１ｉｐａｓｅ　ｇｅｎ　ｆｒｏｍ　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ ａｓ　ｆｒａｇｉ　ＩＦＯ−１２０４９ｉｎ　Ｅ、ｃｏｌｉ。

ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、、２４２．３６−４０　；Ｄｅｒｅｗｅｎｄａ、Ｚｙｇｍ ｕｎｔ　Ｓ、ら、（１９９２）、Ｒｅ１ａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ　Ａｍｏｎｇ　Ｓ ｅｒｉｎｇｔ（ｙｄｒｏｌａｓｅｓ　：　Ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ａ　Ｃｏ ｍｍｏｎ　５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ　Ｍｏｔｉｆ　ｉｎＴｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅ ｒｉｄｅ　Ｌｉｐａｓｅｓ　ａｎｄ　Ｅｓｔｅｒａｓｅｓ。

配列表 （１）−膜端ｆｉｔ　： （ｉ）出願人： （Ａ）名　称：　Ｎｏｖｏ　Ｎ０ＲＤＩＳＫ　Ａ／５（Ｂ）通　リ：　Ｎｏｖａ 　Ａ１１ｅ （Ｃ）市　：　Ｂａｇｓｖａｅｒｄ （Ｅ）国　、デンマーク （Ｆ）郵便番号：　ＤＫ−２８８０ （Ｇ）を話番号：　＋４５４４４４８８８８（１１）ファックス番号：　＋４５ ４４４９３２５６（１）テレックス番号：　３７３０４ （ｉｉ）発明の名称、リパーゼ変異体 （伍）配列の数＝１１ （ｉｖ）コンピューター読取形式 （Ａ）媒体タイプ・フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：　ＩＢＭ　ＰＣ コンパチブル（Ｃ）作動システム：　ＰＣ−ＤＯ５／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフト ウェア、パテントイン　リリース　＃１．Ｏ。

バージョン＃　１．２５　（ＥＰＯ） （２）　ＳＥＱ　［Ｄ　Ｎｏ、　ｌについての情味・（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長　さ：　１３８９　塩基対 （Ｂ）タイプ：核　酸 （Ｃ）鎖の数；−重鎖 （Ｄ）トポロジー：直　鎖 （ｕ）分子のタイプ、　ＤＮＡ（ゲノム）（川ｌ）ヒポセティカル、Ｎ０ （ｉｉｉ）アンチセンス　Ｎｏ （ｖ）フラグメントのタイプ：内　部 （ｖｉ　）生物起源： （Ａ）生　物：カンジダ　アンタルクチ力（Ｃ）個別単離物：　ＤＳＭ　３８５ ５（ｘｌ）配列についての情ＩＲ：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　Ｉ　：π−ζロ端 ＧＣＡＪ■０：丁α込αη訊αＡスα℃■α迅詰賞ゴα℃αスＣπｎスπＤコ　 １２６０α工酊α℃３ｘ茫ワＣユＣαＤゴσ乃工ω印品ｅｅぢ訊工π；ＧＣＣＡ ＡＣ日２０αン工ＴＴＡＧ　１３８９ （２）ＳＥＱ　１０　Ｎｏ、　２についての情報。

（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長　さ　４６３アミノ酸 （Ｂ）タイプ　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数、−重鎖 （Ｄ）トポロジー　直　ｊＪｔ （１１）分子のタイプ、タンパク質 （ｉｉ　）ヒボセティカルニＮ０ （ｉｉｉ）アンチセンス、Ｎｏ （Ｖ）フラグメントのタイプ　Ｎ−末端（ｖｉ　）生物起源 （△）生　物：カンジダ　アンタルクチ力（Ｃ）個別単離物　ＤＳＭ　３８５５ （Ｘｌ）配列についての情報　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　２Ａｌａ　Ａｌａ　Ｖａ ｌ　Ｉｇｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｔｎｒ　比り 判扁四Ａｒｇ　Ａｈａ工１ｅ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｇｌ ｙ　Ｇｉｎ　ＶａｌＩｌｅ　Ｇｌｎ　Ｓａｒ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｖａｎ　Ｐｒ。

ＴｈｒＡｓｐ工１ａ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ａｌ ａ　Ｓａｒ　Ｐｈｅ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｔｆｒ６５　７０　７５　ＢＣ ） ９フエｌｅ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒ ｏ　Ｌｙｓ工１ｅ　Ｐｈａ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｇ１ｎＶａユ　Ｔｆｒ　Ｇｌｕ　 Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　ＡＬａ　Ｌｇｕ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　ｐｒｏ　 Ｓａｒ　Ｔｙｒ　ｓｅｒ　丁ンｒ１１５　１２０　Ｌｌ！　５ Ｌａｕ　’Ｉｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｇ知Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｖ ａｌ　’Ｉｈｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　’Ｉｈ■ Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　工１ｅ　エユ”　Ｇｌｙ　Ｔｒ９　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ｇｌｎ　 Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　５ｅｒ１４５　１５０　１ ５５　ユ６０ Ｇｌｙ　Ｐ、ｅｔ　Ａｌａ工１ｅ　Ｌａｕ　ｐｓｐ　ｃｌｙ工１ｅ　Ａｒｇ　Ａ ｌａ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｇｌｎ　ＡｓｎＬｊＩｉＩＰｒＯ５ｅ ｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｙ ｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｌａ＋（ｉｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｒ ｐ　Ａｌａ　’ｒｈｒ　Ｓａｒ　ＬａＪ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｓａｒ　Ｔ’ｆｒ　 Ａｌａ　Ｐｒｏ　fｌｕ Ｌａｕ　Ａｓｎ工１ｅａｍ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｓｅｔ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ 　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｓａｒ　Ａｌａ　Ｌｙｓ２２５　２コ０　２３５　 ２４０ Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｓａｒ　Ｇｌｙ　′ＬＡｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ 　）Ｌｉｓ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｓａｒ　１hｈｅ １１ｅ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ工１ａ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｐ ｒｏ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ３５５　コロ０　３５ ５ （２）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　３についての情報（ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長　さ　２７７アミノ酸 （Ｂ）タイプ　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数・−重鎖 （Ｄ）ｌ−ボロジー　直　鎖 （］」）分子のタイプ　タンパク質 （ｍ）ヒボセティカル、ＮＯ （ｍ）アンチセンス　Ｎｏ （Ｖ）フラグメントのタイプ　内　部 （Ｖ］）生物起源 （Ａ　）生　物　ツユ−トモナス　フラギ（Ｘｌ）配列についての情ｆａ　：　 ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　３（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　４についてのｔｔＪ ＦＩ：（１）配列の特徴 （Ａ、　）長　さ　２６９アミノ酸 （Ｂ）タイプ・アミノ酸 （Ｃ）鎖の数、−重鎖 （Ｄ）トポロン−直　鎖 （ｉｉ）分子のタイプ、タンパク質 （ｉｉ）ヒボセティカル、Ｎ０ （ｉｉ）アンチセンス、Ｎｏ （ｖ）フラグメントのタイプ：内　部 （ｖｉ　）生物起源 （Ａ）生　物　リゾムカー　ミーヘイ （ｘｌ）配列についての情報：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　４：Ｌ６５　１７０　 １７５ （２）　ＳＥＱ　１０　Ｎｏ、　５についての情報：（ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長　さ・２９７アミノ酸 （Ｂ）タイプ、アミノ酸 （Ｃ）ｊｆｆの数、−重鎖 （Ｄ）トポロジー：直　鎖 （ｉ）分子のタイプ　タンパク質 （ｉｉｉ）ヒポセティカル：Ｎ０ （ｉｉ）アンチセンス　Ｎｏ （ｖ）フラグメントのタイプ・内　部 （ｖｌ）生物起源 （Ａ）生　物　リゾプス　二へウス （ｘｉ）配列についての情報　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　５　：（２）　ＳＥＱ　 ＩＤ　Ｎｏ、　６についての情報：（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長　さ　４４　塩基対 （Ｂ）タイプ　核　酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直　鎖 （ｉｉ）分子のタイプ　ＤＮＡ　（合成）（ｉｉ）ヒボセティカル　ＮＯ （ｍ）アンチセンス　Ｎｏ （ｖ）フラグメントのタイプ：内　部 （ｘｌ）配列についての情報：　ＳＥＱ　［Ｄ　Ｎｏ、　６　：ＧＣＴＧＣＴＣ ＴＧＣＣＴＡＡＣＣＣＴＴＡ　ＣＧＡＹＧＡＹＣＣＴ　ＴＴＣＴＡＣＡＣＣＡ　 ＣＣＣＣ４４（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　７についての情報。

（１）配列の特徴・ （Ａ）長　さ　１７　塩基対 （Ｂ）タイプ：核　酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー　直　鎖 （ｕ）分子のタイプ　ＤＮＡ（合成） （ｉｉｉ）ヒポセティカル、Ｎ。

ＴＴＣＴＴＧＡＧＣＧ　ＣＧＣＧＧＡＴＧＣＣＧＴＣＧＡＧＧＡＴＡ　ＧＣＣＡ ＴＧＣＣＣＴ　ＣＴＴＣＧＴＡＧＣＣ５０ＡＧＣＧＡＴＣＣＡＧ　’ＧＣＧＧＣ ＴＴＴＣＣＡＧＣＣＴＴＣＧＴＧ　８０Ｕｃ１９ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，ｂ　識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｐ　７／６４　 ７４３２−４Ｂ Ｃ１２Ｓ　３１０８ Ｄ　２１　Ｃ９１０８７１９９−３Ｂ ／／（Ｃ１２Ｎ　９／２０ Ｃ１２Ｒ１：６９） （Ｃ１２Ｎ　１／１９ Ｃ１２Ｒ１：６９） （７２）発明者　アイエルーミターニ　ミチデンマーク国、デーコー−２９５０ ベズベーク、ゴーエンゲスレッテン　３１ （７２）発明者　ポルチ、キム デンマーク国、テーコー−１８０８コペンハーゲン　コー、クレルケガゼ　１２ ．　２．テーパー。

Ｉ （７２）発明者　クラウセン、イブ　グロスデンマーク国、デーコー−３４ＯＯ ヒレレーズ、フユレステイエシ　６ （７２）発明者　ハンセン、モーゲンス　トリエルデンマーク国、デーコー−３ ４５０リュンゲ、モセバン　９

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. １．リパーゼ分子の主に疎水性の長い結合ポケットの中に位置する活性セリンを 含むトリプシン様触媒三つ組残基と、リパーゼ構造の脂質接触ゾーンの重要な位 置に位置しており、加水分解の最中に脂質基質と相互作用する、芳香族アミノ酸 とは異なるアミノ酸残基とを含んで成る親リパーゼのリパーゼ変異体であって、 前記アミノ酸残基が、この親リパーゼのそれに比して高い比活性をその変異体に 授ける芳香族アミノ酸残基によって置換されている、リパーゼ変異体。
2. ２．前記重要な位置に挿入すべき芳香族アミノ酸が、トリプトファン、フェニル アラニン、チロシン及びヒスチジンより成る群から選ばれる、請求項１記載のリ パーゼ変異体。
3. ３．芳香族アミノ酸残基とは異なる前記アミノ酸残基がフェニルアラニン残基で ある、請求項１又は２記載のリパーゼ変異体。
4. ４．リパーゼの重要な位置に位置している前記アミノ酸残基がトリプトファンで なく、そして前記アミノ酸残基がトリプトファン残基により置換されている、請 求項１〜３のいづれか１項記載のリパーゼ変異体。
5. ５．前記親リパーゼが微生物又は哺乳動物性リパーゼより選ばれる、先の請求項 のいづれか１項記載のリパーゼ変異体。
6. ６．前記親リパーゼが酵母性リパーゼである、請求項５記載のリパーゼ変異体。
7. ７．前記親リパーゼがカンジダアンタルクチカの株に由来する、請求項６記載の リパーゼ変異体。
8. ８．前記親リパーゼがＣ．アンタルクチカのリパーゼＡである、請求項７記載の リパーゼ変異体。
9. ９．ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１に示すアミノ酸配列を有し、親リパーゼのフェニル アラニン１３９がトリプトファン残基により置換されているか、又は親リパーゼ のフェニルアラニン１３５及び１３９がトリブトファン残基により置換されてい る、請求項８記載のリパーゼ変異体。
10. １０．前記親リパーゼが細菌性リパーゼである、請求項５記載のリパーゼ変異体 。
11. １１．前記親リパーゼがシュードモナスの株に由来する、請求項１０記載のリパ ーゼ変異体。
12. １２．Ｐｓ．フラギの株に由来する、請求項１１記載のリパーゼ変異体。
13. １３．ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．３に示すアミノ酸配列を有し、親リパーゼのフェニ ルアラニン２９がトリプトファン残基により置換されている、請求項１２記載の リパーゼ変異体。
14. １４．前記親リパーゼが菌類性リパーゼ、ヒト性リパーゼ、ネズミ性リパーゼ、 ラット性リパーゼ又はネコ性リパーゼである、請求項５記載のリパーゼ変異体。
15. １５．Ｃ．アンタルクチカ由来の他の物質を本質的に含まず、ＳＥＱＩＤ　Ｎｏ ．２に示すアミノ酸配列を含んで成るＣ．アンタルクチカリパーゼＡ、又は １）リパーゼ活性を有する、 ２）アミノ酸配列ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．２を有するＣ．アンタルクチカリパーゼ Ａの少なくとも一のエピトープと反応性の抗体と反応する、及び／もしくは ３）Ｃ．アンタルクチカリパーゼＡをエンコードするＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１に 示す全もしくは部分ヌクレオチド配列を基礎として調製されたオリゴヌクレオチ ドとハイブリダイズするヌクレオチド配列によりエンコードされる、 前記リパーゼの変異体。
16. １６．ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．２に示すアミノ酸配列を有するＣ．アンタルクチカ リパーゼＡをエンコードするＤＮＡ、又は１）リパーゼ活性を有する、 ２）アミノ酸配列ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．２を有するＣ．アンタルクチカリパーゼ Ａの少なくとも一のエピトープと反応性の抗体と反応する、及び／もしくは ３）Ｃ．アンタルクチカリパーゼＡをエンコードするＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１に 示す全もしくは部分ヌクレオチド配列を基礎として調製されたオリゴヌクレオチ ドとハイブリダイズするヌクレオチド配列によりエンコードされる、 Ｃ．アンタルクチカリパーゼＡの変異体をエンコードする前記ＤＮＡ配列の改変 体。
17. １７．請求項１〜１４のいづれか１項記載のリパーゼ変異体又は請求項１５記載 のＣ．アンタルクチカリパーゼＡをエンコードするＤＮＡ配列を含んで成るＤＮ Ａ構築体。
18. １８．請求項１７記載のＤＮＡ構築体を担持している組換発現ベクター。
19. １９．請求項１７記載のＤＮＡ構築体又は請求項１８記載のベクターにより形質 転換された細胞。
20. ２０．例えばアスペルギルス属に属する菌類細胞、例えばＡ．ニガー、Ａ．オリ ザもしくはＡ．ニドウランス；例えばサッカロマイシスの株に属する酵母細胞、 例えばＳ．セレビシエ、又はハンセヌラ属に由来するメチロトローフ酵母、例え ばＨ．ポリモファもしくはフィシア（Ｐｈｉｃｈｉａ）、例えばＰ．パストリス （Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）；又は例えばバチルスの株に属する細菌細胞、例えば Ｂ．スブチリス、Ｂ．リシェニホルミスもしくはＢ．レンタス、又はエッシェリ ヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）の株に属する細菌細胞、例えばＥ．コリである 、請求項１９記載の細胞。
21. ２１．請求項１〜１４のいづれか１項記載のリパーゼ変異体を製造する方法であ って、請求項１９又は２０記載の細胞を、このリパーゼ変異体の製造を誘発する 条件下で培養し、そしてそのリパーゼ変異体をその後この培養物から回収する方 法。
22. ２２．請求項１〜１４のいづれか１項記載のリパーゼ変異体又は請求項１５記載 のＣ．アンタルクチカリパーゼＡもしくはその変異体の、エステル加水分解、エ ステル合成又はエステル交換における利用。
23. ２３．請求項１〜１４のいづれか１項記載のリパーゼ変異体又は請求項１５記載 のＣ．アンタルクチカリパーゼＡもしくはその変異体の、機械パルプの製造のた めの工程又は機械パルプを使用する製紙工程における、ピッチの問題を解消する ため利用。