JPH038197B2

JPH038197B2 -

Info

Publication number: JPH038197B2
Application number: JP56101161A
Authority: JP
Inventors: Katsuro Kubo; Yasuo Fukagawa; Tomoyuki Ishikura
Original assignee: MERUSHAN KK
Current assignee: MERUSHAN KK
Priority date: 1981-07-01
Filing date: 1981-07-01
Publication date: 1991-02-05
Also published as: JPS585189A; US4438201A; DE3271129D1; EP0068486A3; EP0068486A2; EP0068486B1

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規な酵素に関し、さらに詳しくは式で示される抗生物質OA−6129Aの脱パントテイ
ニル化能を有するが、式で示される抗生物質PS−５の脱アセチル化能を
実質的に有しないアミドヒドロラーゼに関する。本発明者らは先にストレプトミセス・フルボビ
リデイスA933（Streptmyces fluvoviridis A933）
（FERM BP−10）が上記式（）で示される抗
生物質PS−５を生産すること〔ジヤーナル・オ
ブ・フアーメンテイシヨン・テクノロジー第57巻
（1979年）265−272頁参照〕、並びにストレプトミ
セスsp.OA−6129（FERM Ｐ−5714）が上記式
（）で示される抗生物質OA−6129Aを生産する
こと（特願昭55−135829号）を見い出し提案し
た。本発明者らはさらに上記２つの抗生物質PS−
５及びOA−6129Aの生成機構を探求すべく、上
記２種の菌株の生化学的相違について研究を重ね
た結果、或る種の酵素の生産性に差異があること
をつきとめ、それが前記の新規なアミドヒドロラ
ーゼであることを見い出し、本発明を完成するに
至つたものである。本発明により提供されるアミドヒドロラーゼは
一般に下記に示すような種々の作用特性を有して
いる。 (1) 本発明により提供されるアミドヒドロラーゼ
は、下記式で示される抗生物質OA−6129Aの３位に結合
するパントテイニル側鎖中のパントテイニル基を開裂させる能力、すなわち脱パントテイニル
化能を有するが、しかし下記式で示される抗生物質PS−５の３位に結合する
アセチルアミノエチルチオ側鎖中のアセチル基
は開裂させる能力（脱アセチル化能）を実質的
に有しない、すなわちパントテイニル基の選択
的開裂作用を有している点で特徴的である。 (2) 本発明により提供されるアミドヒドロラーゼ
は、一般的にＬ−アミノ酸アシラーゼの性状を
もち、Ｌ−アシルアミノ酸、例えばＮ−クロロ
アセチルＬ−フエニルアラニンの脱アシル化作
用を有するが、Ｄ−アシルアミノ酸の脱アシル
化能をもたないＬ−アシルアミノ酸アミドヒド
ロラーゼの１種である。 (3) 本発明により提供されるアミドヒドロラーゼ
は、ペニシリン・アシラーゼの場合に知られて
いるように、或る種の遊離アミノ基又はアミド
結合を含有する基質に対して、アシル−コエン
ザイムＡ（CoA）からアシル基を転移させる作
用をも併せもつている場合もある。例えば、本
発明により提供されるアミドヒドロラーゼは、
前記式（）で示される抗生物質OA−6129A
の３位の側鎖中のパントテイニル基を、アセチ
ル−CoA、プロピオニル−CoA、ブチリル−
CoA又はグルタリル−CoA中のアセチル基、
プロピオニル基、ブチリル基またはグルタリル
基と交換する触媒作用；および／あるいは６−
アミノペニシラン酸（６−APA）の６−位の
アミノ基に対しアセチル−CoA、プロピオニ
ル−CoA、ブチリル−CoAまたはグルタリル
−CoAからアセチル基、プロピオニル基、ブ
チリル基またはグルタリル基を転移させる作用
を有していることがある。本発明により提供されるアミドヒドロラーゼは
通常、ストレプトミセス属に属するカルバペネム
系抗生物質生産菌を栄養培地中で培養し、その培
地から前記特性を有するアミドヒドロラーゼをそ
れ自体公知の方法によつて回収することにより生
産することができる。本生産に使用しうるストレプトミセス属に属す
るカルバペネム系抗生物質生産菌としては、下記
式で示されるカルバペネム骨格を有する抗生物質、
例えばチエナマイシン〔R₁＝CH₃（OH）CH−；
R₂＝−SCH₂CH₂NH₂：J.Antibiotics、32、１〜
12（1979年）〕、Ｎ−アセチルチエナマイシン〔R₁
＝CH₃（OH）CH−；R₂＝−
SCH₂CH₂NHCOCH₃：特開昭52−65294号公
報〕、Ｎ−アセチルデヒドロチエナマイシン〔R₁
＝CH₃（OH）CH−；R₂＝−SCH＝
CHNHCOCH₃：特開昭53−130494号公報〕、エ
ピチエナマイシンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ〔R₁＝CH₃
（OH）CH−；R₂＝−SCH₂CH₂NH₂：特開昭52
−65293号公報及び特開昭52−131596号公報〕、
MM17880〔R₁＝CH₃（OSO₃H）CH−；R₂＝−
SCH₂CH₂NHCOCH₃：J.Antibiotics、32、295
〜304（1979年）〕、MM13902〔R₁＝CH₃（OSO₃H）
CH−；R₂＝−SCH＝CHNHCOCH₃：J.
Antibiotics、32、295〜304（1979年）〕、MM4550
〔R₁＝CH₃（OSO₃H）CH−；

【式】：J. Antibiotics、32、295〜304（1979年）〕、抗生物質
PS−５〔R₁＝CH₃CH₂−；R₂＝−
SCH₂CH₂NHCOCH₃：J.Antibiotics、33、796
〜803（1980年）〕、抗生物質PS−６〔R₁＝
（CH₃）₂CH−；R₂＝−SCH₂CH₂NHCOCH₃：J.
Antibiotics、33、1128〜1137（1980年）〕、抗生物
質PS−７〔R₁＝CH₃CH₂−；R₂＝−SCH＝
CHNHCOCH₃：J.Antibiotics、33、1128〜1137
（1980年）〕、抗生物質PS−８〔R₁＝（CH₃）₂CH
−；R₂＝−SCH＝CHNHCOCH₃：特開昭56−
25183号公報〕、カーペチマイシンＡ〔R₁＝
（CH₃）₂（OH）Ｃ−；

【式】：J. Antibiotics、33、1388〜1389（1980年）〕、Ｃ−
19393S₂〔R₁＝（CH₃）₂（OSO₃H）Ｃ−；

【式】：J. Antibiotics、33、1425〜1430（1980年）〕、PA−
31088−〔R₁＝HOCH₂（CH₃）Ｃ＝；

【式】：特開昭 55−136282号公報〕等の抗生物質の生産能を有す
る微生物が包含され、具体的には次のものを挙げ
ることができる。ストレプトミセス・フルボビリデイス
（Streptomyces fulvoviridis）ATCC15863及び
21954、FERM Ｐ−3935〜3937ストレプトミセ
ス・カトレヤ（Streptomyces cattleya）
NRRL8057 ストレプトミセス・フラボグリゼウス
（Streptomyces flavogriseus）NRRL8139及び
8140 ストレプトミセス・オリバセウス
（Streptomyces olivaceus）ATCC21379〜
21382、31126及び31365、NCIB8238及び8509 ストレプトミセス・ゲダエンシス
（Streptomyces gedanensis）ATCC4880 ストレプトミセス・アルゲンテオルス
（Streptomyces argenteolus）ATCC11009 ストレプトミセス・フラボビイレンス
（Streptomyces flavovirens）ATCC3320 ストレプトミセス・フラブス（Streptomyces
flavus）ATCC3369 ストレプトミセス・シオヤエンシス
（Streptomyces sioyaensis）ATCC13989 ストレプトミセス・クレメウス・サブスピシ
ス・オーラテイリス（Streptomyces cremeus
subsp.auratillis）ATCC31358 ストレプトミセス・フルボビリデイスA933
（Streptomyces fulvoviridis A933）（FERM
BP−10）ストレプトミセス・スピシスKC−6643
（Streptomyces sp.KC−6643FERM）Ｐ−4467 ストレプトミセス・グリセウス・サブスピシ
ス・クリオフイラス（Streptomyces griseus
subsp.cryophilus）IFO13886 ストレプトミセス・トクノネンシス
（Streptomyces tokunonensis）FERM Ｐ−4843 上記に挙げた微生物のうち、ストレプトミセ
ス・フルボビリデイス、ストレプトミセス・カト
レヤ、ストレプトミセス・クレメウス・サブスピ
シス・オーラテイリス及びストレプトミセス・ア
ルゲンテオルスが好適であり、中でもストレプト
ミセス・フルボビリデイスA933が特に好適であ
り、その菌学的性質を説明すれば次のとおりであ
る。 (1) 形態顕微鏡下でよく分枝した基中菌糸より、直状
〜曲状（Straight〜flexuous）の気菌糸を伸長
し、輪生枝はみとめられない。成熟した胞子鎖
は10〜50個の楕円〜円筒形をした胞子から成
り、胞子のうは認められない。胞子の大きさは
（0.8〜1.0）×（1.0〜2.0）ミクロン位で、胞子の
表面は平滑である。鞭毛胞子はみとめられな
い。 (2) 各種培地における生育状態培養は特記しないかぎり28゜〜30℃で行つた。
また色調の記載は主としてエツチ・デイ・トレ
スナーとイー・ジエー・バカス（H.D.Tresner
and E.J.Backus）著、ジヤーナル・オブ・ア
プライド・ミクロピオロジイー（Journal of
Applied Microbiology）11巻、４号、（1963
年）335〜338頁の方法に従い、〔〕内に示す符
号〔CHMコード（code）〕はコンテイナー・
コーポレーシヨン・オブ・アメリカのカラー・
ハーモニー・マニユアル（Container
Corporation of AmericaのColor Harmony
Manual）を用いた。 (1) シユークロース・硝酸塩寒天培地：黄灰〔2dc〕〜灰色〔2fe〕の中等度生育上
に、明るい茶灰〔3fe〕〜茶灰〔5ih〕の気菌
糸を着生し、溶解性色素はみとめられない。 (2) グルコース・アスパラギン寒天培地：明るい黄〔１ 1/2fb〜2fb〕の良好な生育
上に、明るい茶灰〔3fe〕〜暗い灰〔3ih〕の
気菌糸を着生し、溶解性色素はみとめられな
い。 (3) グリセリン・アスパラギン寒天培地（ISP
培地−５）：灰黄〔3ec〕、一部明るい茶灰〔3fe〕の良
好な生育上に、明るい灰〔ｄ〕〜明るい灰赤
茶〔5fe〕の気菌糸を着生する。溶解性色素
はみとめられない。 (4) スターチ無機塩寒天培地（ISP培地−
４）：うす黄〔2db〕〜うす黄縁〔24 1/2dc〕の
良好な生育上に暗い灰〔3ih〕の気菌糸を着
生する。溶解性色素は生成しない。 (5) チロシン寒天培地（ISP培地−７）：明るい黄〔2fb〕、後に明るいオリーブ茶
〔2ge〕の良好な生育上に、明るい灰〔ｄ〕
だがやや緑がかつた気菌糸を着生する。培地
は極く僅かに茶色を帯びる。 (6) 栄養寒天培地：明るい茶灰〔3fe〕の中等度生育上に、明
るい灰〔ｄ〕の気菌糸を着生する。溶解色素
はみとめられない。 (7) イーストエキス・麦芽エキス寒天培地
（ISP培地−２）：白〔ｂ〕の良好な生育上に、明るい茶灰
〔3fe〕〜茶灰〔5ih〕の気菌糸を着生する。
溶解性色素はみとめられない。 (8) オートミール寒天培地（ISP培地−３）：暗い灰〔3ih〕の良好な生育上に、明るい
茶灰〔3fe〕〜暗い灰〔3ih〕の気菌糸を着生
する。溶解性色素は認められない。 (9) リンゴ酒石灰寒天培地：明るいオリーブ茶〔2ge〕の中等度の生育
上に、明るい灰茶〔3fe〕の気菌糸を着生し、
溶解性色素はみとめられない。 (10) ヘプトン・イーストエキス・鉄寒天培地
（ISP培地−６）：うす黄〔2db〕の良好な生育上にあわい白
〔ｗ〕〜明るい灰〔ｄ〕の気菌糸を着生する。 (3) 生理的性質 (1) 生育温度範囲イーストエキス・麦芽エキス寒天培地
（ISP培地−２）を用いて10゜、20゜、25゜、30゜、
34゜、37゜、40゜、45゜、50℃の各温度で実験の
結果、37℃では殆んど発育出来ない。40℃以
上では全く発育しない。その他の各温度では
生育がみとめられた。最適生育温度範囲は20
〜30℃と思われる。 (2) ゲラチンの液化：液化する。 (3) スターチの加水分解：分解する。 (4) 脱脂牛乳の凝固、ペプトン化：凝固はしな
いが、ペプトン化する。 (5) 硝酸塩の還元：還元する。 (6) メラニン様色素の生成：ペプトン・イースト・鉄寒天培地（ISP培
地−６）及びチロシン寒天培地ではメラニン
様色素の生成は認められなかつた。トリプト
ン・イーストエキス・ブロス培地（ISP培地
−11）で極く僅かに茶色の色素を生産した。 (4) 各種炭素源の同化性（プリドハム・ゴトリブ
寒天培地用） (1) Ｌ−アラビノース＋ (2) Ｄ−キシロース＋ (3) Ｄ−グルコース＋ (4) Ｄ−フラクトース＋ (5) シユークロース ± (6) イノシトール ± (7) Ｌ−ラムノース＋ (8) ラフイノース − (9) Ｄ−マンニトール＋＋は同化する、−は同化しない。上記の菌学的性質をもつストレプトミセス・フ
ルボビリデイスA933は、通商産業省工業技術院
微生物工業技術研究所に微工研条寄第10号
（FERM BP−10）として国際寄託されている。本発明に従う前述した如きストレプトミセス属
に属するカルバペネム系抗生物質生産菌の培養の
ための栄養源としては、放線菌の栄養源として通
常使用されるもの、例えば炭水化物、窒素源、無
機塩などの同化できる栄養源を使用できる。例え
ば、ぶどう糖、グリセリン、麦芽糖、蔗糖、糖
蜜、デキストリン、殿粉などの炭水化物や、大豆
油、落花生油、ラードなどの油脂、脂肪類の如き
炭素源；ペプトン、肉エキス、大豆粉、綿実粉、
乾燥酵母、コーンスチーブリカー、酵母エキス、
脱脂乳、ガゼイン、硝酸ナトリウム、硝酸アンモ
ニウム、硝酸アンモニウムなどの窒素源；燐酸二
カリウム、食塩、炭酸カルシウム、硫酸マグネシ
ウムなどの無機塩が使用でき、必要により微量金
属例えばコバルト、マンガンなどを添加すること
ができる。栄養源としては、その他、本発明のア
ミドヒドロラーゼを生産するものであれば、いず
れの栄養源でも使用でき、公知の放線菌の培養材
料はいずれも使用できる。また、加熱殺菌時及び
培養中における発泡を抑えるため、シリコン、植
物油などの消泡剤を添加することもできる。上記の如き栄養源の配合割合は特に制約される
ものではなく、広範囲に亘つて変えることがで
き、使用する前記生産菌にとつて最適の栄養源の
組成及び配合割合は、当業者であれば簡単な小規
模実験により容易に決定することができる。また栄養培地は培養に先立ち殺菌することがで
き、この殺菌の前又は後で、培地のPHを４〜９の
範囲、特にPH６〜８の範囲に調節するのが有利で
ある。かかる栄養培地での前記生産菌の培養は原則的
には、一般の放線菌による抗生物質の製造におい
て通常使用されている方法に準じて行なうことが
できる。通常好気的条件下に培養するのが好適で
あり、通常撹拌しながら及び／又は通気しながら
行なうことができる。また、培養方法としては静
置培養、振盪培養、通気撹拌をともなう液内培養
のいずれも使用可能であるが、液内培養が有利で
ある。使用しうる培養温度は使用する生産菌株に応じ
て変えることができるが、一般に20〜40℃、好ま
しくは25〜35℃の範囲内の温度が好適である。また、培養を好適に行なうため、必要に応じ
て、培養中に培養物のPHを４〜９、特に６〜８の
範囲に調節することができる。大規模な大量培養の場合、適宜種母培養を行な
い、これを栄養培地に接種し、液体培養するのが
有利である。また、培養時間は、培地の組成や培養温度、使
用生産株等により異なるが、通常30〜90時間の範
囲である。なお、使用する培養条件は、使用する生産菌株
の特性に応じて、当業者であれば簡単な実験によ
り、最適条件を容易に決定することができる。かくして得られる培養物からの本発明の酵素の
抽出、精製は、一般の酵素の抽出、精製法に従つ
て行なうことができる。例えば適当な方法により培養物から菌体を分離
したのち、その菌体を摩耗剤の存在下ですりつぶ
す方法、リゾチーム等の溶菌酵素を用いる方法、
超音波エネルギーを適用する方法、浸透圧シヨツ
クを適用する方法等の公知の任意の方法により破
壊するか、またはソデイウムコール酸、トリトン
Ｘ−100のような界面活性剤、トルエン等の存在
下で振盪もしくは放置することにより、本発明の
酵素を菌体外に排出させた後、その菌体処理液を
過法、遠心分離方法などの適当な操作により処
理し、固形物を除去するか、或いは該菌体処理液
を水、緩衝液もしくは適当な溶剤で抽出すること
によつて粗酵素液を得る。また通常の酵素回収
法、すなわち該抽出液に必要により凍結乾燥法、
アルコール沈殿法、アセトン沈殿法等を適宜選択
して実施することにより該粗酵素液から粗酵素粉
末を得ることもできる。上記粗酵素液もしくは粗酵素粉末よりさらに精
製酵素標品を得るには、例えばセフアデツクスも
しくはバイオゲル等を用いるゲル過法、イオン
交換体を用いる吸着溶出法、ポリアクリルアミド
ゲル等を用いる電気泳動法、ハイドロオキシアバ
タイトを用いる吸着溶出法、蔗糖密度勾配遠心法
等の沈降法、アフイニテイクロマト法、分子ふる
い膜もしくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜
選択し、組み合わせて実施することにより、精製
された酵素標品を得ることができる。また、培養時間を長くして自己消化を行なわせ
た場合の培養液についても、同様に処理するこ
とにより本発明の酵素を得ることができる。次に実施例により本発明をさらに説明する。実施例１グリセリン36ｇ、エスサンミート〔味の素(株)
製〕13.5ｇ、魚粉4.5ｇ、K₂HPO₄0.9ｇ、
MgSO₄・7H₂O0.9ｇ、CaCO₃1.35ｇを水道水に溶
解し、PHを7.2に調整後、全量を450mlとしたもの
を15mlずつ250ml容のエルレンマイヤーフラスコ
に分注し、120℃で15分間殺菌した。培地冷却後
ストレプトマイセス・フルポビリデイスA933
（FERM BP−10）を接種し、28℃で68時間振盪
培養した。培養後遠心分離により菌体を得、
0.01Mリン酸カリウム緩衝液（PH7.1）で２度洗
浄後、同緩衝液に全量100ml程度になるように懸
濁した。これを超音波処理（20KHz、60W、５分
間）によつて菌体を破砕し、遠心分離で固形物を
除き、細胞抽出液80mlを得た。これに粉末状の
（NH₄）₂SO₄を加え、60％飽和で沈殿した蛋白画
分を少量の0.01Mリン酸カリウム緩衝液（PH7.1）
に溶解し、同緩衝液で十分透析後、予め同緩衝液
で平衡化したDEAE−セフアセル（フアルマシマ
ア社製）カラム（２×40cm）に吸着させた。この
カラムを同緩衝液で十分洗浄後、同緩衝液に溶解
したNaCl0.1M〜0.4Mの濃度勾配にて溶出し活性
区分200mlを得た。これをコロジオンバツグ25（ザ
ルトリウスメンブランフイルター社製）で濃縮
し、0.01Mリン酸カリウム緩衝液（PH7.1）で透
析後、予め同緩衝液で平衡させたDEAE−セフア
デツクス（フアルマシア社製）カラム（1.5×15
cmに吸着させた。カラムを同緩衝液で洗浄後、
0.25MNaClを含む同緩衝液で溶出し活性区分65
mlを得た。この活性区分をコロジオンバツグ25で
濃縮し、0.01Mリン酸カリウム緩衝液で透析後、
アンフオライン（PH４〜６）を用い、粒状ポリア
クリルアミドゲルを支持体としてプレパラテイブ
な等電点電気泳動を行つた。活性区分を集め、予
め0.01Mリン酸カリウム緩衝液（PH7.1）で平衡
化してあるセフアデツクスＧ−150（フアルマシア
社製）カラム（1.9×60cm）でゲル過を行い、
活性区分をコロジオンバツグ25で濃縮後、再びセ
フアデツクスＧ−150カラム（1.9×60cm）でゲル
過を行つた。この活性区分15mlをコロジオンバ
ツグ25で濃縮し、本発明の酵素標品1.5ml（蛋白
量270μｇ）を得た。本酵素標品をPH8.3のデイスクゲル電気泳動を
行い、泳動後ゲルをクマシーブリリアントブル−
Ｒで染色して蛋白の純度を検定した。ブロモフエ
ノールブルーを指標とした相対移動度（Rm_BPB）
で表わした場合、本酵素標品はRm_BPB＝0.52であ
り、その位置に明瞭な染色帯が観察され、それ以
外ではRm_BPB＝0.33の位置に、ごく微量の染色帯
が観察されたに過ぎなかつた。これらの結果か
ら、本酵素標品は蛋白純度として95％以上である
と推定される。かくして得られた酵素標品の特性を示せば次の
とおりである。 (1) 作用〓脱パントテイニル化能を有する。すなわ
ち、下記式（）で示される化合物からパン
トテイニル基を離脱させる能力を有する。（R₁＝Ｈ、OH又はOSO₃H）本反応の具体例は後記試験例Ａに示す。〓Ｌ−アシルアミン酸の脱アシル化能を示
す。（Ｒ＝有機残基；R′CO＝アシル基）ただし、Ｄ−アシルアミノ酸に対しては実
質的に作用しない。〓アシル−CoAからのアシル転移または交
換能を有する。（R′CO＝アシル基；R₂＝Ｈ、OH、OSO₃H又は
CH₃）（R₁＝Ｈ、OH又はOSO₃H；R′CO＝アシル）反応例３（R′CO＝アシル基）これら反応の具体例は後記試験例Ｂ及びＣに示
す。 (2) 基質特異性上記(1)に示す作用のうち、〓のＮ−アシル−
アミノ酸に対する基質特異性は下記第１表の通
りである。なお、第１表中の相対活性はＮ−ク
ロロアセチル−Ｌ−フエニルアラニンの活性を
100とした時の活性比で示す。

【表】

【表】 (3) 至適PH及び安定PH範囲至適PHは、後記(4)の力価測定法に示す標準的
測定条件下で、ただし緩衝液を以下の緩衝液に
置換えて力価を測定し、それから相対活性を算
出した。酢酸緩衝液（PH５〜６）、 PIPES緩衝液（PH６〜８）、ベロナール緩衝液（PH８〜9.5）。その結果は第１図に示すとおりであり、至適
PHは、７〜7.5であつた。安定PHは酵素を各PHの緩衝液（上記と同じ）
中で６℃、15時間放置後、標準的測定条件下で
力価を測定し、それから残存相対活性（％）を
算出した。その結果を第２図に示す。第２図か
ら明らかなように安定PH範囲は６〜８であつ
た。 (4) 力価の測定法 0.2Mピペラジン−Ｎ−N′−ビス（２−エタ
ンスルフオン酸）PIPES緩衝液（PH7.3）10μ
と100ｍMN−クロロアセチル−Ｌ−フエニル
アラニン（NaOHでPH６〜７に調整）10μと
を蒸留水で40μにし、これに酵素液（30〜
50μｇ／ml）10μを加え、37℃で15分間反応
させた後、50％酢酸50μを加えて酵素反応を
停止させる。この反応液中の基質より遊離した
Ｌ−フエニルアラニン量を、Yemm−Cocking
のニンヒドリン比色法（E.W.Yemm ＆ E.
C.Cocking：Analyst.第80巻、第209頁、1955
年）によるか、又は日立835−50型アミノ酸自
動分析機により定量した。本酵素標品の上記方法で測定したＬ−フエニ
ルアラニンの生産量は酵素蛋白１mg当り
11.9μmoles／min、であつた。なお、蛋白の定
量はWhitaker−GranumのUV法（J.R.
Whitaker ＆P.E.Granum：Anal.Biochem，
第109巻、第156頁、1980年）で測定した。 (5) 作用適温の範囲上記(4)に示す標準的測定条件下で、作用温度
を種々変更して力価を測定し、それから相対活
性（％）を算出し、相対活性と作用温度との関
係をグラフロプロツトして作用適温を調べた。
第３図に示すごとく、作用適温の範囲は25℃〜
45℃であつた。 (6) PH、温度などによる失活条件安定PH範囲のところで示したごとく（第２
図）、PH５では６℃、15時間で75％失活し、PH
9.5では同温度、同時間で60％失活した。また、
温度による失活は本酵素をPH7.3のPIPES緩衝
液中、各温度で15時間放置後、直ちに冷却して
その力価を測定し、残存相対活性（％）を求め
ることにより調べた。その結果を第４図に示す。第４図から明らか
なように本酵素は50℃では50％失活し、60℃で
は完全に失活した。 (7) 阻害、活性化及び安定化各種金属イオン、キレート剤、−SH阻害剤な
どの薬剤を終濃度が下記第２表に示すようにな
るまで反応液に加えた時、その薬剤が本酵素の
酵素活性に及ぼす影響を第２表にまとめて示
す。なお、第２表中の相対活性は薬剤無添加時の
活性に対する薬剤添加時の活性比で示す。既知の多くのアシラーゼ（Ｎ−アシルアミノ
酸アミドヒドロラーゼ）はCo⁺⁺イオンの添加
（濃度0.5〜10ｍＭ）によつて活性化又は安定化
されているが本酵素は逆に阻害を受けている点
が特徴的である。

【表】 (8) 分子量セフアデツクスＧ−150を用いたゲル過法
により求めた本酵素の分子量は約10万である。 (9) 等電点アンフオライン（PH３〜10）を用いたポリア
クリルアミドゲル等電点電気泳動により測定し
た結果、本酵素の等電点はpI＝5.1である。 (10) デイスクゲル電気泳動 PH8.3のデイスクゲル電気泳動での本酵素の
移動度は、ブロモフエノールブルーを指標とし
て、相対移動度Rm_BPB＝0.52である。試験例Ａ 0.2Mリン酸カリウム緩衝液（PH7.4）10μ、
抗生物質PS−５溶液（500μｇ／ml）又は抗生物
質OA−6129A溶液（500μｇ／ml）20μ及び実
施例１で得られた酵素液10μから成る反応液
50μを37℃で３時間反応させた。他方、コントロールとして上記組成の反応液か
ら酵素液を除いたものも同時に反応させた。各反応液3μをワツトマンNo.１紙にスポツ
トし、PH8.6のベロナール緩衝液で1500V／30cm、
50分間電気泳動を行つた。泳動後コマモナス・テ
リゲナＢ−996菌を被検菌とするバイオオートグ
ラフイーで生成物を検定した。その結果、抗生物
質PS−５を基質とした反応液は全て陽極側6.5cm
の所にそれぞれ同じ大きさの抗菌スポツトが認め
られるのみであつた。これは同時に泳動した抗生
物質PS−５の標準品と同じ位置である。このこ
とから、本酵素は抗生物質PS−５に対し何ら変
化を与えていないことがわかる。一方、抗生物質OA−6129Aを基質とした反応
後の場合、酵素液を加えないものは陽極側4.4cm
の位置にのみ、また酵素液を添加したものは陰極
側１cmの所にのみ抗菌スポツトが認められた。こ
れらは同時に泳動した抗生物質OA−6129A及び
Ｎ−脱アセチル抗生物質PS−５（以下抗生物質
NS−５という）の標準品とそれぞれ同じ位置で
ある。更に該反応液をパントテン酸要求株である
サツカロマイセス・カールスペルゲンシス
ATCC9080を被検菌とするバイオアツセイで検定
した所8μｇ／mlのパントテン酸が認められた。
これらの結果から、本酵素は抗生物質OA−
6129Aを完全に脱パントテイニル化し、抗生物質
NS−５に変換させたことがわかる。試験例Ｂ 0.2Mリン酸カリウム緩衝液（PH7.4）10μ、
抗生物質OA−6129A溶液（500μｇ／ml）10μ、
アシル−CoA（5μmoles／ml）10μ及び実施例１
で得られた酵素10μを含む反応液50μを37℃
で３時間反応させた後、試験例Ａと同様にして高
電圧紙電気泳動（HVPE）で生成物を検定し
た。他方、コントロールとして上記組成の反応液か
らアシル−CoAを除いたもの及び酵素液を除い
たものも同時に反応させた。なお、ここで用いた
アシル−CoAはアセチル−CoA、ｎ−プロピオ
ニル−CoA、ｎ−ブチリル−CoA、グルタリル
−CoAの４種である。抗菌スポツトは、酵素液を加えない反応液では
陽極側4.5cmの位置（抗生物質OA−6129A）にの
み、アシル−CoAを加えない反応後では陰極側
１cmの位置（抗生物質NS−５）にのみ認めた。
他方、アシル−CoA添加区では全て抗生物質NS
−５の位置と共にＮ−アシル抗生物質NS−５に
相当する位置にも抗菌スポツトが認められた。即
ち、アセチル−CoA、ｎ−プロピオニル−CoA
又はｎ−ブチリル−CoA添加では陽極側6.5cmの
位置（PS−５の位置）に、グルタリル−CoA添
加では陽極側11.2cmの位置に新しい抗菌スポツト
が認められた。これらの結果から、本酵素はアシ
ル−CoAの存在下で抗生物質OA−6129Aのパン
トテイニル基を該当するアシル−CoAのアシル
基に変換することがわかる。試験例Ｃ 0.2Mリン酸カリウム緩衝液（PH7.4）10μ、
６−アミノペニシラン酸（６−APA）溶液
（500μｇ／ml）10μ、アシル−CoA（5μmoles／
ml）20μ及び実施例１で得られた酵素液10μ
を37℃で３時間反応させ、実施例２と同様にして
HVEPで生成物を検定した。但し、HVPEの緩
衝液は酢酸緩衝液（PH4.5）に変えて行つた。ま
た、用いたアシル−CoAはアセチル−CoA及び
グルタリル−CoAの２種であり、コントロール
として上記組成の反応液から酵素液又はアシル−
CoAを除いたものも同時に反応させた。コントロールの２種の反応後はいずれも陽極側
0.7cmの位置（６−APAの位置）にのみ抗菌スポ
ツトが認められたが、アセチル−CoA添加区分
では陽極側0.7cmと5.3cmの所に、グルタリル−
CoA添加区では陽極側0.7cmと6.2cmの所に抗菌ス
ポツトが認められた。これらの結果から、本酵素
とアシル−CoAにより６−APAはそれぞれ対応
するアシル−６−APAに変換されたことがわか
る。実施例２グルコース2.5ｇ、コーンステイープリカー１
ｇ、フアルマメデイア（トレーダーズオイルミル
社製）0.5ｇ、酵母エキス0.5ｇ及びCaCO₃0.3ｇを
水道水100mlに溶解し、PHを7.0に調整した後、50
mlずつ250ml容エルレンマイヤーフラスコに分注
し、120℃15分間殺菌した。培地冷却後、ストレ
プトミセス・カトレヤNRRL8057を接種し、28
℃で90時間振盪培養した。培養後、遠心分離によ
り菌体を得、実施例１と同様の操作で細胞抽出液
20mlを得、酵素生成確認のため以下の反応に用い
た。 0.2Mリン酸カリウム緩衝液（PH7.4）10μ、
抗生物質PS−５溶液（500μｇ／ml又は抗生物質
OA−6129A溶液（500μｇ／ml）10μ、アシル
−CoA（5μmoles／ml）10μ及び上記細胞抽出液
20μを37℃で４時間反応させた後、試験例Ａと
同様にしてHVPEで生成物を検定した。コントロールとして上記組成の反応液から細胞
抽出液又はアシル−CoAを除いたものを同時に
反応させた。なお、アシル−CoAとしてはアセ
チル−CoA及びｎ−プロピオニル−CoAの２種
を用いた。抗生物質PS−５を基質とした場合には、全て
陽極側6.8cmの位置（抗生物質PS−５の位置）の
みにそれぞれ同じ大きさの抗菌スポツトが認めら
れたに過ぎず、上記細胞抽出液及びアシル−
CoAの添加によつて何ら変化を受けない、すな
わち上記細胞抽出液は抗生物質PS−５に対して
脱アシル化反応及びアシル−CoAからのアシル
転移又は交換反応を行なわないことがわかる。一方、抗生物質OA−6129Aを基質とした場合、
上記の細胞抽出液を除いたものは陽極側4.5cm
（抗生物質OA−6129Aの位置）に、アシル−CoA
を除いたものは陰極側1.1cm（抗生物質NS−５の
位置）に、アシル−CoAを加えたものは陽極側
6.8cm（抗生物質PS−５の位置）にそれぞれ単独
の抗菌スポツトが認められた。これらの結果か
ら、上記の細胞抽出液の添加により、抗生物質
OA−6129A→抗生物質NS−５の脱パントテイニ
ル化反応が生じ、更にアシル−CoAの添加によ
り抗生物質OA−6129A→抗生物質NS−５→Ｎ−
アシル抗生物質NS−５の脱パントテイニル化及
びＮ−アシル転移反応が完全に進行したことがわ
かる。実施例３可溶性デンプン5.2ｇ、エスサンミート1.2ｇ、
NaCl0.16ｇ、K₂HPO₄0.08ｇ及びMgSO₄・
7H₂O0.04ｇを水道水に溶解し全量を80mlにした
後、40mlずつ250ml容エルレンマイヤーフラスコ
に分注し、120℃で15分間殺菌した。培地を冷却
後、ストレプトマイセス・クレメウス・サブスピ
シス・オーラテイリ又はA271（ATCC31358）を
接種し、28℃68時間培養した。培養後実施例１と
同様の操作で細胞抽出液20mlを得、この細胞抽出
液の酵素活性確認のため以下の反応に用いた。 0.2Mリン酸カリウム緩衝液10μ、抗生物質
PS−５溶液（500μｇ／ml）又は抗生物質OA−
6129A溶液（500μｇ／ml）10μ及び上記細胞抽
出液20μを含む反応液50μを37℃、４時間反
応させた後、試験例Ａと同様にHVPEで生成物
を検定した。コントロールとして上記組成の反応液から細胞
抽出液を除いたものを同時に反応させた。抗生物質PS−５を基質とした場合には、細胞
抽出液添加の有無に拘わらず何ら変化が行らず、
陽極側6.5cmの位置にそれぞれ同じ大きさの抗菌
スポツトが認められた。一方、抗生物質OA−
6129Aを基質とした場合には、細胞抽出液無添加
では陽極側4.5cm（抗生物質OA−6129Aの位置）
に、細胞抽出液添加区では陰極側1.1cm（抗生物
質NS−５の位置）にそれぞれ単独の抗菌スポツ
トが認められた。これらの結果から、上記細胞抽
出液は抗生物質PS−５の脱アセチル化能は有し
ていないが、抗生物質OA−6129Aの脱パントテ
イニル化能を有していることがわかる。実施例４グリセリン４ｇ、ペプトン0.5ｇ、グルコース
0.2ｇ、可溶性デンプン0.2ｇ、エスサンミート0.5
ｇ、乾燥酵母0.5ｇ及びNaCl0.5ｇ、CaCO₃0.2ｇ
を水道水100mlに溶解し、25mlずつ250ml容エルレ
ンマイヤーフラスコに分注して120℃、15分間殺
菌した。培地冷却後ストレプトマイセス・アルゲ
ンテオルス（ATCC11009）を接種し、28℃、68
時間振盪培養した。培養後実施例１と同様の操作
で細胞抽出液20mlを得、実施例３と同様の反応操
作を行つた。試験例Ａ並びに実施例２及び３における場合と
全く同様に、上記細胞抽出液は抗生物質PS−５
の脱アセチル化能はもたないが、抗生物質OA−
6129Aの脱パントテイニル化能は有していること
が認められた。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１で得られた酵素の至適PHが７
〜7.5にあることを示すグラフであり、第２図は
該酵素の安定PHを示すグラフであり、第３図は該
酵素の作用適温を示すグラフであり、第４図は該
酵素の温度安定性を示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】１ (a) 式で示される抗生物質OA−6129Aの脱パントテ
イニル化能を有するが、式で示される抗生物質PS−５の脱アセチル化能
を実質的に有さず、 (b) 至適PH及び安定PH範囲がそれぞれ７〜7.5及
び６〜８であり、 (c) セフアデツクスＧ−150を用いたゲル過法
により測定したときの分子量が約10万であり、 (d) アンフオライン（PH３〜10）を用いたポリア
クリルアミドゲル等電点電気泳動により測定し
たときの等電点（pI）が5.1であることを特徴とするアミドヒドロラーゼである新規
酵素。２ストレプトミセス属に属するカルバペネム系
抗生物質生産菌によつて生産される特許請求の範
囲第１項記載の酵素。３該生産菌がストレプトミセス・フルボビリデ
イス（Streptomyces fluvoviridis）、ストレプト
ミセス・カトレヤ（Streptomyces cattleya）、
ストレプトミセス・クレメウス・サブスピシス・
オーラテイリス（Streptomyces cremeus subsp
auratilis）又はストレプトミセス・アルゲンテオ
ルス（Streptomyces argenteolus）である特許
請求の範囲第２項記載の酵素。４該生産菌がストレプトミセス・フルボビリデ
イスA933（Streptomyces fluvoviridis A933）で
ある特許請求の範囲第２項記載の酵素。