JPH0768141B2 - トロンビンの新規インヒビター - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の技術分野 本発明は、トロンビンに結合して阻害する新規な生物学
的活性分子に関する。特に、トロンビンの外部のアニオ
ン結合部位に結合する部分（ABEAM）、少なくとも長な
が18オングストロームのリンカー部分およびトロンビン
の触媒部位に特異的な部分（CSDM）によって特徴付けら
れる。さらに本発明は、治療、予防および診断の目的の
ためにこれらの分子を用いる組成物、組合せおよび方法
に関する。

背景技術 急性の血管性疾患、例えば、心筋梗塞、脳卒中、肺塞栓
症、深部静脈血栓症、末梢動脈閉塞、および他の血管系
の血栓症は、主要な生命の危険要因である。このような
病気はフィブリンおよび血小板を含有する血液クロット
で、血管が一部または完全に閉塞することによって起こ
る。

血栓性疾患の現在の治療および予防法には、２つの異な
る経路のうち一つに作用する治療剤が含まれる。第一の
タイプの治療剤は、トロンビン活性またはトロンビン形
成を阻害し、それによりクロット形成を防止する。これ
らの薬物はまた、血小板の活性化および凝集をも阻害す
る。第二のカテゴリーの治療法は、血栓溶解を促進して
血液クロットを溶解し、それにより血管から血液クロッ
トを除去して血流の阻止を解く［J.P.Cazenaveら、Agen
ts Action,15,Suppl.,pp.24−49（1984）］。

前述のクラスの化合物であるヘパリンは、静脈血栓塞栓
症などのトロンビン活性が血栓の発生および成長に原因
する症状を処置するために広く用いられている。効果的
ではあるが、ヘパリンは、出血および血小板減少症を含
む望ましくない多くの副作用を生じる。このことは、さ
らに特異的な毒性の少ない抗凝固剤の研究を導いてい
る。

ヒルジン（Hirudin）は、血を吸うヒルHirudo medicina
lisによって産生される天然のポリペプチドである。ヒ
ルの唾液腺で合成されるこの化合物は、血液凝固の最も
強力な天然の阻害剤であることが知られている。ヒルジ
ンは、1:1の化学量論的な複合体としてトロンビン（K_d
＝２×10^-11M）と固く結合して血液が凝固するのを防ぐ
［S.R.StoneおよびJ.Hofsteenge,“Kinetics of the In
hibition of Thrombin by Hirudin",Biochemistry,25,p
p.4622−28（1986）］。次に、これは、他の全てのトロ
ンビン媒介性の経路を阻害するのと同様に、トロンビン
がフィブリノーゲンからフィブリン（クロット）に転換
するのを阻害する［J.W.Fenton,II,“Regulation of Th
rombin Generation and Functions",Semin.Thromb.Hemo
st.,14,pp.234−40（1988）］。

ヒルジンとトロンビンとの実際の結合には２つの工程が
ある。最初に、ヒルジンは、触媒部位とは異なるトロン
ビン分子の親和性の「低い」部位（K_d＝１×10^-8M）に
結合する。この結合には、トロンビンの「アニオン結合
外部部位」（ABE）とのヒルジンＣ末端の構造の相互作
用が含まれる［J.W.Fenton,IIら、“Thrombin Anion Bi
nding Exosite Interactions with Heparin and Variou
s Polyanions",Ann.New York Acad.Sci.,556,pp.158−6
5（1989）］。親和性の低い結合後、ヒルジン−トロン
ビン複合体は、立体構造の変化を経て、次にヒルジンは
トロンビンの親和性の「高い」部位に結合する［S.Kono
ら、“Analysis of Secondary Structure of Hirudin a
nd the Conformational Change Upon Interaction with
Thrombin",Arch.Biochem.Biophys.,267,pp.158−66（1
988）］。後者の部位は、トロンビンの活性部位に相当
する。

ヒルジンの単離、精製および化学組成は当分野には公知
である［P.WalsmannおよびF.Markwardt,“Biochemical
and Pharmacological Aspects of the Thrombin Inhibi
tor Hirudin",Pharmazin,36,pp.653−60（1981）］。最
近、そのポリペプチドの全アミノ酸配列が明かにされた
［J.Dodtら、“The Complete Covalent Structure of H
irudin:Localization of the Disulfide Bonds",Biol.C
hem.Hoppe−Seyler,366,pp.379−85（1985）;S.J.T.Mao
ら、“Rapid Purification and Revised Amino Termina
l Sequence of Hirudin:A Specific Thrombin Inhibito
r of the Blood−Sucking Leech",Anal.Biochem,161,p
p.514−18（1987）；およびR.P.Harveyら、“Cloning a
nd Expression of a cDNA Coding for the Anti−Coagu
lant Hirudin from the Bloodsucking Leech,Hirudo me
dicinalis",Proc,Natl.Acad.Sci.USA,83,pp.1084−88
（1986）］。

少なくとも10個のヒルジンの同質異性体が配列分析され
ていて、アミノ酸配列がわずかに異なることが示されて
いる［D.Tripier,“Hirudin:A Family of Iso−Protein
s.Isolation and Sequence Determination of New Hiru
dins",Folia Haematol.,115,pp.30−35（1988）］。全
ての型のヒルジンは、アミノ末端の主に疏水性アミノ
酸、および典型的にはカルボキシ末端に極性アミノ酸を
有する、65あるいは66個のアミノ酸を含有する一本鎖の
ポリペプチドタンパク質を有する。さらに詳細には、全
ての型のヒルジンは、１−２、３−５および４−６の半
システイニルパターンでの３つのジスルフィド架橋によ
り固定されたＮ末端ドメイン（１−39残基）、および高
度に酸性であるＣ末端セグメント（40−65残基）によっ
て特徴付けられる。さらに、ヒルジンのＣ末端セグメン
トは、アミノ酸63位の硫酸エステル化されているチロシ
ン残基によって特徴付けられる。

動物での研究では、ヒルから精製されたヒルジンが、静
脈血栓症、脈管シャント閉塞およびトロンビン誘導性の
播種性血管内凝固を防ぐ効力が示された。さらに、ヒル
ジンは毒性が低く、抗原性がほとんどなく、循環からの
クリアランスタイムが非常に短い［F.Markwardtら、“P
harmacological Studies on the Antithrombotic Actio
n of Hirudin in Experimental Animals",Thromb.Haemo
st.,47,pp.226−29（1982）］。

ヒルジンを大量供給するために、組換えDNA法によって
ポリペプチドを生産する試みがなされてきた。天然ヒル
ジンに０−硫酸エステル化チロシン残基が存在するこ
と、および微生物が類似のタンパン質修飾を行う能力が
ないことは、生物学的に活性なヒルジンを組換え産生す
る見込みを高度に思索的なものにしている。しかし、脱
硫酸エステル化されたヒルジンは硫酸エステル化された
ものとほとんど同程度に活性である（米国特許第4,654,
302号）との観察によって、E.coli（ヨーロッパ特許出
願第158,564号、第168,342号および第171,024号）およ
び酵母（ヨーロッパ特許出願第200,655号）でのヒルジ
ンのクローニングおよび発現法が導かれた。このような
利点にもかかわらず、ヒルジンは生産するにはまだほど
ほどに高価であって、そう広くには入手可能ではない。

最近、凝集する時間を延ばす効果もある天然ヒルジンの
ペプチドフラグメントの同定に努力が払われてきた。硫
酸エステル化されていないヒルジンの21個のアミノ酸の
Ｃ末端フラグメントであるＮ−アセチルヒルジン_45-65
は、インビトロでクロット形成を阻害する。さらに、ヒ
ルジンのＣ末端11あるいは12個のアミノ酸（55−65位お
よび54−65位の残基）に相当する、数個の他の小さな硫
酸エステル化されていないペプチドもまた、インビトロ
でクロット形成を阻害する効果が示された［J.L.Krsten
anskyら、“Antithrombin Properties of C−terminus
of Hirudin Using Synthe tic Unsulfated N−acetyl−
hirudin_45-65",FEBS Lett,211,pp.10−16（1987）］。
しかし、このようなペプチドフラグメントは、低活性で
あるために継続中の治療法において血液クロットを溶解
するには十分満足のゆくものではあり得ない。例えば、
Ｎ−アセチル−ヒルジン_45-65は、天然のヒルジンより
は、比活性が４桁低い。

フィブリンクロットの形成を触媒するのに加えて、トロ
ンビンは他にいくつかの生体調節能を有する［J.W.Fent
on,II,“Thrombin Bioregulatory Functions",Adv.Cli
n.Enzymol.,6,pp.186−93（1988）］。例えば、トロン
ビンは血小板凝集および放出反応を直接活性化する。こ
のことは、トロンビンが急性血小板依存性の血栓症の中
心的役割をなしていることを意味している［S.R.Hanson
およびL.A.Harker,“Interruption of Acute Platelet
−Dependent Thrombosis by the Synthetic Antithromb
in D−Phenylalanyl−Ｌ−Proly−Ｌ−Arginylchlorome
thylketone",Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,pp.3184−88
（1988）］。トロンビンはさらに、内皮細胞中の血小板
活性化因子（PAF）の合成を促進することによって炎症
反応を直接活性化し得る［S.Prescottら、“Human Endo
thelial Cells in Culture Produce Platelet−Activat
ing Factor（１−alkyl−２−acetyl−sn−glycero−３
−phosphocholine）When Stimulated With Thrombin",P
roc.Natl.Acad.Sci.USA,81,pp.3534−38（1984）］。PA
Fは、内皮細胞表面にさらされて、好中球接着およびそ
れに続く脱顆粒化のためのリガンドとして働く［G.M.Ve
rcollettiら、“Platelet−Activating Factor Primes
Neutrophil Responses to Agonists:Role in Promoting
Neutrophil−Mediated Endothelial Damage",Blood,7
1,pp.1100−07（1988）］。あるいは、トロンビンは、
浮腫を導き得る血管浸透性を増すことにより炎症を促進
し得る［P.J.Del Vecchioら、“Endothelial Monolayer
Permeability To Macromolecules",Fed.Proc.,46,pp.2
511−15（1987）］。トロンビンの活性部位をブロック
する、ヒルジンなどの薬剤は、血小板および内皮細胞の
活性化を阻止する［C.L.Knupp,“Effect of Thrombin I
nhibitors on Thrombin−Induced Release and Aggrega
tion",Thrombosis Res.,49,pp.23−36（1988）］。

さらにトロンビンは、その天然の消化産物であるフィブ
リンの能力に基づいて、腫瘍成長の基質として癌腫を促
進することが示唆されている［A.Falangaら、“Isolati
on and Characterization of Cancer Procoagulant:A C
ysteine Proteinase from Malignant Tissue",Biochemi
stry,24,pp.5558−67（1985）;S.G.Gordonら、“Cystei
ne Proteinase Procoagulant From Amnion−Chorion",B
lood,66,pp.1261−65（1985）；そしてA.Falangaら、
“A New Procoagulant In Acute Leukemia",Blood,71,p
p.870−75（1988）］。そして、トロンビンは神経突起
退縮を引き起こす能力に基づいて、神経変性性の疾患に
関係していると示唆されている［D.Gurwitzら、“Throm
bin Modulates and Reverses Neuroblastoma Neurite O
utgrowth",Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,pp.3440−44（1
988）］。従って、トロンビンのインボでの活性を調節
する能力は、多くの臨床上の意義を示唆している。

今日までの発展にもかかわらず、クロット形成、血小板
活性化、および種々の他のトロンビン媒介性の経路にお
いてトロンビンの機能を効果的に阻害する分子で、安価
にそして商業的に実行可能な量で生産され得る分子の必
要性がいまだに存在する。

発明の要旨 本発明は、α−トロンビンの親和性の低いアニオン結合
外部部位（ABE）および触媒部位の両者に結合すること
によりヒルジン作用を模擬する分子を提供することによ
て、前記の問題を解決する。これらの分子は、ヒルジン
よりも強力であり、従って、ヒルジンに基づく治療法に
要求されるよりも比較的少量の投与量で患者に投与され
得る。本発明の分子は、トロンビン媒介性あるいはトロ
ンビン関連の、任意の機能あるいは経路を阻害するため
の組成物および方法に使用され得る。これらの分子を含
有する薬学的組成物、およびそれらを用いる、血管性疾
患、炎症反応、癌腫および神経変性性の疾患の治療ある
いは予防法もまた、本発明の一部である。さらに、これ
らの分子は、エキソビボでの画像化、対外血の貯蔵およ
び処置、並びに挿入装置の被覆用組成物および方法に用
いられ得る。そして、本発明の分子は、薬剤の所定量の
効果を増すかあるいは血液のクロットを溶解するような
効果に必要とされる薬剤の量を減少させるために、フィ
ブリン溶解剤と組み合わせて患者に投与され得る。

その強い効能とそれらが化学合成によって調製され得る
事実のために、本発明の分子は、費用をあまりかけずに
商業的に実行可能な量に調製され得る。さらに、本発明
の分子は、ヒルジンよりも十分に小さいので、これを用
いて処置される患者において望ましくない免疫応答を促
進することはありそうもない。従って、これらのトロン
ビンインヒビターの使用は、急性疾患の処置に限定され
ない。これらの分子は、アテローム性動脈硬化症および
血管形成術後の再狭窄などの慢性血栓塞栓症の治療にも
使用され得る。本発明の分子は、天然あるいは組換えヒ
ルジンの代用として、他の種々の応用にも使用され得
る。

下記の開示から明かになるように、本発明の分子、組成
物、および方法は、トロンビンの望ましくない影響に起
因する種々の疾患の処置および予防、並びに診断の目的
に有用である。

図面の簡単な説明 図１は、スルホ−Tyr₆₃−Ｎ−アセチル−ヒルジン_53-64
が存在するか、あるいは存在しない場合の、DNFB−［³⁵
S］−スルホ−Tyr₆₃ヒルジン_54-64のヒトα−トロンビ
ンへの結合を示す、SDS−ポリアクリルアミドゲルのオ
ートラジオグラフを示す。

図２は、ヒトα−トロンビンの三次元モデルを示す。

図３のパネルＡは、ヒトα−トロンビンによるスペクト
ロザイムTH開裂におけるヒルログ−８（Hirulog−８）
およびスルホ−Tyr₆₃ヒルジン_53-64の効果を示す。

図３のパネルＢは、ヒルログ−８あるいはスルホ−Tyr
₆₃ヒルジン_53-64のいずれかの存在下あるいは非存在下
での、ヒトα−トロンビンによる、スペクトロザイムTH
開裂のLineweaver−Burkeプロットを示す。

図４は、正常ヒト血清の活性化された部分的トロンボプ
ラスチンタイムに対する、種々の濃度のヒルログ−８、
ヒルジンあるいはスルホ−Tyr₆₃−Ｎ−アセチル−ヒル
ジン_53-64の効果を示す。

図５のパネルＡは、ヒトα−トロンビンによる種々の濃
度のヒルログ−８による開裂の経時変化を示す。

図５のパネルＢは、ヒルログ−８の濃度と、ヒトα−ト
ロンビンによるスペクトロザイムTH加水分解阻害の持続
との関係を示す。

図６は、スペクトロザイムTHのトロンビンの触媒による
加水分解の阻害に対する、本発明のトロンビンインヒビ
ターのリンカーの長さの影響を示す。

図７は、¹⁴C−DFPによるトロンビン修飾に対する、種々
の濃度のヒルログ−８あるいはスルホ−Tyr₆₃−Ｎ−ア
セチル−ヒルジン_53-64の阻害効果を示す。

図８は、ヒヒのAPTTに対する、ヒルログ−８の種々の投
与量のインビボでの効果を示す。

図９は、可溶性トロンビンあるいはクロット結合トロン
ビンによる、フィブリノーゲンの加水分解に対する、ヒ
ルログ−８あるいはヘパリンの阻害効果の比較を示す。

図10は、ヒヒの大動脈の動脈内膜切除されたセグメント
上の血小板沈着に対する、ヒルログ−８の種々の投与量
のインビボでの効果を示す。

図11は、ヒヒに挿入された、コラーゲン被覆されたチュ
ーブのセグメント上の血小板沈着に対する、ヒルログ−
８の種々の投与量のインビボでの効果を示す。

図12は、ヒヒのAVシャントに挿入された、コラーゲン被
覆されたチューブのセグメント上の血小板沈着に対す
る、ヘパリン、ヒルジンおよびヒルログ−８のインビボ
での効果の比較を示す。

図13は、ヒヒのAVシャントに挿入された、コラーゲン被
覆されたチューブのセグメント上のフィブリン沈着に対
する、ヒルログ−８の種々の投与量のインビボでの効果
を示す。

図14は、ヒルログ−８のヒヒの静脈内ボーラス注射後
の、APTTの経時変化を示す。

図15は、ヒルログ−８のヒヒの皮下注射後の、APTTの経
時変化を示す。

図16は、ラットモデルでの再潅流するまでの時間に対す
る、生理食塩水、ヘパリン、ヒルジンあるいはヒルジン
−８のいずれかを伴っての、組織プラスミノーゲン活性
化因子のインビボでの効果の比較を示す。

図17は、ラットモデルでの、生理食塩水、ヘパリン、ヒ
ルジンあるいはヒルログ−８のいずれかを伴っての、組
織プラスミノーゲン活性化因子の再閉塞時間に対するイ
ンビボでの効果の比較を示す。

図18は、ラットモデルでの、生理食塩水、ヘパリン、ヒ
リジンあるいはヒルログ−８のいずれかを伴っての、組
織プラスミノーゲン活性化因子のAPTTに対するインビボ
での効果の比較を示す。

第19は、ラットモデルでの、生理食塩水、ヘパリン、ヒ
ルジンあるいはヒルログ−８のいずれかを伴っての、組
織プラスミノーゲン活性化因子の血管の開通に対するイ
ンビボでの効果の比較を示す。

図20は、ヒヒモデルでの出血時間に対するヒルログ−８
の種々の投与量の効果を示す。

発明の詳細な説明 本明細書および特許請求の範囲を通して下記のアミノ酸
の一般的な略号が用いられている： Orn−オルニチン、Gly−グリシン Ala−アラニン、Val−バリン Leu−ロイシン、Ile−イソロイシン Pro−プロリン、Phe−フェニルアラニン Trp−トリプトファン、Met−メチオニン Ser−セリン、Thr−スレオニン Cys−システイン、Tyr−チロシン Asn−アスパラギン、Gln−グルタミン Asp−アスパラギン酸、Glu−グレタミン酸 Lys−リシン、Arg−アルギニン His−ヒスチジン、Nle−ノルロイシン Hyp−ヒドロキシプロリン、Pgl−フェニルグリシン Ac−アセチル、Suc−スクシニル BOC−ｔ−ブトキシカルボニル、Tos−ｐ−トルエンスル
ホニル Cbz−カルボキシベンジルオキシ、Ｄ−Ala−Ｄ−アラニ
ン 3,4,−デヒドロPro−3,4,−デヒドロプロリン、Sar−サ
ルコシン（Ｎ−メチルグリシン） Tyr（OSO₃H）−チロシンサルフェート、Tyr（SO₃H）−
チロシンスルホネート ３−,5−ジョードTyr−３−,5−ジョードチロシン 本明細書に用いられている用語「任意のアミノ酸」に
は、天然のアミノペプチドの合成アナログを調製する際
の、天然のアミン酸のＬ−異性体およびペプチド化学め
分野の当業者に一般的に用いられている他の「非タンパ
ク質」α−アミノ酸が含まれる。天然のアミノ酸には、
グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシ
ン、セリン、メチオニン、スレオニン、フェニルアラニ
ン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリ
ン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グル
タミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、
アルギニン、オルニチンおよびリシンがある。「非タン
パク質」α−アミノ酸の例には、ノルロイシン、ノルバ
リン、アロイソロイシン、ホモアルギニン、チアプロリ
ン、デヒドロプロリン、ヒドロキシプロリン（Hyp）、
ホモセリン、シクロヘキシルグリシン（Chg）、α−ア
ミノ−ｎ−酪酸（Aba）、シクロヘキシルアラニン（Ch
a）、アミノフェニル酪酸（Pba）、フェニル部分の、オ
ルト、メタ、あるいはパラ位で、下記の１つあるいは２
つで置換されたフェニルアラニンが含まれる：（C₁−
C₄）アルキル、（C₁−C₄）アルコキシ、ハロゲンまたは
ニトロ基、あるいはメチレンジオキシ基による置換；β
−２−および３−チエニラル−アラニン、β−２−およ
び３−フラニルアラニン、β−２−、３−および４−ピ
リジンアラニン、β−（ベンゾチエニル−２−および３
−イル）アラニン、β−（１−および２−ナフチル）ア
ラニン、セリン、スレオニン、あるいはチロシンのＯ−
アルキル化誘導体、Ｓ−アルキル化システイン、Ｓ−ア
ルキル化ホモシステイン、チロシンのＯ−硫酸エステ
ル、Ｏ−リン酸エステルおよびＯ−カルキシエステル、
３−および５−スルホニルチロシン、３−および５−カ
ルボニルチロシン、３−および５−ホスホニルチロシ
ン、４−メチルスルホニルチロシン、４−メチルホスホ
ニルチロシン、４−フェニル酢酸、3,5ジヨードチロシ
ン、３−および５−ニトロチロシン、ε−アルキルリシ
ン、δ−アルキルオルニチン、および天然のアミノ酸の
Ｄ−異性体。

本明細書で、硫酸化チロシン、Tyr（OSO₃H）、およびチ
ロシンのＯ−硫酸化エステルと称する化合物は同一のも
のであり、下記の構造式に有する。

本明細書で、スルホン化チロシン、Tyr（SO₃H）、３−
スルホニルチロシンおよび５−スルホニルチロシンと称
する化合物は同一のものであり、下記の構造式を有す
る。

用語「患者」とは、本願においては任意の哺乳動物、特
にヒトのことである。

本明細書で用いられている「アニオン性アミノ酸」と
は、メタ、パラあるいはオルト位で、モノあるいはジ置
換されたフェニルアラニン、シクロヘキシルアラニンあ
るいはカルボキシル、ホスホリルあるいはスルホニル部
分を有するチロシン、およびＳ−アルキル化システイ
ン、Ｓ−アルキル化ホモシステイン、γ−カルボキシグ
ルタミン酸、ε−アルキルリシン、δ−アルキルオルニ
チン、グルタミン酸およびアスパラギン酸を意味する。
アニオン性アミノ酸の例には、ホスホスレオニン、ホス
ホセリン、ホスホチロシン、３−、４−あるいは５−ス
ルホチロシン、３−メチルホスホニルチロシンおよび３
−メチルスルホニルチロシンが含まれる。

本明細書で用いられている用語「触媒部位」、「活性部
位」および「活性部位ポケット」は、それぞれ下記に示
されるトロンビンの部位のいずれかあるいは全てのこと
である：基質結合あるいは「S₁」部位；疏水結合あるい
は「油性」部位；および基質の開裂が実際に起こる部位
（「電荷を受け渡す部位」）。

本明細書で用いられている用語「N^orn」とは、オルニチ
ンの側鎖の窒素のことである。用語「N^g」とは、アルギ
ニンの側鎖の任意の窒素のことである。用語「Ｎ^α」と
は、アミノ酸のα−アミノ基のことである。そして、本
明細書および特許請求の範囲に用いられている用語「ps
i」とは、J.Rudinger,In Drug Design,Vol.II,E.J.Arie
ns編、Academic Press,New York,p.319（1971）に記載
の命名法に従って、括弧内に示した原子によるアミド結
合の置換のことである。

本明細書に用いられている用語「骨格鎖」とは、化学構
造の一端から他の端にたどりつけ得る、最も数少ない連
続した結合である化学構造の一部である。骨格鎖をなす
元素組成には、少なくとも２つの他の原子と結合を形成
し得る任意の原子が含まれ得る。

例えば、下記の各々の化学構造は、７個の原子（骨格鎖
に含まれる原子はボールド体で示されている）の骨格鎖
によって特徴付けられる。

本願で用いられている用語「計算上の長さ」とは、骨格
鎖の原子間の結合の長さの合計によって予測される長さ
のことである。任意の２つの原子間の結合の長さは当分
野では公知である（例えば、CRC Handbook of Chemistr
y and Physics,65th Edition,R.C.Weist編、CRC Press,
Inc.,Boca Raton,FL,pp.F−166−70（1984）を参照の
と）。

本発明は、トロンビンに結合してそしてトロンビンを阻
害する分子に関する。これらの分子は、３つのドメイ
ン、すなわち、触媒部位特異的部分（“CSDM"）、リン
カー領域、および外部のアニオン結合部位に結合する部
分（“ABEAM"）によって特徴付けられる。

本発明による、最初のドメインCSDMは、Ser−195位ある
いはその付近のトロンビンの触媒部位に結合して、トロ
ンビンのアミド結合分解活性あるいはエステル結合分解
活性に阻害あるいは妨害する。好ましくは、本発明のCS
DMは、下記の３つの一般的な基のうちの１つから選択さ
れる：トロンビンに可逆的に結合して徐々に開裂される
基；トロンビンに可逆的に結合して開裂されない基；お
よびトロンビンに不可逆的に結合する基。可逆的なイン
ヒビターは、トロンビンの活性部位に、イオン結合、疏
水性相互作用あるいは水素結合のような非共有的な相互
作用によって結合する。不可逆的なCSDMは、トロンビン
と共有結合する。

好ましい実施態様では、可逆的にトロンビンに結合して
徐々に開裂されるCSDMは、下記の式を有する： Ｘ−A₁−A₂−A₃−Ｙ ここでＸは水素であるか、あるいは１から35個の原子か
らなる骨格鎖によって特徴付けられる;A₁は、Arg,Lysあ
るいはOrnである;A₂は、非アミド結合である;A₃は、１
から９個の原子からなる骨格鎖にによって特徴付けられ
る：そしてＹは、結合手である。

この実施態様に従う非アミド結合成分は、アミド結合を
化学的に修飾することによって形成され得る。このこと
は、当分野に公知の方法によって達成され得る［M.Szel
keら、“Potent New Inhibitors of Human Renin",Natu
re,299,pp.555−57（1982）;D.H.Coyら、“Facile Soli
d Phase Preparation of Proteins Containing the CH₂
−NH Peptide Bond Isostere and Application to the
Synthesis of Somatostatin（SRIF）Octapeptide Analo
gues",Peptides 1986,D.Theodoropoulos編、Walter DeG
ruyter and Co.,Berlin,pp.143−46（1987）］。非アミ
ド結合がこの様式で形成される場合には、CSDMの他の成
分あるいはトロンビンインヒビター分子の残りの部分へ
この結合を含有するジペプチドを付加する前に化学修飾
を行うのが好ましい。このような様式においては、ジペ
プチドA₁−A₂−A₃は、１つのかたまりとして、１回の合
成工程で分子の残りの部分に付加される。

より好ましい実施態様では、A₁はArgであり、そしてA₃
はPro、Ｄ−ProあるいはSarである。この実施態様で
は、A₂は天然のイミド結合であって、これは徐々にトロ
ンビンによって開裂される。このことは、非アミド結合
の前もって形成する必要性をなくし、A₁およびA₃は、か
たまりとしてではなく順次に分子の残りの部分に付加す
ることを可能にする。

前述のように、本発明のCSDMは、不可逆的にトロンビン
に結合し得る。付加逆的なCSDMの例には、フェニルメチ
ルスルホニルフルオライド（PMSF）、ジイソプロピルフ
ルオロホスフェート（DFP）、トシルプロリルクロロメ
チルケトン（TPCK）およびトシルリシルクロロメチルケ
トン（TLCK）などの一般的なセリンプロテアーゼインヒ
ビター；イソクマリンなどのヘテロサイクリックプロテ
アーゼインヒビター；Ｄ−Phe−Pro−Arg−CHCl₂（PPAC
K）などのトロンビン特異的インヒビター；およびジフ
ルオロケトメチレンなどの遷移状態のアナログが含まれ
る。しかしこれらには限定されない。

本発明の他の実施態様では、開裂され得ない可逆的なCS
DMは、下記の式からなる： Ｘ−C₁−C₂−A₃−Ｙ ここでC₁は、還元カルボキシル基あるいは１から10個の
原子の骨格鎖で特徴付けられる化学構造によって、α−
炭素で置換されるカルボキシル基によって特徴付けられ
るArg、LysあるいはOrnの誘導体;C₂は、開裂され得ない
結合；およびＸ、ＹおよびA₃は前記定義された通りであ
る。C₁の成分の例には、β−ホモアルギニン、Arg［psi
CH₂NH］などの還元カルボキル化部分を含有するアルギ
ニン；β−ホモリシンおよびβ−ホモオルニチンがあ
る。

本発明のトロンビンインヒビターに用いられる他の開裂
され得ない可逆的CSDMは、ベンズアミジン、DAPA、NAPA
Pおよびアルガトロバン（argatroban）（アルギピジン
（argipidine））がある。

CSDM領域がA₂結合あるいはC₂結合によって特徴付けられ
る本発明のトロンビンインヒビターに対する、本明細書
に用いられている用語「P₁−P₁′」の配列は、この結合
によってつながれている２つの化学構造のことである。

CSDMのＸ成分は、触媒部位への実際の結合にはかかわら
ないで、限定されない長さで種々変えられ得る。しか
し、実用的目的および合成の費用を減少させるために
は、Ｘは、１から35個の原子の骨格鎖で、計算上の長さ
が36オングストロームを越えないのが好ましい。好まし
くは、Ｘはペプチドであり、最も好ましくは、Ｄ−Phe
−Proである。この最も好ましい実施態様では、Ｘ成分
は、トロンビンの活性部位に隣接する溝にはまり得る
［S.Bajuszら、“Inhibition of Thrombin and Trypsin
by Tripeptide Aldehydes",Int.J.Peptide Protein Re
s.,12,pp.217−21（1978）;C.Kettnerら、“Ｄ−Phe−P
ro−Arg−CH2Cl−A Selective Affinity Label for Thr
ombin",Thromb.Res.,14,pp.969−73（1979）］。これに
より、CDSM成分、従って本発明の分子は、有利に高度の
親和性および最適な特異性でトロンビンに結合できる。

本発明による、本発明のトロンビンインヒビターの第二
の成分は、リンカー領域である。分子のこの部分の役割
は、CSDMとABEAMとの間の架橋を提供することなので、
構造よりもリンカーの長さが最も重要である。リンカー
の特徴付ける骨格鎖の計算上の長さは、トロンビンの触
媒部位とアニオン結合外部部位との間の距離であり、少
なくとも約18オングストロームでなければならず、約42
オングストロームを越えてはならない。

リンカーの骨格鎖は、少なくとも２つの他の原子に結合
し得る任意の原子を含有し得る。好ましくは、骨格鎖
は、酸素、炭素、窒素およびイオウから選択される原子
の化学的に可能な組合せからなる。当業者には、既知の
種々の結合の距離に基づいて、前記骨格鎖の原子のどの
ような組合せが必要な長さになるのか明かである［例え
ば、R.T.MorrisonおよびR.N.Boyd,Organic Chemistry,3
rd Edition,Allyn and Bacon,Inc.,Boston,Massachuset
ts（1977）を参照のこと］。好ましい実施態様では、リ
ンカーは、アミノ酸配列Gly−Gly−Gly−Asn−Gly−Asp
−Pheを有するペプチドである。好ましくは、ABEAM成分
に結合するアミノ酸はPheである。

本発明のトロンビンインヒビターの第三のドメインは、
トロンビンのアニオン結合外部部位に結合するABEAM成
分である。好ましくはABEAMは、下記の式を有する： Ｗ−B₁−B₂−B₃−B₄−B₅−B₆−B₇−B₈−Ｚ ここでＷは、結合手であり;B₁は、アニオン性アミノ酸
であり;B₂は、任意のアミノ酸であり;B₃は、Ile、Val、
Leu、NleあるいはPheであり;B₄は、Pro、Hyp、3,4−デ
ヒドロPro、チアゾリジン−４−カルボン酸、Sar、任意
のＮ−メチルアミノ酸あるいはＤ−Alaであり;B₅は、ア
ニオン性アミノ酸であり;B₆は、アニオン性アミノ酸で
あり;B₇は、Tyr、Trp、Phe、Leu、Nle、Ile、Val、Ch
a、Proでなる群から選択される脂質親和性アミノ酸、あ
るいはこれらの脂質親和性アミノ酸の１つと任意のアミ
ノ酸とからなるジペプチドであり;B₈は、結合手である
いは任意のアミノ酸の１から５残基を有するペプチドで
あり；およびＺは、OH、C₁−C₆アルコキシ、アミノ、モ
ノあるいはジ−（C₁−C₄）アルキル置換アミノあるいは
ベンジルアミノから選択されるカルボキシ末端残基であ
る。

ヒルジンのカルボキシ末端に相同であるペプチドは、ト
ロンビンのアニオン結合外部部位に結合することが報告
されている［係属中の同期出願である米国特許出願第31
4,756号およびJ.M.Maraganoreら、“Anticoagulant Act
ivity of Synthetic Hirudin Peptides",J.Biol.Chem.,
264,pp.8692−98（1989）；両者とも本明細書に参考と
して援用されている］。

本発明の好ましい実施態様では、ABEAMは、ヒルジンの5
6−64位のアミノ酸に相同である。すなわち、B₁はGluで
あり;B₂はGluであり;B₃はIleであり;B₄はProであり;B₅
はGluであり;B₆はGluであり;B₇はTyr−Leu、Tyr（SO
₃H）−LeuあるいはTyr（OSO₃H）−Leu、あるいは（３
−,5−ジヨードTyr）−Leuであり;B₈は結合手であり；
そしてＺはOHである。天然のヒルジンが63位にTyr（OSO
₃H）を有することは注目されるべきである。しかし、Ty
r（SO₃H）を有するカルボキシ末端のヒルジンペプチド
は、天然のTyr（OSO₃H）を有するものと同じ抗凝固活性
を有する［係属中の同時出願である米国特許出願第314,
756号を参照のこと］。

本発明の範囲内の他のABEAM成分は、トロンビンのアニ
オン結合部位に結合することが知られている任意の分子
の一部を含み得る。これらには、第Ｖ因子の1675−1686
位のアミノ酸、血小板糖タンパク質Ibの272−285位のア
ミノ酸、トロンボモジュリン（thrombomodulin）の415
−428位のアミノ酸、プロトロンビンの第二フラグメン
トの245−259位のアミノ酸、およびフィブリノーゲンＡ
α鎖の30から44位のアミノ酸が含まれる。さらに、ABEA
M成分は、J.L.Krstenanskyら、“Development of MDL−
28,050,A Small Stable Antithrombin Agent Based On
A Functional Domain of the Leech Protein,Hirudin",
Thromb.Haemostas.,63,pp.208−14（1990）に記載され
ているヒルジンペプチドの任意のアナログから選択され
得る。

本発明の好ましいトロンビンインヒビターは、ヒルログ
（Hirulog）と呼ばれ、次の実施例に記載されている。
最も好ましいヒルログは、ヒルログ−８、ヒルログ−1
2、ヒルログ−18a、ヒルログ−18bおよびヒルログ−33
である。ヒルログ−８、−12および−33は、可逆的なト
ロンビンインヒビターであって、徐々に開裂される。ヒ
ルログ−18aおよび−18bは、開裂されない可逆的なイン
ヒビターである。

本発明のトロンビンインヒビターは、当分野には公知の
種々の方法によって合成され得る。これらには、天然あ
るいは組換えヒルジンの酵素的開裂、組換えDNA法、固
相ペプチド合成、液相ペプチド合成、有機化学合成法、
あるいはこれらの方法の組合せが含まれる。合成法の選
択は、もちろん特定のインヒビターの組成に依存する。
本発明の好ましい実施態様では、トロンビンインヒビタ
ーは完全にペプチド性であって、固相ペプチド合成法、
液相ペプチド合成法、あるいはこれらの分子を商業的な
量で生産するためにコスト的に最も効率的な方法になる
これらの組合せによって合成される。

「非タンパク質」アミノ酸がトロンビンインヒビター分
子に含まれる場合には、所望の「非タンパク質」アミノ
酸の性質によってペプチド合成の間に作られる鎖に直接
に付加されるか、あるいは完全に合成されたペプチドに
化学修飾して調製され得る。化学合成分野の当業者に
は、「非タンパク質」アミノ酸が直接付加され得るこ
と、およびペプチド合成後に完全なペプチド鎖を化学修
飾して合成され得ることは明かである。

非アミノ酸およびペプチド性部分を含有する本発明のそ
れらのトロンビンインヒビターの合成は、好ましくは、
異種混合／固相合成法によって達成される。この方法に
は、分子のペプチド部分の全てあるいはほとんどを固相
合成し、その後、液相合成法によって合成された非アミ
ノ酸成分を付加する方法が含まれる。非アミノ酸は、固
相あるいは液相法によってペプチド性部分にカップリン
グされ得る。同様に、いかなる残りのペプチド性部分も
また固相あるいは液相法によって付加され得る。

本発明の分子は、強力な抗凝固活性を示す。この活性
は、従来の方法を用いてインビトロでアッセイされ得
る。好ましくは、抗凝固活性のアッセイには、分子のト
ロンビン阻害活性の直接測定が含まれる。このような方
法は、トロンビン触媒によるの比色用基質の開裂の阻害
の測定、あるいは、さらに好ましくは、ヒト血漿中のト
ロンビンタイムの増加あるいは活性化部分的トロンビン
プラスチンタイムの増加を測定する。後者のアッセイで
は、「内因性」の凝固経路におけるファクターが測定さ
れる。あるいは、使用されるアッセイでは、ラジオイム
アッセイあるいはELISAによってフィブリノペプチドＡ
あるいはＢの放出の阻害を測定するために、精製トロン
ビンおよびフィブリノーゲンが用いられ得る。

本発明の分子の抗血小板活性はまた、多くの従来からの
いずれの血小板アッセイによっても測定され得る。好ま
しくは、アッセイは、血小板の凝集の程度の変化、ある
いはトロンビン存在下での血小板分泌成分の放出の変化
を測定する。前者は、aggregometerで測定され得る。後
者は、分泌される成分は特異的なRIAあるいはELISA法を
用いて測定され得る。

本発明の分子は、トロンビン触媒性およびトロンビン関
連の機能および経路に起因する種々の疾患の治療および
予防のための、組成物、組合せおよび方法に有用であ
る。これらには、心筋梗塞、脳卒中、肺動脈梗塞症、深
部静脈血栓症、末梢動脈閉塞、動脈損傷あるいは心臓へ
の挿入手順後の再狭窄、急性または慢性のアテローム性
動脈硬化症、浮腫、および炎症、種々の細胞調節過程
（例えば、分泌、形状の変化、増殖）、癌腫および転
移、および神経変性性の疾患が含まれる。

本発明のトロンビンインヒビターは、薬学的に受容可能
なキャリアーの添加などの、薬学的に有用な組成物を調
製するための従来法を用いて処方され得る。それらを用
いるこれらの組成物および方法は、患者の血栓性疾患を
処置あるいは予防するために用いられ得る。

本発明の他の実施態様では、トロンビンインヒビター
は、患者の、血栓性疾患を処置するため、および再潅流
の確立あるいは再閉塞の予防に必要とされる血栓溶解剤
投与量を減少させるための、組合せ、組成物および方法
に用いられ得る。さらに、本発明のトロンビンインヒビ
ターは、血栓溶解剤で処置されている患者の再潅流する
までの時間の減少あるいは再閉塞するまでの時間の増加
のための組合せ、組成物および方法に使用され得る。こ
れらの組合せおよび組成物は、本発明のトロンビンイン
ヒビターの薬学的に有効な量、および血栓溶解剤の薬学
的に有効な量を含有し得る。

このような組合せおよび組成物においては、トロンビン
インヒビターおよび血栓溶解剤は、相補的に作用して血
液クロットで溶解し、その結果、それで処置されている
患者の再潅流するまでの時間の減少および再閉塞するま
での時間の増加を図る。特に、血栓溶解剤は、クロット
を溶解する一方、トロンビンインヒビターは、新たに曝
され、クロットに捕らえられるトロンビン、あるいはク
ロットに結合したトロンビンが、クロットを再発生させ
ることを防ぐ。本発明の組合せおよび組成物中のトロン
ビンの使用は、以前には、少なすぎてそれのみでは血栓
溶解効果が得られないと考えられてた投与量での血栓溶
解剤の投与が有利に可能である。このことは、出血合併
症のような、血栓溶解剤の使用に伴う望ましくない副作
用のいくらかは避ける。

本発明の組合せおよび組成物に用いられ得る血栓溶解剤
は、当分野では公知である。このような薬剤には、天然
原料から精製された組織プラスミノーゲン活性化因子、
組換え組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキ
ナーゼ、ウロキナーゼ、プロウロキナーゲ、単離されて
いないストレプトキナーゼプラスミノーゲン活性化因子
複合体（ASPAC）、動物の唾液腺プラスミノーゲン活性
化因子、および公知である前述の任意の生物学的に活性
な誘導体が含まれる。しかしこれらには限定されない。

本明細書に用いられている用語「組み合わせ」には、少
なくとも１種の本発明のトロンビンインヒビターと、少
なくとも１種の血栓溶解剤とを含有する単回投与形式；
トロンビンインヒビターと血栓溶解剤とを同時ではな
く、別々に投与する複数回投与形式；あるいは２種の成
分を連続して別々に投与する複数回投与が含まれる。連
続投与では、トロンビンインヒビターは、血栓溶解剤の
投与の約５時間前から約５時間後のあいだの期間に患者
に投与され得る。好ましくは、トロンビンインヒビター
は、血栓溶解剤の投与の２時間前から２時間後の間に患
者に投与される。

あるいは、トロンビンインヒビターおよび血栓溶解剤
は、単一の形態、すなわち結合分子の形態であり得る。
２つの成分の結合は、当分野では公知の標準的な架橋結
合法によって達成され得る。さらに単一分子は、トロン
ビンインヒビターと血栓溶解剤との両方がペプチドであ
るときには、組換え融合タンパク質の形態を取り得る。

種々の投与形式が、本発明の組成物および組み合わせを
投与するために用いられ得る。これらには、非経口投
与、経口投与および局所施用が含まれるが、しかしこれ
らには限定されない。本発明の組成物および組み合わせ
は、患者に薬害的に受容可能な任意の投与形式で投与さ
れ得る：これには、静脈内へのボーラス単回投与あるい
は持続投与；脊椎旁および関節周囲の筋肉内、皮下、皮
内、関節内、滑液嚢内、包膜内、病巣内、骨膜；あるい
は経口、経鼻、または局所経路によって投与され得る。
このような組成物および組み合わせは、好ましくは、局
所、経鼻、経口および非経口投与に適応されるが、最も
好ましくは、非経口投与用に処方される。

非経口用の組成物は、最も好ましくはボーラス単回投与
あるいは持続注入のいずれかで、静脈内に投与される。
トロンビンインヒビターが抗血小板化合物として用いら
れる時には、持続注入が好ましい。トロンビンインヒビ
ターが抗凝固剤として用いられるときには、皮下、ある
いは静脈内ボーラス注射が好ましい。非経口投与用に
は、本発明のトロンビンインヒビターと無菌のビヒクル
とを含有する、液状の単位投与形態に調製される。トロ
ンビンインヒビターは、ビヒクルの性質および特定のト
ロンビンインヒビターの性質によって、懸濁あるいは溶
解され得る。非経口用の組成物は、トロンビンインヒビ
ターを、必要に応じて他の成分とともにビヒクルに溶解
し、そして適当なバイアルあるいはアンプルに詰める前
に濾過滅菌してシールして、通常は調製される。好まし
くは、局所麻酔剤のようなアジュバント、防腐剤および
緩衝剤もまたビヒクル中に溶解される。次に、組成物は
安定性を増すために凍結乾燥され得る。

非経口用の懸濁液は、活性成分がビヒクルに溶解される
のではなく懸濁されること以外は、実質的には同じ様式
で調製される。組成物の滅菌は、好ましくは無菌のビヒ
クルに懸濁され前に、エチレンオキサイドに曝すことに
よってなされる。さらに、表面活性剤あるいは湿潤剤
が、成分成分が均質に分散されるのを促進するために組
成物中に含有される。

経口投与用の錠剤およびカプセルには、結合剤、充填
剤、希釈剤、錠剤形成剤、潤滑剤、錠剤分解剤および湿
潤剤などの従来の賦形剤が含まれ得る。錠剤は、当分野
では公知の方法によって被覆され得る。使用され得る適
切な充填剤には、セルロース、マンニトール、ラクトー
スおよび他の類似の物質が含まれる。適切な錠剤分割剤
には、デンプン、ポリビニルピロリドン、およびソディ
ウムスターチグリコレートのようなデンプンの誘導体が
含まれるが、これらには限定されない。適切な潤滑剤に
は、例えばステアリン酸マグネシウムが含まれる。適切
な潤滑剤には、ラウリル硫酸ナトリウムが含まれる。

経口用液体の調製物は、水溶液、あるいは油状懸濁液、
溶液、乳濁液、シロップあるいはエリキシール（elixi
r）の形態、または使用の前に水あるいは他の適切なビ
ヒクルで再生できる乾燥産物であり得る。このような液
体調製物は、従来の添加物を含有し得る。これらには、
ソルビトール、シロップ、メチルセルロース、ゼラチ
ン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセ
ルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル、あるいは水
素添加食用油脂などの懸濁剤；レシチン、ソルビタンモ
ノオレイン酸、ポリエチレングリコール、あるいはアラ
ビアゴムなどの乳化剤；アーモンドオイル、分留ココナ
ッツオイル、および油状エステルなどの非水性ビヒク
ル；メチルあるいはプロピルｐ−ヒドロキシベンゾエー
トあるいはソルビン酸などの防腐剤が含まれる。

局所投与用に処方される組成物は、例えば、水溶性ゼリ
ー、油状懸濁液あるいは乳液状の軟膏の形態に処方され
得る。

トロンビンインヒビターの投与量および投与の割合は、
患者の大きさ、使用される特定の薬学的組成物、処置の
目的、即ち治療あるいは予防、処置されるべき血栓性疾
患の性質、および処置を行う医者の判断などの種々の因
子に依存する。

本発明による、本発明のトロンビンインヒビターの好ま
しい薬学的に有効な一日当りの投与量は、約１μg/kg処
置される患者の体重（「体重」）と、約5mg/kg体重との
間である。血栓溶解剤を含有する組合せでは、血栓溶解
剤の薬学的に有効な一日当りの投与量は、従来の投与量
範囲の約10％から80％の間である。血栓溶解剤の「従来
の投与量範囲」は、その薬剤が単独で使用されるのに用
いられる一日当りの投与量である。［Physician's Desk
Reference 1989,43rd Edition,Edward R.Barnhart,pub
lisher］。その従来の投与量範囲は、もちろん、用いら
れる血栓溶解剤に依存して変化する。従来の投与量範囲
の例を下記に示す：ウロキナーゼ−500,000から6,250,0
00ユニット／患者；ストレプトキナーゼ−140,000から
2,500,000ユニット／患者;tPA−0.5から5.0mg/kg体重;A
SPAC−0.1から10ユニット/kg体重。

最も好ましくは、本発明の治療およい予防用の組成物
は、トロンビンインヒビターの約10μg/kg体重と約500
μg/kg体重との間の投与量を含有する。最も好ましい組
み合わせは、トロンビンインヒビターの同じ量と、従来
の投与量範囲の約10％から約70％の間の血栓溶解剤とを
含有する。さらに、本発明のトロンビンインヒビターあ
るいは本発明の組み合わせ中に存在する血栓溶解剤のい
ずれかの一日当りの薬学的に有効な投与量は、前述の特
定の範囲よりも少ない量あるいは多い量であり得ること
は理解される。

患者の状態が一旦改善されると、必要であれば、本発明
の組み合わせあるいは組成物の、維持のための投与量が
投与される。次に、投与量あるいは投与頻度、あるいは
その両方は、症状の相関的要素として、改善された症状
が維持されるレベルに減量され得る。症状が所望のレベ
ルにまで軽減されると、処置は終了されるべきである。
しかし、患者には、疾患症状の再発に対しては断続的な
処置が必要とされ得る。

本発明の他の実施態様では、トロンビンインヒビター
は、挿入装置の表面を被覆するための組成物および方法
に用いられ得て、そのことによってこのような装置を挿
入した患者でのクロット形成あるいは血小板活性化の危
険性を低くする。本発明の組成物で被覆され得る表面に
は、例えば、人工装具、人工バルブ、血管移植片、ステ
ントおよびカテーテルが含まれる。これらの装置を被覆
するための方法および組成物は、当業者には公知であ
る。これらには、トロンビンインヒビター含有組成物の
装置表面への化学的架橋結合あるいは物理的吸着が含ま
れる。

さらに他の本発明の実施態様では、トロンビンインヒビ
ターは、患者におけるエキソビボでの血栓画像化に用い
られ得る。この実施態様では、トロンビンインヒビター
は、ラジオアイソトープで標識されている。ラジオアイ
ソトープの選択は、例えば、毒性、生物学的半減期およ
び検出能のような多くの既知の因子に基づいている。好
ましいラジオアイソトープには、¹²⁵I、¹²³Iおよび¹¹¹I
nが含まれるが、しかしこれらには限定されない。トロ
ンビンインヒビターを標識する方法は、当分野では公知
である。最も好ましくは、ラジオアイソトープは、¹²³I
であって、標識は¹²³I−Bolton−Hunter Reagentを用い
て行われる。標識されたトロンビンインヒビターは、患
者に投与され、そしてクロット中のトロンビンに結合さ
れる。次にそのクロットは、コンピューターイメージン
グシステムを組み合わせた放射活性を検出し得るカメラ
などの既知の検出方法を用いて観察される。さらに、こ
の方法により血小板−結合トロンビンおよびメイゾトロ
ンビン（meizothrombin）の画像を得る。

さらに、本発明は、本発明のトロンビンインヒビター含
有の組成物およびそのような組成物を腫瘍の転移の処置
に用いる方法に関する。本発明のトロンビンインヒビタ
ーの腫瘍の転移の処理に対する効力は、転移成長の阻害
によって明かにされる。このことは、ある種の癌細胞に
は凝固促進酵素が存在することに基づいている。この酵
素は、凝固カスケードにおける第Ｘ因子の第Xa因子への
転移を活性化し、その結果フィビリンの沈着がおこり、
次に腫瘍の成長のための基質とされる。トロンビン阻害
によってフィブリンの沈着を阻害することによって、本
発明の分子は、有効な抗転移腫瘍剤とされる。本発明の
トロンビンインヒビターによって処置され得る転移腫瘍
の例には、脳腫瘍、肝臓癌、肺癌、骨癌および腫瘍性プ
ラズマ細胞癌が含まれるが、これらには限定されない。

さらに、本発明は、前述のトロンビンインヒビターを用
いてトロンビンに誘導される内皮細胞活性化を阻害する
方法および組成物に関する。この阻害には、内皮細胞に
よる血小板活性因子（PAF）の合成の抑制が含まれる。
これらの組成物および方法には、PAFに媒介されると考
えられている、トロンビン誘導による炎症および浮腫に
特徴がある疾患の処置という重要な適応がある。これら
の疾患には、成人呼吸困難症、敗血症性ショック、敗血
症および再潅流の損傷が含まれるが、これらには限定さ
れない。

敗血症性ショックの初期段階には、散在性の急性炎症反
応および凝固異常反応が含まれる。E.coli生菌の致死量
をヒヒに注射することによって、好中球の計数、血圧お
よびヘマトクリット値の著しい減少が起こることが、以
前に示された。血圧およびヘマトクリット値の変化は、
ある程度の播種性血管内凝固（DIC）の発生によるもの
で、それに平行するフィブリノーゲンの消耗が示された
［F.B.Taylorら、“Protein C Prevents the Coagulopa
thic and Lethal Effects of Escherichia coli infusi
on in the Baboon",J.Clin.Invest.,79,pp.918−25（19
87）］。好中球減少は、腫瘍壊死因子レベルの著しい増
加に至る、敗血症性ショックによる重篤な炎症反応によ
る。本発明のトロンビンインヒビターは、敗血症および
他の疾患でのDICを処置あるいは予防するための組成物
および方法に用いられ得る。

さらに、本発明は、前述のトロンビンインヒビターある
いはそれらを含有する組成物を、体外血液の抗凝固剤と
して使用することに関する。本明細書に用いられている
ように、用語「体外血液」には、患者から採血され、体
外処置がほどこされ、そして透析、血液濾過あるいは手
術中の血液バイパスなどの方法によって患者にもどされ
る血液が含まれる。さらにこの用語には、体外で保存さ
れ、最終的には患者に投与される血液製剤、および患者
から採血された種々のアッセイに用いられる血液が含ま
れる。このような製剤には、全血、血漿、あるいは凝固
阻害が望まれる任意の血液画分が含まれる。

このようなタイプの組成物中のトロンビンインヒビター
の量あるいは濃度は、処置される血液の容積、あるい
は、より好ましくは、トロンビン含有量に基づく。好ま
しくは、体外血液の凝固を阻害するための、本発明のト
ロンビンインヒビターの有効量は、約１μg/体外血液60
mlから約5mg/体外血液60mlである。

本発明のトロンビンインヒビターは、さらにクロットの
付着成長に寄与すると考えられているクロット結合トロ
ンビンの阻害に用いられ得る。このことは、ヘパリンお
よび低分子量ヘパリンのような通常用いられている抗ト
ロンビン剤が、クロット結合トロンビンには効果がない
ので特に重要である。

最後に、本発明のトロンビンインヒビターは、神経変性
性疾患を処置するための組成物および方法に用いられ得
る。トロンビンは、脳細胞の形状の変化での考えられる
プロセスである。神経突起退縮を起こすことが知られて
おり、アルツハイマー症およびパーキンソン病などの神
経変性性疾患に関与することが示唆されている。

ここに開示されている本発明をさらに理解するために下
記に実施例を示す。これらの実施例は、例示することの
みを目的とし、いかなる方法においても本発明を限定す
るようには説明していないことは理解されるべきであ
る。

実施例１ スルホ−Tyr₆₃ヒルジン_54-64の合成 スルホ−Tyr₆₃ヒルジン_54-64はアミノ酸:H−Gly−Asp−
Phe−Glu−Glu−Ile−Pro−Glu−Gly−Tyr（OSO₃）−Le
u−OHの構造式を有する。このペプチドはアプライドバ
イオシステムズ430Aペプチド合成機（Applied Biosyste
ms,Foster City,CA）を用いて固相ペプチド合成法を用
いて合成した。

詳しく述べると、0.259meqのBOC−Ｏ−Leu樹脂（１％DV
B樹脂）を連続的に2mmolの保護したアミノ酸と反応させ
た。10サイクルの反応の後、ペプチドの保護基を脱離
し、無水HF:p−クレゾール：エチルメチル硫酸（10:1:
1、v/v/v）で処理してDVB樹脂から外した。ペプチド
は、さらに、0.1％TFA水溶液で予め平衡化したビダック
（Vydac）C₁₈HPLC逆相カラム（22mmx25cm）を用いて精
製した。ペプチドをカラムにかける前に、ペプチドを2.
0mlの0.1％TFA水溶液に溶解した。必要に応じて、1mlの
6Mグアニジン塩酸を追加し、サンプルの溶解性を増加さ
せた。サンプルをかけた後、4.0ml/分の速度で、0.1％T
FA中のアセトニトリルを45分間で直線的に増加（０−80
％）させる濃度勾配にかけてカラムを展開した。流出液
は229nmでモニターし、画分は手動で集めた。

生じた精製ペプチドの１箇所のチロシン残基を通常の方
法で硫酸エステル化した。［T.Nakaharaら、“Preparat
ion of Tyrosine−Ｏ−［³⁵S］Sulfated Cholecystokin
in Octapeptide From A Non−Sulfated Precursor pept
ide",Anal.Biochem.,154,pp.194−99（1986）］。スル
ホ−Tyr₆₃ヒルジン_54-64は次に、ビダックC₁₈カラム
（4.6x25cm）およびアプライドバイオシステムの液体ク
ロマトグラフィーを用いる逆相HPLCで、他のペプチドお
よび反応組成物から精製した。カラムは0.1％TFA/水溶
媒で平衡化し、0.8ml/分の速度で、0.085％TFAを含有す
る溶媒中のアセトニトリルを90分間で直線的に０から35
％に増加させる濃度勾配にかけて、カラムを展開した。
画分は214nmの吸収でアッセイした。

実施例２ ヒトトロンビンとスルホ−Tyr₆₃−ジニトロフルオロベ
ンジル−ヒルジン_54-64との架橋 スルホ−Tyr₆₃ヒルジン_54-64（2.0mg、実施例１で調
製）と化学量論的に同量のジフルオロジニトロベンゼン
（Pierce Chemical Co.,Rockford,IL）とをジメチルホ
ルムアミド（DMF）中で18時間室温で反応させて、スル
ホ−Tyr₆₃−ジニトロフルオロベンジル−ヒルジン_54-64
（スルホ−Tyr₆₃−DNFB−ヒルジン_54-64）を調製した。
次に、サンプルを、アプライドバイオシステムの150A液
体クロマトグラフィーシステム用いる分析用HPLC分離に
かけ、ついでブラウンリー（Brownlee）RP−300 C₈カラ
ム（0.46x10cm）を用いて、誘導化の程度を測定した。
カラムは0.1％TFA水溶液（溶媒Ａ）で平衡化し、0.058
％TFA/70％アセトニトリル（溶媒Ｂ）を用いて、45分間
で直線的に０−50％に増加させ、ついで15分間の50−10
0％の直線濃度勾配にかけて、カラムを展開した。1.0ml
/分の一定流量を用いた。

流出液は214nmおよび310nmの吸収でモニターした。ジフ
ルオロジニトロベンゼン試薬で誘導体としたペプチドは
310nmに吸光を有する。上記の反応で、スルホ−Tyr₆₃−
DNFB−ヒルジン_54-64が15−30％の収率で生産されてい
た。合成の後、スルホ−Tyr₆₃−DNFB−ヒルジン_54-64は
同じジメチルホルムアミド中、−20℃で最高１月保存し
た。

10倍モル過剰のスルホ−Tyr₆₃−DNFB−ヒルジン
_54-64を、ヒトα−トロンビン（12.5mg）とリン酸緩衝
化した生理食塩水中で、室温で18時間反応させた。架橋
の程度を、反応混合をSDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動分析で測定した。SDS−PAGEでα−トロンビンバ
ンドの相対的な泳動度が減少し、分子量が1000−2000ダ
ルトン（Da）増加していることを反映していた。このシ
フトは、トロンビンとスルホ−Tyr₆₃−DNFB−ヒルジン
_54-64とが１ケ所で架橋していることと一致する。

スルホ−Tyr₆₃−DNFB−ヒルジン_54-64とヒトトロンビン
との間の共有複合体の形成は、［³⁵S］−スルホ−Tyr₆₃
−DNFB−ヒルジン_54-64を用いて、特異的であることを
確認した。［³⁵S］−スルホ−Tyr₆₃−DNFB−ヒルジン
_54-64は、本質的には上述の方法で、H₂［³⁵S］O₄をH₂SO
₄の代わりに用いて、Nakaharaらの硫酸エステル化法に
よって調製した［係属中の同時出願である米国特許出願
番号164,178、251,150、280、618および314、756、およ
びJ.M.Maraganoreら、“Anticoagulant Activity of Sy
nthetic Hirudin Peptides",J.Biol.Chem.,264,pp.8692
−98（1989）を参照。これらすべては本発明に引例とし
て取り込まれる］。

［³⁵S］−スルホ−Tyr₆₃−DNFB−ヒルジン_54-64とヒト
α−トロンビンとは、（トロンビン濃度に対して）５倍
あるいは20倍のモル過剰率のスルホ−Tyr₆₃−Ｎ−アセ
チル−ヒルジン_53-64（実施例１のペプチド合成の最終
段階で、Ｎ−アセチルアスパラギンを加えて調製し
た。）の存在下で、あるいは非存在下で反応させた。室
温で18時間インキュベートした後、混合物をSDS−PAGE
とオートラジオグラフィーとにかけた。結果（図１）
は、［³⁵S］−ラベルしたペプチドがトロンビンを表す
バンドに取り込まれていることを示し、コールドのラベ
ルされていないヒルジンペプチドの存在は共有複合体形
成の程度が10％以下に減少していることを示した。この
ように、スルホ−Tyr₆₃−DNFB−ヒルジン_54-64とトロン
ビンとの反応は、ヒルジンペプチドと特異的な結合部位
で、1:1の化学量論的な結合をもたらす。

スルホ−Tyr₆₃−DNFB−ヒルジン_54-64がトロンビンと結
合する部位を同定するため、トロンビン／スルホ−Tyr
₆₃−ジニトロベンジル（DNB）−ヒルジン_54-64複合体
（1.0mg）をセファデックスＧ−50カラム（1.5x45cm）
にかけた。カラムは7M尿素、20mMトリス、pH7.5で平衡
化し、展開した。このクロマトグラフィーで未反応のス
ルホ−Tyr₆₃−DNFB−ヒルジン_54-64を除いた。トロンビ
ン／スルホ−Tyr₆₃−DNB−ヒルジン_54-64はボイドボリ
ューム画分で単離され、プールして10μｌのβ−メルカ
プトエタノールを添加して還元した。

還元跡、その複合体をヨード酢酸を用いて、Ｓ−カルボ
キシメチル化した。その方法は既述した［J.M.Maragano
reら“A New Class of Phospholipases A₂ with Lysine
in Place of Aspartate−49",J.Biol,Chem.,259,pp.13
839−43（1984）］。還元したＳ−アルキル化タンパク
質は、次に、大量の３％酢酸に対して室温で透析した。
透析に続いて、複合体をペプシン（２％W/V）で、37
℃、４時間消化した。還元したＳ−カルボキシメチル化
したトロンビン／スルホ−Tyr₆₃−DNB−ヒルジン_54-64
の加水分解フラグメントは、アクアポアーRP−300 C₈カ
ラム（0.46x10cm）を用いる逆相HPLC分離を行い、精製
した。カラムは0.1％水溶液で平衡化し、0.085％TFA/70
％アセトニトリル（０−60％）を用いて、1.0ml/分の流
速で、80分間の直線的に増加させる濃度勾配にかけて展
開した。流出液は214nmおよび310nmの両方の吸収で測定
した。1.0mlの画分を自動的に集めた。加水分解フラグ
メントのHPLC分離で、214nmおよび310nmの両方に単一の
大きなピークを有する物質が分離された。遠紫外線吸収
から、このフラグメントは結合したスルホ−Tyr₆₃−DNF
B−ヒルジン_54-64を有していた。

次に、このフラグメントを、900Aデータシステムを備え
たアプライドバイオシステズ470Aの気相配列決定装置
で、自動化エドマン分解にかけた。フェニルチオヒダン
トイン（PTH）アミノ酸は、アプライドバイオシステム
ズ120A PTH分析機およびPTH−C₁₈カラム（2.1x220mm）
を用いて、オンラインで分析した。以下に示したのは、
配列分析からの反復的な収率の表である。サイクル アミノ酸 ピコモル 1 Lys 858.5 2 Glu 629.2 3 Thr 357.6 4 Trp 276.3 5 Thr 289.0 6 Ala 474.4 7 Asn 369.0 8 Val 490.7 9 Gly 296.1 10 （Ｘ） （−） 11 Gly 267.2 12 Gln 208.8 13 Pro 103.5 14 Ser 21.6 15 Val 23.3 ペプチドの配列は、ヒトα−トロンビンの144−154残基
に一致した［J.W.Fenton,II.,“Thrombin Active Site
Regions",Semin.Thromb.Hemostasis,12,pp.200−08（19
86）］。ペプチドの開裂はロイシン−リシン結合および
バリン−ロイシン結合で起こり、この酵素の特異性と一
致した。

配列解析中に、リシン−149（サイクル10）に対応する
アミノ酸は同定されず、定量にもされなかった。これ
は、恐らく、このアミノ酸のε−NH₂基が、スルホ−Tyr
₆₃−DNFB−ヒルジン_54-64のジニトロフルオロベンジル
部位で誘導体化されていることによる。このように、リ
シン−149は、スルホ−Tyr₆₃−DNFB−ヒルジン_54-64が
α−トロンビンと反応する主な部位である。

実施例３ 触媒部位をブロックすることおよび外側のアニオン結合
部位に結合することが可能なトロンビンインヒビターの
設計 ヒルジンペプチドのカルボキシ末端は、効果的にトロン
ビンが触媒するフィブリノーゲン加水分解をブロックす
るが、発色基質の加水分解はブロックしない［J.M.Mara
ganoreら、J.Biol.Chem.,264,pp.8692−98（1989）］。
さらに、ヒルジンペプチドは、トロンビンが触媒する第
Ｖ因子および第VIII因子の活性化を中和しない［J.W.Fe
nton,II,ら、“Hirudin Inhibition by Thrombin",Angi
o.Archiv.Biol.,18,p.27（1989）］。

ヒルジンペプチド、例えば、スルホ−Tyr₆₃−Ｎ−アセ
チル−ヒルジン_53-64は、インビトロでトロンビン誘発
の血小板活性化に対して、潜在的な阻害活性を表す［J.
A.JakubowskyおよびJ.M.Maraganore,“Inhibition of T
hrombin−Induced Platelet Activities By A Syntheti
c 12 Amino Acid Residue Sulfated Peptide（Hiruge
n）",Blood,p.1213（1989）］。それにもかかわらず、
活性部位をブロックできるトロンビンインヒビターは、
仮に、第Ｖ因子および第VIII因子の活性化が律速段階で
あれば、インビボでの血小板血栓症の阻害に要求され得
る。この結論は、不可逆的なトロンビンインヒビター
（Ｄ−Phe）−Pro−Arg−CH₂Clで得られた結果［S.R.Ha
nsonおよびL.A.Harker,“Interruption of Acute Plate
let−Dependent Thrombosis by the Synthetic Antithr
ombin Ｄ−Phenylalanyl−Ｌ−Prolyl−Ｌ−Arginyl−C
hlormethyl Ketone",Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,pp.31
84−88（1988）］および他の可逆的なトロンビンインヒ
ビター［J.F.Eidtら、“Thrombin is an Important Med
iator of Platelet Aggregation in Stenosed Canine C
oronary Arteries with Endothelial Injury",J.Clin.I
nvest.,84,pp.18−27（1989）］の結果から、証明され
る。

ヒルジンペプチドのNH₂末端はリジン−149に近いという
上記知見を使用して、トロンビンの３次元モデル（図
２）を使用して［B.Furieら、“Computer−Generated M
odels of Blood Coagulation factor Xa,Factor IXa,an
d Thrombin Based Up on Stuctural Homology with Oth
er Serine Proteases",J.Biol.Chem.,257,pp,3875−82
（1982）］、１）トロンビンの外側のアニオン結合部位
に結合し、および２）トロンビンの活性部位ポケットを
ブロックでき、その中に含まれる触媒残基の機能を阻害
できる。薬剤を設計した。

リシン−149のε−NH₂基からセリン−195のβ−ヒドロ
キシルまでの最小の距離は18−20オングストロームであ
ることを決定した。３オングストローム／アミノ酸残基
長に基づいて、少なくとも約４−７アミノ酸が、ヒルジ
ンペプチド、たとえば、スルホ−Tyr₆₃ヒルジン_53-64と
活性部位阻害構造を包含するドメインとを結合するのに
必要であると計算した。リンカーの組成はグリシンであ
るように設計した。グリシンは、これらの予備的な研究
から、最も柔軟性があるリンカーを設計するために選択
された。しかし、他の、もっと硬いバイオポリマーのリ
ンカーもまた使用され得ることも理解される。

（Ｄ−Phe）−Pro−Arg−Pro配列を、活性部位インヒビ
ターとして選択した。これはトロンビンが、基質の開裂
において、P₁アミノ酸としてアルギニンに特異性を有す
るからである。アルギニンに続くプロリンは、トロンビ
ンによって非常に緩慢に開裂される。プロリン（P₁アル
ギニンの後）をサルコシル−アラニンアミノ酸あるいは
Ｎ−メチル−アラニンアミノ酸で置換することにより、
あるいは切れやすいアルギニン−グリシン結合の化学的
還元によって、別のペプチドを設計した。

実施例４ ヒルログ−８の合成 ヒルログ−８は次の構造式を有する:H−（Ｄ−Phe）−P
ro−Arg−Pro−（Gly）_４−Asn−Gly−Asp−Phe−Glu−
Glu−Ile−Pro−Glu−Glu−Tyr−Leu−OH。ヒルログ−
８はアプライドバイオシステムズ430Aペプチド合成機を
用いて、一般的な固相ペプチド合成を行った。このペプ
チドはBOC−Ｌ−ロイシン−Ｏ−ジビニルベンゼン樹脂
を用いて合成した。使用した追加のｔ−BOC−アミノ酸
（Peninsula Laboratories,Belmont,CA）は、BOC−Ｏ−
2,6−ジクロロベンジルチロシン、BOC−Ｌ−グルタミン
酸（γ−ベンジルエステル）、BOC−Ｌ−プロリン、BOC
−Ｌ−イソロイシン、BOC−Ｌ−フェニルアラニン、BOC
−Ｌ−アスパラギン酸（β−ベンジルエステル）、BOC
−グリシン、BOC−Ｌ−アスパラギン、BOC−Ｄ−フェニ
ルアラニン、およびBOC−Ｌ−アルギニンを包含した。
より高い合成収率を達成するために、（Gly）_４リンカ
ーセグメントは、BOC−グリシルグリシン（Beckman Bio
sciences,Inc.,Philadelphia,PA）をマニュアルで加え
て２回のサイクルでつけた。合成終了後、ペプチドは完
全に脱保護し、無水HF:ｐ−クレゾール：エチルメチル
硫酸（10:1:1、v/v/v）で処理してジビニルベンゼン樹
脂から外した。樹脂からの脱離の後、ペプチドは凍結乾
燥して乾燥した。

ヒルログ−８粗製物は、アプライドバイオシステムズ15
1A液体クロマトグラフィーおよびビダックC₁₈カラム
（2.2x25cm）を用いる逆相HPLCにかけて精製した。カラ
ムは0.1％TFA/水で平衡化し、0.1％TFA中のアセトニト
リルを4.0ml/分の速度で、45分の間に０から80％に直線
的に増加させる濃度勾配にかけ、カラムを展開した。流
出液は229nmの吸収でモニターし、画分は手動で集め
た。ヒルログ−８粗製物25−30mgをHPLCで精製し、15−
20mgの純粋なペプチドを得た。

精製したヒルログ−８の構造は、アミノ酸と配列分析と
から確認した。アミノ酸加水分解物はペプチドを6N HCl
で減圧下、110℃、24時間処理して調製した。次に、加
水分解をイオン交換クロマトグラフィーで分析し、引続
きベックマン6300自動分析機を用いて、ニンヒドリン誘
導体検出にかけた。900Aデータシステムを備えたアプラ
イドバイオシステムズ470Aの気相配列決定装置で、自動
化エドマン分解にかけて配列を決定した。フェニルチオ
ヒダントイン（PTH）アミノ酸は、アプライドバイオシ
ステムズ120A PTH分析機およびPTH−C₁₈カラム（2.1x22
0mm）を用いて、オンラインで分析した。

実施例５ ヒルログ−９の合成 ヒルログ−９は次の構造式を有する:H−（Ｄ−Phe）−P
ro−Arg−Ｄ−Pro−（Gly）_４−Asn−Gly−Asp−Phe−G
lu−Glu−Ile−Pro−Glu−Glu−Tyr−Leu−OH。このペ
プチドは、実施例４の記載と同じ方法で、第15サイクル
で、BOC−Ｌ−プロリンの代わりにBOC−Ｄ−プロリン
（Peninsula Laboratories）を使用して、合成した。精
製と同定は実施例４に記載の方法で行った。

実施例６ ヒルログ−10の合成 ヒルログ−10は次の構造式を有する:H−（Ｄ−Phe）−P
ro−Arg−Sar−（Gly）_５−Asn−Gly−Asp−Phe−Glu−
Glu−Ile−Pro−Glu−Glu−Tyr−Leu−OH。このペプチ
ドは、実施例４に記載の方法で、第16サイクルで、BOC
−サルコシン（Sigma Chemical Co.,St.Louis,Mo.）を
使用して合成した。精製と同定は実施例４に記載の方法
で行った。

実施例７ ヒルログ−11の合成 ヒルログ−11は次の構造式を有する:H−（Ｄ−Phe）−P
ro−Arg−Pro−（Gly）_４−Asn−Gly−Asp−Phe−Glu−
Glu−Ile−Pro−Glu−Glu−（3,5−ジヨードTyr）−Leu
−OH。このペプチドは、実施例４に記載の方法で、第２
サイクルで、BOC−3,5−ジヨード−Ｌ−Tyr（Sigma）を
使用して合成した。精製と同定は実施例４に記載の方法
で行った。

実施例８ ヒルログ−12の合成 ヒルログ−12は次の構造式を有する:H−（Ｄ−Phe）−P
ro−Arg−Pro−（Gly）_４−Asn−Gly−Asp−Phe−Glu−
Glu−Ile−Pro−Glu−Glu−Tyr（OSO₃）−Leu−OH。こ
のペプチドは、1.0mgのヒルログ−８をジメチルホルム
アミド（80μｌ）に溶解し、ジシクロヘキシルカルボジ
イミド溶液（1.25g/ml,0.007ml）および濃硫酸（0.5μ
ｌ）を、０℃、10分間反応させて合成した。反応は水
（1.0ml）を加えて止めた。

反応混合物をアプライドバイオシステムズ150A液体クロ
マトグラフィーシステムおよびアクアポアーRP−300C₈
カラム（0.46x10cm）を用いる逆相HPLCにかけた。カラ
ムは溶媒Ａ（0.1％TFA水溶液）で平衡化し、溶媒Ｂ（0.
085％TFA/70％アセトニトリル）の濃度を、1.0ml/分の
流速で、45分間、０から50％に増加させて、カラムを展
開した。流出液は214nmの吸収でモニターした。

精製したヒルログ−12は、次に0.1N NaOHを加えてpH7に
中和し、凍結乾燥して、リン酸緩衝化生理食塩水に再溶
解した。

実施例９ ヒルログ−８による、ｐ−ニトロアニリド合成基質のト
ロンビンが触媒する加水分解の阻害 次に、スペクトロザイム（Spectrozyme）TH（トシル−G
ly−Pro−Arg−ｐ−ニトロアニリド;American Diagnost
ica,New York,NY）の、ヒトα−トロンビンが触媒する
加水分解に対するヒルログ−８の効果を分析した。詳し
く述べると、基質濃度が2.2から22μＭまでの範囲で、
ヒルログ−８の存在下で、あるいは非存在下で初速度を
測定した。トロンビンの触媒速度はカーリー（Cary）19
スペクトロメーターを用い、405nmでモニターして時間
の関数として連続的に記録した。反応は室温（25±１
℃）で、0.05Mトリス、pH7.5、0.1M NaCl緩衝液中で行
った。

典型的な酵素反応は、サンプルおよび対照の両方のキュ
ベットに緩衝液を1.0ml加えた。トロンビン（最終濃度
3.2x10^-9M）およびヒルログ−８（０−4x10^-8M）をサン
プルキュベットに添加してから、スペクトロザイムTH
（2.2−22μＭ）を加えた。基質の添加直後に、プラス
チックピペットでサンプルキュベットの内容物を混合し
た。反応は分光光度計で５−15分モニターした。

それぞれの基質濃度における初速度は、加水分解された
スペクトロザイムTHのモル数／秒/1モルトロンビンに表
される。これは、反応の初期の直線相の間（基質のトー
タル加水分解が≦15％）の、加水分解反応の傾きを測定
して、決定した。初速度の逆数を基質濃度の逆数に対し
てプロットして、ラインウエーバー−バルクプロットを
作った。結果は、スペクトロザイムTHのヒトα−トロン
ビン触媒加水分解は、V_max＝17モル／秒/1モルトロンビ
ンであり、K_m値は1.19x10^-6Mであった。図３のパネルＡ
およびＢは、ヒルログ−８の濃度を増加すると、K_m値が
有意に、添加量に比例して増加するが、スペクトロザイ
ムTHの加水分解のV_maxがほとんど増加しないことを示し
ている。従って、ヒルログ−８による、トロンビンが触
媒する反応の阻害は、スペクトロザイムTHの加水分解に
関する、拮抗／非拮抗混合機構によって行われた。トロ
ンビンに対するヒルログ−８のK_iは式： を用いて決定できる。ここで、 はヒルログ−８存在下におけるトロンビン触媒反応の傾
き；［ヒルログ−８］はそのペプチドモル濃度； はインヒビター非存在下のトロンビン触媒反応；および
K_iはヒルログ−８のヒトα−トロンビンに対するモル阻
害定数を表す。ヒルログ−８のK_iは1.95±0.11x10^-9Mと
計算された。

実施例10 ヒトα−トロンビンのヒルジンペプチド結合部位および
活性部位に対するヒルログ−８の特異性 ヒルログ−８は、ヒトα−トロンビンにそのヒルジンペ
プチド結合部位を介して結合する一方で、トロンビンの
触媒部位をブロックするように設計された。以下に述べ
る種々の研究を行って、ヒルログ−８がこれらの機能を
発揮できるかについて、検討した。

ヒトγ−トロンビンのヒルログ−８阻害の動力学を、本
質的には実施例９でα−トロンビンについて上述した方
法で検討した。ヒトγ−トロンビンのスペクトロザイム
THに対する触媒反応はV_max＝7.14モル／秒/1モルトロン
ビンであり、K_m＝1.1X10^-6Mであった。この結果によ
り、トロンビンのプロテアーゼ分解物であるγ−トロン
ビンは、凝固活性を本質的に欠いている［S.D.Lewis
ら、“Catalytic Competence of Human α−and γ−Th
rombins in the Activation of Fibrinogen and Factor
XIII",Biochemistry,26,pp.7597−7603（1987）］が、
ほとんど完全な触媒能力を示すことが確認された。γ−
トロンビンのヒルログ−８による阻害を、ペプチド濃度
が2.7x10^-8から6.8x10^-6Mまでの範囲で検討した。以下
に示すように、ヒルログ−８はα−トロンビンと比較し
てK_iが３桁増大したことを示した。γ−トロンビンに対
するこの高いK_i値は、γ−トロンビン中に完全な外側の
アニオン結合部位（ABE）がないことによる［J.W.Fento
n II,ら、“Anion−Binding Exosite of Human α−Thr
ombin and Fibrin（ogen）Recognitino",Biochemistry,
27,pp.7106−12（1988）］。γ−トロンビンはα−トロ
ンビンのＢ−鎖のLys−149およびArg−78でプロテアー
ゼ分解を受けて作られる。

ヒトα−トロンビンのヒルログ−８による阻害は、2.6x
10^-6Mから1.29x10^-5Mまでの濃度のスルホ−Tyr₆₃−Ｎ−
アセチル−ヒルジン_53-64存在下、有意に減少した。こ
れは、トロンビン中のABEへの結合を、スルホ−Tyr₆₃−
Ｎ−アセチル−ヒルジン_53-64とヒルログ−８とが拮抗
することによる。

このことは、また、ヒルログ−８とヒトα−トロンビン
とを、フェニルメチルスルホニル−α−トロンビン（PM
S−α−トロンビン、最終濃度18nM）を添加して反応さ
せたときにも示された。この修飾トロンビンの添加は、
ヒルログ−８がα−トロンビンを阻害する能力を実質的
に減少させたPMS−α−トロンビンは、完全なABEを有し
ているが、活性部位で共有結合的に修飾されている。こ
の修飾トロンビンは、反応液中のヒルログ−８の活性を
抑え、これにより、完全な、触媒活性を有するヒトα−
トロンビンの阻害に使用できるペプチド量を減少させ
る。

さらに、ヒルログ−８のトロンビンに対するK_iに与える
塩濃度の影響を、上記実施例９の方法で測定した。ヒル
ログ−８（11.5x10^-9M）を含む、あるいは含まない緩衝
液中で、0.1M、0.25M、および0.5M NaCl濃度で行った。
下記の表に示すように、ヒルログ−８によるα−トロン
ビンの阻害は、低塩濃度で増加した。この結果は、ヒル
ログ−８の高度に陰イオン化したペプチド部位にトロン
ビンのLys−149付近の陽イオンにチャージした部位との
相互作用が、トロンビンが触媒するスペクトロザイムTH
の加水分解をヒルログ−８が阻害するときの本質であ
る。

実施例11 ヒルログ−８の抗凝固活性：ヒルジンおよびスルホ−Ty
r₆₃−Ｎ−アセチル−ヒルジン_53-64との比較 ヒルログ−８の抗凝固活性を、プールした正常ヒト血漿
（George King Biomedical,Overland Park,KA）およびC
oag−Ａ−Mate XC装置（General Diagnostics,Organon
Technica,Oklahoma City,OK）を陽いて検討した。活性
は、製造者から入手したCaCl₂およびリン脂質の溶液を
用いて、活性化パーシャル トロンボプラスチン タイ
ム（APTT） アッセイ（activated partial thrombopla
stin time assey）でモニターした。ヒルログ−８、ヒ
ルジン、あるいはスルホ−Tyr₆₃−Ｎ−アセチル−ヒル
ジン_53-64を、APTT測定ウエルに最終濃度が10から32,30
0ng/mlで、トータル容量が25μｌとなるように加えた
後、100μｌの血漿を加えた。

コントロールのAPTT（インヒビターなし）は、29.6秒
（平均値、ｎ＝８、SEM＜0.5％）であった。図４は、こ
れらの投与量依存効果の結果を示した。ヒルログ−８
は、ヒルジンよりも２から３倍効果があり、スルホ−Ty
r₆₃−Ｎ−アセチル−ヒルジン_53-64よりも100から150倍
の効果を有していた。ヒルログ−８およびヒルジンの両
方とも、血漿のAPTTを増加させ、高すぎて測定できなか
った。これと対照的に、スルホ−Tyr₆₃−Ｎ−アセチル
−ヒルジン_53-64は、APTTにおいて充分な投与依存効果
を表し、コントロール値の200−250％であった［J.M.Ma
raganoreら,J.Biol.Chem.,264,pp.8692−98（198
9）］。この結果は、ヒルログ−８が、ヒルジンと同様
の方法で、インビトロでの発色アッセイと同様、血漿中
のトロンビンの活性部位を阻害することができることを
示している。

実施例12 トロンビン誘発血小板活性化のヒルログ−８による阻害 トロンビン誘発血小板活性化の実験は、37℃で、Biodat
a PAP₄血小板凝集器（Aggregometer）を用いて行った。
高血小板含有血漿（PRP）を、研究の少なくとも１週間
前に血小板の機能を変える治療を受けていない、正常
で、健康なボランティアから採取した。PRPは、J.A.Jak
ubowskiら、“Modification of Human Platelet by a D
iet Enriched in Saturated or Polyunsaturated Fat",
Atherosclerosis,31,pp.335−44（1978）に記載の方法
で調製した。種々の濃度（50μｌの水に０−500ng/ml）
のヒルログ−８を、温めて（37℃）おいた0.4mlのPRPに
添加した。１分後、血小板懸濁液にヒトα−トロンビン
を最終濃度0.2,0.25もしくは0.5ユニット/mlトータルア
ッセイ容量となるように加えた。凝集はトロンビンを添
加してから５分間の光の伝導度の増加をモニターした。
次に、％阻害を（％凝集_sample）／（％凝集_control）x
100で計算した。この実験の結果、ヒルログ−８は、イ
ンビトロでトロンビン誘発血小板活性化を阻害すること
を示す。

実施例13 血栓イメージ化のためのヒルログ−８の使用 ヒルログ−８は¹²³Iを保有する化学基の共有結合により
修飾される。詳述すると、ヒルログ−８（実施例４で作
成）を,0.1Mホウ酸ナトリウム,pH9.0中で、¹²³I−ボル
トンハンター試薬（New England Nuclear,Boston,Massa
chusetts）と反応させた。¹²³I−ラベルした分子（比活
性＞５μCi/μｇ）を、リン酸緩衝化した生理食塩水で
平衡化したバイオゲル P2カラムで脱塩した。

実験的な血栓の生体外イメージは、本質的にT.M.Palabr
icaら、“Thrombus Imaging in a Primate Model with
Antibodies Specific for an External Membrane Prote
in of Activated Platelets",Proc.Natl.Acad.Sci.USA,
86,pp.1039−40（1989）に記載の方法で行った。さらに
詳しくは、イメージ化は、ヒヒの大腿動脈および大腿静
脈間の外部にチコフレックスシャント（Ticoflex Shun
t）を用いて行った。実験的な血栓は、シャントの中
で、予め血栓を有するダルコン移植片（Darcon graft）
を設置して形成させた。¹²³I−ラベルしたトロンビンイ
ンヒビターをチコフレックスシャントの静脈部に注入し
た。PDP−11/34を備えたOhio Nuclear Series 100 Gamm
a Cameraを用いて、0.5から１時間、連続的に先のイメ
ージが得られた。グラフトおよび血液のプールによる
¹²³I−トロンビン阻害剤の取り込みの動力学は、このよ
うにして得られた放射核種イメージから誘導されるもの
である。

同様の技術を、ヒヒの大腿静脈の血行を静止して起こし
た深部静脈血栓の生体外イメージを得るのに使用し得
る。¹²³I−ヒルログ８は高い特異性でトロンビンに結合
するため、この分子を使用することにより、血栓の詳細
な生体外イメージがわかる。さらに、ヒルログ−８は、
天然のヒルジンあるいはトロンビンに対する抗体と対照
的にサイズが小さいので、放射能ラベルしたトロンビン
の阻害剤が、フィブリンクロットに含まれるトロンビン
と同様、血小板に結合したトロンビンおよびメイゾトロ
ンビンのイメージを明かにできる可能性を有している。

実施例14 トロンビンインヒビターの抗転移活性 本発明のトロンビンインヒビター、好ましくはヒルログ
−８の抗転移活性は、T241細胞肉腫（sarcoma T241 cel
ls）［L.A.Liottaら、Nature,284,pp.67−68（1980）］
および先天的なC57BL/6マウス（Jackson Laboratory,Ba
r Harbor,ME）を用いてアッセイした。このマウスに静
脈あるいは皮下注射で、実施例４で作成したヒルログ−
８を０−250g/kg投与し、その後、10⁴−10⁶のT241腫瘍
細胞を注射した。15日後、その動物を殺して、肺の腫瘍
コロニーを数えた。ヒルログ−８の抗転移活性をプラシ
ーボ処理したコントロールマウスの腫瘍に対するコロニ
ー数の減少％で測定した。ヒルログ−８は、このアッセ
イで、抗転移活性を有することが示された。

実施例15 トロンビンインヒビターによる内皮細胞の阻害 本発明のトロンビンインヒビターが、トロンビンが誘発
する血小板活性化因子（PAF）の合成を阻害する能力を
有するかを、ヒト臍静脈内皮細胞培養細胞（HUVEC）を
用いてアッセイした。HUVECsは、ヒト臍帯からコラーゲ
ナーゼ消化により抽出したが、この方法は確立された方
法である［M.A.Gimborne,Jr.,“Culture of Vascular E
ndothelium",Prog.Hemost.Thromb.,3,pp.1−28（197
6）］。HUVECは、96ウエルのマイクロタイマープレート
にコンフルエンスになるまで、［³H］−酢酸存在下で、
インキュベートした。この方法で培養した細胞は、
［³H］−アセチル−PAFを生産し、これは、HUVEC膜のリ
ン脂質の抽出により定量し得る。

ヒルログ−８（０−１μg/ml）を［³H］−酢酸を有する
HUVECに加え、１分後、トロンビン（最終濃度1U/ml）を
添加した。細胞を５分間インキュベートし、上清を除去
した。0.1％ゼラチン、メタノールに溶解した50mM酢酸
（2:1v/v）を含む培地を、次に、HUVECに添加した。PAF
は、次に、一般的な手法で抽出し、定量した［T.M.McIn
tyreら、“Cultured Endothelial Cells Synthesize Bo
th Platelet−Activating Factor and Prostacyclin in
Respose to Histamine,Bradykinin and Adenosine Tri
phoshate",J.Clin.Invest.,76,pp.271−80（1985）］。
IC₅₀値を次に計算した。ヒルログ−８は、このアッセイ
で、HUVECによるPAFの合成を阻害した。

トロンビン誘発による多形核白血球（PMN）のHUVECへの
接着に対するにヒルログ−８の効果は、以下のようであ
った。HUVECは、24ウエルクラスタープレート中、１％
ウシ胎児血清を含むMEM培地で、コンフルエントまで培
養した。次に培地を除き、新鮮な無血清培地で２回洗浄
し、同じ培地で37℃、10−30分インキュベートし、血清
生産物を取り除いた。予め37℃にしておいたPMN（1ml中
2.5x10⁶）を、各ウエルに添加した。PMNは、２分間HUVE
Cの単層上に置いておき、ヒルログ−８（５μg/ml）あ
るいは生理食塩水をそれぞれのウエルに添加し、その直
後にα−トロンビン（0.1あるいは1U/ml）を加えた。細
胞を37℃、５分間インキュベートし、２回洗浄し位相差
顕微鏡で調査した。接着したPMNは直接カウントした。
ヒルログ−８とインキュベートしたサンプルは、生理食
塩水処理したPMNの細胞接着に比べて有意に少なかっ
た。

実施例16 ヒルログ−13の合成 ヒルログ−13は、次の構造式を有する:H−（Ｄ−Phe）
−Pro−Arg−PrO−（Gly）_２−Asn−Gly−Asp−Phe−Gl
u−Glu−Ile−Pro−Glu−Glu−Tyr−Leu−OH。このペプ
チドの合成、精製、同定は、実施例４と実質的に同様に
行ったが、ジグリシンセグメントを作るためにBOC−グ
リシルグリシンのサイクルを一回行ったことのみが異な
る。

実施例17 ヒルログ−14の合成 ヒルログ−14は、次の構造式を有する:H−（Ｄ−Phe）
−Pro−Arg−Pro−（Gly）_５−Asn−Gly−Asp−Phe−Gl
u−Glu−Ile−Pro−Glu−Glu−Tyr−Leu−OH。このペプ
チドの合成、精製、同定は、実施例４と実質的に同様に
行ったが、ペンタグリシンセグメントを作るためにBOC
−グリシルグリシンのサイクルを２回行った後に、BOC
−グリシンを添加のサイクルを１回行った。

実施例18 ヒルログ−15の合成 ヒルログ−15は、次の構造式を有する:H−（Ｄ−Phe）
−Pro−Arg−Pro−（Gly）_６−Asn−Gly−Asp−Phe−Gl
u−Glu−Ile−Pro−Glu−Glu−Tyr−Leu−OH。ヒルログ
−15の合成、精製、同定は、実施例４と実質的に同様で
行ったが、ヘキサグリシンセグメントを作るためにBOC
−グリシルグリシンのサイクルを３回行った。

実施例19 ヒルログ−16の合成 ヒルログ−16は、次の構造式を有する:H−（Ｄ−Phe）
−Pro−Arg−Pro−（Gly）_８−Asn−Gly−Asp−Phe−Gl
u−Glu−Ile−Pro−Glu−Glu−Tyr−Leu−OH。ヒルログ
16の合成、精製、同定は、実施例４と実質的に同様に行
ったが、オクタグリシンセグメントを作るためにBOC−
グリシルグリシンのサイクルを４回行った。

実施例20 ヒルログ−17の合成 ヒルログ−17は、次の構造式を有する:H−（Ｄ−Phe）
−Pro−Arg−Pro−Gly−Gly−Glu−Gly−His−Gly−Asn
−Gly−Asp−Phe−Glu−Glu−Ile−Pro−Glu−Glu−Tyr
−Leu−OH。ヒルログ17の合成は、Gly−Gly−Glu−Gly
−His−Glyをヒルログ−８に存在するGly₄セグメントと
置換した以外は、実施例４と実質的に同様に行った。こ
の配列は、伸長しているペプチドに、BOC−グリシン、B
OC−Ｌ−ヒスチジン、BOC−グリシン、BOC−Ｌ−グルタ
ミン酸およびBOC−グリシルグリシンを第13−17サイク
ルの合成で、連続的に付加した。ヒルログ−17の精製、
同定は、実施例４と実質的に同様に行った。

実施例21 ヒルログ−18a、−18bおよび−18cの合成 ヒルログ−18aは、Ｈ−（Ｄ−Phe）−Pro−（β−ホモ
アルギニン）−（Gly）_５−Asn−Gly−Asp−Phe−Glu−
Glu−Ile−Pro−Glu−Glu−Tyr−Leu−OHの構造式を有
する。ヒルログ−18bは、Ｈ−Ｄ−Phe）−Pro−（β−
ホモアルギニン）−Pro−（Gly）_４−Asn−Gly−Asp−P
he−Glu−Glu−Ile−Pro−Glu−Glu−Tyr−Leu−OHの構
造式を有する。ヒルログ−18cは、Ｈ−（Ｄ−Phe）−Pr
o−（β−ホモアルギニン）−Val−（Gly）_４−Asn−Gl
y−Asp−Phe−Glu−Glu−Ile−Pro−Glu−Glu−Tyr−Le
u−OHの構造式を有する。ヒルログ−18aは、均一／固相
法を混合して行った。５−20残基は、実施例４および17
の固相合成法で調製した。樹脂に結合した中間体と、β
−ホモアルギニン−Glyの保護された中間体とを反応さ
せた。β−ホモアルギニン−Glyの保護中間体は、以下
の図に示す多段階の反応で合成し、この後すぐに説明す
る。

Ｎ^α−BOC−N^g−Tos−アルギニンジアゾメチルケトン 10g（13.4mmol）のＮ^α−BOC−N^g−Tos−アルギニン（B
achem,Torrance,CA）および2.1ml（19.1mmole）のＮ−
メチルモルフォリン（Aldrich,Milwaukee,Wis.）を100m
lの無水テトラヒドロフラン（THF）中でアルゴン雰囲気
下、５分、室温で撹拌した。この溶液を−15℃に冷却
し、2.8ml（21.6mmol）のイソブチルクロロホルメート
（Aldrich）を加えた。この反応溶液を−15℃、５分間
さらに撹拌を続けて、セライト/MgSO₄パッドで濾過し
た。次に、濾液にジアゾメタンの氷冷エタノール溶液
（150mM:32.4gのジアザルド（Diazald）から得た:Aldri
ch）を添加した。溶液を撹拌し、一昼夜放置して、室温
に徐々に戻した。溶媒は減圧下除き、残渣を200mlのク
ロロホルムに溶解した。有機溶媒を、200mlの飽和NaHCO
₃、次に、200mlの飽和NaClで連続的に洗い、無水MgSO₄
で乾燥し、油状になるまで再度濃縮した。残渣は、4x17
cmのシリカゲルカラムのフラッシュクロマトグラフィー
を行い、アセトンのクロロホルム溶液で段階的濃度勾配
（21クロロホルム中10％アセトンに続いて、31クロロホ
ルム中20％アセトン）で精製した。25mlの画分を集め、
それぞれの画分の一部を薄相クロマトグラフィー（TL
C）にかけた。所望の生成物を含む画分をプールし、エ
バポレートして乾燥した。生成物であるジアゾメチルケ
トンが、淡黄色の泡末として精製された（6.54g）。

Ｎ^α−BOC−N^g−Tos−β−ホモアルギニンメチルエステ
ル 上記調製したジアゾメチルケトンを100mlの無水メタノ
ールに溶解し、アルゴン雰囲気下、還流しながら、安息
香酸銀触媒溶液（400μｌトリエチルアミン中、165mg）
を滴下した。30分後、還流溶液を室温まで冷却し、ノー
リット（Norit）でスラリー化してセライトで濾過し
た。溶媒は次に減圧下除去し、油状の残渣は，シリカゲ
ルカラムのフラッシュクロマトグラフィーを行って、精
製した。溶出は4lのクロロホルムの10％アセトン溶液で
行い、所望の生成物、β−ホモアルギニンメチルエステ
ルが明黄褐色の泡末（6.43g）として得られた。

Ｎ^α−BOC−N^g−Tos−β−ホモアルギニン 上記のメチルエステルを全部、100mlのメタノールに溶
解し、LiOHの水溶液（1.48g、50ml水）と、一昼夜、ア
ルゴン雰囲気下、室温で連続的に撹拌しながら反応させ
た。メタノールを減圧下で除き、残渣を水に溶解して、
酢酸エチルで洗浄した。次に、pHが４になるまで飽和ク
エン酸を添加した。得られたカルボン酸を酢酸エチル中
に抽出した。抽出は、pH3で繰り返し、まとめた有機層
はMgSO₄で乾燥し、減圧下、濃縮した。粗生成物は白色
の泡末（4.9g）であった。この酸は、ビダックC₁₈逆相H
PLCカラムにかけて精製したが、流出液を214nmで測定す
る点を除いて、実施例４に記載した方法と同じである。
所望のフラクションの凍結乾燥後、生成物のＮ^α−BOC
−N^g−Tos−β−ホモアルギニンが、白色の無定形の結
晶として得られた。

Ｎ^α−BOC−N^g−Tos−β−ホモアルギニンは、HF中で加
水分解し、アミノ酸分析のスタンダードとして用いた。
β−ホモアルギニンの保持時間はアルギニンのそれと同
じであったが、ピークの強さは予想したようにかなり低
かった。

Ｎ^α−BOC−N^g−Tos−β−ホモアルギニルグリシンベン
ジルエステル 次に、上記カルボン酸の4.06g（9.02mmol）を25ml無水T
HF溶液に溶解したＮ−メチル−モルフォリン2.04mlと混
合し、アルゴン雰囲気下、−５℃で撹拌した。冷却した
イソブチルクロロフォルメート（25mlTHF中に2.4ml）溶
液を10分間で、滴下した。この添加に続き、反応液−５
℃で12分間撹拌した。ヒルログ−18aに対して、次にグ
リシンベンジルエステル（40mlTHF中に4.9;27.6mmol）
の溶液を加え、室温になるまで溶液を放置した。溶媒は
減圧下除去し、生じた残渣は100mlの酢酸エチルに溶解
した。溶液は、100mlの飽和NaHCO₃、次に、100mlの飽和
NaClで連続的に抽出し、無水MgSO₄で乾燥し、減圧下濃
縮した。生じた粗ジペプチドエステルは、4x20cmのシリ
カゲルカラムを用い、100ml当り10滴のNH₄OHを含むクロ
ロホルム中のメタノールの段階的濃度勾配（2lクロロホ
ルム中１％メタノールに続いて、3lクロロホルム中２％
メタノール）にかけて精製した。画分（25ml）を集め、
TLCでアッセイして、生成物を含むフラクションをプー
ルして、溶媒を減圧下除去した。生成物、Ｎ^α−BOC−N
^g−Tos−β−ホモアルギニルグリシンベンジルエステル
を、泡末として単離した（3.9g）。

ヒルログ−18bおよびヒルログ−18cに対しては、以下の
修正を加えた以外は、上記反応と同じであった。ヒルロ
グ−18bに対しては、グリシンベンジルエステルをプロ
リンベンジルエステルで置換して反応は1.8mmoleスケー
ルで行った。ヒルログ−18cに対しては、グリシンベン
ジルエステルをバリンベンジルエステルで置換して反応
は3.0mmoleスケールで行った。

Ｎ^α−BOC−N^g−Tos−β−ホモアルギニルグリシン 上記ベンジルエステルを50mlのメタノールに溶解し、10
％パラジウム／カーボン1.0gを用いて、17時間常圧で水
素化した。反応溶液をセライト濾過し、溶媒を減圧下、
除去した。反応で2.9gの粗Ｎ^α−BOC−N^g−Tos−β−ホ
モアルギニルグリシンを得て、上記のビダックC₁₈HPLC
カラムにかけて精製した。

上記Ｎ^α−BOC−N^g−Tos−β−ホモアルギニルグリシン
（1.02g）を1mlの無水DMEに溶解し、アイスバスで冷却
した。この溶液に、DMFに溶解した0.5Mヒドロキシベズ
トリアゾール（Applied Biosystems Inc,Forter City,C
A）を5.5ml、続いて、CH₂Cl₂に溶解した0.5Mジシクロヘ
キシルカルボジイミド（Applied Biosystems）を5.5ml
加えた。１時間後、ジペプチユニットの対称的な無水物
の冷却液をグラスウールを用いて素早く濾過し、ジシク
ロヘキシルウレアを取り除いた。

その間、Ｎ−BOC−（Gly）_４−Asn−Gly−Asp−Phe−Gl
u−Glu−Ile−Pro−Glu−Glu−Tyr−Leu−Ｏ−PAM（CH₂
Cl₂中0.2mmol）を標準的なペプチド合成法で、活性化し
ておいた。生じた生成物のカイザーテストで、遊離のア
ミノ末端基が示された。

活性化されたβ−ホモアルギニルグリシンジペプチド
を、樹脂に結合したヘキサデカペプチドとカップルさせ
た。生じたオクタデカペプチドを引続き、Ｎ−BOC−Pro
およびＮ−BOC−（Ｄ−Phe）を標準的なカップリング方
法で結合した。生じたペプチドのヒルログ−18aは実施
例４の方法で精製した。

同様の方法をピルログ−18bおよびヒルログ−18cの合成
に用いた。

実施例22 ヒルログ−19の合成 ヒルログ−19は、Ｈ−（Ｄ−Phe）−Pro−Arg−［psiCH
₂NH］−（Gly）_５−Asn−Gly−Asp−Phe−Glu−Glu−Il
e−Pro−Glu−Glu−Tyr−Leu−OHの構造式を有する。こ
のペプチドの残基４−20は、実施例４に記載の固相ペプ
チドを合成法で組み立てた。次に付加するＮ^α−BOC−N
^g−トリシル−アルギニナルは、以下に図示した。

Ｎ^α−BOC−N^g−Tos−アルギニナル Ｎ^α−BOC−N^g−トシル−アルギニン（Bachem Inc.;10
g）を80mlの無水THFに加え、その懸濁液を０−５℃に冷
却した。次に、1,1′−カルボニルジイミダゾール（Ald
rich;3.61g）を一度に加え、、20分間撹拌を続けた。生
じた清澄液は、一部をドライアイス／アセトン浴につ
け、温度を−20℃から−30℃に保ちながら、リチウムア
ルミニウムハイドライド（Aldrich;80mlTHF中1.8g）の
懸濁液を、連続的に撹拌しながら45分間、滴下して添加
した。反応液は、さらに−20℃で30分撹拌し、−10℃で
63mlの2N HClを滴下して反応を停止した。生じた液をガ
ラスろうとを通して濾過し、減圧下濃縮した。

生じた粗アルデヒドは、白色泡末（11.5g）として得ら
れ、100mlのクロロホルムに懸濁して、水で洗浄し（50m
lで２回）有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下、
濃縮した。粗アルデヒド（7.7g）は、100mlのクロロホ
ルムに溶解し、350mlのシリカゲル（Merck Grade 60,23
0−400mesh、60オングストローム）を含む5x20cmのフラ
ッシュカラムで精製した。溶出は、0.5％メタノール含
有のクロロホルム500ml、１％メタノール含有のクロロ
ホルム1l、および1.5％メタノール含有のクロロホルム1
lでの段階的な濃度勾配を用いて行った。この方法で、
Ｎ^α−BOC−N^g−Tos−アルギニナルが8.9g得られた。

Ｎ^α−BOC−N^g−Tos−アルギニナル（258mg）を樹脂に
結合した（Gly）_５−Asn−Gly−Asp−Phe−Glu−Glu−I
le−Pro−Glu−Glu−Tyr−Leu−Ｏ−PAMに、D.H.Coy
ら、“Solid−Phase Synthesis of Peptides"In Peptid
es,Vol.8,pp.119−121（1978）の方法を用いて、固相還
元アルキル化条件下（40mg、sodium cyanoborohydrid
e、24時間）で付加した。樹脂に結合したペプチド合成
の後、BOC−プロリンの取り込みのサイクルおよびBOC,
−（Ｄ−フェニルアラニン）取り込みのサイクルでペプ
チド合成を完結した。合成終了後、実施例４に記載した
方法で、ヒルログ−19を脱保護し、樹脂から離した。

ヒルログ−19は、アプライドバイオシステムズ151A液体
クロマトグラフィーシステムおよびアクアポアC₈カラム
（10x22cm）を用いる逆相HPLCにかけて精製した。カラ
ムは70％アセトニトリル/0.85％のTFAを含む30％の水
（緩衝液Ｂ）を１部と１％TFAを含む水（緩衝液Ａ）を
４部とで平衡化し、緩衝液Ｂの濃度を直線的に増加させ
る濃度勾配（20−50％）にかけ、4.0ml/分の速度で、12
0分間展開した。流出液は214nmの吸収でモニターし、画
分は手動で集めた。さらなる精製は、20％緩衝液B/80％
緩衝液Ａの一定（isocratic）条件で行った。

実施例23 ヒルログ−21の合成 ヒルログ−21は、Ｈ−（Ｄ−Phe）−Pro−Arg−Pro−
（Gly）_４−Asn−Gly−Asp−Phe−Glu−Glu−Ile−Pro
−Glu−Glu−Tyr−Leu−（Guy）_２−Lys−OHの構造式を
有する。ヒルログ−21は、適当なBOC−アミノ酸を用い
て、実施例４に記載の方法で行った。ヒルログ−21の精
製と同定は、実施例４に記載の方法によった。

実施例24 ヒルログ−25の合成 ヒルログ−25は、Ｈ−（Ｄ−Phe）−Pro−（４−アルギ
ニル−2,2−ジフルオロ）マロニルグリシル−（Gly）_４
−Asn−Gly−Asp−Phe−Glu−Glu−Ile−Pro−Glu−Glu
−Tyr−Leu−OHの構造式を有する。ヘキサデカペプチド
である、（Gly）_４−Asn−Gly−Asp−Phe−Glu−Glu−I
le−Pro−Glu−Glu−Tyr−Leuは、既に記載してあり、
樹脂に結合したままである。次の残基、（３−アルギニ
ル−2,2−ジフルオロ）マロニルグリシンは、下記に詳
細に記載したような反応式で合成される。

１−［（２′−カルボエトキシ−１′,1′−ジフルオ
ロ）エチル］Ｎ^α−BOC−N^orn−ベンジル−N^orn−Cbzオ
ルニチノール 3.1g（7.1mmol）のＮ^α−BOC−N^orn−ベンジル−N^orn−
Cbzオルニチノール［F.Salituroら、“Inhibition of A
spartic Proteinases By Peptides Containing Lysine
and Onithine Side Chain Analogues of Statine",J.Me
d.Chem.,30,pp,286−95（1987）］の溶液、および15ml
無水THF溶液中に溶解した1.56ml（9.23mmol）のエチル
ブロモジフルオロアセテートを、アルゴン雰囲気下、15
mlのTHFに786mgの亜鉛粉末（Fluka）を懸濁した溶液を
還流しながら90分にわたって添加した。還流を４時間行
い、室温に２時間放置した後、混合液の冷却し、それぞ
れ200mlの酢酸エチルおよび飽和NaCl/KHSO₄に分配し
た。有機層をとり、MgSO₄で乾燥し、減圧下濃縮した。
生じた油状の残渣は、CHCl₃:メタノール（90:10）に100
滴/lのNH₄OHを加えたものを溶出溶媒として、シリカゲ
ルで精製した。

１−［（２′−カルボエトキシ−１′,1′−ジフロオ
ロ）エチル］Ｎ^α−BOC−オルニチノール ターシャリ
ーブチルジメチルシリルエーテル 生じた化合物１−［（２′−カルボエトキシ−１′−
１′−ジフルオロ）エチル］Ｎ^α−BOC−N^orn−ベンジ
ル−N^orn−Cbzオルニチノールを、次に、５当量のター
シャリーブチルジメチルシリルクロライドおよび10当量
のイミダゾールと、35℃、DMF中で反応させた。反応
は、E.J.Coreyら、“Protection of Hydroxyl Groups a
s tertButyldimethylsrlyl Derivatives",J.Amer.Chem.
Soc.,94,pp.6190−6191,（1972）の方法に従った。オル
ト位が保護されたアミンをメタノールに溶解し、pd（O
H）_２を触媒として30psiで18時間、水素化した。次に、
触媒を濾過で除き、濾液を減圧下濃縮して、１−
［（２′−カルボエトキシ−１′−１′−ジフルオロ）
エチル］Ｎ^α−BOC−オルニチノール ターシャリーブ
チルジメチルシリルエーテルを得た。

１−［（２′−カルボエトキシ−１′,1′−ジフルオ
ロ）エチル］Ｎ^α−BOC−N^g−Tos−アルギニノール タ
ーシャリーブチルジメチルシリルエーテル 上記、調製した化合物を、次に、それぞれ6.8当量の１
−グアニル−3,5−ジメチルピラゾールおよびトリエチ
ルアミンと105℃の水中、24時間反応させた。混合物
は、凍結乾燥し、残渣を実施例４で述べた調製用HPLCに
かけた。所望のグアニジニウム化合物を（TLCでアッセ
イし）、プールして減圧下、乾燥した。残渣は、H₂O:ア
セトン（1:4）に溶解し、アイスバスで冷却して、50％W
/V NaOHでpHを12に調製した。この溶液に３当量のパラ
トルエンスルフォニルクロライドのアセトン溶液を60分
で加え、この間、NaOHでpHを11−12に保った。溶液は室
温まで温め、一晩撹拌し続けた。アセトンを減圧下除
き、残りの水溶液をエーテルで洗った。エーテル層をと
り、飽和NaHCO₃で逆に抽出した。水層を集め、2N HClで
pH3まで酸性化した。生じた酸性液は、次に、酢酸エチ
ルは２度抽出し、乾燥後、減圧下濃縮して所望の生成物
を得た。

１−［（２′−カルボキシ−１′,1′−ジフルオロ）エ
チル］Ｎ^α−BOC−N^g−Tos−アルギニノール 生じた化合物、１−［（２′−カルボエトキシ−１′−
１′−ジフルオロ）エチル］Ｎ^α−BOC−N^g−Tos−アル
ギニノール ターシャリーブチルジメチルシリルエーテ
ルの脱シリル化を、３当量のテトラ−ｎ−ブチルアンモ
ニウムフルオライドを用いて、THF中、室温で処理し
た。この方法は、上記E.J.Coreyらに記載されている。
この過程で生じた化学物は、次に、メタノール／水中で
2.5当量のLiOHで、アルゴン雰囲気下、室温で一晩処理
してけん化した。反応溶液は、酢酸エチルで洗浄し、ク
エン酸でpH4まで酸性化した。生じた酸を酢酸エチルに
抽出し、有機層を乾燥し、減圧下濃縮した。粗製の酸
は、実施例４に記載の条件下で、ビダックのC₁₈逆相HPL
Cカラムにかけて精製した。

１−［（２′−カルボキシ−１′,1′−ジフルオロ）エ
チル］Ｎ^α−BOC−N^g−Tos−アルギニノン 上記化合物のアルコール基の、ケトンへの変換は、モレ
キュラーシーブ存在下、0.5％氷酢酸を含むCH₂Cl₂中
で、１当量のピリジニウムジクロメートを添加して行っ
た［N.Peetら、“Synthesis of Peptidyl and Fluorome
thyl Ketones and Peptidyl α−Keto Esters as Inhib
itors of Porcine Pancreatic Elastase,Human Neutrop
hil Elastase,and Rat and Human Neutrophil Cathepsi
n G",J.Med.Chem.,33,pp.394−407（1990）］。アルゴ
ン下、15時間撹拌後、反応液を濾過し、溶媒を真空下、
除去した。生じた１−［（２′−カルボキシ−１′−
１′−ジフルオロ）エチル］Ｎ^α−BOC−N^g−Tos−アル
ギニノンは、油状の残渣として得られ、実施例４に記載
の条件下、HPLCカラムにかけて精製した。

遊離のカルボキシル酸は、対称的な無水物に変換し、実
施例21に記載の樹脂に結合したヘキサデカペプチドと反
応させた。ヒルログ−25の２つのＮ−末端アミノ酸であ
る、BOC−ProおよびBOC−（Ｄ−Phe）は、標準的なペプ
チド合成条件で付加し、生じたペプチドは、HFで開裂し
た。

実施例25 ヒルログ−26の合成 ヒルログ−26は、Ｈ（Ｄ−Phe）−Pro−アルゴオキソプ
ロピオニルグリシル−（Gly）_４−Asn−Gly−Asp−Phe
−Glu−Glu−Ile−Pro−Glu−Glu−Tyr−Leu−OHの構造
式を有する。ヘキサデカペプチドである、（Gly）_４−A
sn−Gly−Asp−Phe−Glu−Glu−Ile−Pro−Glu−Glu−T
yr−Lueは、既に記載してあるように合成し、樹脂に結
合したままである。次の残基、Ｎ^α−BOC−アルグオキ
ソプロピオニルグリシンは、下記に詳細に記載したよう
な反応式合成される。

３−（Cbzアミノ）−２−オキソ−３−（３−［N^g−To
s）グアニジニル］プロピル｝ジターシャリーブチルマ
ロネート Ｎ^α−Cbz−N^g−Tos−アルギニンジアゾメチルケトン
を、実施例21に記載のＮ^α−BOC−N^g−Tos−アルギニン
ジアゾメチルケトンの合成方法と同様の方法で行った
が、Ｎ^α−Cbz−N^g−Tos−アルギニンをＮ^α−BOC−N^g
−Tos−アルギニンの代わりに用いた。4.5mgのＮ^α−Cb
z−N^g−Tos−アルギニンジアゾメチルケトンを、フラス
コ中で、200mlのCH₂Cl₂に溶解し、ドライアイス／アセ
トン浴中で撹拌しながら−70℃に冷却した。無水HBrガ
スをその溶液に穏やかな速度の15分間、吹き込んだ。さ
らに15分間、−70℃で撹拌し、減圧下濃縮した。生じた
生成物、Ｎ^α−Cbz−N^g−Tos−Arg−COCO₂Brを黄色の結
晶として5.0gを回収した。

その間、1mlのDMF中のNaOH（36mg;油中80％の分散液）
および1.2mlのヘキサメチルホスホルアミド（“HMPA"）
を、ジターシャリーブトキシマロネート259mgをDMF4ml
に溶解した液に加えた。混合物を室温で40分撹拌し、次
に、20分にわたって、1mmolのＮ^α−Cbz−N^g−Tos−Arg
−COCH₂Brの1ml/0.13ml HMPA溶液に滴下した。反応を３
時間続行し、その後、この溶液を50mlの水に注ぎ、50ml
の酢酸で２回抽出した。有機層を単離し、乾燥し、減圧
下濃縮して、油状の残渣を得た。残渣は、3x10cmのシリ
カゲルカラムで順次精製した。カラムは、400mlの５％
アセトン−クロロホルム、400mlの10％アセトン−クロ
ロホルムおよび200mlの20％アセトン−クロロホルムを
連続的に流して精製した。画分（25ml）を集め、TLCで
アッセイした。所望の化合物を有する画分をプールし、
濃縮して、３−（Cbzアミノ）−２−オキソ−３−｛３
−［（N^g−Tos）グアニジニル］プロピル｝−ジ−ター
シャリーブチルマロネートを得た。

５−（Ｎ^α−Cbzアミノ）−４−オキソ−５−｛３−
［（N^g−Tos）グアニジニル］プロピル｝ペンタノイル
グリシンベンジルエステル 上記、ジ−ｔ−ブチルエステルを1.2当量の1N塩酸中
で、室温で２時間撹拌し、次に過剰のピリジンを加え
て、100℃、15分処理して、脱カルボキシルした。溶媒
を減圧下除去し、残渣を上記のシリカゲルクロマトグラ
フィーで精製した。生じたカルボン酸は、実施例21に記
載の方法に従って、グリシンベンジルエステルでアシル
化した。

５−（アミノ）−４−オキソ−５−｛３−［N^g−Tos）
グアニジニル］プロピル｝ペンタノイルグリシン 生じたエステルを500mlメタノールに溶解し、600mgの10
％パラジウムカーボン触媒を用いて、１気圧の水素雰囲
気下、一晩、水素化した。反応混合液は、次に、セライ
トで濾過し、減圧下濃縮して、固体の残渣（155mg）を
得た。生じたアミノ酸は次に、実施例４に記載した条件
で、HELCで精製した。

５−（Ｎ^α−BOCアミノ）−４−オキソ−５−｛３−
［（N^g−Tos）グアニジル］プロピル｝ペンタノイルグ
リシン 上記アミノ酸を、ジオキサン／水（2:1,v/v）に溶解
し、撹拌しながら０℃まで冷却して、対応するBOS誘導
に変換した。pHを0.1N NaCHで10に調整し、次に、1.1当
量のジ−ターシャリーブチルジカーボネート（ジオキサ
ン中）を添加した。反応は０℃から20℃で４時間、撹拌
して行い、減圧下、エバポレートした。次に、残渣を、
酢酸エチル/1％クエン酸（2:1）で分配した。有機層を
とり、１％クエン酸で１回、飽和食塩水で３回抽出し
た。有機層はMgSO₄で乾燥し、濾過して、減圧下濃縮
し、BOC−保護された生成物を得た。

生じた、保護されたプソイドペプチドの遊離のカルボキ
シル基は、次に、標準的なペプチド合成方法で、樹脂に
結合したヘキサデカペプチドにカップリングした。さら
に、BOC−Ｄ−PheおよびBOC−Proを、樹脂に結合したペ
プチドに連続的に付加した。完成したヒルログ−26は、
実施例４に記載のように、樹脂から開裂し、脱保護、精
製した。

実施例26 ヒルログ−27の合成 ヒルログ−27は、構造式Ｈ−（Ｄ−Phe）−Pro−Arg−
（CO−CH₂）−Pro−（Gly）_４−Asn−Gly−Asp−Phe−G
lu−Glu−Ile−Pro−Glu−Glu−Tyr−Leu−OHを有す
る。ヘキサデカペプチド（Gly）_４−Asn−Gly−Asp−Ph
e−Glu−Glu−Ile−Pro−Glu−Glu−Tyr−Leuは、先に
述べたように合成され、そして樹脂に結合したままにし
ておいた。分子の残りの部分を、以下に図示、記載する
反応の図式により、合成する。

Ｎ^α−Cbz−N^g−Tos−アルギニン（COCH₂）プロリンベ
ンジルエステル720mgのプロリンベンジルエステル（HCl
塩）を25mlのTHFに溶解した。次に、この溶液を、アセ
トン／ドライアイスの入ったバスケット中で、撹拌しな
がら、アルゴン雰囲気下で−78℃に冷却した。次に、リ
チウムジイソプロピルアミド（8.0mlの0.75Mヘキサン懸
濁液）を加え、さらに５分間撹拌した。これに、実施例
25に記載のように調製した、10mlのTHF中の1.08gのＮ^α
−Cbz−N^g−Tos−アルギニンブロモメチルケトンを、20
分間にわたって滴下して加えた。反応液をさらに５分間
撹拌し、次いで溶液を撹拌しながら室温に暖めた。10ml
の飽和NaClを加えて反応を止め、相を分離させて有機層
を取り出した。次にこの相をMgSO₄上で乾燥、濾過し、
そして減圧下で蒸発させた。

Ｎ^α−BOC−N^g−Tos−アルギニン（COCH₂）プロリン 上述のベンジルエステル（1.3g）を、実施例25に記載の
パラジウム−カーボン法を用いて水素化した。所望の生
成物を得るために、得られたプソイドジペプチド（pseu
dodipeptide）を実施例25に記載の方法でBOC保護した。

次に、精製し、保護したプソイドジペプチドを、ペプチ
ド合成の標準法により、ヘキサデカペプチドが結合して
いる樹脂に結合させた。ヒルログ−27の保護をはずし、
樹脂から切り離し、そして実施例４に記載の方法で精製
した。

実施例27 ヒルログ−28の合成 ヒルログ−28は、構造式Ｈ−（Ｄ−Phe）−Pro−Arg（C
H₂N）−Pro−（Gly）_４−Asn−Gly−Asp−Phe−Glu−Gl
u−Ile−Pro−Glu−Glu−Tyr−Leu−OHを有する。ヘキ
サデカペプチド（Gly）_４−Asn−Gly−Asp−Phe−Glu−
Glu−Ile−Pro−Glu−Glu−Tyr−Leu−Ｏ−PAMは、先に
述べたように合成し、そして樹脂に結合させたままして
おいた。分子の残りの部分を、以下に図示、記載する反
応の図式により合成した。

Ｎ^α−BOC−N^g−Tos−アルギニン［psiCH₂N］プロリン
ベンジルエステル 1gの粉砕した３オングストロームのモレキュラーシーブ
（Aldrich）を、室温、アルゴン雰囲気下で、無水THF10
ml中の5.25gのプロリンベンジルエステルの遊離の塩基
（Schweizerhall）および2mlの無水エタノール溶液に撹
拌しながら、加えた。1.45mlの5Nメタノール化HClおよ
び1.5gのＮ^α−BOC−N^g−Tos−アルギニナル（実施例22
に記載のように調製した）をこの混合液に加え、そして
１時間撹拌した。85mgのソディムシアノボロハイドライ
ドをこの混合液に加え、そして１時間後、２度目の85mg
のソディウムハイドライドを加えた。次に反応液を、20
時間撹拌し、そして濾過した。濾過液に、1mlの水およ
び0.9mlの1N HClを、撹拌しながら加え、次いで減圧下
で濃縮して、Ｎ^α−BOC−N^g−Arg−［psiCH₂N］−Pro−
ベンジルエステルの清澄なオイル6.2gを得た。

350mlのシリカゲル（Merck Grade 60,230−400mesh,60
オングストローム）を有する5cmのカラムでのフラッシ
ュクロマトグラフィーにより、さらにオイルを精製し
た。クロロホルム中0.25％、0.75％および1.5％のメタ
ノールで連続的に溶出して、産生物を得た。

Ｎ^α−BOC−N^g−Tos−アルギニン［psiCH₂N］プロリン 得られたベンジルエステルを、実施例25に記載のように
パラジウム−カーボン上で水素化し、そして精製した。
この工程で160mgのＮ^α−BOC−N^g−Arg−［psiCH₂N］−
プロリンの遊離の酸を生成した。これを、実施例４に記
載のHPLCクロマトグラフィーシステムを用いて、さらに
精製した。ただし、溶出は、先に実施例22で述べた、26
％バッファーB/74％バッファーＡの一定のシステムによ
ってなされた。ジペプチドの最終収量は86mgであった。

次に、樹脂に結合しているヘキサデカペプチドに、ジペ
プチドを結合させ、次いでBOC−Pro導入サイクルおよび
BOC−（Ｄ−Phe）導入サイクルを行った。実施例４に記
載の方法で、合成が完了したヒルログ−28の保護をはず
し、樹脂から切り離し、そして精製した。

実施例28 ヒルログ−29の合成 ヒルログ−29は、構造式４−クロロ−イソクマリノ−３
−カルボキシエトキシ（Gly）_５−Asn−Gly−Asp−Phe
−Glu−Glu−Ile−Pro−Glu−Glu−Tyr−Leu−OHを有す
る。ヘプタデカペプチド（Gly）_５−Asn−Gly−Asp−Ph
e−Glu−Glu−Ile−Pro−Glu−Glu−Tyr−Leuを、先に
述べたように合成し、樹脂に結合したままにした。４−
クロロ−イソクマリノ−３−カルボキシアルコキシ部分
を、以下に記載する反応図式および方法で合成した。

エチル２−ブロモ−ホモフタレート ホモフタル酸（10.0g）、２−ブロモエタノール（21.0
g）およびベンゼン（200ml）を混合した。次に、12−15
滴の硫酸を加え、そして、2.5時間加熱還流した。次
に、溶液を濾過し、減圧下で濃縮した。残留物を250ml
のエーテル／ヘキサン（1:1）で洗浄し、そしてシンタ
ーグラスファンネルで濾過した。得られた明褐色の固体
を減圧下で乾燥して、約15.0gの生成物を得た。

４−クロロ−３−［２−ブロモエチルオキシ］−イソク
マリン 上述のように調製したエチル２−ブロモホモフタレート
（4g）を、五塩化リン（8.2g）およびベンゼン（100m
l）とともに混合した。混合液を4.5時間還流し、熱いま
ま濾過し、そして減圧下で蒸発させた。赤褐色の油性の
残留物をすぐに、溶出液にジクロロムエタンを用いて、
24mmx175mmのシリカゲルカラムによるクロマトグラフィ
ーにかけた。20mlの画分を集め、TLCでアッセイした。
４−クロロ−３−［２−ブロモエチルオキシ］−イソク
マリンは、フラクション２−６に溶出した。画分をプー
ルし、減圧下で蒸発させて、得られた残留物は、透明の
明黄色のオイル（2.2g）であり、これを回収した。

４−クロロ−３−［３−オキシプロパン酸］−イソクマ
リン 上記で調製した４−クロロ−３−［２−ブロモエチル］
−イソクマリン（1.4g）を無水THFに溶解し、アルゴン
雰囲気下で撹拌している、マグネシウムターニング（tu
rnings）（170mg）および15mlの無水THF中の数個のヨー
ド結晶の還流溶液に直接加えた。混合液は、1.5時間還
流した。次に、これを400mlのビーカー中で、過剰のド
ライアイスに注いだ。すべての過剰のCO₂が昇華するま
で混合液を20゜に放置し、そしてジエチルエーテルおよ
びTHF各々約100mlずつを、大量の白色である目の荒い沈
澱物を含有する黄色の溶液に加えた。

この混合液に無水塩酸を吹き込んだ。これにより、ほと
んどの沈澱物が溶解した。次に溶液を濾過し、減圧下で
蒸発して粗生成物を得た。次にこれをDCMから、一晩再
結晶させた。

得られた４−クロロ−３−［３−オキシプロパン酸］−
イソクマリンを、グリシンベンジルエステルに結合さ
せ、そして得られた産生物を、実施例25に記載のよう
に、パラジウム−カーボン上で触媒作用により水素化し
た。次いでプソイドペプチドを、ヘキサデカペプチド
（Gly）_４−Asn−Gly−Asp−Phe−Glu−Glu−Ile−Pro
−Glu−Glu−Tly−Leuに、ペプチド合成の標準法によっ
て、結合させた。

実施例29 ヒルログ−30の合成 ヒルログ−30は、構造式４−クロロ−３−［２−アミノ
エタノール］−イソクマリン−（Gly）_５−Asn−Gly−A
sp−Phe−Glu−Glu−Ile−Pro−Glu−Glu−Tyr−Leuを
有する。ヘキサデカペプチド（Gly）_４−Asn−Gly−Asp
−Phe−Glu−Glu−Ile−Pro−Glu−Glu−Tyr−Leuは、
先に述べたように合成し、そして樹脂に結合させたまま
にする。

４−クロロ−３−［２−アミノエタノール］−イソクマ
リン部分を、実施例28の記載の類似の方法により、４−
クロロ−３−［２−ブロモエタノール］−イソクマリン
を合成して、調製したが、ホモフタル酸をエステル化す
る最初の工程で２−ブロモエタノールに代わり２−アミ
ノエタノールを用いる点が異なる。

尿素結合は、４−クロロ−３−［２−アミノエタノー
ル］−イソクマリンのアミノ基を活性化剤カルボニルジ
イミダゾール（“CDI"）と反応させることにより形成す
る。得られた中間体イミダゾールは単離しないで、樹脂
に結合しているヘキサデカペプチドと反応させて、ヒル
ログ−30を生成する。次に、ヒルログ−30の保護をはず
し、樹脂から切り離し、そして実施例４に記載の方法に
より精製する。

実施例30 ヒルログ−31の合成 ヒルログ−31は、構造式アルギピジル−（Gly）_５−Asn
−Gly−Asp−Phe−Glu−Glu−Ile−Pro−Glu−Glu−Tyr
−Lue−OHを有する。ヘキサデカペプチド（G1y）_４−As
n−Gly−Asp−Phe−Glu−Glu−Ile−Pro−Glu−Glu−Ty
r−Leuは、先に述べたペプチド合成の標準法により合成
し、そしてペプチドを樹脂に結合させたままにしてお
く。このヒルログのアルギピジルグリシン部分は、以下
に図示、記載する反応図式によって合成する。

デヒドロ−N^g−ニトロアルギピジンを、実質的にアルギ
ピジンを合成する方法で合成する。これは、本願で参考
文献として引用する米国特許No.4,258,192に記載されて
いる。異なるのは、グアニジニウム基がニトロ官能基に
より保護され、キノリンの複素環が、不飽和のままであ
ることのみである。この中間体を、実施例21に記載の方
法でｔ−ブチルグリシンをアシル化するのに使用する。
ｔ−ブチルエステルは、標準的な酸性加水分解法により
取り除く。得られた遊離の酸を、標準的な結合法により
ヘキサデカペプチドと反応させる。得られたペプチドの
保護をはずし、樹脂から切り離し、そして実施例４に記
載の方法により精製する。

次に、ペプチドを、4,258,192号に特許に記載の水素化
法を適用させ、そして実施例４に記載のHPLCの手順で精
製した。

実施例31 ヒルログ−32の合成 ヒルログ−32は、構造式Ｈ−（Ｄ−Phe）−Pro−Arg−
（Gly）_５−Asn−Gly−Asp−Phe−Glu−Glu−Ile−Pro
−Glu−Glu−Tyr−Leu−OHを有する。ヒルログ−32を、
２サイクルのBOC−グリシルグリシン付加後のサイクル
でBOC−プロリンの代わりにBOC−グリシンを使用したこ
と以外は実施例４に記載の方法を用いて合成、精製し、
そして同定した。

実施例32 ヒルログ−33の合成 ヒルログ−33は、構造式Ｎ−アセチル−Gly−Asp−Phe
−Leu−Ala−Glu−（Gly）_３−Val−Arg−Pro−（Gly）
_４−Asn−Gly−Asp−Phe−Glu−Glu−Ile−Pro−Glu−G
lu−Tyr−Leu−OHを有する。実施例４で使用したペプチ
ド合成の標準法により、適切なBOC−アミノ酸で置換し
て、ヒルログ−33を合成、精製、そして同定した。ヒル
ログ−33のCSDM部分は、ヒトフィブリノーゲンのＡα鎖
のフィブリノペプチドＡ配列のセグメントと同一のアミ
ノ酸配列を有する。

実施例33 種々のヒルログのトロンビンによる開裂 ヒルログ−８によるトロンビンの阻害は、トロンビンが
Arg−Pro結合を徐々に開裂することにより、一過性であ
ることがわかった。この開裂後、トロンビンが色素産生
基質に対する完全な加水分解活性を回復することが観察
された。従って、ヒルログ−８を、トロンビンの「遅性
−基質（slow−substrate）」インヒビターと特徴付け
た。

本発明の他のヒルログと同様に、ヒトα−トロンビンに
よるヒルログ−８の開裂はインビトロのアッセイで証明
された。ヒトα−トロンビン（1.6nM）および異なる濃
度のヒルログ−８、ヒルログ−10、ヒルログ−18a、ヒ
ルログ−18b、ヒルログ−18c、ヒルログ−19、ヒルログ
−32あるいはヒルログ−33のいずれか（80から160nM）
を含有する反応混合液を、0.1M NaClを含有する20mM Tr
is−HCl,pH7,4で調製した。反応混合液の一部（0.975m
l）を異なる時間で取り、0.025mlの色素産生基質スペク
トロザイムTH（最終濃度11μＭ）を含むキュベット中で
混合した。反応の初速度を測定し、そしてヒルログを含
まずトロンビンを含有するコントロール混合液に基づい
て、％阻害を算出した。

別の方法では、逆相HPLCを用いてヒルログ／トロンビン
反応混合液の一部を分離した。このアッセイでは、ヒト
α−トロンビン（最終濃度0.25μＭ）を、上述のヒルロ
グの１つ（最終濃度12.5μＭ）を含有する反応容器に加
えた。トロンビンの添加の前および添加後の種々の時間
に一部（50μｌ）を取った。この一部の反応液は、フラ
ッシュ凍結するか、あるいは直接HPLCカラムにかけた。
HPLCシステムには、アクアポアC₈カラム（0.46X10cm）
を装着したアプライドバイオシステムズ液体クロマトグ
ラフィーシステムを用いた。カラムを70％の溶媒Ａ（0.
1％ TFA水溶液）および30％の溶媒Ｂ（0.085％ TFA/70
％アセトアニリル）で平衡化し、そして流速1ml/分で30
分間、30％から50％への溶媒Ｂの直線濃度勾配にかけ
た。流出液は、214nmでモニターした。ペプチドの濃度
は、ピークの高さを測ることにより決定した。

上述のアッセイのどちらによっても、トロンビンによる
ヒルログの加水分解速度（M/分で表す）およびターンオ
ーバー速度（k_cat;分^-1で表す）の測定が可能である。
どちらの方法も比較し得るk_cat値を示した。それらを以
下の表に示す。

インヒビター P₁−P₁′配列 K_cat分（^-1） ヒルログ−８ Arg−Pro 0.31−0.5 ヒルログ−10 Arg−Sar 10 ヒルログ−18a β−HomoArg−Gly ＜0.01 ヒルログ−18b β−HomoArg−Pro ＜0.01 ヒルログ−18c β−HomoArg−Val ＜0.01 ヒルログ−19 Arg［psiCH₂NH］−Gly ＜0.01 ヒルログ−32 Arg−Gly 535 ヒルログ−33 Arg−Pro 0.056 上述のように、ヒルログ−８、ヒルログ−10、ヒルログ
−32およびヒルログ−33は、0.056分^-1（遅い開裂）か
ら535分^-1（速い開裂）の範囲のk_catで、トロンビンに
より開裂された。対照的に、ヒルログ−18a、ヒルログ1
8b、ヒルログ−18cおよびヒルログ−19は、トロンビン
による開裂に抵抗性があるようである。

図５のパネルＡおよびＢは、トロンビンによるヒルログ
−８の開裂のより詳細な分析を示す。図５のパネルＡに
示すように、ヒルログ−８の濃度がトロンビンよりわず
かに多い場合には、一過性の阻害活性を示した（ヒルロ
グの濃度によって10分間より長いか、あるいは10分
間）。ヒルログ−８の濃度が高くなるに従って、阻害効
果が長引くことを示した。阻害の持続期間とヒルログ−
８との直線的相関を図５のパネルＢに示す。これらのデ
ータから、ターンオーバー時間、すなわち、k_catを0.37
分^-1と算出した。

上述の反応で生成したヒルログ−８由来の消火産物の精
製および配列分析によって、ヒルログ−８のArg−Pro結
合がトロンビンによって徐々に開裂されると決定した。
これは、セリンプロテアーゼにとっては非常に異常な開
裂部位であり、ヒルログ−８においては、ペプチドがト
ロンビンに対して高い親和性を有するために開裂にされ
やすくなっていると考えられる。

実施例34 ヒルログの活性に対するリンカーの長さの効果 ヒルログ−８、ヒルログ−13、ヒルログ−15およびヒル
ログ−16は互いに、それらの各々のリンカー部分のポリ
グリシン部分の長さにおいてのみ異なる。リンカーの長
さが活性にどのような効果を与えるかを知るために、こ
れらのヒルログ各々によるヒトα−トロンビンの阻害を
比較した。次の表に、各々のヒルログのリンカーの長さ
を列記する：ペプチド リンカーの長さ（オングストローム） ヒルログ−８ 24 ヒルログ−13 18 ヒルログ−15 30 ヒルログ−16 36 これらのヒルログのアンチトロンビン活性は、実質的に
実施例９に記載のように、トロンビンが触媒するスペク
トロザイムTHの加水分解で測定した。図６は、リンカー
の長さとこのトロンビン触媒反応のヒルログによる阻害
のKiの関係を示す。この図は、ヒルログ−８、ヒルログ
−15およびヒルログ−16は比較し得る阻害活性を有する
が、リンカーの長さが18オングストロームのヒルログ−
13は、10倍以上低い活性を有することを示す。このこと
は、リンカーの長さが＞18オングストロームおよび＜42
オングストロームの場合は、ヒルログの活性に影響しな
いことを確証する。仮説に縛られることは望まないが、
出願人は、これは溶液中に遊離している場合にもトロン
ビンに結合している場合と同等にヒルログリンカーが無
秩序になっているという事実によると考える。さらに、
出願人は、本発明のトロンビンインヒビターのCSDMおよ
びABEAM部分のトロンビンへの結合にはほとんど共働性
がないと考える。

実施例35 種々のヒルログによるトロンビンが触媒する加水分解の
阻害 トリペプチジル−ｐ−ニトロアニリド基質のトロンビン
が触媒する加水分解に対する、本発明の種々のトロンビ
ンインヒビターの阻害活性を比較した。ヒルログ−10、
ヒルログ−18a、ヒルログ−18b、ヒルログ−18c、ヒル
ログ19、ヒルログ−32およびヒルログ−33の抗トロンビ
ン活性を、実施例９に記載の方法で、スペクトロザイム
THを基質として用いてアッセイした。以下の表に、これ
らのトロンビンインヒビター各々の算出したKi値ならび
にP₁−P₁′配列を列記する。

インヒビター P₁−P₁′配列 Ki（nM） ヒルログ−８ Arg−Pro 1.9±1.4 ヒルログ−10 Arg−Sar ＞2,000 ヒルログ−18a β−HomoArg−Gly 7.4 ヒルログ−18b β−HomoArg−Pro 4.6 ヒルログ−18c β−HomoArg−Val 205.0 ヒルログ−19 Arg［psiCH₂NH］−Gly 20.0 ヒルログ−32 Arg−Gly ＞2,000 ヒルログ−33 Arg−Pro 3.6 上記に示すように、ヒルログ−10およびヒルログ−32は
トロンビンが触媒するスペクトロザイムTHの加水分解に
対して活性の低いインヒビターがあった。これは、これ
らのインヒビター各々がトロンビンによってP₁−P₁′結
合で開裂されるという事実と矛盾しない。ヒルログ19
は、この結合がpsiCH₂−NHに還元され、トロンビンによ
り開裂されなくなってういるため、トロンビンによる加
水分解の有効な阻害が観察された。

β−ホモアルギニンを有するインヒビター（ヒルログ−
18a、ヒルログ−18b、およびヒルログ−18c）での実験
により、このアミノ酸誘導体が活性に影響せずに本発明
のインヒビターのアルギニンを置換し得ることがわかっ
た。さらに、１つのメチレンによるアミド結合の置換
は、トロンビン阻害活性を顕著に低下させないことを示
す。ヒルログ−18aおよびヒルログ−18b各々に比較して
ヒルログ−18cのKiが30から50倍に上昇したことは、
Ｐ′_１アミノ酸の構造が阻害活性に重要であることを示
唆する。

仮説に縛られることは望まないが、出願人は、Ｐ′_１ア
ミノ酸（ヒルログ−18aのGly;ヒルログ−18bのPro）のp
hi−psiの角度の存在ならびに構造的束縛（例えばヒル
ログ−18bのプロリンに起因する）が、本発明のインタ
ヒビーの効力に貢献すると考える。他の可能性は、立体
的考察により、ヒルログ−18cのＰ′_１アミノ酸Valのβ
分枝した側鎖が、この分子のCSDM部分のトロンビンの活
性中心への結合を損ない得ることである。

実施例36 トロンビンの活性部位へのヒルログ−８の結合 ジイソプロピルフルオロホスフェート（DFP）は、トロ
ンビンを含むセリンプロテアーゼの周知のインヒビター
であり、それは、共有結合でSer−195のヒドロキシ基を
修飾することによって作用する。270倍過剰の¹⁴C−DFP
を、0.1Mのホウ酸ナトリウム、pH8.0中のトロンビンに
加えた。10分間の反応後、トロンビン複合体の形成を、
SDS−PAGEおよびフルオログラフィーによる分析によっ
て示した。（図７、レーン１）。反応をスルホ−Tyr₆₃
−Ｎ−アセチル−ヒルジン_53-64（トロビンに対して300
倍および3000倍モル過剰）の存在下で行うと、トロンビ
ンの［¹⁴C］−DFPによる修飾は、有意に変化しなかった
（図７、レーン４および５）。しかし、その反応をヒル
ログ−８（トロンビンに対して３倍あるいは30倍モル過
剰）の存在下で行うと、［¹⁴C］−DEFのトロンビン触媒
部位への取り込みは、完全に阻害された（図７、レーン
２および３）。これらのデータは、本発明のトロンビン
インヒビターのCSDMがトロンビン触媒部位に結合し、そ
して触媒活性を阻害し得ることを示す。

実施例37 ヒルログ−８のアンチトロンビン活性および合成触媒部
位特異性ペンタペプチド（Ｄ−Phe−Pro−Arg−Pro−Gl
y）の比較 図１に示すように、ヒルログ−８はトロンビンが触媒す
る小さいｐ−ニトロアニリド基質の加水分解を阻害し得
たが、その構成成分である外部（exosite）にアニオン
結合部位を伴う、スルホ−Tyr₆₃−Ｎ−アセチル−ヒル
ジン_53-64と異なった。同様に、ペンタペプチド（Ｄ−P
he）−Pro−Arg−Pro−Glyのトロンビン触媒反応性の阻
害能を試験した。

ペンタペプチドは実施例４に記載のように、BOC−グリ
シン−ジビニルベンゼン樹脂を用いて合成した。ペンタ
ペプチドは、実施例４に記載のように精製し、同定し
た。

ヒルログ−８およびこのペンタペプチドの両方の、トロ
ンビンが触媒するスペクトロザイムTHの加水分解に対す
る効果は、50nMあるいは10μＭ各々に固定した濃度のペ
プチドを用いて実施例９に記載のように実験した。我々
の結果は、ナノモル濃度のヒルログ−８はトロンビン触
媒反応を阻害し得るが、10μＭの濃度のペンタペプチド
はトロンビン触媒速度に有意な効果がないことを示す。
これらのデータは、本発明のトロンビンインヒビターの
CSDM成分それ自体は、トロンビンの触媒機能の弱いイン
ヒビターでしかないことを示す。

実施例38 ヒルログ−８のインビボで抗凝固活性 我々は、ヒルログ−８のヒヒへのこのペプチドの静脈内
投与後のインビボでの抗凝固活性を測定した。0.002か
ら0.2mg/kg/分範囲のヒルログ−８の種々の投与量を用
いた。ヒヒ（雄、10−15kg）を、ヒルログ−８投与前に
塩酸ケタミンで鎮静させた。処置した動物およびコント
ロール動物の大腿静脈にいれたカテーテルから全血を、
3.8％のクエン酸ナトリウム中に採取した（血液：クエ
ン酸ナトリウムが9:1）。血漿を標準法により得、実施
例10に記載の方法でAPTTを記録した。図８に示すよう
に、ヒルログ−８は、APTTで投与量に依存する上昇を示
した。APTTの200％の上昇（治療的範囲と考えられる）
は、最も低いヒルログの投与量（0.002mg/kg/分持続注
入）で達成された。

実施例39 ヒルログ−８によるクロットに結合しているトロンビン
の阻害 トロンビンがフィブリンクロットに結合し得、そして一
度吸収されると、さらに別のフィブリノーゲンを開裂し
てクロットが成長することが知られている。クロットに
結合したトロンビン（クロット結合トロンビン）は、ヘ
パリン−アンチトロンビンIII複合体による中和に対し
て耐性であることが示されている［P.J.Hoggら、“Fibr
in Monomer Protects Thrombin From InactiNation By
Heparin−AntiThorombinIII:Implications for Efficac
y",Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,pp.3619−23（198
9）］。しかし、PPACK、ヒルジン、あるいはスルホ−Ty
r₆₃−Ｎ−アセチル−ヒルジン_53-64のようなアンチトロ
ンビンIIIに依存しないインヒビターによって阻害し得
る。クロット結合トロンビンは、血栓の付着および血栓
溶解性の治療後の再血栓症において役割を演じると考え
られている。

我々は、ヒルログ−８およびヘパリンのクロート結合ト
ロンビンを阻害する能力を、J.I.Weitzら、“Clot−Bou
nd Thrombin Is Protected from Heparin Inhibition−
−A Potential Mechanism for Rethrombosis After Lyt
ic Therapy",Blood,74,p.136a,（1989）に記載の方法を
用いて比較した。

ヘパリンの臨床的に妥当な投与量（0.1U/ml）は、可溶
性トロンビンの触媒によるフィブリノペプチドＡ（FP
A）の放出を約70％阻害した。しかし、同様の投与量
は、クロット結合トロンビンの触媒によるFPAの放出に
何の効果もなかった。対照的に、ヒルログ−８は、可溶
性トロンビンあるいはクロット結合トロンビンのいずれ
かの触媒によるFPAの放出に対してほとんど同一の効果
があった（図９）。

この実験は、ヒルログ−８および本発明の他のトロンビ
ンインヒビターが、血栓溶解による再潅流率を増加し、
血栓溶解処置後の再血栓症を防いで、血栓付着を阻害す
ることにおいて現在の薬物より有効であることを示す。

実施例40 血小板依存性血栓症へのインビボでのヒルログ−８の効
果 ヒヒがヒトと類似の凝固および止血反応を有することが
知られているので、ヒヒモデルを使用して、ヒルログ−
８の血小板依存性血栓症を防げる能力を調べた。詳細に
は、種々の血栓形成性表面を、動物の慢性的に体外に露
出したAVシャントに入れた。これらの表面には、動脈血
管内幕切除したヒヒ大動脈のセグメント、コラーゲンで
コートしたサイラステックチューブ、コラーゲン被覆し
たゴーテックス（Gortex）およびダクロン（Dacron）血
管移植片が含まれる。シャント中に配置 した後、表面を天然の血流に曝して血栓形成を誘起し
た。血栓形成表面上への血小板の沈着をモニターするこ
とにより、60分間にわたって血栓の形成を測定した。こ
れらの測定は、¹¹¹In標識した自己血小板を試験動物に
予め注入した後、外部のガンマーカメラによる映像で記
録した。

動脈血管内膜切除したヒヒ大動脈の5cmのセグメント
を、ヒルログ−８を入れずに体外に露出したAVシャント
に入れると、時間に伴う血小板の沈着が起こった。この
堆積は60分でプラトーに達し、プラトーでは、総量で1
4.0±5.0X10⁸血小板/cmが動脈血管内膜切除したセグメ
ント上に沈着していた。0.002および0.01mg/kg/分の投
与量のヒルログ−８は、血小板の沈着を各々、53.6％お
よび75.5％阻害した。これらの結果を図10に示す。この
モデルシステムのヒルログ−８のED₅₀（血小板の沈着を
50％減少させるの必要な投与量）は0.002mg/kg/分であ
った。

5cm片のコラーゲン被覆したサイラスティックチューブ
をAVシャントにいれた場合には、ヒルログ−８を入れな
いと12.6±5.0X10⁸血小板/cmが60分後に沈着していた。
ヒルログ−８を投与すると、投与量に伴う血小板沈着の
阻害が起こった。0.04mg/kg/分の投与量のヒルログ−８
は、血小板の沈着を完全に阻害した。実験のこの部分の
結果を図11に示す。このシステムで算出されたヒルログ
−８のED₅₀は、0.004mg/kg/分であった。

コラーゲン被覆したゴーテックスあるいはダクロン血管
移植片はどちらも、サイラスティックチューブより血栓
形成性が強いことが知られている。ヒルログ−８を入れ
ないと、60分間の天然の血流への露出後、総量で35.0±
6.0X10⁸血小板/cmが沈着した。ヒルログ−８が、血小板
血栓形成に対して投与量依存症の抗血栓効果を再度示し
たことを見い出した。0.2mg/kg/分の投与量のヒルログ
−８は、血小板の沈着を62.9％阻害した。ゴーテックス
システムでのヒルログ−８のED₅₀は0.135/mg/kg/分であ
った。ダクロン移植片についても同様の結果が得られ
た。これら２つの表面上での血小板沈着を阻害するの
に、高い投与量のヒルログ−８が必要であることは、そ
れらの血栓形成性が高いことから、予想されたことであ
った。

さらに、よく剪断された、あるいはあまり剪断されてい
ない血小板に依存する血栓形成に対するヒルログ−８の
効果を、デュアルチャンバー装置を用いて調べた。この
装置によって両方の剪断条件を同時に測定し得た。装置
に、2cmのコラーゲン被覆したゴーテックスを入れ、次
いで直径が伸びた2cmのセグメントを入れた。この装置
を使用して、コラーゲン被覆したゴーテックスのセグメ
ントを、高い剪断条件で天然の血流に露出することによ
り、血栓形成を開始させた。実験手順のこの部分は、動
脈様条件をシミュレートしている。直径が伸びたセグメ
ントに血液が入ると、低い剪断、渦巻の条件が維持さ
れ、それによって動脈血栓症をシミュレートする。コン
トロールの動物では、高い剪断条件および低い剪断条件
での各々のセグメントに、40分後に総量で9.3±2.3X10⁸
および6.1±0.5X10⁸血小板/cmが沈着した。ヒルログ−
８は、高い剪断条件および低い剪断条件でのセグメント
の両方で、血小板の沈着を阻害した。0.05mg/kg/分の投
与量は、低い剪断条件で42.6％、高い剪断条件で29.0％
血小板の沈着を阻害した。

実施例41 急性血小板依存性血栓症の阻害についてのヒルログ−８
と他の抗血栓剤との比較 実施例40で述べたコラーゲン被覆したサイラスティック
チューブ／体外に露出したAVシャントのヒヒモデルでの
血小板沈着に対する、ヘパリン、低分子量のヘパリンお
よび組換えヒルジンの効果を調べた。

160U/kgのヘパリンを１回で注射し、次いで160U/kg/時
間を持続注入すると、生理食塩水で処置したコントロー
ルの動物で観察された血小板沈着の約80％のレベルにま
で阻害されることが以前から知られていた。低分子量の
ヘパリン53抗Xa U/kgを１回で注射し、次いで53抗Xa U/
kg/時間を持続注入すると、同様の結果が得られた［Y.C
adroy,“In Vivo Mechanism of Thrombus Formation.St
udies Using a Primate Model",Dctoral Thesis,L'Univ
ersite Paul Sabatier de Toulouse（Sciences）（198
9）］。モル当量（5nmole/kg/分）では、組換えヒルジ
ン［A.B.Kellyら、“Recombinant Hirudin Interruptio
n of Platelet−Dependent Thrombus Formation",Circu
lation,78,p.II−311（1988）］およびヒルログ−８は
どちらも血小板依存性血栓形成を、コントロールに比較
して約60−70％阻害した。これらの結果を図12に示す。
他のトロンビンインヒビターは、ヒヒモデルで以前に試
験されている［A.B.Kelleyら、“Comparison of Antrth
rombotic and Antihemostatic Effects Produced by An
tithrombins in Primate Models Of Arterial Thrombos
is",Thromb.and Hemostas.,62,p.42（1989）］。コラー
ゲン被覆した表面でのそれらの物質の報告されているED
₅₀投与量ならびに我々が調べたED₅₀を、以下の表にまと
めた：物質 ED₅₀ PRACK 75nmoles/kg/分 Gyki 14,451 500 ベンズアミジン 3000 アルギピジン（MD805） 500 組換えヒルジン ＜５ ヒルログ−８ ＜５ 実施例42 フィブリン沈着に対するヒルログ−８の効果 実施例40で述べた動脈血管内膜切除した大動脈およびコ
ラーゲン被覆したサイラスティックチューブのセグメン
トのモデルシステムで形成された血栓中のフィブリン
（フィブリノーゲン）の沈着に対するヒルログ−８の効
果を測った。フィブリン沈着は、上述の¹¹¹In−血小板
アッセイが完了した30日後に¹²⁵I−フィブリン（フィブ
リノーゲン）を測定することにより、調べた。これは、
¹¹¹In標識が影響しないレベルにまで崩壊させた。

図13は、ヒルログ−８を使用しないと、実施例40で述べ
たようにコラーゲン被覆したチューブを血流に60分間露
出した後、0.17mg/cmのフィブリンが沈着したことを示
す。0.01および0.04mg/kg/分の投与量は、完全にフィブ
リン（フィブリノーゲン）沈着を阻害した。動脈血管内
膜切除した大動脈のセグメントモデルでも同様な結果が
得られた。これらの結果は、本発明のトロンビンインヒ
ビターが血栓に伴うフィブリン（フィブリノーゲン）沈
着を減少させる効果および急性の血小板依存性血栓形成
を阻害する効果を有することを示す。

実施例43 ヒルログ−８のクリアランス時間の測定 ヒヒモデルを使用して、静脈内持続注入後、単回の静脈
内ボーラス（bolus）注射後および単回の皮下ボーラス
注入後のヒルログ−８のクリアランス時間を測定した。
実施例11に記載のように行ったAPTTアッセイを用いてク
リアランス時間をモニターした。

種々の投与量のヒルログ−８（0.002−0.2mg/kg/分）
を、全身性の静脈内持続注入によって60分間にわたって
ヒヒに投与した。60分間の持続注入後、およびそれ以後
種々の時間毎にAPTTを測定した。測定したヒルログ−８
のクリアランスの平均半減期は9.2±3.3分であった。

単回のボーラス注射後のクリアランス時間を測定するた
めに、1mg/kgの投与量のヒルログ−８をヒヒに静脈内注
射あるいは皮下注射した。APTT測定は、注射後種々の時
間毎に行った。図14は、APTTが静脈内注射後２分でピー
クのコントロールの値の570％にまで増加したことを示
す。静脈内注射後のヒルログ−８の半減期は14分であっ
た。

図15は、ヒルログ−８の皮下注射後最も早い時点（すな
わち15分後）で、APTTがコントロールの約200％に増加
したことを示す。皮下経路によるクリアランスでは、半
減期が340分に延びた。皮下投与によるヒルログ−８
は、相当量が吸着することがわかった。

実施例44 ヒヒモデルの播種性血管内凝固（DIC）に対するヒルロ
グ−８効果 F.B.Taylorら、J.Clin.Inverst.,79,pp.918−25（198
7）に記載の方法に従って、致死量のE.coli生菌を注射
して、ヒヒに敗血症を起こした。0.08mg/kg/時間の投与
量のヒルログ−８を、E.coli投与の15分前から投与後最
長６時間まで持続注入した。ヒルログ−８を使用しない
と、E.coliにより引き起こされた敗血症性ショックは、
好中球数、血圧およびヘマトクリットの顕著な低下を起
こした。コントロール動物では、３時間後にはヘマトク
リットはベースラインの70％にまで低下し、血圧はベー
スラインの20％にまで落ちた。ヒルログ−８の投与によ
って、ヘマトリットの低下は完全に減じ、そして血圧の
ピーク時の低下もベースラインの60％までにとどまっ
た。

ヒルログ−８によるDIC減衰にもかかわらず、致死量の
E.coliの注入によって、まだ致死を起こした。コントロ
ールおよびヒルログ−８で処置した動物の両方の剖検
で、どちらの群でも大量の組織浮腫が見られた。しか
し、コントロール群のみに血管内血栓が見られた。剖検
の結果は、敗血栓の凝固障害の段階を妨げるだけでは敗
血症性ショックによる死亡を防ぐには十分でないことを
示す。

実施例45 血栓溶解に対するtPAおよびヒルログ−８の組み合わせ
の効果 tPAに誘起される血栓溶解を強化するヒルログ−８の効
果を調べるために、動脈血栓溶解のラットモデルを使用
した。このモデルでは、バルーンカテーテルによる剥脱
および高度（95％）の狭窄後の実験的血栓を腹部大動脈
に形成させた。血流および血圧は、損傷および狭窄部位
から遠い部位でから記録した。ラットを無作為に選んで
tPA（1.0mg/kgの単回投与後、1.0mg/kg/時間の持続注
入）とともに次のうちの１つを投与した：すなわち生理
食塩水、ヘパリン（10U/kg単回投与後、1.5U/kg/分の持
続注入）、組換えヒルジン（1.0mg/kgの単回投与後、0.
02mg/kg/時間の持続注入）あるいはヒルログ−８（0.6m
g/kgの単回投与後、0.02mg/kg/時間の持続注入）であ
る。抗血栓剤あるいは生理食塩水をtPAと同時に投与
し、そしてtPAの持続注入終了後さらに50分間投与し
た。

図16にこれらの実験の結果を示す。tPA＋生理食塩水で
処置した動物の再潅流までの時間は16.2分だった。ヘパ
リンは再潅流までの時間を12.2分に短縮し、一方、ヒル
ジンは13.0分に短縮した。これらの短縮のどちらでも統
計的に有意ではなかった（ｐ＜0.05）。ヒルログ−８の
tPAとの組み合わせは、再潅流までの時間を4.4分に有意
（ｐ＜0.01）に短縮し、そしてtPAのフィブリン溶解効
果を４倍に促進した。

ヘパリン、ヒルジンおよひヒルログ−８はすべて、生理
食塩水で処置したコントロールに比較して有意に再閉塞
を防いだ（図17）。これらの物質もまた、APTTを各々、
コントロールの値の600％、500％および400％の値に延
ばした（図18）。最後に、ヘパリン、ヒルジンおよびヒ
ルログ−８はそれぞれ、血管の開通性を各々、80.2％、
82％および93.1％に上げた（コントロール＝43.6％）
（図19）。これらの結果は、本発明のトロンビンインヒ
ビターが、tPAの有効性を増すのに、他の既知の抗血栓
剤より優れていることを示す。

実施例46 ヒヒの出血に対するヒルログ−８および他の抗血栓剤の
効果 テンプレート（templete）出血時間測定を用いて、止血
に対するヒルログ−８の効果を調べた。

種々の投与量のヒルログ−８（0.002から0.2mg/kg/分）
の出血時間に対する効果を分析した。0.002からの0.04m
g/kg/分の投与量では、有意な出血時間の延長は起こら
なかった。この実験の結果を図20に示す。0.1mg/kg/分
の投与量では、ヒルログ−８は、出血時間をコントロー
ル値の２倍にした。0.2mg/kg/分のヒルログ−８では、
出血時間はコントロール値の３倍に延びた。これらの結
果は、血小板依存性血栓症を抑制するのに必要な量（0.
002mg/kg/分；実施例40を参照）では、止血栓形成に有
意な影響を与えないことを、明かに示している。

我々はさらに、種々の他の物質の、ヒヒのテンプレート
出血時間に対する効果および全身性の抗凝固効果（APTT
で測定）を試験した。これらの結果を以下に要約する： 実施例47 ヒルログ−34の合成 ヒルログ34は、構造式Ｈ−（Ｄ−Phe）−Pro−Arg−
（テトラエチレングリコリルスクシニル）−Asn−Gly−
Asp−Phe−Glu−Glu−Ile−Pro−Glu−Glu−Tyr−Leu−
OHを有する。デカペプチドAsn−Gly−Asp−Phe−Glu−G
lu−Ile−Pro−Glu−Glu−Tyr−Leuは、先に述べたよう
に合成して樹脂に結合したままにしておく。分子の残り
の部分を、以下に図示、記載する反応図式によって合成
する。

Ｎ^α−BOC−（Ｄ−Phe）−Pro−N^g,N^g−（Cbz）_２−Arg Ｎ^α−BOC−N^g−（Cbz）_２−Arg（Bachem,Inc.,Torranc
e,CA）を過剰のジアゾメタンのエーテル溶液と反応さ
せ、次いで酸で処理してＮ^α−BOC基を除く。次に、得
られた生成物、N^g,N^g−（Cbz）_２−アルギニンメチルエ
ステルをDMFに溶解し、氷浴で冷却し、そして、２当量
のＮ^α−BOC−プロリン、１当量のブタノール、１当量
のEDCIおよび１当量のジイソプロピルエチルアミンで順
番に処理する。反応混合液は一番撹拌し、次いで５容量
の冷水で希釈し、そして酢酸エチルで抽出する。有機層
を回収し、等量の飽和クエン酸、飽和NaHCO₃および飽和
NaClで連続的に洗浄する。次に生成物をMgSO₄で乾燥さ
せ、そして減圧下で濃縮する。得られたジペプチド中間
物質、Ｎ^α−BOC−プロリル−N^g,N^g（Cbz）_２−アルギ
ニンメチルエステルを、10倍モル過剰の4N HCl/ジオキ
サンで30分間処理する。遊離のHClを減圧下で除去し、
そして残留物を無水DMFに溶解する。次に、生成物を氷
浴で冷却し、そして上述のように、ブタノール、EDCIお
よびジイソプロピルエチルアミンの存在下で２当量のＮ
^α−BOC−（Ｄ−Phe）と反応させる。直交的に（orthog
onally）保護されている粗製のトリペプチドを上述のよ
うに単離し、シリカゲルカラムにかけ、0.1％のNH₄OHを
含有するクロロホルム：メタノール（95:5）で溶出して
精製する。次に、Ｎ^α−BOC−（Ｄ）−フェニルアラニ
ルプロリル−N^g,N^g−（Cbz）_２−アルギニンメチルエス
テルを、メタノール：水（2:1）中、２当量のLiOHで、
室温で３時間、けん化する。メタノールを減圧下で除去
し、そして水溶液を２容量のジエチルエーテルで洗浄す
る。次に、溶液を飽和クエン酸でpH3に酸性化する。得
られた粗製トルペプチドの遊離酸を酢酸エチル中に抽出
する。有機層を３容量の飽和NaClで洗浄し、無水MgSO₄
で乾燥させ、そして減圧下で濃縮する。得られたＮ^α−
BOC−（Ｄ）−フェニルアラニルプロリル−N^g,N^g（Cb
z）_２−アルギニンを、実施例４に記載の条件下で逆相H
PLCで精製する。

Ｎ^α−BOC−（Ｄ）−フェニルアラニルプロリル−N^g,N^g
−（Cbz）_２−アルギニンテトラエチレングリコールエ
ステル 上述のトリペプチド溶液をTHFに溶解し、そして、ジエ
チルアゾジカルボキシレートおよびトリフェニルホスフ
ィン各々１当量の存在下で、1.5当量のテトラエチレン
グリコールでエステル化する。これは、O.Mitsunobu,
“The Use of Diethyl Azodicarboxylate and Tripheny
lphosphine in Synthesis and Transformation of Natu
ral Products,Synthesis,pp.x1−28（1981）に記載のよ
うに行う。これに開示されているものを本願の参考文献
として引用する。

Ｎ^α−BOC−（Ｄ）−フェニルアラニルプロリル−N^g,N^g
−（Cbz）_２−アルギニンテトラエチレングリコールエ
ステルヘミスクシネート 得られた化合物をDMFに溶解し、そして、１当量のジイ
ソプロピルエチルアミンの存在下で１当量の無水コハク
酸でエステル化する。揮発性の溶媒を減圧下で除去し、
そして、遊離の酸を、実施例４に記載の条件で逆相HPLC
で精製する。

Ｎ^α−BOC−（Ｄ）−フェニルアラニルプロリル−N^g,N^g
−（Cbz）_２−アルギニンテトラエチレングリコールヘ
ミスクシネートＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル 上述の酸の溶液を、DMF中の１当量のＮ−ヒドロキシス
クシンイミドと混合し、氷浴で冷却し、そして、DMF中
の１当量のDCCを滴下して混合する。反応液を室温で24
時間撹拌し、沈澱したジシクロヘキシル尿素を濾過し、
そして減圧下で濃縮する。次に、溶液を冷やしたベンゼ
ン／ヘキサンで濃縮して粗製ペプチド−グリコールが結
合したＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを得る。

実施例21に記載のように、上述の化合物を樹脂に結合し
ているドデカペプチドと反応させる。得られたヒルログ
−34を実施例４に記載のように、樹脂から切り離し、精
製し、そして同定した。

これまでに、本発明の多数の実施態様を示してきたが、
我々の基本的な構築を変えて、本発明の分子、組成物、
組み合わせ、そして方法を使用する他の実施態様を提供
し得るのは明かである。従って、本発明の範囲は、これ
までに実施例として述べてきた特定の実施態様よりむし
ろ、ここに添付する請求の範囲によって定義されること
は、理解される。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/60 Ｚ 33/68 (72)発明者 マラガノーレ，ジョン エム. アメリカ合衆国 マサチューセッツ 01876 テュークスベリー，パトリック ロード 84 (72)発明者 フェントン ザ セカンド，ジョン ダブ リュー. アメリカ合衆国 ニューヨーク 12115, メイドン ブリッジ，ルート 66，ピー. オー．ボックス 37 (72)発明者 クライン，トウニ アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02139 ケンブリッジ，ヘイズ ストリー ト 47

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】トロンビンインヒビターであって； ａ）トロンビンの活性部位に結合し、そして阻害する触
   媒部位特異的部分； ｂ）計算上の長さが18オングストロームと42オングスト
   ロームとの間である骨格鎖で特徴付けられるリンカー部
   分；および ｃ）外部のアニオン結合部位に結合する部分； を含有し、該触媒部位特異的部分（ａ）は該リンカー部
   分（ｂ）に結合しており、該リンカー部分（ｂ）は該外
   部のアニオン結合部位に結合する部分（ｃ）に結合し、 ここで、該触媒部位特異的部分（ａ）が、（ｉ）可逆的
   にトロンビンに結合して徐々に開裂される部分、（ii）
   可逆的にトロンビンに結合して開裂されない部分、（ii
   i）不可逆的にトロンビンに結合する部分からなる群か
   ら選択され、 該可逆的にトロンビンに結合して徐々に開裂される部分
   （ｉ）は、次の構造式； Ｘ−A₁−A₂−A₃−Ｙ を有し、ここで、Ｘは水素であるか、あるいは１個から
   35個の原子からなる骨格鎖によって特徴付けられ;A₁はA
   rg、LysあるいはOrnであり;A₂は非アミド結合であり;A₃
   は、１個から９個の原子からなる骨格鎖によって特徴付
   けられ；そしてＹは結合手であり、 該可逆的にトロンビンに結合して開裂されない部分（i
   i）は、ベンズアミジン、DAPA、NAPAP、アルギピジン
   （argipidine）であるか、または次の構造式： Ｘ−C₁−C₂−A₃−Ｙ を有し、ここで、C₁は、還元されたカルボキシル基ある
   いは１個から10個の原子の骨格鎖によって特徴付けられ
   る構造によってα位炭素で置換されているカルボキシル
   基を有するArg、LysあるいはOrnの誘導体であり、そし
   てC₂は開裂可能でない結合であり、 該不可逆的にトロンビンに結合する部分（iii）は、セ
   リンプロテアーゼインヒビター、ヘテロサイクリックプ
   ロテアーゼインヒビター、トロンビン特異的インヒビタ
   ー、または遷移状態のアナログである、 トロンビンインヒビター。
2. 【請求項２】前記外部のアニオン結合部位に結合する部
   分（ｃ）が次の構造式； Ｗ−B₁−B₂−B₃−B₄−B₅−B₆−B₇−B₈−Ｚ からなる請求項１に記載のトロンビンインヒビターであ
   って、ここで、Ｗは結合手であり;B₁はアニオン性アミ
   ノ酸であり;B₂は任意のアミノ酸であり;B₃はIle、Val、
   Leu、NleあるいはPheであり;B₄はPro、Hyp、3,4−デヒ
   ドロPro、チアゾリジン−４−カルボン酸塩、Sar、任意
   のＮ−メチルアミノ酸、あるいはＤ−Alaであり;B₅はア
   ニオン性アミノ酸であり;B₆はアニオン性アミノ酸であ
   り;B₇は、Tyr、Trp、Phe、Leu、Nle、Ile、Val、Cha、P
   roからなる群から選択される脂質親和性アミノ酸、ある
   いは、これらの脂質親和性アミノ酸の１つとおよび任意
   のアミノ酸からなるジペプチドであり;B₈は結合手、あ
   るいは、１から５残基の任意のアミノ酸の形態を有する
   ペプチドであり；そしてＺは、OH、C₁−C₆アルコキシ、
   アミノ、モノ（C₁−C₄）あるいはジ（C₁−C₄）アルキル
   置換アミノあるいはベンジルアミノから選択されるカル
   ボキシ末端残基である、トロンビンインヒビター。
3. 【請求項３】請求項２に記載のトロンビンインヒビター
   であって、ここで、B₁はGluであり;B₂はGluであり;B₃は
   Ileであり;B₄はProであり;B₅はGluであり;B₆はGluであ
   り;B₇はTyr−Leu、Tyr（SO₃H）−Leu、Tyr（OSO₃H）−L
   euあるいは（３−,5−ジヨードTyr）−Leuであり;B₈は
   結合手であり；そしてＺはOHである、トロンビンインヒ
   ビター。
4. 【請求項４】前記リンカー部分（ｂ）の前記骨格鎖が、
   炭素、窒素、イオウおよび酸素からなる群から選択され
   る原子の任意の組み合わせからなる、請求項１に記載の
   トロンビンインヒビター。
5. 【請求項５】前記リンカー部分（ｂ）が、アミノ酸配
   列； Gly−Gly−Gly−Asn−Gly−Asp−Phe を含有する、請求項４に記載のトロンビンインヒビタ
   ー。
6. 【請求項６】前記触媒部位特異的部分（ａ）が、可逆的
   にトロンビンに結合し、そしてトロンビンによって徐々
   に開裂される部分（ｉ）である、請求項１に記載のトロ
   ンビンインヒビター。
7. 【請求項７】前記触媒部位特異的部分（ａ）が、可逆的
   にトロンビンに結合し、そしてトロンビンによって開裂
   され得ない部分（ii）である、請求項１に記載のトロン
   ビンインヒビター。
8. 【請求項８】前記触媒部位特異的部分（ａ）が、不可逆
   的にトロンビンに結合する部分（iii）である、請求項
   １に記載のトロンビンインヒビター。
9. 【請求項９】ＸがＤ−Phe−Proであり;A₁がArgであり；
   そしてA₃がＤ−Pro、ProあるいはSarである、請求項６
   に記載のトロンビンインヒビター。
10. 【請求項１０】前記トロンビンインヒビターが、以下の
    構造式のヒルログ−８およびヒルログ−12からなる群か
    ら選択される、請求項９に記載のトロンビンインヒビタ
    ー： ヒルログ−8:H−（Ｄ−Phe）−Pro−Arg−Pro−（Gly）
    _４−Asn−Gly−Asp−Phe−Glu−Glu−Ile−Pro−Glu−G
    lu−Tyr−Leu−OH、および ヒルログ−12:H−（Ｄ−Phe）−Pro−Arg−Pro−（Gl
    y）_４−Asn−Gly−Asp−Phe−Glu−Glu−Ile−Pro−Glu
    −Glu−Tyr（OSO₃）−Leu−OH。
11. 【請求項１１】ＸがＮ−アセチル−Gly−Asp−Phe−Leu
    −Ala−Glu−Gly−Gly−Gly−Valであり;A₁がArgであ
    り；そしてA₃がPorである、請求項６に記載のトロンビ
    ンインヒビター。
12. 【請求項１２】前記触媒部位特異的部分（ａ）が次の構
    造式； Ｘ−C₁−C₂−A₃−Ｙ である、請求項７に記載のトロンビンインヒビター。
13. 【請求項１３】以下の構造式のヒルログ−18aおよびヒ
    ルログ−18bからなる群から選択される、請求項12に記
    載のトロンビンインヒビター： ヒルログ−18a:H−（Ｄ−Phe）−Pro−（β−ホモアル
    ギニン）−（Gly）_５−Asn−Gly−Asp−Phe−Glu−Glu
    −Ile−Pro−Glu−Glu−Tyr−Leu−OH、および ヒルログ−18b:H−（Ｄ−Phe）−Pro−（β−ホモアル
    ギニン）−Pro−（Gly）_４−Asn−Gly−Asp−Phe−Glu
    −Glu−Ile−Pro−Glu−Glu−Tyr−Leu−OH。
14. 【請求項１４】患者あるいは体外の血液中のトロンビン
    が介在する機能を阻害するための薬学的に許容し得る組
    成物であって、請求項１から13のいずれか１つに記載の
    トロンビンインヒビターの薬学的に有効な量および薬学
    的に許容し得る担体を含有する、組成物。
15. 【請求項１５】前記薬学的に有効な量が、１μg/kg体重
    ／日から5mg/kg体重／日の間である、請求項14に記載の
    薬学的に許容し得る組成物。
16. 【請求項１６】前記薬学的に有効な量が、10μg/kg体重
    ／日から500μg/kg体重／日の間である、請求項15に記
    載の薬学的に許容し得る組成物。
17. 【請求項１７】前記インヒビターが放射性同位元素で標
    識されている、請求項１に記載のトロンビンインヒビタ
    ー。
18. 【請求項１８】前記放射性同位元素が、¹²³I、¹²⁵Iおよ
    び¹¹¹Inからなる群から選択される、請求項17に記載の
    トロンビンインヒビター。
19. 【請求項１９】患者のフィブリンあるいは血小板血栓を
    生体外（ex vivo）で画像にするための組成物であっ
    て、該組成物が、薬学的に許容し得るバッファーおよび
    請求項17あるいは18に記載のトロンビンインヒビターを
    含有する、組成物。
20. 【請求項２０】患者に挿入するための挿入（invasive）
    装置の表面をコートするための組成物であって、該組成
    物は適切なバッファーおよび請求項１から13のいずれか
    １つに記載の少なくとも１つのトロンビンインヒビター
    を含有する、組成物。
21. 【請求項２１】患者に挿入する挿入装置の表面をコート
    する方法であって、該方法が、請求項20に記載の組成物
    に該表面を接触させる工程を含包する、方法。
22. 【請求項２２】患者の血栓による疾患を治療あるいは予
    防するために、薬学的に有効に組み合わせて用いるため
    のキットであって、該キットは； ａ）請求項１から13のいずれか１つに記載のトロンビン
    インヒビター； ｂ）血栓溶解剤；および ｃ）薬学的に許容し得る担体； を含有する、キット。
23. 【請求項２３】前記トロンビンインヒビターが以下の構
    造式のヒルログ−8: Ｈ−（Ｄ−Phe）−Pro−Arg−Pro−（Gly）_４−Asn−Gl
    y−Asp−Phe−Glu−Glu−Ile−Pro−Glu−Glu−Try−Le
    u−OH であり、前記血栓溶解剤がtPAである、請求項22に記載
    のキット。
24. 【請求項２４】請求項22に記載のキットであって、ここ
    で前記トロンビンインヒビターの日用量は１μg/kg体重
    と5mg/kg体重との間であり、そして前記血栓溶解剤の日
    用量は前記血栓溶解剤の従来の用量範囲の10％と80％の
    間である、キット。
25. 【請求項２５】請求項24に記載のキットであって、ここ
    で前記トロンビンインヒビターの日用量は10μg/kg体重
    と500μg/kg体重との間であり、そして前記血栓溶解剤
    の日用量は、前記血栓溶解剤の従来の用量範囲の10％と
    70％の間である、キット。
26. 【請求項２６】請求項22から25のいずれかに記載のキッ
    トであって、該キットは患者の再灌流を成立させるため
    に、あるいは再閉塞を防ぐために要する血栓溶解剤の用
    量を減らす、キット。
27. 【請求項２７】前記血栓溶解剤で処理するまたは処置し
    た患者の再灌流するまでの時間を短縮し、再閉塞するま
    での時間を延長させるための、請求項22から25のいずれ
    かに記載のキット。
28. 【請求項２８】請求項２に記載のトロンビンインヒビタ
    ーであって、前記リンカー部分（ｂ）が、18オングスト
    ロームと36オングストロームの間の計算上の長さを有す
    る骨格鎖によって特徴付けられ、そして、17から35個の
    炭素原子のアシル基、カルボベンジルオキシあるいはｔ
    −ブチルオキシカルボニル、17から35個の骨格結合のア
    ルキル基、６から12残基の任意のアミノ酸を有するペプ
    チドおよびこれらの組み合わせからなる群から選択され
    る、インヒビター。
29. 【請求項２９】請求項３に記載のトロンビンインヒビタ
    ーであって、ここで； B₇はTry（SO₃H）−LeuあるいはTyr（OSO₃H）−Leuであ
    り； 前記リンカー部分（ｂ）は８個から10個のアミノ酸から
    なるペプチドであり、該リンカー部分（ｂ）の、前記外
    部のアニオン結合部位に結合する部分（ｃ）のアミノ酸
    はPheであり；そして 前記接触部位特異的部分（ａ）は、次の構造式； Ｘ−Arg−Ｒ からなり、ここでＸは、Ｄ−Phe−Proおよびトシル−Gl
    yでなる群から選択され；そしてＲは、Pro、Sarおよび
    Ｎ−メチルAlaでなる群から選択される、トロンビンイ
    ンヒビター。
30. 【請求項３０】前記トロンビンインヒビターが以下の構
    造式のヒルログ−33である、請求項11に記載のトロンビ
    ンインヒビター： ヒルログ−33:N−アセチル−Gly−Asp−Phe−Leu−Ala
    −Glu−（Gly）_３−Val−Arg−Pro−（Gly）_４−Asn−G
    ly−Asp−Phe−Glu−Glu−Ile−Pro−Glu−Glu−Tyr−L
    eu−OH。