JPH0764750B2 - アルフア−１−プロテイナ−ゼ阻害剤の製造方法 - Google Patents

アルフア−１−プロテイナ−ゼ阻害剤の製造方法

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JPH0764750B2
JPH0764750B2 JP61258702A JP25870286A JPH0764750B2 JP H0764750 B2 JPH0764750 B2 JP H0764750B2 JP 61258702 A JP61258702 A JP 61258702A JP 25870286 A JP25870286 A JP 25870286A JP H0764750 B2 JPH0764750 B2 JP H0764750B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、アルファ−１−プロテイナーゼ阻害剤（alph
a−１−proteinase inhibitor）（PI）を血漿または血
漿分画から分離する新規な方法に関し、なかでもそれを
提供することを目的とする。本発明の他の目的は、以下
の説明から明らかとなるであろう。以下の説明におい
て、部および百分率は、特記しないかぎり、重量によ
る。
アルファ−１−プロテイナーゼ阻害剤は分子量が54,000
の糖蛋白質である。この蛋白質は単一のポリペプトド鎖
から成り、これにいくつかのオリゴ多糖単位が共有結合
している。ヒトPIは内因性セリンプロテイナーゼ類によ
る組織の破壊においてある役割を演ずる。血漿中のトリ
プシン阻害能力の90％に及ぶPIの遺伝的欠損は、肺気腫
の早期の発現に関連することが示された。気腫に関連す
るエラスチンの退化は、弾力線維分解酵素および天然に
存在する組織および血漿のプロテイナーゼ阻害剤類の局
所的アンバランスから生ずる。PIはヒトのパンクレアチ
ンおよび白血球のエラスターゼを急速に阻害する［バイ
オケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コ
ミュニケーションズ（Biochem. Biophys. Res. Com
m.）、Vol.72、No.1、33−39ページ;ibid.、Vol.88、N
o.2、346−350、1979］。
ある数の方法が血漿からPIを単離するために使用されて
きている。これらの方法の大部分は実験的規模の単離に
向けられたいるが、他の方法は商業的水準の生産に関連
する。
パンネル（Pannel）ら、バイオケミストリー（Biochemi
stry）、Vol.13、5439−5445ページ、（1974）は、アル
ブミンに劣った血漿をプールし、そして固体の硫酸アン
モニウム（0.60〜0.80の飽和）で分別する方法を用い
た。生ずる沈殿を可溶化し、透析し、そしてDEAE−セル
ロースのカラムに適用した。0.05〜0.15モルのNaClの直
線の勾配中に溶離されるPIの分画をプールし、濃縮し、
透析し、次いで再びDEAE−セルロースのカラムに適用し
た。0.05〜0.20モルのNaClの直線の勾配中に溶離される
PIの分画を集め、プールし、そして濃縮してPIを得た。
サクラトバラ（Saklatvala）ら、バイオケミカル・ジャ
ーナル（Biochem. J.）、Vol.157、339−351ページ（1
976）の方法において、ヒト血漿を硫酸アンモニウム（8
0％の飽和）で分別して沈殿を形成し、これを溶解し、
透析し、そしてDEAE−セルロースのクロマトグラフィー
にかけた。0.5モルのNaClの抽出液をコンカナバリンＡ
−セファロース（Sepharose）カラムに適用した。アル
ファ−Ｄ−メチルグルコピラノシドの溶離液を濃縮し、
そして再びDEAE−セルロースカラムに適用した。0.0〜
0.2モルのNaCl溶離液はPIを含有した。
ムシアニ（Musiani）ら、バイオケミストリー（Bioche
m.）、Vol.15、798−804ページ（1976）は50％の飽和硫
酸アンモニウムの沈殿法を使用して、PIに富んだ分画を
分離し、これを可溶化し、次いでDEADイオン交換体、コ
ンカナバリンＡ−セファロース、セファデックス（Seph
adex）Ｇ−100、および免疫吸着性カラムを使用する連
続的クロマトグラフィー工程にかけて精製されたPIを得
た。
ヒト血漿からの大規模の精製はクレス（Kress）ら、プ
レパレイティブ・バイオケミストリー（Preparative B
iochemistry）、Vol.3、No.6、541−552（1973）に開示
された。ヒト血漿の80％の硫酸アンモニウム処理からの
沈殿を透析し、そしてDEAE−セルロースのクロマトグラ
フィーにかけた。得られた濃縮物を再び透析し、そして
セラデックスＧ−100カラムでゲル濾過した。PI含有分
画をDE−52セルロースのクロマトグラフィーに２回かけ
てPIを得た。
グレイザー（Graser）ら、ibid.、Vol.5、No.4、333−3
48ページ（1975）はPIをコーンフラクションIV−１から
30％の全体の収率で単離した。溶解したIV−１をDEAE−
セルロース、QAE−セファデックス、コンカナバリンＡ
−セファロース、およびGI−150セファデックスのクロ
マトグラフィーにかけた。
ポリエチレングリコール（PEG）に基づく統合された血
漿分画系は、ハオ（Hao）ら、プロシーディング・オブ
・ジ・インタナショナル・ワークショップ・オン・テク
ノロジー・フォー・プロテイン・セパレイション・アン
ド・インプルーメント・オブ・ブラッド・プラズマ・フ
ラクショネイション（Proceeding of the Internati
onal Workshop on Technology for Protein Sepa
ration and Improvement of Blood Plasma Fract
ination）、1977年９月７−９日開催、米国バージニア
州レストン、により開示された。発表された方法におい
て、コーン低温沈殿（Cohn cyoprecipitate）を40g/l
の量のPEGと混合した。すべての作業は５℃において実
施された。
60分間撹拌した後、第１分画を遠心により除去した。追
加の60g/lのPEGを上澄みに添加した（最終濃度ほぼ10
％）。次いで、プロトロンビン複合体（PTC）を10％のP
EG上澄みからバッチ式にDEAE−セルロース上に吸着させ
ることによって抽出し、そして追加の100g/lのPEGを添
加して10〜20％のPEG沈殿を得た。このようにして得ら
れた４つの分画は０〜４％のPEG沈殿、４〜10％のPEG沈
殿、10〜20％のPEG沈殿および20％のPEG上澄みであり、
そして分画Ａ、Ｂ、ＣおよびＤと表示された。これらの
PEG濃度は低温上澄み（cryosupernate）のもとの体積に
基づくことを指摘すべきである。
４つのPEG分画中の蛋白質類の分布は次の通りであっ
た：フィブリノゲンは分画Ａ中の主要蛋白質であり、そ
してアルブミンは主要な汚染物質であった。分画Ａ、Ｂ
およびＣ中の汚染アルブミンの大部分は、アルブミン自
体がこれらの条件下で沈殿しないので、共沈および／ま
たは上澄みの連行から由来した。分画Ｂはプラスミノゲ
ン、補体のC3成分、IgGおよびIgMに富んでいた。さら
に、ベーター脂蛋白質の事実上全部はこの分画中に存在
した。分画Ｃは感知しうる量のアルファ２マクログロブ
リン、IgAを含有し、そしてプロトロンビンといわゆる
プロトロンビン複合体を構成する他の凝固因子とに富ん
でいた。しかしながら、著者が発見したところによる
と、PTCのよりすぐれた収率は10〜20％のPEG沈殿からよ
りはむしろ10％のPEG上澄みから得ることができた。分
画Ｄはアルムビンが主要比率を占めたが、またアルファ
−１−酸糖蛋白質のすべてならびにPI、抗トロンビンII
I（AT III）、セルロプラスミン（Cp）、ハプトグロビ
ン、トランスフェリン（Tf）およびClエラスターゼ阻害
剤（Cl阻害剤）の大部分を含有した。いく種類かの追加
の蛋白質類、例えば、プレアルブミン（PA）、レチノー
ル結合性蛋白質（RBP）、トランスコルチンおよびアン
ギオテンシノゲンも分画Ｄから単離された。一般に、よ
り小さい蛋白質類の大部分は分画Ｄ中に存在した。
コアン（Coan）およびブロックウェイ（Btockway）、米
国特許第4,379,087号および同第4,439,358号は、血漿分
画、例えば、コーンフラクションIV−１からアルファ−
１−プロテイナーゼ阻害剤を分離する方法を開示してお
り、この方法において、血漿の水溶液を準備し、この溶
液を約6.5〜8.5のpHおよび約２〜50℃の温度に約0.2〜
４時間の間保持し、この溶液をある量のポリ縮合ポリグ
リコール、例えば、溶液の容積に基づいて、約８−10％
〜約23％（w/v）の範囲の量のポリエチレングリコール
と約4.6〜約7.5の範囲のpHにおいて混合し、ここでポリ
縮合ポリグリコールの量をpHの0.5の増加につき約２〜
３％で増加する。好ましい実施態様において、特許され
た方法において、コーンフラクションIV−１を含有する
水溶液の100mlにつき約10〜15gのポリ縮合ポリグリコー
ルをpH4.6〜5.7において使用し、ポリ縮合ポリグリコー
ルの部対血漿分画の部の比は約2:1〜1:1である。アルフ
ァ−１−プロテイナーゼ阻害剤は、生じた混合物をポリ
縮合ポリグリコール処理から遠心分離し、そして上澄み
溶液から回収し、得られた上澄み溶液をアニオン交換樹
脂とpH約5.5〜8.6において接触させ、そしてアルファ−
１−プロテイナーゼ阻害剤をアニオン交換樹脂から選択
的に溶離することによって、得られた混合物から分離さ
れる。あるいは、アルファ−１−プロテイナーゼ阻害剤
は、混合物を遠心分離した後、ポリ縮合ポリグリコール
をさらに添加してアルファ−１−プロテイナーゼ阻害剤
を混合物から沈殿させることによって分離することがで
きる。
本発明は、アルファ−１−プロテイナーゼ阻害剤（文献
中で「アルファ−１抗トリプシン」としてまた知られて
いる）を分離する新規な方法、ことに従来未知の源から
従来開示されているものよりも高い収率でかつ高い純度
でアルファ−１−プロテイナーゼ阻害剤を分離する新規
な方法に関する。
ここに記載する発明は、工程： （ａ）アルファ−１−プロイテナーゼ阻害剤を含有する
血漿蛋白質の水溶液を透析濾過（diafiltration）およ
びゲル濾過から選択される少なくとも１つの手段により
処理して、前記溶液中の塩類の濃度を低下させ、 （ｂ）上の工程（ａ）において得られた溶液を前記溶液
中のアルファ−１−プロイテナーゼ阻害剤に対して選択
的親和性を有するアニオン交換樹脂と接触させて、前記
樹脂にアルファ−１−プロイテナーゼ阻害剤を選択的に
結合させかつ前記樹脂に結合しない血漿蛋白質類を前記
樹脂を通して第１溶離液中に溶離し、 （ｃ）工程（ｂ）から得られたアルファ−１−プロイテ
ナーゼ阻害剤を選択的に結合して有するアニオン交換樹
脂を、アルファ−１−プロイテナーゼ阻害剤を前記樹脂
から第２溶離液中に置換するために十分なイオン強度を
有する溶離剤と接触させ、そして （ｄ）工程（ｃ）から得られた前記第２溶離液からアル
ファ−１−プロイテナーゼ阻害剤を回収する、 を含んでなることを特徴とするアルファ−１−プロイテ
ナーゼ阻害剤を含有する血漿蛋白質の水溶液からアルフ
ァ−１−プロイテナーゼ阻害剤を分離する方法である。
本発明による方法におけるアルファ−１−プロテイナー
ゼ阻害剤の新規な源は、コーンエフルエント（Cohn Ef
fluent）II＋III、コーンエフルエントＩおよび低温上
澄み溶液（cryosupernatant solution）から成る群よ
り選択されるアルファ−１−プロイテナーゼ阻害剤を含
有する血漿蛋白質の水溶液である。
本発明による方法の主要な利点は、先行技術において報
告された多くの方法により得られたPIの収率と比較した
とき、血漿中のPIの合計量からの収率で表わして、PIの
回収率が高いということである。
他の利点は本発明による方法により得られるPIの純度が
高いことであり、この方法によれば、先行技術の方法に
おいてPIと一緒に不必要な汚染物質として頻繁に回収さ
れる他の血漿蛋白質類の分離が増大される。
前述のように、本発明による方法の出発物質はアルファ
−１−プロイテナーゼ阻害剤を含有する血漿蛋白質の水
溶液である。好ましくは、PIを含有する水溶液はコーン
エフルエントII＋III、コーンエフルエントＩおよび低
温上澄み溶液から成る群より選択される。コーンエフル
エントII＋IIIおよびコーンエフルエントＩは、コーン
エタノール分画技術またはその変法に従い血漿を分画す
るおとによって得ることができる。例えば、E.J.コーン
（Cohn）ら、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル
・ソサイアティ（J. Amer. Chem. Soc.）、68、459
（1946）;E.J.コーン（Cohn）、米国特許第2,390,074
号；オンクレイ（Oncley）ら、ジャーナル・オブ・アメ
リカン・ケミカル・ソサイアティ（J. Amer. Chem.
Soc.）、71、541（1974）；および「血漿蛋白質類（The
Plasma Proteins）」第２版、Vol.III、548−550ペ
ージ、アカデミック・プレス（Academic Press）、ニ
ューヨーク州ニューヨーク（1975）参照。低温上澄み溶
液は、新鮮な凍結血漿を５℃以下において融解し、残留
する沈殿［「低温沈殿（cryoprecipitate）」と呼ぶ」
を慣用の手段により、通常遠心分離により除去し、そし
て上澄み溶液（「低温上澄み溶液」）を本発明による方
法における使用のため保持することによって得ることが
できる。例えば、ミトラ（Mitra）ら、米国特許第4,30
6,068号参照。より好ましくは、出発物質として使用す
るPI含有水溶液はコーンエフルエントII＋IIIおよびコ
ーンエフルエントＩから選択される。最も好ましくは、
出発PI含有水溶液はコーンエフルエントII＋IIIであ
る。
前述のように、本発明による方法における第１工程はPI
含有血漿蛋白質の出発水溶液を処理してこの溶液のイオ
ン強度を低下させること、すなわち、この水溶液中の塩
類を除去することであり、これによりPIはアニオン交換
樹脂に結合するであろう。好ましくは、出発水溶液中の
塩類の濃度は、約0.02M以下、より好ましくは約0.01M以
下に低下させるべきであり、そして水溶液を透析濾過ま
たはゲル濾過することにより、低下させることができ
る。最も好ましくは、水溶液を透析濾過してその中の塩
類の濃度を低下させる。典型的には、出発水溶液をアミ
コン（Amicon ）セル中で慣用の技術に従い透析濾過す
る。一般に、第１工程は約２〜10℃の温度および約6.0
〜7.0のpHにおいて実施する。典型的は条件は５℃およ
びpH6.5である。
出発水溶液がコーン分画技術により得られる血漿分画を
含有するとき、それはコーンエフルエントII＋IIIまた
はコーンエフルエントＩであり、好ましくはその溶液は
初期の追加の工程において処理してそれを濃縮しかつコ
ーン分画技術を使用することによりその溶液中に含有さ
れるアルコールを除去する。コーンエフルエントII＋II
IまたはコーンエフルエントＩの水溶液をそのように濃
縮しかつその中のアルコールの実質的にすべてを除去す
る１つの好ましい技術は、その水溶液を限外濾過するこ
とである。この限外濾過における温度およびpHの条件は
一般に前述の透析濾過について記載したものと同一であ
り、ここで限外濾過膜はロミコン（Romicon ）PM−10
膜である。
本発明による方法の第２工程は、塩濃度を低下させおよ
び必要に応じてアルコール濃度を低下させた溶液を、こ
の溶液中のPIに対して選択的親和性を有するアニオン交
換樹脂と接触させて、PIをこの樹脂に選択的に結合させ
かつこの樹脂に結合しない血漿蛋白質をこの樹脂を通し
て第１溶離液中に溶離させることである。アニオン交換
樹脂に結合しない血漿蛋白質類はPIを含有する組成物中
の成分として不必要であるが、第１溶離液は一般に廃棄
せず、むしろ、再処理してPIが意図されない用途以外の
他の治療または予防の用途を有する血漿蛋白質を単離す
る。任意のアニオン交換樹脂を使用できるが、一般に第
２工程において使用するために、アニオン交換樹脂はポ
リガラクトース、ポリデキストランおよびセルロースの
樹脂の群から選択される多糖類吸着剤であり、ここで多
糖類の鎖は多糖類の鎖のグルコース単位へエーテル結合
により取り付けられたジエチルアミノエチル基および第
四エチル基から選択される正に帯電した基を有する。第
２工程においてアニオン交換樹脂として有用な適当な多
糖類吸着剤は、DEAE−セファロース（Sepharose）、DEA
E−セファデックス（Sephadex）、DEAE−セルロースお
よびQAE−セファデックス［ファーマシア・ファイン・
ケミカルス（Pharmacia Fine Chemicals）、米国ニュ
ージャージイ州ピスカタウェイ］などのように商業的に
入手可能な樹脂を包含する。この工程は一般に約２〜10
℃およびpH6.0〜7.0、典型的には約５℃およびpH6.5に
おいて実施する。出発の水溶液および洗浄溶液中の塩類
の濃度は約0.02モルまで、好ましくは約0.01モルまでで
あるべきである。
第１工程からの溶液はアニオン交換樹脂と任意の適当な
方法、例えば、塊状法およびカラムクロマトグラフィー
法により接触させることができるが、カラムクロマトグ
ラフィー法の使用は一派にいっそう便利である。
出発水溶液中のPIがアニオン交換樹脂との接触およびそ
れへの結合により溶液から吸着されかつこの溶液中に存
在する他の血漿蛋白質類が樹脂を通して溶離されかつ樹
脂が慣用の技術により洗浄された後、第２工程（ｂ）か
ら得られたアルファ−１−プロテイナーゼ阻害剤を選択
的に結合して有するアニオン交換樹脂を、アルファ−１
−プロテイナーゼ阻害剤を前記樹脂から第２溶離液中に
置換するために十分なイオン強度を有する溶離剤と接触
させる。広義には、アルファ−１−プロテイナーゼ阻害
剤をアニオン交換樹脂から置換するために十分なイオン
強度を有する溶離剤は、約0.02M〜約0.3Mモルの範囲の
濃度および約5.5〜約8.6の範囲のpHを有する水溶性無機
塩および水溶性有機塩から成る群より選択される少なく
とも１種の構成員を含有する水性緩衝溶液である。より
好ましくは、本発明による方法の第３工程（ｃ）におい
て使用する溶離剤は無機塩の水溶液である。より好まし
くは、この工程において使用する溶離剤を約0.02M〜約
0.1Mの範囲の濃度を有し、そしてpH約6.0〜約7.0であろ
う。一般に、この工程の間の温度は約２〜10℃、典型的
には５℃である。
本発明による方法における最終工程は、前述の第３工程
において得られた第２溶離液からPIを比較的高い収率で
回収することである。これはいくつかの手段の１つによ
って達成することができる。好ましくは、第２溶離液か
らPIを回収するために有用な技術はポリエチレングリコ
ール（PEG）およびポリプロピレングリコール（PPG）か
ら選択されるポリ縮合ポリアルキレングリコールと接触
させることによる。いずれを使用することもできるが、
入手容易性（例えば、ユニオン・カーバイド・コーポレ
ーションから）の理由で、PEGは好ましい。このPEGは約
200〜20,000、好ましくは約2,000〜10,000、より好まし
くは約3,000〜8,000、最も好ましくは約3,000〜約4,000
の分子量を有することができる。
こうして、アルファ−１−プロテイナーゼ阻害剤は、
（１）まず第２溶離液を、第２溶離液の容積に基づい
て、約10％〜約20％（w/v）のポリ縮合ポリアルキレン
グリコールと約4.6〜5.7の範囲のpHおよび約２℃〜約10
℃の温度において約１分〜約１時間の間接触させ、そし
て生ずる沈殿を分離しかつ生ずる上澄み溶液を保持し、
次いで（２）保持された上澄み溶液を、第２溶離液の容
積に基づいて、約８〜約15w/v％の追加のポリ縮合ポリ
アルキレングリコールと約4.6〜5.7の範囲のpHおよび約
２℃〜約10℃の温度において約１分〜約１時間の間接触
させ、そしてアルファ−１−プロイテナーゼ阻害剤を含
有する得られた沈殿を保持することによって、第２溶離
液から回収することができる。
あるいは、上の第１ポリアルキレングリコールの添加か
ら保持された上澄み溶液を追加のポリアルキレングリコ
ールと接触させる代わりに、得られる保持された上澄み
溶液または緩衝溶液中で再構成された生ずるPI含有沈殿
の溶液を、アルファ−１−プロテイナーゼ阻害剤に対す
る親和性を有するアニオン交換樹脂と接触させ、次いで
アルファ−１−プロテイナーゼ阻害剤を置換するために
十分なイオン強度を有する溶離剤とアニオン交換樹脂を
接触させてアルファ−１−プロテイナーゼ阻害剤を含有
する生ずる第３溶離液を得ることによって、アルファ−
１−プロテイナーゼ阻害剤をアニオン交換樹脂から溶離
することができる。この別法に従い、本発明により第２
工程（ｂ）においてアニオン交換樹脂にPIを吸着させそ
してそれをアニオン交換樹脂から溶離することに関して
前述したアニオン交換樹脂および条件を使用することが
できる。
もちろん、追加のポリアルキレングリコール沈殿からの
PI含有沈殿を適当な緩衝溶液中に溶解し、次いでこれを
別のアニオン交換樹脂処理に付すことができる。
先行技術は、普通の血漿蛋白質沈殿剤および親和クロマ
トグラフィー技術を単独であるいは特定の組み合わせで
使用して、コーンフラクションIV−１および低温沈殿を
含む血漿分画を処理することによってPIを単離すること
を開示しているが、本発明による方法は従来未知の源お
よび同様によく既知の源からPIを高い収率でかつ高い純
度で得る手段を提供する。
こうして、本発明の他の面は、工程： （ｉ）アルファ−１−プロイテナーゼ阻害剤を含有する
血漿分画の水溶液を、前記水溶液の容積に基づいて、約
10％〜約35％（w/v）のポリ縮合ポリアルキレングリコ
ールと約4.6〜5.7の範囲のpHおよび約２℃〜約10℃の温
度において約１〜24時間の間接触させて、水溶液からア
ルファ−１−プロイテナーゼ阻害剤を沈殿させないで不
必要な蛋白質類を選択的に沈殿させ、そして （ii）工程（ｉ）において得られた溶液からアルファ−
１−プロイテナーゼ阻害剤を分離する、 を含んでなるアアルファ−１−プロイテナーゼ阻害剤を
含有する血漿分画の水溶液からアルファ−１−プロイテ
ナーゼ阻害剤を分離する方法において、 （ａ）血漿蛋白質の水溶液を処理して、その中の血漿蛋
白質を濃縮し、出発水溶液中に存在する実質的にすべて
の水溶性血漿蛋白質沈殿剤を除去し、そして水溶液のイ
オン強度を低下させ、 （ｂ）工程（ａ）からの溶液をアルファ−１−プロイテ
ナーゼ阻害剤に対して選択的親和性を有するアニオン交
換樹脂と接触させて、前記樹脂にアルファ−１−プロイ
テナーゼ阻害剤を選択的に結合させかつ前記樹脂に結合
しない血漿蛋白質類を前記樹脂を通して第１溶離液中に
溶離し、 （ｃ）工程（ｂ）から得られたアルファ−１−プロイテ
ナーゼ阻害剤を選択的に結合して有するアニオン交換樹
脂を、アルファ−１−プロイテナーゼ阻害剤を前記樹脂
から第２溶離液中に置換するために十分なイオン強度を
有する溶離剤と接触させる、 を含んでなり、 前記第２溶離液は上の工程（ｉ）および（ii）に従い処
理された水溶液からなる、 ことを特徴とする方法である。
前述の他の面において、PIを含有する血漿蛋白質の好ま
しい出発水溶液はコーンエフルエントII＋IIIおよびコ
ーンエフルエントＩから成る群より選択される。また、
工程（ａ）および（ｂ）を実施するための条件は同一工
程について説明したものと同一である。
沈殿として得られかつ緩衝溶液中で再構成されたものと
として、あるいはその溶液または濃厚物として、本発明
に従う方法により得られたPIは、治療、診断または他の
用途のためにプロテアーゼ阻害有効量のPIおよび製薬学
的に許容されうる担体を含有する製薬学的製剤に配合す
ることができる。それを静脈内投与のために調製するた
めに、組成物は生理学的に許容されうる物質、例えば、
塩化ナトウム、グリシンなどを含有しかつ生理学的条件
と適合する緩衝化pHを有する水中に溶解される。一般
に、静脈内に投与される組成物のためのガイドラインは
政府の条例により確立されている。
PIの濃厚物は伝染性微生物、例えば、肝炎およびエイズ
（AIDS）のウイルスに関して非伝染性であることが望ま
しい。これに関して、この濃厚物を処理してこのような
微生物を不活性化しかつそれに対する伝染性を減少する
ことができる。これは、例えば、次の手段の１または２
以上により達成することができる：滅菌濾過、紫外線照
射、化学的ウイルス不活性化剤による処理、凍結乾燥さ
れた状態における熱処理（例えば、60〜85℃）、または
「低温殺菌」、すなわち、PI含有溶液をPI間塩を非伝染
性とするために十分な温度および時間、例えば、約60℃
以上および約10時間までの期間における加熱。この低温
殺菌の間PIを安定化するために、クエン酸イオン源を加
熱の間PIを安定化するために十分な量で添加する。一般
に、合計約20mgの蛋白質がPI濃厚物中に存在する場合、
この溶液を約0.25〜0.5Mのクエン酸イオン濃度にする。
この加熱工程の間の混合物のpHは好ましくは約6.0〜7.0
であるべきである。
加熱の間にPIを最高に安定化するために、炭水化物を安
定剤として単独であるいはクエン酸ナトリウムと組み合
わせて使用することが望ましい。この目的で、炭水化物
として、単糖類、二糖類および三糖類、例えば、アラビ
ノース、グルコース、ガラクトース、マルトース、フル
クトース、リボース、マンノース、ラムノース、スクロ
ースなど、あるいは糖アルコール、例えば、ソルビトー
ルおよびマンニトールをPI溶液1mlにつき約0.5〜2.4gの
量で使用することができる。
前述のように、本発明の低温殺菌された生成物は治療の
目的に使用できる製薬学的調製物中に混入することがで
きる。しかしながら、「製薬学的調製物」という用語
は、ここではより広い意味に用いて、治療の目的ばかり
でははなく、かつまたこの分野において知られている試
薬または診断の目的にあるいは組織培養のために使用さ
れる、本発明に従う蛋白質組成物を含有する調製物を包
含することを意図する。治療の用途を意図する製薬学的
調製物は、治療学的量、すなわち、予防的または治療的
健康手段のために必要なプロテアーゼ阻害量のPIを含有
すべきである。製薬学的調製物を試薬または診断剤とし
て使用するとき、それは試薬または診断の量のPIを含有
すべきである。
実施例 本発明を次の例示的実施例によりさらに説明する。
コーンエフルエントII＋IIIおよびコーンエフルエント
Ｉは、前述のコーン分画技術に従う分画により得た。
アッセイ PIは、エラスターゼについての発色性基質を使用して、
そのエラスターゼ阻害能力により推定する。エラスター
ゼによりＮ−スクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル
−Ｌ−アラニル−ｐ−ニトロアニリド（SA3pNA）が加水
分解されると、405nmにおける吸収が増加する。この増
加を通常37℃において連続的に監視する。試料（PI）の
存在下および不存在下において得られた時間経過の吸収
の直線変化を比較する。次いで、阻害剤の量をエラスタ
ーゼおよびPIの既知の分子量、既知の1:1の化学量論お
よびエラスターゼの既知の使用量に基づいて計算する。
PIは、また、同様な方法でそのトリプシン阻害能力によ
り推定することができる。
実施例１ この実施例は、本発明による方法における最初の３つの
工程、すなわち、（ａ）コーンエフルエントII＋IIIの
溶液の塩類の濃度の低下、（ｂ）工程（ａ）からのPI含
有溶液とアニオン交換樹脂との接触、および（ｃ）前記
樹脂からのPIの選択的溶離、を例示する。
コーンエフルエントII＋IIIを、５倍容積の0.02Mのリン
酸ナトリウム緩衝溶液に対してpH6.5および５℃の温度
において透析濾過した。
下表Ｉに記載する変化量のコーンエフルエントII＋III
の各々を、0.02Mのリン酸ナトリウム緩衝溶液で平衡化
した一定量のDEAE−セファロース（Sepharose ）CL6B
ファスト・フロー（Fast Flow）（ファーマシア・ファ
イン・ケミカル・リミテッド）を含有するカラムにpH6.
5、５℃において適用した。このカラムを１容積の0.02M
のリン酸ナトリウム緩衝溶液でpH6.5、５℃において洗
浄した後、0.02Mのリン酸ナトリウム緩衝溶離液を他の
処理のために廃棄した。
次いで、このカラムを0.05Mのリン酸ナトリウム緩衝溶
液でpH6.5、５℃において溶離して、DEAE−セファロー
ス（Sepharose ）CL6B樹脂へ結合した出発コーンエフ
ルエントII＋III中に含有されるPIを置換した。
下表Ｉは前述の実験における７つの試薬からのデータを
要約する。DEAE−セファロース（Sepharose ）CL6Bへ
のPIの適用量を、280nmにおける試料の吸収×容積（m
l）/mlDEAEにより表わす。生成物の収率（％）は、前述
の第２溶離液中のPIの量÷出発コーンエフルエントII＋
III中のPIの量×100により決定した。相対純度は、溶離
液中の蛋白質の合計量につき前述のアッセイ手順により
決定した第２の前述のPI含有溶離液中の阻害剤の量であ
る。
実施例２ この実施例は、本発明による方法における最初の３つの
工程、すなわち、（ａ）コーンエフルエントII＋IIIの
溶液の塩類のイオン強度の低下、（ｂ）工程（ａ）から
のPI含有溶液とアニオン交換樹脂との接触、および
（ｃ）前記樹脂からのPIの選択的溶離、を例示する。
この実施例において、固定量のコーンエフルエントII＋
III、230A280単位/mlDEAEを0.02モルのリン酸ナトリウ
ム緩衝溶液で平衡化した一定量のDEAE−セファロース
（Sepharose ）CL6Bファスト・フロー（Fast Flow）
（100gの樹脂/100mlの緩衝溶液）を含有するカラムにpH
6.5、５℃において適用した。このカラムを１容積の0.0
2モルのリン酸ナトリウム緩衝溶液でpH6.5、５℃におい
て洗浄した後、0.02Mのリン酸ナトリウム緩衝溶離液を
他の処理のために廃棄した。
次いで、このカラムを0.05Mのリン酸ナトリウム緩衝溶
液でpH6.5、５℃において溶離して、DEAE−セファロー
ス（Sepharose）CL6B樹脂へ結合した出発コーンエフル
エントII＋III中に含有されるPIを置換した。
下表Ｉは前述の実験のデータを要約する。収率（％）お
よび相対純度は実施例１におけるようにして決定した。
実施例３ この実施例は、本発明による方法における第３工程にお
ける樹脂からPIを選択的に置換して得られた溶離液から
PIを回収する、本発明による方法の第４工程を例示す
る。
PIを結合して有するDEAE−セファロースCL6Bカラムを溶
離することによって得られた工程（ｃ）からの溶離液の
プールを、６つの等しい部分に分割した。各部分に、溶
液中に20％（w/v）のPEGを供給するために十分な量でPE
G3350（ユニオン・カーバイド・コーポレーション）を
添加した。pHを下表IIIに記載するように調節し、温度
を５℃に保持し、そしてこの混合物を約１時間撹拌し、
次いで遠心した。
透明の上澄み溶液をPI活性についてアッセイした。この
実験の結果を表IIIに要約し、ここで収率（％）および
相対純度は実施例１に記載するようにして決定した。
実施例４ この実施例は、実施例３におけるような本発明による方
法の第４工程を例示する。
実施例３におけるようにして得られたPIをを含有する工
程（ｃ）からの溶離液のプールを６つの等しい部分に分
割し、そしてDEAE−溶離液のもとの容積に基づいて11.5
％（w/v）になるようにPEG 3350を添加した。pHおよび
温度をpH6.5および５℃に調節し、この混合物を約１時
間撹拌し、次いで遠心した。透明の上澄み溶液をPI活性
についてアッセイした。この実験の結果を表IVに要約
し、ここで収率（％）および相対純度は実施例１に記載
するようにして決定した。
実施例５ この実施例は、本発明による方法の第４工程におけるPI
のそれ以上の精製を例示する。
PIを含有するカラム溶離液を実施例３に記載するように
して得て、6.0に調節したpHにおいて20％（w/v）のPEG
3350を含有するPI含有上澄み溶液を形成した。この上
澄み溶液を５つの等しい部分に分割し、そして各部分に
下表Ｖに記載する増分でPEGの追加の部分を添加した。P
IはPEG含有上澄み溶液から沈殿した。このPIを緩衝溶液
中で再構成し、そしてPI活性についてアッセイした。こ
の実験の結果を下表Ｖに記載し、ここで収率（％）は再
構成した溶液のPI活性を出発上澄み溶液のPI活性で割っ
た値に100を掛けることによって決定した。
実施例６ この実施例は、実施例５に記載するようなPIのそれ以上
の精製を例示するが、ただし、この実施例において、実
施例３に記載するようにして得られたカラムの溶離液の
２つの部分をアッセイしてカラムの溶離液中のPIの相対
純度を決定した。次いで、PIをカラムの溶離液から上の
実施例に記載するような２工程のPEG 335−の添加（20
％＋10％、w/v）により分離し、そして得られるPIの沈
殿を緩衝溶液中で再構成し、そしてPI活性をアッセイし
た。結果を下表VIに記載する。
実施例７ この実施例は、実施例５および実施例６に記載するよう
にして得られたPIのDEAE置換多糖類の樹脂のクロマトグ
ラフィー、すなわち、DEAEアニオン交換樹脂のクロマト
グラフィーによるなおそれ以上の精製を例示する。カラ
ム上のDEAE−セファロースCL6Bファスト・フロー樹脂
（二重反復試験で）を0.02Mのリン酸ナトリウム緩衝溶
液でpH6.5において平衡化し、そして実施例５および実
施例６に従い得られたPI含有沈殿をこのカラムに適用し
た。カラムを１容積の緩衝溶液で洗浄した後、このアニ
オン交換樹脂に結合したPIを0.02モルのリン酸ナトリウ
ム緩衝溶液pH6.5でその樹脂から溶離した。この実施例
の結果を下表７に記載する。
実施例８ 実質的に実施例１に記載するのと同一の手順を反復した
が、ただしコーンエフルエントII＋IIIの代わりにコー
ンエフルエントＩを使用した。
コーンエフルエントＩを５容積の0.02Mのリン酸ナトリ
ウム緩衝溶液に対してpH6.5および５℃の温度において
透析濾過した。
この透析濾過したコーンエフルエントＩを、0.02Mのリ
ン酸ナトリウム緩衝溶液でpH6.5、５℃において平衡化
したDEAE−セファロースCL6Bファスト・フロー樹脂を含
有するカラムに適用した。このカラムを１容積の0.02モ
ルのリン酸ナトリウム緩衝溶液でpH6.5、５℃において
洗浄した後、緩衝溶離液を他の処理のために廃棄した。
次いで、このカラムを0.075Mのリン酸ナトリウム緩衝溶
液でpH6.5、５℃において溶離して、DEAE−セファロー
スCL6B樹脂へ結合した出発コーンエフルエントＩ中に含
有されたPIを置換した。
PIは出発コーンエフルエントＩに関して30倍の純度で得
られた溶離液中に回収された。

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ａ） アルフア−１−プロテイナーゼ阻
    害剤を含有する血漿蛋白質の水溶液を透析濾過およびゲ
    ル濾過から選択される少なくとも１つの手段により処理
    して、該溶液中の塩類の濃度を0.02M以下に低下させ、 （ｂ） 工程（ａ）から得られた溶液を該溶液中のアル
    フア−１−プロテイナーゼ阻害剤に対して選択的親和性
    を有するアニオン交換樹脂と接触させて、該樹脂にアル
    フア−１−プロテイナーゼ阻害剤を選択的に結合させか
    つ該樹脂に結合しない血漿蛋白質類を該樹脂を通して第
    １溶離液中に溶離し、 （ｃ） 工程（ｂ）から得られたアルフア−１−プロテ
    イナーゼ阻害剤を選択的に結合しているアニオン交換樹
    脂を、アルフア−１−プロテイナーゼ阻害剤を該樹脂か
    ら第２溶離液中に置換するために十分なイオン強度を有
    する溶離剤と接触させ、そして （ｄ） 工程（ｃ）から得られた該第２溶離液からアル
    フア−１−プロテイナーゼ阻害剤を回収する、 工程を含んでなることを特徴とするアルフア−１−プロ
    テイナーゼ阻害剤を含有する血漿蛋白質の水溶液からア
    ルフア−１−プロテイナーゼ阻害剤を分離する方法。
  2. 【請求項２】アルフア−１−プロテイナーゼ阻害剤を含
    有する血漿蛋白質の水溶液がコーン エフルエントII＋
    III、コーン エフルエントＩおよび低温上澄み溶液か
    ら成る群より選択される特許請求の範囲第１項記載の方
    法。
  3. 【請求項３】アルフア−１−プロテイナーゼ阻害剤を含
    有する血漿蛋白質の水溶液がコーン エフルエントII＋
    IIIおよびコーン エフルエントＩから成る群より選択
    される特許請求の範囲第１項記載の方法。
  4. 【請求項４】アルフア−１−プロテイナーゼ阻害剤を含
    有する血漿蛋白質の水溶液がコーン エフルエントII＋
    IIIから成る群より選択される特許請求の範囲第１項記
    載の方法。
  5. 【請求項５】工程（ａ）の前に、前記水溶液を処理し
    て、コーン エフルエントII＋IIIおよびコーン エフ
    ルエントＩから成る群の成分の水溶液中に存在するアル
    コールの実質的にすべてを除去する特許請求の範囲第３
    項記載の方法。
  6. 【請求項６】工程（ｂ）において、アニオン交換樹脂が
    ポリガラクトース、ポリデキストランおよびセルロース
    樹脂の群から選択される多糖類吸着剤であり、ここで多
    糖類鎖は多糖類鎖のグルコース単位にエーテル結合によ
    り結合したジエチルアミノエチル基および第四エチル基
    から選択される正に帯電した基を有する特許請求の範囲
    第１項記載の方法。
  7. 【請求項７】工程（ｃ）において、アルフア−１−プロ
    テイナーゼ阻害剤をアニオン交換樹脂から置換するため
    に十分なイオン強度を有する溶離剤が、0.02M〜0.3Mの
    範囲内の濃度を有しかつ5.5〜8.6の範囲内のpHを有する
    水溶性無機塩および水溶性有機塩から成る群より選択さ
    れる少なくとも１種の成分を含有する水性緩衝溶液であ
    る特許請求の範囲第１項記載の方法。
  8. 【請求項８】工程（ｄ）において、第２溶離液をポリエ
    チレングリコールおよびポリプロピレングリコールから
    選択されるポリ縮合ポリアルキレングリコールと接触さ
    せることによって、アルフア−１−プロテイナーゼ阻害
    剤を第２溶離液から回収する特許請求の範囲第１項記載
    の方法。
  9. 【請求項９】工程（ｄ）において、（１）まず第２溶離
    液を、第２溶離液の容積に基づいて、10％〜20％（w/
    v）のポリ縮合ポリアルキレングリコールと、4.6〜5.7
    の範囲内のpHおよび２℃〜10℃の温度において１分〜１
    時間接触させ、そして生ずる沈殿を分離しかつ生ずる上
    澄み溶液を保持し、次いで（２）保持された上澄み溶液
    を、第２溶離液の容積に基づいて、８〜15w/v％の追加
    のポリ縮合ポリアルキレングリコールと、4.6〜5.4の範
    囲内のpHおよび２℃〜10℃の温度において１分〜１時間
    接触させ、そしてアルフア−１−プロテイナーゼ阻害剤
    を含有する得られた沈殿を保持する特許請求の範囲第８
    項記載の方法。
  10. 【請求項１０】（３）アルフア−１−プロテイナーゼ阻
    害剤を含有する得られた沈殿を緩衝溶液中で再構成し、
    （４）次に工程（３）からの溶液を、アルフア−１−プ
    ロテイナーゼ阻害剤に対する親和性を有するアニオン交
    換樹脂と接触させ、そして（５）次いでアニオン交換樹
    脂を、アルフア−１−プロテイナーゼ阻害剤を置換する
    ために十分なイオン強度を有する溶離液と接触させて、
    アルフア−１−プロテイナーゼ阻害剤をアニオン交換樹
    脂から溶離し、アルフア−１−プロテイナーゼ阻害剤を
    含有する生ずる第３溶離液を得る追加の工程を含む特許
    請求の範囲第９項記載の方法。
  11. 【請求項１１】工程（ｄ）において、（１）まず第２溶
    離液を、10％〜20％（w/v）のポリエチレングリコール
    およびポリプロピレングリコールから選択されるポリ縮
    合ポリアルキレングリコールと4.6〜5.7の範囲内のpHお
    よび２℃〜10℃の温度において１分〜１時間接触させ
    て、第２溶離液からアルフア−１−プロテイナーゼ阻害
    剤を沈殿させないで、不必要な蛋白質類を沈殿させ、そ
    して生ずる沈殿を分離しかつ生ずる上澄み溶液を保持
    し、（２）次に保持された上澄み溶液を、アルフア−１
    −プロテイナーゼ阻害剤に対して親和性を有するアニオ
    ン交換樹脂と接触させ、そして（３）次いでアニオン交
    換樹脂を、アルフア−１−プロテイナーゼ阻害剤を置換
    するために十分なイオン強度を有する溶離液と接触させ
    て、該樹脂からアルフア−１−プロテイナーゼ阻害剤を
    溶離してアルフア−１−プロテイナーゼ阻害剤を含有す
    る生ずる第３溶離液を得ることによって、アルフア−１
    −プロテイナーゼ阻害剤を第２溶離液から回収する特許
    請求の範囲第１項記載の方法。
  12. 【請求項１２】工程（ｄ）から得られたアルフア−１−
    プロテイナーゼ阻害剤を処理して不活性化し、そして感
    染性微生物の感染性を減少させて、アルフア−１−プロ
    テイナーゼ阻害剤をこのような伝染性微生物に対して非
    伝染性とし、これによりアルフア−１−プロテイナーゼ
    阻害剤を治療および予防の目的に有用とする工程をさら
    に含む特許請求の範囲第１項記載の方法。
  13. 【請求項１３】（ｉ） コーン エフルエントII＋III
    およびコーン エフルエントＩから成る群より選択され
    るアルフア−１−プロテイナーゼ阻害剤を含有する血漿
    分画の水溶液を処理して、コーン エフルエントII＋II
    Iおよびコーン エフルエントＩから成る群の成分の水
    溶液中に存在するアルコールの実質的にすべてを除去
    し、 （ii） 工程（ｉ）からの水溶液を透析濾過およびゲル
    濾過から選択される少なくとも１つの手段により処理し
    て、前記溶液中の塩類の濃度を0.02M以下に低下させ、 （iii） 工程（ii）からの溶液を、該溶液中のアルフ
    ア−１−プロテイナーゼ阻害剤に対して選択的親和性を
    有するアニオン交換樹脂と接触させて、該樹脂にアルフ
    ア−１−プロテイナーゼ阻害剤を選択的に結合させかつ
    該樹脂に結合しない血漿蛋白質類を該樹脂を通して第１
    溶離液中に溶離し、 （iv） 工程（iii）から得られたアルフア−１−プロ
    テイナーゼ阻害剤を選択的に結合しているアニオン交換
    樹脂を、アルフア−１−プロテイナーゼ阻害剤を該樹脂
    から第２溶離液中に置換するために十分なイオン強度を
    有する溶離剤と接触させ、 （ｖ） 工程（iv）から得られた第２溶離液を該溶離液
    の容積に基づいて、10％〜35％（w/v）のポリエチレン
    グリコールおよびポリプロピレングリコールから選択さ
    れるポリ縮合ポリアルキレングリコールと4.6〜5.7の範
    囲内のpHおよび２℃〜10℃の温度において１〜24時間接
    触させて、前記溶離液からアルフア−１−プロテイナー
    ゼ阻害剤を沈殿させないで不必要な蛋白質類を性的に沈
    殿させ、そして （vi） 工程（ｖ）において得られた溶液からアルフア
    −１−プロテイナーゼ阻害剤を分離する、 工程を含んでなる、コーン エフルエントII＋IIIおよ
    びコーン エフルエントＩから成る群より選択されるア
    ルフア−１−プロテイナーゼ阻害剤を含有する血漿分画
    の水溶液からアルフア−１−プロテイナーゼ阻害剤を分
    離するための特許請求の範囲第１項記載の方法。
  14. 【請求項１４】工程（iii）において、アニオン交換樹
    脂がポリガラクトース、ポリデキストランおよびセルロ
    ース樹脂の群から選択される多糖類吸着剤であり、ここ
    で多糖類鎖は多糖類鎖のグルコース単位にエーテル結合
    により結合したジエチルアミノエチル基および第四エチ
    ル基から選択される正に帯電した基を有する特許請求の
    範囲第13項記載の方法。
  15. 【請求項１５】工程（iv）において、アルフア−１−プ
    ロテイナーゼ阻害剤をアニオン交換樹脂から置換するた
    めに十分なイオン強度を有する溶離剤が、0.02M〜0.3M
    の範囲内の濃度を有しかつ5.5〜8.6の範囲内のpHを有す
    る水溶性無機塩および水溶性有機塩の１種を含有する水
    性緩衝溶液である特許請求の範囲第13項記載の方法。
  16. 【請求項１６】工程（vi）から得られたアルフア−１−
    プロテイナーゼ阻害剤を処理して不活性化し、そして伝
    染性微生物の伝染性を減少させて、アルフア−１−プロ
    テイナーゼ阻害剤をこのような伝染性微生物に対して非
    伝染性とし、これによりアルフア−１−プロテイナーゼ
    阻害剤を治療および予防の目的に有用とする工程をさら
    に含む特許請求の範囲第13項記載の方法。
JP61258702A 1985-11-01 1986-10-31 アルフア−１−プロテイナ−ゼ阻害剤の製造方法 Expired - Lifetime JPH0764750B2 (ja)

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