JPH0761950B2 - 抗腫瘍剤 - Google Patents
抗腫瘍剤Info
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- JPH0761950B2 JPH0761950B2 JP61248122A JP24812286A JPH0761950B2 JP H0761950 B2 JPH0761950 B2 JP H0761950B2 JP 61248122 A JP61248122 A JP 61248122A JP 24812286 A JP24812286 A JP 24812286A JP H0761950 B2 JPH0761950 B2 JP H0761950B2
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- mycoplasma
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はマイコプラズマを有効成分とする抗腫瘍剤、お
よび、更にインターフェロンを含有する抗腫瘍剤に関す
る。
よび、更にインターフェロンを含有する抗腫瘍剤に関す
る。
先行技術 種々の細菌体および菌体成分が免疫賦活物質として働
き、抗腫瘍能を有することは公知の事実で、近年これを
用いて腫瘍の治療を行なおうとする研究がなされてい
る。例えば、BCG（Bacillus Calmette Guerin）菌やコ
リネバクテリウム・バルバム（Corynebacterium parvu
m）、ストレプトコッカス・ヘモリティクス（Streptoco
ccus hemolyticus）等が代表的なものである。一方、マ
イコプラズマの研究の歴史は比較的新しく、近年それら
の分類学的、生態学的あるいは病原学的研究が進み、動
物対マイコプラズマの関係が次第に解明されつつある。
マイコプラズマは一般的に宿主特異性が強く、種を越え
て感染することはほとんどない。さらに、多くのマイコ
プラズマは病原性が比較的弱く、通常正常菌叢として健
康動物から分離されることが多く、その毒性も比較的弱
いと考えられる。またリンパ球に対してマイトジェニッ
クに働くという報告もなされており（Y.Mizushima et a
l,Infect.Immun.Vol.tg,636−645,1985）宿主の免疫機
能へ影響を与えることが予想される。
き、抗腫瘍能を有することは公知の事実で、近年これを
用いて腫瘍の治療を行なおうとする研究がなされてい
る。例えば、BCG（Bacillus Calmette Guerin）菌やコ
リネバクテリウム・バルバム（Corynebacterium parvu
m）、ストレプトコッカス・ヘモリティクス（Streptoco
ccus hemolyticus）等が代表的なものである。一方、マ
イコプラズマの研究の歴史は比較的新しく、近年それら
の分類学的、生態学的あるいは病原学的研究が進み、動
物対マイコプラズマの関係が次第に解明されつつある。
マイコプラズマは一般的に宿主特異性が強く、種を越え
て感染することはほとんどない。さらに、多くのマイコ
プラズマは病原性が比較的弱く、通常正常菌叢として健
康動物から分離されることが多く、その毒性も比較的弱
いと考えられる。またリンパ球に対してマイトジェニッ
クに働くという報告もなされており（Y.Mizushima et a
l,Infect.Immun.Vol.tg,636−645,1985）宿主の免疫機
能へ影響を与えることが予想される。
インターフェロン（IFN）は、リンパ球や線維芽細胞な
ど種々の細胞が産生する生理活性蛋白質で、抗ウイルス
作用や抗癌作用などを示す。IFNにはα、β、γのサブ
タイプがあり、αは多少のアミノ酸配列の違い、それに
伴う抗ウイルス作用の違いにより、さらに少なくとも14
種以上に分類される。これらIFNは、近年の遺伝子組換
え技術や大量細胞培養技術によって工業的に生産され、
抗ウイルス剤や抗癌剤として臨床上で応用されつつあ
る。またこれらの天然のIFNのみならず、遺伝子組換え
技術によって、上記のIFNのアミノ酸配列を一部置換し
たり、各IFNの配列を組み合わせるなどして、新規な人
工的IFNも生産されている。
ど種々の細胞が産生する生理活性蛋白質で、抗ウイルス
作用や抗癌作用などを示す。IFNにはα、β、γのサブ
タイプがあり、αは多少のアミノ酸配列の違い、それに
伴う抗ウイルス作用の違いにより、さらに少なくとも14
種以上に分類される。これらIFNは、近年の遺伝子組換
え技術や大量細胞培養技術によって工業的に生産され、
抗ウイルス剤や抗癌剤として臨床上で応用されつつあ
る。またこれらの天然のIFNのみならず、遺伝子組換え
技術によって、上記のIFNのアミノ酸配列を一部置換し
たり、各IFNの配列を組み合わせるなどして、新規な人
工的IFNも生産されている。
発明が解決しようとする問題点 上記の様にマイコプラズマが免疫賦活作用を有すること
は良く知られていたが、癌治療に有効であるとの知見は
全く得られていなかった。
は良く知られていたが、癌治療に有効であるとの知見は
全く得られていなかった。
また、IFNとその他の抗癌剤、例えばTNF、IL2、ダカル
バジン、ACNC（商品名ニドラン）等との併用に関しても
様々な試みが成されているが、マイコプラズマ菌体処理
物との併用に関する知見は全く無く、新規であり、IFN
単独投与の場合より、腫瘍治療に非常に有効な剤形を与
える。
バジン、ACNC（商品名ニドラン）等との併用に関しても
様々な試みが成されているが、マイコプラズマ菌体処理
物との併用に関する知見は全く無く、新規であり、IFN
単独投与の場合より、腫瘍治療に非常に有効な剤形を与
える。
問題点を解決するための手段 本発明はマイコプラズマ菌体処理物を有効成分とする抗
腫瘍剤、さらにIFNを含む抗腫瘍剤を提供する。
腫瘍剤、さらにIFNを含む抗腫瘍剤を提供する。
本発明に用い得るマイコプラズマの種としては、ガリセ
プチクム（gallisepticum）、ハイオライニス（hyorhin
is）、オラーレ（orale）、ファーメンタンス（ferment
ans）、ホミニス（hominis）、ミコイデス（mycoide
s）、ファリンジス（pharyngis）、ニューモニエ（pneu
moniae）、サリバリウム（salivarium）などが挙げられ
るが、これらに限定されるものではなく、免疫賦活活性
をを有するマイコプラズマであれば全て用いることがで
き、これらの種を組み合わせて用いてもよい。
プチクム（gallisepticum）、ハイオライニス（hyorhin
is）、オラーレ（orale）、ファーメンタンス（ferment
ans）、ホミニス（hominis）、ミコイデス（mycoide
s）、ファリンジス（pharyngis）、ニューモニエ（pneu
moniae）、サリバリウム（salivarium）などが挙げられ
るが、これらに限定されるものではなく、免疫賦活活性
をを有するマイコプラズマであれば全て用いることがで
き、これらの種を組み合わせて用いてもよい。
上記のようなマイコプラズマは常法に従って培養でき
る。すなわち、一般に用いられる倍地、例えば、PPLO培
地、Freyの培地、Hayflick培地、ハンクス液、Chanock
らの液体培地、ハート・インフュージョン培地などに、
常法どおり牛、馬、豚、ウサギなどの血清や酵母エキス
などを加えた液体培地で、約30〜39℃、好ましくは37℃
で２〜10日間静置培養すればよい。場合によっては、培
養器にゴム栓をしたり５〜10％炭酸ガス雰囲気下で培養
するのが好ましいこともある。培養された菌体は、遠心
分離などによって分離し、生理食塩水などで洗浄し、滅
菌する。得られたマイコプラズマ菌体処理物は、所望に
より濃縮または凍結乾燥しても良い。該菌体処理物は、
冷凍保存しておくことが望ましい。
る。すなわち、一般に用いられる倍地、例えば、PPLO培
地、Freyの培地、Hayflick培地、ハンクス液、Chanock
らの液体培地、ハート・インフュージョン培地などに、
常法どおり牛、馬、豚、ウサギなどの血清や酵母エキス
などを加えた液体培地で、約30〜39℃、好ましくは37℃
で２〜10日間静置培養すればよい。場合によっては、培
養器にゴム栓をしたり５〜10％炭酸ガス雰囲気下で培養
するのが好ましいこともある。培養された菌体は、遠心
分離などによって分離し、生理食塩水などで洗浄し、滅
菌する。得られたマイコプラズマ菌体処理物は、所望に
より濃縮または凍結乾燥しても良い。該菌体処理物は、
冷凍保存しておくことが望ましい。
これ以外にも、マイコプラズマに感染した細胞を培養
し、その培養上清からマイコプラズマを調整してもよ
い。
し、その培養上清からマイコプラズマを調整してもよ
い。
得られたマイコプラズマ菌体処理物は、単独で投与して
も著しい抗癌作用を有するが、さらにIFNを含有させて
投与すれば、さらに優れた抗癌作用を示す。本発明で用
いることができるIFNは特定のIFNに限らず、IFNαおよ
びそのサブタイプ、IFNβ、IFNγなど天然または人工の
IFN全て使用可能である。ただし、IFNが種特異性を有す
る場合には、投与の対象に応じたIFNを使用すべきであ
る。各種のインターフェロンは既に市販されており（例
えば、LEE Biomolecular Research Laboratories,Incな
どより）、これらの市販品を用いることができる。これ
らのIFNは単独でも組み合わせても使用できる。
も著しい抗癌作用を有するが、さらにIFNを含有させて
投与すれば、さらに優れた抗癌作用を示す。本発明で用
いることができるIFNは特定のIFNに限らず、IFNαおよ
びそのサブタイプ、IFNβ、IFNγなど天然または人工の
IFN全て使用可能である。ただし、IFNが種特異性を有す
る場合には、投与の対象に応じたIFNを使用すべきであ
る。各種のインターフェロンは既に市販されており（例
えば、LEE Biomolecular Research Laboratories,Incな
どより）、これらの市販品を用いることができる。これ
らのIFNは単独でも組み合わせても使用できる。
得られたマイコプラズマ菌体処理物は、一般に注射剤に
使用される生理食塩水、注射用蒸留水などで希釈または
溶解して、ヒトおよび動物の静脈、筋肉、腹腔または皮
下に投与し得る。ヒトに投与する場合は、症状、年齢、
性別等によって異なるが、通常約108〜1011個/Kg/日の
投与で効果があると考えられる。また、該製剤中にIFN
を含有させ、約10〜1000万単位／日となるよう投与すれ
ば、さらなる抗癌作用が期待できる。該注射剤には、通
常製薬上許容される防腐剤、安定化剤、保存剤を含有し
ていてもよく、また所望によりプロカイン等の局麻剤を
含んでいても良い。
使用される生理食塩水、注射用蒸留水などで希釈または
溶解して、ヒトおよび動物の静脈、筋肉、腹腔または皮
下に投与し得る。ヒトに投与する場合は、症状、年齢、
性別等によって異なるが、通常約108〜1011個/Kg/日の
投与で効果があると考えられる。また、該製剤中にIFN
を含有させ、約10〜1000万単位／日となるよう投与すれ
ば、さらなる抗癌作用が期待できる。該注射剤には、通
常製薬上許容される防腐剤、安定化剤、保存剤を含有し
ていてもよく、また所望によりプロカイン等の局麻剤を
含んでいても良い。
発明の作用 本発明の抗腫瘍剤は、マイコプラズマさらにIFNからな
り、マイコプラズマのマクロファージ等に対する免疫賦
活作用さらにIFNの抗腫瘍作用との相乗作用によって、
優れた延命効果および癌細胞増殖抑制効果を有する。
り、マイコプラズマのマクロファージ等に対する免疫賦
活作用さらにIFNの抗腫瘍作用との相乗作用によって、
優れた延命効果および癌細胞増殖抑制効果を有する。
実施例 実施例１ 癌細胞（MethA−R1株）の調製 MethA−R1細胞はBalb/cマウス由来のメチルコランスレ
ン誘発繊維肉腫で、マウス・インターフェロンα、βお
よびγに対する抵抗性株として宇野らにより株化された
ものである（K.Uno et al,1985,Cancer Res.45:1320−1
327）。
ン誘発繊維肉腫で、マウス・インターフェロンα、βお
よびγに対する抵抗性株として宇野らにより株化された
ものである（K.Uno et al,1985,Cancer Res.45:1320−1
327）。
２×106個のMethA−R1細胞をBalb/cマウスの腹腔内に移
植し、10日後に腹腔より回収する。回収は、注射筒で10
mlのハンクス液（Hanks、日水）をマウス腹腔内に注入
して、腹腔内にたまった液を再び注射筒で採取すること
により行なった。回収した液は、50mlの大遠沈管（Falc
on）に入れて、1000rpm、10分間遠心後、上清を捨て、
再びハンクス液に懸濁した。この細胞浮遊液を実験に使
用した。
植し、10日後に腹腔より回収する。回収は、注射筒で10
mlのハンクス液（Hanks、日水）をマウス腹腔内に注入
して、腹腔内にたまった液を再び注射筒で採取すること
により行なった。回収した液は、50mlの大遠沈管（Falc
on）に入れて、1000rpm、10分間遠心後、上清を捨て、
再びハンクス液に懸濁した。この細胞浮遊液を実験に使
用した。
マイコプラズマの調整（その１） マイコプラズマ・ガリセプティクム（Mycoplasma galli
septicum、Ｓ−６株；以下MGと略記）は、以下の方法で
培養し、調整した。ニワトリPPLO培地（栄研製：牛心臓
浸出液100g、ペプトン10g、塩化ナトリウム5g、ブドウ
糖1g、酢酸タリウム0.25gを水1Lに溶解し、pH7.8とした
もの）に馬血清（濾過滅菌を行なってMGフリーとしたも
の）を12％の割合に添加した培地（以下、馬血清添加培
地とする）で、37℃下、２日間培養した菌液（50ml、菌
数約108CFU/ml、CFU＝Colony Forming Unit）を元培養
菌液とした。本菌液をさらに約2Lの馬血清添加培地（3L
容の３角フラスコ使用）に接種し、37℃で７日間静置培
養を行なった。この培養液を8000rpm、30分間遠心して
上清を捨てた後、沈殿した菌体を生理食塩水で懸濁し
て、16000rpm、20分間遠心を行なった。この操作を３回
繰り返して菌体を洗浄し、最後に100倍に濃縮した菌液
約18ml（２×1010個/ml）を得た。該菌液は120℃20分間
滅菌して、−20℃で保存する。
septicum、Ｓ−６株；以下MGと略記）は、以下の方法で
培養し、調整した。ニワトリPPLO培地（栄研製：牛心臓
浸出液100g、ペプトン10g、塩化ナトリウム5g、ブドウ
糖1g、酢酸タリウム0.25gを水1Lに溶解し、pH7.8とした
もの）に馬血清（濾過滅菌を行なってMGフリーとしたも
の）を12％の割合に添加した培地（以下、馬血清添加培
地とする）で、37℃下、２日間培養した菌液（50ml、菌
数約108CFU/ml、CFU＝Colony Forming Unit）を元培養
菌液とした。本菌液をさらに約2Lの馬血清添加培地（3L
容の３角フラスコ使用）に接種し、37℃で７日間静置培
養を行なった。この培養液を8000rpm、30分間遠心して
上清を捨てた後、沈殿した菌体を生理食塩水で懸濁し
て、16000rpm、20分間遠心を行なった。この操作を３回
繰り返して菌体を洗浄し、最後に100倍に濃縮した菌液
約18ml（２×1010個/ml）を得た。該菌液は120℃20分間
滅菌して、−20℃で保存する。
マイコプラズマの調整（その２） 上記の方法で作成し、100倍に濃縮した菌液を以下の手
順で凍結乾燥した。即ち、MG菌液をガラス瓶（直径3c
m、高さ6cm）に3ml充填した後、凍結乾燥（真空凍結乾
燥機、Freezvac−4c−100S型、東西通商株式会社製を使
用）を行なった。MG菌が入ったサンプル瓶をドライアイ
ス・メタノールで予備凍結（−50℃、約20分）を行なっ
た後、凍結乾燥機に装着し、真空度×10-2torrで約６時
間運転し、サンプルが粉状となったことを確認して、凍
結乾燥を終了した。乾燥済みのサンプルは0.2mg当り109
個のMG菌を含んでいた。
順で凍結乾燥した。即ち、MG菌液をガラス瓶（直径3c
m、高さ6cm）に3ml充填した後、凍結乾燥（真空凍結乾
燥機、Freezvac−4c−100S型、東西通商株式会社製を使
用）を行なった。MG菌が入ったサンプル瓶をドライアイ
ス・メタノールで予備凍結（−50℃、約20分）を行なっ
た後、凍結乾燥機に装着し、真空度×10-2torrで約６時
間運転し、サンプルが粉状となったことを確認して、凍
結乾燥を終了した。乾燥済みのサンプルは0.2mg当り109
個のMG菌を含んでいた。
インターフェロンの調整 マウスに特異性を有するIFNα（180万単位含有）を生理
食塩水に溶解し9mlとし、IFNα溶液（20万単位/ml）を
調整した。
食塩水に溶解し9mlとし、IFNα溶液（20万単位/ml）を
調整した。
マウス遺伝子組換えインターフェロンγ（以下、IFNγ
と略記）は、渡部らによって確立された、ConAで誘導さ
れたＴ細胞の産生株B5株（Y.Watanabe et al,Character
ization of mouse IFNγ form a cloned T cell line,i
n the Biology of the Interferon System,1983（eds.
E.DcMaeyer and H.Schellekens）,p.143〜）からクロー
ニングされたmRNAを用いて得られたものである。1mlの
元の標品には1mgのIFNγ、100μｇのマウス血清アルブ
ミンを含んでいる。この抗ウイルス活性は１×107単位
である。該IFNγ標品0.1mlを生理食塩水に溶解し10mlと
して、IFNγ溶液（10万単位/ml）を調整した。
と略記）は、渡部らによって確立された、ConAで誘導さ
れたＴ細胞の産生株B5株（Y.Watanabe et al,Character
ization of mouse IFNγ form a cloned T cell line,i
n the Biology of the Interferon System,1983（eds.
E.DcMaeyer and H.Schellekens）,p.143〜）からクロー
ニングされたmRNAを用いて得られたものである。1mlの
元の標品には1mgのIFNγ、100μｇのマウス血清アルブ
ミンを含んでいる。この抗ウイルス活性は１×107単位
である。該IFNγ標品0.1mlを生理食塩水に溶解し10mlと
して、IFNγ溶液（10万単位/ml）を調整した。
実験方法と結果 上記の方法で回収したMethA−R1細胞を、４×106個/ml
となるように希釈し、23G針付きの2.5ml注射筒を用いて
Balb/cマウスに１匹当り２×106個を腹腔内に移植す
る。前述のMG菌（調整その１）又はその凍結乾燥品（調
整その２）を１匹当り109個を、あるいは２万単位のIFN
γまたは５万単位のIFNαを、それぞれ単独に投与する
か、あるいはMG菌とインターフェロンを混合して投与す
る。
となるように希釈し、23G針付きの2.5ml注射筒を用いて
Balb/cマウスに１匹当り２×106個を腹腔内に移植す
る。前述のMG菌（調整その１）又はその凍結乾燥品（調
整その２）を１匹当り109個を、あるいは２万単位のIFN
γまたは５万単位のIFNαを、それぞれ単独に投与する
か、あるいはMG菌とインターフェロンを混合して投与す
る。
・MG溶液の調整（その１） 調整その１で得られた菌液（２×1010個/ml）2mlを生理
食塩水で希釈して10ml（４×109個/ml）とする。該MG溶
液を等量の生理食塩水と混合した（１×109個/0.5m
l）。
食塩水で希釈して10ml（４×109個/ml）とする。該MG溶
液を等量の生理食塩水と混合した（１×109個/0.5m
l）。
・MG溶液の調整（その２） 調整その２で得られた菌凍結乾燥品（５×109個/mg）8m
gを生理食塩水で希釈して10ml（４×109個/ml）とす
る。該MG溶液を等量の生理食塩水と混合した（１×109/
0.5ml）。
gを生理食塩水で希釈して10ml（４×109個/ml）とす
る。該MG溶液を等量の生理食塩水と混合した（１×109/
0.5ml）。
・IFN含有MG溶液の調整 上記のIFNの調整で得られたIFNα溶液（20万単位/ml）
またはIFNγ溶液（10万単位/ml）を等量の上記MG溶液
（４×109個/ml）と混合し、IFNα（５万単位/0.5ml）
またはIFNγ（2.5万単位/0.5ml）とMG（１×109個/0.5m
l）を含む溶液を調整した。
またはIFNγ溶液（10万単位/ml）を等量の上記MG溶液
（４×109個/ml）と混合し、IFNα（５万単位/0.5ml）
またはIFNγ（2.5万単位/0.5ml）とMG（１×109個/0.5m
l）を含む溶液を調整した。
・IFN溶液の調整 上記のIFNの調整で得られたIFNα溶液（20万単位/ml）
またはIFNγ溶液（10万単位/ml）を等量の生理食塩水と
混合し、IFNα（５万単位/0.5ml）またはIFNγ（2.5万
単位/0.5ml）を含む溶液を調整した。
またはIFNγ溶液（10万単位/ml）を等量の生理食塩水と
混合し、IFNα（５万単位/0.5ml）またはIFNγ（2.5万
単位/0.5ml）を含む溶液を調整した。
投与は、３日後により隔日毎に、上記のMG及び／又はIF
NγあるいはIFNαを懸濁した液を１匹当り0.5ml、23G針
付きの2.5ml注射筒を用いてマウスの腹腔内に注入し
た。
NγあるいはIFNαを懸濁した液を１匹当り0.5ml、23G針
付きの2.5ml注射筒を用いてマウスの腹腔内に注入し
た。
Balb/cマウスは各群６〜15匹とした。10回目のMG菌又は
インターフェロンの投与を終わった後は、そのまま飼育
を続け、生残状況を観察した。
インターフェロンの投与を終わった後は、そのまま飼育
を続け、生残状況を観察した。
試験終了時（35日）までの生残率と共に、平均生存日数
を計算により求めた。平均生存日数は各個体毎の生存日
数の逆数の算術平均値と偏差値を計算して、さらにその
逆数とした値である。これらの結果を表１に示す。
を計算により求めた。平均生存日数は各個体毎の生存日
数の逆数の算術平均値と偏差値を計算して、さらにその
逆数とした値である。これらの結果を表１に示す。
IFNαの５万単位の投与では充分な効果が得られなかっ
たが、MG109個の投与で、大幅な延命効果が認められ
た。MG菌109個とIFNαの５万単位の同時投与により、MG
の単独投与よりも、さらに著しい延命効果が認められ
た。また、IFNγの2.5万単位投与で、ある程度の延命効
果があり、MGの109個の組合わせで、全例治癒という、
優れた抗腫瘍効果が得られた。
たが、MG109個の投与で、大幅な延命効果が認められ
た。MG菌109個とIFNαの５万単位の同時投与により、MG
の単独投与よりも、さらに著しい延命効果が認められ
た。また、IFNγの2.5万単位投与で、ある程度の延命効
果があり、MGの109個の組合わせで、全例治癒という、
優れた抗腫瘍効果が得られた。
以上の結果より、MG単独投与でも延命効果があり、IFN
α又はIFNγとの組合わせによって、さらに著しい抗腫
瘍効果を示すことが証明された。
α又はIFNγとの組合わせによって、さらに著しい抗腫
瘍効果を示すことが証明された。
実施例２ 癌細胞は実施例１と同じ方法で調整した。マイコプラズ
マは、実施例１に記載した調整（その１）で作成したMG
菌の他に、以下に記載する方法で作成したものを使用し
た。
マは、実施例１に記載した調整（その１）で作成したMG
菌の他に、以下に記載する方法で作成したものを使用し
た。
マイコプラズマの調整（その３） マイコプラズマ・ハイオライニス（Mycoplasma hyorhin
is、BTS−７株、以下MHと略記）をBHL培地（組成は以下
に記載）に約10％の割合（使用した保存菌液はBHL培地
で継代し、−70℃で保存していたもの）に加え、37℃で
３日間培養後、さらに培地で２倍に希釈して培養し菌液
20mlを得た。この菌液を、2000mlのBHL培地（3L容の３
角フラスコを使用）に加え、ゴム栓をして37℃でマグネ
チック・スターラーで撹拌しながら培養した。培養３日
後、8000rpmで30分間冷却遠心して菌体を集め、滅菌PBS
（NaH2PO4・H2O 0.23g、Na2HPO4・12H2O 1.19g、NaCl
8.5g、蒸留水1000ml、pH6.8）で再浮游して15000rpmで2
0分間遠心を行なった。この操作を３回繰り返して洗浄
した後、120℃で20分間蒸気滅菌処理して、−20℃で保
存した。該菌液の濃度は２×1010個/mlである。
is、BTS−７株、以下MHと略記）をBHL培地（組成は以下
に記載）に約10％の割合（使用した保存菌液はBHL培地
で継代し、−70℃で保存していたもの）に加え、37℃で
３日間培養後、さらに培地で２倍に希釈して培養し菌液
20mlを得た。この菌液を、2000mlのBHL培地（3L容の３
角フラスコを使用）に加え、ゴム栓をして37℃でマグネ
チック・スターラーで撹拌しながら培養した。培養３日
後、8000rpmで30分間冷却遠心して菌体を集め、滅菌PBS
（NaH2PO4・H2O 0.23g、Na2HPO4・12H2O 1.19g、NaCl
8.5g、蒸留水1000ml、pH6.8）で再浮游して15000rpmで2
0分間遠心を行なった。この操作を３回繰り返して洗浄
した後、120℃で20分間蒸気滅菌処理して、−20℃で保
存した。該菌液の濃度は２×1010個/mlである。
BHL培地 BHL基礎培地a) 750ml 豚血清b) 100ml 馬血清b) 100ml 25％イースト抽出液c) 50ml ５％炭酸ナトリウムでpH7.8に修正 ａ）BHL基礎培地（115℃、15分オートクレーブで滅菌） ブルセラ・ブロス（Gibco） 11.6g ラクトアルブミン水解物 4.0g 塩類液（×10）＃ 100 ml 蒸留水 1400 ml ｂ）血清（濾過滅菌済みのもの） 豚血清（Flow Lab.） 馬血清（阪大微研） ｃ）イースト抽出液 ドライ・イースト（ニッケン） 500g 蒸留水 1500ml 沸騰水中20分間加熱後、7000〜8000rpmで20分間遠心
し、その上清を４％水酸化ナトリウムでpH7.6とし、濾
過滅菌する ＃ 塩類液（×10） NaCl 80.0g KCl 4.0g Na2HPO4・12H2O 1.2g KH2PO4 0.6g グルコース 20.0g 0.5％フェノール・レッド40.0ml蒸留水で1000mlとし、1
15℃で10分間オートクレーブで滅菌 マイコプラズマの調整（その４） MHあるいはマイコプラズマ・オラーレ（Mycoplasma ora
le）に感染したMethA−R1細胞2.5×105個を10mlの培養
液［RPMI−1640（日水）に10％牛胎児血清（ハイクロー
レ社）を加え、さらに炭酸水素ナトリウムを1Lにつき1.
3g、HEPESを1.2g加えたもの］に懸濁し、プラスチック
シャーレ（直径10cm）に入れ、これを20枚調整する。３
日間培養後、培養液を細胞と共に回収し、1000rpmで５
分間遠心して細胞を除く。さらに、その上清を30000rp
m、30分間超遠心する。上清にはマイコプラズマ由来成
分が、沈渣にはマイコプラズマ菌体が含まれる。沈渣は
さらに生理食塩水で３回洗った後、懸濁し菌体数を数え
て120℃10分間蒸気滅菌をして、−70℃で保存した。該
菌液は1010個/mlの菌体を含む。
し、その上清を４％水酸化ナトリウムでpH7.6とし、濾
過滅菌する ＃ 塩類液（×10） NaCl 80.0g KCl 4.0g Na2HPO4・12H2O 1.2g KH2PO4 0.6g グルコース 20.0g 0.5％フェノール・レッド40.0ml蒸留水で1000mlとし、1
15℃で10分間オートクレーブで滅菌 マイコプラズマの調整（その４） MHあるいはマイコプラズマ・オラーレ（Mycoplasma ora
le）に感染したMethA−R1細胞2.5×105個を10mlの培養
液［RPMI−1640（日水）に10％牛胎児血清（ハイクロー
レ社）を加え、さらに炭酸水素ナトリウムを1Lにつき1.
3g、HEPESを1.2g加えたもの］に懸濁し、プラスチック
シャーレ（直径10cm）に入れ、これを20枚調整する。３
日間培養後、培養液を細胞と共に回収し、1000rpmで５
分間遠心して細胞を除く。さらに、その上清を30000rp
m、30分間超遠心する。上清にはマイコプラズマ由来成
分が、沈渣にはマイコプラズマ菌体が含まれる。沈渣は
さらに生理食塩水で３回洗った後、懸濁し菌体数を数え
て120℃10分間蒸気滅菌をして、−70℃で保存した。該
菌液は1010個/mlの菌体を含む。
実験方法と結果 ４×106個/mlとなるように希釈したMethA−R1細胞を23G
針付注射筒で、Balb/cマウスの腹腔内に、１匹当り２×
106個を移植する。３日後より隔日毎に、MG［調整（そ
の１）］２×108個、あるいはMH［調整（その３）また
は（その４）］２×108個を、23G針付注射筒にて0.5ml
ずつ腹腔内投与し、８日後に腹腔内の全MethA−R1細胞
数を計数した。MGまたはMHの調整は実施例１と同様に生
理食塩水で希釈して調整した。
針付注射筒で、Balb/cマウスの腹腔内に、１匹当り２×
106個を移植する。３日後より隔日毎に、MG［調整（そ
の１）］２×108個、あるいはMH［調整（その３）また
は（その４）］２×108個を、23G針付注射筒にて0.5ml
ずつ腹腔内投与し、８日後に腹腔内の全MethA−R1細胞
数を計数した。MGまたはMHの調整は実施例１と同様に生
理食塩水で希釈して調整した。
MethA−R1細胞の計数 脛動脈を切って放血したマウスの腹腔に、20G針付注射
筒を用いてハンクス液10mlを注入した後、再び同じ注射
筒を用いて可能な限り液を回収し、トーマ血球計算板を
用いて1ml当りの癌細胞数を計数し、ハンクス液10ml中
のマウス腹腔内の全細胞数を算出した。腹水がたまって
いて回収された液が9mlを越えるときには、回収された
量に1mlをプラスし、それにml当りの癌細胞数をかけて
全細胞数とした。結果を表２に示す。８日目の時点では
MG、MHの種に関係なく、また、MHの調整法に関係なく、
マイコプラズマの投与によって有意にMethA−R1細胞の
増殖が抑制された。
筒を用いてハンクス液10mlを注入した後、再び同じ注射
筒を用いて可能な限り液を回収し、トーマ血球計算板を
用いて1ml当りの癌細胞数を計数し、ハンクス液10ml中
のマウス腹腔内の全細胞数を算出した。腹水がたまって
いて回収された液が9mlを越えるときには、回収された
量に1mlをプラスし、それにml当りの癌細胞数をかけて
全細胞数とした。結果を表２に示す。８日目の時点では
MG、MHの種に関係なく、また、MHの調整法に関係なく、
マイコプラズマの投与によって有意にMethA−R1細胞の
増殖が抑制された。
実施例３ 癌細胞（MethA−R1）とIFNαの調整法は実施例１と同様
である。マイコプラズマは実施例２に示したマイコプラ
ズマの調製法（その４）により調整したMHとM.oraleを
用いた。
である。マイコプラズマは実施例２に示したマイコプラ
ズマの調製法（その４）により調整したMHとM.oraleを
用いた。
実験方法と結果 MethA−R1細胞をハンクス液で４×107個/mlに希釈懸濁
し、Balb/cマウスの後足蹠に25μｌ（106個の細胞）ず
つ、100μｌのマイクロシリンジを用いて注射する。３
日後から隔日毎に癌細胞を移植した足蹠に、MH2×10
8個、M.orale2×108個、IFNα１万単位を単独あるいは
組み合わせて27Gマント針付の1ml注射筒で注入した。注
入液量は50μｌである。足蹠の腫張は、ノギス（ダイア
ルキャリパー）で測定した足蹠の厚さで示した。計測は
隔日毎に注射を行なう前に行なった。その結果を第１図
に示す。ここに示したデータは６匹分の足蹠厚の平均値
である。実際のMethA−R1細胞の増殖による固型癌の大
きさは、足蹠厚の約３乗の値に匹敵する。
し、Balb/cマウスの後足蹠に25μｌ（106個の細胞）ず
つ、100μｌのマイクロシリンジを用いて注射する。３
日後から隔日毎に癌細胞を移植した足蹠に、MH2×10
8個、M.orale2×108個、IFNα１万単位を単独あるいは
組み合わせて27Gマント針付の1ml注射筒で注入した。注
入液量は50μｌである。足蹠の腫張は、ノギス（ダイア
ルキャリパー）で測定した足蹠の厚さで示した。計測は
隔日毎に注射を行なう前に行なった。その結果を第１図
に示す。ここに示したデータは６匹分の足蹠厚の平均値
である。実際のMethA−R1細胞の増殖による固型癌の大
きさは、足蹠厚の約３乗の値に匹敵する。
固型癌においても、MH、M.orale共に単独で有効であっ
た。IFNα 1万単位の単独投与でも多少の効果がみられ
た。IFNαとMHまたはM.oraleと組み合わせて投与するこ
とにより、顕著に癌細胞の増殖が抑制された。
た。IFNα 1万単位の単独投与でも多少の効果がみられ
た。IFNαとMHまたはM.oraleと組み合わせて投与するこ
とにより、顕著に癌細胞の増殖が抑制された。
マイコプラズマ・ガリセプチカム（MG）とIFNα併用に
よる安全性 安全性試験は、マウスの尾静脈内接種法を用いて実施し
た。試験方法は、４週令のdds系マウス（雌、体重18〜2
0g）の尾静脈に、MGとIFNαを下記の配合比率で混合し
たものを、１匹当り0.4ml接種した（１群５匹使用）。
接種に用いた注射筒は、1mlの注射器にルアー針1/5静脈
針をセットしたものを使用した。MGとIFNαの配合比率
は次の通りである。
よる安全性 安全性試験は、マウスの尾静脈内接種法を用いて実施し
た。試験方法は、４週令のdds系マウス（雌、体重18〜2
0g）の尾静脈に、MGとIFNαを下記の配合比率で混合し
たものを、１匹当り0.4ml接種した（１群５匹使用）。
接種に用いた注射筒は、1mlの注射器にルアー針1/5静脈
針をセットしたものを使用した。MGとIFNαの配合比率
は次の通りである。
1.MG 0.2mg＋IFNα 5万単位/0.4ml/マウス 2.MG 2mg＋IFNα 50万単位/0.4ml/マウス 3.MG 10mg＋IFNα 250万単位/0.4ml/マウス 4.滅菌生理食塩水0.4ml/マウス MG菌は、凍結乾燥（マイコプラズマの調整（その２）、
109個/0.2mgを含む）したサンプルを滅菌生理食塩水に
溶解して、必要濃度となるように調整して用いた。
109個/0.2mgを含む）したサンプルを滅菌生理食塩水に
溶解して、必要濃度となるように調整して用いた。
結果：各群は、接種後12日目まで死亡するマウス及び副
作用（食欲不振、立毛等）が認められなかった。
作用（食欲不振、立毛等）が認められなかった。
発明の効果 本発明の抗腫瘍剤は、マウスを用いた実験において、著
しい延命効果および癌細胞抑制作用を示し、ヒトおよび
動物に対して有効な抗腫瘍剤である。
しい延命効果および癌細胞抑制作用を示し、ヒトおよび
動物に対して有効な抗腫瘍剤である。
第１図はMethA−R1細胞を移植したマウス足蹠に、IFNお
よび／またはマイコプラズマ菌体処理物を投与した際
の、足蹠厚の変化を示す。
よび／またはマイコプラズマ菌体処理物を投与した際
の、足蹠厚の変化を示す。
Claims (4)
- 【請求項１】マイコプラズマ菌体処理物を有効成分とす
る抗腫瘍剤。 - 【請求項２】該マイコプラズマが、マイコプラズマ・ガ
リセプティクム、マイコプラズマ・ハイオライニスおよ
び／またはマイコプラズマ・オラーレである特許請求の
範囲第１項に記載の抗腫瘍剤。 - 【請求項３】さらにインターフェロンを有効成分として
含む特許請求の範囲第１項に記載の抗腫瘍剤。 - 【請求項４】該インターフェロンがインターフェロンα
および／またはインターフェロンγである特許請求の範
囲第３項に記載の抗腫瘍剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61248122A JPH0761950B2 (ja) | 1986-10-17 | 1986-10-17 | 抗腫瘍剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61248122A JPH0761950B2 (ja) | 1986-10-17 | 1986-10-17 | 抗腫瘍剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63101328A JPS63101328A (ja) | 1988-05-06 |
| JPH0761950B2 true JPH0761950B2 (ja) | 1995-07-05 |
Family
ID=17173557
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61248122A Expired - Lifetime JPH0761950B2 (ja) | 1986-10-17 | 1986-10-17 | 抗腫瘍剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0761950B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002500001A (ja) | 1997-09-10 | 2002-01-08 | ヴァイオン ファーマシューティカルズ、インコーポレーテッド | 低下した毒性を有する遺伝子改変腫瘍標的化細菌 |
| US6080849A (en) | 1997-09-10 | 2000-06-27 | Vion Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified tumor-targeted bacteria with reduced virulence |
| US6962696B1 (en) | 1999-10-04 | 2005-11-08 | Vion Pharmaceuticals Inc. | Compositions and methods for tumor-targeted delivery of effector molecules |
-
1986
- 1986-10-17 JP JP61248122A patent/JPH0761950B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63101328A (ja) | 1988-05-06 |
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