JPH0759596A - マグネシウム測定方法およびその試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 体液中のマグネシウムを特異性の高い酵素法
により測定する。 【構成】 試料にホスホエノールピルビン酸塩および重
炭酸塩の存在下、ホスホエノールピルビン酸カルボキシ
ラーゼを反応させ、生成したオキザロ酢酸にＮＡＤＨの
存在下、マレートデヒドロゲナーゼを作用させ、減少す
るＮＡＤＨを測定する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は酵素法によって試料中、
特に体液中のマグネシウムを測定する方法およびその試
薬に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】マグネシウムは生体内必須金属の一つで
あり、各種酵素の活性化剤として知られている。臨床的
には、高血圧、心臓病、糖尿病、腎結石など種々の循環
器系疾患に関連することが明らかになり、その存在が注
目されるようになってきた。マグネシウムの測定には、
従来より原子吸光法、キシリジンブルーに代表される比
色法などが一般に用いられてきたが、最近、特異性の高
い酵素的測定法がいくつか開発され実用性の高い方法と
してその利用価値が高まっている（検査と技術vol.19 n
o16 p507参照）。例えば、ヘキソキナーゼ・グルコース
-6- リン酸デヒドロゲナーゼ法は、D-グルコースおよび
ＡＴＰの存在下でヘキソキナーゼの反応速度がマグネシ
ウム濃度に依存することから、生成するグルコース-6-
リン酸にグルコース-6- リン酸デヒドロゲナーゼを作用
させ、補酵素であるＮＡＤＨの減少を測定することによ
り、試料中のマグネシウムを測定する方法である。この
方法は、マグネシウムとＡＴＰの結合体が酵素の基質と
なることを利用したものである。その他、同一原理に基
づく測定法にグリセロールキナーゼ−グリセロリン酸オ
キシダーゼ法、マグネシウムが基質ではなく活性化剤と
して作用することを利用したホスホグルコムターゼ−グ
ルコ−ス-6−リン酸デヒドロゲナーゼ法などが知られて
いる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】臨床検査におけるマグ
ネシウム測定は、従来行われてきたキシリジンブルーな
どを用いた化学法に代わる測定法として、特異性の高い
上記酵素法が普及しつつあるが、測定に用いる酵素や基
質の安定性が不充分、化学法に比べて測定に要する時間
が長く、定量域が狭いなどの問題もあることが知られて
いる。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
点を解決するマグネシウム測定方法を種々検討する中、
マグネシウムが酵素反応の活性化剤として作用するホス
ホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）を
用いる新たな測定法を見い出し、本発明に到達した。

【０００５】すなわち、本発明はマグネシウムを含有す
る試料にホスホエノールピルビン酸塩（ＰＥＰ）および
重炭酸塩の存在下、ホスホエノールピルビン酸カルボキ
シラーゼを反応させ、生成したオキザロ酢酸にＮＡＤＨ
の存在下、マレートデヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）を作用
させ、減少するＮＡＤＨを測定することにより試料中の
マグネシウムを測定することを特徴とするマグネシウム
測定方法である。

【０００６】本発明の測定原理は下記に示す通りであ
る。

【０００７】

【化１】

【０００８】

【化２】

【０００９】また本発明は、（ａ）ホスホエノールピル
ビン酸塩、（ｂ）重炭酸塩、（ｃ）ホスホエノールピル
ビン酸カルボキシラーゼ、（ｄ）ＮＡＤＨ、（ｅ）マレ
ートデヒドロゲナーゼおよび（ｆ）緩衝液を含有するこ
とを特徴とするマグネシウム測定試薬である。

【００１０】本発明に使用するホスホエノールピルビン
酸カルボキシラーゼは、多くの植物組織および細菌から
得ることができ、いずれの起源によるものを用いてもよ
い。しかし、公知の該酵素は、植物起源では安定性が不
充分であり、液状で長時間保存できず、一方、細菌起源
の多くはマグネシウム以外にも例えばアセチルコエンザ
イムＡのような高価な活性化剤を反応に必要とすること
が知られている。これらの欠点を有することなく、本発
明の目的に好適な例としては、酢酸菌由来のホスホエノ
ールピルビン酸カルボキシラーゼが挙げられる。

【００１１】本発明に使用するマレートデヒドロゲナー
ゼは、いかなる起源のものを用いてもよいが、例えば豚
心臓由来、サーマス属由来、バチルス属由来のもの等が
挙げられる。ホスホエノールピルビン酸塩としては、カ
リウム塩、ナトリウム塩、トリシクロヘキシルアンモニ
ウム塩、モノシクロヘキシルアンモニウム塩等が挙げら
れる。重炭酸塩としては、カリウム塩、ナトリウム塩、
アンモニウム塩等が挙げられる。

【００１２】本発明に使用する緩衝液は、ホスホエノー
ルピルビン酸カルボキシラーゼおよびマレートデヒドロ
ゲナーゼ反応に適したｐＨに保たれるものであればいか
なるものでもよいが、通常ｐＨ７〜９が用いられる。例
えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、トリシン緩衝液な
どが挙げられる。緩衝液の濃度は特に限定されないが、
通常１０〜１００ｍＭ程度である。

【００１３】本発明の試薬には必要により、界面活性
剤、防腐剤、安定化剤、酵素賦活剤等を加えてもよい。
界面活性剤、防腐剤、安定化剤、酵素賦活剤は、特に限
定されるものではない。界面活性剤としては、非イオン
性界面活性剤が好適に用いられる。防腐剤としては、Ｎ
ａＮ₃ 、キレート剤、抗生物質が好適に用いられる。安
定化剤、酵素賦活剤としては、効果を示すものであれば
特に限定されない。例えば、アルブミン、アセチルコエ
ンザイムＡ、マンガンイオン等が挙げられる。

【００１４】本発明試薬は一般的な組成を以下に示す。 弱アルカリ性緩衝液 １０〜５０ｍＭ ホスホエノールピルビン酸塩 ２〜５ｍＭ 重炭酸塩 ５〜２０ｍＭ ＮＡＤＨ ０．１〜０．３ｍＭ ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ ０. ０２〜０. ２Ｕ／ｍｌ マレートデヒドロゲナーゼ １〜１０Ｕ／ｍｌ

【００１５】更に具体的な組成の一例を以下に示す。 トリス塩酸緩衝液 １０〜５０ｍＭ ホスホエノールピルビン酸カリウム塩 ２〜５ｍＭ 炭酸ナトリウム ５〜２０ｍＭ ＮＡＤＨ ０. １〜０. ３ｍＭ 酢酸菌由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ ０. ０２〜０. ２Ｕ／ｍｌ マレートデヒドロゲナーゼ １〜１０Ｕ／ｍｌ

【００１６】また試料中のラクテートデヒドロゲナーゼ
とピルビン酸による妨害反応を抑えるために、オキザメ
ートのようなラクテートインヒビターを１〜２０ｍＭ程
度添加することが望ましい。本発明はマグネシウムがホ
スホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性化剤と
して作用し、特定の条件下でマグネシウム量とホスホエ
ノールピルビン酸カルボキシラーゼの反応速度が比例す
ることを利用して、試料中のマグネシウム量を測定する
ことを特徴とするマグネシウム測定方法である。従っ
て、試料中のマグネシウムとホスホエノールピルビン酸
カルボキシラーゼの急速な結合を弱めるために、ＥＤＴ
Ａのようなキレート剤を適量加えることで測定感度を自
在に調節することも可能である。

【００１７】上記試薬３. ０〜１０ｍｌを３０℃で５分
間程度予備加温した後、マグネシウムを含む試料０. １
ｍｌを混合後、３０℃で１〜１０分間反応させ、ＮＡＤ
Ｈ濃度の減少を、例えば３４０ｎｍ、３６０ｎｍ、３８
０ｎｍ等の吸光度から測定する。

【００１８】

【実施例】次に本発明を実施例を挙げて具体的に示す。 実施例１ アセトバクター・ハンゼニイ（Acetobacter hansenii）
ＩＦＯ１４８２０由来のホスホエノールピルビン酸カル
ボキシラーゼを用い、以下に示すマグネシウム測定試薬
を作成した。 トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８. ０） ５０ｍＭ ホスホエノールピルビン酸カリウム塩 ３. ５ｍＭ 炭酸ナトリウム １０ｍＭ ＮＡＤＨ ０. １４ｍＭ ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ ０. １Ｕ／ｍｌ マレートデヒドロゲナーゼ １Ｕ／ｍｌ

【００１９】上記試薬３. ０ｍｌを３０℃で５分間予備
加温した後、マグネシウム０〜２ｍＭを含む試料０．１
ｍｌを添加し、３０℃で５分間反応させ、３４０ｎｍに
おける吸光度の減少を測定した。試料中のマグネシウム
濃度と１分間当りの吸光度の減少量の関係を図１に示
す。マグネシウム０〜２ｍＭでは、吸光度変化との間に
直線関係が成立した。

【００２０】実施例２ アセトバクター・パスツリアヌス（Acetobacter pasteu
rianus）ＩＦＯ１４８１４由来のホスホエノールピルビ
ン酸カルボキシラーゼを用い、以下に示すマグネシウム
測定試薬を作成した。 トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８. ０） ５０ｍＭ ホスホエノールピルビン酸カリウム塩 ３. ５ｍＭ 炭酸ナトリウム １０ｍＭ 硫酸マグネシウム ３０ｍＭ ＮＡＤＨ ０．１４ｍＭ ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ ０. ０５Ｕ／ｍｌ マレートデヒドロゲナーゼ １Ｕ／ｍｌ

【００２１】上記試薬３. ０ｍｌを３０℃で５分間予備
加温した後、マグネシウム０〜１Ｍを含む試料０. １ｍ
ｌを添加し、３０℃で５分間反応させ、３４０ｎｍにお
ける吸光度の減少を測定した（試料中のマグネシウム濃
度０ｍＭ時の減少量をブランクとして減じた）。試料中
のマグネシウム濃度と１分間当りの吸光度の減少量の関
係を図２に示す。マグネシウム０〜１. ２Ｍの間で、吸
光度変化との間に直線関係が成立した。

【００２２】

【発明の効果】ホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼを用いる本発明によれば、従来の酵素法に比べて、
測定に使用する酵素や基質の安定性が充分であり、化学
法に比べて測定に要する時間が短く、定量域が広い。し
かも高い特異性という酵素法の利点を生かしながら、安
価で迅速なマグネシウム測定が可能であり、特に循環器
系疾患の予防・診断に行われるマグネシウム測定に有用
である。

【図面の簡単な説明】

【図１】２ｍＭ硫酸マグネシウム水溶液の希釈直線性を
示す。

【図２】１Ｍ硫酸マグネシウム水溶液の希釈直線性を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 川村 良久 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀バイオ研究所内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 マグネシウムを含有する試料に、ホスホ
   エノールピルビン酸カルボキシラーゼを反応させること
   により、試料中のマグネシウムを測定することを特徴と
   するマグネシウム測定方法。
2. 【請求項２】 マグネシウムを含有する試料に、ホスホ
   エノールピルビン酸塩および重炭酸塩の存在下、ホスホ
   エノールピルビン酸カルボキシラーゼを反応させ、生成
   したオキザロ酢酸にＮＡＤＨの存在下、マレートデヒド
   ロゲナーゼを作用させ、減少するＮＡＤＨを測定するこ
   とにより試料中のマグネシウムを測定することを特徴と
   するマグネシウム測定方法。
3. 【請求項３】 （ａ）ホスホエノールピルビン酸塩、
   （ｂ）重炭酸塩、（ｃ）ホスホエノールピルビン酸カル
   ボキシラーゼ、（ｄ）ＮＡＤＨ、（ｅ）マレートデヒド
   ロゲナーゼおよび（ｆ）緩衝液を含有することを特徴と
   するマグネシウム測定試薬。