JPH0767670A - グリオキザールの生化学的製造法 - Google Patents
グリオキザールの生化学的製造法Info
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】本発明は新規なグリオキザールの生化学的製造
法に関する。 【構成】エチレングルコール又はグリコールアルデヒド
に酸化還元酵素又は該酸化還元酵素を含有する微生物を
作用させることによって、エチレングリコール又はグリ
コールアルデヒドをグリオキザールに変換せしめた後、
これを採取するグリオキザールの生化学的製造法を提供
する。
法に関する。 【構成】エチレングルコール又はグリコールアルデヒド
に酸化還元酵素又は該酸化還元酵素を含有する微生物を
作用させることによって、エチレングリコール又はグリ
コールアルデヒドをグリオキザールに変換せしめた後、
これを採取するグリオキザールの生化学的製造法を提供
する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はグリオキザールの生化学
的製造法に関する。更に詳細には、エチレングリコール
又はグリコールアルデヒドに酸化還元酵素又は該酸化還
元酵素を含有する微生物を作用させることによってエチ
レングリコール又はグリコールアルデヒドをグリオキザ
ールに変換せしめ、これを採取することを特徴とするグ
リオキザールの生化学的製造法に関する。
的製造法に関する。更に詳細には、エチレングリコール
又はグリコールアルデヒドに酸化還元酵素又は該酸化還
元酵素を含有する微生物を作用させることによってエチ
レングリコール又はグリコールアルデヒドをグリオキザ
ールに変換せしめ、これを採取することを特徴とするグ
リオキザールの生化学的製造法に関する。
【０００２】グリオキザールは、繊維加工剤、紙加工
剤、セメント添加剤、澱粉等の高分子の架橋剤、消臭
剤、土壌硬化剤、医薬、香料等の合成中間体として有用
な化合物である。
剤、セメント添加剤、澱粉等の高分子の架橋剤、消臭
剤、土壌硬化剤、医薬、香料等の合成中間体として有用
な化合物である。
【０００３】
【従来の技術】従来、グリオキザールは、アセトアルデ
ヒド水溶液に硝酸を滴下反応させ、酸化して製造する方
法、及びエチレングリコールを水蒸気、空気と共に気相
高温下、銀触媒により酸化、脱水素して製造する方法等
の化学合成法により工業的に製造されてきたが、生化学
的方法によっては、これまで製造がなされていなかっ
た。
ヒド水溶液に硝酸を滴下反応させ、酸化して製造する方
法、及びエチレングリコールを水蒸気、空気と共に気相
高温下、銀触媒により酸化、脱水素して製造する方法等
の化学合成法により工業的に製造されてきたが、生化学
的方法によっては、これまで製造がなされていなかっ
た。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、グリオ
キザールを化学合成法により製造する場合には、何れも
多量の有機酸等の副産物が生成されるため、これらを除
去精製する必要があり、そのため複雑な操作を必要とし
ていた。従って、副産物を生成せず、且つ複雑な操作を
必要としないところのグリオキザールの製造法が求めら
れていた。
キザールを化学合成法により製造する場合には、何れも
多量の有機酸等の副産物が生成されるため、これらを除
去精製する必要があり、そのため複雑な操作を必要とし
ていた。従って、副産物を生成せず、且つ複雑な操作を
必要としないところのグリオキザールの製造法が求めら
れていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】このような状況下、本発
明者は、副産物を生成せず且つ又、繁雑な操作を必要と
しない生化学的方法でグリオキザールを製造することを
試みた。これまで、アルコールの酸化に関する生化学的
研究として、ある種の１価または３価のアルコールに作
用する酸化還元酵素の存在は知られていた〔 Y. Tan
i, T. Miya andK. Ogata, Agric. Biol. Chem.,36巻,76
〜83(1972)、 H. Sahm and F. Wagner, Eur. J. Bioc
hem.,36巻,250〜256(1973)、 N. Kato, Y. Omori, Y.
tani and K. Ogata, Eur. J. Biochem.,64巻,341〜350
(1976)、 C. R. Couder and J.Baratti, Agric. Bio
l. Chem.,44巻,2279〜2289(1980)、 T. Uwajima, H.
Akita, K. Ito, A. Mihara, K. Aisaka and O. Terada,
Agric. Biol. Chem.,43巻,2633〜2634(1979)〕。
明者は、副産物を生成せず且つ又、繁雑な操作を必要と
しない生化学的方法でグリオキザールを製造することを
試みた。これまで、アルコールの酸化に関する生化学的
研究として、ある種の１価または３価のアルコールに作
用する酸化還元酵素の存在は知られていた〔 Y. Tan
i, T. Miya andK. Ogata, Agric. Biol. Chem.,36巻,76
〜83(1972)、 H. Sahm and F. Wagner, Eur. J. Bioc
hem.,36巻,250〜256(1973)、 N. Kato, Y. Omori, Y.
tani and K. Ogata, Eur. J. Biochem.,64巻,341〜350
(1976)、 C. R. Couder and J.Baratti, Agric. Bio
l. Chem.,44巻,2279〜2289(1980)、 T. Uwajima, H.
Akita, K. Ito, A. Mihara, K. Aisaka and O. Terada,
Agric. Biol. Chem.,43巻,2633〜2634(1979)〕。
【０００６】２価アルコールに作用する酸化還元酵素に
ついては、その存在の可能性が示唆されるのみであり
〔A. Boronat, E. Caballero and J. Aguilar, J. Bact
eriol.,153巻,134〜139(1983)〕、その反応生成物の同
定は全く行われていなかった。更に又、上記記載のアル
コールに作用する酵素が２価のアルコールに作用すると
の報告はあるが、その反応生成物は全く同定されておら
ず、かつ又、これらの酵素がアルコールアルデヒドであ
るグリコールアルデヒドの酸化に関与するとの生化学的
研究は、全くなされていなかった。
ついては、その存在の可能性が示唆されるのみであり
〔A. Boronat, E. Caballero and J. Aguilar, J. Bact
eriol.,153巻,134〜139(1983)〕、その反応生成物の同
定は全く行われていなかった。更に又、上記記載のアル
コールに作用する酵素が２価のアルコールに作用すると
の報告はあるが、その反応生成物は全く同定されておら
ず、かつ又、これらの酵素がアルコールアルデヒドであ
るグリコールアルデヒドの酸化に関与するとの生化学的
研究は、全くなされていなかった。
【０００７】しかしながら、本発明者は長年にわたり、
微生物の産生する酸化還元酵素の研究に従事し、２価ア
ルコールのエチレングリコールを酸化できる酵素を求め
鋭意検討してきた結果、酸化還元酵素の中に、エチレン
グリコール又はグリコールアルデヒドをグリオキザール
に酸化できるものがあることを見いだすと共に、更に
又、酸化還元酵素の２種以上を組み合わせて使用するこ
とにより、その酸化作用が促進され得ることをも見いだ
した。
微生物の産生する酸化還元酵素の研究に従事し、２価ア
ルコールのエチレングリコールを酸化できる酵素を求め
鋭意検討してきた結果、酸化還元酵素の中に、エチレン
グリコール又はグリコールアルデヒドをグリオキザール
に酸化できるものがあることを見いだすと共に、更に
又、酸化還元酵素の２種以上を組み合わせて使用するこ
とにより、その酸化作用が促進され得ることをも見いだ
した。
【０００８】本発明は、これらの知見により完成された
ものである。即ち、エチレングリコール又はグリコール
アルデヒドに酸化還元酵素又は該酸化還元酵素を含有す
る微生物を作用させることによってエチレングリコール
又はグリコールアルデヒドをグリオキザールに変換せし
め、これを採取するグリオキザールの生化学的製造法で
あり、本発明によって、初めてグリオキザールを温和な
条件下で効率よく製造することが可能となったのであ
る。
ものである。即ち、エチレングリコール又はグリコール
アルデヒドに酸化還元酵素又は該酸化還元酵素を含有す
る微生物を作用させることによってエチレングリコール
又はグリコールアルデヒドをグリオキザールに変換せし
め、これを採取するグリオキザールの生化学的製造法で
あり、本発明によって、初めてグリオキザールを温和な
条件下で効率よく製造することが可能となったのであ
る。
【０００９】本発明のエチレングリコール又はグリコー
ルアルデヒドから酸化還元反応によってグリオキザール
が生成される化学反応式を式１及び式２に示す。
ルアルデヒドから酸化還元反応によってグリオキザール
が生成される化学反応式を式１及び式２に示す。
【００１０】
【式１】
【００１１】
【式２】
【００１２】上記の式１で示される反応は、酸化酵素又
は該酵素を含有する微生物が介在する場合であり、式２
で示される反応は、脱水素酵素又は該酵素を含有する微
生物が介在する場合をそれぞれ示す。尚、上記式１単独
又は上記式１と式２との組み合わせ反応において、何れ
も過酸化水素が生成するが、この過酸化水素は、オキシ
ダーゼを不安定にしたり、また生成したグリオキザール
を酸化すること等により、グリオキザールの生成量を減
少させる場合があるが、しかしながら、この場合、反応
時にカタラーゼを添加することによって過酸化水素を除
去し、グリオキザールの蓄積量を増大させることが可能
である。
は該酵素を含有する微生物が介在する場合であり、式２
で示される反応は、脱水素酵素又は該酵素を含有する微
生物が介在する場合をそれぞれ示す。尚、上記式１単独
又は上記式１と式２との組み合わせ反応において、何れ
も過酸化水素が生成するが、この過酸化水素は、オキシ
ダーゼを不安定にしたり、また生成したグリオキザール
を酸化すること等により、グリオキザールの生成量を減
少させる場合があるが、しかしながら、この場合、反応
時にカタラーゼを添加することによって過酸化水素を除
去し、グリオキザールの蓄積量を増大させることが可能
である。
【００１３】本発明者は、上記反応に使用可能な酵素を
スクリーニングするにあたって先ず反応生成物のグリコ
ールアルデヒド及びグリオキザールの定量法を確立する
と共に更に上記反応においては、グリオキシル酸（ＯＨ
ＣＣＯＯＨ）は生成しないことを確認するためのグリオ
キシル酸の定量法をも確立した。
スクリーニングするにあたって先ず反応生成物のグリコ
ールアルデヒド及びグリオキザールの定量法を確立する
と共に更に上記反応においては、グリオキシル酸（ＯＨ
ＣＣＯＯＨ）は生成しないことを確認するためのグリオ
キシル酸の定量法をも確立した。
【００１４】実験例１ グリコールアルデヒドの定量は、〔M. A. Paz, O. O. B
lumenfeld, M. Rojikind, E. Henson, C. Furfin and
P. Gallop, Arch. Biochem. Biophys.,109巻,547〜 559
(1965)〕等の方法を改良して以下の条件で行った。0.5m
M〜2.5mMのグリコールアルデヒド溶液10μｌに対し0.1
Mグリシン塩酸緩衝液（pH4.0）150μl、１％ＭＢＴＨ
〔３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン・ヒドラゾン・
ヒドロクロライド（3-methyl-2-benzothiazolinone hyd
razone hydrochloride）〕溶液60μl、0.2％塩化第二鉄
溶液750μlを添加し、グリコールアルデヒドの誘導体−
２を生成し、その吸収スペクトル及び吸光度610nmとグ
リコールアルデヒド濃度との関係を検討した。その結
果、図１に示すような吸光度曲線と図２に示す吸光度と
グリコールアルデヒド濃度との関係が得られ、本条件で
グリコールアルデヒドが定量できることが示された。
lumenfeld, M. Rojikind, E. Henson, C. Furfin and
P. Gallop, Arch. Biochem. Biophys.,109巻,547〜 559
(1965)〕等の方法を改良して以下の条件で行った。0.5m
M〜2.5mMのグリコールアルデヒド溶液10μｌに対し0.1
Mグリシン塩酸緩衝液（pH4.0）150μl、１％ＭＢＴＨ
〔３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン・ヒドラゾン・
ヒドロクロライド（3-methyl-2-benzothiazolinone hyd
razone hydrochloride）〕溶液60μl、0.2％塩化第二鉄
溶液750μlを添加し、グリコールアルデヒドの誘導体−
２を生成し、その吸収スペクトル及び吸光度610nmとグ
リコールアルデヒド濃度との関係を検討した。その結
果、図１に示すような吸光度曲線と図２に示す吸光度と
グリコールアルデヒド濃度との関係が得られ、本条件で
グリコールアルデヒドが定量できることが示された。
【００１５】実験例２ グリオキザールの定量は、〔M. A. Paz, O. O. Blumenf
eld, M. Rojikind, E.Henson, C. Furfin and P. Gallo
p, Arch. Biochem. Biophys.,109巻,547〜559(1965)〕
等の方法を改良して以下の条件で行った。0.5mM〜2.5mM
のグリオキザール溶液10μlに対し0.1Mグリシン塩酸緩
衝液（pH4.0）750μl、１％ＭＢＴＨ溶液300μlを添加
し、グリオキザールの誘導体−１を生成し、その吸収ス
ペクトル及び吸光度380nmとグリオキザール濃度との関
係を検討した。その結果、図１に示すような吸光度曲線
と図２に示す吸光度とグリオキザール濃度との関係が得
られ、本条件でグリオキザールが定量できることが示さ
れた。
eld, M. Rojikind, E.Henson, C. Furfin and P. Gallo
p, Arch. Biochem. Biophys.,109巻,547〜559(1965)〕
等の方法を改良して以下の条件で行った。0.5mM〜2.5mM
のグリオキザール溶液10μlに対し0.1Mグリシン塩酸緩
衝液（pH4.0）750μl、１％ＭＢＴＨ溶液300μlを添加
し、グリオキザールの誘導体−１を生成し、その吸収ス
ペクトル及び吸光度380nmとグリオキザール濃度との関
係を検討した。その結果、図１に示すような吸光度曲線
と図２に示す吸光度とグリオキザール濃度との関係が得
られ、本条件でグリオキザールが定量できることが示さ
れた。
【００１６】実験例３ グリオキシル酸の定量は、〔M. A. Paz, O. O. Blumenf
eld, M. Rojikind, E.Henson, C. Furfin and P. Gallo
p, Arch. Biochem. Biophys.,109巻,547〜559(1965)〕
等の方法を改良し、実験例１及び実験例２と同様の条件
で行った。その結果、図１に示すような吸光度曲線と図
２に示す吸光度とグリオキシル酸濃度との関係が得ら
れ、本条件でグリオキシル酸が定量できることが示され
た。
eld, M. Rojikind, E.Henson, C. Furfin and P. Gallo
p, Arch. Biochem. Biophys.,109巻,547〜559(1965)〕
等の方法を改良し、実験例１及び実験例２と同様の条件
で行った。その結果、図１に示すような吸光度曲線と図
２に示す吸光度とグリオキシル酸濃度との関係が得ら
れ、本条件でグリオキシル酸が定量できることが示され
た。
【００１７】実験例４ 実験例１〜３においてグリオキザールは、１％ＭＢＴＨ
溶液を添加すると黄色に着色するが、0.2％塩化第２鉄
溶液を添加しても青色に着色する事はなく、一方、グリ
コールアルデヒドとグリオキシル酸は、１％ＭＢＴＨ溶
液の添加では無色であり、0.2 ％塩化第２鉄溶液を添加
することより青色を呈した。従って、グリオキザールを
グリコールアルデヒドやグリオキシル酸と分別測定する
事は可能であったが、しかし、グリコールアルデヒドと
グリオキシル酸の誘導体の吸収曲線は類似しており、両
者の区別は困難であった。そこで、それら３種化合物の
誘導体を実験例１〜３に準じて調製し、Ｃ18カラムを用
いる逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーで３種化合物の分
別を行った。尚、グリオキシル酸に関しては、0.2％塩
化第２鉄溶液添加前後の誘導体−１及び誘導体−２の溶
液をＨＰＬＣに供した。その結果、図３に示すように塩
化第２鉄無添加でグリオキザール（誘導体−１）は34.0
分、34.6分付近にそれぞれピークが得られ、グリオキシ
ル酸（誘導体−１）は12.1分付近にピークが認められ
た。又塩化第２鉄イオン添加液の誘導体ではグリコール
アルデヒド（誘導体−２）が16.4分付近、グリオキシル
酸（誘導体−２）が22.8分付近にピークが得られ、３種
化合物の分別定量が可能となった。
溶液を添加すると黄色に着色するが、0.2％塩化第２鉄
溶液を添加しても青色に着色する事はなく、一方、グリ
コールアルデヒドとグリオキシル酸は、１％ＭＢＴＨ溶
液の添加では無色であり、0.2 ％塩化第２鉄溶液を添加
することより青色を呈した。従って、グリオキザールを
グリコールアルデヒドやグリオキシル酸と分別測定する
事は可能であったが、しかし、グリコールアルデヒドと
グリオキシル酸の誘導体の吸収曲線は類似しており、両
者の区別は困難であった。そこで、それら３種化合物の
誘導体を実験例１〜３に準じて調製し、Ｃ18カラムを用
いる逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーで３種化合物の分
別を行った。尚、グリオキシル酸に関しては、0.2％塩
化第２鉄溶液添加前後の誘導体−１及び誘導体−２の溶
液をＨＰＬＣに供した。その結果、図３に示すように塩
化第２鉄無添加でグリオキザール（誘導体−１）は34.0
分、34.6分付近にそれぞれピークが得られ、グリオキシ
ル酸（誘導体−１）は12.1分付近にピークが認められ
た。又塩化第２鉄イオン添加液の誘導体ではグリコール
アルデヒド（誘導体−２）が16.4分付近、グリオキシル
酸（誘導体−２）が22.8分付近にピークが得られ、３種
化合物の分別定量が可能となった。
【００１８】こうして３種化合物の定量法を確立できた
ので、次に、エチレングリコール及びグリコールアルデ
ヒド酸化能を有する酵素及び微生物を広く検索するため
に、pH5.5〜9.0の間でエチレングリコールとグリコール
アルデヒドに作用させたところ、少なくとも以下に例示
する酵素及び微生物にエチレングリコール及びグリコー
ルアルデヒドを酸化分解し、グリオキザールを生成蓄積
する能力があることが判明した。即ち、
ので、次に、エチレングリコール及びグリコールアルデ
ヒド酸化能を有する酵素及び微生物を広く検索するため
に、pH5.5〜9.0の間でエチレングリコールとグリコール
アルデヒドに作用させたところ、少なくとも以下に例示
する酵素及び微生物にエチレングリコール及びグリコー
ルアルデヒドを酸化分解し、グリオキザールを生成蓄積
する能力があることが判明した。即ち、
【００１９】(1)：シグマ社製品のピチア属（Pichia pa
storis）由来のアルコールオキシダーゼ、(2)：Candida
sp. No.SS104（本菌の菌学的性質は、甲子園大学紀要,
No.18,(A),23−29(1990)に記載されており、工業技術院
生命工学工業技術研究所にFERM-P No.13702として寄託
されている。）を文献に準じて培養して得られるカン
ジダ属由来のアルコールオキシダーゼ及び該微生物、
(3)：シグマ社製品のハンセヌラ属由来のアルコールオ
キシダーゼ、(4)及び(5)：文献並びに特公昭60−3147
1号及び特公昭60−49477号で述べられているAspergillu
s japonicus KY−45ATCC No.1042に由来するアスペルギ
ルス属由来のグリセロールオキシダーゼ及び該微生物、
並びにPenicillium sp. KY868 NRRL No.11339に由来す
るペニシリウム属由来のグリセロールオキシダーゼ及び
該微生物、(6)：天野製薬社製品のグリセロールデヒド
ロゲナーゼ「アマノ」、(7)及び(8)：ノイロスポラ属
（Neurospora crassa IFO No.6068）及びアセトバクタ
ー属（Acetobacter pasteurianus IFO No.13753）の微
生物、(9)及び(10)：シュードモナス属（Pseudomonas s
p.GOX-201 FERM p-14328）及びアルカリゲネス属（Alca
ligenes sp. GX-52 FERMp-14329）の10種である。これ
らのうち(9)及び(10)の微生物は、自然界より分離した
ものであり、その菌学的性質は次の通りである。
storis）由来のアルコールオキシダーゼ、(2)：Candida
sp. No.SS104（本菌の菌学的性質は、甲子園大学紀要,
No.18,(A),23−29(1990)に記載されており、工業技術院
生命工学工業技術研究所にFERM-P No.13702として寄託
されている。）を文献に準じて培養して得られるカン
ジダ属由来のアルコールオキシダーゼ及び該微生物、
(3)：シグマ社製品のハンセヌラ属由来のアルコールオ
キシダーゼ、(4)及び(5)：文献並びに特公昭60−3147
1号及び特公昭60−49477号で述べられているAspergillu
s japonicus KY−45ATCC No.1042に由来するアスペルギ
ルス属由来のグリセロールオキシダーゼ及び該微生物、
並びにPenicillium sp. KY868 NRRL No.11339に由来す
るペニシリウム属由来のグリセロールオキシダーゼ及び
該微生物、(6)：天野製薬社製品のグリセロールデヒド
ロゲナーゼ「アマノ」、(7)及び(8)：ノイロスポラ属
（Neurospora crassa IFO No.6068）及びアセトバクタ
ー属（Acetobacter pasteurianus IFO No.13753）の微
生物、(9)及び(10)：シュードモナス属（Pseudomonas s
p.GOX-201 FERM p-14328）及びアルカリゲネス属（Alca
ligenes sp. GX-52 FERMp-14329）の10種である。これ
らのうち(9)及び(10)の微生物は、自然界より分離した
ものであり、その菌学的性質は次の通りである。
【００２０】(9)の微生物の菌学的性質： (1) 形態 大きさ：0.7×0.9 幅の広い短桿菌で且つ多形性桿菌 グラム染色性：陰性 運動性：側鞭毛 胞子の有無：無
【００２１】(2) 各培地における生育状態 肉汁寒天平板培養：円形、凸円状、半透明光沢、内光、
粘稠 肉汁ゼラチン穿刺培養：ゼラチンを液化しない。 リトマス・ミルク培養：ペプトン化する。
粘稠 肉汁ゼラチン穿刺培養：ゼラチンを液化しない。 リトマス・ミルク培養：ペプトン化する。
【００２２】(3) 生理学的性質 酸素要求性：好気性 Ｏ−Ｆテスト：酸化 カタラーゼ：陽性 オキシダーゼ：陽性 ＶＰ反応：陰性 ＭＲ反応：陰性 インドールの生成：陰性 硝酸塩の還元性：陰性 脱窒反応：陰性 硫化水素の生成：陰性 ウレアーゼ：陽性 クエン酸分解：陰性（シモンズ培地） 陽性（クリステンセン培地） カゼイン分解：陽性 デンプンの加水分解：陰性 糖類からの酸生成：Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、
Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マルトース
から酸を生成するが、乳糖、シュークロース、Ｄ−マン
ニットからは酸を生成しない。 色素産生：ピオシアニン 陰性 フルオレシン 陰性 生育温度の範囲：15〜42℃で生育 生育pHの範囲：pH4.5〜9.6 生育食塩濃度：０〜５％
Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マルトース
から酸を生成するが、乳糖、シュークロース、Ｄ−マン
ニットからは酸を生成しない。 色素産生：ピオシアニン 陰性 フルオレシン 陰性 生育温度の範囲：15〜42℃で生育 生育pHの範囲：pH4.5〜9.6 生育食塩濃度：０〜５％
【００２３】以上の菌学的性質について、Bergey's Man
nual of Determinative Bacteriology第８巻（1974年）
及びBergey's Mannual of Systematic Bacteriology、
第１巻（1984年）を参照し、本菌をシュードモナス（Ps
eudomonas）に属する菌と同定し、シュードモナス・エ
スピー（Pseudomonas sp.）GOX−201と命名した。尚、
本菌は、FERM P-14328として、工業技術院生命工学工業
技術研究所に寄託されている。
nual of Determinative Bacteriology第８巻（1974年）
及びBergey's Mannual of Systematic Bacteriology、
第１巻（1984年）を参照し、本菌をシュードモナス（Ps
eudomonas）に属する菌と同定し、シュードモナス・エ
スピー（Pseudomonas sp.）GOX−201と命名した。尚、
本菌は、FERM P-14328として、工業技術院生命工学工業
技術研究所に寄託されている。
【００２４】(10)の微生物の菌学的性質： (1) 形態 大きさ：0.7×0.9 幅の広い短桿菌で且つ多形性桿菌 グラム染色性：陰性 運動性：側鞭毛 胞子の有無：無
【００２５】(2) 各培地における生育状態 肉汁寒天平板培養：円形、凸円状、半透明な光沢、粘稠 肉汁ゼラチン穿刺培養：ゼラチンを液化しない。 リトマス・ミルク培養：アルカリ形成
【００２６】(3) 生理学的性質 酸素要求性：好気性 Ｏ−Ｆテスト：陰性 カタラーゼ：陽性 オキシダーゼ：陽性 ＶＰ反応：陰性 ＭＲ反応：陰性 インドールの生成：陰性 硝酸塩の還元性：陽性 脱窒反応：陰性 硫化水素の生成：陽性 ウレアーゼ：陰性 クエン酸分解：弱い陽性（シモンズ培地） 陽性（クリステンセン培地） カゼイン分解：陰性 デンプンの加水分解：陰性 糖類からの酸生成：Ｄ−キシロース、Ｄ−フラクトー
ス、Ｄ−ガラクトースから酸を生成し、Ｄ−マルトー
ス、Ｄ−マンニットからも弱い酸を生成するが、乳糖、
シュークロース、Ｄ−グルコースからは酸を生成しな
い。 色素産生：ピオシアニン 陰性 フルオレシン 陰性 生育温度の範囲：15〜45℃で生育 生育pHの範囲：pH4.5〜9.6 生育食塩濃度：０〜５％
ス、Ｄ−ガラクトースから酸を生成し、Ｄ−マルトー
ス、Ｄ−マンニットからも弱い酸を生成するが、乳糖、
シュークロース、Ｄ−グルコースからは酸を生成しな
い。 色素産生：ピオシアニン 陰性 フルオレシン 陰性 生育温度の範囲：15〜45℃で生育 生育pHの範囲：pH4.5〜9.6 生育食塩濃度：０〜５％
【００２７】以上の菌学的性質について、Bergey's Man
nual of Determinative Bacteriology第８巻（1974年）
及びBergey's Mannual of Systematic Bacteriology、
第１巻（1984年）を参照し、本菌をアルカリゲネス（Al
caligenes）に属する菌と同定し、アルカリゲネス・エ
スピー（Alcaligenes sp.）GX−52と命名した。尚、本
菌は、FERM P-14329として、工業技術院生命工学工業技
術研究所に寄託されている。
nual of Determinative Bacteriology第８巻（1974年）
及びBergey's Mannual of Systematic Bacteriology、
第１巻（1984年）を参照し、本菌をアルカリゲネス（Al
caligenes）に属する菌と同定し、アルカリゲネス・エ
スピー（Alcaligenes sp.）GX−52と命名した。尚、本
菌は、FERM P-14329として、工業技術院生命工学工業技
術研究所に寄託されている。
【００２８】そして、上記の10種の酵素及び微生物のう
ちから２種について、実験例５及び６にその反応経過及
び生成物を示すが、他の８種の酵素及び微生物について
もこれと同様にグリオキザールの蓄積されることが明ら
かになった。
ちから２種について、実験例５及び６にその反応経過及
び生成物を示すが、他の８種の酵素及び微生物について
もこれと同様にグリオキザールの蓄積されることが明ら
かになった。
【００２９】実験例５ ピチア（Pichia）属由来のアルコールオキシダーゼをpH
5.5〜9.0の間でエチレングリコールとグリコールアルデ
ヒドに作用させた結果、図４に示すようにエチレングリ
コールに対してはpH８付近、グリコールアルデヒドに対
しては、pH６付近でその分解速度は最大であった。この
反応液を実験例１及び２に示すと同様の操作で誘導体を
調製し、実験例４と同様の条件でＨＰＬＣを行った。そ
の結果、グリコールアルデヒドからグリオキザールの誘
導体に相当する時間にピークが認められ、グリオキザー
ルが生成されていること及びエチレングリコールからグ
リコールアルデヒドとグリオキザールの誘導体に相当す
る時間にピークが認められ、化学反応式１に示すように
エチレングリコールがグリコールアルデヒド経由でグリ
オキザールに変換されることが明かとなった。又、グリ
オキシル酸の誘導体に相当するピークは存在せず、本酵
素は、グリオキザールの酸化には関与せず、グリオキザ
ールの蓄積がなされることが確認された。
5.5〜9.0の間でエチレングリコールとグリコールアルデ
ヒドに作用させた結果、図４に示すようにエチレングリ
コールに対してはpH８付近、グリコールアルデヒドに対
しては、pH６付近でその分解速度は最大であった。この
反応液を実験例１及び２に示すと同様の操作で誘導体を
調製し、実験例４と同様の条件でＨＰＬＣを行った。そ
の結果、グリコールアルデヒドからグリオキザールの誘
導体に相当する時間にピークが認められ、グリオキザー
ルが生成されていること及びエチレングリコールからグ
リコールアルデヒドとグリオキザールの誘導体に相当す
る時間にピークが認められ、化学反応式１に示すように
エチレングリコールがグリコールアルデヒド経由でグリ
オキザールに変換されることが明かとなった。又、グリ
オキシル酸の誘導体に相当するピークは存在せず、本酵
素は、グリオキザールの酸化には関与せず、グリオキザ
ールの蓄積がなされることが確認された。
【００３０】実験例６ カンジダ（Candida）属由来のアルコールオキシダーゼ
をpH5.5〜9.0の間でエチレングリコール及びグリコール
アルデヒドに作用させた。その結果、エチレングリコー
ルを基質として用いた場合、pH8.5付近に、グリコール
アルデヒドを基質とした場合、pH5.5付近にそれぞれ最
大分解速度が得られた。また、この反応液を実験例１及
び２に示すと同様の操作で誘導体を調製し、実験例４と
同様の条件でＨＰＬＣを行った。その結果、グリコール
アルデヒドからグリオキザールの誘導体に相当する時間
にピークが認められ、グリコールアルデヒドからグリオ
キザールが生成されていること、エチレングリコールか
らグリコールアルデヒドとグリオキザールの誘導体に相
当する時間にピークが認められ、式１に示すようにエチ
レングリコールがグリコールアルデヒド経由でグリオキ
ザールに変換されることが明かとなった。又、グリオキ
シル酸の誘導体に相当するピークは存在せず、本反応
は、グリオキザールの酸化には関与せず、グリオキザー
ルの蓄積がなされることが確認された。
をpH5.5〜9.0の間でエチレングリコール及びグリコール
アルデヒドに作用させた。その結果、エチレングリコー
ルを基質として用いた場合、pH8.5付近に、グリコール
アルデヒドを基質とした場合、pH5.5付近にそれぞれ最
大分解速度が得られた。また、この反応液を実験例１及
び２に示すと同様の操作で誘導体を調製し、実験例４と
同様の条件でＨＰＬＣを行った。その結果、グリコール
アルデヒドからグリオキザールの誘導体に相当する時間
にピークが認められ、グリコールアルデヒドからグリオ
キザールが生成されていること、エチレングリコールか
らグリコールアルデヒドとグリオキザールの誘導体に相
当する時間にピークが認められ、式１に示すようにエチ
レングリコールがグリコールアルデヒド経由でグリオキ
ザールに変換されることが明かとなった。又、グリオキ
シル酸の誘導体に相当するピークは存在せず、本反応
は、グリオキザールの酸化には関与せず、グリオキザー
ルの蓄積がなされることが確認された。
【００３１】上記の実験例５及び６の結果を表１に示
す。尚、表１中の＊は残存基質による誘導体を示すもの
であり、ＮＤは、（Not Detected即ち、検出されない）
の略である。
す。尚、表１中の＊は残存基質による誘導体を示すもの
であり、ＮＤは、（Not Detected即ち、検出されない）
の略である。
【００３２】
【表１】
【００３３】本発明のグリオキザールの生化学的製造法
における酸化還元酵素の作用条件について述べると、ま
ず反応時間に関しては、酸化還元酵素が作用する条件で
あれば特に制限されるものではない。反応温度も特に制
限されないが、好ましい反応温度としては、０〜40℃で
ある。そして反応時のpHの条件も酸化還元酵素が作用で
きるpHであれば特に制限はないが、通常はpH３〜10が好
ましい。
における酸化還元酵素の作用条件について述べると、ま
ず反応時間に関しては、酸化還元酵素が作用する条件で
あれば特に制限されるものではない。反応温度も特に制
限されないが、好ましい反応温度としては、０〜40℃で
ある。そして反応時のpHの条件も酸化還元酵素が作用で
きるpHであれば特に制限はないが、通常はpH３〜10が好
ましい。
【００３４】以下実施例によって本発明をより具体的に
説明するが、本発明はこれら実施例により何等制限され
るものではない。尚、実施例中の各種酵素の活性測定法
は、アルコールオキシダーゼについては、前記文献の
記載の方法であり、グリセロールオキシダーゼについて
は、前記文献の記載方法を使用した。又カタラーゼ及
びグリセロールデヒドロゲナーゼについては、それぞれ
特開平2-76579号及び特開昭57-206385号によって行っ
た。
説明するが、本発明はこれら実施例により何等制限され
るものではない。尚、実施例中の各種酵素の活性測定法
は、アルコールオキシダーゼについては、前記文献の
記載の方法であり、グリセロールオキシダーゼについて
は、前記文献の記載方法を使用した。又カタラーゼ及
びグリセロールデヒドロゲナーゼについては、それぞれ
特開平2-76579号及び特開昭57-206385号によって行っ
た。
【００３５】
実施例１ 0.2M ＴＥＳ緩衝液（pH7.0）７mlに1.0 Mグリコールア
ルデヒド１ml、ピチア（Pichia）属由来のアルコールオ
キシダーゼ400単位、カタラーゼ130 kuを添加し、反応
液を10mlとし、30℃、３時間反応した。この反応液から
実験例１及び２に準じて誘導体を作成し、実験例４に準
じてＨＰＬＣ分離を行った。その結果グリコールアルデ
ヒドに相当するピークが著しく減少し、それに相当する
量のグリオキザールのピークのみが出現し、その濃度は
75.4mMであった。
ルデヒド１ml、ピチア（Pichia）属由来のアルコールオ
キシダーゼ400単位、カタラーゼ130 kuを添加し、反応
液を10mlとし、30℃、３時間反応した。この反応液から
実験例１及び２に準じて誘導体を作成し、実験例４に準
じてＨＰＬＣ分離を行った。その結果グリコールアルデ
ヒドに相当するピークが著しく減少し、それに相当する
量のグリオキザールのピークのみが出現し、その濃度は
75.4mMであった。
【００３６】実施例２ 実施例１と同様の組成で反応を行い、反応によって生ず
るpHの低下を６Ｎ水酸化ナトリウム（NaOH）添加で補い
つつ、pHを７付近に保って30℃、３時間反応した。その
結果、86.7mMのグリオキザールが得られた。
るpHの低下を６Ｎ水酸化ナトリウム（NaOH）添加で補い
つつ、pHを７付近に保って30℃、３時間反応した。その
結果、86.7mMのグリオキザールが得られた。
【００３７】実施例３ 実施例１と同様の組成で反応を20℃、３時間行った結
果、91.8mMのグリオキザールが得られた。又実施例２と
同様にpHを７付近に保った場合グリオキザール濃度は10
0mMでありグリコールアルデヒドがほぼ完全にグリオキ
ザールに変換された。
果、91.8mMのグリオキザールが得られた。又実施例２と
同様にpHを７付近に保った場合グリオキザール濃度は10
0mMでありグリコールアルデヒドがほぼ完全にグリオキ
ザールに変換された。
【００３８】実施例４ 実施例１と同様の組成で反応を行い、10℃以下（０〜10
℃）で４時間反応させた結果、100 mMのグリオキザール
が確認され、低温でも本反応が速やかに進行することが
明かとなった。
℃）で４時間反応させた結果、100 mMのグリオキザール
が確認され、低温でも本反応が速やかに進行することが
明かとなった。
【００３９】実施例５ 0.2 M ＴＥＳ緩衝液（pH7.0）７mlに1.8M エチレングリ
コール１ml、ピチア（Pichia）属由来のアルコールオキ
シダーゼ400単位、カタラーゼ（ベーリンガーマンハイ
ム社製品、牛肝臓由来）130 kuを添加し、反応液を10ml
に調整した後、10℃以下（０〜10℃）で３時間反応し
た。その結果176.0mMのグリオキザールが確認され、低
温でエチレングリコールからもグリオキザールが効率よ
く生産された。
コール１ml、ピチア（Pichia）属由来のアルコールオキ
シダーゼ400単位、カタラーゼ（ベーリンガーマンハイ
ム社製品、牛肝臓由来）130 kuを添加し、反応液を10ml
に調整した後、10℃以下（０〜10℃）で３時間反応し
た。その結果176.0mMのグリオキザールが確認され、低
温でエチレングリコールからもグリオキザールが効率よ
く生産された。
【００４０】実施例６ 0.2M ＴＥＳ緩衝液（pH7.0）７mlに10M エチレングリコ
ール１ml、ピチア（Pichia）属由来のアルコールオキシ
ダーゼ800単位、カタラーゼ130 kuを添加し、反応液を1
0mlに調整した後、pHを７付近に保ちながら10℃以下
（０〜10℃）で24間反応した。その結果427mMのグリオ
キザールと350mMのグリコールアルデヒドが確認され、
高濃度のエチレングリコールからもグリオキザールが効
率よく生産された。
ール１ml、ピチア（Pichia）属由来のアルコールオキシ
ダーゼ800単位、カタラーゼ130 kuを添加し、反応液を1
0mlに調整した後、pHを７付近に保ちながら10℃以下
（０〜10℃）で24間反応した。その結果427mMのグリオ
キザールと350mMのグリコールアルデヒドが確認され、
高濃度のエチレングリコールからもグリオキザールが効
率よく生産された。
【００４１】実施例７ 0.2M ＴＥＳ緩衝液（pH7.0）７mlに1.0M エチレングリ
コール１ml、カンジダ（Candida）属由来のアルコール
オキシダーゼ135単位、カタラーゼ130 kuを添加し、反
応液を10mlに調整した後、pHを７付近に保ちながら10℃
以下（０〜10℃）で６時間反応した。その結果98.6mMの
グリオキザールが蓄積し、エチレングリコールが効率よ
くグリオキザールに変換された。
コール１ml、カンジダ（Candida）属由来のアルコール
オキシダーゼ135単位、カタラーゼ130 kuを添加し、反
応液を10mlに調整した後、pHを７付近に保ちながら10℃
以下（０〜10℃）で６時間反応した。その結果98.6mMの
グリオキザールが蓄積し、エチレングリコールが効率よ
くグリオキザールに変換された。
【００４２】実施例８ ハンセヌラ（Hansenula ）属由来のアルコールオキシダ
ーゼ（シグマ社製品）400単位を用いて実施例６と同様
に10℃以下（０〜10℃）で18時間反応させた結果、99.7
mMのグリオキザールが蓄積し、エチレングリコールが効
率よくグリオキザールに変換された。
ーゼ（シグマ社製品）400単位を用いて実施例６と同様
に10℃以下（０〜10℃）で18時間反応させた結果、99.7
mMのグリオキザールが蓄積し、エチレングリコールが効
率よくグリオキザールに変換された。
【００４３】実施例９ アスペルギルス（Aspergillus ）属由来のグリセロール
オキシダーゼ50単位を用いて実施例７と同様の条件で反
応させた結果、99.9mMのグリオキザールが蓄積し、エチ
レングリコールが効率よくグリオキザールに変換され
た。
オキシダーゼ50単位を用いて実施例７と同様の条件で反
応させた結果、99.9mMのグリオキザールが蓄積し、エチ
レングリコールが効率よくグリオキザールに変換され
た。
【００４４】実施例１０ ペニシリウム（Penicillium ）属由来のグリセロールオ
キシダーゼ50単位を用いて実施例７と同様の条件で反応
させた結果、98.9mMのグリオキザールが蓄積し、エチレ
ングリコールが効率よくグリオキザールに変換された。
キシダーゼ50単位を用いて実施例７と同様の条件で反応
させた結果、98.9mMのグリオキザールが蓄積し、エチレ
ングリコールが効率よくグリオキザールに変換された。
【００４５】実施例１１ 20mM エチレングリコールと10 mM ＮＡＤを含有する0.2
Mリン酸緩衝液（pH8.5）にグリセロールデヒドロゲナー
ゼ「アマノ」（天野製薬社製品）50単位を添加し25℃、
20時間反応させた結果、約3.5mMのグリオキザールの蓄
積が確認された。
Mリン酸緩衝液（pH8.5）にグリセロールデヒドロゲナー
ゼ「アマノ」（天野製薬社製品）50単位を添加し25℃、
20時間反応させた結果、約3.5mMのグリオキザールの蓄
積が確認された。
【００４６】実施例１２ R. Couderc 等の方法〔前記の文献〕に準じて培養し
て得られたピチア・パストリス（Pichia pastoris）JCM
No.3650の菌体を凍結乾燥し、その菌体500mgを0.2M Ｔ
ＥＳ緩衝液（pH7.0）4.5mlに懸濁後1.0M エチレングリ
コール0.5mlを添加し、20℃、20時間反応した結果、48.
2mMのグリオキザールが得られた。
て得られたピチア・パストリス（Pichia pastoris）JCM
No.3650の菌体を凍結乾燥し、その菌体500mgを0.2M Ｔ
ＥＳ緩衝液（pH7.0）4.5mlに懸濁後1.0M エチレングリ
コール0.5mlを添加し、20℃、20時間反応した結果、48.
2mMのグリオキザールが得られた。
【００４７】実施例１３ Y. Tani等の方法〔前記の文献〕に準じて培養して得
られたカンジダ・エスピーNo.SS104（FERM-P No.1370
2）の菌体を凍結乾燥し、その菌体500mgを0.2MＴＥＳ緩
衝液（pH7.0）4.5mlに懸濁後1.0 M エチレングリコール
0.5mlを添加し、10℃以下（０〜10℃）で16時間反応し
た結果、53.7mMのグリオキザールが得られた。
られたカンジダ・エスピーNo.SS104（FERM-P No.1370
2）の菌体を凍結乾燥し、その菌体500mgを0.2MＴＥＳ緩
衝液（pH7.0）4.5mlに懸濁後1.0 M エチレングリコール
0.5mlを添加し、10℃以下（０〜10℃）で16時間反応し
た結果、53.7mMのグリオキザールが得られた。
【００４８】実施例１４ T. Uwajima等の方法〔Agric. Biol. Chem.,44巻,399〜4
06(1980)〕に準じて培養して得られたノイロスポラ・ク
ラッサ（Neurospora crassa）IFO No.6068の菌体を凍結
乾燥し、その菌体300mgを0.2M ＴＥＳ緩衝液（pH7.0）
７mlに懸濁後、1.0M エチレングリコール１mlを添加
し、反応液を10mlに調整した後、10℃以下（０〜10℃）
で16時間反応した。その結果13.0mMのグリオキザールが
蓄積した。
06(1980)〕に準じて培養して得られたノイロスポラ・ク
ラッサ（Neurospora crassa）IFO No.6068の菌体を凍結
乾燥し、その菌体300mgを0.2M ＴＥＳ緩衝液（pH7.0）
７mlに懸濁後、1.0M エチレングリコール１mlを添加
し、反応液を10mlに調整した後、10℃以下（０〜10℃）
で16時間反応した。その結果13.0mMのグリオキザールが
蓄積した。
【００４９】実施例１５ S. Yamada等の方法〔 J. Ferment. Technol.,57巻,221
〜226(1979)〕に準じて培養して得られたアセトバクタ
ー・パステウリアヌス（Acetobacter pasteurianus）IF
O No.13753の菌体を凍結乾燥し、その菌体300mgを0.2M
ＴＥＳ緩衝液（pH7.0）７mlに懸濁後、1.0M エチレング
リコール１mlを添加し、反応液を10mlに調整した後、10
℃以下（０〜10℃）で16時間反応した。その結果53mMの
グリオキザールが蓄積し、エチレングリコールが効率よ
くグリオキザールに変換された。
〜226(1979)〕に準じて培養して得られたアセトバクタ
ー・パステウリアヌス（Acetobacter pasteurianus）IF
O No.13753の菌体を凍結乾燥し、その菌体300mgを0.2M
ＴＥＳ緩衝液（pH7.0）７mlに懸濁後、1.0M エチレング
リコール１mlを添加し、反応液を10mlに調整した後、10
℃以下（０〜10℃）で16時間反応した。その結果53mMの
グリオキザールが蓄積し、エチレングリコールが効率よ
くグリオキザールに変換された。
【００５０】実施例１６ R. Couderc等の方法〔前記の文献〕に準じて培養して
得られたハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymo
rpha）ATCC No.26012の菌体を凍結乾燥し、その菌体500
mgを0.2M ＴＥＳ緩衝液（pH7.0）７mlに懸濁後、1.0M
エチレングリコール１mlを添加し、反応液を10mlに調整
した後、10℃以下（０〜10℃）で16時間反応した。その
結果23.7mMのグリオキザールが蓄積し、エチレングリコ
ールが効率よくグリオキザールに変換された。
得られたハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymo
rpha）ATCC No.26012の菌体を凍結乾燥し、その菌体500
mgを0.2M ＴＥＳ緩衝液（pH7.0）７mlに懸濁後、1.0M
エチレングリコール１mlを添加し、反応液を10mlに調整
した後、10℃以下（０〜10℃）で16時間反応した。その
結果23.7mMのグリオキザールが蓄積し、エチレングリコ
ールが効率よくグリオキザールに変換された。
【００５１】
【実施例１７】土壌より分離したシュードモナス属細菌
（Pseudomonas sp. GOX-201 FERM p-14328）を２％プロ
ピレングリコール、0.5％ＣＳＬを含有する培地で３０
℃２日間培養し、菌体を遠心分離で集めた。この菌体を
生理食塩水で洗浄後500 mM エチレングリコールを含む
0.2 M ＴＥＳ-ＮａＯＨ緩衝液（pH 7.0）20 mlに加え、
30℃で16時間反応した。その結果、80 mMグリオキザー
ルを蓄積させることができた。
（Pseudomonas sp. GOX-201 FERM p-14328）を２％プロ
ピレングリコール、0.5％ＣＳＬを含有する培地で３０
℃２日間培養し、菌体を遠心分離で集めた。この菌体を
生理食塩水で洗浄後500 mM エチレングリコールを含む
0.2 M ＴＥＳ-ＮａＯＨ緩衝液（pH 7.0）20 mlに加え、
30℃で16時間反応した。その結果、80 mMグリオキザー
ルを蓄積させることができた。
【００５２】
【実施例１８】土壌より分したアルカリゲネス属細菌
（Alcaligenes sp. GX-52 FERM p-14329）を実施例７と
同様の条件で培養し、得られた菌体を用いて実施例７と
同様にエチレングリコールのグリオキザールへの変換を
検討した。その結果、66 mMグリオキザールを蓄積させ
ることができた。
（Alcaligenes sp. GX-52 FERM p-14329）を実施例７と
同様の条件で培養し、得られた菌体を用いて実施例７と
同様にエチレングリコールのグリオキザールへの変換を
検討した。その結果、66 mMグリオキザールを蓄積させ
ることができた。
【００５３】
【実施例１９】ピチア属由来アルコールオキシダーゼ25
0単位を常法によりＣＮＢｒ−セファロース（250mg）に
固定化し、カラムに充填した。このカラム（カラム容積
0.9 ml）に130 kuのカタラーゼを含有する100 mMエチレ
ングリコール10 mlを循環させながら２日間反応した。
その結果、試料として用いたエチレングリコールの全て
がグリコールアルデヒドに変換できた。
0単位を常法によりＣＮＢｒ−セファロース（250mg）に
固定化し、カラムに充填した。このカラム（カラム容積
0.9 ml）に130 kuのカタラーゼを含有する100 mMエチレ
ングリコール10 mlを循環させながら２日間反応した。
その結果、試料として用いたエチレングリコールの全て
がグリコールアルデヒドに変換できた。
【００５４】
【発明の効果】本発明は、グリオキザールを酸化還元酵
素又は該酵素を含有する微生物を用いて生化学的に製造
するものであり、これにより、グリオキザールを温和な
条件下で、且つ副産物を生成すること無く製造できる利
点がある。
素又は該酵素を含有する微生物を用いて生化学的に製造
するものであり、これにより、グリオキザールを温和な
条件下で、且つ副産物を生成すること無く製造できる利
点がある。
【図１】グリコールアルデヒド、グリオキザール及びグ
リオキシル酸の各誘導体−１（実線で示される。）及び
誘導体−２（破線で示される。）の吸光度曲線を示すも
のである。尚、図中の番号の１は水を、２は15mM グリ
オキザールを、３はグリオキシル酸を、４はグリコール
アルデヒドをそれぞれ使用した場合を示す。
リオキシル酸の各誘導体−１（実線で示される。）及び
誘導体−２（破線で示される。）の吸光度曲線を示すも
のである。尚、図中の番号の１は水を、２は15mM グリ
オキザールを、３はグリオキシル酸を、４はグリコール
アルデヒドをそれぞれ使用した場合を示す。
【図２】グリオキシル酸、グリオキザール各誘導体−１
（波長380 nmで測定され、実線で示される。）及びグリ
コールアルデヒド、グリオキシル酸の各誘導体−２（波
長610nmで測定され、破線で示される。）のそれぞれの
検量曲線を示すものである。尚、図中白丸はグリオキシ
ル酸、黒丸はグリオキザール、そして白四角はグリコー
ルアルデヒドをそれぞれ示す。
（波長380 nmで測定され、実線で示される。）及びグリ
コールアルデヒド、グリオキシル酸の各誘導体−２（波
長610nmで測定され、破線で示される。）のそれぞれの
検量曲線を示すものである。尚、図中白丸はグリオキシ
ル酸、黒丸はグリオキザール、そして白四角はグリコー
ルアルデヒドをそれぞれ示す。
【図３】各種誘導体の逆相液体クロマトグラフ図であ
る。図中のピーク１及び２は、グリオキシル酸及びグリ
オキザールの各誘導体−１（波長380nmで測定）を示す
ものであり、ピーク３及び４はグリコールアルデヒド及
びグリオキシル酸の各誘導体−２（波長を610nmで測
定）をそれぞれ示すものである。
る。図中のピーク１及び２は、グリオキシル酸及びグリ
オキザールの各誘導体−１（波長380nmで測定）を示す
ものであり、ピーク３及び４はグリコールアルデヒド及
びグリオキシル酸の各誘導体−２（波長を610nmで測
定）をそれぞれ示すものである。
【図４】ピチア属由来アルコールオキシダーゼが、基質
グリコールアルデヒド及びエチレングリコールを酸化す
る場合の至適pH曲線を示すものである。尚、図中におい
て、エチレングリコールの場合はリン酸緩衝液を使用し
破線で示され、グリコールアルデヒドの場合は、トリス
塩酸緩衝液を使用し、実線で示される。
グリコールアルデヒド及びエチレングリコールを酸化す
る場合の至適pH曲線を示すものである。尚、図中におい
て、エチレングリコールの場合はリン酸緩衝液を使用し
破線で示され、グリコールアルデヒドの場合は、トリス
塩酸緩衝液を使用し、実線で示される。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年６月２２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５１】実施例１７ 土壌より分離したシュードモナス属細菌（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ｓｐ．ＧＯＸ−２０１ ＦＥＲＭ ｐ−１
４３２８）を２％プロピレングリコール、０．５％ＣＳ
Ｌを含有する培地で３０℃２日間培養し、菌体を遠心分
離で集めた。この菌体を生理食塩水で洗浄後５００ｍＭ
エチレングリコールを含む０．２Ｍ ＴＥＳ−ＮａＯＨ
緩衝液（ｐＨ ７．０）２０ｍｌに加え、３０℃で１６
時間反応した。その結果、８０ｍＭグリオキザールを蓄
積させることができた。
ｍｏｎａｓ ｓｐ．ＧＯＸ−２０１ ＦＥＲＭ ｐ−１
４３２８）を２％プロピレングリコール、０．５％ＣＳ
Ｌを含有する培地で３０℃２日間培養し、菌体を遠心分
離で集めた。この菌体を生理食塩水で洗浄後５００ｍＭ
エチレングリコールを含む０．２Ｍ ＴＥＳ−ＮａＯＨ
緩衝液（ｐＨ ７．０）２０ｍｌに加え、３０℃で１６
時間反応した。その結果、８０ｍＭグリオキザールを蓄
積させることができた。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５２】実施例１８ 土壌より分したアルカリゲネス属細菌（Ａｌａｌｉｇｅ
ｎｅｓ ｓｐ．ＧＸ−５２ ＦＥＲＭ ｐ−１４３２
９）を実施例７と同様の条件で培養し、得られた菌体を
用いて実施例７と同様にエチレングリコールのグリオキ
ザールへの変換を検討した。その結果、６６ｍＭグリオ
キザールを蓄積させることができた。
ｎｅｓ ｓｐ．ＧＸ−５２ ＦＥＲＭ ｐ−１４３２
９）を実施例７と同様の条件で培養し、得られた菌体を
用いて実施例７と同様にエチレングリコールのグリオキ
ザールへの変換を検討した。その結果、６６ｍＭグリオ
キザールを蓄積させることができた。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５３】実施例１９ ピチア属由来アルコールオキシダーゼ５００単位を常法
によりＣＮＢｒ−セファロース （５００ｍｇ）に固定
化し、カラムに充填した。このカラム（カラム容積１．
８ｍｌ）に１３０ｋｕのカタラーゼを含有する１００ｍ
Ｍグリコールアルデヒド１０ｍｌを循環させながら２日
間反応した。その結果、試料として用いたグリコールア
ルデヒドの全てがグリオキザールに変換できた。
によりＣＮＢｒ−セファロース （５００ｍｇ）に固定
化し、カラムに充填した。このカラム（カラム容積１．
８ｍｌ）に１３０ｋｕのカタラーゼを含有する１００ｍ
Ｍグリコールアルデヒド１０ｍｌを循環させながら２日
間反応した。その結果、試料として用いたグリコールア
ルデヒドの全てがグリオキザールに変換できた。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５４】
【発明の効果】本発明は、グリオキザールを酸化還元酵
素又は該酵素を含有する微生物を用いて生化学的に製造
するものであり、これにより、グリオキザールを温和な
条件下で、且つ化学合成法における副産物である有機酸
を生成すること無く製造できる利点がある。
素又は該酵素を含有する微生物を用いて生化学的に製造
するものであり、これにより、グリオキザールを温和な
条件下で、且つ化学合成法における副産物である有機酸
を生成すること無く製造できる利点がある。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 7/24 Ｃ１２Ｒ 1:78） (Ｃ１２Ｐ 7/24 Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｐ 7/24 Ｃ１２Ｒ 1:80） (Ｃ１２Ｐ 7/24 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 7/24 Ｃ１２Ｒ 1:02） (Ｃ１２Ｐ 7/24 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｐ 7/24 Ｃ１２Ｒ 1:05）
Claims (5)
- 【請求項１】エチレングリコール又はグリコールアルデ
ヒドに酸化還元酵素又は該酸化還元酵素を含有する微生
物を作用させることによってエチレングリコール又はグ
リコールアルデヒドをグリオキザールに変換せしめ、こ
れを採取することを特徴とするグリオキザールの生化学
的製造法。 - 【請求項２】酸化還元酵素がエチレングリコール又はグ
リコールアルデヒドを酸化する能力を有するオキシダー
ゼ及び／又はデヒドロゲナーゼであるところの請求項１
記載のグリオキザールの生化学的製造法。 - 【請求項３】酸化還元酵素を含有する微生物がピチア
属、カンジダ属、ハンセヌラ属、アスペルギルス属、ペ
ニシリウム属、ノイロスポラ属、アセトバクター属、シ
ュードモナス属、アルカリゲネス属のうちのいずれかに
属する菌株であるところの請求項１記載のグリオキザー
ルの生化学的製造法。 - 【請求項４】オキシダーゼがアルコールオキシダーゼ又
はグリセロールオキシダーゼであり、デヒドロゲナーゼ
がグリセロールデヒドロゲナーゼであるところの請求項
２記載のグリオキザールの生化学的製造法。 - 【請求項５】エチレングリコール又はグリコールアルデ
ヒドに酸化還元酵素又は該酸化還元酵素を含有する微生
物を作用させることによってエチレングリコール又はグ
リコールアルデヒドをグリオキザールに変換せしめ、こ
れを採取するグリオキザールの生化学的製造法におい
て、反応工程中にカタラーゼを添加することにより、反
応生成物であるグリオキザールの蓄積量を増大せしめる
ことを特徴とする請求項１〜請求項４のうちのいずれか
１項記載のグリオキザールの生化学的製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16284394A JPH0767670A (ja) | 1993-07-09 | 1994-06-20 | グリオキザールの生化学的製造法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5-193919 | 1993-07-09 | ||
| JP19391993 | 1993-07-09 | ||
| JP16284394A JPH0767670A (ja) | 1993-07-09 | 1994-06-20 | グリオキザールの生化学的製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0767670A true JPH0767670A (ja) | 1995-03-14 |
Family
ID=26488487
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16284394A Pending JPH0767670A (ja) | 1993-07-09 | 1994-06-20 | グリオキザールの生化学的製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0767670A (ja) |
-
1994
- 1994-06-20 JP JP16284394A patent/JPH0767670A/ja active Pending
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