JPH062067B2

JPH062067B2 - 酵母ｎａｄｐｈ‐チトクロムｐ４５０還元酵素産生菌株

Info

Publication number: JPH062067B2
Application number: JP63202758A
Authority: JP
Inventors: 裕子村上; 利之 ▲榊▼; 恵柴田; 義康薮崎; 秀郎大川
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1988-08-16
Filing date: 1988-08-16
Publication date: 1994-01-12
Anticipated expiration: 2009-01-12
Also published as: JPH02211880A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、酵母NADPH-チトクロムP450還元酵素遺伝子お
よび該酵素を大量生産するための発現プラスミド、該プ
ラスミドを保持する酵母菌株、および該酵母を用いるこ
とによる該酵素の生産方法に関する。さらに、本発明
は、NADPH-チトクロムP450還元酵素を大量生産すること
により、酵母菌体内の該酸素レベルを上昇させ、哺乳動
物由来のチトクロムP450に依存した一原子酵素添加活性
を向上させる方法に関する。本発明により得られる酵母
菌株は、チトクロムP450を生産し、かつ、NADPH-チトク
ロムP450還元酵素を大量生産しており、高い一原子酸素
添加活性を有する。したがって、この菌株は、医薬品と
して有用なアセトアミノフエンやステロイド類を合成の
ためのバイオリアクターとして用いることができる。

従来技術および問題点哺乳動物や酵母などの真核細胞のミクロソーム膜には、
チトクロムP450とNADPH-チトクロムP450還元酵素から構
成される電子伝達系が存在する。チトクロムP450は、こ
の電子伝達系の末端に位置するヘム蛋白質である。チト
クロムP450は多くの分子種からなる酵素群で、各々の分
子種は幅の広い基質特異性を示し、しかもその基質特異
性が重複しているので、広範囲の脂溶性化合物に対し
て、一原子酸素添加反応を触媒することができる。一
方、NADPH-チトクロムP450還元酵素は分子内にフラビン
アデニンモノヌクレオチドとフラビンモノヌクレオチド
を１分子ずつ含有するフラビン酵素であり、NADPHから
の電子をチトクロムP450へ伝達する役割をはたす。チト
クロムP450が分子多様性を示すにもかかわらず、NADPH-
チトクロムP450還元酵素はいずれのチトクロムP450分子
種に対しても、NADPHからの電子を供給することができ
る。しかも、このNADPH-チトクロムP450還元酵素による
チトクロムP450への電子伝達は、生物種をこえており、
例えば、ラット肝還元酵素がウサギ肝チトクロムP450
へ、酵母還元酵素がウサギあるいはラット肝チトクロム
P450へと、電子の伝達が可能である。

本発明者らは、すでに、ラット肝チトクロムP450遺伝子
およびラット肝NADPH-チトクロムP450還元酵素遺伝子
を、それぞれ単離し（特開昭61-56072，特開昭62-1908
5）、これらの遺伝子を酵母内で発現させ、機能を有す
る酵素蛋白質を生産させることに成功した。酵母内で発
現したラット肝チトクロムP450と還元酵素は、酵母ミク
ロソーム膜に局在し、ラット肝チトクロムP450に依存し
た一原子酸素添加活性を発揮した。さらに、発明者ら
は、チトクロムP450と還元酵素の両方を生産する酵母菌
株を製造し、これがチトクロムP450に依存した酸化活性
を示し、各種化合物の酸化反応プロセスへバイオリアク
ターとして利用できることを示した（特開昭62-10458
2）。また、発明者らは、遺伝子工学および蛋白質工学
的手法を用いて、各種のチトクロムP450分子種間でのキ
メラ体チトクロムP450およびチトクロムP450と還元酵素
の機能を１分子内に合わせもつ新規モノオキシゲナーゼ
の作出に成功した（特願昭62-104583，特願昭61-7663
3，特願昭61-187713）。さらにまた、発明者らはウシ副
腎皮質ミクロソームのチトクロムP450分子種について
も、その遺伝子を単離し、酵母で発現させることによ
り、ステロイド化合物を酸化できる酵母菌株を製造し
た。（特願昭62-204101）一方、NADPH-チトクロムP450
還元酵素に関しては、ラット肝還元酵素遺伝子のほか
に、ウサギ肝還元酵素遺伝子（特願昭61-43443）、酵母
還元酵素遺伝子（特願昭62-325527）の取得に成功し
た。このように、NADPH-チトクロムP450還元酵素は、チ
トクロムP450とともに用いることにより酸化反応用のバ
イオリアクターとして利用できる。酵母還元酵素は、ラ
ット肝チトクロムP450、ウシ副腎チトクロムP450へ、NA
DPHからの電子を供給でき、しかも、酵母還元酵素によ
るチトクロムP450への電子供給作用はきわめて効率的で
ある。したがって、酵母還元酵素を大量に生産すること
により、酸化反応用バイオリアクターの性能向上が期待
できる。

本発明者らは、酵母NADPH-チトクロムP450還元酵素の遺
伝子を用いて、これを酵母内で発現させる発現プラスミ
ドの構築に成功した。これにより、酵母還元酵素を大量
に生産する酵母菌株が創製できた。このことは酵母還元
酵素の単離、精製を容易にする、すなわち、従来、酵母
還元酵素の精製は、酵母ミクロソームを界面活性剤で可
溶化し、化溶化ミクロソーム蛋白質を硫安分画したの
ち、ヒドロキシルアパタイト、（ジエチルアミノエチ
ル）DEAE−セルロースカラムクロマトグラフィーを行う
ことにより可能であった(Y.Aoyama et al., Arch, Bioc
hem. Biophys., 185, 362(1985))が、酵母ミクロソーム
の還元酵素含量が大幅に上昇したことにより、精製が容
易に実施できると考えられる。また、本発明者らは、酵
母還元酵素と哺乳動物由来のチトクロムP450分子種を同
時に発現させる発現プラスミドを構築した。構築した発
現プラスミドにより形質転換した酵母は、チトクロムP4
50を生産するとともに、酵母還元酵素を大量生産してお
り、チトクロムP450依存性の酸化活性が著しく上昇し
た。この結果、製造した酵母菌株は酸化反応用バイオリ
アクターとしての性能が向上したと考えられる。

以下、本発明を更に詳細に説明する。

本発明に用いる酵母NADPH-チトクロムP450還元酵素をコ
ードするcDNAは、既に公知であり、通常の操作法でこれ
を単離することができる。本発明の融合酵素を発現する
発現プラスミドは酵母NADPH-チトクロムP450還元酵素遺
伝子を適当な発現プラスミドに常法により挿入し構築す
ることができる。発現プラスミドとしては、公知の発現
ベクターを用いることができる。例えば、酵母アルコー
ル脱水素酵素（ＡＤＨ１）遺伝子のプロモーターおよび
同ターミネーターを保持する酵母発現ベクターpAAH5(Me
thods in Enzymology,101,partC,p192-201)が挙げられ
るが、PGKプロモーター、G3PDHプロモーター，GAL10プ
ロモーターを有する発現ベクターなど、宿主内で効率よ
く機能するプロモーターおよびターミネーターを有する
ものであればよく、特に、限定されるものでない。ま
た、発現プラスミドの構造も限定されるものでなく、酵
母内で安定に保持されるものであればよい。宿主として
酵母、例えばサッカロミセス・セレビシェAH22株、サッ
カロミセス・セレビシェSHY3株やサッカロミセス・セレ
ビシェNA87-11A株などが、好都合に使用することができ
る。宿主の酵母NADPH-チトクロムP450還元酵素遺伝子を
含む発現プラスミドによる形質転換は、アルカリ金属(L
iCl)を用いる方法、プロトプラスト法など公知の方法で
行うことができる。このようにして得られた形質転換酵
母菌体を培養することにより酵母NADPH-チトクロムP450
還元酵素を製造することができる。本発明により得られ
る形質転換酵母の培養は通常の培養方法により行う事が
できる。

以下、実施例に基づき、本発明を詳細に説明する。本発
明は実施例のみに限定されるものではなく、本発明の技
術分野における通常の変更をすることができる。

実施例１発現プラスミドpAAR1の構築以下の実施例で、制限酵素によるＤＮＡの切断、アルカ
リホスファターゼによるＤＮＡの脱リン酸化、ＤＮＡリ
ガーゼによるＤＮＡの結合などの反応は、特に断わらな
い限り、通常20〜200μの反応容積を用いて、これら
の酵素類を市販するメーカー（例えば、宝酒造（株））
が製品に添付した反応条件で実施した。

第１図に発現プラスミドpAAR1の構築を示す。

酵母NADPH-チトクロムP450還元酵素遺伝子を含むλgt11
ファージpgGYK（特願昭62-325527参照）を、制限酵素Kp
mIとSacIで同時消化し、約１．９KbのKpnI断片と約0.9K
bのKpnI−SacI断片を、それぞれ低融点アガロースゲル
電気泳動法により回収し、市販のクローニングベクター
pUC19とのリガーゼ反応を行い、大腸菌JM109株を形質転
換した。それぞれの形質転換体から、Birnboim-Dolyの
方法(Nucleic Acids Ref., 7,1513(1979))に従い、プラ
スミドＤＮＡを調整し、目的とするＤＮＡ断片が挿入さ
れたプラスミドを、それぞれ、pUKN3，pUKS31とした。p
UKN3をSau3AIで消化し、約１．０KbのＤＮＡ断片をpUC1
9のBamHI部位に挿入することにより、プラスミドpUHBを
得た。同様に、pUKS31をSau3AIで消化し、約350bpのＤ
ＮＡ断片をpUC19のBamHI部位に挿入することにより、プ
ラスミドpUBHを得た。pUHB、pUBHは、それぞれ、還元酵
素遺伝子の開始コドン、終止コドンを、pUC19のマルチ
クローニングサイトのHindIII側に有する構造をとる。
ついで、pUHB，pUBHをそれぞれ、HindIIIとBamHIで同時
消化することにより調整したＤＮＡ断片を、あらかじめ
BamHI部位を欠失させたpUC19(pUC19をHincIIとSmaIで消
化し、再結合することにより調整できる）をHindIII消
化しアルカリホスファターゼ処理したベクターＤＮＡ断
片とともに、リガーゼ反応を行ったのち、大腸菌JM109
株を形質転換した。形質転換体からプラスミドＤＮＡを
調整し、pUHB、pUBH由来のＤＮＡ断片を１つずつ含むプ
ラスミドをpUHBHとした。

一方、前述のプラスミドpUKN3をKpnIで消化し、約1.9Kb
のKpnI断片を調製した。これを、pUKS31のKpnI部位に挿
入し、還元酵素遺伝子が正しく挿入されたプラスミドを
pUSKK6とした。pUSKK6をBamHIで消化し、約720bpのBamH
I断片を調製し、プラスミドpUHBHのBamHIに挿入した。
還元酵素の構造遺伝子部分が正しく再生されたプラスミ
ドをpUARとした。pUARは還元酵素の構造遺伝子を含み、
HindIIIで消化することにより、構造遺伝子部分を容易
に調製できる。pUARをHindIIIで消化し、約2.1KbのＤＮ
Ａ断片を調製し、これをHindIII消化後、アルカリ性ホ
スファターゼ処理を施した酵素発現ベクターpAAH5(Meth
ods in Enzymology, vol 101, P192)とのリガーゼ反応
を行った後、大腸菌JM109株を形質転換した。形質転換
体からプラスミドＤＮＡを調製し、ＤＮＡ構造を確認
し、還元酵素遺伝子がＡＤＨプロモーターとターミネー
タに対して、順方向に挿入されたプラスミドをpAAR1と
した。

実施例２発現プラスミドpARR3の構築第２図に発現プラスミドpARR3の構築を示す。

実施例１で構築したプラスミドpUSKK6は、還元酵素遺伝
子の5'上流非翻訳領域約350bpと、3'下流非翻訳領域約5
00bpを含む。これら非翻訳領域中には、酵母遺伝子のプ
ロモーター、ターミネーターに特異的な塩基配列が見い
出され、これらは酵母内で機能し、還元酵素蛋白質を合
成できると考えられる。そこで、還元酵素遺伝子のプロ
モーター、ターミネーター支配下に、還元酵素を発現す
るプラスミドを構築した。

プラスミドpUSKK6をSphI、ScaI、SacIで同時消化し、約
1.2KbのSphI−ScaI断片と約1.7KbのScaI−SacI断片を調
製した。一方、クローニングベクターpUC19のEcoRI部位
を、フィルイン反応により平滑末端としたのち、HindII
Iリンカー（市販品）を付加した。このベクターをSph
I、SacIで同時消化し、先に調製したSphI−ScaI断片、S
caI−SacI断片とともにリガーゼ反応の行ない、大腸菌J
M109株を形質転換した。こうして、還元酵素遺伝子の両
側にHindIII部位を導入したプラスミドpUPRを得た。

酵母発現ベクターpAAH5をBamHIで消化し、ＡＤＨプロモ
ーター、ターミネーター領域を除き、BamHI部位をフィ
ルインしたのち、HindIIIリンカーの付加した。このベ
クターと、先のプラスミドpUPRのHindIII、ScaI同時消
化物とのリガーゼ反応を行ない、大腸菌を形質転換し
た。形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、そのＤ
ＮＡ構造を確認することにより、目的とする発現プラス
ミドpARR3を得た。

実施例３発現プラスミドpAMR1の構築ラットp450c(P-450MC)発現プラスミドpAMC1（特開昭61-
88878，特開昭61-56072に記載）をBamHIで部分消化し、
１ヶ所のみ切断されたＤＮＡ断片を、低融点アガロース
ゲル電気泳動法により回収し、アルカリホスファターゼ
処理を施した。一方、実施例１で構築した酵母還元酵素
発現プラスミドpAAR1をBamHIで部分消化し、ＡＤＨプロ
モーター・還元酵素遺伝子・ＡＤＨターミネーターから
成る約4Kbの還元酵素発現ユニットを、低融点アガロー
スゲル電気泳動により回収した。調製した両ＤＮＡ断片
をリガーゼ反応により連結したのち、大腸菌JM109株を
形質転換した。形質転換株からプラスミドＤＮＡを調製
し、ＤＮＡ構造を解析した。p450c発現ユニットと還元
酵素発現ユニットを１つずつ含むプラスミドを、pAMR1
と名づけた。

実施例４発現プラスミドpAMR2の構築ラットP450c発現プラスミドpAMC1をBamHIで消化し、約
3.7KbのP450c発現ユニット（ＡＤＨプロモーター・P450
ccＤＮＡ・ＡＤＨターミネーター）を低融点アガロース
ゲル電気泳動法により回収した。一方、実施例２で構築
した酵母還元酵素発現プラスミドpARR3をBamHIで部分消
化し、１ヶ所のみ切断されたＤＮＡ断片を調製し、アル
カリ性ホルファターゼ処理を施した。これに、P450c発
現ユニットから成るBamHI断片を挿入した。pARR3には、
BamHI部位が４ヶ所あるが、還元酵素遺伝子の両端にあ
るBamHI部位のうち一方に、p450c発現ユニットが挿入さ
れたプラスミドをpAMR2と名づけた。

実施例５発現プラスミドpARαの構築酵母発現ベクターpAAH5は、BamHI消化によりＡＤＨプロ
モーターターミネーターから成る発現ユニットを切り出
すことができる。pAAH5のHindIII部位に異種遺伝子を挿
入した場合にも同様に、BamHI消化により、発現ユニッ
トを切り出すことができる。例えばP450c発現プラスミ
ドpAMC1をBamHIで切断すると、ＡＤＨプロモーターP450
ccＤＮＡ−ＡＤＨターミネーターから成るP450c発現ユ
ニットを容易に調製できる。しかしながら、挿入した異
種遺伝子中にBamHI部位が存在する場合には、これ程容
易ではない。例えば、実施例３で述べた還元酵素発現ユ
ニットを調製するためには、pAAR1をBamHIで部分消化
し、目的とする約4KbのＤＮＡ断片を切り出す必要があ
った。そこで、pAAH5のBamHI部位をNotI部位に置換した
発現ベクターpAAH5Nを構築した。BamHIが６塩基認識酵
素であるのに対して、NotIは８塩基認識酵素であるの
で、遺伝子中のNotI存在頻度は、BamHIに比べ著しく低
いと考えられる。

第３図に発現プラスミドpARαの構築を示す。

現ベクターpAAH5をBamHIで部分消化したのち、アルカ
リ性ホスファターゼ処理を施した。これと以下に示すNo
tIリンカー（ＤＮＡ合成機を用いて作製）とのリガーゼ
反応を行ない、大腸菌DH1株を形質転換した。

Not1リンカー：GATCGCGGCCGC CGCCGGCGCTGAC 形質転換株からプラスミドＤＮＡを調製し、NotIで切断
されるプラスミドを得た。これを、前述と同様に、BamH
I消化し、アルカリホスファターゼ処理を施したのち、N
otIリンカーとのリガーゼ反応を行ない、大腸菌DH1株を
形質転換した。こうしてpAAH5の２ヶ所のBamHI部位をNo
tIで置換した発現ベクターpAAH5Nを得た。

ウシ副腎P450₁₇α発現プラスミドPAα２をHindIIIとEco
RIで同時消化し、約0.3Kbと1.5KbのHindIII−EcoRI断片
を調製した。このＤＮＡ断片を、あらかじめHindIII消
化し、アルカリホスファターゼ処理を施したpAAH5Nとの
リガーゼ反応を行ない、大腸菌DH1株を形質転換した。
形質転換株からプラスミドＤＮＡを調製し、HindIII、E
coRI消化などにより、ＤＮＡ構造を解析し、ＡＤＨプロ
モーターターミネーターに対して、P450₁₇α ＣＤＮＡ
が順方向に挿入されたプラスミドをpANαと名づけた。

一方、酵母還元酵素発現プラスミドpARR3をBamHIで部分
消化し、上述したとの同様に、NotIリンカーを挿入し、
還元酵素遺伝子の３’側のBamHI部位をNotIで置換した
プラスミドpARRNを得た。pARRNをNotIで消化したのち、
pANαから調製した約1.8KbのNotI断片を挿入した。得ら
れた形質転換株のプラスミドＤＮＡ構造を解析した結
果、P450₁₇α発現ユニットを１つ挿入したプラスミドを
pARαとした。

実施例６発現プラスミドpARγの構築第４図に発現プラスミドpARγの構築を示す。

ウシ副腎P450_C21発現プラスミドpUC21C2（微工研菌寄第
10093号）をHindIIIで消化し、約1.6KbのHindIII断片を
調製した。実施例５と同様にして、このＤＮＡ断片を、
pAHH5NのHindIII部位に挿入して、ＡＤＨプロモータ
ー、ターミネータに対して、P450_C21CＤＮＡが順方向に
挿入されたプラスミドpANγを得た。pANγをNotIで消化
し、P450_C21発現ユニットから成る約3.6KbのNotI断片を
調製し、実施例５と同様にして、これをpARRNのNotI部
位に挿入することにより、目的とする発現プラスミドpA
Rγを構築した。

実施例７発現プラスミドによる酵母の形質転換サッカロミセス・セレビシェAH22株(ATCC 38626)を、５
mlのYPD培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２
％グルコース）中で30℃、18時間培養したのち、１mlの
酵母培養液を遠心分離し、集菌した。菌体を、0.2M LiC
l溶液１mlで洗浄したのち、1M LiCl溶液20μｌに懸濁し
た。

これに、70％ポリエチレングリコール4000溶液30μｌ、
発現プラスミド溶液10μｌ（約１μｇ）を添加して、十
分に混合したのち、30℃で１時間インキュベートした。
ついで、140μｌの水を加え、よく撹拌したのち、この
溶液をＳＤ合成培地プレート（２％グルコース、0.67％
酵母窒素源アミノ酸不含、20μｇ／mlヒスチジン、２％
寒天）上にまき、30℃で３日間インキュベートすること
により、プラスミドを保持する形質転換体を得た。プラ
スミドpAAR1、pARR3、pAMR1、pAMR2、pARα、pARγで形
質転換した酵母を、それぞれ、AH22(pAAR1)株、AM22(pA
RR3)株、AM22(pAMRI)株、AH22(pAMR2)株、AH22(pARα）
株、AH22(pARγ）株とした。

実施例８酵母NADPH-チトクロムP450還元酵素の生産実施例７で得た酵母AH22(pAARI)株、AH22(pARR3)株およ
び対照として、発現ベクターpAAH5で形質転換した酵母A
H22(pAAH5)株を、それぞれ、SD合成培地（２％グルコー
ス、0.67％酵母窒素源アミノ酸不含、20μｇ／mlヒスチ
ジン）で、約２×10⁷菌体／mlまで培養した。酵母培養
液0.9mlに、2NHaOH、８％２−メルカプトエタノール
を0.1ml加え、氷中で10分間インキュベートしたのち、3
0％トリクロロ酢酸0.2mlを加え、さらに、氷中で10分間
インキュベートした。12,000rpm２分間の遠心分離によ
り沈澱を集め、氷冷したアセトンで洗浄したのち、乾燥
させた。

調製した酵母全蛋白質は、100℃５分間加熱したサンプ
ルバッファー（４％ドデシル硫酸ナトリウム、0.16Mト
リス−塩酸(pH6.8)、0.38M２−メルカプトエタノール、
20％グリセロール、0.01％プロムフェノールグルー）50
μｌを加え、100℃でインキュベートすることにより溶
解させた。これを、７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲルに供し、Laemmliの方法(Nature,227,680)に従っ
て、電気泳動を行った。泳動後、アクリルアミドゲルと
ニトロセルロースフィルターを重ね、ブロッティングバ
ッファー（25mMトリス−塩酸(pH8.8), 192mMグリシン、
20％メタノール）中で、30Ｖの電圧をかけ、泳動した蛋
白質をアクリルアミドゲルからニトロセルロースフィル
ターへ移行させた。ついで、ニトロセルロースフィルタ
ーをＴＢＳバッファー（50mMトリス−塩酸(pH7.5)、200
mM NaCl）に浸したのち、３％ゼラチン、0.05％ツィン2
0を含むＴＢＳバッファー中で、37℃40分間インキュベ
ートした。つぎに100μｇの抗酵母還元酵素抗体(Y.Aoya
ma et al.,J.B.C.,259,1661(1984)参照）、％ゼラチ
ン、0.05％ツィン20を含むＴＢＳバッファー中で、37℃
２時間インキュベートした。抗体との反応後、0.05％ツ
ィン20を含むＴＢＳバッファー中で、37℃30分間ずつ４
回洗浄をくりかえしたのち、３％ゼラチン、0.05％ツィ
ン20を含むＴＢＳバッファー中で、37℃20分間インキュ
ベートした。続いて、このニトロセルロースフィルター
を、２μCiの〔¹²⁵I〕プロティンＡ（アマーシャム社よ
り購入）、１％ゼラチン、0.05％ツィン20を含むＴＢＳ
バッファー中に浸し37℃１時間インキュベートした。0.
05％ツィン20を含むＴＢＳバッファー中で、37℃で 30
分間ずつ４回洗浄したのち、フィルターを風乾し、オー
トラジオグラフィーを行った。AH22(pAARI)株、AH22(pA
RR3)株，AH22(pAAH5)株は、いずれも抗還元酵素抗体を
反応する蛋白質のバンドを示し、その泳動位置は、酵母
還元酵素標品(Y.Aoyama et al.,Arch.Biochem.Biophys.
185,362(1978)参照）の泳動位置と同じであった。既知
量の酵母還元酵素標品を同時に電気泳動し、抗還元酵素
抗体と反応するバンドの部分をフィルターから切取り、
γ−カウンターで放射活性を測定することにより、還元
酵素量と放射活性の間の検量線を作成した。各酵母菌株
の抗還元酵素抗体と反応することができる。バンドの部
分の放射活性を測定し、作成した検量線から酵母細胞に
おける還元酵素産生量を測定した。その結果、AH22(pAA
RI)株で9.4×10⁵分子／菌体、AH22(pARR3)株で7.5×10⁵
分子／菌体の還元酵素が産生していることが判明した。
これに対して、対照であるAH22(pAAH5)株の還元酵素含
量は、４×10⁴分子／菌体以下であった。したがって、A
H22(pAARI)株、AH22(pARR3)株は、AH22(pAAH5)株に比べ
て、約20倍多く還元酵素を生産することが明らかになっ
た。

一方、AH22(pAARI)株、AH22(pARR3)株，AH22(pAAH5)株
をそれぞれ約２×10⁷菌体／mlまで培養した。約２×10⁸
菌体分を集菌し、ザイモリアーゼ溶液（1.2M ソルビト
ール，50mMリン酸カリウム(pH7.2)、14mM２−メルカプ
トエタノール、0.4mg／mlザイモリアーゼ60,000）に懸
濁し、30℃で１時間インキュベートし、スフェロプラス
トを調製した。これに、ガラスビーズを加えて、３分間
ボルテックスミキサーで撹拌することにより、菌体を破
砕した。10,000rpm20分間の遠心分離により、未破砕菌
体、核、ミトコンドリアなどを除去し、上清を粗抽出液
とし、チトクロムＣ還元活性を測定した。

チトクロムＣ還元活性は、200mMリン酸カリウム(pH7.
7)、60μＭ、EDTA、1mMKCN、0.1mM NADPH，40μＭチト
クロムＣからなる反応混液に、粗抽出液を加え、全容を
３mlとし、30℃で550nmの吸光度変化を測定した。チト
クロムＣの酸化型−還元型モル吸光係数を21.2として、
還元型チトクロムＣ生成速度を計算した。表１に示すよ
うに、AH22(pAAR1)株，AH22(pARR3)株は、AH22(pAAH5)
株に比べて、約20倍高いチトクロムＣ還元活性を示し
た。以上の結果から、酵母内で生産された還元酵素は、
分子内に補酵素FAD，FMNを含み、チトクロムＣ還元活性
を有することが明らかになった。

実施例９チトクロムP450cと酵母還元酵素の同時発現実施例７で得た酵母AH22(pAMRI)，AH22(pAMR2)株および
ラット肝チトクロムP450c発現酵母AH22(pAMC1)株をそれ
ぞれＳＤ合成培地で約２×10⁷菌体／mlまで培養したの
ち、1.5Mアセトアニリド（メタノール溶液）を終濃度25
mMとなるように添加した。その後、振とう培養を続けな
がら、一定時間後に一定量を分取し、遠心分離により菌
体を除去したのち、培養液上清をHPCL（高速液体クロマ
トグラフィー）にかけ、生成したアセトアミノフェン量
を定量した。HPLCはカラムとしてμBondapak C18(4×30
0mm)を用い、メタノール：水：酢酸(15:84:1％）で溶出
し、245nmの吸光度をモニターした。表２に、反応６時
間後のアセトアミノフェン生産活性を示す。AH22(pAMR
1)，AH22(pAMR2)は、AH22(pAMC1)株に比べて、それぞ
れ、約15倍、約11倍高い活性を示した。ラット肝チトク
ロムP450cとラット肝還元酵素の同時発現酵母AH22(pARM
1)株（特願昭62-104582に記載）の場合は、P450c発現株
AH22(pAMC1)株に比べて、活性が、約２倍に上昇したに
すぎなかった。したがって、本実験結果は、酸化反応用
バイオリアクターとして、AH22(pAMR1)株やAH22(pAMR2)
株の方がAM22(pARM1)株より有用であることを示す。

実施例10 チトクロムP450₁₇αと酵母還元酵素の同時発
現実施例７で得た酵母AH22(pARα）株と、ウシ副腎チトク
ロムP450₁₇α発現酵母AH22(PAα₁)株をそれぞれＳＤ合
成培地５mlで、約１０8×⁶菌体／mlまで培養したのち、
10μCiの〔³H〕プロゲステロンを含む1mMプロゲステロ
ン（エタノール溶液）50μｌを添加し、振とう培養を続
けた。1,2,6時間後に、1.0mlを分取し、遠心分離により
菌体を除去した培養上清0.8mlに、ジクロロメタン2.0ml
を添加し、激しく撹拌した。遠心分離後、ジクロロメタ
ン層1.0mlを乾燥させ、残査をエタノール、酢酸エチル
等容量液20μｌに溶解し、10μｌをシリカゲル薄層プレ
ートにアプライした。クロロホルム−酢酸エチル（３：
１、v/v）を溶媒として、室温で約50分間プレートを展
開したのち、オートラジオグラフィーを行ない、フィル
ム上にあらわれたスポットに相当する薄層ゲル部分をか
きとり、液体シンチレーションカウンターにより、放射
活性を測定した。

その結果、AH22(pARα）株では1,2,6時間後に、47，7
8，95％のプロゲステロンが17−ヒドロキシプロゲステ
ロンへ変換したことがわかった。それに対して、AH22(p
Aα1)株のプロゲステロンから17−ヒドロキシプロゲス
テロンへの変換率は1,2,6時間後で、10，20，80％であ
った。したがって、AH22(pARα）株は、１時間目の変換
率でみた場合、AH22(PAα1)株に比べて、約５倍高い変
換活性を示し、ステロイド酸化反応菌株として、有用で
あることが判明した。

実施例11 チトクロムP450c₂₁と酵母還元酵素の同時発
現実施例７で得た酵母AH22(pARγ）株と、ウシ副腎チトク
ロムP450c₂₁発現酵母AH22(pUC21C2)株を、それぞれＳＤ
合成培地５mlで、約８×10⁶菌体／mlまで培養したの
ち、10μCiの〔³H〕−プロゲステロンを含む1mMプロゲ
ステロン（エタノール溶媒）50μｌ、あるいは、10μCi
の〔³H〕17−ヒドロキシプロゲステロンを含む1mM 17−
ヒドロキシプロゲステロン（エタノール溶液）50μｌを
添加し、振とう培養を続けた2,5,23時間後に、それぞれ
1.0mlずつ分取し、遠心分離により菌体を除去した培養
上清0.8mlにジクロロメタン2.0mlを加え、激しく撹拌し
た。その後、実施例10と同様の操作を行ない、変換物の
放射活性を測定した。

プロゲステロンを基質とした場合、2,5,23時間後におけ
る21−ヒドロキシプロゲステロンへの変換率は、AH22(p
ARγ）株が0.7,2.3,13であり、AH22(pUC21C2)株が0.2,
1.2,11％であった。したがって、AH22(pARγ）株の方
が、AH22(pUC21C2)株よりわずかに変換活性が高かっ
た。一方、17−ヒドロキシプロゲステロンを基質とした
場合、2,5,23時間後における11−デオキシコルチゾール
への変換率は、AH22(pARγ）株が0.6,4.4,42％であり、
AH22(pUC21C2)株が0.4,2.0,30.6％であった。したがっ
て、AH22(pAPγ）株の方が、AH22(pUC21C2)株に比べ
て、約1.5〜２倍程高い変換活性を示すことが判明し
た。

参考例１発現プラスミドpAα２の構築図５にプラスミドpAα２の構築の概要を示した。450₁₇
α_cDNAのアミノ末端部分を含むプラスミドpαNR(H)（特
願昭62-204101）を制限酵素HphＩとEcoRＩで同時に切断
した。反応混液を低融点アガロース電気泳動に供し、P4
50₁₇αアミノ末端コーディング領域に相当する約２５０
Kbの断片を回収した。

この断片と合成リンカー： 5'-AGCTTAAAAAAATGTGGCTGCTCCTGGCTGTC ATTTTTTTACACCGACGAGGACCGACA-5' （左右両端にそれぞれHind III、HphＩを有する。以
下、合成ＤＮＡは全てアプライド・バイオシステム社製
３８０Ａ型シンセサイザーを用いて合成した。）とをプ
ラスミドpUC19のHind III−EcoRI部位に挿入し、目的と
するプラスミドpαN(H)2を得た。こうして得られたプラ
スミドpαN(H)2と、P450₁₇αのカルボキシル末端コーデ
ィング領域を含むプラスミドpαC(H)（特願62-204101）
とを制限酵素Hind IIIとEcoR Iで同時に切断した。反応
混液を低融点アガロース電気泳動に供し、P450₁₇αアミ
ノ末端およびカルボキシル末端コーディング領域に相当
するそれぞれ約285bp、1400bpの断片を回収した。これ
らの両断片を酵母発現ベクターpAAHのHind III部位に挿
入し、P450₁₇αの単独発現プラスミドpAα２を得た。

発明の効果本発明により提供される酵母NADPH-チトクロムP450還元
酵素生産酵母菌株は、対照とした野生酵母菌株に比べ
て、約20倍多く還元酵素を生産する。酵母内で生産され
た還元酵素は、活性に必要な補酵素類を含有しており、
酵母本来の還元酵素と同等の機能を有する。したがっ
て、形質転換酵母菌株を含有することにより、還元酵素
含量の高い酵母を得ることができ、還元酵素の単離、精
製が容易になると考えられる。

また、本発明により提供される酵母NADPH-チトクロムP4
50還元酵素生産酵母菌株は、哺乳動物チトクロムP450遺
伝子を発現させる宿主として有用である。哺乳動物チト
クロムP450を酵母内で生産し、菌体をバイオリアクター
として用いる場合、P450に依存した１原子酸素添加活性
を最大限を発揮するためには、酵母内で還元酵素との効
率的な相互作用が必要となる。したがって、酵母内の還
元酵素含量の増加は、P450に依存した活性を上昇させる
効果を持つ。例えば、ラット肝チトクロムP450cを、還
元酵素生産酵母を宿宿として、生産した場合、P450cに
依存したアセトアミノフェン生産活性は1〜16倍にも上
昇した。また、ウシ副腎チトクロムP450₁₇αやP450c₂₁
の場合にも、これらP450に依存した酵母菌株のステロイ
ド酸化活性は２〜５倍上昇した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の発現プラスミドpAAR1の構築工程を
示す。第２図は、本発明の発現プラスミドpAAR3の構築工程を
示す。第３図は、本発明の発現プラスミドpARαの構築工程を
示す。第４図は、本発明の発現プラスミドpARγの構築工程を
示す。制限酵素切断部位は、B:BamHI,E:EcoRI,H:Hind III,Hc:
Hinc II,K:KpnI,N:NotI,S:Sau3AI,Sa:SacI,Sc:ScaI,Sm:
SmaI,Sp:SphIを示す。また、P,TはそれぞれＡＤＨプロ
モーター、ターミネータ翻訳領域を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者大川秀郎兵庫県宝塚市高司４丁目２番１号住友化学工業株式会社内審査官平田和男 (56)参考文献特開昭62−19085 特開昭62−104582 ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 103 ［６］（1988）Ｐ： 1004−1010

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ラット肝チトクロムＰ４５０をコードする
ＤＮＡと酵母ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０還元酵素
をコードするＤＮＡを含み、上記両酵素が酵母内で発現
するプラスミド。
【請求項２】pAMR1と命名した請求項１記載のプラスミ
ド。
【請求項３】pAMR2と命名した請求項１記載のプラスミ
ド。
【請求項４】ウシ副腎皮質のチトクロムＰ４５０₁₇αを
コードするＤＮＡと酵母ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５
０還元酵素をコードするＤＮＡを含み、上記両酵素が酵
母内で発現するプラスミド。
【請求項５】pARαと命名した請求項４記載のプラスミ
ド。
【請求項６】ウシ副腎皮質のチトクロムＰ４５０_C21を
コードするＤＮＡと酵母ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５
０還元酵素をコードするＤＮＡを含み、上記両酵素が酵
母内で発現するプラスミド。
【請求項７】pARγと命名した請求項６記載のプラス
ミ。
【請求項８】ラット肝チトクロムＰ４５０をコードする
ＤＮＡ、ウシ副腎皮質のチトクロムＰ４５０₁₇αをコー
ドするＤＮＡあるいはウシ副腎皮質のチトクロムＰ４５
０_C21をコードするＤＮＡと、酵母ＮＡＤＰＨ−チトク
ロムＰ４５０還元酵素をコードするＤＮＡを含み、上記
両酵素が酵母内で発現するプラスミドを保持する酵母菌
株。
【請求項９】プラスミドpAMR2を保持する請求項８記載
の酵母菌株。
【請求項１０】サッカロミセス・セレビシェAH22/pAMR2
と命名した請求項９記載の酵母菌株。
【請求項１１】プラスミドpAMR1を保持する請求項８記
載の酵母菌株。
【請求項１２】サッカロミセス・セレビシェAH22/pAMR1
と命名した請求項11記載の酵母菌株。
【請求項１３】プラスミドpARαを保持する請求項８記
載の酵母菌株。
【請求項１４】サッカロミセス・セレビシェAH22/pARα
と命名した請求項13記載の酵母菌株。
【請求項１５】プラスミドpARγを保持する請求項８記
載の酵母菌株。
【請求項１６】サッカロミセス・セレビシェAH22/pARγ
と命名した請求項15記載の酵母菌株。