JPH07509060A

JPH07509060A - 構造エピトープを有する抗原を用いる抗ｈｃｖ抗体のイムノアッセイ

Info

Publication number: JPH07509060A
Application number: JP6503440A
Authority: JP
Inventors: チエン，デイビッド　ワイ．
Original assignee: カイロン　コーポレイション
Priority date: 1992-07-07
Filing date: 1993-07-02
Publication date: 1995-10-05
Anticipated expiration: 2019-01-26
Also published as: DE69331845D1; RU2126158C1; DE69331845T2; SK284556B6; NO321185B1; AU4662993A; RU94046284A; CZ291951B6; CA2139645A1; DE69331845T3; DK0649537T3; ATE216779T1; UA39944C2; EP0649537B1; AU685059B2; SK495A3; HUT70473A; US20020150883A1; ES2171414T3; PT649537E

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】構造エピトープを有する抗原を用いる抗＋１ｃＶ抗体のイムノアッセイ技術分野本発明は、Ｃ型肝炎ウィルス（）ＩＣＶ）感染の広がりを管理するための物質および方法論に関する。より特定すれば、本発明は、ＨＣｖ感染の検出、予防および治療、ならびにイムノアッセイおよびそれに用いるキットに有用なポリペプチド免疫剤に関する。

■ ＨＣＶは、輸血後非＾、非Ｂ肝炎（ＮＡＮＢＨ）の主な原因として、Ｈｏｕｇｈｔｏｎらによって最初に同定および特徴付けられた。ＨＣＶに関する実質的な情報を提供することに加えて、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、および彼らの共同研究音速は、多数の一般的および特異的免疫剤および方法を開示した。例えば、以下の文献を参照のことＨｏｕｇｈｔｏｎら、ＥＰＯ第３１８．２１６号ＨＨｏｕｇｈｔｏｎら、ＥＰＯ第３８８．２３２号ＨＣｈｏｏら、５ｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３５９〜３６２　；　Ｋｕｏら、５ｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３６２−３６４　；　Ｔａｋｅｕｃｈｉら、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、（１９９０）７１：３０２７−３０３３　；　Ｔａｋｅｕｃｈｉら、Ｇｅｎｅ（１９９０）旦：２８７−２９１　；　Ｔａｋｅｕｃｈｉら、Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　（１９９０）１８：４６２６　；　Ｍｉｙａｍｕｒａら、Ｐｒｏｃ、ＮＮａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ　（１９９０）８７：６５４７−６５４９　；　Ｃｈｏｏら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　（１９９１）８８：２４５１〜２４５５　；　）ｆａｎら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８８１７１１−１７１５　；　）Ｉｏｕｇｈｔｏｎら、肋はり酊四分（１９９１）　１４　：　３８１〜３８８　；　Ｗｅｉｎｅｒら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ｕｓ＾（１９９２）８９：３４６８〜３４７２゜これらの文献は、Ｉｔ（Ｊ−Ｊナラびに）ＩＣＶポリペプチド免疫剤の製造および使用に関して、当該技術に広範囲な背景を提供する。簡単のために、従って、これらの文献の開示は、特に本明細書中に参考として援用されている。

Ｈｏｕｇｈｔｏｎらの研究は、さらに応用および展開された。例えば、以下の文献を参照のこと二Ｌｇｈｆｉｅｌｄら、Ｕに特許出願第２゜２３９、２４５号（Ｔｈｅ　Ｗｅｌｃｏｎｅ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　Ｌｔｄ、　）　；　ｆａｎｇ、　ＥＰＯ第４４２゜３９４号（Ｕｎｉｔｅｄ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｉｎｃ、　）　；　Ｌｅｕｎｇら、ＥＰＯ第４４５．４２３号（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　；　）ｌａｂｉｔｓら、ＥＰＯ第４５１，８９１号（Ａｋｚｏ　Ｎ−Ｖ、　）　ＨＲｅｙｅｓら、ＰＣＴ第Ｗ０９１／１５５１６号（Ｇｅｎｅｌａｂｓ　Ｉｎｃ、　）　ＨＭａｋｉら、ＥＰＯ第４６８．６５７号（Ｔｏｎｅｎ　Ｃｏｒｐ、　）　；およびＫａｍａｄａら、ＥＰＯ第４６９゜３４８号（Ｓｈｉｏｎｏｇｉ　５ｅｉｙａｋｕ　Ｋ、　Ｋ、　）。以下の文献もまた参照のこと　Ｍａｔｓｕｕｒａら、（１９９２）ムーロエ己四■６６　：１４２５　；　Ｋａｔｏら、Ｐｒ。

ｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　（１９９０）８７：９５２４ −９５２８　；　Ｔａｋａｉｉｚａｗａら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、（１９９１）６５：１１０５〜ＩＨ３；Ｃｈｉｂａら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ７２＋２０２１−２０２４　；　Ｗａｔａｎａｂｅ呟１ｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ（１９９１）４８：３４０〜３４３゜ＨＣＶのキャリアおよびＨＣＶ汚染された血液または血液製剤をスクリーニングおよび同定するための高感度の特異的な方法は、医学における重要な進歩である。輸血後肝炎（ＰＴ）Ｉ）は輸血した患者の約ｌＯ％に生じ、これらの症例の９０％までＨＣＶが原因であった。この疾患の主な問題点は、他の肝炎（例えば、Ｂ型）と比較して、慢性的な肝臓障害に頻繁に進行することである（２２〜５５％）。

患者の看護、および、血液および血液製剤または親密な個人的接触によるＨＣＶの伝染の予防には、ＨＣＶに関する抗体を検出するための信頼性のある診断および予後手段（例えば、肛Ｖポリペプチド）が必要である。このようなポリペプチドはまた、疾患の予防および／または治療のためのワクチンおよび免疫療法治療薬として有用である。ＨＣｖは比較的新しい因子であるので、疾患の臨床経過および集団における）ＩＣＶの疫学のさらなる研究を与え得る追加の免疫剤を明らかにすることが継続的に必要とされる。

発」１回ｉ示出願人らは、ＯＣＶ抗原に関するさらなる血清学的研究を行い、そして構造エピトープを保持するＯＣＶエンベロープ抗原を利用するイムノアッセイが、直鎖状エピトープを有する同じ抗原を利用するアッセイよりも、抗）ＩＣＶ抗体を検出するのにさらに有効であることを発見した。

従って、本発明の一つの局面は、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）に対する抗体を含む疑いのあるは乳類生体成分中の該抗体を検出する方法であって、該生体成分を、ＨＣＶのＥｌまたはＥ２ドメイン由来の構造エピトープを含むｔｌｃｖ抗原と、（もし存在すれば）該抗体と該抗原との間の免疫反応を行わせる条件下で接触させる工程、および該抗体と該抗原との（もし存在すれば）免疫複合体の存在を検出する工程を包含する。

他の実施態様において、本発明の方法は、抗原がＥｌおよび／またはＥ２ドメイン中にコードされ、またはＥｌおよび／またはＥ２抗原である。ある実施態様においては、抗原はワクチニアベクターから発現し得るか、またはＣＦＩＯ細胞中で発現し得る。

さらに、本発明の特定の実施態様においては、別の構造エピトープから構成される第二の抗原が含まれる。

本発明の別の局面は、血液製剤を調製するために血液または血液成分を使用する前に、そのような血液または血液成分をＨＣＶについてスクリーニングする方法であって、ａ、潜在的な供与者由来の生体成分を、ＨＣＶのＥｌまたはＥ２ドメイン由来の構造エピトープを含むＨＣＶ抗原と、（もし存在すれば）該生体成分中の抗体と該抗原との間の免疫反応を行わせる条件下で反応させる工程；ｂ、該抗原と該抗体との間で形成される複合体を、もし存在すれば、検出する工程；およびＣ１該複合体が工程すで検出される場合に該供与者からのすべての血液または血液成分を捨てる工程、を包含する。

本発明のさらに別の局面は、ＨＣＶ抗体を検出するキットであって、適切なバイアル中に荷造りされた、ＨＣＶのＥｌまたはＥ２ドメイン由来の構造エピトープを含むＨＣＶ抗原、および対照標準物、ならびに該キット成分の使用の指示を含む。

゛　の　ｔ−１［＋図１は、ＨＣｖポリタンパク質の推定されるドメインを示す図である。

図２は、ベクターｐＳＣ５９のいくつかの特徴を示す図である。

図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃ１ｔ、個々）ＨＣｖ抗原ニ対すルＥＬＩＳＡアッセイに陽性のクループ］、Ｉ＋およびＩＩ＋の患者の割合を示す。

日の−な晋ＢｒＨｃＶ抗原」とは、少なくとも一つのＨＣＶエピトープを規定するアミノ酸配列（および／またはアミノ酸類似体）を包含する、ポリペプチドまたはポリペプチド類似体（例えば、ミミトーブ（ｎｉＩｌｌｉｔｏｐｅ））を意味する。代表的には、エピトープを規定する配列は、ＨＣＶタンパク質のアミノ酸配列に相当するく同一であるか、またはエピトープを破壊しないネイティブのアミノ酸残基の類似体で置換されている）。一般に、エピトープを規定する配列は、５個またはそれ以上のアミノ酸の長さてあり、より代表的には８個またはそれ以上のアミノ酸の長さであり、そしてよりさらに代表的には１０個またはそれ以上のアミノ酸の長さである。構造エピトープに関しては、エピトープを規定する配列の長さはさまざまな変化を受け易く、なぜならこれらのエピトープは三次元形態の抗原（例えば、ひだ（ｆｏｌｄｉｎｇ）形成）より形成されると考えられるがらである。従って、エピトープを規定するアミノ酸は、比較的数は少なく、分子長にそって（または、二量体などの場合では異なる分子上にさえも）広く散在し得、ひだ形成を介して正しいエピトープ構造をもたらす。エピトープを規定する残基の間の抗原の部分は、構造エピトープの構造に対して重要であり得ない。例えば、構造エピトープに重要な配列が維持されているならば（例えば、ジスルフィド結合を伴ったシスティン、グリコジル化部位など）、これらの介在する配列が欠失または置換されても構造エピトープに影響し得ない。

本発明の）ＩＣＶ抗原は、口ＣｖのＥｌおよび／またはＥ２　（エンベロープ）ドメイン由来の構造エピトープを含む。Ｅｌドメイン（ウィルスエンベロープタンパク質に相当すると考えられる）は、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２位〜３８３位の範囲にあると現在推定されている（　ＰＣＴ公開番号Ｗ０９１／１５７７１１図１）。ＣｕＯ系（グリコジル化）における発現では、５Ｏ３−ＰＡＧＥにより決定されるように、約３５Ｋｄの分子量を有すると考えられている。

Ｅ２タンパク質（以前はＮＳＩと称されていた）は、ポリタンパク質のアミノ酸３８４位〜８００位の範囲にあると考えられており、そしてまたエンベロープタンパク質であると考えれている。

ＣＨＯ系（グリコジル化）における発現では、約７２Ｋｄの見かけのゲル分子量を有すると考えられている。これらのタンパク質の終点は近似値であることが理解される（例えば、Ｅ２のカルボキシ末端は７５０位〜８２０位のアミノ酸領域のどこかに存在し得る）。前述のＰＣＴ出願中のプロトタイプ単離物のＨＣＶ　ｌ配列は、例示目的のみのため引用されていること、そして本発明の実施には任意のＨＣｖ単離物（例えば、「背景」のセクションで引用した参考文献を参照のこと）が、Ｅｌおよび／またはＥ２配列の適切な供給源であることがまた理解される。

本発明に用いられるＥｌおよびＥ２抗原は、完全長のウィルスタンパク質、実質的に完全長であるそれらの変形物、またはそれらの機能的フラグメント（例えば、構造エピトープの形成または保持に必須の配列を欠いていないフラグメント）であり得る。さらに、本発明のＨＣＶ抗原はまた、目的の構造エピトープの形成をブロックまたは妨害しない他の配列を包含し得る。構造エピトープの存在または不在は、目的の抗原を抗体（ポリクローナルの血清または構造エピトープに対してモノクローナル）でスクリーニングし、そしてその反応性と（存在すれば）直鎖状エピトープのみを保持する変性型の抗原の反応性とを比較することにより容易に決定され得る。ポリクローナル抗体を用いるそのようなスクリーニングにおいては、最初にポリクローナル血清を変性抗原で吸着し、そしてそれが目的の抗原に対する抗体を保持しているかどう力１を観察することが有利であり得る。

本発明のＨＣＶ抗原は、目的の構造エピトープを提供する任意の都合のよい方法で作成され得る。例えば、は乳類または昆虫細胞における組換え発現は、分泌グリコジル化Ｅｌおよび／またはＥ２抗原を「ネイティブな」構造（”ｎａｔｉｖｅ″ｃｏｎｆｏｒｔ＋ａｔｉｏｎ）で提供する好適な方法である。しかし、タンパク質について知られているように、他の組換え宿主で抗原を発現し、そして回収後にタンパク質を再生することもまた可能である。化学合成もまた、「ネイティブな」抗原の構造エピトープと交差反応する構造ミミトーブ（ｎｉｒｌｉ　ｔｏｐｅ）を提供し得ることが理解される。

１つ以上のＥｌまたはＥ２モノマーを含むＥｌおよび／またはＥ２の複合体（凝集体とも呼ばれる）はまた、好適な抗原である。Ｅｌ：Ｅｌダイマー、Ｅ２：Ｅ２ダイマー、およびＥｌ：Ｅ２ヘテロダイマーはすべて、本発明の範囲内にある抗原である。凝集体はまた、より大きい形態を包含し得、そして８００ｋＤを超える分子量を有し得る。

用語「融合ポリペプチド」は、ＨＣＶ抗原が、アミノ酸の単一かつ連続の鎖（この鎖は天然にはない。）の部分であるポリペプチドを意味する。ＨＣＶ抗原は、ペプチド結合により互いに直接に結合し得、または介在するアミノ酸配列により分離され得る。融合ポリペプチドはまた、ＨＣｖに対して外因性のアミノ酸配列を含有し得る。

用語［共通の固体マトリックス］は、個々のＩＩｃＶ抗原またはＨＣＶ抗原を含む融合ポリペプチドが、共有結合によりまたは疎水吸着のような非共有結合手段により結合する固体を意味する。

用語「生体成分」は、個体により産生される抗体を通常含む、は乳類個体（例えば、類人猿、ヒト）の流体または組織を意味する。そのような成分は、当該技術分野で公知であり、そして、制限されないが、血液、血漿、血清、を椎液、リンパ液、分泌物（呼吸器、腸管または尿生殖器の）、涙、唾液、乳、白血球、および骨髄腫を含む。生体成分は、生物学的液体を含む。用語「生物学的液体」は生物体から得られた流体をいう。いくつかの生物学的流体は、凝血因子（例えば、第Ｖ１１１：Ｃ因子）、血清アルブミン、成長ホルモンなどのような他の産物の供給源として使用される。そのような場合、生物学的流体の供給源はＨＣＶなどのウィルスによる汚染のないことが重要である。

用語「免疫学的に反応性」は、問題の抗原が、ＨＣｖ感染個体由来の生体成分中に存在する抗ＨＣｖ抗体と特異的に反応することを意味する。

用語「免疫複合体」は、抗体が抗原上のエピトープに結合するとき形成される結合物を意味する。

本明細書で使用される用語「Ｅｌ」は、ときにＥまたはＳタンパク質と呼ばれる、ＨＣＶポリタンパク質の最初の４００アミノ酸の内で発現されるタンパク質またはポリペプチドをいう。その天然の形態において、それは膜と強固に会合して見いだされる３５ｋＤの糖タンパク質である。大部分の天然）１（Ｊ株で、このＥ１タンパク質は、ウィルスポリタンパク質中でＣ（コア）タンパク質に続いてコードされる。Ｅｌタンパク質は、完全長ポリタンパク質のアミノ酸約１９２位から約３８３位まで拡がる。本明細書で使用される用語ｒＥＩＪはまた、天然のＥｌと免疫学的に交差反応する類似体および短縮形態を含む。

本明細書で使用される用語「Ｅ２」は、ときにＮＳＩＳタンパク質ばれる、ＨＣＶポリタンパク質の最初の９００アミノ酸の内で発現されるタンパク質またはポリペプチドをいう。その天然の形態では、それは膜と強固に会合して見いだされる７２ｋＤの糖タンパク質である。大部分の天然のＨＣＶ株では、Ｅ２タンパク質は、ウィルスポリタンパク質中でＥｌタンパク質に続いてコードされる。Ｅ２タンパク質は、アミノ酸約３８４位から約８２０位まで拡がる。本明細書で使用される用語「Ｅ２」はまた、天然のＥ２と免疫学的に交差反応する類似体および短縮形態を含む。

本明細書で使用される用語「凝集体」は、１つ以上のＥｌまたはＥ２モノマーを含むＥｌおよび／またはＥ２の複合体をいう。Ｅｌ：Ｅ１ダイマー、Ｅ２　：　Ｅ２ダイマー、およびＥｌ：Ｅ２ヘテロダイマーはすべて、本定義の範囲内の「凝集体」である。凝集体はまた、より大きい形態を包含し得、そして８００ｋＤを超える分子量を有し得る。

本明細書でタンパク質に適用される用語「精製された」は、所望のタンパク質が組成物中で全タンパク質成分の少なくとも３５％を占める組成物についていう。

所望のタンパク質は、好適には、全タンパク質成分の少なくとも４０％、より好適には少なくとも約５０％、より好適には少なくとも約６０％、さらにより好適には少なくとも約７０％、なおより好適には少なくとも約８０％、なおより好適には少なくとも約９０％、そして最も好適には少なくとも約９５％を占める。組成物は、本明細書で使用される純度百分率の決定に影響することなく、炭水化物、塩、脂質、溶媒などの他の成分を含有し得る。「単離されたＪ　）ＩＣＶタンパク質とは、少なくとも３５％の純度であるＨＣＶタンパク質組成物を意味する。

用語「単離されたポリペプチド」は、他のＨＣｖウィルス成分、特にゲノムＩＩｃｖポリヌクレオチドが実質的に無いポリペプチドをいう。組成物中のポリペプチドの重量が、ポリペプチドおよび他の成分を組み合わせた重量の少なくとも７０％、より好適には少なくとも約８９％、なおより好適には約９０％、そして最も好適には９５％またはそれ以上であれば、ポリペプチド組成物には別の成分が「実質的にない」という。

日本発明のイムノアッセイ法は、ＥｌおよびＥ２ドメイン由来であって、ＨＣｖに感染した個体の血清中の抗体により認識される構造エピトープを維持するＨＣ■ 抗原を利用する。各抗原は、抗原とＯＣＶ感染個体由来の生体成分中の抗体との免疫反応性、および抗原の変性によるエピトープの免疫反応性の損失により証明されるように、天然に存在するＦＩＣＶ粒子またはその感染性生成物中にある少なくとも１つの構造エピトープを有する。

ｌＬ並人工之　１且よ土立遺１抗原の長さは、そのエピトープに関連する免疫反応性構造エピトープを維持するために充分である。１つの抗原上に１つ以上の構造エピトープを有することは本発明の範囲内である。

しばしば、イムノアッセイで使用されるネイティブなエンベロープ抗原はほとんど完全長であり得るが、例えば、溶解度を増加するために、または分泌を改善するため（例えば膜結合ドメインの欠失）に、短縮され得る。単一の抗原、あるいは抗原の組み合わせまたは凝集体のいずれを使用することも本発明の範囲内である。従って、イムノアッセイは、Ｅｌエピトープ、Ｅ２エピトープ、ネイティブなＥｌおよびＥ２の凝集体または組み合わせを使用し得る。直鎖状のエピトープを有する抗原をＨＣｖエンベロープ構造エピトープと組み合わせて使用することも本発明の範囲内にある。

構造エピトープの存在を検出する方法は当該技術分野で公知であり、そしていくつかは以下の実施例で説明される。

！（ＣＶ　１のヌクレオチド配列中にコードされる推定アミノ酸および他の証拠に基づき、コードされるＨＣＶポリタンパク質の可能なタンパク質ドメインおよびおおよその境界は以下のとお真核性宿主は、培養系中の酵母およびは乳類細胞を含む。

Ｑ二辷り菫ＪＩｉ３ＵＣ（ヌクレオキャプシドタンパク質）　ｌ−１９１Ｅｌ（ピリオンエンベロープタンパク質）＋９２−３８３Ｅ２／’Ｎ５Ｉ（エンベロープ７　）　３８４−８０ＯＮＳ３（プロテアーゼ？　）　１０５０−１６５ＯＮＳ４　１６５１−２１００ＮＳ５（ポリメラーゼ）２１００−３０１１（末端）これらのドメインは、しかし、暫定的なものである。例えば、ＥｉＮＳ２境界は多分７５０−８１０領域中にあり、そしてＮ５３−Ｎ５４領域は約１６４０−１６５０である。Ｃの１９１アミノ酸形態は、さらにプロセッシングされる（例えば、約１７０アミノ酸の長さまで）前駆体であり、そして、ＮＳ２、ＮＳ４およびＮＳ５タンパク質はそれぞれ２つの成熟タンパク質にプロセッシングされる証拠もある。これらドメインの関係が図１に示される。

ネイティブな構造を有するＥｌおよびＥ２抗原を含むＥｌおよびＥ２抗原を調製する方法は、３ｐａｅｔｅ　Ｒ，ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９２）１８８：８１９−８３０およびＷ０９２１０８７３４中に記載され、これらは本明細書に参考として援用される。一般に、宿主細胞としては、発現されるエンベロープタンパク質内にネイティブな構造エピトープを形成させる宿主が選択され：これら宿主細胞は、例えば、動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞などを包含し得る。

５ａｃｃｈａｒｏｎ＋　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび５ａｃｃｈａｒｏｉ　ｃｅｓ　姐杜非肛話ｎ５ｉｓは、最も一般的に使用される酵母宿主であり、そして便利な真菌宿主である。酵母適合ベクターは、栄養要求性変異株に原栄養性、または野生型株に重金属耐性を付与することにより形質転換体の選択を可能にするマーカーを担持する。

酵母適合ベクターは、複製の２ミクロン複製起点（Ｂｒｏａｃｈら、（１９８３）Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚ、１０１：３０７．）、ＣＥＮ３および＾Ｒ３Ｉの組み合わせ、または宿主細胞ゲノム中への適切なフラグメントの取り込みをもたらす配列のような、複製を確実にする他の手段を使用し得る。酵母ベクターの制御配列は、当該技術分野で公知であり、そして、３ホスホグリセレートキナーゼ（Ｈｉｔｚｅｃａｎ（１９８０）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｆｆｌ、２５５：２０７３）を含む、解糖系酵素合成のためのプロモーター（Ｉ（ｅｓｓら（１９６８）　Ｊ、＾ｄｖ、　Ｅｎｚ）＋ｖ＋ｅ　Ｒｅｇ　Ｚ：１４９　；　Ｈｏ１ｌａｎｄら、（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅ＋＋１ｓｔｒｙ　１７：４９００）を含む。エノラーゼ遺伝子由来のターミネータ−（Ｆｌｏｌｌａｎｄ（１９８１）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５６：１３８５、）などのターミネータ−もまた含有され得る。特に有用な制御系は、グリセルアルデヒド−３ホスフエートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターまたはアルコールデヒドロゲナーゼ（＾ＤＩ）ｍ節可能なプロモーター、やはりＧＡＰＤＦＩに由来するターミネータ−１そして分泌が望まれる場合は、酵母アルファーファクター由来のリーダー配列を含む制御系である。さらに、作動可能に連結された転写調節領域および転写開始領域は、野生型生物において天然には結合しないようなものであり得る。これらの系は、１９８４年ｌＯ月３日に公開されたＥＰＯ第１２０．５５１号、　１９８４年８月２２日に公開されたＥＰＯ第１１６，２０１号：および１９８５年１２月１８日に公開されたＥＰＯ第１６４．５５６号中に詳細に記載され、これらすべては本発明の譲受人に譲渡され、そして本明細書に参考として援用される。

発現宿主として利用可能なは乳類細胞系は、当該技術分野で公知であり、モしてＨｅＬａ細胞を含む、アメリカンタイプカルチャーコレクション（＾ＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞系、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビー／”ｔムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、および多くの他の細胞系を含む。

は乳類細胞に適するプロモーターもまた、当該技術分野で公知であり、そしてシミアンウィルス４０（ＳＶ４０）（Ｆｉｅｒｓ（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ　’１７３：１１３）、ラウス肉腫ウィルス（Ｒ８ｖ）、アデノウィルス（ＡＤｖ）、およびウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）などのウィルスプロモーターを含む。

は乳類細胞はまた、ターミネータ−配列およびポリＡ付加配列を必要とし得る；発現を増加するエン／へンサー配列もまた含まれ得、そして遺伝子の増幅を引き起こす配列もまた所望され得る。これらの配列は当該技術分野で公知である。

は乳類細胞中での複製に適するベクターは当該技術分野で公知であり、そしてウィルス複製単位（レプリコン）、または宿主ゲノム中へのＮＡＮＢＶエピトープをコードする適切な配列の組み込みを確実にする配列を含有し得る。

外来ＤＮＡを発現するために使用されるベクターであって、ワクチン調製に使用され得るベクターがワクチニアウィルスである。この場合、異質のＤＮＡがワクチニアゲノム中に挿入される。外来ＤＮＡのワタチニアウイルスゲノム中への挿入手法は、当該技術分野で公知であり、そして例えば、相同組換えを利用する。

異質ＤＮＡの挿入は、一般に生来必須でない遺伝子、例えば、チミジンキナーゼ遺伝子（拝）中であり、それはまた選択可能なマーカーを提供する。組換えウィルスの構築を多大に促進するプラスミドベクターが記載されている（例えば、Ｍａｃｋｅｔｔら（１９８４）Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　４９：８５７．、Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら（１９８５）　Ｍｏｌ。

Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、５：３４０３：　ＧＥＮＥ　ＴＲＡＮＳＦＥＲＶＥＣＴＯＲ３ＦＯＲＭＡＭＭＡＬＩ＾ＮＣＥＬＬＳ（ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１（ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ。

ｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ、）、ｐ−ｔｏ、中のＭｏ５ｓ（，１９８７）参照）。

次いで、ＨＣＶポリペプチドの発現が、細胞、または生きている組換えワクチニアウィルスで免疫化された個体中で起こる。

所望の配列をコードするＨＣＶ　ＣＤＮＡのセグメントが、ワクチニアベクター中に挿入される。ポリペプチドをコードする配列は、リーダー配列に付着され得る。リーダー配列は、組織プラスミノゲン活性化因子（ＴＰ＾）のリーダー配列、または例えば、β−グロビンのリーダー配列のような別の起源由来であり得る。異質のポリヌクレオチドは、クローニング部位を含むポリリンカー配列の付加による、ｐｓｃｌｌの改変形態である、ワクチニアベクター中に挿入され得る。

■Ｃｖポリペプチドが、ワクチニアベクターから発現されるか否か検出するために、ＢＳＣｌ細胞は組換えベクターで感染され得、そして発現を許容する条件下で顕微鏡スライド上で成長され得る。次いで、細胞はアセトン固定化され得、そして組換え発現ベクター中のＨＣＶセグメントが由来した■Ｃｖゲノム領域中にコードされるポリペプチドに対する抗ＨＣＶ抗体を含むことが知られている血清を用いて免疫蛍光アッセイが実行され得る。

真核性またはウィルスゲノムの発現のための他の系は、昆虫細胞およびこれら細胞中の使用に適したベクターを含む。

これらの系は、当該技術分野で公知であり、そして例えば、ヘルパー非依存性のウィルス発現ベクターである、バキュロウィルス組包旺肛血ｃａ　ｌ　ｉ　ｆ　ｏ　ｒｎ　ｉ　ｃａ核多角体病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）に由来する昆虫発現転移ベクターを含む。この系に由来する発現ベクターは、通常、強力なウィルス多角体病遺伝子プロモーターを使用し、異質遺伝子の発現を行う。目下のところ、ＡｃＮＰＶ中に外来遺伝子を導入するために最も一般的に使用される転移ベクターはｐＡｃ３７３である。当業者に公知の、多くの他のベクターがまた、改善された発現のために設計された。

これらは、例えば、ｐＶＬ９８５（多角体病遺伝子（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）開始コドンを＾ＴＧからＡＴＴに変え、そしてＡＴＴから３２塩基対下流にＢａ１旧クロ一ニング部位を導入；　ＬｕｃｋｏｖおよびＳｕ＋ｎｎ＋ｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１７：３１参照）を含む。融合していない外来タンパク質の良好な発現には、通常、ＡＴＧ開始信号に先行する適切な翻訳開始信号を含む、短いリーダー配列を理想的に有する外来遺アデニル化信号およびアンピシリン耐性（ａ！！Ｊ２）遺伝子、ならびに旦、並旦中での選択および増殖のための複製起点を含有し得る。

バキュロウィルス中の所望の部位に異質ＤＮＡを導入する方法は当該技術分野で公知である（Ｓｕ＋ｎａ＋ｅｒおよびＳｍ１ｔｈ、　Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｎ＋ｅｎｔ　５ｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ、１５５５　；　Ｊｕら（１９８７）　；　Ｓｎ＋ｉｔｈら（１９８３）Ｍｏ１．＆　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、３：２１５６−２１６５　；およびＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１７：３１参照）。例えば、挿入は、相同組換えにより、多角体病遺伝子のような遺伝子中てあり得、挿入はまた、所望のバキュロウィルス遺伝子中に作成された制限酵素部位中であり得る。挿入される配列は、ポリタンパク質の全てのまたは変化するセグメントをコードする配列、またはウィルスポリペプチドをコードする他のオーブンリーディングフレームであり得る。

シグナルペプチド切断、タンパク質分解性切断、およびリン酸化などの、翻訳後の修飾のための信号は、昆虫細胞により認識されるようである。分泌および核蓄積に必要な信号はまた、無を椎動物細胞およびを椎動物細胞間で保存されているようである。無を椎動物細胞中で有効なを椎動物細胞由来のシグナル配列の例は当該技術分野で公知であり、例えば、細胞外への輸送のための信号であるヒトインターロイキン−２シグナル（ＩＬ−２）は、昆虫細胞中で認識されそして適切に除去される。

イム　−セイ　゛本発明のｏｃｖ　ＥｌおよびＥ２抗原は、抗体を検出するために既知の抗原を用いる実質上すべてのアッセイ方法において用いられ得る。もちろん、目的の１（ＣＶ構造エピトープを変性する方法は避けるか、改変されるべきである。これらのアッセイのすべての共通の特徴は、）ＩＣＶ抗体を含む疑いのある生体成分と抗原とを、抗原を生体成分中に存在するそのような任意の抗体と結合する条件下で接触させるということである。このような条件は、代表的には、生理学的温度、ｐＨおよび過剰の抗原を用いるイオン強度である。抗原を標本とインキュベーションし、次いで抗原を含む免疫複合体を検出する。

イムノアッセイのデザインには、多数の変法があり、そして多くの方法が当該分野で公知である。例えば、プロトコルには、固体支持体または免疫沈降法が用いられ得る。大部分のアッセイは、標識化抗体またはポリペプチドの使用を含む：これらの標識は、例えば、酵素、蛍光、化学発光、放射活性、または色素分子であり得る。免疫複合体からのシグナルを増幅するアッセイもまた公知である：それらの例としては、ビオチンおよびアビジンを利用するアッセイ、および、ＥＬＩＳ＾アッセイのような酵素標識化および酵素介在性イムノアッセイがある。

イムノアッセイは、限定はされず、不均一系での方法または均−系での方法であり得、そして標準型または競合型であり得る。不均一系の方法では、ポリペプチドは、代表的には、インキュベーション後、ポリペプチドからの試料の分離を容易にするための固体マトリックスまたは固体支持体に結合する。用いられ得る固体支持体の例としては、ニトロセルロース（例えば、膜またはマイクロタイターウェル形態で）、ポリビニルクロライド（例えば、シートまたはマイクロタイターウェルで）、ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズまたはマイクロタイタープレートで）、ポリビニリジンフルオライド（Ｉｎ＋ｍｕｎｌｏｎＴ′とじて知られる）、ジアゾ化紙、ナイロン膜、活性化ビーズ、およびプロティンＡビーズがある。例えば、Ｄｙｎａｔｅｃｈ　ｌＩｎ１＋ｕｎｌｏｎＴ′１またはＩ■ ＩＩＩｕｎｌｏｎ”　２　フィクロタイタープレートまたは０．２５インチポリスチレンビーズ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｐｌａｓｔｉｃ　Ｂａ１ｌ）が、不均一系での方法において用いられ得る。抗原性ポリペプチドを含有する固体支持体は、代表的には、試験試料からその固体支持体を分離した後に、そして結合抗体を検出する前に、洗浄される。標準型の方法および競合型の方法は共に、当該分野では公知である。

均−系の方法では、試験試料は、溶液中の抗原と組み合わせてインキュベートされる。例えば、それは、形成される任意の抗原−抗体複合体が沈降され得る条件下で行われ得る。これらのアッセイの標準型の方法および競合型の方法は共に、当該分野では公知である。

標準型の方法では、抗原−抗体複合体中のＨＣＶ抗体の量は、直接、モニターされる。これは、抗）ＩＣｖ抗体上のエピトープを認識する標識化抗異種（例えば、抗ヒト）抗体が、複合体形成により結合し得るかどうかを決定することにより、行われ得る。競合型の方法では、試料中のＨＣＶ抗体の量は、複合体における既知量の標識化抗体（または他の競合リガンド）の結合に対する競合効果をモニターすることにより推定される。

形成された抗Ｈ（Ｊ抗体を含む複合体（または、競合アッセイの場合には競合抗体の量）は、方法に依存して、多くの既知の手法のいずれかによっても検出される。例えば、複合体中の非標識化ＨＣｖ抗体は、標識（例えば、酵素標識）で複合化された抗異種１ｇの複合体を用いて検出され得る。

イムノ沈降アッセイまたは凝集反応アッセイの方法では、Ｈ（Ｊ抗原と抗体との間の反応は、溶液または懸濁液から沈降する網目状物（ｎｅｔｗｏｒｋ）を形成し、そして肉眼で見える沈降物の層またはフィルムを形成する。抗ＦＩＣＶ抗体が試験標本中に存在しない場合、肉眼で見える沈降物は形成されない。

現在、３つの特異的な型の粒子凝集反応（ＰＡ）アッセイが存在する。これらのアッセイは、支持体にコーティングされる場合、種々の抗原に対して抗体を検出するために用いられる。

このアッセイの１つの型は、赤血球（ＲＢＣ）を用いる赤血球凝集反応アッセイであり、このＲＢＣは、ＲＢＣに吸着する抗原（または抗体）により受動的に感作される。生体成分中に存在する特異的抗原抗体の添加は、もし存在すれば、精製抗原でコーティングされたＲＢＣを凝集させる。

赤血球凝集反応アッセイにおける潜在的な非特異的反応を排除するために、２つの人工担体がＰＡ反応においてＲＢＣの代わりに使用され得る。これらのうち最も一般的なものは、ラテックス粒子である。しかし、ゼラチン粒子もまた使用され得る。これらの担体のいずれかを利用するアッセイは、精製抗原でコーティングされた粒子の受動的凝集反応に基づいている。

構造エピトープを含むＨＣＶ　ＥｌおよびＥ２抗原は、代表的には、これらのイムノアッセイにおいて使用されるためのキットの形態でパッケージされる。このキットは、通常は、別々の容器中に、ネイティブなＨＣＶ抗原、対照の抗体調製物（陽性および／または陰性）、そのアッセイ方法が標識化抗体を必要とする場合には標識化抗体、および、標識が直接シグナルを生成しないならばシグナル生成試薬（例えば、酵素基質）を含む。ネイティブなＨＣｖ抗原は、固体マトリックスに既に結合しているか、またはその抗原をマトリックスに結合させるための試薬とは別々であり得る。このアッセイを行うための指示書（例えば、書面、テープ、ＣＤ−ＲＯＭなど）が、通常、キット内に含まれ得る。

ネイティブなＨＣＶ抗原を利用するイムノアッセイは、潜在的に感染性ＨＣＶのない供給品を調製するための血液をスクリーニングするのに有用である。血液供給品を調製する方法は以下の工程を含む。血液供与者からの生体成分（好ましくは、血液または血液成分）を、１（ＣＶ抗体（もし存在すれば）とＨ（Ｊ抗原との間の免疫学的反応を可能にするために、ネイティブな）ＩＣＶ　ＥｌまたはネイティブなＨＣＶ　Ｅ２抗原と反応させる工程。抗ＨＣＶ抗体−ＨＣｖ抗原複合体が上記反応の結果として形成されるかどうかを検出する工程。血液製剤に拠出される血液は、ネイティブなＨＣｖ抗原、すなわちＥｌまたはＢ２に対する抗体を示さない供与者からのものである。

ＨＣＶ抗原に対する陽性の反応性の場合において、疑陽性の可能性を小さくするためにイムノアッセイを繰り返すのが好ましい。例えば、血液製剤（例えば、輸血、血漿、第Ｖｌｌ＋因子、免疫グロブリンなど）を製造するための血液の大規模スクリーニングにおいて、「スクリーニング」試験は、代表的には、特異性を犠牲にして、（汚染血液が合格しないことを確実にするために）フォーマット化されて感度を増大させる。すなわち、疑陽性の割合が増加する。従って、代表的には、「繰り返し反応性」　（すなわち、供与試料についてイムノアッセイを２回またはそれ以上実施した場合に陽性）である疑陽性の供与者をさらに試験するために繰り延べるだけである。

以下の実施例は、本発明を例示することを意図し、そしていかなる方法でも本発明を限定することを意図しない。

裏五勇ユ益並よ［九Δ遺ゑこの構築に用いられるｌ−１ｃｙ配列を、プラスミドｐＣ５Ｐ−１がら５ｔｕｌ　（部分消化）　／Ｂｇｌ１１フラグメントとして単離した。このフラグメントは、）ＩｃＶ−１のポリタンパクの最初のメチオニンがら９６６位のアスパラギン酸まで延びている。含まれるドメインは、それぞれ、ヌクレオキャプシドであるＣ１いずれも推定エンベロープ糖タンパクであるＥｌおよびＢ２、ならびにＮＳ２の短縮型である。さらに、そのフラグメントはまた、ＨＣＶゲノムの５°− 非翻訳領域部分に対応する約ｅｏｂｐを含む。

フレノウポリメラーゼでこのフラグメントを処理して平滑末端を作り、次いでワクチニアベクター、すなわちＰＳＣ５９（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭｄのＢ、　１ｌｏｓｓ博士から入手）の５ｔｕｌ部位内にクローニングする。このベクターを図２に示す。ベクターのポリリンカー配列内への連結反応の結果として、ＮＳ２領域のＣ゛末端、さらにＰｒｏ−Ｔｙｒ配列を含む。

夾亙貢ｌＥｌおよびＥ２Ａ゛ＨＣ■ポリタンパ　フラ　メント　。

コード　るワ　チニアウイルスのスト・・　の−１組換えワクチニアウィルスのスクリーニングを、Ｍａｃｋｅｔｔらのｒ　ＤＮＡ　ＣｌｏｎｉｎｇＪ第１１巻（Ｄ、　ｉｆ、　Ｇｌｏｖｅｒ編、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｏｘｆ。

ｒｄ、’Ｅｎｇｌａｎｄ、　１９８５．１９１−２１１頁）の記載に本質的に従って、実施した。さらに詳細には、アフリカミドリザルの腎細胞、すなわちＢ５Ｃ４０の集密細胞単層（６ｃ＋ｎ皿）を、０．０５の感染多重度（ＭＯＩ）で野生型ワクチニアウィルス（ＷＲ株）で感染させた。

３７°Ｃで２時間インキュベーション後、リン酸カルシウム法を用いて、２５μ ｇのＰＳＣ５９ポリＤＮＡで細胞をトランスフェクトした。

４時間のインキュベーション後、培地を正常培地に変え、そして細胞を３７°Ｃでさらに４８時間インキュベートした。細胞を皿からかき取ることによって細胞を回収し、そして凍結−融解を３回行うことによってウィルスを放出させ、そして細胞溶解物中の放出されたウィルスを一８０°Ｃで貯蔵した。

組換えウィルスをスクリーニングするために、ヒト１４３Ｔに一細胞に、細胞溶解物のＩＯ倍系列希釈液を２時間感染させた。

接種液を除去した後、２５μｇ／ｌｎ１の５−ブロモデオキシウリジンを含有する１％アガロース血清培地を添加し、そして細胞を３７℃で７２時間インキュベートした。０．０１％のニュートラルレッドを加えた１％アガロースを有する細胞層を重層し、そして細胞を３７°Ｃで一晩インキユベートすることによって、プラークを肉眼で見えるようにした。次いで、重層アガロースを注意深く除去し、そして細胞層をマスターニトリセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｒおよび５ｃｈｕｅｌｌ、　Ｂ、Ａ８５．０．４５μｉ＋）を用いてブロッティングした。マスターフィルターのレプリカプレートを作り、そしてＩＩｃＶＩｃ一対する３２Ｐ標識化ハイブリダイゼーシヨンプローブてプローブした。陽性プラークをマスターフィルターから単離し、それらを０．５ｍｌ無血清培地中に置き、そして３０秒間ずつ２回超音波処理した。このスクリーニングプロセスをプラークに２回繰り返して、ウィルスを精製した。

組換えワクチニアウィルスを増殖させるために、Ｂ５Ｃ４０細胞の１０個の皿（１５０ＣＩｎ２）に０．５の１１０１でウィルスストックを感染させた。感染を３７°Ｃで２時間行い、そしてウィルスストックを新鮮培地で置き換えた。７２時間後、細胞を集め、ｌｈ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ（ｐ）Ｉ　９．０）中に警濁し、そしてＷｈｅａｔｏｎ　ｄｏｕｎｃｅ組織破砕機中でホモゲナイズした。細胞破片を遠心分離によって除去し、上清液をトリプシン処理および超音波処理し、そしてウィルス懸濁液のアリコツトを一８０°Ｃで貯蔵した。

夫ム■１ ■」」【東Δ主減１リツトルのＨｅ１ａ　Ｓ３撹拌（５ｐｉｎｎｅｒ）細胞を、撹拌フラスコ中でｌｎ＋１当たり１０’個細胞の密度まで増殖させた。ＨＣＶポリタンパク質フラグメントをコードする組換えワクチニアウィルスを１．ＯのＭＯＩを用いて細胞に感染させ、−晩インキユベートし、細胞を集め、そして−８０°Ｃで細胞ペレットとして貯蔵した。

Ｅｌ／Ｅ２発現産物を、低張緩衝液中で細胞を溶解し、続いて非イオン性界面活性剤を含有する緩衝液中で抽出することにより精製した。細胞抽出物を、レクチン（ＧＮ＾）アガロースカラムを通してクロマトグラフィーにかけた。所望のタンパク質を、メチル−α−Ｄ−マンノピラノシド（Ｓｉｇｍａ　Ｃｏｒｐ、　）を用いてカラムから溶出させた。ＥｌまたはＢ２に対して作製された特異的抗血清を用いて、ウェスタンプロットによりＥｌおよびＢ２について溶出フラクションをモニターした。抗原を含むフラクションをプールし、Ｓ−セファロースカラム（ＰｈａｒＩｎａｃｉａ）上で濃縮した。最終生成物の純度は約７０％であった。

尖嵐■１イムノア・・セイのためのＥｌ／Ｅ２の■ 血清試料は、Ｕｎｉｇｌｏｂｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　（Ｒｅｓｅｄａ、　ＩＣ＾）から購入し、米国の東部用、西部用、中西部用および南部用から集められ、ランダムに選択された供与者の有償血漿から得た。　Ｈ，Ｔｏｎｇ　（Ｐａｓａｄｅｎａ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａのＨｕｎｔｉｎｇｔｏｎ　ＭｅＩｒｌｏｒｉａｌ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ）により提供された血清試料は、輸血関連慢性ＮＡＮＢＨの３８人の患者からなる一群と、慢性ＮＡＮＢＨの第１ｖ薬物（ＩＶ　ｄｒｕｇ）服用者の３９人の患者からなる別の群から得られた。

これらの７７人の患者は、他の肝疾患はなく、抗ＨＡＹおよび抗Ｈｂｓ抗原に非反応性であり、そして抗核抗体（ＡＮＡ）は正常であった。３人の輸血に伴うＩＩｃＶ血清変換（５ｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）パネルは、Ｈ０＾１ｔｅｒ　（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　１ｌａｒｙｌａｎｄ）およびＣ１ａｒｋｓｔｏｎ、　ＧｅｏｒｇｉａのＳｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから得た。急性分解性（ａｃｕｔｅ　ｒｅｓｏｌｖｅｄ）　ＨＣＶ試料は、Ｍａｘ　ｖｏｎ　Ｐｅｔｌｅｎｋｏｆｅｒ−１ｎｓｔｉｔｕｔｅ、［Ｉｎ１ｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　１ｌｕｎｉｃｈ、　Ｍｕｎｉｃｈ、　ＧｅｒＩｒｌａｎｙにより提供された。急性分解性（ａｃｕｔｅ　ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ）　ＮＡＮＢＩ（の１９人の患者を、長期追跡試験（２〜ｌ１年）の間の肝生体組織検査および正常アラニンアミノトランスフェラーゼ（＾ＬＴ）レベルに基づいて診断した。

”　）ＩｃＶ　、の　・　び１Ｃ２２（１１９７ミ／酸）、Ｃ１（１３０７ミ／酸）、Ｃ２（２５１７ミ／酸）、Ｎ５５（９４２アミノ酸）およびキメラＣ２５（ｃ２００／ｃ２２とも呼ばれる）　（８５８アミノ酸）の抗原を、酵母Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内の内部抗原として、Ｋｕｏ、　Ｇ、ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８９）　２４４：３６２−３６４およびＣｏｕｓｅｎｓ　Ｌ、ら、　Ｇｅｎｅ　（１９８７）　６１：２６５−２７２による前述の方法を用いてヒトスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）とのＣ−末端融合物として発現させた。５−ｔ−を抗原を合成するために、前述の方法を用いてＥ、　ｃｏｌｉ内で内部ＳＯＤ融合ポリペプチドとシテ、Ｃ３３Ｃ抗Ｒ（２６６アミ／酸）を発現させた（ＰＣＴ　１０８９１０４６６９９　、　ＥＰＯ公開番号第３１８．２１６号；およびＨｏｕｇｈｔｏｎら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４４：３５９　（１９８９）を参照、これらは、本明細書中に参考として援用されている）。細胞破壊および遠心分離に続いて、５關尿素または１％ＳＤＳのいずれかを用いて細胞ペレットから不溶性ＳＯＤ融合ポリペプチドを抽出し、そしてゲル濾過、またはイオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−およびＳ−セファロース）およびゲル濾過クロマトグラフィー（セファクリルＳ− ３００１１Ｒ）の組み合わせのいずれかを用いて精製した。

１（ＣｖのネイティブなＥｌおよびＥ２抗原［ｒＶＶ（ｅｌおよびＣ２）とも呼ばれる］を、完全長ＨＣＶ　ＥｌおよびＥ２遺伝子を含む組換えワクチニアウィルス（ｒｖｖ）感染細胞の小胞体から精製した。アフィニティクロマトグラフィー、続いて非変性条件下でイオン交換クロマトグラフィーによって精製を行った。これらの方法は、Ｗｏ　９２１０８７３４に記載されており、それは本明細書中に参考として援用されている。

ネイティブなＨＣＶ　Ｅ２抗原、すなわちＣＨＯ−Ｃ２を、５ｐａｅｔｅら。

Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　（１９９２）　１８８：８１９−８３０に本質的に従って調製した。より詳細には、ＣＨＯ−Ｃ２抗原を産生ずる哺乳動物Ｃｌ−１０細胞系を、３８３位の＾ｌａから６６１位のＧｌｕまでコードするＨｃｖ−を配列を含むプラスミドから構築した。次いで、完全長ｅ２（Ｃ２／ｎｓｌとも呼ばれる）抗原を発現する安定な細胞系を生成するために、このプラスミドをＣｌｌ０細胞内にトランスフェクトした。高い発現を示すクローンを、選別し、そしてｌＯ％透析済ウシ胎児血清および１．６μ菖メトトレキセートを加えた通常の補充液を含むＤＭＥ／１（２１内で増殖させることによって、ローラーボトル内で増殖させた。培養培地の上清液を集め、そしてＣＨＯ−Ｃ２抗原を精製するために用いた。精製スキームは、非変性条件下でのアフィニティクロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーを含んでいた。

ネイティブなＣ２推定構造エピトープを不安定化するために、最終濃度１０ａ＋ＭのＤＬ−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．２％ドデシル硫酸ナトリウム（５ＤＳ）を添加し、１００℃で５分間煮沸することによって、変性Ｃｌ０−Ｃ２を調製した。すべての精製組換え）１ｃＶ抗原は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル分析およびクマシーブルーによる染色により、少なくとも９０％の純度であると判断された。

匹卦尤ＬＬ欠イ［Ｖ（ｅｌおよびＣ２）　、ＣＨＯ−Ｃ２および変性Ｃｌ０−Ｃ２抗原を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）　（ｐＨ７，４）で最適濃度に希釈し、そしてこれらをｌｆｆ１ｆｆｌｕｌｏｎＴ１′１プレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ、　Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、Ｆ＾）上にコーティングした。ＥＬＩＳ＾アッセイを以下のように行った。プレート上の試験標本を試料希釈液で４０倍に希釈し、そして３７℃ で１時間インキュベートし、次いで洗浄緩衝液で洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）に結合したポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）抗体を各ウェルに添加した。プレートを３７°Ｃで１時間インキュベートし、次いで洗浄した。０−フェニレンジアミン２　ＨＣＩ　（ＯＰＤ）および過酸化水素をＨＲＰ発色のために添加した。これらの結果は、プレートリーダーを用いて、４９２／６２０ｎｍで読み取った。抗原のＲＶＶ（ｅｌおよびＣ２）　、５ＯＤＳＣ２５、Ｃ２２、Ｃ３３Ｃおよびｎ５−５に対するＥＬＩＳＡカットオフ０．Ｄ、値は、陰性対照の平均からの０．Ｄ、値に０．４を加えた値であった。Ｃｌ０−Ｃ２および変性ＣｔｌＯ−ｅ２のカットオフ値は、対応する抗原陰性対照からの０．Ｄ、値に０．３０．Ｄ、を加えた値であった。抗Ｃ１００−３のカットオフ値は、その平均陰性対照０．Ｄ。

値に０．４５０．Ｄ、値を加えた値であった。

イム　・・セ　ｒ米国患者群から得た血液成分中の抗ＨＣＶ抗体を検出するための上記の抗原を用いたＥＬＩＳ＾アッセイの結果を表１に示す。

（以下余白）表１の結果は、酵母産生ＨＣＶエンベロープ抗原ｅｌおよびＣ２が、ワクチニアウィルスＲＶＶ（ｅｌおよびＣ２）内ならびにＣ）１０細胞ｃｎｏ−Ｃ２内で産生された組換え抗原よりも免疫反応性がずっと低いことを示す。各試験群において、酵母産生抗原（ｅｌおよびＣ２）の反応性は、動物細胞内で産生された抗原の反応性の２７３にすぎないかまたはそれより低かった。酵母ｅｌおよびＣ２抗原が酵母細胞内で産生され、そして変性条件下で精製されたことは、注記に値する。このように、直鎖状エピトープのみがこれらの抗原内に存在するようである。対照的に、ネイティブなＨＣＶ抗原、ＲＶｖ（ｅｌおよびＣ２）、ならび１． −Ｃ）１０−Ｃ２は、非変性条件下で宿主動物細胞から単離し、ネイティブな構造エピトープを存在させるようにした。

細胞内でＥｌおよびＥ２遺伝子から発現した組換えネイティブＨＣＶ抗原は、Ｃ３３Ｃおよび恐らくはＣ２５と同程度の免疫反応性があり、そして調べた他のＨＣｖ抗原のいずれよりも免疫反応性が高いようである。Ｃ２５は、ＮＳｓ、　ＮＳ４、およびＣポリペプチド部分を含み、そして図１に示したように融合したキメラ性ポリタンパク質である。

宿主免疫系初期応答の刺激における構造エピトープの役割を、ＨＣＶ血清変換パネルのイムノアッセイにより評価した。表２の結果は、ネイティブなＨＣＶエンベロープ抗原、ＲＶＶ（ｅｌおよびＣ２）、ならびにＣＩ（０−Ｃ２の、３種の血清変換パネルのサンプルとの免疫反応性を示す。パネルのサンプルはそれぞれ、輸血後ＮＡＮＢＨである個人からの逐次的採血を示す。表２の結果かられかるように、ネイティブなＨＣＶエンベロープ抗原、即ち、天然の構造エピトープを有するＨＣｖエンベロープ抗原は、試験した他の■Ｃｖ抗原が検出する抗体と比べると、感染経過の間の比較的初期に生じる抗体を検出する。このように、これらの抗原は、Ｉ（ＣＶ感染診断用イムノアッセイに特に有用であり得る。

（以下余白）表３の結果は、ＥｌおよびＥ２遺伝子から発現したネイティブな１（ＣＶ抗原の、対応する変性抗原との比較を示す。表では、急性分解性ＮＡＮＢ）Ｉである患者由来の血清との免疫反応性を、時間と共に追跡し、そして慢性ＮＡＮＢＨである患者由来の血清と比較した。表３かられかるように、構造エピトープおよび直鎖状エピトープを両方とも含むネイティブなＨＣＶエンベロープ抗原、ＲＶＶ（ｅｌおよびｅ２）、ならびにＣＨＯ−ｅ２は、直鎖状エピトープ、ｅｌおよびｅ２（酵母内で産生された）、ならびに変性ＣＨＯ−ｅ２を含む抗原よりも免疫反応性が高い。総合的な観察によれば、ネイティブなＨＣＶエンベロープ抗原の免疫反応性は、急性分解性患者では、８〜９倍の間で増大し、そして慢性ＮＡＮＢＨ患者では約２倍増大する。このように、分解型（ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ　ｆｏｒｔ＋）ＮＡＮＢＨである患者の免疫学的反応の多くは、構造エピトープに対しての反応であるが、急性型での免疫学的反応は、構造エピトープおよび直鎖状エピトープに対する反応に、大体均等に分かれる。

これらの研究は、構造エピトープが、ＨＣＶに対する宿主の免疫学的反応に関与し得るという最初の証拠を与える。

（以下余白）蝿怠薯斧社型寧本トベ八ｉ太］汁旦 ■ ３群の患者を調べた。全ての患者は、ヒト免疫不全ウィルス（ｌ（ＩＶ）に対する抗体については陰性であった。群ｌは、２０人の輸血関連慢性ＨＣＶ感染しているが、それ以外は健康な免疫適格（ｉｍｆｆｌｕｎｏｃｏａ＋ｐｅｔｅｎｔ）患者からなっていた。全ての患者が抗ＩＩＣｖおよびＨＣＶ　ＲＮＡについて陽性であった。群ＩＩは、１５人の維持血液透析中の患者を含んでいた。１１人が、提示（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉ。

ｎ）時に抗ＨＣＶ陽性であり、１人は、追跡調査（ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ）中に腎移植を受けた。４人の患者が、追跡調査中に抗ＨＣｖ陽性になった。群ＩＩ＋は、１７人の腎移植片波移植者を含んでいた。７人の患者が、提示時にＨＣＶおよびＨＣＶ　ＲＮＡ陽性であった。７人が追跡調査中に抗ＨＣＶ陽性になり、そのうちの２人は初期にはＨＣＶ　ＲＮＡのみ陽性であった。２人の患者が、提示時に１（ＣＶ　ＲＮＡのみ陽性であり、両者ともＨＣＶ　ＲＮＡ陽性であり続けたが追跡調査中は抗ＨＣＶ陰性であった。１人の患者が、追跡調査中にのみ１１ＣＶ　ＲＮＡ陽性になった。

■ 血清は、先を見越して１９８９年７月と１９９２年４月との間に収集し、そして試験に先立って、アリコートを一７０℃で貯蔵した。

ｕＩの患者については、２〜４サンプルを６〜１２ケ月の間隔で試験した。群Ｉ＋および群ＩＩ＋の全ての患者については、１．５〜２年の間隔で収集した２サンプルを試験した。第２サンプルで抗ＨＣＶおよび／またはＨＣＶ　ＲＮ＾状態に変化があった患者については、中途期間の追加サンプルおよび追跡調査サンプルも試験した。

匹卦Ａ７ム立イ）ＩＣＶ抗原を実施例４と同様にして調製し、そして実施例４で記載したように、ＥＬＩＳＡアッセイで用いた。ＮｅｌおよびＣ２アッセイでは、ワクチニアタンパク質への結合による偽陽性は、（ｉ）サンプル希釈物への、競争的抗原として作用するワクチニア細胞溶解物の添加、および（１１）陰性コントロールとしてのワクチニア反応性サンプルの使用により低下する。

図３八〜３Ｃに結果を示す。群■の免疫適格患者のうち５５％のみが、酵母内で発現したｅｌおよびＣ２抗原に対して反応した。

しかし、全ての患者が、ワクチニアウィルス内で発現したネイティブなグリコジル化ｅｌまたはＣ２抗原に対して反応した。

免疫適格患者の場合と同様に、はとんどの群１■の血液透析患者が、Ｃ２５、Ｃ２２、ならびにＮ　ｅｌおよびＣ２抗原に対して反応性であった。顕著に低い割合の患者が、Ｃ１００−３、Ｃ３３ＣＳＮＳ−５、ｅｌ、およびＣ２と反応した。免疫適格患者と比較すると、群１１１の腎移植片波移植者のうちの顕著に少数が、試験した全ての）ＩＣＶ抗原に対して反応した。

全ての免疫適格患者が、Ｃ２５、Ｃ２２、およびＣ３３Ｃに反応した１９０％がＮ５−５に反応し、そして８０％がＣ１００−３に反応した。５５％のみが酵母誘導ｅｌおよびＣ２抗原に対して反応したが、全員がワクチニア発現Ｎ　ｅｌおよびＣ２抗原に反応し、このことにより、エンベロープエピトープが構造性であり、そしてグリコジル化されていることが示された。透析患者および移植患者のうち６５％〜９０％が、Ｃ２５、Ｃ２２、ならびにＮｅｌおよびＣ２に反応したが、１２％〜６０％のみがＣ１００−３、Ｃ３３Ｃ，およびＮ５−５に反応した。Ｃ２５ならびにＮ　ｅｔおよびＣ２はあまり影響されずに、肝炎Ｃウィルス抗原への反応性の減少または喪失が、腎移植または骨髄移植の後、観測された。

このことは、ｅｌおよびＣ２エピトープが構造性であり、そしてこれらのエピトープへの反応性は、他のＨＣｖ抗原に比べて、免疫抑制により最小の影響を受けることを示唆する。

巾障慣審報牛ＰＣＴ／ｕｓ　９３１０６３０９

Claims

【特許請求の範囲】

１．Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対する抗体を含む疑いのあるほ乳類生体成分中の該抗体を検出する方法であって、該生体成分を、ＨＣＶのＥ１またはＥ２ドメイン由来の構造エピトープを含むＨＣＶ抗原と、（もし存在すれば）該抗体と該抗原との間の免疫反応を行わせる条件下で接触させる工程、および該抗体と該抗原との（もし存在すれば）免疫複合体の存在を検出する工程を包含する方法。
２．前記ＨＣＶエンベロープ抗原がＨＣＶゲノムのＥ１ドメイン内にコードされる、請求項１に記載の方法。
３．前記ＨＣＶエンベロープ抗原がＥＩである、請求項１に記載の方法。
４．前記ＨＣＶエンベロープ抗原がＨＣＶゲノムのＥ２ドメイン内にコードされる、請求項１に記載の方法。
５．前記ＨＣＶエンベロープ抗原がＥ２である、請求項１に記載の方法。
６．構造エピトープを含む第２のＨＣＶエンベロープ抗原をさらに含む、請求項１に記載の方法。
７．前記天然のＨＣＶエンベロープ抗原が組換えワクチニアウイルスから発現される、請求項６に記載の方法。
８．前記Ｅ２がＣＨＯ細胞で発現される、請求項５に記載の方法。
９．血液製剤を調製するために血液または血液成分を使用する前に、そのような血液または血液成分をＨＣＶについてスクリーニングする方法であって、ａ）潜在的な供与者由来の生体成分を、ＨＣＶのＥ１またはＥ２ドメイン由来の構造エピトープを含むＨＣＶ抗原と、（もし存在すれば）該生体成分中の抗体と該抗原との間の免疫反応を行わせる条件下で反応させる工程；ｂ）該抗原と該抗体との間で形成される複合体を、もし存在すれば、検出する工程；およびｃ）該複合体が工程ｂ）で検出される場合に該供与者からのすべての血液または血液成分を捨てる工程、を包含する方法。
１０．ＨＣＶ抗体を検出するキットであって、適切なバイアル中に荷造りされた、ＨＣＶのＥ１またはＥ２ドメイン由来の構造エピトープを含むＨＣＶ抗原、および対照標準物、ならびに該キット成分の使用の指示を含むキット。