DD210306A5 - Verfahren zur herstellung eines rekombinanten dna-klonierungsvektors zur expression von exogenem protein - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten DNA-Klonierungsvektors zur Expression von exogenem Protein, indem man folgende DNA-Segmente miteinander verknuepft:(a) ein DNA-Segment, dass einen funktionellen Replikationsursprung enthaelt,(b) ein oder mehr DNA-Segmente, von denen jedes einer transformierbaren Wirtszelle eine Eigenschaft verleiht,die fuer eine Selektion brauchbar ist,wenn dieser Vektor in die Wirtszelle transformiert ist, und (c) ein DNA-Segment,das eine Sequenz enthaelt, die in Tandemanordnung folgendes definiert:(1) den Promotor einer Lipoproteinexpressionssteuersequenz, (2) die 5'-untranslatierte Region einer Lipoproteinexpressionssteuersequenz und (3) ein Translationsstartkodon,das ohne Zwischenanordnung eines Teils oder Gesamten einer Nucleotidsequenz, die fuer endogenes Protein kodiert, gefolgt wird von (i) einer Sequenz, die fuer ein exogenes Protein kodiert, oder (ii) einer Nucleotidsequenz, die fuer eine Enterokinasespaltstelle kodiert, an welche ohne Unterbrechung eine Nucleotidsequenz gebunden ist, die fuer ein exogenes Protein kodiert.

Description

* Aktenzeichen:

-A-

Χ-5872

Vertreter: Patentanwaltsbüro Berlin

jQ ;. Titel' der Erfindung:

Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten DNA-KIonierungsvektors zur Expression von exogenem Protein

Anwendungsgebiet der Erfindung: Die Erfindung bezieht sich auf neue DNA-Sequenzen und Kl oni'eruiigs vektoren:.-- (Träger) , die sich zur Herstellung von Proteinprodukten verwenden lassen.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen und Aufgabe der Erfindung: ' ' Γ ', '.·..

Inouye .und verschiedene seiner Mitarbeiter,.haben eingehende νυηΐβχ3ΤΛσΗυη9θή'''··βήν·Ό6ηε«<5'ΰοή·ζεή^:.··'β1ΐΓ.ο·ΐΊ^:5βΐ'ίίϊΐΓί^;> die für Proteine aus der äußeren Zellmembran gramnegativer Bakterien kodieren und insbesondere für das Lipoprotein. Diese Untersuchungen haben gezeigt, daß Lipoproteine in Bakterienzellen in verhältnismäßig großen Mengen vorhanden sind. So gibt es beispielsweise etwa 7,2. χ 10 Lipo-' proteinmoleküle in der äußeren Zellmembran von Escherichia cbli pro Zelle. Da es ferner anscheinend nur ein Strukturgen für das Lipoprotein im Chromosom von Escherichia coli gibt, muß dieses über eine hocheffiziente Transkriptionsmaschinerie verfügen.

Neuere Arbeiten von Inouye und Mitarbeitern befassen sich mit der Expression von .Lipoprotein unter Verwendunggeeignet formulierter Plasmide in zweckentsprechend transformierten Mikroorganismen und mit der Bestimmung und Analyse von DNA-Sequenzen verschiedener Lipoproteingene

. MA11933*091303

(lpp). So wird in Cell 18, 1109 bis 1117 (1979) über die DNA-Sequenz des in der äußeren Zellmembran enthaltenen Lipoproteins von Escherichia coli berichtet. Eine Analyse der Promotorregion dieser Sequenz zeigt einige interessante Merkmale. Das erste dieser Merkmale besteht darin, daß das aus 261 Basenpaaren (bp) bestehende Segment, das der . Transkriptionsinitiationsstelle vorangeht (-1 bis -261), über einen sehr hohen AT-Gehalt (70 %) verfügt, was im Gegensatz steht zum Gehalt von 53 % für die 322 bp mRNA-Region von 44 % für das Segment von 127 bp nach der Transkriptionsterminations'stelIe und-von 49 % für den mittleren AT-Gehalt des Chromosoms von Escherichi-a coli. Als zweites Merkmal hat sich gezeigt, daß die ersten 45 bp vor der Transkriptionsinitiationsstelle (-1 bis -45) 36 Basen (80 %) enthalten, die A oder T sind. Als drittes Merkmal· ist' eine Heptanucleotidsequenz analog; zur; sogenannten Pribnow Box acht Basen von der Transkriptionsinitiationsstelle entfernt vorhanden. Das vierte Merkmal besteht darin, daß sich eine zur RNA-Polymerase-Erkennungsstelle analoge¹Sequenz^;an beiden Strängen zwischen den' Stellungen -27 und -39 befindet. Schließlich ist als·fünftes. Merkmal eine lange- Dyadensymmetrie- an" der Trans-kriptipnsi-nitiationsstelle zentriert.

Von Inouye und Mitarbeitern wird postuliert, daß diese Merkmale entweder getrennt oder in Kombination für das hohe Ausmaß an lpp-Promotorstärke verantwortlich sind. Insbesondere wird postuliert,: daß der hohe AT-Gehalt in der Promotorsequenz zu einer Destabilisierung der Hel-ixstruktur der DNA neigt und somit eine Entspiralisierung' erleichtert, die für die Initiation der Transkription wesentlich ist. * ' ^:

Von Inouye und Mitarbeitern ist weiter gezeigt worden,. daß es ein hohes Ausmaß an Homologie in bezug auf Lipoproteingensequenzen anderer und- möglicherweise; aller gramnegativen Bakterien gibt. _;So zeigt eine Analyse der DNA-Sequenz des Lipoproteingens von Serratia marcescens und

] ein Vergleich mit der entsprechenden Sequenz des Ipp-Gens von Escherichia coli ein hohes Ausmaß an Homologie (Proc. Natl. Acad.. Sei. USA 77, 1369 bis 1373 (1980)). Vor allem ist von dieser Forschergruppe gezeigt worden, daß die Promotorregion in hohem Ausmaß erhalten bleibt (84 % Homologie) und über einen äußerst hohen Gehalt an A und T (78 %) verfügt, der genau so liegt, wie bei Escherichia coli (80 %] Ferner ist auch die 5'-untranslatierte Region der Lipopro-' tein-mJRNA in hohem Ausmaß erhalten (95 % Homologie).

;. . .10' ν .^: : ' . . ' ; · ' . .·

InJ. Biol. Chem. 256, 2194 bis. 2198 (1981) wird die DNA- _; Sequenz des Lipoproteingens von Erwinia amylovora analysiert und mit der von Escherichia coli und von Serratia marcescens verglichen. Diese Untersuchung bestätigt erneut das in den lpp-Genen bestehende hohe Ausmaß an Homologie. _: So ist die .Promotorregion (-45 bis -1) in hohem Ausmaß er- halten (87 % im Verhältnis zu Escherichia coli. und·- 93 % .im Verhältnis zu Serratia marcescens). Es besteht auch ein äußerst hoher Gehalt an A und T (80 %), wie dies auch bei. Escherichia coli (80 %) und^:Serratia marcescens (78 %)

:der Fall ist. Ferner., ist die, .Sequenz,..der. untrans lati;e:rten Regi off-, de x"^:: rriRNÄv.-ih-.höhem'-Ausmaß , erhalten.... ( 97 % ... in- bezug auf Escherichia coli und 92 % im Verhältnis zu Serratia '. . . marcescens)

O 25 . " ·

Das für das Lipoproteingen beobachtete hohe Ausmaß an konstitutiver Transkription, das die Arbeiten von Inouye zeigen, empfiehlt dieses Gen als Träger zur Expression exogener DNA-Fragmente.. Ferner legen die.Arbeiten von Inouye nahe, daß sich für diesen Zweck.auch irgendein Lipoproteingen eines gramnegativen Bakteriums verwenden läßt, wie beispielsweise von Escherichia coli, Shigella dysenteriae, Salmonella typhimurium, Citrobacter- freundii, Klebsiella aerogenes, Enterobacter aerogenes, Edwardsiella tarda, Erwinia amylovora, Serratia marcescens und dergleichen .

Vor kurzem ist auch die Eignung des Lipoproteingens von

Inouye und Mitarbeitern zur Produktexpression gezeigt worden (J. Bacter. 146, 861 bis 866 (1981)). Hiernach ist das Lipoproteingen von Serratia inarcescens in einen Λ-Phagenvektor kloniert und dann in die Plasmidvektoren pBR322 und pSCIOl rekloniert worden. Beide Vektoren, die das lpp-Gen von Serratia inarcescens tragen, sind zur Transformation von Zellen von Escherichia coli verwendet worden. Es besteht also offensichtlich eine normale Expression, wenn auch in einem gegenüber Vektoren, die das lpp-Gen von Escherichia coli enthalten, etwas geringeren Ausmaß. Auf jeden Fall ergibt sich aus dieser Literatur, daß Vektoren, die den lpp-Genpromotor und 5'-untranslatierte Regionen enthalten,·zur Erzielung eines ziemlichen Ausmaßes an Lipoproteinexpression verwendet werden können.

Unter dem hierin· verwendeten, Begriff. Vektor, wird ein Plasmid, eine Phagen-DNA oder eine sonstige DNA-Sequenz verstanden, die (1) zu einer Replikation in einer Wirtszelle befähigt ist, (2) zu einer Transformation ..einer Wirts- " zelle befähigt ist und (3) einen Marker enthält, der sich zur Identifizierung transformierter Zellen verwenden läßt.

Es gibt zwei Ausführungsformen der speziellen Klasse von Klonierungsvektoren, auf die sich die Erfindung bezieht.

Unter Verwendung beider Ausführungsformen dieser Klonierungsvektoren lassen sich signifikant hohe Ausmaße einer Expression an exogenem Protein erzielen. Bei der ersten Ausführungsform sind die Klonierungsvektoren so konstru- iert, daß sie in Tandemanordnung eine-Nucleotidsequenz, die die Lipoproteinpromotorregion definiert, eine Nucleotidsequenz,die die 5'-untranslatierte Lipoproteinregion definiert, und eine Sequenz enthalten, die für ein exogenes Proteinprodukt kodiert, wobei die für ein solches Produkt kodierende Sequenz über ein Translationsstartsignalkodon mit dem 3'-Ende der 5'-untranslatierten Region des Lipoproteingens verbunden ist. Bei einer zweiten Ausführungsform ist die für das exogene Proteinprodukt kodierende Sequenz über das oben erwähnte Startkodon und eine

Nucleotidsequenz, die für eine Enterokinasespaltstelle kodiert, an das 3'-Ende der 5'-untranslatierten Region des Lipoproteingens gebunden.

Die Erfindung bezieht sich daher auf ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten DNA-Klonierungsvektors zur Expression von exogenem Protein, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man folgende Segmente miteinander verknüpft:

(a) ein DNA-Segment, das einen funktionellen Replikations-Ursprung enthält,

(b) ein oder¹ mehr DNA-Segmente, von denen jedes einer transformierbaren Wirtszelle eine Eigenschaft verleiht, die für eine Selektion brauchbar ist, wenn dieser Vektor in die Wirtszelle transformiert ist, und

(c) ein DNA-Segment, das eine Sequenz enthält, die in Tandemanordnung· folgendes definiert:

(1) den Promotor einer Lipoproteinexpressionssteuersequenz,

(2) die 5'-untranslatierte Region einer Lipoproteinexpressionssteuersequenz und .

(3) ein Translationsstartkodon, das ohne Zwischenanordnung eines Teils oder Gesamten einer Nücleotidsequenz, die für endogenes Protein kodiert, gefolgt wird von

(i) . einer Sequenz, die für ein exogenes Protein kodiert, oder

(ii) einer Nucleotidsequenz, die für eine Enterokinasespaltstelle kodiert, an welche ohne Unterbrechung eine Nucleotidsequenz gebunden ist, die für ein exogenes Protein kodiert. 30

Der rekombinante DNA-Klonierungsvektor wird dadurch hergestellt, daß man die.DNA-Segmente (a), (b) und (c) miteinander verknüpft. Die Erfindung ist daher, wie bereits erwähnt, auf DNA-Sequenzen und rekombinante DNA-Klonierungsvektoren gerichtet,· durch die sich exogenes Protein äußerst effizient produzieren läßt. Jedes davon trägt wenigstens einen Teil einer Lipoproteingenmaschinerie (Ιρρ-Maschinerie) und vorzugsweise ein Lipoproteingen von gram-

Vl.

GKI1933*1"-H!)7

negativen Bakterien„ Unter einem exogenen Protein wird vorliegend ein Proteinprodukt verstanden, das anders ist als das Lipoproteinmolekül, das normalerweise von der Lipoproteingenmaschinerie exprimiert wird, oder irgendein Teil eines solchen Moleküls.

Beispiele für typische gramnegative Bakterien, die als Quelle für eine lpp-Maschinerie dienen können, sind beispielsweise Escherichia coli, Shigella dysenteriae, SaI-monella typhimurium, Citrobacter freundii, Klebsieila · aerogenes, Enterobacter aerogenes, Edwardsieila tarda, Erwinia amylovora, Serratia marcescens und dergleichen.

Das Ipp-Gen läßt sich durch fünf Elemente beschreiben.

Diese Elemente setzen sich in der Reihenfolge ihres Auftretens im Gen wie folgt zusammen-: (1) der Promotorregion, (2) der 5'-untranslatierten Region, (3) der Lipopr.oteinkodierungssequenz, (4) der 3'-untranslatierten Region und (5) der TranskriptionsterminatipnsstelIe.

Man weiß bereits genau, welche Funktion jedem dieser Elemente - in Gensystemen.zukommt. Die Promotorregion vermittelt eine Initiation der Bildung von Messenger-RNA (mRNA) (Transkription). Der Promotor kann frei sein von äußerer Steuerung.(konstitutiv), sich unter der Steuerung eines Repressers befinden, nämlich einer Substanz, die bei Anwesenheit eine, Genfunktion reprimiert, oder sich unter der Steuerung eines Induzers befinden, nämlich einer Substanz, die zur Einleitung einer Genfunktion erforderlich ist. Das Ipp-Gen ist frei von äußerer Steuerung und wird daher als konstitutiv bezeichnet.' Am oder in der Nähe des Promotors angeordnet befindet sich die Transkriptionsinitiationsstelle, nämlich ein. Punkt, an den sich RNA-PoIymerase bindet und so eine Transkription von mRNA initiiert. Nach erfolgter Initiierung der Transkription wird mRNA gebildet. Die Struktur der erhaltenen mRNA wird von der DNA-Sequenz der oben erwähnten Genelemente (2.-)' bis (4) bestimmt. . ·

] Die erhaltene raRNA trägt eine Sequenz, die in Proteinprodukt translatierbar ist. Die translatierbare Sequenz ist nach der 5'-untranslatierten Region und vor der 3'-untranslatierten Region lokalisiert. Eine Translation wird c durch Bindung von Ribosomen an eine Sequenz in der 5'-untranslatierten Region von mRNA vermittelt, die als Ribosombindestelle bezeichnet wird, und an dem Translationsstartkodon (AUG) initiiert wird, das als erstes Kodon'.der Produktgensequenz auftritt und auch· für die Aminosäure Me-IQ thionin (Met) kodiert. Eine Translation endet an ein oder mehr Terminationskodonen, die am Ende der Translationsregion erscheinen.

Durch die Techniken rekombinanter DNA ist die Herstellung von Klonierungsvektoren möglich geworden, die sich zur Produktion von Fremdproteinen (exogenen Proteinen) eignen, indem.in solche Vektoren eine Expressionssteuersequenz inseriert wird, nämlich eine Sequenz von Nucleotiden, die eine Expression von Strukturgenen steuern und regulieren, wenn sie arbeitsfähig an solche Gene gebunden sind. Beim Erfindungsgegenstand machen die"Klonierungsvektoren teilweise.· oder ganz Gebrauch von der lpp-Expressionssteuersequenz, die die oben erwähnten Elemente (1), (2), (4) und (5) enthält. Von diesen vier Elementen sind bei den erfindungsgemäßen Klonierungsvektoren lediglich die Elemente (I) und (2) erforderlich, nämlich die Promotorregion und die 5'-untranslatierte Region.

Bei Anwendung einer rekombinanten DNA-Methodologie erfolgt die Produktion von Fremdprotein gewöhnlich durch Insertion einer DNA-Sequenz, die für ein solches Fremdprotein kodiert, in die Expressionssteuersequenz eines Klonierungsvektors an einer Stelle, daß das exprimierte Produkt ein Hybridprotein enthält. Unter einem Hybridprotein wird ein rekombinantes DNA-Produkt verstanden, das das natürliche Protein (endogene Protein) insgesamt oder teilweise enthält, welches durch die Expressionssteuersequenz gebildet wird (in diesem Fall Lipoprotein), an die das Fremdprotein

(exogene Protein) gebunden ist.

Das geeignet ausgelegte Hybridprotein enthält eine Spaltstelle an der Verbindung zwischen dem endogenen Proteinanteil und dem exogenen Protein. Die Spaltstelle erlaubt die Bildung von reifem exogenem Proteinprodukt durch chemische oder enzymatische Behandlung des Hybridproteinprodukts. ' .--.'..

Obigen Ausführungen zufolge ist bereits bekannt, daß sich die Ipp-Expressionssteuersequenz zur Expression exogener' Proteine eignet. Nun ist. jedoch gefunden worden, daß sich die Ipp-Expressionssteuersequenz mit besonderem Vorteil zur Expression von exogenem Gen verwenden läßt, wenn das Ganze so konstruiert ist, daß ein DNA-Segment vorhanden ist, das eine Sequenz enthält, die in Tandemanordnung den Promotor und die,.. 5 ' -untrans.lati.erte Region einer Lipoproteinexpressionss'teuerseq'uenz und ein Translationsstartkodori enthält, woran sich ohne .Zwischenanordnung eines'Teils oder Gesamten einer Nucleotidsequenz, die für endogenes Protein kodiert, eine Sequenz, die für exogenes Protein kodiert, oder eine Nucleotidsequenz, die für eine EnterokinasespaltstelIe kodiert, anschließt, worauf ohne Unterbrechung eine Sequenz folgt, die für exogenes Protein kodiert. Dies steht im Gegensatz zu einem Hybridprotein, das Lipoprotein oder einen Teil hiervon und exogenes Protein enthält.

Zur Konstruktion der erfindungsgemäßen Klonierungsvektoren sind mehrere Elemente erforderlich. Zwei der benötigten Elemente sind allen brauchbaren Klonierungsvektoren gemeinsam. Das erste dieser Elemente besteht darin, daß der Vektor ein DNA-Segment haben muß, das einen funktioneilen' Ursprung an' Replikation (Replikon) enthält. Plasrnide und Phagen-DMA enthalten von Natur aus Replikone, die eine Replikation in einer' WirtszelIe erleichtern.

Das zweite Element besteht darin, daß der Vektor ein DNA-'

- y -

Segment haben muß, das einer transformierbaren Wirtszelle eine Eigenschaft verleiht, die zur Selektion transformierbarer Zellen von nichttransformierbaren Zellen brauchbar ist. Für solche Selektionszwecke läßt sich irgendeine der zahlreichen Eigenschaften heranziehen. Eine der am häufigsten benutzten Eigenschaften ist die Antibiötikumresistenz, nämlich beispielsweise eine Resistenz gegenüber Tetracyclin oder Ampicillin.

Die obigen beiden Elemente sind in den leicht verfügbaren und anerkannten Klonierungsvektoren im allgemeinen vorhanden. Beispiele geeigneter Klonierungsvektoren sind bakte- r~

''—' rielle Plasmide, wie Plasmide von Escherichia coli unter Einschluß von pBR322, pMB89, CoIEl oder pCRl, Plasmide ' mit einem breiteren Wirtbereich unter Einschluß von RP4, P.hagen-DNAs,. wie.Lambda, und dergleichen. Die meisten, wenn nicht, alle, der oben erwähnten:. Vektoren tragen bereits die Oben beschriebenen zwei Elemente.

Ein drittes Element, das für die erfindungsgemäßen Vektoren spezifisch ist, ist die Lipoproteinexpressionssteuersequehz. Die¹ .Lipop.roteinexpressionssteuersequenz- von· Escherichia coli, die im Plasmid pKENlll vorhanden und in Escherichia coli CC620 gezüchtet worden ist, ist bei f-;_ 25 der ständigen Kulturensammlung des Northern Regional Research Center, Agricultural Research, North Central. Region, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, V.St.A., hinterlegt worden und von.dort.unter der Hinterlegungsnummer NRRL 15Ό11 frei beziehbar. Die Lipo- 30- ,proteinexpressionssteuersequenz läßt sich von pKENlll unter Anwendung anerkannter Restriktionsstellen und ihrer entsprechenden Restriktionsendonucleasen entfernen. Unter Anwendung anerkannter Verfahren sind auch zahlreiche andere Lipoproteinexpressionssteuersequenzen zugänglich. Zu solchen Methoden gehören beispielsweise die durch Synthe- _: . se oder Isolierung erfolgende Herstellung einer Sonde unter Verwendung verfügbarer lpp-Sequenzen, wie pKENlll, und die vorteilhafte Ausnutzung des zwischen Ipp-Sequen-

] zen bestehenden hohen Ausmaßes an Homologie durch Verwendung einer solchen Sonde zur auf Hybridisierung beruhenden Selektion von lpp-Sequenzen von anderen Quellen.

Zur Bildung eines geeigneten Klonierungsvektors durch Insertion der Lipoproteinexpressionssteuersequenz werden ebenfalls übliche Methoden herangezogen. Innerhalb von Klonierungsvektoren gibt es verschiedene Stellen, an denen sich unter Verwendung einer für eine solche Stelle spezifischen Restriktionsendonuclease Schnitte machen lassen. Jede dieser Stelle läßt sich zur Insertion der Lipoproteinexpressionssteuersequenz selektieren. So existieren beispielsweise beim wohlbekannten und dokumentierten Plasmid pBR322 mehrere geeignete Restriktionsstellen, von

]5 denen irgendeine als Insertionsstelle herangezogen werden kann. Eine Pstl-Stelle ist innerhalb des Gens für ß-Lactamase lokalisiert. Andere Stellen außerhalb irgendeiner spezifischen Kodierungsregion sind EcoRI und ^:PvuII. Diese und andere Stellen sind dem Fachmann wohlbekannt. .

Unter Ausnutzung irgendeiner dieser Stellen oder einer anderen Stelle lassen sich' durch Insertion einer Lipoproteinexpressionssteuersequenz oder des wesentlichen Teils hiervon ohne weiteres erfindungsgemäße Vektoren herstellen.

Ein viertes Element, das für die .erfindungsgemäßen Vektoren wiederum spezifisch ist, ist die DNA-Sequenz, die für das exogene Protein kodiert. Das Schlüsselerfordernis in bezug auf die exogene Protein-DNA-Sequenz.. in den erfindungsgemäßen Vektoren ist ihre Stellung. Diese Sequenz

30' muß nach dem 3'-Ende der 5'-untranslatierten Region der Lipoproteinexpressionssteüersequenz und in Verbindung damit über ein Translationsstartk-odon angeordnet sein, dem eine Nucleotidsequenz folgt, die für eine Enterokinasespaltstelle kodiert. Notwendigerweise darf bei den erfindungsgemäßen Vektoren keine der DNA-Sequenz, die für Lipoprotein kodiert, zwischen der 5'-untranslatierten Region und. der Sequenz angeordnet sein, die für exogenes Protein kodiert.

] Ein fünftes und für die erfindungsgemäßen Vektoren ebenfalls spezifisches Element besteht darin, daß das Translationskodon von einer Mucleotidsequenz gefolgt wird, die für eine Enterokinasespaltstelle kodiert, an die ohne Unjr terbrechung eine Sequenz gebunden ist, die für exogenes Protein kodiert. Die Aminosäuresequenz dieser Spaltstelle wird von dem Enzym Enterokinase erkannt und an ihrer endständigen Carboxylgruppe gespalten. Die Nucleotidsequenz, die für eine durch Enterokinase spaltbare Aminosäurese-

IQ quenz kodiert, ist an ihrem 5'-Ende an das Translationsstartkodon und an ihrem 3'-Ende an das 5'-Ende der Nucleotidsequenz gebunden, die für das exogene Protein kodiert, und sie ist so aufgebaut, daß das entstehende Translationsprodukt aus (Methionin)-(Enterokinasespaltstelle)-(exo- genem Protein) durch Behandlung mit Enterokinase unter Bildung von reifem exogenem Protein gespalten werden kann.

Über Enterokinase- (3.4.21.9) wird in J. Biol. Chem. 254, 1677 bis 1683 (1979) berichtet, daß es sich dabei um "ei^{ne von v}i^el^en Hydrolasen handelt, die in der bürstenartigen Grenzmembran des intestinalen Duodenums lokalisiert sind". Isolierung·' und. Reinigung, von' Ehterokiinase' werden in einer Reihe von Publikationen beschrieben,' und hierzu wird beispielsweise hingewiesen auf J. Biol. Chem. 254, ^{1677 bis 1683} (1979), J, Biol. Chem. 246, 5031 bis 5039

(1971) und Biochimica et Biophysica Acta 315,. 147 bis 161 (1973) .

Enterokinase scheint ein Peptid an der Carboxylgruppe eines Lysinrests (Lys) zu spalten, dem eine Vielzahl-an sauren Aminosäuren vorangeht, nämlich Glutaminsäure (Glu)und/ oder Asparaginsäure (Asp). So wird beispielsweise in Anal. Biochem. 106, 199 bis 206 (1980) eine Anzahl an Aminosäuresequenzen beschrieben, die von Enterokinase erkannt werden, und zu diesen Sequenzen gehören beispielsweise Sequenzen wie

Phe-Pro-Leu-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys,

Phe-Pro-Ile-Glu-Glu-Asp-Lys,

Leu-Pro-Leu-Glu-Asp-Asp-Lys,

Ala-Asp-Asp-Lys,

Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, und dergleichen.

Die Nucleotidsequenzen, die für irgendeine der oben angegebenen und auch für andere Aminosäuresequenzen kodieren, können in den erfindungsgemäßen Klonierungsvektoren vorhanden sein. Einziges Erfordernis ist, daß es sich bei der Nucleotidsequenz um eine Sequenz handelt, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, die von Enterokinase erkannt und, falls sie in einem längerkettigen Peptid enthalten ist, an ihrer endständigen Carboxylgruppe gespalten wird.

Zur Konstruktion von Vektoren, die diese Erfordernisse erfüllen, kann mit Vorteil Gebrauch gemacht werden von einer seltenen Xbal-Restriktionsstelle, die in der -5'-untranslatierten Region der Lipöproteinexpressionssteuersequenz von Escherichia coli. vorhanden ist. An der Xbal-Stelle. läßt sich ein Schnitt machen, wodurch ein Teilstück der 5'-untranslatierten Region entfernt wird. Unter Anwendung von Methoden, wie sie zur Synthese von Oligonucleotiden üblich sind", kann man einen Linker herstellen, der das entfernte Teilstück der 5'-untranslatierten Region enthält, an welches eine DNA-Sequenz, die für ein Startkodon kodiert, oder das Startkodon, das von der Enterokinasespaltstelle gefolgt wird, und ein Teilstück oder das- gesamte exogene Protein gebunden sind.

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Die DNA-Sequenz, die für exogenes Protein kodiert, kann entweder synthetisch konstruiert werden, beispielsweise unter Einsatz der bekannten Phosphotriester-Methode oder sonstiger bekannter Methoden, oder diese DNA-Sequenz läßt sich auch durch Anwendung einer bekannten Methodologie als eine Kopie aus isolierter mRNÄ erhalten. Eine solche cDNA-Kopie läßt sich dann an einer Restriktionsstelle an einem Punkt schneiden', der möglichst nahe am Startkodon

liegt. Bei der ersten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Klonierungsvektoren läßt sich synthetisch ein Linker herstellen, der zusammengesetzt ist aus dem durch Spaltung mit Xbal entfernten Lipoproteinfragment der 5'-untranslatierten Region, an das sich das gespaltene Teilstück unter Einschluß des Startkodons .des exogenen Proteins anschließt. Bei der zweiten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Klonierungsvektoren wird synthetisch ein Linker hergestellt, der zusammengesetzt ist aus dem durch Spaltung mit Xbal erhaltenen Lipoproteinfragment der 5'-untranslatierten Region und dem sich daran anschließenden Startkodon, der Enterokinasespaltstelle und dem gespaltenen Teilstück des exogenen.Proteins. Diese Linker, die zu einer Überbrückung des Spalts ausreichen, werden dann in Verbindung mit restlichen verfügbaren Elementen der Lipoproteinexpressionssteuersequenz zur Herstellung eines Vektors- verwendet.

Die erfindungsgemäßen Klonierungsvektoren eignen sich zur Herstellung irgendeines exogenen- Proteins'unter Einschluß von .Säugetier-;; und Humanhormonen, Enzymen und immunogenen Prote'ihen . (oder Zwischenprodukten hierfür). Beispiele, für solche Produkte sind Insulin-A-Kette, Insulin-B-Kette, Proinsulin, Interferon, Wachstumshormon, antigene Proteine für Fuß- und Mundkrankheiten, S"omatostatin, ß-Endorphin und dergleichen. Bevorzugte Klonierungsvektoren sind solche, die sich zur Herstellung von Hümanwachstumshormon oder Rinderwachstumshormon verwenden lassen. Infolge der Gegenwart des Startkodons enthält das Expressionsprodukt der ersten Ausführungsform der Klonierungsvektoren selbstverständlich ein Methionin (Met.) an der endständigen Ami-, nogruppe. Ein Expressionsprodukt der Vektoren der zweiten Ausführungsform enthält Methionin (Startkodon}, eine Enterokinasespaltstelle und exogenes Protein. Reifes exogenes Protein wird gebildet durch an sich bekannte Behandlung des letztgenannten Expressionsprodukts mit Enteroki- '. nase/ wozu Beispiel sweise auf das in J. Biol. Chem.. 254, 1577 bis 1683 ( 1979) beschriebene Verfahren hingewiesen

wird.

Die erfindungsgemäßen Klonierungsvektoren können in einem • breiten Bereich an Wirtsorganismen angewandt werden, beispielsweise in gramnegativen prokaryotischen Organismen wie Escherichia coli, Serratia, Pseudomonas und 'dergleichen, grampositiven prokaryotischen Organismen, wie Bacillus, Streptomyces und dergleichen, sowie eukaryotischen Organismen, wie Saccharomyces und dergleichen. Vorzugsweise ist der Wirtsorganismus ein gramnegativer prokaryotischer Organismus. Von den gramnegativen prokaryotischen Organismen werden Organismen von Escherichia coli besonders bevorzugt, nämlich beispielsweise die Stämme K—12 von Escherichia coli, wie RV308.

Die Klonierungsvektoren werden unter Anwendung bekannter Methoden zur Transformation geeigneter Wirtsorganismen verwendet, indem man solche Organismen unter Einsatz üblicher Fermentationsbedingungen ämplifiziert und''das exogene Proteinprodukt exprimiert.. Aus der dabei erhaltenen Fermentationsbrühe wird das exogene. Proteinprodukt in. üblicher Weise isoliert.

Struktur und Funktion der erfindungsgemäßen Klonierungsvektoren gehen aus den später folgenden Beispielen hervor, die in Verbindung mit der Zeichnung zu lesen und zu verstehen sind. In dieser Zeichnung zeigen:

Fig. 1 bis 4 zusammen eine schematische Darstellung der Herstellung von Zwischenprodukten

. und Ausgangsmaterialien, die sich zur Konstruktion beider Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Klonierungsvektoren verwenden lassen; ' '

Fig. 5 in Verbindung mit den Fig. 1 bis 4 eine

schematische Darstellung einer im späteren Beispiel 1 beschriebenen Methode zur Kon-

] struktion eines Klonierungsvektors, der

zur Produktion von Methionylhumanwachstumshormon verwendet werden kann;

Fig. 6 bis 8 zusammen und in Verbindung mit den Fig.

bis 5 eine schematische Darstellung einer im Beispiel 2 beschriebenen Methode zur Konstruktion eines Klonierungsvektors, der sich zur Produktion von Methionylrin-IQ derwachstumshormon eignet;

Fig. 9 in Verbindung mit.den Fig. 1 bis 5 eine schematische Darstellung einer in Beispiel 3 beschriebenen Methode zur Konstruktion eines Klonierungsvektors-, der eine

Variante des in Beispiel 1 beschriebenen Klpnierungsvektors, darstellt, und der· sich zur Produktion von Methionylhumanwachstumshormon verwenden läßt;

Fig.. 10 in Verbindung mit den Fig. 1 bis 4 eine schematische Darstellung.einer in Beispiel 4 beschriebenen Methode zur Konstruktion einer zweiten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Klonierungsvektoren, die

sich zur Produktion von Humanwachstumshormon verwenden lassen;

Fig. 11 bis 13 zusammen und in Verbindung mit der Fig. und den Fig. 1 bis 4 eine schematische Darstellung einer in Beispiel·5 beschriebenen Methode zur Konstruktion eines Klonierungsvektors der zweiten Ausführungsform zur Produktion von Rinderwachstumshormon.

Ausführungsbeispiele:

' Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen

näher beschrieben.

.Das folgende Herstellungsbeispiel zeigt die Bildung von Zwischenprodukten und Ausgängsmaterialien zur Konstruktion der ersten und zweiten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Plasmide.

Herstellungsbeispiel

.10 Als Ausgangsmaterial wird das etwa- 5,lkb (Kilobasen) Fragment verwendet, welches durch Xbal (5'TCTAGA3'), BamHI (5¹GGATCCS¹) Spaltung des Plasmidvektors pKEN021 (106 in Fig. 3) hergestellt wird. pKEN021 ist ein Derivat von pKENlll (101 in Fig. 1) ( J. Bact. .146 ,. 861 bis 866. ( 1981) und J. Bact. 145, 654 bis 656 (1981)), das in Escherichia coli CC620 hinterlegt, ist (NRRL-Hinterlegungsnummer 15011] Das Plasmid pKENlll hat ein 2,8kb Fragment, welches, das. Lipoproteingen von Escherichia coli enthält. Dieses Fragment .wird in Cell 18, 1109 bis 1117 (1979) beschrieben.

Im pKEN021 ist die 650 bp (Basenpaar)-Sequenz zwischen den seltenen Restriktionsstellen von EcoRI (5'GAATTC3') und Sail (5'GTCGAGS.') von pBR322 durch Sequenzen; ersetzt, die vom Lipoproteingen von Escherichia coli entnommen sind. Die Nucleotidsequenz aller funktioneller-Teile dieses Gens ist bereits bestimmt worden. Die Lipoproteingensequenz (Cell 18, 1109 bis 1117 (1979)) enthält ein 462 bp AIuI (5¹AGCT3')-Fragment vor dem" ersten Kodon (Methionin) des Lipoproteingens. Dieses Fragment enthält den Promotor, die 5'-untranslatierte -Region und die Ribosombindestelle. Innerhalb der Ribosombindestelle 16 bp ist vor dem die:Translation initiierenden Methioninkodon eine seltene Xbal (5'TCTAGA3')-Restriktionsstelle angeordnet. Eine PvuII (5'CAGCTG3')-Restriktionsstelle, die 105 bp vor dem Translationsterminationskodon des Strukturgens

^JJ angeordnet ist, wird durch Zusatz eines synthetischen DNA-Adapterfragments (5'CCGGATCCGG3' von Collaborative Research) in eine BamHI ( 5.'GGATCC3')-Restriktionsstelle um-_: gewandelt. Die Ködierungssequenz für die letzten 35 Amino-

] säuren von Lipoprotein, das Translationsterminationskodon und die der 3'-untranslatierten Region der Messenger-RNA entsprechende Sequenz folgen der BamHI-StelIe. Das Plasmid pKEN021 enthält ferner auch einige 850 bp an fremden Sequenzen, die nichts mit dem Lipoproteingen zu tun haben und nach diesem im Chromosom von Escherichia coli lokalisiert sind. Diese Sequenzen 'sind eine Folge der bei der ursprünglichen Isolierung des Gens angewandten Methoden und Restriktionsenzymstellen.

Die Fig. 1, 2 und 3 zeigen die Konstruktion des Plasmids pKEN0 21 ausgehend von pKENlll, wozu man wie.folgt vorgeht: Man verdaut 50 pg pKENlll (101 in Fig. 1) mit 25 Einheiten Restriktionsenzym Hpall (5'CCGG3') in 300 μΐ eines Puffers aus 20 mMol Tris:HCl,(pH 7,4>,10 mMol MgCl₂ und 6 mMol· ß-Mercäptoethahol über-, eine Zeitdauer von 2 . Stunden bei 37°C. Das Gemisch wird zweimal mit jeweils 300 μΐ eines 50:50-Gemisches aus Phenol und Chloroform extrahiert, und die rückgewonnene wäßrige Schicht wird mit 2,5 Volumina Ethanol gefällt. Das DNA-Pellet wird in 100 μΐ eines Elektrophoresepuffers gelöst und auf einem; 5 %-igan, P.olyacrylamidge-l·: fraktioniert; (falls, nichts':·-anderes angegeben ist, beträgt das Verhältnis von Acrylamid zu Bis in allen Gelen 29 : 1). Das Gel wird mit einer Lösung angefärbt, die 0,5 μg Ethidiumbromid pro ml enthält, und die Banden werden unter·langwelligem· Ultraviolettlicht ' sichtbar gemacht. Eine 950 bp-Bande wird isoliert und vom Gel durch Elektroelution in einen Dialyseschlauch gewonnen. Die nach Extraktion mit Phenol und Chloroform sowie Fällung mit Ethanol gewonnene DNA (etwa 2,5 ^g) wird in 25 μΐ TEN (10 mMol NaCl, 10 mMol Tris:' HCl (pH 7,4) und 1 mMol Natriumethylendinitiilotetraacetat (EDTA) (pH 8,0) gelöst.

2' μ<3 des 950 bp-Hpall-Fragments werden mit Restriktions-' enzym AIuI. (5'AGCT3') in 200 _μ1 eines Puffers aus 50 mMol NaCl, SmMoI Tris:HCl (pH 7,6), 6 mMol"MgCl₂ und 6 mMol ß-Mercaptoethanol bei 37°C über eine Zeitdauer von 2 Stunden

. verdaut. Die DNA wird auf einem 6 %-igen Polyacrylamidgel fraktioniert, wobei man das gebildete 462 bp Aiul-Fragment unter Anwendung des oben beschriebenen Verfahrens gewinnt und reinigt. Das 462 bp Alul-Fragment (etwa 1 μg) wird in 10 μΐ T DNA-Ligasepuffer (66 mMol .Tris:HC1,(pH 7,6),10 mMol MgCl₃, 10 mMol Dithiothreit, 0,4 mMol ATP) mit einem Gehalt von 150 pMol an phosphoryliertem EcoRI-Linker (5¹GGAATTCCS' von Collaborative Research) und 2 Einheiten T DNA-Ligase gelöst. Das nach 16 Stunden langer Inkubation bei 4°C erhaltene Gemisch wird 10 Minuten auf 65⁰C erwärmt, und dann durch Zugabe von EcoRI-Puffer (100 mMol Tris:HCl (pH 7,2), 50 mMol NaCl, 10 mMol MgCl₂, . 6 mMol ß-Mercaptoethanol und 40 Einheiten EcoRI-Enzym auf 100 μΐ verdünnt. Nach 2-stündiger Behandlung bei 37⁰C wird die.Probe unter Anwendung des oben beschriebenen Verfahrens mit. Phenol und Chloroform- extrahiert, und mit Ethanol gefällt. Die DNA löst man in 20 μΐ. T. DNA-Ligasepuffer, der 0,1 Einheiten T₄ DNA-Ligase .und 0,1 μg pBR322 (102 in Fig. 1). enthält, das man vorher mit EcoRI linearisiert und _mit Alkaliphosphatase zur Entfernung von Endphosphaten behandelt hat. Das nach 16 Stunden langer Ligation bei 4°C erhaltene Material verwendet man dann zur Transformation eines geeigneten Stammes von Escherichia coli (hsr , hsm ), wie HBlOl. Die Bakterienzellen werden durch übliche Be-,) 25 handlung mit CaCl₂ zur Transformation leistungsfähig gemacht. Entsprechende Transf.ormanten werden auf Agarplatten ; selektiert, die Λ2 μ$ Tetracyclin pro ml enthalten. Aus mehreren, gegenüber Tetracyclin resistenten Kolonien werden unter Anwendung des in Nucleic Acids Research 7, 1513 bis 1523 (1979) beschriebenen schnellen alkalischen Extraktionsverfahrens Plasmide, isoliert. Ein Plasmid (103 in Fig. 1), das ein 466 bp Xbal,-BamHI-Fragment (mit der gewünschten Orientierung) enthält, wird-. selektiert und als Ausgangsmaterial für die nächste Stufe verwendet.

35

Man verdaut 2 μg dieses Plasmids (103 in Fig. 2) (mit einer Hindlll. '( 5 ¹AAGCTT3 ' )-Restriktionsstelle ) mit 2 Einheiten Hindlll-Enzym in 50 μΐ Hindlll-Puffer (60 mMol NaCl,

10 mMol Tris^HCl (pH 7,4), 10 itiMo.1 MgCl₃ und 6 mMol ß-Mercaptoethanol) bei 37°C über eine Zeitdauer von 1 Stunde. Die nach Extraktion mit Phenol und Chloroform sowie Fällung mit Ethanol erhaltene DNA wird in 200 μΐ eines Puffers aus 300 mMol NaCl, 30 mMol Natriumacetat (pH 4,25), 1 mMol ZnCl₂ und 200 Einheiten Sl-Nuclease (Miles Laboratories), die für einsträngige DNA spezifisch ist, gelöst. Nach einstündiger Behandlung bei 15⁰C wird die Reaktion durch Extraktion mit Phenol und Chloroform sowie Fällung mit Ethanol beendet. Das Plasmid, bei dem nun die einsträngigen und mit Hindlll erzeugten Enden entfernt sind, wird in 10 μΐ T DNA-Ligasepuffer gelöst, der 20 pMol phosphorylierte BamHI-Linker (5'CCGGATCCGG3' von Collaborative Research) und 2 Einheiten T. DNA-Ligase enthält. Nach 16-stündiger Behandlung bei 4⁰C wird das Reaktiönsgemisch zur Inaktivierung;: der Ligase 10 Minuten auf 65°C erwärmt. Im Anschluß daran verdünnt man das Gemi.sch auf 100 μΐ mit einem BamHI-Puffer (150 mMol NaCl, 20 mMol TrisrHCl (pH 8,0), 10 mMol MgCl₃, 6 mMol ß-Mercaptoethanol), der 20 Einheiten- BamHI-Enzym enthält. Nach 2-stündiger Behandlung bei .37⁰C-wird., das Gemisch auf einem 1 %-igen.. Agaros^gei gereinigt. Das Gel wird angefärbt, und-/das größere Fragment (4,5kb) wird durch Elution nach Einfrieren gewonnen und durch Extraktion mit Phenol und Chloro- C^) 25 form sowie Fällung mit Ethanol gereinigt. Das gewonnene Plasmid mit BamHI-kohäsiven Enden wird in 20 μΐ T. DNA-Ligasepuf fer gelöst, der 0,1 Einheiten T. DMA-Ligase enthält. Die nach 16-stündiger Behandlung bei 4°C erhaltene · DNA wird zur Transformation von Escherichia coli HBlOl verwendet. Entsprechende Transformanten-werden bezüglich ihrer Resistenz gegenüber Ampicillin (Ap ) bei 100 μg/ml selektiert und hinsichtlich ihrer Sensitivität gegenüber 10 μg Tetracyclin (Tc ) pro ml ausgelesen. Unter Anwendung des bereits oben erwähnten und in Nucleic Acids Research 7, 1513 bis 1523.(1979) beschriebenen Verfahrens

r s

'werden aus Kolonien, die Ap Tc sind, mehrere ·Plasmide hergestellt.

Diese Plasmide werden hinsichtlich der; Abwesenheit einer Hindlll-Stelle und der Anwesenheit einer einzelnen BamHI-

- 2U- -

] Stelle untersucht. Durch sequentielle Verdauung mit EcoRI und Sail gelangt man zu einem 466 bp-und einem 305 bp-Fragment. Ein Plasmid (104 in Fig. 2) mit diesen Eigenschaften wird selektiert und so modifiziert, daß hierdurch die vor dem Ipp-Promotor liegende EcoRI-Stelle entfernt und in eine Hindlll-Restriktionsstelle umgewandelt wird. .

Man verdaut 2 μg Plasmid (104 in Fig. 2) in 100 μΐ EcoRI-

IQ Puffer mit 0,2 Einheiten EcoRI über eine Zeitdauer von Minuten bei 37°C. Die Umsetzung wird durch 10 Minuten langes Erwärmen auf 65⁰C beendet. Die nach Extraktion mit Phenol und Chloroform sowie Fällung mit Ethanol erhaltene DNA wird in 200 μΐ Sl-Nucleasepuffer gelöst, der 1000 Einheiten Si-Nuclease pro ml enthält. Nach einstündiger Umsetzung bei 12⁰C wird die Reaktion durch Extraktion mit Phenol und Chloroform sowie Fällung mit Ethanol beendet. Die erhaltene DNA wird in 10 μΐ T. DNA-Ligasepuffer, der 2 0 pMol phosphorylierten Hindlll-Linker (S'CCAAGCTTGGS¹ von Collaborative Research) und 2 Einheiten T. DNA-Ligase enthält, resuspendiert. Nach 16-stündiger Behandlung bei 4 ⁰C wird die Ligase durch LO Minuten langes' Erwärmen auf 65°C inaktiviert. Das Reaktionsgemisch wird mit Hindlll-Puffer, der 10 Einheiten Hindlll-Enzym enthält;, auf 150 μΐ verdünnt. Das- nach 2-stündiger Inkubation bei 3 7⁰C erhaltene Gemisch wird auf einem 1 %-igen Agarosegel fraktioniert. Die nach Anfärbung mit Ethidiumbroir.id erhaltene größte Bande (die einem Einzelschnittplasmid entspricht) wird gewonnen und gereinigt. Das Plasmid wird in 20 μΐ T_d-Liga- sepuffer, der 0,2 Einheiten T.-Ligase enthält, 16 Stunden bei 4⁰C irikubiert und zur Transformation von Escherichia col-i KBlOl verwendet. Entsprechende Transformanten werden bezüglich ihrer Resistenz gegenüber Ampicillin selektiert und durch das oben beschriebene schnelle alkalische Ex-

35' traktionsverfahren ausgelesen. Durch Restriktion mit den Enzymen EcöRI (eine Stelle) und Hindlll (eine Stelle) werden entsprechende Plasmidisolate analysiert. Ein Plasmid (105 in Fig. 2) mit.einem EcoRI- und HindiII-Fragment von

500 bp wird selektiert und als Klonierungsvektor zur Addition der 3'-Region des lpp-Gens verwendet.

Man verdaut 2 μg Plasmid (105 in Fig. 3) in 50 μΐ Sails'. Restriktionspuffer (1.50 mMol NaCl, 6 mMol TrisrHCl (pH 7,9), 6 mMol lMgCl^, 6 mMol ß-Mercaptoethanol) mit 2 Einheiten Sail über eine Zeitdauer von 1 Stunde bei 37⁰C. Das Reaktionsgemisch wird mit BamHI-Puffer, der 2 Einheiten BamHI enthält, auf-150 μΐ verdünnt. Nach einstündiger Behandlung bei 37⁰C gibt man 2,5 Einheiten Alkaliphosphatase zu und inkubiert 1 Stunde bei 65°C weiter. Das erhaltene Material wird mit Phenol und Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt und in TEN gelöst, worauf man es als Klonierungsvektor für das lpp 3'-Fragment verwendet.

Zur Bildung dös Fragments; mit der Ipp'3'-Region verdaut man; LO, ^g. pKENlll (101 in Fig, 3 ) in 200; μ! Jpal-Puf f.er (20'mMol KCl, 10 mMol Tris:HCl (pH 7,4), 10 mMol MgCl₃ ^;· und 6 mMol ß-Mercaptoethanol) mit .10 Einheiten Hpal (5'GTTAACS') über eine Zeitdauer von 2 Stunden bei 37⁰C. Die nach Extraktion mit Phenol und Chloroform spwie,Fällung; mit Ethanol erhaltene DNA wird in 10 μ,Ι,· T^_: DNA-Lag'asepuffer gelöst, der 20 pMol phosphorylierten SaXI-Linker (15'GGTCGACCS¹ von Collaborative Research) und zwei Einheiten

T. DNA-Ligase enthält. Nach 16-stündiger Inkubation bei 4°C auf 65⁰C · wird die Ligase durch '10 Minuten langes.Erwärmen inaktiviert. Das Material wird mit Sail-Puffer, der' 10 Einheiten Sail enthält, auf 100 μΐ verdünnt und eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die DNA wird mit PvuII-Puffer (60 MVIoI NaCl, 6 rrMol Tris:HCl (pH 7,5), 6 mMol"MgCl₂, 6mMol ß-Mercaptoethanol), der^;-10 Einheiten PvuII-Restriktionsenzym enthält, auf 300 μΐ verdünnt. Die"nach einstündiger Behandlung bei' 37°C erhaltene DNA wird"auf einem.5 %-igen Polyacrylamidgel fraktioniert. Das dabei in -einer Menge von etwa 0,5 μΐ anfallende bp-Frag- ~ ment wird gereinigt und in TEN gelöst. 0,2 μg dieses- Fragments verdünnt man in 20 μΐ T. DNA-Ligasepuffer, der 20 pMol phosphorylierten BamHI-Linker (5¹CCGGaTCCGGS' von Collaborative Research) und 2 Einheiten T₄ DNA-Ligase enthalt. Nach 16-stündiger Behandlung bei 4'⁰C wird die Liga-

] se durch 10 Minuten langes Erwärmen auf 65°C inaktiviert.

Die erhaltene DNA wird mit- BämHI-Puffer, der- 20 Einheiten BamHI enthält, auf 100 μΐ verdünnt. Die nach 2-stündiger Behandlung bei 37⁰C erhaltene DNA wird auf einem 5 %-igen Polyacrylamidgel fraktioniert, um hierdurch überschüssige Linkermoleküle zu entfernen. Das erhaltene bp-Fragment, das kohäsive Enden von BamHI und Sail enthält, wird gewonnen und gereinigt. Das Fragment wird in 20 μΐ T. DNA-Ligasepuffer gelöst, der 0,2 μg des oben beschrie-

jg benen Klonierungsvektors und 0,2 Einheiten T. DNA-Ligase enthält. Das nach 16-stündiger Inkubation bei 4°C erhaltene Material wird zur Transformation von Escherichia coli HBlOl verwendet. Aus gegenüber Ampicillin resistenten . Transformanten werden Plasmide hergestellt und bezüglich eines Sail- und.BamHI-Fragments von 950 bp analysiert. Das

gewünschte Plasmid (5,2kb) wird als pKEN021 bezeichnet (106 in Fig.. 3) .

Man verdaut 10 μς' pKENO-21. in 200 μΐ Xbal/BamHI-Puffer 2o' (150 mMol.NaCl, 10 mMol TrisrHCl (pH'8), 10 mMol MgCl₃, 6 mMol ß-Me.rcaptoethanol) unter Verwendung von zuerst 10 Einheiten BamHI über eine' Zeitdauer von 1 Stunde bei 37⁰C und dann 10 Einheiten Xbal über eine Zeitdauer von ebenfalls 1 Stunde bei 37⁰C. Die erhaltene. DNA wird dann 25. mit 2,5 Einheiten Alkaliphosphatase 1,5 Stunden bei 65°C behandelt, mit Phenol und Chloroform extrahiert, durch. Fällung mit Ethanol gesammelt und in 50 μΐ TEN (10 mMol TrisrHCl (pH 7,4), 10 mMol NaCl, Γ. mMol EDTA). auf 0,2 μg pro ml gelöst. Diese Präparation (107 in Fig. 3) wird als Plasmidkloniarungsvektor verwendet. '

Das Plasmid ptrpED50chGH800 (108 in Fig. 4), welches in Science 205, 602 bis 607 (1979) beschrieben ist, wird als Quelle für ein DNA-Fragment verwendet, das die Kodierungssequenz für einen Teil des Humanwachstumshormongens enthält. Dieses Fragment ist auch durch Anwendung bekannter Methoden zur Isolierung von mRNA aus Humanhypophysepräparaten zugänglich, die für Humanwachstumshormon kodieren..

Dieses Verfahren wird in Methods in Enzymology 68, 75 bis 90 (1979) beschrieben- Der Humanwachstumshormongenteil des Plasmids ptrpED50chGH800 enthält eine seltene Smal (5'CCCGGG3')-Restriktionsstelle 6 bp nach dem Translationstermxnationskodon des Gens. Diese Stelle wird unter Anwendung des folgenden Verfahrens in eine BamHI-Stelle überführt: Man verdaut 6 μ9 des Plasmids mit 6 Einheiten Smal in 200 μΐ Smal-Restriktionspuffer (15 mMol TrisrHCl (pH 8,0), 6 mMol MgCl₃, 15 mMol KCl und 6 mMol ß-Mercapto-

ethanol über eine Zeitdauer von 1,5 Stunden bei 37⁰C. Nach beendeter Verdauung extrahiert man die DNA mit Phenol und Chloroform und gewinnt sie durch Fällung mit Ethanol. Die ausgefällte DNA wird in 24 μΐ TEN gelöst. 40 pMol phosphoryliertes BamHI-Adapterfragment (Collaborative Re-

]5 search) gibt man zu 0,5 μg (0,2 pMol-Enden) des obigen verdauten'Plasrnids'-. in,. 1 6 μΐ- Ligäseb"uf fer , der 2 Einheiten T _A: DNA-Ligas.e. enthält .·. Man läßt das. Ganze zuerst* 2 -Stunden bei 22°C und dann 16 Stunden bei 4⁰C ligieren. Hierauf wird die T. DNA-Ligase durch 10 Minuten langes Erwärmen auf 65°C inaktiviert. Zur Bildung von BamHI-kohäsiven Enden wird in BamHI-Puf fer ,.der 20 Einheiten ^BamHI-Enzyin.-enthält, bis.;.'-.aü.f^eUnA- Gesamtvolumen -von · 40'. μΐ ' verdünnt,- und dann 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Das Enzym spaltet sowohl die Linkersequenz als auch die BamHI-Stelle, die am Beginn der klonierten cDNA-Sequenz von Humanwachstumshormon lokalisiert ist. Das auf diese Weise erhaltene 691 bp-Fragment mit kohäsiven BamHI-Enden wird auf 6 %-igem Polyacrylamidgel abgetrennt und unter langwelligem Ultraviolettlicht nach Anfärbung in einer Ethidiumbromidlösung bei 1 ag/ml sichtbar gemacht. Die das Fragment enthaltende Genregion wird herausgeschnitten und das DNA-Fragment durch Elektroelution in einen Dialyseschlauch und anschließende Fällung mit Ethanol gewonnen. Die ausgefällte DNA wird durch Zentrifugation gewonnen, in TEN gelost, zur Entfernung von Ethidiumbromid mit Phenol und Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Das gewonnene . DNA-Fragment wird zur- Ligation' (unter Verwendung von- 0,2 Einheiten T DNA-Ligase in 20 μΐ, Puffer unter den oben be-

. 1 schriebenen Bedingungen) mit 0,2 μg pBR3 2 2 (102 in Fig. 4) umgesetzt, welches vorher an seiner seltenen BamHI-Stell-e gespalte-n-,"- und mit Alkaliphosphatase behandelt. Das nach 16-stündiger Inkubation bei 4⁰C erhaltene Material wird zur Trans-formation von Escherichia coli Stamm JA221 (recA~, hrs~hsm , AtrpE5, thr, leu, thi, lacY~) verwendet, und dieser Stamm ist beim NRRL unter der Nr.15014 hinterlegt. Die unter Anwendung des in Cell 3, 315 bis (1974)· beschriebenen Transformationsverfahrens erhaltenen transformierten Kolonien werden auf Agarplatten selektiert, die 100 ^g Ampicillin/ml enthalten. Die Plasmid-DNAs werden aus 16 gegenüber Ampicillin resistenten Kolonien durch das oben beschriebene schnelle alkalische Denaturierungsverfahren isoliert und dann durch Restriktionsenzymverdauung und Gelelektrophorese analysiert. Elf der 16 untersuchten Plasmide, enthalten, ein BamHI-Fragment von etwa 700 bp. Eines dieser-Plasmide pNM575 (109 in Fig. 4) wird zur Amplification und" als Quelle' für" ein DNA-Fragment zur später beschriebenen Konstruktion des Plasmids verwendet.

Die DNA-S.eqüenz von reifem'Humanwachstumshormon enthält eine ,FnuDII ( 5,' CGCG3' ) -Stelle, die 47.bp vom ersten Nucleotid entfernt ,ist.' Für dies-es, Enzym, gibt, es. im pBR322 insgesamt 23 Erkennungsstellen. 25 μg des Plasmids pNM575 .verdaut man in 250 μΐ BamHI-Puffer mit 25 Einheiten BamHI über eine Zeitdauer von 1 Stunde bei 37⁰C. Das 621 bp-Fragment mit kohäsiven BamHI-Enden wird.in der oben beschriebenen Weise aus einem.6 %-igen Polyacrylamidgel isoliert und gereinigt. Nach Reinigung verdaut man ein Drittel des dabei erhaltenen Fragments (was 8 μg Plasmid eritspricht) in 100 μΐ FnuDII-Puffer (6 mMol NaCl₇ 6 mMol TrisrHCl (pH 7,4), 6 mMol ^MgCl₂, 6 mMol ß-Mercaptoethanol) mit 2,5 Einheiten FnuDII über eine Zeitdauer von 1,5 Stun-" den bei 37°C. Durch Elektrophorese.· über einem 6 %-igen Polyacrylamidgel und übliche Gewinnung erhält man ein 538 bp-DNA-Fragment, das die Kodierungssequenz für die letzten.175 Aminosäuren des Gens enthält, worauf sich ein Translationsstoppkodon anschließt.

!Beispiel 1

Plasmid für die Expression von Methionylhumanwachstums- hormon unter Verwendung des Lipoproteinprornotors von Escherichia coli

A. Konstruktion

Man synthetisiert ein doppelsträngiges DNA-Fragment (110 in Fig. 5) unter Anwendung der Phosphotriestermethode durch Verbindung der lpp-Promotorregion mit der Human,-wachstumshorrnon-Kodierungsregion zur direkten Expression von Humanwachstumshormon. Der obere Strang hat 66 Nucleotide, zu denen am 5'-Ende die aus vier Nucleotiden bestehe.nde einzelsträngige Sequenz gehört,, die durch Spaltung mit" Xbal; gebildet·; worden" ist". D er" untere -Sträng^ weist ; 62 Nucleotide auf , die zu- den letzten 62 -Nucleotiden des oberen Strangs komplementär sind. Dem ersten Teilstück des synthetischen DNA-Fragments folgt die natürliche Sequenz des lpp-Gens: von der Xbal-Restriktiönsstelle' in der Ribos/ombindestelle- bis zum Translationsinitiationsmethio,-nlnkodcJffM19 -'bpD _/5 woratif V: sich¹ die~vS,eq^;üen2:l:f är.?"die:':ef^;stßni^: 47 Nucleotide von Humanwachsturnshormon bis zur seltenen FnuDII-Stelle der oben beschriebenen Art anschließt.

. .

Das doppelsträngige DNA-Fragment (110 in Fig. 5) hat folgende Struktur:

Xbal ' .'

5' CTAGAGGGTATTAATAATGTTCCCAACCATTCCCTTATCC- 3' TCCCATAATTATTACAAGGGTTGGTAAGGGAATAGG-

¹ ' " ' T¹ V"! r\ T

AGGCTTTTTGACAACGCTATGCTCCG 3' TCCGAAAAACTGTTGCGATACGAGGC 5'.

Das Fragment wird durch die übliche Phosphotriestermethode unter Bildung der folgenden Segmente hergestellt:

j 1) CTAGAGGGTAT

2) TAATAATGTTCC .

3) CAACCATTCCC

4) TTATCCAGGC

c 5) TTTTTGACAACG

β) CTATGCTCCG

7) CATTÄTTAATACCCT

8) GGTTGGGAA

9) GGATAAGGGAAT ^q 10) GTCAAAAAGCCT

11) CGGAGCATAGCGTT

Unter Verwendung der in obiger Weise gebildeten Segmente werden dann die folgenden drei Duplexe hergestellt.

a) Das Segment 1 (welches in Stellung 5'unphophory-

liert ist) wird an das in Stellung 5' phosphorylierte Segment 2 in Anwesenheit von in Stellung 5' phosphoryliertem Segment 7 unter Verwendung von T.-Ligase und 2Q Bildung des Duplex 1 unter Anwendung des in Methods of Enzymology 68, 109 bis 151 (1979) beschriebenen Verfahrens gebunden. Der Duplex wird durch präparative Gelelektrophorese an 15 %-iges Polyacrylamid isoliert.

b) Das in Stellung 5' phosphorylierte Segment 3 wird an das in Stellung 5' phosphorylierte Segment 4 in Anwesenheit der in Stellung 5' phosphorylierten Segmente und 9 unter Verwendung von T.-Ligase und Bildung des Duplex 2 gebunden, der durch präparative Gelelektropho-

3Q ' rese an.15 %-iges-Polyacrylamid.isoliert wird. Die Reaktion wird, in der oben beschriebenen Weise durchgeführt.

c) Das in Stellung 5' phosphorylierte Segment 5 wird an das in Stellung 5' phcsphorylierte Segment 6 in Anwesenheit des in Stellung 5' phosphorylierten Segments und des in Stellung 5' unphosphorylierten- Segments 11 unter Verwendung von T.-Ligase in der oben beschriebenen Weise gebunden,'wodurch man den Duplex 3 erhS.lt.

Der Duplex wird durch präparative Gelelektrophorese an 15 %-iges Polyacrylamid isoliert.

Die Duplexe .1, 2 und 3 werden dann mit T.-Ligase miteinander verbunden, wodurch das doppelsträngige DNA-Segment (110 in Fig. 5) gebildet wird/ welches man durch präparative Gelelektrophorese an 15 %-igem Polyacrylamid isoliert. Dieses Produkt wird dann an seinen 5'-Enden unter

- 32 — Verwendung von T.-Polynucleotidkinase und /T-P _/ATP unter Einsatz üblicher Verfahren enzymatisch phosphoryliert.

Zur Konstruktion des Expressionsplasmids verknüpft man enzymatisch 0,1 pMol (0,4 μg) Plasmidvektor (107 in Fig. 5), 3,2 pMol synthetisches DNA-Fragment (110 in Fig. 5) und 0,24 pMol (0,08>g) 538 bp-Fragment (109 in Fig. 5, siehe-rHeirsteiiung); in 14-^l-VLigatiphspüf f er unter -Vefwen- '· dung, von 2 Einheiten T.-DNA-Ligase. Das nach Ιβ-stündig.er Inkubation bei 4°C erhaltene Gemisch wird in der oben beschriebenen Weise zur Transformation von Escherichia coli JA221 verwendet. Transformierte Kolonien werden auf Agarplatten, die 10 0 ugAmpici11in/ml enthalten, selektiert. Vohi10 Kolonien; werden unter. Anwendung des oben beschriebenen schnellen alkalischen Extraktionsverfahrens Plasmide ausgelesen. Nach Verdauung durch die Restriktionsenzy- jme Xbal und BamHI und anschließender Elektrophorese durch Acrylamidgel wird ein Plasmid gefunden, das das erwartete 604 bp-Fragment enthält. Dieses Plasmid wird amplifiziert, worauf man die DNA-Sequenz von der Xbal-Stelle bis zur FnuDII-Stelle nach dem in Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 560 bis 564 (1977) beschriebenen Verfahren bestimmt, wodurch ' sich ergibt ,· daß diese Sequenz richtig ist. Das Plasmid wird im folgenden als pNM64 5 (111 in Fig. 5) bezeichnet .

β. Expression von Humanwachstumshormon

Eine Initialexpression von Humanwachstumshormon durch das . Plasmid pNM645 in Escherichia coli JA221 wird durch Modi-

. \ fikationen des Festphasen-Radioimmunversuchsdetektiert, wie er beispielsweise beschrieben ist in Proc. Natl. Acad. Sei USA 75, 2746 bis 2749 (1978), ICN-UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology 1.4, 57 bis 68 (1979) und Cell 13, 681 bis 689 (1978) .

Durch SDS-Polyacrylamidgel-Analyse des gesamten bakteriellen Zellproteins nach dem in Nature 227, 680 bis 685 (1970) beschriebenen Verfahren erhält man eine überwiegende Proteinbande von etwa 20 000 Dalton. Diese Bande dürfte wenigstens 10 % des ,Gesamtproteins ausmachen und ist in Präparationen von Escherichia coli JA221 nicht vorhanden, die pKEN021 enthalten. Durch Messung der quantitativen Expression nach dem üblichen Radioimmunversuch,wie er in Clin. Chem. 20, 389 bis 391 (1974) beschrieben wird, ergibt sich eine Menge von. wenigstens 2 000 000 Molekülen pro Zelle. Das Methionylhumanwachstumshormon wird aus 500 g Zellen von Escherichia coli durch Extraktion mit" 8 Mol Harnstoff und 1 %-igem Triton XlOQ teilgereinigt.

Die Bruchstücke werden durch Zentrifugation entfernt und die das .lösliche Wachstumshormon enthaltende überstehende Flüssigkeit wird auf einer Whatman DE52-Säule-fraktioniert. Die durch einen Radioimmunversuch(RIA) bestimmten Peakfraktionen werden zusammengefaßt und einer isoelektrisehen Fällung unterzogen. Das dabei erhaltene Material wird auf einer Whatman SE53-Säule weiter gereinigt. Die Peakfraktionen werden durch RIA bestimmt und das Material wird durch isoelektrische Fällung oder Ultrafiltration konzentriert

.

Die biologische,Wirksamkeit des gewonnenen Methionylhumanwachstumshormons wird durch Messung der Breite des proximalen Epiphysenknorpels bei hypophysektomisierten weiblichen Ratten nach der in Endocrinology 45, 455 bis 463 (1948) beschriebenen Methode bestimmt. Die dabei ermittelte Wirksamkeit stimmt überein mit der Wirksamkeit von tatsächlichem Humanwachstumshörmon.

Beispiel· 2

Plasmid zur Expression von Methionylrinderwachstumshormon unter Verwendung des Lipoproteinpromotors von Escherichia coli ..

Das Plasmid pNM645 (111 in Fig. 6), nämlich das Expressionsplasmid für Methionylhumanwachstumshormon, wird als Ausgangsmaterial zur Konstruktion eines Plasmids verwendet, das Methionylrinderwachstumshormon exprimiert.

Das in J. Biol. Chem. 255, 7521 bis 7524 (1980) beschriebene Plasmid pBP348 (112 in Fig. 6) wird als Quelle für zwei DNA-Fragmente verwendet, die die Kodierungssequenz für einen Teil des Rinderwachstumshormons enthalten. Das Plasmid enthält eine; 831- bp-Sequenz , die für Rinderwachstumshormon kodiert, die,in die.Pstl (5'CTGCAGB')-Restriktionsstelle von pBR322 kloniert ist. Nach einem anderen Verfahren als dem oben beschriebenen läßt .sich die Sequenz. für Rinderwachstumshormon aus Messenger-RNA erhalten, die aus .Rinderhypophysen ,unter Anwendung.. der in Methods!- of,, Enzymology 6 8 ,. 75 bis 90 (197 9-) beschriebenen Verfahren isoliert worden ist.

Die Kodierungssequenzen für Humanwachstumshorinon und Rinderwachstumshormon sind sehr ähnlich und zeigen zahlreiche Homologien. Besonders brauchbar zur Konstruktion des Expressionsplasmids für Rinderwachstumshormon sind die Fragmente, die durch Verdauung mit dem Restriktionsenzym PvuII (5'CAGCTGS') gebildet werden. Die hierdurch erzeugten Fragmente haben Größen von 497 bp bei: Humanwachstumshormon und von 494 bp bei Rinderwachstumshormon. Die entsprechenden Restriktionsstellen treten bei beiden Sequenzen in den gleichen Kodierungsrahmen auf.

Man verdaut 10 μg pNM645 (111 in Fig. 6), das pro Molekül drei PvuIT-SteTlen enthält, mit einer Einheit PvuII in 200 μΐ PvuII-Restriktionspuffer (60 mMol NaCl, 6 mMol

Tris:HCl (pH 7,5), 6 mMol MgCl₂, 6 mMol ß-Mercaptoethanol) über eine Zeitdauer von 10 Minuten bei 37⁰C. Die Reaktion wird durch 10 Minuten langes Erwärmen.auf 65⁰C beendet und die erhaltene DNA mit Alkaliphosphatase behandelt. Dieses beschränkte Verdauungsverfahren führt zur Abspaltung von der Hälfte bis zu zwei Dritteln der vorhandenen PvuII-Stellen. Die Fragmente werden auf einem 1 %-igen Agarosegel aufgetrennt, und das DNA-Fragment (113 in Fig. 6), das in seiner Größe dem linearen Plasmid entspricht, bei welchem das 497 bp-PvuII-Fragment fehlt (das etwas schneller läuft als das Einzelschnittplasmid) wird herausgeschnitten, gereinigt und als Vektor zur Konstruktion des Zwischenplasmids pNM685 (114 in Fig. 6) verwendet.

Zur Herstellung-eines 494 bp-PvuII-Fragments geht man von pBP348 aus. Hierzu verdaut man 10 ^g dieses Plasmids in 200 μΐ PvuII-Puffer mit 10 Einheiten PvuII über eine Zeitdauer von einer Stunde bei 37⁰C. Die Fragmente werden auf einem 6 %-igen Polyacrylamidgel aufgetrennt, und das 494 bp-Fragment (112 in Fig. 6) wird unter Anwendung der oben beschriebenen Methoden visualisiert und gereinigt.

Zur Konstruktion des Zwischenplasmids pNM685 (.114 in Fig. 6) ligiert man 0,2 ,ug Vektor mit 0/05 μg 494 bp-Fragment in 20 μΐ T.DNA-Ligasepuffer, der 2 Einheiten T .-DNA-Ligase enthält/ über eine Zeitdauer von 16 Stunden bei 4°C. Nach erfolgter Transformation und Selektion.von Transformanten bezüglich ihrer Resistenz gegenüber Ampicillin werden die unter Anwendung des oben erwähnten schnellen alkalischen Extraktionsverfahrens hergestellten Plasmide hinsichtlich der Anwesenheit des 494 bp-PvuII-Fragments analysiert. Die geeignete Orientierung des Fragments wird durch sequentielle Verdauung mit den Enzymen Xbal und Smal bestimmt. Das 494 bp-PvuII-Fragment der Rinderwachstumshormonsequenz hat eine seltene asymmetrische Smal-Restriktionsstelle. Das Stammplasmid pNM645 enthält keine Smal-Ste11en. Ein. Plasmid mit einem 494 bp-PvuI'I-Fragment und einem 416 bp-Xbal, Smal-Fragment wird als das gewünschte Zwischenpro-

Jl

dukt selektiert und bei weiteren Konstruktionen verwendet.

Das Plasmid p'NM6 85 (114 in Fig. 7) wird unter Einsatz der folgenden beiden Verfahren in ein Rinderwachsturashormonexpressionsplasmid überführt: (1) Die Kodierungssequenz der ersten 22 Aminosäuren von Humanwachstumshormon wird entfernt und durch die Kodierungssequenz für die ersten 2 3 Aminosäuren von Rinderwachstumshormon ersetzt und (2) eine kurze Sequenz zwischen der zweiten PvuII-StelIe in der 'Kodierungssequenz und dem Stoppkodon (welches eine Humanwachstumshormonsequenz ist) wird durch ein synthetisches Fragment ersetzt, um so das Kodon für Alanin wieder herzustellen, nämlich die 190. Aminosäure von Rinderwachstumshormon. -

Man verdaut 10 ^g pNM685 mit einer Einheit PvuII in ',. 200 μ-I PvuII-Puffer über eine Zeitdauer von 5 Minuten, bei 37⁰C. Die Reaktion wird durch 10 Minuten langes Erwärmen auf 65 °C beendet. Das Fragmentgemisch wird auf ein 1 %-iges Agarosegel gesprüht, und das lineare Plasmid, welches lediglich einen einzelnen PvuII-Schnitt. pro. _;MOlekül enthält, wird gewonnen und gereinigt. Das.»gewonnene^ Material' (etwa 3 μg) wird vollständig mit 5 Einheiten Xbal verdaut und mit Alkaliphosphatase behandelt. Die Fragmente werden auf 1 %-iges Agarosegel gesprüht-, und das größte Fragment (bei welchem das 8 5 bp-Fragment zwischen ' Xbal und der ersten PvuII-Stelle im Human- und· Rinderwachstumshormon fehlt) wird gewonnen und als Klonierungsvektor' (115 in Fig. 7) verwendet.

Die'DNA-Sequenz für die ersten 23 Aminosäuren (69 bp) von Rinderwachstumshormon bis zur ersten PvuII-Stelle enthält zwei Restriktionsstellen für das Enzym H'pall. (5'CCGG3'). Die erste Stelle liegt bei 23 bp vom ersten Nucleotid der Kodierungssequenz. Ein 42 bp-Fragment (116 in Fig. 7), das der 19 bp-Sequenz von der-.Xbal-Steile in der ^: lpp-RibosömbindestelIe bis zum ATG-Initiationskodon entspricht, welches von der Sequenz für die ersten 2 3 bp von Rinder-

' wachstumshormon gefolgt wird, wird unter Anwendung der Phosphotriestermethode synthetisiert.

Dieses Fragment hat folgende Struktur: ' 5

Xbal Hpall

5 ' 3 '

CTAGAGGGTATTAATAATGGCTTTTCCGGCTATGTCTCTGTC

3' TCCCATAATTATTACCGAAAAGGCCGATACAGAGACAGGC 5

Zur Bildung des 42.bp-Fragments werden folgende sechs Segmente hergestellt:

1) CTAGAGGGTAT

2) TAATAATGGCTTTTC

3) CGGCTATGTCTCTGTC .

4) CATTATTAATACCCT

5) TAGCCGGAAAAGC

6) CGGACAGAGACA

Unter Einsatz der in obiger Weise.hergestellten Segmente ligiert man das in Stellung- 5 ' ' phosphorylierte Segment 2, das in Stellung- 5 ' phosphorylierte- Segment. 3, das in- Stellung 5' phosphorylierte Segment 5 und das in Stellung 5' unphosphorylierte Segment 6 unter Verwendung von T^-Ligase

zu einem Duplex, der durch Elektrophorese mit 50 %-igem Polyacrylamidgel gereinigt wird. An diesen Duplex wird in Stellung.5' unphosphoryliertes Segment 1' und in Stel- ] lung 5' phosphoryliertes Segment- 4 in Anwesenheit von. T -Ligase addiert. Der, erhaltene 42 bp-DNA-Duplex, (116

in Fig. 7) wird durch Elektrophorese mit 15 %-igem Polyacrylamidgel isoliert. Der Duplex wird.anschließend unter Anwendung herkömmlicher Verfahren an seinen 5'-Enden un-

' -3 2-

ter Verwendung von T^-Polynucleoti.dkinase und /_f~2 _/ATP

enzymatisch phosphoryliert

35

Aus dem ursprünglichen Plasmid pBP348 erhält man das DNA-Fragment von 46 bp, das von der oben beschriebenen Hpall--Stelle bis zur PvuII-Stelle läuft. 100 ug dieses Plasmids

- JJ - .

verdaut man in 400 μΐ PvuII-Püffer mit 50 Einheiten PvuII über eine Zeitdauer von-2 Stunden bei 37°C. Die nach Extraktion mit Phenol und Fällung mit"Ethanol erhaltene DNA wird in 400 μΐ Pstl (5'CTGCAG3')-Puffer (50 mMol NaCl, 6 mMol Tris:HCl (pH 7,4), 6 mMol MgCl₃, 6 mMol ß-Mercaptoethanolj mit 50 Einheiten Pstl über eine Zeitdauer von 2 Stunden bei 37⁰C gelöst. Die DNA-Fragmente werden auf 6 %-iges Polyacrylamidgel (30 cm lang) aufgegeben, wobei •man das 135 pb-Fragment, das die gewünschte 46.bp-Sequenz

]0 enthält, durch übliche Verfahren gewinnt und reinigt. Ein Drittel der gewonnenen DNA (entsprechend einer Menge von 33'μ^ Plasmid) unterzieht man einer begrenzten Verdauung mit Hpall-Restriktionsenzym. Die DNA wird in 100 μΐ Hpall-Puffer (.20 mMol Tris:HCl (pH 7,4), 7 mMol MgCl₃₇ 6 mMol ß-Mercaptoethanol) mit einer Einheit Hpall über eine Zeitdauer von 40 Minuten bei 37°C verdaut. Die Reaktion,wird durch 10 Minuten lan:_:ge& ,Erwärmen ..auf _:65^O,C_: beendet. ..Die-; DNA-Fragmente werden auf ein 5 %-iges Acrylamidgel gegeben (das Verhältnis von Acrylamid zu Bis beträgt 19 : 1).

20 1 Vg des mit SauIIIA-Restriktionsenzym verdauten pBR322

\ läßt man in einer getrennten Sonde laufen,. Dieses, Fragmentg'erhis,ch,, enthälvt.. eini 4'6-_: bp-Fragment·,.. welches-, ais Größenmarker verwendet wird. Das durch Teilverdauung des 135 bp-Fragments (112 in Fig. 7) mit Hpall erhaltene 46 bp-Fragment wird' durch übliche Verfahren gereinigt.

Man vereinigt 0,2 μg Plasmidvektor (115 in Fig. 7), der Xbal- und PvuII-Enden aufweist, mit 1,6 pMol synthetischem 4 2 bp-Fragment (116 in Fig. 7).und 0,5 bis 1 pMol 46 bp-Fragment (112 in Fig.. 7) in 10 μΐ Ligationsp.uffer mit 2 Einheiten T -DNA-Ligase und ligiert das 'Ganze über eine Zeitdauer von 16-Stunden bei 4⁰C. Unter Verwendung dieses Gemisches transformiert man dann Escherichia coli JA221 und stellt Plasmide aus Kolonien her, die bezüglich einer Resistenz gegenüber Ampicillin selektiert werden. Die Plasmide' werden hinsichtlich der Anwesenheit eines 494 bp-PvuII-Fragments und"eines-88 bp Xbal, PvuII-Fragments ausgewählt. Von 36 analysierten Fragmenten haben 18 diese

Fragmente. Zwei dieser Plasmide werden von der Xbal-Stelle bis zur PvuII-Stelle sequenziert und in einem Radioimmunversuch bezüglich Rinderwachstumshormon untersucht. Ein Plasmid reagiert im Radioimmunversuch positiv und hat die genaue Sequenz. Dieses Plasmid wird als pNM797 (117 in Fig. 7) bezeichnet. Die quantitative Expression wird durch übliche Radioimmun-Verfahren für.Ririderwachstumshormon gemessen, wobei sich ein Wert von wenigstens 10 Mole-, külen pro Zelle ergibt.

TO ....'

Das PlasmidipNM7 9 7 (117 in Fig. 8) erfordert eine Aminosäurekodonveränderung für eine vollständige Umwandlung in Rinderwachstumshormon. Dies wird erreicht durch Entfernung des 28 bp PvuII- bis BamHI-Fragments von pNM797 und Ersatz dieses Fragments durch ein synthetisches doppelsträngiges Fragment (13 bp oberer Strang, 17 bp unterer Strang), das die folgende Sequenz hat und bei. 118 in Fig. 8 angegeben ist:

' ⁵ CTGTGCCTTCTAG³ ·

,GACACGGAAGATCCTAG ,

Man verdaut 10 \xq pNM797 mit einer Einheit PvuII in 200 μΐ PvuII-Puffer über eine Zeitdauer von 5 Minuten bei 37°C.

Das Enzym wird zur Inaktivierung 10 Minuten auf 65⁰C erwärmt. Die Probe wird durch Zugabe von BamHI-Puffer auf 300 μΐ verdünnt, und mit 10 Einheiten BamHI über eine Zeitdauer von 1 Stunde bei 37⁰C vollständig verdaut. Sodann gibt man 5 Einheiten Alkaliphosphatase zu und inkubiert das Ganze eine Stunde bei 6 5⁰C, Die DNA-Fragmente werden auf einem 1 %-igen Agarosegel aufgetrennt, und ein DNA-Fragment (119 in Fig. 8) mit der Größe eines Einzelschnittplasmids wird gereinigt, 0,2^g dieses Fragments ligiert man dann mit 5 pMol an synthetischem Fragment unter Verwendung von 2 Einheiten-T -Ligase in 20 μΐ Ligasep.uffer über Nacht bei 4 ⁰C. Nach erfolgter Transformation und Durchführung des oben beschriebenen' schnellen alkalischen Extraktionsverfahrens werden mehrere Plasmide selek-

tiert, die die geeignete Größe an PvuII-Fragment (494 bp) und an Xbal, BamHI-Fragment (504 bp) enthalten. Die Sequenz wenigstens eines dieser beiden Fragmente wird ausgehend von der BamHI-Stelle hin zur seltenen Smal-Stelle bestimmt, wobei eine der gewünschten Sequenzen (120 in. Fig. 8) selektiert wird.

Beispiel ·3

Variation des Plasmids von Beispiel 1

Eine gegenüber Tetracyclin resistente Variation von pNM645 (111 in Fig. 9) wird konstruiert durch Ersatz der lpp 3'-Sequenz zwischen der BamHI-Restriktionsstelle und der Sall-Restriktionsstelle durch ein von pBR322 (102 in Fig. 9) abgeleitetes DNA-Fragment.. Die Tetracyclinresi-- stenz im pBR322 stammt vom Produkt eines-,Gens-, dessen,: Promotor durch Hindlll ( 5 ' AAGCTT.3 ' ) gespalten wird . Die · Kodierungsregion für das Gen erstreckt sich durch die BamHI-' und Sall-Restriktionsstellen des Plasmids und:beginnt in deren Nähe . De.r Tetracyclinpromotor y/ird,durch Verdauung der _: Se'quetiz:.'mit-, HdndI.II-,und anschließende, Behandlung-mit Si-Nuclease unter Entfernung der einzelsträngigen Enden zerstört. Man verdaut 5 μg pBR322 in 200 μΐ Hindlll-Puffer (60 mMol NaCl, 20 mMol Tris:HCl (pH 7., 4), 10 mMol MgCl₂, 6 mMol ß-Mercaptoethanol) mit 10 Einheiten Hindlll über eine Zeitdauer von 1 Stunde bei 37⁰C, worauf man. die DNA mit Phenol und Chloroform extrahiert, mit Ethanol fällt und in 300 μΐ Sl-Puffer (300 mMol NaCl, 25 mMol·

30' Natriumacetat (pH 4,25), 1 mMol ZnCl~) resuspendiert. Man gibt Sl-Nuclease in einer Menge von 1000 Einheiten/ml zu und inkubiert das-Ganze 1 Stunde bei 15°C. Die nach Extraktion mit Phenol und Chloroform sowie Fällung mit Ethanol erhaltene DNA wird in 200 μΐ Sall-Re.striktionspuffer (150 mMol NaCl, 6 mMol Tris:HCl (pH ' 7,9), 6 mMol ^: MgCl-, 6 mMol ß-Mercaptoethanol.). suspendiert und mit 5 Einheiten' Sail über eine Zeitdauer von 1'Stunde bei 37°C verdaut. Das gebildete 617 bp-Fragment wird durch Elektro-

. ι phorese über ein 6 %-iges Polyacrylamidgel isoliert. Das Fragment wird in der oben bereits beschriebenen Weise gewonnen und gereinigt. Man verdaut 5 μg pNM645 mit 5 Einheiten BamHI über eine Zeitdauer von 1 Stunde bei 37°C. Die nach Extraktion mit Phenol und Chloroform sowie Fällung mit Ethanol erhaltene DNA wird in TEN gelöst. Sodann überführt man 2 ^g pNM645 mit BamHI-kohäsiven Enden in eine stumpfendige DNA durch Einfüllung von einer Einheit des größeren Fragments von Escherichia coli DNA-PoIy- merase I in 20 μΐ DNA-Polymerase I-Puffer (70 mMol Tris: HCl (pH 7,6), 10 mMol MgCl₃, 10 mMol ß-Mercaptoethanol, 0,5 mMol von jeweils dATP, dCTP, dGTP, TTP) über eine Zeitdauer von 1 Stunde bei 15°C. Das Enzym wird 10 Minuten bei 65⁰C denaturiert, worauf man die DNA durch Zugabe von Säll-Puffer und 3 Einheiten Sall-Restriktionsenzym über eine Zeitdauer von 1 Stunde bei 37°C spaltet. Die DNA wird auf einem 1 %-igen Agarosegel aufgetrennt, und das größere Plasmidfragment wird vom Gel nach-Einfrieren eluiert. Sodann entfernt man das zum. Anfärben verwendete Ethidiumbromid und die-Agarosefragmente durch Extraktion mit Phenol und Chloroform sowie Fällung mit Ethanol. Das erhaltene- Plasmid wird- in- 20 μΐ TEN gelös't. 0 , 2 μg des-Plasmidvektors (0,05 pMo.l) ligiert man dann- unter Anwendung der oben beschriebenen Bedingungen mit 0,2 ^g 617 bp-Fragment (0,5 pMol). Transformierte Kolonien von Escherichia coli JA2.21 werden auf Agarplatten selektiert, die 100 μ$ Ampicillin/ml und 15 μ9.Tetracyclin/ml enthalten. Die isolierten-Plasmide (welche als.. pNM736 bezeichnet werden und in Fig. 9 bei -1-21 angegeben sind) enthalten

• ^ aufgrund' einer Restriktionsenzymanalyse die gewünschte Sequenz. Sie zeigen eine gleich'hohe Expression an Methionylhumanwachstumshormon wie das Plasmid pNM645.

B e i s ρ i e 1 4 ^: -

. ' . - . ·'. ...

Plasmid zur Expression von M'et-Phe-Pro-Leu-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Humanwachstumshormon und seine' Verwendung als Substrat zur selektiven Spaltung durch 'Enterokinase

. - 37 (3.4.21.9) unter Bildung von reifem Humanwachstumshormon

Zur Synthese eines doppelsträngigen DNA-Fragments (122 in Fig. 10) nach der Phosphotriestermethode verknüpft man die lpp-Promotorregion mit der Humanwachstumshormon-Kodierungsregion, der ein Startkodon und eine Kodierungsregion für ein kurzes Peptid vorangeht, das eine von Enterokinase erkennbare und spaltbare Sequenz definiert. Der obere Strang hat 90 Nucleotide, zu denen die am 5'-Ende befindliche und aus vier Nucleotiden bestehende einzelsträngige Sequenz gehört, die durch Spaltung mit Xbal gebildet wird. Der untere Strang hat 86 Nucleotide, die zu den letzten 86 Nucleotiden des oberen Strangs komplementär sind. Dem ersten Teil des synthetischen DNA^Fragments folgt die natürliche Sequenz des Ipp-Gehs; von der Xbal-,Restriktionsstelle_; in der .Ribosombindesteile bis_: zum.. Translationsinitiationsmathioninkodon (19 bp), und daran schließen sich die Sequenz für die Enterokinasespaltstel-Ie und die ersten 47 Nucleotide von Humanwachstumshormon bis, zur seltenen FnuDII-Stelle an-, wie dies, oben be- schrieben, worden,ist-

Das doppelsträngige DNA-Fragment (122 in Fig. 10) hat folgende Struktur:

Xbal

5' CTAGAGGGTATTAATAATGTTCCCATTGGATGATGATGATAAGTTCCCAa-TCCCATAATTATTACAAGGGTAACCTACTACTACTATTCAAGGGTt-CCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATGCTCCG 3' ^FrmDI1 . GGTAAGGGAATAGGTCCGAAAAACTGTTGCGATACGAGGC 5'

Das Fragment wird nach der bekannten Phosphotriestermethode unter Bildung folgender Segmente hergestellt:

1) GTAGAGGGTAT .;..'. '

2) TAATAATGTTCC ^: . '.' '

3) CATTGGATGAT . 4) GATGATAAGTTCC

5) CAACCATTCCC

6) TTATCCAGGC

7) TTTTTGACAACG .8) CTATGCTCCG

9) CATTATTAATACCCT

10)'ATGGGAA

11) CTTATCATCATCCA

12) GGTTGGGAA

13) GGATAAGGGAAT ]0 14) 'GTCAAAAAGCCT

15) CGGAGCATAGCGTT

Unter Verwendung der in obiger Weise hergestellten Segmente führt man die durch T.-Ligase katalysierten Verknüpfungsreaktionen stufenweise wie folgt durch:

a) Das in Stellung 5'-unphosphorylierte Segment 1 verknüpft man mit dem in Stellung 5' phosphorylierten Segment 2 in Gegenwart des in Stellung 5' phosphorylierten Segments 9 unter-Verwendung von T.-Ligase zum DNA-Duplex- 1 (Methods in.Enzymology 6 8,' 109. bis 151 (1.9.79)).. Der, Duplex wird, durch präparative. Gelelektrophorese auf 15 %-igem Polyacrylamid isoliert.

b) Das in Stellung 5' phosphorylierte Segment 3 verknüpft man mit dem in Stellung 5' phosphorylierten Segment 4 in Gegenwart des in Stellung 5' phosphorylierten Segments 11 unter Verwendung von T.-Ligase zum DNA-Duplex 2, den man durch Gelelektrophorese· über 15 %-igem PoIyacrylamid reinigt.

c) Das in Stellung 5' phosphorylierte- Segment 5 verknüpft man mit dem in Stellung 5' phosphorylierten Segment 6 in Gegenwart der in Stellung 5' phosphorylierten S.egmente ,12 und 13 unter Verwendung von T^-Ligase zum DNA-Duplex 3, den man durch Elektrophorese über 15 %-igem Polyacrylamidgel reinigt. .

] d) Das in Stellung 5' phosphorylierte Segment 7 verknüpft man mit dem in Stellung 5' phosphorylierten Segment 8 in Gegenwart des in Stellung 5' phosphorylierten Segments 14 und des in Stellung 5' unphosphorylierten Segments 15 unter Verwendung von T -Ligase zum DNA-Duplex 4, den man durch Elektrophorese über 15 %-igem Polyacrylamidgel reinigt.

e) Die DNA-Duplexe 2, 3 und 4 verknüpft man dann unter Verwendung von T.-Ligase miteinander zum DNA-Duplex 5, den man durch Elektrophorese mit 15 %-igem Polyacrylamidgel reinigt.

f) An den DNA-Duplex 1 addiert man dann das in Stellung 5' phosphorylierte Segment 10 und den DNA-Duplex 5 in Gegenwart von T _ä -Ligase.und reinigt.den; dabei erhaltenen DNA-Duplex (110 in Fig. 10) durch Elektrophorese mit 10 %-igem Polyacrylamidgel. Dieser DNA-Duplex wird anschließend unter Anwendung bekannter Verfahren und Ein-

— 3 2-

satz von. T . -Polynucleotidkinaseund /Γ-Ρ-. _/ATP enzymatisch phösphoryliert.^:

Zur Konstruktion des Expressxonsplasmids verknüpft man enzymatisch 0,1 pMol (0,4 ^g) Plasmidvektor (107 in Fig. 5), 0,025 pMol synthetisches DNA-Fragment (110' in- Fig., 5) und 0,3 pMol (0,08 μς) 538 bp-Fragment (109 in Fig. 10, siehe Herstellung) in 24 μΐ Ligationspuffer unter.Verwendung von 1,5 Einheiten' T.-DNA-Ligase. Das nach Ιβ-stündiger Inkubation bei 4°C erhaltene Gemisch verwendet man dann in der oben beschriebenen Weise zur Transformation von Escherichiacoli JA221. Entsprechende transformierte Kolonien werden auf Agarplatten selektiert, die 100 ^g Ampicillin/ ml enthalten. Aus 19 Kolonien werden unter Anwendung- des oben beschriebenen schnellen alkalischen Extraktionsverfahrens Plasmide ausgelesen. Nach Verdauung durch die Restriktionsenzyme Xbal und BamHT und -anschließender. Elektrophorese mit- Acrylamidgel erhält man 12 Plasmide, die das erwartete 628 bp-Fragment enthalten.

] Acht der positiven Plasmide verdaut man sequentiell mit Xbal und PvuII, wobei sieben dieser Plasmide ein 109 bp-Fragment ergeben. Die Sequenz eines Plasmids wird unter Anwendung des in Proc. Natl. Sei. USA 74, 560 bis 564 (1977) beschriebenen Verfahrens bestimmt und dabei als richtig gefunden. Das Plasmid-wird als pNM702.(123 in Fig. 10) bezeichnet. Eine Expression von Humanwachstumshormon wird nach dein-in. Clin. Chem. 20, 389 bis 391 (1974) beschriebenen üblichen Radioiminunversuch· detektiert. Die quantitative Expression beträgt einer Bestimmung zufolge wenigstens 2 Millionen Moleküle pro Zelle.

Man reinigt Met-Phe-Pro-Leu (Asp)₄ Lys-Humanwachstumshor-. mon teilweise aus 500 g Zellen von Escherichia co.li durch Extraktion.mit 8 Mol Harnstoff und 1 % Triton XlOO. Die Bruchstücke werden durch Zentrifugation entfernt, und die das lösliche- Hümanwachstuinshormon enthaltende überstehende Flüssigkeit wird auf einer Whatman DE52-Säule fraktioniert. Die ·.: durch den._; Radioimmunversu-ch: . ' (RIA), .bestimmten

20·... Peakf raktionen werden.; zusammengefaßt und einer isoelektris'cHen Fällung unterzogen. Dieses Material wird dann auf einer Whatman SE53-Säule weiter gereinigt. Die Peakfraktionen werden durch RIA bestimmt und das Material wird durch 'isoelektrische Fällung oder Ultrafiltration konzentriert.

'. '

Das teilweise gereinigte Material unterzieht man einer Spaltung, mit Enterokinase. Rohe Schweineintestinalentero- kinase (Miles Laboratories) wird nach dem' in Biochemistry 16, 3354 bis 3360 (1977) beschriebenen Verfahren weiter

30' gereinigt. Die erhaltene Enterokinase wird mit Substrat inkubiert, und zu bestimmten Zeitabständen entnommene Proben werden auf einem isoelektrisch fokussierenden Gel untersucht. Das Ausgangsmaterial hat einen isoelektrischen-Punkt von 4,3, und dieser verschiebt sich im. Laufe der Zeit zu einer Bande, die den isoelektrischen Punkt von Humanwachstumshormon (4,91) hat. ..-..'

- 41 - . . !Beispiel 5

Plasmid zur Expression von Met—Phe-Pro-Leu-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Rinderwachstumshormon unter Verwendung des Lipoproteinpromotors von Escherichia coli.

Das Plasmid pNM702 (123 in Fig. 11), nämlich das Expressionsplasmid für Humanwachstumshormon, wird als Ausgangsmaterial zur Konstruktion eines Plasmids verwendet, das ; Met-Phe-Pro-Leu-Äsp-Äsp-Asp-Asp-Lys-Rinderwachstumshormon exprimiert.

Das in J. Biol. Chem. 255, 7521 bis 7524 (1980) beschriebene Plasmid pBP348 (124 in Fig. .11) wird als Quelle für

15. zwei DNA-Fragmente/verwendet, die die Kodierungssequenz für,, einen. Teil- des Rinderwachstum.shormo.n.gens enthalten;. Das Plasmid enthält eine 831 bp-Sequenz, die für Rinderwachs-· tumshormon kodiert, die in die Pstl (5'CTGCAG3')-Restriktionsstelle von pBR322 kloniert ist. Nach einem anderen

2,0. Verfahren als, dem/oben beschriebenen läßt sich die·: Sequenz für Rinderwachstumshormo.n. aus Messenger-RNA erhalten, die: aus Rinderhypophysen unter Anwendung der in Methods of Enzymology 68, 75 bis 90 (1979) beschriebenen Verfahren isoliert worden ist.

Die Kodierungssequenzen für Humanwachstumshormon und Rinderwachstumshormon sind, wie bereits oben erwähnt, sehr ähnlich und zeigen eine starke Homologie. Zur Konstruktion dieses. Expressionsplasmids für Rinderwachstumshormon eignen sich daher auch die Fragmente, welche durch Verdauung mit dem Restriktionsenzym PvuII (.5'CAGCTGS') gebildet werden.

Man verdaut 10 ^g pNM702 (123 in Fig. 11), das pro MoIekül drei PvuII-Stellen enthält, mit einer Einheit PvuII. in 200 μΐ PvuII-Restriktiönspuffer (60 mMöl NaCIy 6 mMöl Tris:HCl (pH 7,5), 6 mMol MgCl-, 6 mMol ß-Mercaptoethanol) über eine Zeitdauer von 10 Minuten bei 37°C. Die Reaktion

wird durch 10 Minuten langes Erwärmen auf 65⁰C beendet und die erhaltene DNA mit Alkaliphosphatase behandelt. Dieses beschränkte Verdauungsverfahren führt zur Abspaltung von der Hälfte bis zu zwei Dritteln der vorhandenen PvuII-Stellen. Die Fragmente werden auf einem 1 %-igen Agarosegel aufgetrennt,: und das DNA-Fragment (125 in Fig. 11), das in seiner Größe dem linearen Plasmid entspricht, bei welchem das 497 bp-PvuII-Fragment fehlt (das etwas schneller läuft als das Einzelschnittplasmid) wird herausgeschnitten, gereinigt und als Vektor zur Kontruktion des Zwischenplasmids (126 in Fig. 11) verwendet.

) Zur Herstellung eines 494 bp-PvuII-Fragments geht man von pBP348 aus. Hierzu verdaut man 10 μg dieses Plasmids in 200 μΐ PvuII-Puffer mit 10 Einheiten PvuII über eine Zeitdauer von einer Stunde bei 37°C. Die Fragmente werden auf einem 6 %-igen Polyacrylamidgel aufgetrennt, Und.das 494 bp-Fragment (124 in' Fig. 11) wird unter Anwendung der oben beschriebenen !Methoden visualisiert und gereinigt.

20

Zur Konstruktion des Zwischenplasmids (126 in Fig. 11) Iigiert' man 0,2 μg Vektor mit .0,05 μg 494 bp-Fragment in 20 μΐ T^-DNA-Ligasepuffer, der 2 Einheiten T_d-DNA-Ligase enthält,- über eine Zeitdauer von 16 Stunden bei 4°C. Nach erfolgter Transformation und Selektion von Transformanten bezüglich ihrer Resistenz gegenüber Ampicillin werden die

^; . unter Anwendung des oben erwähnten schnellen alkalischen Extraktionsverfahrens hergestellten Plasmide hinsichtlich der Anwesenheit des' 494 bp-PvuII-Fragments analysiert. Die geeignete Orientierung des Fragments wird durch sequentielle Verdauung mit den Enzymen Xbal und Smal bestimmt. Das 494 bp-PvuII-Fragment der Rinderwachstumshormonsequenz hat eine seltene asymmetrische Smal-Restriktionsstelle. Das Stammplasmid pNM702 enthält keine Smal-Stellen. Ein Plasmid mit einem 494 bp-PvuII-Fragment und. einem 440 bp-Xbal, Smal-Fragment wird als das gewünschte Zwischenprodukt selektiert und bei weiteren Konstruktionen verwendet.

] Das Zwischenplasmid (126 in Fig. 12) überführt man in das gewünschte verschmolzene Rinderwachstumshormon-Expressionsplasmid unter Anwendung der folgenden zwei Verfahren: (1) Die Kodierungssequenz der ersten 3 0 Aminosäuren von Humanwachstumshormon wird entfernt und durch die Kodierungssequenz für. die ersten 31 Aminosäuren von. Enterokinase-Rinderwachstumshormon ersetzt, und (2) eine kurze Sequenz zwischen der zweiten PvuII-Stelle in der Kodierungssequenz und dem Stoppkodon (welches eine Humanwachstumshormonse-]Q quenz ist) wird durch ein synthetisches Fragment ersetzt, um so. das Kodon für Alanin wieder herzustellen, nämlich die 190. Aminosäure von Rinderwachstumshormon.

10 μg des Zwischenplasmids (126 in Fig. 1.2) verdaut man ]5 mit einer Einheit PvuII in 200 μΐ PvuII-Puffer über eine Zeitdauer von 5 Minuten hei 37^;OC. Die Reaktion wird,'durch 10 Minuten langes Erwärmen auf 6'B⁰C beendet. Das" Fragmentgemisch wird auf ein 1 %-iges Agarosegel aufgetragen, und das lineare Plasmid, welches lediglich einen einzelnen PvuII-. 2-Q Schnitt pro Molekül enthält, wird gewonnen und gereinigt. Das gewonnene Material (etwa 3 μς) wird vollständig mit 5 Einheiten Xbal verdaut und mit Alkaiiphosphatase behandelt. Die Fragmente werden auf 1 %-iges Agarosegel aufgetragen,, und das¹ größte; Fragment (bei welchem das 109 bp-Fragment zwischen Xbal und der ersten PvuII-StelIe im ι Human- und Rinderwachstumshormon fehlt) wird gewonnen und als Klonierungsvektor (127 in Fig. 12) verwendet.

Die DNA-Sequenz für die ersten 23 Aminosäuren (69 bp) von Rinderwachstumshormon bis zur ersten PvuII-Stelle- enthält zwei Restriktionsstellen für das Enzym Hpa.II (5'CCGGS'). Die erste Stelle liegt bei 23 bp vom ersten Nucleotid der Kodierungssequenz. Ein 63 bp-Fragment (128 in Fig. 12) wurde mittels der Phosphotriestermethode'synthetisiert. Dieses Fragment entspricht der 19 bp-Sequenz von der· Xbal Stelle in der lpp-Ribosombindestelle bis zum ÄTG-Initia- · tionskodon, welches von der Kodierungssequenz für Phe-Pro-Leu-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (24 bp) und 20 Nucleotiden der

] Kodierungssequenz des Rinderwachstumshormons von Phe bis zur ersten Hpall-Stelle gefolgt wird.

Dieses Fragment hat die folgende Struktur:

.-. " L .

Xbal

5' CTAGAGGGTATTAATAATGTTCCCATTGGATGATGATGATAAG-3' TCCCATAATTATTACAAGGGTAACCTACTACTACTATTC-

Hpall . ·

}Q TTCCCAGCCATGTCCTTGTC 3'

AAGGGTCGGTACAGGAACAGGC 5'

Zur Bildung des 63 bp-Fragments werden folgende neun Segmente hergestellt:

I)- CTAGAGGGTAT

2) TAATAATGTTCC

3) CATTGGATGAT

4) GATGATAAGTTCC

2_;0 ' 5) CAGCCATGTCCTTGTC . : '

6) ÄTGGGÄÄCATTÄTTÄATäCCCT

7) TTATCATCÄTCATCCA '

8) ATGGCTGGGAAC '9) CGGACAAGGAC

Unter Verwendung der in obiger Weise hergestellten Segmente führt man die durch T.-Ligase katalysierten Verknüp-fungsreaktionen stufenweise wie folgt durch:

a) Das in Stellung 5' unphosphorylierte Segment 1 verknüpft man mit dem in Stellung 5' phosphorylierten Segment 2 in Gegenwart des in Stellung 5' phosphorylierten Segments 6 unter Verwendung von T.-Ligase zum DNA-Duplex 1, der durch Elektrophorese mit 15 %-igem Polyacrylamidgel gereinigt wird.

b) Die in Stellung 5' phosphorylierten Segmente 3, 4 und 5 verknüpft man in Gegenwart der in Stellung 5' phos-

phorylierten Segmente.7 und 8 und des in Stellung 5' unphosphorylxerten Segments 9 unter Verwendung von T.-Ligase zu einem DNA-Duplex 2, der durch Elektrophorese mit 15 %-igem Polyacrylamidgel gereinigt wird. ' ' ' . . .

c) Die Duplexe 1 und 2 verknüpft man dann mit T.-Ligase

zu einem DNA-Duplex (128 in Fig. 12), der durch Elek- trophorese mit 15 %-igem Polyacrylamidgel gereinigt wird. Diesen DNA-Duplex unterzieht man dann unter Anwendung eines üblichen Verfahrens einer enzymatischen Phosphorylierung unter Verwendung von T.-Polynucleotidkinase und //-P. _/ATP.

Zur Herstellung des DNA-Fragments von 46 bp, das von der oben beschriebenen Hpall-Stelle bis zur.PvuII-Stelle läuft, geht man vom !ursprünglichen -PBPJ48-Plasmid, aus . Hie.r,zu verdaut man 100 μg dieses Plasmids in 400 μΐ PvuII-Puf.fer mit 50 Einheiten PvuII über eine Zeitdauer von 2 Stunden bei 37°C. Die nach Extraktion mit Phenol und Fällung mit Ethanol erhaltene DNA wird in 4J)₁O μ.1 '.PiStI (5 ' CTGCAG;!¹ ) Puffer (50-mMol NaCl , _;6-- mMol Tris ; KCl (pH;·, 7 , 40^;, 6, mMol,. IMgCl₀, .6 mMol ß-Mercaptoethanol) mit 50 Einheiten Pstl gelöst und 2 Stunden bei 3'7°C behandelt. Die DNA-Fragmente werden auf 6 %-iges Polyacrylamidgel (30 cm lang) .verteilt, und das die gewünschte 46 b.p-Sequenz enthaltende 135 bp-Fragment wird in.üblicher Weise gewonnen und gereinigt. Ein Drittel der gewonnenen DNA-(entsprechend 33 ^g Plasmid) unterzieht man einer· begrenzten Verdauung mit Hpall-Restriktionsensym. Die DNA wird'in 10_0 ,ul Hpall -Puffer (20 mMol Tris:.HCl (pH 7,4), 7 mMol MgCl₉, 6 mMol ß-Mercaptoethanol) mit einer Einheit Hpall über eine Zeitdauer von 4 0 Minuten bei 37⁰C verdaut. Die Reaktion wird durch 10 Minuten langes Erwärmen auf 65⁰C beendet. Sodann' läßt man die. DNA-Fragmente auf einem 5 %-igen.Acrylamidgel (Verhältnis von Acrylamid : Bis = 19 : 1) laufen. In einer getrennten Sonde läßt man 1 μ-g des 'mit SauIXIA-Restriktionsenzym verdauten pBR322 laufen. Dieses Gemisch von Fragmenten enthält ein 46 bp-Fragment, welches als Größen-

marker verwendet wird. Das durch Teilverdauung mit Hpall des 135 bp-Fragments (124 in Fig. 12) erhaltene 46 bp-Fragment wird in üblicher Weise gereinigt.

Man vereinigt 0,2 jag Plasmidvektor (127 in Fig. 12), der Xbal- und PvuII-Enden aufweist, mit 3,2 pMol synthetischem 63 bp-Fragment (128 in Fig. 12) und 0,5; bis 1 pMol 46 bp-.Fragment (124 in Fig. 12) in 10 μΐ Ligationspuffer mit 2 Einheiten T .-DNA-Ligase und ligiert das Ganze über eine Zeitdauer-von 16 Stunden bei 4⁰C. Unter Verwendung dieses' Gemisches transformiert man dann Escherichia coli JA221 und stellt Plasmide aus Kolonien her, die bezüglich einer Resistenz gegenüber Ampicillin selektiert werden. Die Plasmide werden hinsichtlich der Anwesenheit eines 494 bp-Pvuir-Fragments und eines 109 bp Xbal, PvuII-Fragments ausgewählt. Von 12 analysierten Fragmenten enthält eines diese Fragmente. Dieses Plasmid wird von der Xbal-Stelle bis zur PvuII-StelIe. sequenziert und in einem Radiοimmunversuch bezüglich Rinderwachstumshormon untersucht. Es reagiert im Radioimmunversuch positiv und hat die genaue Sequenz. Dieses Plasmid' wird¹ als pNM78 9. (129 in Fig; 12) bezeichnet. Die quantitative Expression wird durch übliche Radio-Radio immun -Verfahren für Rinderwachstumshormon gemessen, wobei sich ein Wert von wenigstens 10^D Molekülen pro Zelle ergibt.

Das- Plasmid ρ·ΝΜ7 8 9 (129'in Fig. 1.3) erfordert eine Ami nosäurekodonveränderung für eine'vollständige Umwandlung in Rinderwachstümshormon. Dies wird erreicht durch Entfernung

30- des 28 bp PvuII-·bis'BamHI-Fragments von pNM7 8 9 und Ersatz dieses Fragments durch ein synthetisches doppelsträngiges Fragment (13 bp oberer Strang, 17 bp unterer Strang), das die folgende Sequenz hat und bei ISO in Fig. 13 angegeben ist:

^;

⁵ ctgtgccttctag³'

₃, GACACGGAAGATCCTAg₅,

j Man verdaut 10 \xq pNM789 mit einer Einheit PvuII in 200 μΐ PvuII-Puffer über eine Zeitdauer von 5 Minuten bei 37°C. Das Enzym wird zur Inaktivierung 10 Minuten auf 65°C erwärmt. Die Probe wird durch Zugabe von BamHI-Puffer auf 3 00 μ.1 verdünnt und mit 10 Einheiten BamHI über eine Zeitdauer von 1 Stunde bei 37⁰C vollständig verdaut. Sodann gibt man 5 Einheiten Alkalxphosphatase zu und inkubiert das Ganze eine Stunde bei 65⁰C. Die DNA-Fragmente werden auf einem 1 %-igen Agarosegel aufgetrennt, und' ein DNA-

IQ Fragment (131 in Fig. 13) mit der. Größe eines Einzelschnittplasmids wird gereinigt. 0,2 μg dieses Fragments ligiert man dann mit 5 pMol an'synthetischem Fragment unter Verwendung von 2 Einheiten T.-Ligase in 20 μΐ Ligasepuffer über Nacht bei 4⁰C. Nach erfolgter Transformation und Durchführung des.oben beschriebenen schnellen.alkalischen Extraktionsverfahrens werden- mehrere „p.lasmide, selektiert, die die geeignete Größe an¹ PvuII-Fragment (494 bp) und an Xbal, BamHI-Fragment (528 bp) enthalten. Die Sequenz wenigstens eines dieser beiden Fragmente wird aus-

20gehend von.der BamHI-Stelle hin zur seltenen Smal-Stelle bestimmt, wobei-eine.; der, gewünschten., S.eque'-nzen. ( 13-2, in,, Fig. 13) selektiert wird.

Claims (17)

1. X-5872

   Erfindungsansprüche:

   . Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten DNA-Klonierungsvektors zur Expression von exogenem Protein, · dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Segmente miteinander verknüpft:

   (a) ein DNA-Segment, das einen funktioneilen Replikationsursprung enthält, .

   (b) ein oder mehr DNA-Segmente, von denen jedes einer transformierbaren Wirtszelle eine Eigenschaft verleiht, die für eine Selektion brauchbar ist, wenn dieser Vektor in die Wirtszelle transformiert ist, . und

   (c) ein DNA-Segment, das eine Sequenz enthält, die in Tandemanordnung folgendes definiert:

   (-]) den Promotor einer Lipoproteinexpressions-

   steuersequenz,

   (2) die 5'-untranslatierte Region einer Lipoproteinexpressionssteuersequenz und

   25. '

   (3) ein Translationsstartkodon, das ohne Zwischenanordnung eines Teils oder Gesamten einer Nucleotidsequenz, die für endogenes Protein kodiert, gefolgt wird von

   (i) einer Sequenz, die für ein exogenes Pro-• ' tein kodiert, oder ' -

   (ii) einer Nucleotidsequenz, die für eine Ente- ; . rokinasespaltstelle kodiert, an welche ohne·

   Unterbrechung eine Nucleotidsequenz gebunden ist, die für ein exogenes Protein ko-' diert. . '
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß. die exogene Proteinnucleotidsequenz für Humanwachstumshormon oder Rinderwachstumshormon kodiert.
3. 3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Nücleotidsequenz des Promotors und die der 5'-untranslatierten Region von gramnegativen Bakterien abgeleitet sind.
4. 4. Verfahren nach Punkt 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Nücleotidsequenz des Promotors und die der 5'-untranslatierten Region von den gleichen gramnegativen Bakterien abgeleitet sind. .
5. 5. Verfahren^! nach· Punkt 4., dadurch gekennzeichnet, daß die Nücleotidsequenz des Promotors und die der- 5·-untranslatierten Region von Escherichia coli abgeleitet sind.
6. 6. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Ganzes oder als Teil-die 3'-untrans-1 aiii er te- Region--.: einer?¹¹" Lipppröteihexpre'ss ions st euer sequenz. enthalten ist und die untranslatierte Region nach der Sequenz verknüpft ist,.die für das exogene Protein kodiert.
7. 7. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Ganzes oder zumTeil die'Transkrip-. tionsterminationsregion einer Lipoproteinexpressionssteuersequenz enthalten ist und die Transkriptionsterminationsregion nach der Sequenz verknüpft ist, die für das exogene Protein kodiert. '
8. 8. Verfahren nach Punkt 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Ganzes oder als Teil die Transkriptionsterminationsregion einer Lipoproteinexpressionssteuersequenz enthalten ist und die Transkriptionsterminationsregion nach der 3'-untranslatierten Region verknüpft ist.
9. 9. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Enterokinasespaltstelle für eine Sequenz an Aminosäuren aus Asp-Asp-Asp-Asp-Lys kodiert.
10. 10. Verfahren nach Punkt 9, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz für die Enterokinasespaltstelle aus

    GATGATGATGATAAG kodiert
    CTACTACTACTATTC
11. 11. Verfahren nach Punkt 9 oder 10,'dadurch,gekennzeich- net, daß die Enterokinasespaltstelle für Phe-Pro-Leu-Asp-

    Asp-Asp-Asp-Lys kodiert..
12. 12. Verfahren nach Punkt 11, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz, die für die Enterokinasespaltstelle ko-

    15·' diert, die Sequenz . TTCCCATTGGATGATGATGATAAG ist.

    AAGGGTAACCTACTACTACTATTC
13. 13. Verfahren nach Punkt 1 zur Herstellung von PlasmidpNM645, dadurch gekennzeichnet, daß man das 538 bp FnuDII-Digest des 6 91 bp.. BamHI'-Fragments von Pla^:smid-pNM575 , das.

    20 mit Alkaliphosphata.se behandelte BarriHl-Xbal-Fragment von Plasmid ρΚΞΝΌ2;1 un,d: ein -. dop.pelsträngiges, DNA-Sy.nthesef rag- ment-, das die lpp-Promotorregion in Verknüpfung mit der Humanwachstumshormonkodierungsregion enthält, miteinander verknüpft.

    -

    14 ν Verfahren nach Punkt 1 zur-Herstellung von. PlasmidpNM797, dadurch gekennzeichnet, daß-man das größte Fragment des mit Alkaliphosphatase behandelten Xbal-Digests eines PvuII-Partialdigests von Plasmid-pNM6 85, ein 42 bp DNA-
14. 30. Synthesefragment'' und-· ein:46 bpHpall-Partialdigest des bp PvulI-Fragments von Plasmid-pBP348 miteinander verknüpft.
15. 15.' Verfahren nach Punkt 1 zur Herstellung von Plasmid-ρΝΜ73β,. dadurch gekennzeichnet, daß man das- 617 bp Hindlll-Sall-Fragment von pBR3 2 2 mit dem größten Sall-Fragment eines stumpfendigen BamHI-Digests von Plasmid-ρΝΜβ45' verknüpf t
16. 16. Verfahren nach Punkt 1 zur Herstellung von PlasmidpNM702, dadurch gekennzeichnet, daß man das 538 bp FnuDII-Digest des 691 bp BamHI-Fragments von Plasmid-pNM575, das mit Alkaliphosphatase behandelte BamHI-Xbal-Fragment von . Plasmid-pKEN021 und ein doppelsträngiges DNA-Synthesefragment, das in Tandemanordnung die Ipp-Promotorregion, das Startkodon, eine Region, die für ein kurzes Peptid kodiert, das eine Sequenz definiert, die von Enterokinase erkannt und gespalten wird, und die Humanwachstumshormonkodierungsregion enthält, miteinander verknüpft.
17. 17. . Verfahren nach Punkt 1 zur Herstellung von PlasmidpNM789, dadurch gekennzeichnet, daß man das größte mit Alkaliphosphatase behandelte PvuII-Xbal-Partialdigestfragment 15- des ZWisehenρlasmids^ ein: 63 bp\ DNA-Synthesefragment·;und·,., ein" .46 bp Hpall-Partiaidigest.' .des 1 35 bp^; PvüII-Fragments von Plasmid-pBP348 miteinander verknüpft.