JPH0751056A - ミルディオマイシン生産菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】新しいミルディオマイシン生産菌の提供。 【構成】セリンヒドロキサメートまたはカナバニンに耐
性を有し、かつミルディオマイシン生産能を有するスト
レプトバーティシリウム・リモファシエンス。 【効果】優れたミルディオマイシン生産能を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、発酵法によるミルディ
オマイシンの製造法に用いられるミルディオマイシン生
産菌に関する。

【０００２】

【従来の技術】ミルディオマイシン（Mildiomycin）は、
式

【化１】 の構造を有する化合物であって、ストレプトバーティシ
リウム“Streptoverticillium”属に属するミルディオ
マイシン生産菌の培養により当初抗生物質Ｂ−98891と
称して見出され、 その性状とりわけ作用特性から特に広
範囲の作物のウドンコ病に対する予防、 治療効果あるい
は殺ダニ効果が注目されている。 そのため、ミルディオ
マイシンの増産も望まれ、 ミルディオマイシン生産菌を
Ｎ−メチル化合物を３mＭ(mmol/ｌ)以上含有する培地あ
るいは５−ヒドロキシメチルシトシンを含有する培地で
培養する発酵法が試みられている(特公昭50−126892,
同51−9718, 同56−5100, 同56−32495; ザ・ジャーナ
ル・オブ・アンティビオティクス“The Journal of Ant
ibiotics"第31巻, 第6号,第511−518頁及び第519−524
頁(1978年); 日本農薬学会誌(ジャーナル・オブ・ペス
ティサイド・サイエンス“Journal of Pesticide Scien
ce")第4巻, 第3号, 第349−353頁(1979年); テトラヘド
ロン“Tetrahedron"第37巻, 第1317−1327頁(1981年)な
ど)。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
発酵法によるミルディオマイシンの製造法は、用いられ
るミルディオマイシン生産菌のミルディオマイシン生産
能が限られたものであったので、培地含有物の改良によ
るミルディオマイシンの増産も限られたもので、工業的
に多量のミルディオマイシンを生産する上で充分なもの
とは言えない。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、ミルディ
オマイシン生産菌のミルディオマイシン生産能を改良す
べく鋭意研究した結果、ミルディオマイシン生産菌を式

【化２】 の構造を有するセリンヒドロキサメートまたは式

【化３】 の構造を有するカナバニン“canavanine”に耐性にする
と、予想外にもミルディオマイシン生産能が改良され従
来の培地における培養においてもミルディオマイシンの
生産効率がより高いものになることを見出し、これに基
づいて本発明を完成した。即ち、本発明は、セリンヒド
ロキサメートまたはカナバニンに耐性を有し、 かつミル
ディオマイシン生産能を有するストレプトバーティシリ
ウム・リモファシエンス“Streptoverticillium rimof
aciens”に関する。本発明のストレプトバーティシリウ
ム属に属し、セリンヒドロキサメートまたはカナバニン
に耐性を有するミルディオマイシン生産菌（以下“本
菌”と称する）は、たとえば次のような性質を示すもの
である。

【０００５】〔１〕形態的特徴 本菌は通常の分類培地上で気菌糸を形成し、車軸分枝を
示す。輪生枝上の各分枝は直状である。ある種の合成寒
天培地たとえばグルコーズ・アスパラギン寒天培地上で
はまれにループ、 フツクも認められる。胞子の形は卵形
ないし円筒形であり、その大きさは0.6〜0.8×0.7〜1.3
μである。 胞子は通常３ないし16個が連鎖しており、 そ
の表面は平滑ないしいぼ状の突起が認められる。 通常の
分類培地上で胞子のう、 鞭毛胞子、菌核などの形成が認
められない。 〔２〕分類培地上の成育状態 本菌の分類培地上の所見は〔表１〕〜〔表３〕に示すと
おりである。なお、とくに記載しないかぎり28℃で21日
間観察した培養所見である。 また、 表中( )内はカラー
・ハーモニー・マニュアル(４版)(コンティナー・コー
ポレーション・オブ・アメリカ)による色名の記号であ
る。

【０００６】

【表１】

【０００７】

【表２】

【０００８】

【表３】

【０００９】〔３〕生理的性質 （１）生育温度範囲：１５〜３８℃で生育するが２８〜
３６℃でより良好な生育と気菌糸の着生が認められる。 （２）ゼラチンの液化（２４℃，２８日培養）：液化認
められない。 （３）スターチ加水分解:陽性 （４）硝酸塩還元:バクト・ナイトレート・ブロス（Ｉ
ＳＰ−Ｎｏ．８）およびツアペック液で陰性 （５）脱脂乳の凝固: 陽性 ペプトン化: 陽性 （６）メラニン様色素の生成： 陽性(ペプトン・イースト・鉄寒天培地) 陰性(チロシン寒天培地) （７）炭素源利用性(プリドハム・ゴットリーブ寒天培
地) ｉ）よく利用される炭素源 イノシトール,Ｄ−ガラクトーズ,Ｄ−グルコーズ,マル
トーズ,Ｄ−マンノーズ,スターチ,グリセリン,酢酸ナト
リウム,コハク酸ナトリウム,クエン酸ナトリウム ii）やや利用される炭素源 Ｄ−フラクトーズ,トレハローズ iii）利用されない炭素源 エリスリトール,アドニトール,Ｄ−ソルビトール,Ｄ−
マンニトール,ヅルシトール,Ｄ−キシローズ,Ｌ−アラ
ビノーズ,Ｌ−ソルボーズ,ラムノーズ,メリビオーズ,シ
ュークローズ,ラクトーズ,ラフィノーズ,サリシン,エス
キュリン,イヌリン （８）蛋白含有培地上のクロモゲニック作用: 弱 （９）肉汁寒天培地における亀裂生成: 生じない （10）セリンヒドロキサメートまたはカナバニン耐性:
生育を阻止する最少濃度がセリンヒドロキサメートに対
し40μg/mlより大であるか、 カナバニンに対し100μg/m
lより大である。

【００１０】〔４〕その他の性質 ジャーナル・オブ・ファーメンテーション・テクノロジ
ー“Journal of Fermentation Technology”第63巻, 第
1号, 第17−21頁(1985)に記載の酵素法により、５−ヒ
ドロキシメチルシトシンを生成する比活性が0.18nmol/m
in/mg・蛋白より大である。 このような性質を有する本菌としては、ストレプトバー
ティシリウム・リモファシエンスが用いられ、より具体
的にはたとえばストレプトバーティシリウム・リモファ
シエンスＣ₃ ^R−182(セリンヒドロキサメートに耐性),ス
トレプトバーティシリウム・リモファシエンスＣＶ^R−4
8(セリンヒドロキサメート及びカナバニンに耐性)，ス
トレプトバーティシリウム・リモファシエンスＣＶ^R−
１６（カナバニンに耐性）などが用いられる。 上記スト
レプトバーティシリウム・リモファシエンスＣ₃ ^R−182
は、 財団法人発酵研究所(ＩＦＯ)に昭和60年(西暦1985
年)6月28日から受託番号ＩＦＯ−14448として寄託され、
さらに日本国通商産業省工業技術院微生物工業技術研
究所(ＦＲＩ)に昭和60年7月8日から受託番号ＦＥＲＭＰ
−8334として寄託されている。 また、 ストレプトバーテ
ィシリウム・リモファシエンス ＣＶ^R−48は、 ＩＦＯに
昭和60年6月28日から受託番号ＩＦＯ−14449として寄託
され、 さらに、ＦＲＩに昭和60年7月8日から受託番号Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−8333として寄託されている。さらにストレ
プトバーティシリウム・リモファシエンス ＣＶ^R−16
は、 ＩＦＯに昭和61年7月15日から受託番号ＩＦＯ−145
27として寄託され、 さらにＦＲＩに昭和61年7月25日か
ら受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−8874として寄託されている。

【００１１】本発明の本菌を用いたミルディオマイシン
の製造法における培養では、一般に微生物が同化しうる
炭素源、消化しうる窒素源および無機塩類などを含有さ
せた培地が使用される。また培地には必要に応じて微量
栄養素,発育促進物質,前駆物質などの微量有効物質を添
加してもよい。一般に微生物が同化しうる炭素源として
は、たとえば澱粉,デキストリン,グルコース,マルトー
ス,シュクロース,糖密,コーンシラップ,水飴などのほか、たと
えば酢酸,コハク酸などの有機酸や油脂,あるいはグリセ
リンなどの多価アルコールなどを単独もしくは組合せて
用いることができる。消化しうる窒素源としては、各種
のアンモニウム塩,硝酸塩や尿素などの無機窒素化合物
のほか、酵母エキス,カゼイン,肉エキス,綿実粕,コーン
スティープリカー,大豆粕などの天然有機物を単独もし
くは組合せて用いることができる。さらに無機塩類とし
ては、たとえば鉄,マグネシウム,マンガン,コバルト,
銅,ナトリウム,カリウム,カルシウム,亜鉛などの塩類が
適宜必要に応じて用いられる。用いる微生物がアミノ
酸,ビタミン,核酸塩基などの特定の栄養物を要求する場
合には、要求する栄養物を適宜添加することができる。
これら添加物の添加濃度は、本発酵の目的が達成される
限り特に限定されるものではなく、通常一般の発酵法で
用いられる添加濃度範囲より適宜選択される。

【００１２】また、ミルディオマイシンの生成を良好な
ものとするために、培地中にＮ−メチル化合物を存在せ
しめるのがよい。このようなＮ−メチル化合物として
は、分子内に１ないし４個のメチル基で置換された窒素
原子を１個以上有する化合物が用いられる。なかでも、
たとえば分子内にメチル基で置換された窒素原子を１個
有するものなどがよく、とりわけ３個のメチル基で置換
された窒素原子のトリメチルアムモニオ(trimethylammo
nio)基:−Ｎ⁺(CH₃)₃を有する第四アンモニウム塩が好適
である。また培地中で＞Ｎ−ＣＨ₃に変りうるもの、た
とえばＮ,Ｎ−メチレンビスアクリルアミドなども、Ｎ
−メチル化合物として用いられる。Ｎ−メチル化合物の
分子量は、通常50〜1000好ましくは90〜130である。 水
溶性、 非水溶性にかかわらず用いられるが、 易水溶性の
Ｎ−メチル化合物が利用しやすい。具体例としては、た
とえばＮ−メチル酸アミド,Ｎ−メチルアミノ化合物,Ｎ
−メチルアミン,Ｎ−メチルアムモニウムあるいはＮ,Ｎ
−メチレンビスアクリルアミドなどが用いられる。Ｎ−
メチル酸アミドとしては、たとえばＮ,Ｎ−ジメチルア
セタミド,Ｎ−メチルアクリルアミドなどが、Ｎ−メチ
ルアミノ化合物としてはＮ−メチル尿素,１,１,３,３−
テトラメチル尿素,２−ジメチルアミノエタノールなど
が、Ｎ−メチルアミンとしては、たとえばトリメチルア
ミン,ジメチルアミンなどが、またＮ−メチルアムモニ
ウムとしては、たとえばレシチン,コリン,ベタイン,テトラ
メチルアムモニウムなどが有利に用いられる。Ｎ−メチ
ルアムモニウムとりわけコリン,ベタイン,テトラメチル
アムモニウムを用いた場合に、好結果が得られる。

【００１３】これらのＮ−メチル化合物は、単独または
２種以上を混じて用いてもさしつかえない。またＮ−メ
チル化合物を含有する物、たとえばベタインを含有する
てんさい糖蜜、レシチンを含有する大豆粉またはコリン
とレシチンを含有する鶏卵等を多量培地中に添加し、Ｎ
−メチル化合物として３mＭ以上含有させる方法も本発
酵方法に含まれる。培地に含有されるＮ−メチル化合物
の濃度は、用いる微生物の発育を抑制しない範囲で適宜
選択すればよく、通常３mＭ以上含有させられる。望ま
しくは４mＭないし200mＭ、さらに好ましくは７〜50mＭ
の添加が効果的であり、200mＭを越えると効果の進展率
が鈍化する。 またＮ−メチル化合物を含有する天然物の
添加量は、含有されるＮ−メチル化合物の濃度が前述の
範囲になるように選択すればよいが、従来の天然物の添
加量を越える多量を用いることになるので、天然物の単
独添加では他の成分の影響により微生物の発育が著るし
く影響をうけ、ミルディオマイシンの生産が阻害される
場合もあり、その場合にはＮ−メチル化合物を併用する
のがよい。また、これらのＮ−メチル化合物を培地に含
有させる時期は、培地に微生物を接種する以前に添加す
るのが最も容易かつ効果的な方法であるが培養の間に適
宜添加することもできる。

【００１４】さらに、本発酵においては、ミルディオマ
イシンの生成を良好なものとするために、培地中に５−
ヒドロキシメチルシトシンまたは培地中でそれを生成す
る化合物を存在せしめてもよい。５−ヒドロキシメチル
シトシンを添加する場合、あるいは５−ヒドロキシメチ
ルシトシンを培地中で生成する化合物を添加する場合の
添加濃度は、５−ヒドロキシメチルシトシンとして0.01
〜1.0％(重量／容量)が望ましいが、さらに望ましくは
0.03−0.5％(重量／容量)である。これらを培地に添加
する時期は、培養の開始以前に加えるのが最も有効であ
るが培養途中経時に添加しても差支えない。培養は表面
培養法によってもよいが、通常、深部通気培養法による
のが合理的である。深部培養法による場合、培地の液性
は微酸性ないし微アルカリ性がよく、また培養の温度は
15〜40℃、 とりわけ24℃−34℃に保つのが望ましい。 し
かし、 これらの培養条件は、 使用する菌株の種類や外部
の条件などに応じて好ましい結果が得られるように適
宜、 選択することは言うまでもない。 通常４日〜14日間
培養すれば、 ミルディオマイシンを著量含有する培養液
が得られるが、 培養液からミルディオマイシンを採取す
るには、 微生物の代謝産物をその培養液から採取するの
に通常用いられる分離、 採取の手段が適宜使用される。
たとえばミルディオマイシンは水溶性塩基性の物質で、
主として培養液中に含まれるので、 まずろ過、 遠心分離
などの手段で菌体を除去する。 得られた上清液を適宜の
吸着剤、 たとえば活性炭,吸着性樹脂,陽イオン交換樹
脂,活性アルミナ,シリカゲルの如き吸着剤あるいは分子
篩と接触させて目的物質を吸着させたのち、 たとえばア
セトン,メタノール,エタノール,プロパノール,ブタノー
ルなどの水溶性有機溶媒の含水液、 あるいは酸,アルカ
リ,緩衝液もしくは無機塩,有機塩の水溶液を溶剤とし
て、目的物質を溶離することができる。 これらの分離手
段を適宜組合せて実施したのち、 有効画分を濃縮、 粉末
化を行えば、 ミルディオマイシンを遊離の状態もしくは
塩の状態で採取することができる。

【００１５】本発明のミルディオマイシンの製造法で用
いられるストレプトバーティシリウム属に属し、セリン
ヒドロキサメートまたはカナバニンに耐性を有するミル
ディオマイシン生産菌は、たとえばストレプトバーティ
シリウム属に属するミルディオマイシン生産菌をセリン
ヒドロキサメートまたはカナバニン耐性に変異誘導する
などによって得られる。変異誘導に供せられるストレプ
トバーティシリウム属に属するミルディオマイシン生産
菌としては、たとえばストレプトバーティシリウム・リ
モファシエンス Ｅ５−24−５(以下“親株"と称する)
などが繁用される。上記親株は、ＩＦＯに昭和56年(西
暦1981年)6月12日から受託番号ＩＦＯ−14125として寄
託され、 さらにＦＲＩに昭和56年6月24日から受託番号
ＦＥＲＭＰ−6052として寄託されている。 セリンヒドロ
キサメートまたはカナバニン耐性に変異誘導する方法と
しては、 たとえばストレプトバーティシリウム属に属す
るミルディオマイシン生産菌の胞子または菌糸に紫外線
を照射する方法、 ストレプトバーティシリウム属に属す
るミルディオマイシン生産菌を式

【化４】 の構造を有するＮ−メチル Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジンと接触せしめる方法、ストレプトバーティ
シリウム属に属するミルディオマイシン生産菌を式

【化５】 の構造を有するＤ−４−アミノ−３−イソオキサゾリド
ン(一般名“サイクロセリン")含有培地で生育せしめる
方法、あるいはこれらの方法を組合せて用いる方法など
が用いられる。

【００１６】たとえば、ストレプトバーティシリウム属
に属するミルディオマイシン生産菌の胞子または菌糸に
紫外線を照射する変異誘導の方法では、10〜100ワット
好ましくは30〜60ワットの紫外線灯を用いて、 たとえば
親株の胞子または菌糸に紫外線を照射するのがよい。 紫
外線の波長としては、 通常130〜350nm好ましくは190〜2
90nmが用いられる。 照射時間は、 通常30秒〜５分間好ま
しくは60秒〜90秒間である。 親株の胞子または菌糸は、
たとえば滅菌水などに懸濁した後に紫外線照射に供して
もよい。 具体的には、 無菌箱内に設置した30ワットの紫
外線灯の下方30cmに、 親株の胞子を滅菌水に懸濁した液
を置き、 撹拌下90秒間紫外線(波長2537A)照射するなど
によって変異誘導してもよい。 ストレプトバーティシリウム属に属するミルディオマイ
シン生産菌をＮ−メチル Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソ
グアニジン[IV]と接触させる変異誘導の方法では、ミル
ディオマイシン生産菌の胞子、気菌糸の単細胞と化合物
[IV]とを接触させるのがよい。接触は、両者が接触する
限りいかなる方法で行なわれてもよいが、通常混合など
によって行なわれる。接触させる時の温度は、0℃〜50
℃好ましくは10℃〜40℃である。 接触時間は、 通常10秒
〜３時間好ましくは10分〜２時間である。ミルディオマ
イシン生産菌の胞子、気菌糸の単細胞は、適当な分散媒
に分散させて用いてもよく、たとえばシュクロース１〜
９％(w/v)、 グルタミン酸ソーダ１〜６％(w/v)、ツィー
ン80(花王アトラス社製) 0.001〜0.1％(w/v)及び滅菌水
からなる分散媒を110〜130℃で10〜30分間蒸気滅菌した
ものに分散させて用いてもよい。 また、 化合物[IV]は、
たとえばトリスアミノメタン−塩酸緩衝液(pH 7.5)など
の緩衝液に溶して用いてもよい。 化合物[IV]を緩衝液に
溶す濃度は、 1.0〜5000μg/ml 好ましくは100〜200μg
／mlである。

【００１７】さらに、ストレプトバーティシリウム属に
属するミルディオマイシン生産菌をサイクロセリン[V]
含有培地で生育せしめる変異誘導の方法では、ミルディ
オマイシン生産菌をサイクロセリン[V]10〜100μg/ml好
ましくは20〜60μg/ml含有する培地で培養するのがよ
い。 その他の培養条件としては、 上記のセリンヒドロキ
サメートまたはカナバニンに耐性を有するミルディオマ
イシン生産菌の培養で述べたごとき培養条件より適宜選
択して用いることができる。 このような変異誘導の方法によって得られる変異株の中
よりセリンヒドロキサメートまたはカナバニンに耐性を
有するミルディオマイシン生産菌を選択する。このよう
な選択は、 放線菌の分野で一般に用いられる耐性菌の選
択方法に従って行なうことができ、 たとえば変異誘導処
理後に得られる懸濁液、 混合液あるいは菌叢を親株が生
育できないような量のセリンヒドロキサメート(40〜200
μg/ml好ましくは60〜120μg/ml)またはカナバニン(100
〜300μg/ml好ましくは110〜240μg/ml)を含有する培地
に塗布あるいは移植し、 生育する菌株を分離するなどに
より行なってもよい。 また変異誘導処理後に得られる懸
濁液,混合液あるいは菌叢を、 ５−ヒドロキシメチルシ
トシン生合成の阻害剤であるアミノプテリン(２〜50μg
/ml好ましくは５〜20μg/ml)を含有する培地に塗布し、
生育させたのち、その寒天の一部(アガーブロック)を切
り出してその寒天片の抗菌力を常法により検定（被検
菌，Rhodotorula rubra）し、 抗菌力の強いものを選択
することにより、 セリンヒドロキサメート耐性を有する
優れたミルディオマイシン生産菌の選択をより確実なも
のとする目安にすることができる。 以上に述べたセリ
ンヒドロキサメートまたはカナバニンに耐性を有するミ
ルディオマイシン生産菌を得る方法を繰り返し用いるこ
とにより、 セリンヒドロキサメートまたはカナバニンに
対する耐性をより強めたミルディオマイシン生産菌を得
ることができる。 また、 セリンヒドロキサメート耐性の
ミルディオマイシン生産菌あるいはカナバニン耐性のミ
ルディオマイシン生産菌を上記の方法で変異誘導するこ
とにより、 セリンヒドロキサメート及びカナバニンの両
方に耐性を有するミルディオマイシン生産菌を得ること
もできる。 そして、 これらの菌のいずれも本発明のスト
レプトバーティシリウム属に属し、 セリンヒドロキサメ
ートまたはカナバニンに耐性を有するミルディオマイシ
ン生産菌の範囲内に入るものである。 上記本発酵方法によって得られるミルディオマイシン
は、たとえばウドンコ病防除薬剤または植物用殺菌殺ダ
ニ剤の有効成分として安全に用いることができる(特公
昭56−37795,同58−21886)。

【００１８】

【作用】本発明におけるストレプトバーティシリウム属
に属し、セリンヒドロキサメートまたはカナバニンに耐
性を有するミルディオマイシン生産菌は、セリンヒドロ
キサメートまたはカナバニンに対して優れた耐性を有し
ているほか、５−ヒドロキシメチルシトシン生合成にお
いて高い活性を有している。 実験例１ シュクローズ２％，可溶性でんぷん0.5％，硝酸アンモ
ニウム0.12％，リン酸第２カリウム0.25％，硫酸マグネ
シウム0.005％，カザミノ酸0.0025％，酵母エキス0.002
5％，粉末寒天2.0％（百分率表示はw/v）からなる寒天
培地（pH 7.0）に、セリンヒドロキサメートおよびカナ
バニンを種々の濃度で添加した培地を調製した。120℃,
15分の条件で滅菌後、 シャーレに20mlづつ流し込み、 冷
却後、下記の供試菌株の胞子を塗布して28℃,10日間の
培養を行い生育限界の濃度であるM.I.C(最少生育阻止濃
度)を測定し、〔表４〕にまとめた。 供試菌株: (1)ストレプトバーティシリウム・リモファシエンス E5−24−５ （２）ストレプトバーティシリウム・リモファシエンス
Ｃ₃ ^R−182 （３）ストレプトバーティシリウム・リモファシエンス
ＣＶ^R −48 （４）ストレプトバーティシリウム・リモファシエンス
ＣＶ^R −16

【表４】

【００１９】実験例２ グルコース2.5％，コーンスティープリカー２％，綿実
胚芽粉（商品名 プロフロ，トレーダーオイル社製）1.
0％，硫酸アンモニウム0.3％，硫酸マグネシウム0.05
％，炭酸カルシウム0.3％（百分率表示は重量／容量）
からなる培地をつくり、 20％(w/v)苛性ソーダ水溶液を
滴下することによりpHを7.0に調整する。 この培地を200
ml容三角フラスコ(ウレタン栓つき)に25mlづつ分注し、
120℃，15分の条件で蒸気滅菌する。 これにストレプト
バーティシリウム・リモファシエンスＥ5−24−５，Ｃ₃
^R−182，ＣＶ^R−48，ＣＶ^R−16の胞子を接種し、 28℃，
20時間，200rpm(回転/分)の条件下で回転振盪培養機に
かけ培養に供し、 種培養液とする。 次にグルコース11
％，ソルビトール3.0％，カゼイン3.0％，コーンスティ
ープリカー0.5％，プロフロ2.0％，硫酸アンモニウム0.
5％，硝酸アンモニウム0.5％，塩化コリン0.1％，硫酸
マンガン0.005％，硫酸第1鉄0.005％，硫酸銅0.003％
(百分率表示は重量/容量)からなる培地をつくり、 20％
(w/v)苛性ソーダ水溶液を滴下することによりpHを7.0に
調整する。 この培地に炭酸カルシウムを１％(w/v)濃度
になるように加え、十分に混合したのち25mlづつ200ml
容三角フラスコ(ウレタン栓付き)に分注し、 120℃，20
分の条件で蒸気滅菌をして発酵培地とする。 これに前記の種培養液を一つの発酵培地(25ml)に２ml
の割合で移植し、28℃，3〜5日間，200rpmの条件で回転
振盪培養機にかけ培養する。 培養後、 ジャーナル・オブ
・ファーメンテーション・テクノロジー“Journal of F
ermentation Technology" 第63巻, 17頁(1985)に記載の
方法に従って、 無細胞抽出液の調製，酵素反応，および
５−ヒドロキシメチルシトシンの測定を行い、〔表５〕
に示す５−ドロキシメチルシトシン生成活性を得た。

【表５】

【００２０】

【実施例】

実施例１ （１）ストレプトバーティシリウム・リモファシエンス
Ｅ5−24−5(ＦＥＲＭＰ−6052,ＩＦＯ−14125)の斜面
培養物より胞子および気菌糸をかきとり、 シュクロース
３％，グルタミン酸ソーダ２％，ツィーン80 0.01％か
らなる分散媒(120℃，15分の条件下で蒸気滅菌したも
の)30mlに入れ、 ポッターホモゲナイザーを用いてよく
すりつぶす。 東洋ろ紙No.101(東洋瀘紙社製)を用いてこ
の摩砕物をろ過し、 胞子および気菌糸断片よりなる菌懸
濁液をろ液(25ml)として得る。 (2) (1)で得られた菌懸濁液にＮ−メチル Ｎ'−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジンをトリスアミノメタン−塩酸
緩衝液(0.1M，pH 7.5)に２mg／mlの濃度になるように溶
かして得た溶液を当量加え、28℃で90分間振盪する。 こ
のようにして得られた混合液を、 サイクロセリンを30μ
g/mlの濃度で含み、 シュクロース2.0％，可溶性でんぷ
ん0.5％，硝酸アンモニウム0.2％，第２リン酸カリウム
0.1％，塩化カリウム0.05％，硫酸マグネシウム0.05
％，硫酸第１鉄0.0015％，粉末寒天2.0％(百分率表示は
重量/容量)からなる寒天平板培地(pH7.0)に塗布する。 2
8℃，14日間の静置培養をしたのち、 出現してくるコロ
ニーの内で、 形態的に正常で、かつ気菌糸の着生したコ
ロニーを100コ分離した。 これらのコロニーをそれぞれ
滅菌ガラス棒ですりつぶし、 約10mlの滅菌水を加え、 東
洋ろ紙No.101を用いてろ過することによりろ液を得る。
このろ液を、サイクロセリンを含まない寒天平板培地に
塗布し、28℃で10日間静置培養したのち、 出現したコロ
ニーをそれぞれ斜面寒天培地(培地組成は、 前述の寒天
平板培地と同じ)に移植する。 28℃で10日間静置培養す
ることにより、 生育してきた気菌糸および胞子を斜面培
地上よりかきとり、 上記(1)に示した方法で懸濁，摩砕
およびろ紙ろ過し、 100種の菌懸濁液を調製した。 (3) 上記(2)で得た100種の菌懸濁液を10μg/mlのアミノ
プテリンを含む寒天平板培地上一面に塗布し(生菌数約1
×10⁵)、 28℃、 10日間静置培養する。 この寒天平板より
コルクボーラーで寒天片(直径6mm，高さ約４mm)を切り
出して、抗菌力の検定培地（被検菌, Rhodotorula rubr
a，肉汁寒天培地，pH7.0）上に移し、30℃、 一夜静置し
たところ、５種類の菌懸濁液が直径14mm以上の比較的大
きなハロー（阻止円）を示した。 (4) 上記(2)で得た100種の菌懸濁液をそれぞれ生菌数が
約1×10⁵/mlになるように滅菌水で希釈し、 この菌液20
μlを、 40μg/mlのセリンヒドロキサメートを含む寒天
平板培地に塗布し28℃、 14日間静置培養する。 100種の
菌懸濁液の内、 ７種のものが生育することができたが、
この中に上記(3)で大きなハローを示した５種類の菌懸
濁液がすべて含まれていた。 この５種類の菌懸濁液の中
で上記(3)で最大のハローを示した１変異株を、ストレ
プトバーティシリウム・リモファシエンスＣ₁ ^R−18とし
て分離した。

【００２１】実施例２ ストレプトバーティシリウム・リモファシエンスＥ5−2
4−5の代わりに実施例１で得たＣ₁ ^R−18を用いて上記実
施例１の(1)及び(2)と同様の方法により150種の菌懸濁
液を調製した。 この中から実施例１の(3)および(4)と同
様の方法(ただし(4)の方法において寒天平板培地として
50μg／mlのセリンヒドロキサメートを含む寒天平板培
地を使用)で、 ストレプトバーティシリウム・リモファ
シエンスＣ₂ ^R−125を分離した。 実施例３ ストレプトバーティシリウム・リモファシエンスＥ5−2
4−5の代わりに実施例２で得たＣ₂ ^R−125を用いて、 実
施例１の(1)、 (2)と同様の方法で、 200種の菌懸濁液を
調製した。 この中から実施例１の(3)および(4)と同様に
して(ただし(4)の方法において寒天平板培地として60μ
g/mlのセリンヒドロキサメートを含む寒天平板培地を使
用)、 ストレプトバーティシリウム・リモファシエンス
Ｃ₃ ^R−182(FERM P-8334, IFO-14448)を分離した。 実施例４ ストレプトバーティシリウム・リモファシエンスＥ5−2
4−5の代わりに実施例３で得たＣ₃ ^R−182を用いて実施
例１の(1)、 (2)と同様の方法で300種の菌懸濁液を調製
した。 この中から実施例１の(3)および(4)と同様にして
(ただし(4)の方法では寒天平板培地として80μg/mlのセ
リンヒドロキサメートを含む寒天平板培地を使用)、 ス
トレプトバーティシリウム・リモファシエンスＣ₄ ^R−25
7を分離した。

【００２２】実施例５ ストレプトバーティシリウム・リモファシエンスＥ5−2
4−5の代わりに実施例４で得たＣ₄ ^R−257を用いて実施
例１の(1)、 (2)と同様の方法で得られる菌懸濁液100種
を、 190μg/mlのカナバニンを含む寒天平板培地に塗布
し、 28℃，14日間静置培養する。 １種の菌懸濁液より出
現してくるコロニーをシュクロース2.0％，可溶性澱粉
0.5％，硝酸アンモニウム0.12％，リン酸2カリウム0.25
％，硫酸マグネシウム0.005％，カザミノ酸0.0025％，
酵母エキス0.0025％，寒天2.0％(百分率表示は重量/容
量)からなる寒天斜面培地(pH7.0)に移植し、 28℃，10日
間静置培養を行い、 セリンヒドロキサメートおよびカナ
バニンに耐性を有する変異株ＣＶ^R −48(FERM P-8333,
IFO-14449)を得た。 参考例１ グルコース2.5％，コーンスティープリカー２％，綿実
胚芽粉(商品名 プロフロ，トレーダーオイル社製)1.0
％，硫酸アンモニウム0.3％，硫酸マグネシウム0.05
％，炭酸カルシウム0.3％(百分率表示は重量/容量)から
なる培地をつくり、 20％(w／v)苛性ソーダ水溶液を滴下
することによりpHを7.0に調整する。 この培地を200ml容
三角フラスコ(ウレタン栓つき)に25mlづつ分注し、 120
℃，15分の条件で蒸気滅菌する。 これにストレプトバー
ティシリウム・リモファシエンス Ｅ5−24−5，Ｃ₃ ^R−1
82, ＣＶ^R−48の胞子を接種し、 28℃，20時間，200rpm
(回転/分)の条件下で回転振盪培養機にかけ培養に供し、
それぞれの種培養液とする。 次にグルコース11％(w／
v)，ソルビトール3.0％，カゼイン3.0％，コーンスティ
ープリカー0.5％，プロフロ2.0％，硫酸アンモニウム0.
5％，硝酸アンモニウム0.5％，塩化コリン0.1％，硫酸
マンガン0.005％，硫酸第１鉄0.005％，硫酸銅0.003％
(百分率表示は重量/容量)からなる培地をつくり、 20％
(w／v)苛性ソーダ水溶液を滴下することによりpHを7.0
に調整する。 この培地に炭酸カルシウムを１％(w／v)濃
度になるように加え、十分に混合したのち25mlづつ200m
l容三角フラスコ(ウレタン栓付き)に分注し、120℃，20
分の条件で蒸気滅菌をして発酵培地とする。 これに前記の種培養液を一つの発酵培地に２mlの割合
で移植し、28℃，10日間，200rpmの条件で回転振盪培養
機にかけ培養をする。 培養後、 ジャーナル・オブ・ファ
ーメンテーション・テクノロジー“ Journal of Fermen
tation Technology"第62巻, 537頁(1984年)に記載した
方法に従ってミルディオマイシンの高速液体クロマトグ
ラフィーによる定量を行う。 このような方法でミルディ
オマイシンの生産試験を行い、 〔表６〕に示した結果を
得た。

【表６】

【００２３】参考例２ 参考例１と同等の条件でストレプトバーティシリウム・
リモファシエンス ＣＶ^R−48を培養に供し、 発酵終了液
１リットルを集めて、遠心分離によって上澄液を得、こ
れをイオン交換樹脂アムバーライトIRC−50(Ｈ⁺−型)
(ローム・アンド・ハース社製)2.5リットルを充填した
カラムに通液した。 カラムを水洗したのち、 0.5％(w／
v)アンモニア水2.5リットルを用いて溶出し、 活性画分
(参考例１に示した方法で定量後)をクロマトグラフィー
用活性炭(武田薬品製)250mlのカラムに通液吸着させた。
アセトン−水(3:7)の混合溶媒1.25リットルを用いて溶
出した活性画分を集めて濃縮し、 濃縮液にメタノールを
500ml滴下して、 粗ミルディオマイシンを析出させた。
ろ過後得られる粗ミルディオマイシンの粉末6.5gを水に
とかし、 アンバーライトCG−50(Ｈ⁺−型)(ローム・アン
ド・ハース社製)125mlのカラムに通液したのち、 カラム
を50mlの水で洗浄し、 ついで0.5％(w／v)アンモニア水
1.25リットルを用いて溶出した。 活性画分を集め、 活性
炭250mlのカラムに通液して吸着させ、 アセトン−0.1Ｎ
ギ酸(2:8)1.25リットルを用いて分画溶出し、 活性画分
を濃縮した。 濃縮液にメタノールを加え、 ミルディオマ
イシンを析出させた。 これを遠心分離で採取し、 減圧下
に乾燥して、 5.5gのミルディオマイシン ギ酸塩を得た。
このものの理化学的性質中、 融点，旋光度(C 1.0，H₂O
およびＣ 1.0, 0.1Ｎ−ＨＣlにおける[α]_D ²⁴), 271nm
および280nmにおける紫外線吸光度係数は文献[ザ・ジャ
ーナル・オブ・アンティビオティクス “The Journal
of Antibiotics " 第31巻, 第６号, 523頁, 1978年]
に記載された値と完全に一致した。

【００２４】実施例６ ストレプトバーティシリウム・リモファシエンスＥ５−
２４−５を用いて、実施例１の（１)と同様の方法で得
られた菌懸濁液に、Ｎ−メチル Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジンをトリスアミノメタン−塩酸緩衝液
（0.1M，pH7.5）に2mg／mlの濃度になるように溶かして
得た溶液を当量加え、28℃で90分間振盪する。このよう
にして得られた混合液を300μg／mlのＬ−カナバニンを
含む寒天平板培地（培地組成は実施例１の（２）と同
じ）に塗布し、28℃，１４日間静置培養する。出現した
コロニーをそれぞれ斜面寒天培地（培地組成は寒天平板
培地と同じ）に移植し、28℃，10日間静置培養を行いカ
ナバニン耐性を有する変異株を14株得た。これらのカナ
バニン耐性変異株を、その親株（Ｅ５−２４−５）とと
もに、参考例１と同様の条件で培養し、ミルディオマイ
シンの生産性を比較し最大の生産性を示した変異株をス
トレプトバーティシリウム・リモファシエンスＣＶ^R−
１６（ＦＥＲＭ Ｐ−８８７４，ＩＦＯ−１４５２７）
として分離した。〔表７〕に親株と変異株ＣＶ^R−１６
ｋミルディオマイシン生産量を示した。

【表７】 この表から、変異株ＣＶ^R−１６は親株に比べ優れたミ
ルディオマイシン生産能を有していることが明らかであ
る。

【００２４】参考例３ 参考例１と同様の条件でストレプトバーティシリウム・
リモファシエンスＣＶ^R−１６を培養に供し、発酵終了
液１リットルを集めて、参考例２と同様の方法でミルデ
ィオマイシンの単離精製を行ったところ、３．１ｇのミ
ルディオマイシ・ギ酸塩を得た。このものの理科学的性
質中、融点、旋光度、２７１ｎｍおよび２８０ｎｍにお
ける紫外線吸光度係数は文献（参考例２に記載）の値と
完全に一致した。

【００２５】〔発明の効果〕ストレプトバーティシリウ
ム属に属し、セリンヒドロキサメートまたはカナバニン
に耐性を有するミルディオマイシン生産菌を培養するミ
ルディオマイシンの製造法は、ミルディオマイシンを高
い効率で生産することができ、ミルディオマイシンを多
量に生産する工業的な発酵方法として有利な方法であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 17/16 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】セリンヒドロキサメートまたはカナバニン
   に耐性を有し、 かつミルディオマイシン生産能を有する
   ストレプトバーティシリウム・リモファシエンス。