JPS62108821A - アルフア−１−プロテイナ−ゼ阻害剤の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、アルファ−１−プロテイナーゼ阻害剤（ａｌ
ｐｈａ−１−ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　　１ｎｈｉｂｉｔ
ｏｒ）（ＰＩ）を血漿または血漿分画から分離する新規
な方法に関し、なかでもそれを提供することを目的とす
る０本発明の他の目的は、以下の説明から明らかとなる
であろう、以下の説明において、部および百分率は、特
記しないかぎり、重量による。

アルファ−１−プロテイナーゼ阻害剤は分子量が５４．
℃０の糖蛋白質である。この蛋白質は単一のポリペブト
ド鎖から成り、これにいくつかのオリゴ多糖栄位が共有
結合している。ヒトＰＩは内因性セリンブロテイナーゼ
類による組織の破壊においである役割を演する。血漿中
のトリプシン阻害ｆ指力の９０％に及ぶＰＩの遺伝的欠
損は、肺気腫の早期の発現に関連することが示された。

気腫に関連するエラスチンの退化は、弾力線維分解酵素
および天然に存在する組織および血漿のプロテイナーゼ
阻害剤類の局所的アンバランスから生ずる。ＰＩはヒト
のパンクレアチンおよび白血球のエラスターゼを急速に
阻害する［バイオケミ？２、Ｎｏ、１．３３−３９ペー
ジ；１ｂｉｄ、、Ｖｏ１、８８、Ｎ０８２．３４６−３
５０．１９７９］。

ある数の方法が血漿からＰＩを単離するために使用され
てきている。これらの方法の大部分は実験的規模の弔敲
に向けられたいるが、他の方法は商業的水準の生産に関
連する。

パンネル（ｐａｎｎｅｌ）ら、バイオケミストｌ）−（
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、Ｖｏ１、１３．５４３９
−５４４５ページ、　（１９７４）は、アルブミンに劣
った血漿をプールし、そして固体の６ｄ１ｍアンモニウ
ム（０、６０−０、８０（７）飽和）で分別する方法を
用いた。生ずる沈殿をｒＩＴ溶化し、透析し、そしてＤ
ＥＡＥ−セルロースのカラムに適用した。０．０５〜０
．１５モルのＮａｃｌの直線の勾配中に溶離されるＰＩ
の分画をブールレ、濃縮し、透析し４次いで再びＤＥＡ
Ｅ−セルロースのカラムに適用した。０．０５〜０．２
０モルのＮａＣ１の直線の勾配中に溶離されるＰＩの分
画を集め、プールし、そして濃縮してＰＩを得た。

サクラトバラ（Ｓａｋｌａｔｖａｌａ）ら、バイオケミ
カル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ。

エユ）、Ｖｏ１、Ｉ５７．３３９−３５１ページ（１９
７６）の方法において、ヒト血漿を硫酸アンモニウム（
８０％の飽和）で分別して沈殿を形成し、これを溶解し
、透析し、そしてＤＥＡＥ−セルロースのクロマトグラ
フィーにかけた。０゜５モルのＮａＣＩの抽出液をコン
カナバリンＡ−セフ７０−ス（Ｓ　ｅ　ｐ　ｈ　ａ　ｒ
　ｏ　ｓ　ｅ）カラムに適用した。アルファ−Ｄ−メチ
ルグルコピラノシドの溶離液をｅｍｔ、、、そして再び
ＤＥＡＥ−セルロースカラムに適用した。０．０−０．
２モルのＮａＣ１溶離液はＰＩを含有した。

ムシアニ（Ｍｕｓｉａｎｉ）ら、バイオケミスｈｌＪ−
（Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、Ｖｏ１、１５．７９８−８０４
ページ（１９７６）は５０％の飽和硫酸アンモニウムの
沈殿法を使用して、ＰＩに富んだ分画を分離し、これを
可溶化し、次いでＤＥＡＤイオン交換体、コンカナバリ
ンＡ−セファロース、セフ７デツクス（Ｓｅｐｈａｄｅ
ｘ）Ｇ−１℃、および免疫吸着性カラムを使用する連続
的クロマトグラフィ一工程にかけて精製されたＰＩを得
た。

ヒト血漿からの大規模の精製はクレス（Ｋ　ｒ　ｅＳＳ
）ら、プレパレイティプ・バイオケミスト１ｓｔｒｙ）
、Ｖｏ１、３、Ｎｏ、６．５４１−５５２　（１９７３
）に開示された。ヒト血漿の８０％の硫酸アンモニウム
処理からの沈殿を透析し、モしてＤＥＡＥ−セルロース
のクロマトグラフィーにかけた。得られたｅｌｌｉ（物
を再び透析し、そしてセラデンクスＧ−Ｚｏｏカラムで
ゲル挫過した。ＰＩ含有分画をＤＥ−５２セルロースの
クロマトグラフィーに２回かけてＰＩを得た。

グレイザー（Ｇ　ｒ　ａ　ｓ　ｅ　ｒ）ら、１ｂｉｄ、
、Ｖｏ１、５、Ｎ０１４．３３３−３４８ページ（１９
７５）はＰＩをコーンフラクションＩＴ−１から３０％
の全体の収率で屯離した。溶解した■−１をＤＥＡＥ−
セルロース、ＱＡＥ−セファデックス、コンカナバリン
Ａ−セファ０−ス、およびＧ１−１５０セフアデツクス
のクロマトグラフィーにかけた。

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に基づく統合された
血染分画系は、ハオ（Ｈａｏ）ら、７２１９７７年９月
７−９日開催、米国バージニア州レストン、により開示
された０発表された方法において、コーン低温沈殿（ｃ
ｏｈｎ　　ｃｙｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）を４０ｇ／
ｌの量のＰＥＧと混合した。すべての作業は５°Ｃにお
いて実施された。

６０分間攪拌した後、第１分画を遠心により除去した。

追加の６０　ｇ／　ｌのＰＥＧを上澄みに添加した（最
終濃度はぼ１０％）。次いで、プロトロンビン複合体（
ＰＴ（ｃ）を１０％のＰＥＧ上澄みからバッチ式にＤＥ
ＡＥ−セルロース上に吸着させることによって抽出し、
そして追加の１℃ｇ／ｌのＰＥＧを添加して１０〜２０
％のＰＥＧ沈殿を得た。このようにしてずｊＩられた４
つの分画は０〜４％のＰＥＧ沈殿、４〜１０％のＰＥＧ
沈殿、１０〜２０％のＰＥＧ沈殿および２０％のＰＥＧ
上澄みであり、そして分画Ａ、Ｂ、ＣおよびＤと表示さ
れた。これらのＰＥＧｃ度は低温−Ｌ澄み（ｃｒｙｏｓ
ｕｐｅｒｎａｔｅ）のもとの体積に基づくことを指摘す
べきである。

４つのＰＥＧ分画中の蛋白質類の分７τ工は次の通りで
あった：フィブリ／ダンは分画Ａ中の主要蛋白質であり
、そしてアルブミンは主要な汚染物質であった。分画Ａ
、ＢおよびＣ中の汚染アルブミンの大部分は、アルブミ
ン自体がこれらの条件下で沈殿しないので、共沈および
／または上澄みの連行から由来した。分画Ｂはプラスミ
ノゲン、補体の０３成分、ＩｇＧおよびＩｇＭに富んで
いた。さらに、ベーター脂蛋白質の゛ｊ９実−１−全部
はこの分画中に存在した。分画Ｃは感知しうる量のアル
ファ２マクログロブリン、ＩｇＡを含有し、そシテプロ
トロンピンといわゆるプロトロンビン複合体を構成する
他の凝固因子とに富んでいた。しかしながら、著者が発
見したところによると、ＰＴＣのよりすぐれた収率は１
０〜２０％のＰＥＧ沈殿からよりはむしろ１０％のＰ　
Ｅ　Ｇ　ｌ澄みからイ１１ることができた。分画りはア
ルムビンが主要比率を占めたが、またアルファ−１−酸
糖蛋白質のすへてならびにＰ１、抗トロンビンｍ　（Ａ
Ｔ■）、セルロプラスミン（ｃｐ）、ハプトグロビン、
トランスフェリン（Ｔｆ）およびＣＩエラスターゼ阻害
剤（ｃＩ阻害剤）の大部分を含有した。いく種類かの追
加の蛋白質類、例えば、プレアルブミン（ＦＡ）、　　
レチノール結合性蛋白質（ＲＢＰ）、トランスコルチン
およびアンギオテンシノゲンも分画りから単離された。

一般に、より小さい蛋白質類の大部分は分画り中に存在
した。

ファン（ｃｏ　ａ　ｎ）およびブロンクラエイ（Ｂｔ　
ｏｃｋｗａｙ）　、米国特許第４，３７９，０８７弓お
よび同第４．４３９．３５８号は、血漿分画、例えば、
コーンフラクションＩＶ−１からアルファ−１−プロテ
イナーゼ阻害剤を分離する方法を開示しており、この方
法において、血漿の水溶液を準備し、この溶液を約６．
５〜８．５のｐＨおよび約２〜５０℃の温度に約０．２
〜４時間の間保持し、この溶液をある量のポリ縮合ポリ
グリコール、例えば、溶液の容積に基づいて、約８−１
Ｏ％〜約２３％（ｗ／ｖ）の範囲の量のポリエチレング
リコールと約４．６〜約７．５の範囲のｐＨにおいて混
合し、ここでポリ縮合ポリグリコールの州をｐＨの０．
５の増加につき約２〜３％で増加する。好ましい実施１
店様において、特許された方法において、コーンフラク
ション■−１を含有する水溶液の１℃　ｍ　ｌにつき約
１０〜１５ｇのポリ縮合ポリグリコールをｐＨ４，６〜
５７において使用し、ポリ縮合ポリグリコールの部列血
漿分画の部の比は約２＝１〜１：１である。アルファ−
１−プロテイナーゼｉＬＩ害剤は、生じた混合物をポリ
縮合ポリグリコール処理から遠心分離し、そして上澄み
溶液から回収し、得られたト澄み溶液をアニオン交換樹
脂とｐＨ約５．５〜８．６において接触させ、そしてア
ルファ−１−プロテイナーゼ阻害剤をアニオン交換樹脂
から選択的に溶離することによって、得られた混合物か
ら分離される。あるいは、アルファ−１−プロテイナー
ゼｒｌｌ害剤は、混合物を遠心分離した後、ポリ踪：！
リグリコールをさらに添加してアル７．・・１−プロテ
イナーゼ阻害剤を混合物から沈殿させることによって分
離することができる。

本発明は、アルファ−１−プロテイナーゼ阻害剤（文献
中で「アルファ−１抗ｌ・リブシン」としてまた知られ
ている）を分離する新規な方法、ことに従来未知の源か
ら従来開示されているものよりも高い収−ｆ’：でかつ
高い純度でアルファ−１−プロテイナーゼｊｆ＋害剤を
分離する新規な方法に関する。

ここに記・成する発明は、工程： （ａ）アルファ−１−プロイテナーゼ阻害剤を含有する
血漿蛋白質の水溶液を透析諸過（ｄ　ｉ　ａｆｉｌｔｒ
ａｔｉｏｎ）およびゲル濾過から選択される少なくとも
１つの−Ｌ段により処理して、前記溶液中の塩類の濃度
を低下させ、 （ｂ）、ｈの工程（ａ）において得られた溶液を前記溶
液中のアルファ−１−プロイテナーゼ１ｉｌｔ害剤に対
して選択的親和性を有するアニオン交換樹脂と接触させ
て、前記樹脂にアルファ−ｌ−プロイテナーゼ阻害剤を
選択的に結合させかつ前記樹脂に結合しない血漿蛋白質
類を前記樹脂を通して第１溶離液中に溶離し、 （ｃ）工程（ｂ）から得られたアルファ−１−プロイテ
ナーゼＢｌｌ害剤を選択的に結合して有するアニオン交
換樹脂を、アルファ−１−プロイテナーゼ■害剤を前記
樹脂から第２溶離液中に置換するために十分なイオン強
度を有する溶離剤と接触させ、そして （ｄ）工程（ｃ）から得られた前記第２溶離液からアル
ファ−１−プロイテナーゼ阻害剤を回収する、 を含んでなることを特徴とするアルファ−１−プロイテ
ナーゼ阻害剤を含有する血漿蛋白質の水溶液からアルフ
ァ−１−プロイテナーゼ阻害剤を分離する方法である。

本発明による方法におけるアルファ−１−プロテイナー
ゼ阻害剤の新規な源は、コーンエフルエン　ト　（ｃｏ
ｈｎ　　　Ｅｆｆ　　１ｕｅｎｔ）　　ＩＩ＋ｍ　、コ
ーンエフルエン）Ｉおよび低温上澄み溶液（ｃｒｙｏｓ
ｕｐｅｒｎａｔａｎｔ　　５ｏｌｕｔｉ。

ｎ）から成る群より選択されるアルファ−１−プロイテ
ナーゼ阻害剤を含有する血漿蛋白質の水溶液である。

本発明による方法の主要な利点は、先行技術において報
告された多くの方法にょリイ１？られたＰＩに収−４＜
と比・咬したとき、血ζ１７中のＰＩの合計？＋１から
の収−イｌで表わして、ＰＩの回収率が高いということ
である。

他の利点は本発明による方ｊノ、により得られるＰＩの
純度が高いことであり、この方法によれば、先行技術の
方法においてＰＩと一緒に不必習な汚染物質として頻繁
に回収される他の血８２蛋白質類の分離が増大される。

前述のように、本発明による方法の出発物質はアルファ
−１−プロイテナーセＢＩｉ害剤を含有する血漿蛋白質
の水溶液である。好ましくは、ＰＩを含有する水溶液は
コーンエフルエント丁工＋■、コーンエフルエントエお
よび低温１ｉ１６み溶液から成る群より選択される。コ
ーンエフルエンｌ−ＩＩ　＋ｍおよびコーンエフルエン
）Ｉは、コーンエタノール分画技術またはその変法に従
い血漿を分画するおとによって得ることができる。例え
ば、Ｅ、Ｊ　　コーン（ｃｏ　ｈ　ｎ）ら、ジャーナル
・オブ拳アメリカン・ケミカルφソサイアティ　（Ｊ。

４５９　（１９４６）；Ｅ、Ｊ　、コーン（ｃｏｈｎ）
、米国特許第２，３９０，０７４号：オンクレイ（Ｏｎ
ｃｌｅｙ）ら、ジャーナルψオブ・アメリカン拳ケミカ
ル−ソサイアティ（Ｊ、Ａｍｅｒ、　　Ｃｈｅｍ、　　
Ｓｏｃ、）、７１．５４１（１９４９）；および「血漿
蛋白質類（ＴｈｅＰｌａｓｍａ　　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）
」、第２版、Ｖｏ　Ｉ　、ｍ、５４８−５５０ページ、
アカデミツク舎プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓ
ｓ）、ニューヨーク州ニューヨーク（１９７５）参照。

低温ｌ：、澄み溶液は、新鮮な凍結血漿を５°Ｃ以下に
おいて融解し、残留する沈殿［「低温沈殿（ｃｒｙｏｐ
ｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）Ｊ　と呼ぶ］を慣用の手段によ
り、通常遠心分離により除去し、そして上澄み溶液（「
低温上澄み溶液」）を本発明による方法における使用の
ため保持することによって得ることができる。例えば、
ミドう（Ｍｉｔｒａ）ら、米国特許第４．３０６．０６
８号８照。

より好ましくは、出発物質として使用するＰＩ含有水溶
液はコーンエフルエンｌ−ＩＩ　＋　ＩＩＩおよびコー
ンエフルエンｌ−Ｉから選択ごれる。最も好ましくは、
１［１発ＰＩ含有水溶液はコーンエフルエントＩＩ＋丁
である。

前述のように、本発明による方υ、における第１−■工
程はＰ■含イｊ血漿蛋白質の出発水溶液を処理してこの
溶液のイオン強度を低下させること、すなわち、この水
溶液中の塩類を除去することであり、これによりＰＩは
アニオン交換樹脂に結合するであろう。好ましくは、出
発水溶液中の塩類の濃度は、約０．０２モル以下、より
好ましくは約０．０１モル以下に低下さ姓るへきであり
、そして水溶液を透析政過またはゲル６遇することによ
り、低下させることかできる。最も好ましくは水溶液を
透析ｉＩ！過してその中の塩類の濃瓜を低下させる。典
型的には、出発水溶液をアミコン（Ａｍｉｃｏｎ＠）セ
ル中で慣用の枝１１＃ｉに従い透析濾過する。一般に、
第１工程は約２〜１０’Ｃの温度および約６．０〜７．
０のｐＨにおいて実施する。典型的は条件は５°Ｃおよ
びｐＨ６，５である。

出発水溶液がコーン分画技術により得られる血漿分画を
含有するとき、それはコーンエフルエント１１＋ＩＩＩ
またはコーンエフルエントエであり、好ましくはその溶
液は初期の追加の工程において処理してそれをｅ縮しか
つコーン分画技術を使用することによりその溶液中に含
有されるアルコールを除去する。コーンエフルエントｎ
＋ｍまたはコーンエフルエントエの水溶液をそのように
濃縮しかつその中のアルコールの実質的にすべてを除去
する１つの好ましい技術は、その水溶液を限外６過する
ことである。この限外癌過における温度およびｐＨの条
件は一般に前述の透析濾過について記載したものと同一
であり、ここで限外濾過膜はロミコン（Ｒｏｍｉｃｏｎ
＠）ＰＭ−１０膜である。

本発明による方法の第２工程は、塩濃度を低下させおよ
び心安に応じてアルコール濃度を低下させた溶液を、こ
の溶液中のＰＩに対して選択的親和性を有するアニオン
交換樹脂と接触させて１ＰＩをこの樹脂に選択的に結合
させかつこの樹脂に結合しない血漿蛋白質をこの樹脂を
通して第１溶離液中に溶離させることである。アニオン
交換樹脂に結合しない血漿蛋白質類はＰＩを含有する組
成物中の成分として不必要であるが、第１溶離液は一般
に廃棄せず、むしろ、再処理してＰＩが意図されない用
途以外の他の治療または予防の用途を有する血漿蛋白質
を単離する。任意の７ニオン交換樹脂を使用できるが、
一般に第２工程において使用するために、アニオン交換
樹脂はポリガラクトース、ポリデキストランおよびセル
ロースの樹脂の群から選択される多糖類の吸着剤であり
、ここで多糖類の鎖は多糖類の鎖のグルコース単位へエ
ーテル結合により取り付けられたジエチルアミンエチル
基および第四エチル基から選択される正に４ｉ７　’ｒ
［した基を有する。第２工程においてアニオン交換樹脂
として有用な適当な多糖類の吸着剤は、ＤＥＡＥ−セフ
ァロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　）　、　Ｄ　Ｅ　Ａ　
Ｅ　−セフ　ｙデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）、ＤＥＡ
Ｅ−セルロースおよびＱＡＥ−セファデックス［ファー
マシア・ファイン・ケミカルス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　
　Ｆｉｎｅ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、米国ニュージャ
ーシイ州ビス力タウェイ］などのような商業的に入手可
能な樹脂を包含する。この工程は一般に約２〜１０℃お
よびｐＨ６，０〜７．０、典型的には約５℃およびｐＨ
６，５において実施する。出発の水溶液および洗浄溶液
中の塩類の濃度は約０．０２モルまで、好ましくは約０
．０１モルまでであるべきである。

第１工程からの溶液はアニオン交換樹脂と任意の適当な
方法、例えば、塊状法およびカラムクロマトグラフィー
法により接触させることができるが、カラムクロマトグ
ラフィー法の使用は一派にいっそう便利である。

出発水溶液中のＰＩがアニオン交換樹脂との接触および
それへの結合により溶液から吸着されかつこの溶液中に
存在する他の血漿蛋白質類が樹脂を通して溶離されかつ
樹脂が慣用の技術により洗浄された後、第２工程（ｂ）
から得られたアルファ−１−プロテイナーゼ阻害剤を選
択的に結合して有するアニオン交換樹脂を、アルファ−
１−プロテイナーゼ阻害剤を前記樹脂から第２溶離液中
に置換するために十分なイオン強度を有する溶離剤と接
触させる。広義には、アルファ−１−プロテイナーゼ阻
害剤をアニオン交換樹脂から置換するために十分なイオ
ン強度を有する溶離剤は、約０．０２モモル〜約０．３
モルの範囲の濃度および約５．５〜約８．６の範囲のｐ
Ｈを有する水溶性無機塩および水溶性有機塩から成る群
より選択される少なくとも１種の構成員を含有する水性
緩衝溶液である。より好ましくは、本発明による方法の
第３工程（ｃ）において使用する溶離剤は無機塩の水溶
液である。より好ましくは、この工程において使用する
溶離剤を約０．０２〜約０．１モルの範囲の濃度を有し
、そしてｐＨ約６．０〜約７．０であろう、一般に１　
この工程の間の温度は約２〜１０℃、典型的には５℃で
ある。

本発明による方法における最終工程は、前述の第３工程
において得られた第２溶離液からＰＩを比較的高い収率
で回収することである。これはいくつかの手段の１つに
よって達成することができる。好ましくは、第２溶離液
からＰＩを回収するために有用な技術はポリエチレング
リコール（ＰＥＧ）およびポリプロピレングリコール（
ＰＰＧ）から選択されるポリ縮合ポリアルキレングリコ
ールと接触させることによる。いずれを使用することも
できるが、入手容易性（例えば、ユニオン舎カーバイド
・コーポレーションから）の理由で、ＰＥＧは好ましい
。このＰＥＧは約２℃〜２０．℃０、好ましくは約２，
℃０〜１０゜℃０、　　より好ましくは約３．℃０〜８
，℃０、最も好ましくは約３．℃０〜約４　、℃０の分
子量を有することができる。

こうして、アルファ−ｌ−プロテイナーゼ阻害剤は、（
１）まず第２溶離液を、第２溶離液の容積に基づいて、
約１０％〜約２０％（ｗ／ｖ）のポリ縮合ポリアルキレ
ングリコールと約４．６〜５．７の範囲のｐＨおよび約
２℃〜約１０℃の温度において約１分〜約１時間の間接
触させ、そして生ずる沈殿を分離しかつ生ずる上澄み溶
液を保持し、次いで（２）保持された上澄み溶液を、第
２溶離液の容ＩΔに基づいて、約８〜約１５ｗ／ｖ％の
追加のポリ縮合ポリアルキレングリコールと約４．６〜
５．７の範囲のｐＨおよび約２℃〜約１０’Ｏの温度に
おいて約１分〜約１時間の間接触させ、そしてアルファ
−１−プロイテナーゼ阻害剤を含有する得られた沈殿を
保持することによって、第２溶離液から回収することが
できる。

あるいは、上の第１ポリアルキレングリコールの添加か
ら保持された上澄み溶液を追加のポリアルキレングリコ
ールと接触させる代わりに、得られる保持された上澄み
溶液または緩衝溶液中で再構成された生ずるＰＩ含有沈
殿の溶液を、アルファ−１−プロテイナーゼ阻害剤に対
する親和性を有するアニオン交換樹脂と接触させ、次い
でアルファ−１−プロテイナーゼ阻害剤を置換するため
に十分なイオン強度を有する溶離剤とアニオン交換樹脂
を接触させてアルファ−ｌ−プロテイナーゼ阻害剤を含
有する生ずる第３溶離液を得ることによって、アルファ
−１−プロテイナーゼ阻害剤をアニオン交換樹脂から溶
離することができる。この別法に従い、本発明により第
２工程（ｂ）においてアニオン交換樹脂にＰＩを吸若さ
せそしてそれをアニオン交換樹脂から溶離することに関
して前述したアニオン交換樹脂および条件を使用するこ
とができる。

もちろん、追加のポリアルキレングリコール沈殿からの
ＰＩ含有沈殿を適当な緩衝溶液中に溶解し、次いでこれ
を別のアニオン交換樹脂処理に付すことができる。

先行技術は、汗通の血漿蛋白質沈殿剤および親和クロマ
トグラフィー技術を単独であるいは特定の組み合わせで
使用して、コーンフラクション■−１および低温沈殿を
含む血漿分画を処理することによってＰＩを単離するこ
とを開示しているが、本発明による方法は従来未知の源
および同様によく既知の源からＰＩを高い収率でかつ高
い純度で得る手段を提供する。

こうして、本発明の他の面は、工程： （ｉ）アルファ−１−プロイテナーゼ阻害剤を含有する
血漿分画の水溶液を、前記水溶液の容積に基づいて、約
１０％〜約３５％（ｗ／Ｖ）のポリ縮合ポリアルキレン
グリコールと約４．６〜５．７の範囲のｐＨおよび約２
℃〜約１０℃の温度において約１〜２４時間の間接触さ
せて、水溶液からアルファ−１−プロイテナーゼ阻害剤
を沈殿させないで不必果な蛋白質類を選択的に沈殿させ
、そして （１１）工程（ｉ）において得られた溶液からアルファ
−ｌ−プロイテナーゼ阻害剤を分離する、 を含んでなるアアルファ−１−プロイテナーゼ阻害剤を
含有する血漿分画の水溶液からアルファ−１−プロイテ
ナーゼ阻害剤を分離する方法において、 （ａ）血漿蛋白質の水溶液を処理して、その中の血漿蛋
白質を濃縮し、出発水溶液中に存在する実質的にすべて
の水溶性血漿蛋白質沈殿剤を除去し、そして水溶液のイ
オン強度を低下させ、（ｂ）工程（ａ）からの溶液をア
ルファ−１−プロイテナーゼ阻害剤に対して選択的親和
性を有するアニオン交換樹脂と接触させて、前記樹脂に
アルファ−１−プロイテナーゼ阻害剤を選択的に結合さ
せかつ前記樹脂に結合しない血漿蛋白質類を前記樹脂を
通して第１溶離液中に溶離し、（ｃ）工程（ｂ）から得
られたアルファ−１−プロイテナーゼ阻害剤を選択的に
結合して有するアニオン交換樹脂を、アルファ−１−プ
ロイテナーセ阻害剤を前記樹脂から第２溶離液中に置換
するために１゛分なイオン強度を有する溶離剤と接触さ
せる、 を含んでなり、 前記第２溶離液は１−の工程（１）および（ｉ　ｉ）に
従い処理された水溶液からなる、 ことを特徴とする方法である。

＋ｉ？ｊ述の他の面において、ＰＩを含有する血漿蛋白
質の好ましい出発水溶液はコーンエフルエントＩＩ＋Ｉ
ＩＩおよびコーンエフルエントＩから成る群より選択さ
れる。また、工程（ａ）および（ｂ）を実施するための
条件は同一工程について説明したものと同一である。

沈殿として得られかつ緩衝溶液中で１１工構成されたも
のととして、あるいはその溶液または濃厚物として、本
発明に従う方法によりイ１ｔられたＰＩは、治療、１珍
断または他の用途のためにプロテアーゼ阻害有効量のＰ
Ｉおよび製薬学的に許容されうる担体を含イ］する！Ｊ
薬学的製剤に配合することができる。それを静脈内投与
のために調製するために、組成物は生理学的に許容され
うる物質、例えば、塩化ナトラム、グリシンなどを含有
しかつ生理学的条件と適合する緩衝化ｐＨを有する水中
に溶解される。一般に、静脈内に投与される組成物のだ
めのガイドラインは政府の条例により確☆、されている
。

ＰＩの濃厚物は伝染性微生物、例えば、肝炎およびエイ
ズ（ＡＩＤＳ）のウィルスに関して非伝染性であること
が望ましい。これに関して、この濃厚物を処理してこの
ような微生物を不活性化しかつそれに対する伝染性を減
少することができる。これは２例えば、次の手段の１ま
たは２以りにより達成することができる：Ｍ、菌成過、
紫外線照射、化学的ウィルス不活性化剤による処理、凍
結乾燥された状態における熱処理（例えば、６０〜８５
°（ｃ）、または「低温殺菌」、すなわち、Ｐ■含イＪ
溶液をＰＩ間塩を非伝染性とするために十分な温度およ
び時間、例えば、約６０°Ｃ以−１二および約１０時間
までの期間における加熱。この低温殺菌の間ＰＩを安定
化するために、クエン酸イオン源を加熱の間ＰＩを安定
化するために十分な量で添加する。一般に、合計的２０
ｍｇの蛋白質がＰＩ濃厚物中に存在する場合、この溶液
を約０゜２５〜０．５モルのクエン酸イオン濃度にする
。

この加熱工程の間の混合物のｐＨは好ましくは約６．０
〜７．０であるべきである。

加熱の間にＰＩを最高に安定化するために、炭水化物を
安定剤として単独であるいはクエン酸ナトリウムと組み
合わせて使用することが望ましい。この］−１的で、炭
水化物として、単糖類、三糖類および三糖類、例えば、
アラビノース、グルコース、ガラクトース、マルトース
、フルクトース、リホース、マンノース、う１、ソース
、スクロースなど、あるいは即１アルコール、例エバ、
ソルヒト−ルおよびマンニトールをＰＩ溶液１ｍｌにつ
き約０．５〜２．４ｇの量で使用することができる。

前述のように、本発明の低温殺菌された生成物は治療の
目的に使用でよる製薬学的調製物中に混入することがで
きる。じかじながら、「製薬学的調製物」という用語は
、ここではより広い意味に用いて、治療の目的ばかりで
ははなく、かつまたこの分野において知られている試薬
または診断の目的にあるいは組織培養のために使用され
る、本発明に従う蛋白質組成物を含有する調製物を包含
することを意図する。治療の用途を意図する製薬学的調
製物は、治療学的最、すなわち、予防的またはＮｒ療的
Ｍ！康手段のために必要なプロテアーゼ阻害量のＰＩを
含有すべきである。製薬学的調製物を試薬または診断剤
として使用するとき、それは試薬または診断の量のＰＩ
を含有すべきである。

衷為彰 本発明を次の例示的実施例によりさらに説明する。

コーンエフルエントＩＩ＋ｍおよびコーンエフルエント
Ｉは、前述のコーン分画技術に従う分画により得た。

アッセイ ＰＩは、エラスターゼについての発色性ノ、（質を使用
して、そのエラスターゼ阻害能力により推定する。エラ
スターゼによりＮ−ズクシニルーＬ−アラニルーＬ−ア
ラニル−Ｌ−７ラニルーｐ−ニトロアニリｌ”　（ＳＡ
３　ｐＮＡ）が加水分解されると、４０５ｎｍにおける
吸収が増加する。この増加を通常３７°Ｃにおいて連続
的に監視する。試料（ＰＩ）の存在下および不存在下に
おいて得られた時間経過の吸収の直線変化を比較する。

次いで、阻害剤の量をエラスターゼおよびＰＩの既知の
分子量、既知のｌ：１の化学ｒ１）論およびエラスター
ゼの既知の使用着に基づいて計算する。

ＰＩは、また、同様な方法でそのトリプシン阻害能力に
より推定することができる。

実施例１ この実施例は、本発明による方法における最初の３つの
工程、すなわち、（ａ）コーンエフルエン）ＩＩ＋ｍの
溶液の塩類の濃度の低下、　（ｂ）工程（ａ）からのＰ
Ｉ含有溶液とアニオン交換樹脂との接触、および（ｃ）
前記樹脂からのＰＩの選択的溶離、を例示する。

コーンエフルエンｌ−ＩＩ　＋　ｍを、５　倍容１にの
０゜０２モルのリン酸ナトリウム緩衝溶液に対してｐＨ
６，５および５°Ｃの温度において透析癌過しだ。

ド表工に記載する変化量のコーンエフルエントＩＩ＋ｍ
の各々を、０．０２モルのリン酸ナトリウ１、緩衝溶液
で乎衡化した一定量のＤＥＡＥ−セフ７１：＋−ス（Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅ＠）ＣＬ６Ｂ７７スト”７０−（Ｆａ
ｓｔ　　Ｆ　　ｌ　　ｏ　　ｗ）（ファーマシア会ファ
インやケミカル・リミテッド）を含有するカラムにｐＨ
６，５，５°Ｃにおいて適用した。この方ラムを１容積
の０．０２モルのリン酸ナトリウム緩衝溶液でｐ）ＩＦ
５．５．５℃において洗浄した後、０．０２モルのリン
酸ナトリウム緩衝溶離液を他の処理のために廃棄した。

次いで、このカラムを０．０５モルのリン酸ナトリウム
緩衝溶液でｐＨ６，５，５℃において溶離して、ＤＥＡ
Ｅ−セフ７０−ス（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ＠）ＣＬＵＢ樹
脂へ結合した出発コーンエフルエントＩＩ　＋　ＩＩ中
に含有されるＰＩを置換した。

丁表工は前述の実験における７つの試験からのデータを
要約する。ＤＥＡＥ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅ＠）ＣＬ６ＢへのＰＩの適用１′１１を、２８Ｑｎｍ
における試料の吸収×容積（ｍｌ）／ｍ１ＤＥＡＥによ
り表わす。生成物の収率（％）は、前述の第２溶離液中
のＰＩのｊ１１÷出発コーンｚフルエンｔＴＩ＋ｍ中の
ＰＩのｊＩ′Ｌ×１℃により決定した。相対純度は、溶
離液中の蛋白質の合計量につき前述のアッセイ手順によ
り決定した第２の前述のＰＩ含有溶離液中の阻害剤の量
である。

大工、実施例１の結果 ＤＥＡＥカラ ムへの透析症 過液の適用量　収率％（工 （Ａ２　ａ　ｏ単　フルエンド 位／　ｍ　ｌ　Ｄ　Ｅ　　から）（■ ず １−Ｂ　　　　２９３　　　　　　４２　　　　０　。

１１５１−Ｃ２３０５８０，２５ １−Ｄ　　　　２０９　　　　　　４９　　　　０．１
６１−Ｅ　　　　１９２　　　　　　５２　　　　０．
２２１−Ｆ　　　　１８５　　　　　　３７　　　　０
．２８１−Ｇ　　　　　１７３　　　　　　　４０　　
　　　０．２６実施例２ この実施例は、本発明による方法における最初の３つの
工程、すなわち、（ａ）コーンエフルエン）ＩＩ＋ｍの
溶液の塩類のイオン強度の低下、（ｂ）工程（Ｌ）から
のＰＩ含有溶液と７ニオン交換樹脂との接触、および（
ｃ）前記樹脂からのＰＩの選択的溶離、を例示する。

この実施例において、固定量のコーンエフルエントＩＩ
＋ｍ、２３０Ａ２８０単位／　ｍ　ｌ　Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ
を０．０２モルのリン酸ナトリウム緩衝溶液で平ａｉ化
した一定ＦＭのＤＥＡＥ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ＠）ＣＬ６Ｂ７７スト”７０−（Ｆａｓｔ　　Ｆ
ｌｏｗ）（１℃ｇの樹脂／’１℃ｍ１の緩衝溶液）を含
有するカラムにｐＨ６。

５．５℃において適用した。この方ラムを１容植の０．
０２モルのリン酸ナトリウム緩衝溶液でｐＨ６，５，５
℃において洗浄した後、０．０２モルのリン酸ナトリウ
ム緩衝溶離液を他の処理のために廃棄した。

次いで、このカラムを０．０５モルのリン酸ナトリウム
緩衝溶液でｐＨ６，５，５℃において溶離して、ＤＥＡ
Ｅ−セフ７０−ス（Ｓｅｐｈａｒｏ　ｓ　ｅ）ＣＬ６Ｂ
樹脂へ結合した出発コーンエフルエン）　ＩＩ　＋　ｍ
中に含有されるＰＩを置換した。

下表Ｉは前述の実験のデータを要約する。収率（％）お
よび相対純度は実施例１におけるようにして決定した。

表■１．′−７施例２の結果 収率％（ エフルエ ントから ）（ＩＩ＋ ヨ翌−処理法　　　　■から）　相対純度２−Ａ　　透
析フィルター （Ｄ　Ｆ）対５容積 の０．０２モルの リン酸ナトリウ ム、ｐＨ６，５５２０，２８ ２−Ｂ　　ＤＦ対対合容積 Ｈ２Ｏ７，１０，０５ ２−ＣＤＦ対対審容積 Ｈ２Ｏ、次いで２ 容積の０．０２モ ルのリン酸塩　　　９．８　　０．１６２−Ｄ　　限外
濾過により濃 縮２倍１次いでＤ Ｆ対３容積の０゜ ０２モルのリン酸 塩　　　　　　　　３．０　　０．０８２−Ｅ　　限外
６過により儂 縮２倍、ＤＦ対４ 容積のリン酸塩　　５３　　　０．２５２−Ｆ　　限外
６過により濃 縮２倍、ＤＦ対５ 容積のリン酸塩　　４９　　　０．３２２−Ｇ　　限外
濾過によりＣ 縮３倍、ＤＦ対４ 容積のリン酸塩　　４４　　　０．２１２−Ｈ限外濾過
により濃 縮３倍、ＤＦ対５ 容積のリン酸塩　　６５　　　０．３０裏施桝ｌ この実施例は、本発明による方法における第３工程にお
ける樹脂からＰＩを選択的に首換して得られた溶離液か
らＰＩを回収する、本発明による方法の第４工程を例示
する。

ＰＩを結合して有するＤＥＡＥ−セファロースＣＬＳＢ
カラムを溶離することによって得られた工程（ｃ）から
の溶離液のプールを、６つの等しい部分に分割した。各
部分に、溶液中に２０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧを供給する
ために十分な量でＰＥ０３３５０　（ユニオン・カーμ
・ｆド・コーポレーション）を添加した。ｐＨを下表１
に２滅するように調節し、温度を５℃に保持し、そして
この混合物を約１時間攪拌し、次いで遠心した。

透明の上澄み溶液をＰＩ活性についてアッセイした。こ
の実験の結果を表ｍに要約し、ここで収率（％）および
相対純度は実施例１に記載するようにして決定した。

表ｍ、実施例３の結果 アルファ １−Ｐ ■の収率 火笠−ｐＨの調節　　　％　　　　相対純度３−Ａ　　
ｐＨ５，８０Ｗ／ ＨＣＩ　　　　　　　　　　　　７５　　　０．４８３
−Ｂ　　ｐＨ５−９６Ｗ／ ＨＣＩ　　　　　　　　　　　　８７　　　０．４６３
−ＣｐＨ６，１３ｗ／ ＨＣＩ　　　　　　　　　　８４　　　０．３６３−Ｄ
　　　ｐＨ５，５７ｗ／ 酢酸　　　　　　　　６５　　０．４９３　　Ｅ　　　
ｐＨ５，９７ｗ／ 酢酸　　　　　　　　８１　　０．４６３−Ｆ　　　ｐ
Ｈ６，１３ｗ／ 酢酸　　　　　　　　８３　　０．３２実施例４ この実施例は、実施例３におけるような未発明による方
法の第４工程を例示する。

実施例３におけるようにして得られたＰＩをを含有する
工程（ｃ）からの溶離液のプールを６つの等しい部分に
分割し、そしてＤＥＡＥ−溶離液のもとの容積に基づい
て１１．５％（ｗ／ｖ）になるようにＰＥＧ　　３３５
０を添加した。ｐＨおよび温度をｐＨ６，５および５℃
に調節し、この混合物を約１時間攪拌し、次いで遠心し
た。透明の」二澄み溶液をＰＩ活性についてアッセイし
た。

この実験の結果を表■に要約し、ここで収率（％）およ
び相対純度は実施例１に記載するようにして決定した。

表■、−・−例４の　果 アルファ １−Ｐ ■の収率 丈胎−Ｐ）Ｉの調節　　　％　　　　相対純度４−Ａ　
　ｐＨ７，９０ｗ／ ＨＣＩ　　　　　　　　５６　　０．４６４−Ｂ　　ｐ
Ｈ５，ｏｏｗ／ ＨＣＩ　　　　　　　　６０　　０．４２４−ＣｐＨ５
，２０ｗ／ ＨＣＩ　　　　　　　　７３　　’０．４２４−Ｄ　　
ｐＨ５，℃ｗ／ 酢酸　　　　　　　　６８　　０．４６４−Ｅ　　ｐＨ
５，１５ｗ／ 酢酸　　　　　　　　７６　　０．４７４−Ｆ　　ｐＨ
６，２５ｗ／ 酢酸　　　　　　　　８２　　０．４７実施例５ この実施例は、本発明による方法の第４工程におけるＰ
Ｉのそれ以上の精製を例示する。

ＰＩを含有するカラム溶離液を実施例３に記載するよう
にして得て、６．０に調節したｐＨにおいて２０％（ｗ
／ｖ）　（７）ＰＥＧ　　３３５０を含有するＰＩ含有
上澄み溶液を形成した。この上澄み溶液を５つの等しい
部分に分割し、そして各部分に下表Ｖに記載する増分で
ＰＥＧの追加の部分を添加した。ＰＩはＰＥＧ含右含浸
上澄液から沈殿した。このＰＩを緩衝溶液中で再構成し
、モしてＰＩ活性についてアッセイした。この実験の結
果を下表Ｖに記載し、ここで収率（％）は再構成した溶
液のＰＩ活性を出発上澄み溶液のＰＩ活性で割った値に
１℃を掛けることによって決定した。

表Ｖ、実施例５の結果 追加のＰＥＧ　　アルファ−１−ＰＩ 実験　　　（％ｗ／ｖ）　　　　　の収率％５−Ａ　　
　　　　８　　　　　　　８１５−Ｂ　　　　　１０　
　　　　　　９７５−Ｃ１０９３ ５−Ｄ　　　　　１２　　　　　　１℃５−Ｅ、　　　
　　１５　　　　　　１℃夫施燃上 この実施例は、実施例５に記載するようなＰＩのそれ以
上の精製を例示するが、ただし、この実施例において、
実施例３に記載するようにして得られたカラムの溶離液
の２つの部分をアッセイしてカラムの溶離液中のＰＩの
相対純度を決定した。次いで、ＰＩをカラムの溶離液か
ら−Ｌの実施例に記載するような２Ｉ程のＰＥＧ　　３
３５−の添加（２０％＋ｌＯ％、ｗ　／　ｖ　）により
分ＭＬ、そして得られるＰＩの沈殿を緩衝溶液中で再構
成し、そしてＰＩ活性をアッセイした。結果を下表■に
記載する。

表■、実施例６の結果 カラムの溶離　再構成した沈殿の 実験　　　液の相対純度　　　相対純度６−Ａ　　　　
Ｏ，２５０，５３ ６−Ｂ　　　　Ｏ，３２０，５８ 実施例７ この実施例は、実施例５および実施例６に記載するよう
にして得られたＰＩのＤＥＡＥ？ｌ換多糖類の樹脂のク
ロマトグラフィー、すなわち、ＤＥＡＥアニオン交換樹
脂のクロマトグラフィーによるなおそれ以上の精製を例
示する。カラム上のＤＥＡＥ−セファロースＣＬ６Ｂフ
ァスト・フロー樹脂（二重反復試験で）を０．０２モル
のリン酸ナトリウム緩衝溶液でｐＨ６，５においてモ衡
化し　そして実施例５および実施例６に従い得られたＰ
Ｉ含有沈殿をこのカラムに適用した。カラムを１容積の
緩衝溶液で洗浄した後、このアニオン交換樹脂に結合し
たＰＩを０．０２モルのリン酸ナトリウＬ、Ｗ衝溶液ｐ
Ｈ６，５でその樹脂から溶離した。この実施例の結果を
ド表７に記・敗する。

表■、実施例７の結果 ＋Ｉｊ構成した沈殿の　　カラムの溶離実験　　　　　
相対純度　　−液の相対純度７−Ａ　　　　　　　Ｏ，
５８０，７５７−Ｂ　　　　　　　Ｏ，５℃，７２実施
例８ 実質的に実施例１に記載するのと回−の−ｒ順を反復し
たが、ただしコーンエフルエンｈＩＩ−１−Ｄｌｂ７）
代わりにコーンエフルエン）Ｉを使用した。

コーンエフルエントｒを５容積の０．０２モルのリン酸
ナトリウム緩衝溶液に対してｐＨ６，５および５°Ｃの
温度において透析６過しだ。

この’ｘｆｌ　析Ｍ　過したコーンエフルエントエを、
０．０２モルのリン酸ナトリウム緩衝溶液でｐＨ６５，
５°Ｃにおいて平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＣＬ
６Ｂファスト拳フローＭ　脂を含有するカラムに適用し
た。この方ラムを１容積の０．０２モルのリン酸ナトリ
ウム緩衝溶液でｐＨ６，５，５°Ｃにおいて洗浄した後
、緩衝溶離液を他の処理のために廃棄した。

次いで、このカラムを０．０７５モルのリン酸ナトリウ
ム緩衝溶液でｐＨ６，５，５°Ｃにおいて溶離して、Ｄ
ＥＡＥ−セファロースＣＬ６Ｂ樹脂へ結合した出発コー
ンエフルエン）Ｉ中に含有されたＰＩを置換した。

ＰＩは出発コーンエフルエントエに関して３０倍の純度
で得られた溶離液中に回収された。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、工程： （ａ）アルファ−１−プロテイナーゼ阻害剤を含有する
   血漿蛋白質の水溶液を透析濾過およびゲル濾過から選択
   される少なくとも１つの手段により処理して、前記溶液
   中の塩類の濃度を約０．０２モル以下に低下させ、 （ｂ）工程（ａ）から得られた溶液を前記溶液中のアル
   ファ−１−プロテイナーゼ阻害剤に対して選択的親和性
   を有するアニオン交換樹脂と接触させて、前記樹脂にア
   ルファ−１−プロテイナーゼ阻害剤を選択的に結合させ
   かつ前記樹脂に結合しない血漿蛋白質類を前記樹脂を通
   して第１溶離液中に溶離し、 （ｃ）工程（ｂ）から得られたアルファ−１−プロテイ
   ナーゼ阻害剤を選択的に結合して有するアニオン交換樹
   脂を、アルファ−１−プロテイナーゼ阻害剤を前記樹脂
   から第２溶離液中に置換するために十分なイオン強度を
   有する溶離剤と接触させ、そして （ｄ）工程（ｃ）から得られた前記第２溶離液からアル
   ファ−１−プロテイナーゼ阻害剤を回収する、 を含んでなることを特徴とするアルファ−１−プロテイ
   ナーゼ阻害剤を含有する血漿蛋白質の水溶液からアルフ
   ァ−１−プロテイナーゼ阻害剤を分離する方法。 ２、アルファ−１−プロテイナーゼ阻害剤を含有する血
   漿蛋白質の水溶液はコーンエフルエントII＋III、コー
   ンエフルエント I および低温上澄み溶液から成る群よ
   り選択される特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、アルファ−１−プロテイナーゼ阻害剤を含有する血
   漿蛋白質の水溶液はコーンエフルエントII＋IIIおよび
   コーンエフルエント I から成る群より選択される特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 ４、アルファ−１−プロテイナーゼ阻害剤を含有する血
   漿蛋白質の水溶液はコーンエフルエントII＋IIIから成
   る群より選択される特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５、工程（ａ）の前に、前記水溶液を処理して、コーン
   エフルエントII＋IIIおよびコーンエフルエント I から
   成る群の構成員の水溶液中に存在するアルコールの実質
   的にすベてを除去する特許請求の範囲第３項記載の方法
   。 ６、工程（ｂ）において、アニオン交換樹脂はポリガラ
   クトース、ポリデキストランおよびセルロースの樹脂の
   群から選択される多糖類の吸着剤であり、ここで多糖類
   の鎖は多糖類の鎖のグルコース単位へエーテル結合によ
   り取り付けられたジエチルアミノエチル基および第四エ
   チル基から選択される正に帯電した基を有する特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ７、工程（ｃ）において、アルファ−１−プロテイナー
   ゼ阻害剤をアニオン交換樹脂から置換するために十分な
   イオン強度を有する溶離剤は、約０．０２モル〜約０．
   ３モルの範囲の濃度を有しかつ約５．５〜約８．６の範
   囲のｐＨを有する水溶性無機塩および水溶性有機塩から
   成る群より選択される少なくとも１種の構成員を含有す
   る水性緩衝溶液である特許請求の範囲第１項記載の方法
   。 ８、工程（ｄ）において、第２溶離液をポリエチレング
   リコールおよびポリプロピレングリコールから選択され
   るポリ縮合ポリアルキレングリコールと接触させること
   によって、アルファ−１−プロテイナーゼ阻害剤を第２
   溶離液から回収する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ９、工程（ｄ）において、（１）まず第２溶離液を、第
   ２溶離液の容積に基づいて、約１０％〜約２０％（ｗ／
   ｖ）のポリ縮合ポリアルキレングリコールと約４．６〜
   ５．７の範囲のｐＨおよび約２℃〜約１０℃の温度にお
   いて約１分〜約１時間の間接触させ、そして生ずる沈殿
   を分離しかつ生ずる上澄み溶液を保持し、次いで（２）
   保持された上澄み溶液を、第２溶離液の容積に基づいて
   、約８〜約１５ｗ／ｖ％の追加のポリ縮合ポリアルキレ
   ングリコールと約４．６〜５．７の範囲のｐＨおよび約
   ２℃〜約１０℃の温度において約１分〜約１時間の間接
   触させ、そしてアルファ−１−プロテイナーゼ阻害剤を
   含有する得られた沈殿を保持する特許請求の範囲第８項
   記載の方法。 １０、（３）アルファ−１−プロテイナーゼ阻害剤を含
   有する得られた沈殿を緩衝溶液中で再構成し、（４）次
   に工程（３）からの溶液をアルファ−１−プロテイナー
   ゼ阻害剤に対する親和性を有するアニオン交換樹脂と接
   触させ、そして（５）次いでアルファ−１−プロテイナ
   ーゼ阻害剤を置換するために十分なイオン強度を有する
   溶離液とアニオン交換樹脂を接触させて、アルファ−１
   −プロテイナーゼ阻害剤を含有する生ずる第３溶離液を
   得ることによって、アルファ−１−プロテイナーゼ阻害
   剤をアニオン交換樹脂から溶離する追加の工程を含む特
   許請求の範囲第９項記載の方法。 １１、工程（ｄ）において、（１）まず第２溶離液を約
   １０％〜約２０％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール
   およびポリプロピレングリコールから選択されるポリ縮
   合ポリアルキレングリコールと約４．６〜５．７の範囲
   のｐＨおよび約２℃〜約１０℃の温度において約１分〜
   約１時間の間接触させて、第２溶離液からアルファ−１
   −プロテイナーゼ阻害剤を沈殿させないで、不必要な蛋
   白質類を沈殿させ、そして生ずる沈殿を分離しかつ生ず
   る上澄み溶液を保持し、（２）次に保持された上澄み溶
   液をアルファ−１−プロテイナーゼ阻害剤に対する親和
   性を有するアニオン交換樹脂と接触させ、そして（３）
   次いでアルファ−１−プロテイナーゼ阻害剤を置換する
   ために十分なイオン強度を有する溶離液とアニオン交換
   樹脂を接触させて、アルファ−１−プロテイナーゼ阻害
   剤を含有する生ずる第３溶離液を得ることによって、ア
   ルファ−１−プロテイナーゼ阻害剤を第２溶離液から回
   収する特許請求の範囲第１項記載の方法。 １２、工程（ｄ）から得られたアルファ−１−プロテイ
   ナーゼ阻害剤を処理して不活性化し、そして感染性微生
   物の感染性を減少させて、アルファ−１−プロテイナー
   ゼ阻害剤をこのような伝染性微生物に対して非伝染性と
   し、これによりアルファ−１−プロテイナーゼ阻害剤を
   治療および要望の目的に有用とする工程をさらに含む特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 １３、プロテアーゼ阻害有効量の特許請求の範囲第１項
   記載の方法により製造されたアルファ−１−プロテイナ
   ーゼ阻害剤および製薬学的に許容されうる担体を含んで
   なることを特徴とする製薬学的組成物。 １４、プロテアーゼ阻害有効量の特許請求の範囲第１２
   記載の方法により製造されたアルファ−１−プロテイナ
   ーゼ阻害剤および製薬学的に許容されうる担体を含んで
   なることを特徴とする製薬学的組成物。 １５、工程： （ｉ）コーンエフルエントII＋IIIおよびコーンエフル
   エント I から成る群より選択されるアルファ−１−プ
   ロテイナーゼ阻害剤を含有する血漿分画の水溶液を、前
   記水溶液の容積に基づいて、約１０％〜約３５％（ｗ／
   ｖ）のポリエチレングリコールおよびポリプロピレング
   リコールから選択されるポリ縮合ポリアルキレングリコ
   ールと約４．６〜５．７の範囲のｐＨおよび約２℃〜約
   １０℃の温度において約１〜２４時間の間接触させて、
   前記溶液からアルファ−１−プロテイナーゼ阻害剤を沈
   殿させないで不必要な蛋白質類を選択的に沈殿させ、そ
   して （ｉｉ）工程（ｉ）において得られた溶液からアルファ
   −１−プロテイナーゼ阻害剤を分離する、 を含んでなるコーンエフルエントII＋IIIおよびコーン
   エフルエント I から成る群より選択されるアルファ−
   １−プロテイナーゼ阻害剤を含有する血漿分画の水溶液
   からアルファ−１−プロテイナーゼ阻害剤を分離する方
   法において、 （ａ）前記血漿分画の水溶液を処理して、コーンエフル
   エントII＋IIIおよびコーンエフルエント I から成る群
   の構成員の水溶液中に存在するアルコールの実質的にす
   べてを除去し、 （ｂ）工程（ａ）からの水溶液を透析濾過およびゲル濾
   過から選択される少なくとも１つの手段により処理して
   、前記溶液中の塩類の濃度を約０．０２モル以下に低下
   させ、 （ｃ）工程（ｂ）からの溶液を前記溶液中のアルファ−
   １−プロテイナーゼ阻害剤に対して選択的親和性を有す
   るアニオン交換樹脂と接触させて、前記樹脂にアルファ
   −１−プロテイナーゼ阻害剤を選択的に結合させかつ前
   記樹脂に結合しない血漿蛋白質類を前記樹脂を通して第
   １溶離液中に溶離し、 （ｄ）工程（ｃ）から得られたアルファ−１−プロテイ
   ナーゼ阻害剤を選択的に結合して有するアニオン交換樹
   脂を、アルファ−１−プロテイナーゼ阻害剤を前記樹脂
   から第２溶離液中に置換するために十分なイオン強度を
   有する溶離剤と接触させる、 を含んでなり、 前記第２溶離液は上の工程（ｉ）および（ｉｉ）に従い
   処理されたアルファ−１−プロテイナーゼ阻害剤を含有
   する水溶液からなる、 ことを特徴とする方法。 １６、工程（ｃ）において、アニオン交換樹脂はポリガ
   ラクトース、ポリデキストランおよびセルロースの樹脂
   の群から選択される多糖類の吸着剤であり、ここで多糖
   類の鎖は多糖類の鎖のグルコース単位へエーテル結合に
   より取り付けられたジエチルアミノエチル基および第四
   エチル基から選択される正に帯電した基を有する特許請
   求の範囲第１５項記載の方法。 １７、工程（ｄ）において、アルファ−１−プロテイナ
   ーゼ阻害剤をアニオン交換樹脂から置換するために十分
   なイオン強度を有する溶離剤は、約０．０２モル〜約０
   ．３モルの範囲の濃度を有しかつ約５．５〜約８．６の
   範囲のｐＨを有する水溶性無機塩および水溶性有機塩の
   １種を含有する水性緩衝溶液である特許請求の範囲第１
   ５項記載の方法。 １８、工程（ｉｉ）から得られたアルファ−１−プロテ
   イナーゼ阻害剤を処理して不活性化し、そして伝染性微
   生物の伝染性を減少させて、アルファ−１−プロテイナ
   ーゼ阻害剤をこのような伝染性微生物に対して非伝染性
   とし、これによりアルファ−１−プロテイナーゼ阻害剤
   を治療および要望の目的に有用とする工程をさらに含む
   特許請求の範囲第１５項記載の方法。 １９、プロテアーゼ阻害有効量の特許請求の範囲第１５
   項記載の方法により製造されたアルファ−１−プロテイ
   ナーゼ阻害剤および製薬学的に許容されうる担体を含ん
   でなることを特徴とする製薬学的組成物。