JPH07561B2 - 牛アデノウイルス７型ワクチン - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の利用分野〕 本発明は、牛アデノウイルス７型ウイルスを山羊由来の
組織培養細胞で増殖させ、得られたウイルス浮遊液を用
いて調製したワクチンに関し、さらに詳しくは、牛アデ
ノウイルス７型ウイルスを山羊由来の肺，肝，脾，腎，
精巣，胸腺，甲状腺，その他の組織由来の培養細胞に接
種し、30〜37℃で培養又は継代順化させることにより、
牛由来の組織培養細胞と同程度にウイルスを増殖させ、
得られたウイルス浮遊液を原材料として調製された生ワ
クチン又は不活化ワクチンに関するものである。

〔発明の背景〕

牛アデノウイルス７型ウイルスは牛アデノウイルスの多
くの型（９型以上）の中で牛に対する病原性がもっとも
強く、牛に感染すると２〜３日の潜伏期で41〜42℃の発
熱がみられ、５〜７日間持続し、鼻汁，流涙，咳等の呼
吸器症状、又は発熱末期にかけて激しい下痢をともなっ
た消化器症状を発症させる。幼牛はこれらの呼吸器症状
及び消化器症状を同時に発現する場合が多く、このよう
な場合の死亡率は高い。近年、乳用ホルスタイン種雄子
牛の集団的な肉用肥育が行われるようになり、大きな被
害がみられている。本ウイルスは妊娠中に感染すると胎
児感染を起し、流産又は虚弱子症候群の原因ともなって
いる。さらに、本ウイルスはしばしば他のウイルス、例
えば、牛のパラインフルエンザウイルス３型，アールエ
スウイルス，レオウイルス，ライノウイルス，牛伝染性
鼻気管炎ウイルス，牛ウイルス性下痢，粘膜病ウイル
ス，牛パルボウイルス，牛コロナウイルス，牛ロタウイ
ルス等との２種又は３種以上のウイルスとの混合感染を
起すことがあり、このような場合の被害はさらに大きく
なる。このような状況のなかで本ウイルス感染症に対す
る有効なワクチンの開発が急務とされている。言うまで
もなく、ワクチンの製造については、宿主動物に対する
外来の病原ウイルスの混入のない動物材料又は培養細胞
を用い、ウイルスを高度に増殖させる必要があるが、本
ウイルスを牛以外の動物又は培養細胞で高度に増殖させ
る培養細胞等の検索は容易でなく、実際にも未だ見出さ
れていないためこれまでに提案されていない。したがっ
て、野外からのウイルス分離や分離ウイルスの弱毒化に
は、もっぱら子牛精巣培養細胞が用いられており、ワク
チンの製造に適する動物材料又は培養細胞の開発が望ま
れている。

〔発明の目的〕

本発明はかかる観点から、牛以外の動物由来の培養細胞
を用いて高度に牛アデノウイルスを増殖させることので
きる培養法の提供を目的としてなされたものである。

また本発明の他の目的は、かかる培養法によって増殖さ
れたウイルスより製造されたワクチンを提供するところ
にある。

〔発明の概要〕

前記した目的に従って、本発明者等は牛以外の動物、す
なわち、モルモット，ハムスター，豚，サル及び山羊由
来の培養細胞を用いて、本ウイルスの増殖性を検討し
た。これによると、モルモット，ハムスター及びサル由
来の培養細胞では、いずれも良好な成績は得られず、豚
の精巣初代培養細胞では少量のウイルス増殖がみられた
が、継代順化によってもウイルスの増殖性を高めること
には成功していない。これに対し、山羊由来の培養細胞
では非常に良好な結果が得られることを知見した。かか
る観点から、本発明者は牛以外の動物として山羊を選
び、得られた組織から培養細胞を調製し、同培養細胞で
の本ウイルスの増殖性を検討したところ、本ウイルスが
牛由来の培養細胞と同程度に増殖すること、さらには本
培養細胞から得られたウイルス浮遊液から調製した生ワ
クチン及び不活化ワクチンが牛由来の培養細胞から得ら
れたワクチンと同程度の有効性を保持していることを見
い出し本発明をなすに至ったものである。

以下本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明するが、
本発明は実施例のみに限定されるものではない。

（１）山羊由来組織細胞の培養 各種動物の組織由来の細胞培養法は、一般的には細胞を
消化剤で単離させ、その単離細胞を細胞培養液に浮遊さ
せ、宿主動物の体温に近い温度（36〜37℃）で培養し、
細胞層を形成させる単層培養法が用いられ、他に、組織
を可能な限り細切し、その組織由来の性状を保持させた
状態で培養液に浮遊させ、宿主動物の体温に近い温度で
培養する器官培養法が用いられる。単層培養法には静置
培養法，低速回転培養法，マイクロキャリアー培養法，
多重層培養法等の応用が可能である。本発明ではこれら
の各培養法が適用可能であるが、本例では単層培養法の
静置培養法を行なった。

細胞培養用の山羊組織は胎児又は生後30日以内の子山羊
から得たものが、より良好な結果が得られる。各組織を
無菌的に採取し、細切した後、約200倍量の0.01Mリン酸
緩衝食塩液（以下PBSという）に浮遊させ、軽く撹拌し
ながら組織を洗浄し、適当な遠心沈殿管に入れ、500〜8
00rpmで２分間遠心分離し、沈殿に集められた組織を約2
00倍量の0.25％トリプシンPBS溶液、又は0.01％ディス
パーゼPBS溶液中に浮遊させ、７〜10℃又は30〜32℃で
スターラー撹拌しながら細胞をばらばらに消化単離させ
る。単離細胞浮遊液を適当な沈殿管に入れ、800〜1000r
pmで２分間遠心分離し、沈殿に集められた単離細胞を、
約100倍量の牛アデノウイルス７型ウイルス抗体陰性の
山羊血清を５％の割合に含む平衡リン酸緩衝食塩液に浮
遊させ、撹拌洗浄後、800〜1000rpmで２分間遠心分離す
る。沈殿に集められた単離細胞を上記同様にして洗浄す
る。この操作は軽遠心した上清がほとんど透明になるま
でくりかえす。ついで、沈殿に集められた単離細胞を細
胞増殖用培養液（牛アデノウイルス７型ウイルス抗体陰
性の山羊血清10％、TPB（Tryptose Phosphate Broth）
0.295％及び７％NaHCO₃溶液１％を含むイーグルMEM（Mi
nimum Essential Medium）溶液）に1ml当たり５〜８×1
0⁵個になるように浮遊し、細胞培養びんの容量にしたが
って規定量ずつ分注し、37℃で４〜５日間静置培養して
細胞層を形成させる。細胞の継代及び凍結保存は常法に
よって行う。通常これらの培養細胞は５代以上の継代が
可能である。

（２）ウイルスの山羊由来培養細胞での培養 実施例１ 弱毒ウイルスの培養 生後７日の子山羊から肺，肝，脾，腎，胸腺及び精巣を
採取し、前記の細胞培養法で各培養細胞を調製し、試験
には200ml容量の培養びんに10mlずつ分注し、37℃で４
日間培養した継代２代目の細胞を用いた。又、ウイルス
増殖用の対照培養細胞として子牛精巣培養細胞を用い
た。ウイルス株は子牛精巣培養細胞に30℃の低温培養法
で継代順化された弱毒ウイルスBT−３株（農林水産省家
畜試験場より分与）を用いた。ウイルス接種は各培養細
胞の培養液を除去し、PBSで細胞表面を１回洗浄後、10
^5.0TCID₅₀/ml（1ml中の50％組織培養感染ウイルス量）
のウイルス浮遊液を1mlずつ接種し、37℃で60分間感作
してウイルスを吸着させた後、接種材料を除去し、細胞
維持用培養液（牛アデノウイルス７型ウイルス抗体陰性
の山羊血清２％、TPB0.295％及び７％NaHCO₃溶液２％を
含むイーグルMEM溶液）を10mlずつ注加後、37℃と30℃
で静置培養しながらCPE（Cyto Pathogenic Effect:細胞
変性効果）出現状況を観察した。又、37℃では培養７日
目に、30℃では培養14日目に培養液を採取し、子牛精巣
培養細胞を用いてウイルス含有量を測定した。対照培養
細胞として用いた子牛精巣培養細胞は37℃では７日目、
30℃では12日目に培養液を採取した。結果は下記表１に
みられるように、37℃培養ではウイルス接種後７日目に
はすべての培養細胞に20〜50％以上のCPEが出現し、そ
の培養液1ml中のウイルス含有量は、20％程度のCPEを示
した肝，脾，腎ではそれぞれ10^5.8，10^6.0，10^5.7TCID
₅₀、50％以上のCPEを示した肺，胸腺，精巣ではそれぞ
れ10^7.8，10^7.8，10^7.6TCID₅₀であった。対照培養細胞
のCPEは80％以上で、その培養液1ml中のウイルス含有量
は10^7.8TCID₅₀であった。30℃培養では培養14日目では
肺，胸腺，精巣に20〜50％のCPEが出現したが、その他
の培養細胞ではCPEが出現しなかった。これらの培養液1
ml当たりのウイルス含有量は、CPEの出現した肺，胸
腺，精巣ではそれぞれ10^6.2，10^6.3，10^6.0TCID₅₀、CPE
の出現しなかった肝，脾，腎ではそれぞれ10^3.5，1
0^4.0，10^3.8TCID₅₀であった。30℃対照培養細胞のCPEは
12日目に80％以上となり、その培養液1ml当たりのウイ
ルス含有量は10^6.4TCID₅₀であった。以上の成績は本ウ
イルスが山羊由来の培養細胞で牛由来の培養細胞と同程
度に増殖することを示している。

実施例２ 強毒ウイルスの培養 生後３日の子山羊から肺，腎，甲状腺，胸腺及び精巣を
採取し、前記の細胞培養法で各培養細胞を調製し、試験
には500ml容量の培養びんに30mlずつ分注し、37℃で４
日間培養した継代２代目の細胞を用いた。又、ウイルス
増殖用の対照培養細胞として子牛精巣培養細胞を用い
た。ウイルス株は牛に病原性を示す強毒な袋井株（農林
水産省家畜試験場より分与）を用いた。ウイルス接種は
各培養細胞の培養液を除去し、PBSで細胞表面を１回洗
浄後、10^5.0TCID₅₀/mlのウイルス浮遊液を5mlずつ接種
し、37℃で60分間感作してウイルスを吸着させた後、接
種材料を除去し、細胞維持用培養液を50mlずつ注加後、
37℃で静置培養しながらCPE出現状況を観察した。又、
培養液の一部をウイルス接種後５日,8日及び10日目に抜
き取り、そのウイルス含有量を子牛精巣培養を用いて測
定した。結果は下記表２にみられるように、CPEの出現
は胸腺細胞で４日目から、肺及び甲状腺細胞で７日目か
ら認められたが、腎及び精巣細胞では培養10日目まで認
められなかった。ウイルス増殖のピークは大部分の培養
細胞で５日目前後とみられ、７日目以降CPEの認められ
た肺，甲状腺，胸腺由来の培養液1ml当たりのウイルス
含有量は５日目でそれぞれ10^6.5，10^5.0，10^6.8TCID₅₀
で、10日目ではそれぞれ10^6.8，10^5.3，10^6.8TCID₅₀で
あった。CPEの出現しなかった腎及び精巣細胞の培養液
では10日目で10^5.0，10^6.0TCID₅₀/mlの値を示した。対
照として用いた子牛精巣培養細胞ではウイルス接種後３
日目からCPEが出現し、８日目には80％以上となり、そ
の培養液1ml当たりのウイルス含有量は10^8.0TCID₅₀であ
った。以上の成績は、牛アデノウイルス７型強毒ウイル
ス袋井株が山羊由来の培養細胞で増殖することを示して
いるが、その程度は牛由来の培養細胞に若干劣ることが
示されている。

実施例３ 強毒ウイルスの継代順化 実施例２において、山羊由来の培養細胞では強毒ウイル
ス袋井株の増殖が牛由来の培養細胞の場合よりも劣る傾
向が示されたので、本ウイルスの山羊由来培養細胞への
継代順化を試みた。試験に用いた培養細胞は実施例２に
用いた子山羊の肺，胸腺及び精巣細胞の継代４〜８代の
ものを用いた。ウイルスは実施例２の培養10日目に採取
した各培養細胞系のものを用いた。ウイルスの継代は10
^4.7〜10^5.3TCID₅₀/mlのウイルス浮遊液を、実施例２と
同様の方法で接種し、吸着させた後培養液を加え、37℃
で７日間培養する方法で７〜10代行った。その結果、下
記表３にみられるようにいずれの培養細胞でも培養７日
目までのCPEは、ウイルスの継代が進むにつれてその程
度が強く現れるようになり、肺培養細胞では継代３代目
から50％,8代目から80％以上，胸腺培養細胞では２代目
から50％,6代目から80％以上，精巣培養細胞では２代目
まではCPEが出現しなかったが、３代目で20％,6代目で5
0％,8代目で80％以上となった。培養液中のウイルス含
有量はCPEの程度が強く現れるのに平行して増加し、肺
培養細胞では継代７代以降、胸腺培養細胞では継代４代
以降、精巣培養細胞では継代７代以降いずれも10^7.5TCI
D₅₀/ml以上となり、その最高値は胸腺培養細胞継代５代
目の10^8.0TCID₅₀/mlであった。以上の成績は強毒ウイル
ス袋井株が山羊由来の培養細胞に順化し、牛由来の培養
細胞の場合と同程度に増殖することを示している。

（３）ワクチンの調製 ワクチンには、対象動物に病原性を示さないように弱毒
化された生きたウイルスを用いた生ワクチンと、弱毒ウ
イルス又は強毒ウイルスを薬剤又はその他の方法で殺
し、免疫原性のみを保持させた不活化ワクチンとがあ
り、以下これらの各実施例について示す。

実施例４ 生ワクチンの調製及び牛への応用生ワクチン
の調製 胎令137日の山羊胎児から肺，肝，脾，腎，胸腺，筋
肉，皮膚の各組織を採取し、前記（１）の細胞培養法に
よって各培養細胞を調製した。試験には500ml容量の培
養びんに30mlずつ分注し、37℃で４日間培養した継代３
代目の各細胞を用いた。ウイルス株は弱毒ウイルスBT−
３株を山羊胸腺培養細胞で３代限界希釈継代したクロー
ンを同培養細胞でさらに２代継代増殖させたBT−３−GT
h5株を用いた。ウイルス接種は各培養細胞の培養液を除
去し、細胞表面をPBSで１回洗浄後、10^5.3TCID₅₀/mlの
ウイルス浮遊液を5mlずつ接種し、37℃で60分間感作し
てウイルスを吸着させた後、接種材料を除去し、細胞維
持用培養液50mlずつを注加し、32〜34℃で静置培養し
た。培養７日目には20〜80％のCPEが出現したので、各
培養細胞ごとに培養液を採取混合した。各培養液1ml当
たりのウイルス含有量は、CPEが20〜50％であった肝，
脾，腎の各培養細胞由来では、それぞれ10^5.0，10^5.8，
10^5.5TCID₅₀であったが、CPEが80％以上を示したその他
４種の培養細胞由来では10^7.5〜10^7.7の高い値が得られ
た。高い値の得られた前記４種の細胞培養液を混合し、
軽遠心した上液をワクチン調製用のウイルス浮遊液と
し、これを２分し、その一方にはＡ安定剤（乳糖10％及
びポリビニールピロリドン0.3％溶液）を、他方にはＢ
安定剤（ペプトン10％及びポリビニールピロリドン0.3
％溶液）を等量加え、10ml容量のバイアルに1mlずつ分
注し、凍結乾燥後、減圧下で封じ、前者をLotNo.1、後
者をLotNo.2とし、２ロットの生ワクチンを調整した。
本ワクチンを10mlずつの溶解用液（0.01M平衡リン酸緩
衝食塩液）で溶解し、子牛精巣培養細胞を用いてウイル
ス含有量を測定した結果、LotNo.1では10^5.5TCID₅₀/m
l、LotNo.2では10^5.6TCID₅₀/mlであった。この成績は、
弱毒ウイルスの約10^3.0TCID₅₀を牛に注射すると十分な
免疫が付与されることから、山羊由来培養細胞で得られ
たウイルス浮遊液から高力価の生ワクチン製造が可能な
ことを示している。

生ワクチンの安全性 前記により調整した生ワクチンLotNo.1及び２の各２本
ずつを2mlの溶解用液で溶解（含有ウイルス量10^6.8及び
10^6.9TCID₅₀）し、これを体重178〜193kgのアデノウイ
ルス７型ウイルス抗体陰性の子牛１頭ずつに皮下注射
し、１頭を非注射対照牛として同居させた。これらの子
牛は毎日元気・食欲の異常、鼻汁及び下痢の有無等の臨
床症状の観察、体温及び白血球数の計測を14日間、血
液，糞便及び鼻汁からのワクチンウイルスの回収を10日
間実施した。又、ワクチン注射後７日、14日、21日目に
血清中の牛赤血球凝集抑制（HI）抗体価を測定した。そ
の結果、試験牛は観察期間中まったく異常を示さず経過
し、体温及び白血球数にも異常が認められなかった。
又、血液，糞便及び鼻汁からのウイルス回収もすべて陰
性であった。HI抗体はワクチン注射牛では７日目から検
出され、その値は20倍と40倍、14日目には40倍と80倍、
21日目にはいずれも160倍となった。一方、同居牛は同
居21日後においてもHI抗体は検出されなかった。以上の
結果は下記表４に示した通りであり、本ワクチンウイル
スが有効量（10^3.0TCID₅₀）の約5000倍量を子牛に注射
しても安全であることを示している。

生ワクチンの免疫原性 前記生ワクチンLotNo.1及び２を10mlの溶解用液で溶解
し、さらに溶解用液を用いて200倍に希釈して1ml当たり
のウイルス含有量がLotNo.1では10^3.2TCID₅₀,LotNo.2で
は10^3.3TCID₅₀になるように調整したものを注射材料と
した。供試牛は体重167〜235kgの牛アデノウイルス７型
ウイルス抗体陰性の子牛５頭を選出した。２頭にはLotN
o.1希釈ワクチンの1mlずつを、２頭にはLotNo.2希釈ワ
クチンの1mlずつを、それぞれ皮下注射し、１頭は強毒
ウイルス攻撃対照として、ワクチン注射牛に同居させ
た。これらの子牛は毎日元気・食欲の異常、鼻汁及び下
痢の有無等の臨床症状の観察、体温及び白血球数の計測
を14日間行うとともに、７日ごとに28日目までHI及び中
和抗体価を測定した。さらに、これらの試験牛はワクチ
ン注射後28日目に強毒ウイルス袋井株の10^7.0TCID₅₀を
皮下注射する方法で攻撃し、臨床症状の観察、体温及び
白血球数の計測、血中からの攻撃ウイルスの回収を14日
間行うとともに攻撃後７日目及び14日目のHI及び中和抗
体価を測定した。結果は表５にみられるように、ワクチ
ン注射による臨床症状，体温及び白血球数の異常はいず
れの牛にも認められなかった。HI及び中和抗体応答はワ
クチン注射後７日目には４頭中３頭（75％）に、14日目
には全例に認められ、強毒ウイルス攻撃時（ワクチン注
射後28日目）にはHI抗体で40〜80倍、中和抗体で16〜64
倍の値が検出された。これらのワクチン注射牛は強毒ウ
イルス攻撃後も臨床症状，体温及び白血球数の異常をま
ったく示さず経過し、血中ウイルスの検出も陰性であ
り、さらに攻撃後の抗体上昇がまったく認められず、10
^7.0TCID₅₀の攻撃ウイルスに対し完全な防御を示した。
一方、ワクチン非注射対照牛は典型的なアデノウイルス
７型感染症の症状を示して耐過し、血清中には高いHI及
び中和抗体が産生された。以上の成績は、山羊由来の培
養細胞を宿主として作出された生ワクチンは10^3.0TCID
₅₀前後の注射ウイルス量で約１カ月後には野外の強毒ウ
イルスの感染を防御することを示している。

実施例５ 不活化ワクチンの調製及び牛への応用不活化
ワクチンの調製 30日令の子山羊から肺，胸腺及び精巣の各組織を採取
し、前記（１）の細胞培養法によって各培養細胞を調製
した。試験には500ml容量の培養びんに30mlずつ分注
し、37℃で５日間培養した継代３代目の細胞を用いた。
ウイルス株は強毒ウイルス袋井株の山羊精巣培養細胞継
代７代目のウイルスを用いた。ウイルス接種は各培養細
胞の培養液を除去し、細胞表面をPBSで１回洗浄後、10
^5.5TCID₅₀/mlのウイルス浮遊液を5mlずつ接種し、37℃
で60分間感作してウイルスを吸着させた後、接種材料を
除去し、細胞維持用培養液50mlずつを加え、37℃で静置
培養し、ウイルス接種後７日目に各培養細胞ごとに培養
液を採取混合した。ついで軽遠心後、その上液の一部は
ウイルス含有量測定用とし、残部にはホルマリンを0.2
％の割合に添加し４℃で７日間不活化した。不活化ウイ
ルス浮遊液に1/10量のリン酸アルミニウムゲルを添加
し、２日後30ml容量のバイアルに30mlずつ分注後封栓
し、肺，胸腺及び精巣培養細胞由来の順にLotNo.1,2,3
とし、３ロットの不活化ワクチンを調製した。これらの
不活化ワクチン調製用ウイルス浮遊液の不活化前のウイ
ルス含有量は、それぞれ10^7.5，10^8.0，10^8.0TCID₅₀で
あった。以上の成績は本不活化ワクチン中に十分な抗原
量が含有されていることを示している。また、この他に
山羊由来の肝，脾，筋肉，皮膚の各組織を用いて調整し
た不活化ワクチンについても、十分な抗原量の含有され
ていることが確認された。

不活化ワクチンの安全性 前項で試作した不活化ワクチン３ロットを、体重210〜2
30kgの牛アデノウイルス７型ウイルス抗体陰性の子牛１
頭ずつに、それぞれ10mlずつ頸部筋肉内に注射し、元気
・食欲の異常、鼻汁及び下痢の有無等の臨床症状の観察
と体温測定を14日間行うとともに、ワクチン注射後７
日,14日及び21日目にHI抗体価を測定した。その結果は
下記表６に示す通りであり、試験牛は観察期間中まった
く異常を示さず経過した。血清中のHI抗体はワクチン注
射後14日目までは検出されなかったが、21日目に全例に
20〜80倍の値が検出された。この成績は、本不活化ワク
チン中の強毒ウイルスが完全に不活化され、子牛に対し
て安全なことを示している。

不活化ワクチンの免疫原性 前項２−（１）で試作した不活化ワクチン３ロットを、
体重178〜213kgの牛アデノウイルス７型ウイルス抗体陰
性の子牛２頭ずつに、それぞれ3mlずつ28日間隔で２回
頸部筋肉内に注射し、元気・食欲の異常、鼻汁及び下痢
の有無等の臨床症状の観察と体温測定をワクチン注射後
14日間実施するとともに、ワクチン第１回注射直前、第
２回注射直前及び第２回注射後14日目に血清中のHI及び
中和抗体を測定した。結果は表７にみられるように、試
験牛は観察期間中まったく異常を示さず経過し、ワクチ
ン第２回注射直前にはいずれも10〜40倍のHI抗体及び２
〜16倍の中和抗体が検出された。これらのHI及び中和抗
体価はワクチンの第２回注射後14日目にはさらに上昇
し、HI抗体は40〜320倍、中和抗体は32〜256倍の値を示
した。以上の成績は、本不活化ワクチンが有効な免疫原
性を保持していることを示している。

〔発明の効果〕 本発明によって初めて、牛アデノウイルス７型ウイルス
を牛以外の動物（山羊由来）の組織培養を用いて培養増
殖でき、しかも牛由来の培養細胞から得られたワクチン
と同程度の有効性を有するワクチンが、この山羊由来の
培養細胞から得られたウイルス浮遊液より調製できるた
め、これによって宿主動物に由来する病原ウイルスの混
入のない、本ウイルス感染症に対する有効なワクチンを
初めて提供することができるという効果が得られる。

フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭50−18619（ＪＰ，Ａ) 特開 昭48−13519（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−56431（ＪＰ，Ａ) 特公 昭48−2767（ＪＰ，Ｂ１) 特公 昭49−40924（ＪＰ，Ｂ１)

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】牛アデノウイルス７型のウイルスを山羊由
   来の組織培養細胞を用いて増殖させ、得られたウイルス
   浮遊液を継代培養することにより、あるいは不活化する
   ことにより調製されたことを特徴とする生もしくは不活
   化牛アデノウイルス７型ワクチン。