JPH0770092A - 新規水溶性テトラゾリウム化合物 - Google Patents
新規水溶性テトラゾリウム化合物Info
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- JPH0770092A JPH0770092A JP23925393A JP23925393A JPH0770092A JP H0770092 A JPH0770092 A JP H0770092A JP 23925393 A JP23925393 A JP 23925393A JP 23925393 A JP23925393 A JP 23925393A JP H0770092 A JPH0770092 A JP H0770092A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 脱水素酵素と反応させて生成するホルマザン
の吸光度を測定する方法で、水溶性のホルマザンを生成
するテトラゾリウム化合物を提供する。 【構成】 一般式 【化１】 （Ｒ1 及びＲ2 はそれぞれ独立に水素又はニトロ基で、
Ｍはアルカリ金属又はアンモニウムである）で示される
水溶性テトラゾリウム化合物を用いて、脱水素酵素と反
応させ、生成するホルマザンの吸光度を測定して脱水素
酵素の濃度を定量する。 【効果】 得られるホルマザンが水溶性で、測定機器へ
の沈着がなく、自動分析装置による測定が可能となり、
またpHにより吸収スペクトルのが異なり、選択が可能で
ある。
の吸光度を測定する方法で、水溶性のホルマザンを生成
するテトラゾリウム化合物を提供する。 【構成】 一般式 【化１】 （Ｒ1 及びＲ2 はそれぞれ独立に水素又はニトロ基で、
Ｍはアルカリ金属又はアンモニウムである）で示される
水溶性テトラゾリウム化合物を用いて、脱水素酵素と反
応させ、生成するホルマザンの吸光度を測定して脱水素
酵素の濃度を定量する。 【効果】 得られるホルマザンが水溶性で、測定機器へ
の沈着がなく、自動分析装置による測定が可能となり、
またpHにより吸収スペクトルのが異なり、選択が可能で
ある。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は水溶性テトラゾリウム化
合物に関し、特に脱水素酵素と反応させて生成したホル
マザンの吸光度により脱水素酵素を定量分析する方法に
関するものである。
合物に関し、特に脱水素酵素と反応させて生成したホル
マザンの吸光度により脱水素酵素を定量分析する方法に
関するものである。
【０００２】乳酸脱水素酵素（以下、ＬＤＨと略称す
る）、アルコール脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素
などの各種脱水素酵素は従来テトラゾリウム塩を用いて
定量分析が行なわれていた。
る）、アルコール脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素
などの各種脱水素酵素は従来テトラゾリウム塩を用いて
定量分析が行なわれていた。
【０００３】すなわち、テトラゾリウム塩は、これら各
種脱水素酵素の作用により遊離した水素を中間電子運搬
体を介して受容しホルマザンとなる。そのホルマザンの
吸光度を測定することにより脱水素酵素を定量すること
ができる。
種脱水素酵素の作用により遊離した水素を中間電子運搬
体を介して受容しホルマザンとなる。そのホルマザンの
吸光度を測定することにより脱水素酵素を定量すること
ができる。
【０００４】特に、これらの脱水素酵素のうちＬＤＨは
全ての体細胞に分布し、特に心筋、肝臓、骨格筋、腎臓
に多く、心筋梗塞、悪性腫瘍、肝疾患、進行性筋萎縮、
血管内溶血、巨赤芽球性貧血などの疾患の場合には、血
清ＬＤＨ活性が著しく上昇することが知られている。従
って血中のＬＤＨ活性を測定することにより、臨床上、
診断に対する極めて有意義な知見を得ることができる。
この目的の水素受容体としては、従来 3,3'-［3,3'- ジ
メトキシ-( 1,1'-ビフェニル)- 4,4'-ジイル］- ビス
［2-( 4-ニトロフェニル)-5-フェニル- 2Hテトラゾリウ
ム塩化物］（以下ニトロＴＢと略称する）などが一般的
に用いられている。
全ての体細胞に分布し、特に心筋、肝臓、骨格筋、腎臓
に多く、心筋梗塞、悪性腫瘍、肝疾患、進行性筋萎縮、
血管内溶血、巨赤芽球性貧血などの疾患の場合には、血
清ＬＤＨ活性が著しく上昇することが知られている。従
って血中のＬＤＨ活性を測定することにより、臨床上、
診断に対する極めて有意義な知見を得ることができる。
この目的の水素受容体としては、従来 3,3'-［3,3'- ジ
メトキシ-( 1,1'-ビフェニル)- 4,4'-ジイル］- ビス
［2-( 4-ニトロフェニル)-5-フェニル- 2Hテトラゾリウ
ム塩化物］（以下ニトロＴＢと略称する）などが一般的
に用いられている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、このニ
トロＴＢが水素を受容して生じるホルマザンは水に溶け
ず、実用上不便であった。特に自動分析においては、生
成したホルマザンがチューブやセルなど計測系に付着す
る難点があった。これらの欠点を除去するためには、水
溶性のホルマザンを生成するテトラゾリウム塩を使用す
ることが必要となっていた。
トロＴＢが水素を受容して生じるホルマザンは水に溶け
ず、実用上不便であった。特に自動分析においては、生
成したホルマザンがチューブやセルなど計測系に付着す
る難点があった。これらの欠点を除去するためには、水
溶性のホルマザンを生成するテトラゾリウム塩を使用す
ることが必要となっていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】このような問題を解決す
るために、水溶性のテトラゾリウム化合物がいくつか提
案されている（特開昭56-61366号、 特開昭56-61367号各
公報）。これらはいずれも水溶性のホルマザンを生成
し、自動分析装置での利用が可能であるが、本発明者ら
は、溶解性の良好なホルマザンを生じさせる化合物につ
いてさらに研究を重ねた結果、上記とは異なる特定の水
溶性テトラゾリウム化合物が優れた水素受容体で、且つ
このものから生じるホルマザンが水溶性で、自動分析装
置への付着や沈殿を起こさない測定が可能なことを見出
した。
るために、水溶性のテトラゾリウム化合物がいくつか提
案されている（特開昭56-61366号、 特開昭56-61367号各
公報）。これらはいずれも水溶性のホルマザンを生成
し、自動分析装置での利用が可能であるが、本発明者ら
は、溶解性の良好なホルマザンを生じさせる化合物につ
いてさらに研究を重ねた結果、上記とは異なる特定の水
溶性テトラゾリウム化合物が優れた水素受容体で、且つ
このものから生じるホルマザンが水溶性で、自動分析装
置への付着や沈殿を起こさない測定が可能なことを見出
した。
【０００７】すなわちこのような化合物は、一般式
（１）、
（１）、
【化３】 （式中、Ｒ1 及びＲ2 はそれぞれ独立に水素原子又はニ
トロ基で、Ｍはアルカリ金属又はアンモニウムである）
で示される水溶性テトラゾリウム化合物である。
トロ基で、Ｍはアルカリ金属又はアンモニウムである）
で示される水溶性テトラゾリウム化合物である。
【０００８】上記一般式（１）から生じるホルマザンは
酸性から中性の状態では 430〜440nmに極大吸収を有す
る黄色のホルマザンであるが、pH12以上では 580〜590
nmに極大吸収を有する青色のホルマザンとなる。そのた
め、生成したホルマザンのpHを調整することにより 2波
長領域での測定が可能であり、特に長波長領域での測定
は、ビリルビンやヘモグロビンなどの生体成分の妨害を
受け難く、安定した測定が可能であり、臨床検査上有意
義である。
酸性から中性の状態では 430〜440nmに極大吸収を有す
る黄色のホルマザンであるが、pH12以上では 580〜590
nmに極大吸収を有する青色のホルマザンとなる。そのた
め、生成したホルマザンのpHを調整することにより 2波
長領域での測定が可能であり、特に長波長領域での測定
は、ビリルビンやヘモグロビンなどの生体成分の妨害を
受け難く、安定した測定が可能であり、臨床検査上有意
義である。
【０００９】本発明の前記一般式（１）の化合物は常法
によって製造することができる。例えば、次の一般式
（２）
によって製造することができる。例えば、次の一般式
（２）
【００１０】
【化４】
【００１１】（式中Ｒ1 、Ｒ2 はそれぞれ独立に水素原
子又はニトロ基を表わす）で示されるフェニルヒドラジ
ン類にアルデヒド化合物をアルコール溶媒中で反応させ
て、一般式（３）
子又はニトロ基を表わす）で示されるフェニルヒドラジ
ン類にアルデヒド化合物をアルコール溶媒中で反応させ
て、一般式（３）
【００１２】
【化５】
【００１３】（式中Ｒ1 、Ｒ2 は前と同じ）で示される
ヒドラゾンを得、次いで対応するジアゾニウム塩を水溶
媒中塩基性条件下で反応させて一般式（４）
ヒドラゾンを得、次いで対応するジアゾニウム塩を水溶
媒中塩基性条件下で反応させて一般式（４）
【００１４】
【化６】
【００１５】（式中Ｒ1 、Ｒ2 は前と同じ）で示される
ホルマザンを得る。ここで塩基性化剤としては水酸化ナ
トリウム、水酸化カリウムなどが用いられる。
ホルマザンを得る。ここで塩基性化剤としては水酸化ナ
トリウム、水酸化カリウムなどが用いられる。
【００１６】次いで得られた一般式（４）のホルマザン
を亜硝酸ブチル又は次亜塩素酸ナトリウム等の酸化剤を
用いアルコール溶媒中で酸化し、前記一般式（１）のテ
トラゾリウム化合物を得ることができる。
を亜硝酸ブチル又は次亜塩素酸ナトリウム等の酸化剤を
用いアルコール溶媒中で酸化し、前記一般式（１）のテ
トラゾリウム化合物を得ることができる。
【００１７】
【実施例】以下の実施例においては一般式（１）のＲ1
及びＲ2 の両者が水素（化合物ａ）、いずれか一方が N
O2（化合物ｂ）及び両者が NO2（化合物ｃ）のものを合
成し、脱水酵素を反応させた時の吸収スペクトルを示す
が、本発明はその利用に月これらの実施例に限定される
ものではない。
及びＲ2 の両者が水素（化合物ａ）、いずれか一方が N
O2（化合物ｂ）及び両者が NO2（化合物ｃ）のものを合
成し、脱水酵素を反応させた時の吸収スペクトルを示す
が、本発明はその利用に月これらの実施例に限定される
ものではない。
【００１８】実施例１ （化合物ｃの合成）2,4-ジニトロフェニルヒドラジン1
1.9g 及び4-フォルミル- 1,3-ベンゼンジスルホン酸 2
ナトリウム塩一水和物9.3gをメタノール500ml に懸濁さ
せ、 4時間加熱還流させた。次いで溶媒メタノールを3/
5 程度留去し、沈殿物を濾取してヒドラゾン化合物を収
率69％で得た。
1.9g 及び4-フォルミル- 1,3-ベンゼンジスルホン酸 2
ナトリウム塩一水和物9.3gをメタノール500ml に懸濁さ
せ、 4時間加熱還流させた。次いで溶媒メタノールを3/
5 程度留去し、沈殿物を濾取してヒドラゾン化合物を収
率69％で得た。
【００１９】得られたヒドラゾン化合物7.4gを250ml の
水に溶解し、 5℃に冷却した。別にp-ヨードアニリンを
常法によりジアゾ化しヒドラゾン水溶液に加えた。この
反応混合液を内温 0〜5 ℃に保持しながら、NaOH2.4gを
水20ml溶解した水溶液を滴下し、滴下終了後一夜室温で
撹拌した。反応混合液に塩酸を加え、生じた沈殿物を濾
取した。得られた粗生成物は水- テトラヒドロフランで
精製を行ない、47％の収率でホルマザンを得た。
水に溶解し、 5℃に冷却した。別にp-ヨードアニリンを
常法によりジアゾ化しヒドラゾン水溶液に加えた。この
反応混合液を内温 0〜5 ℃に保持しながら、NaOH2.4gを
水20ml溶解した水溶液を滴下し、滴下終了後一夜室温で
撹拌した。反応混合液に塩酸を加え、生じた沈殿物を濾
取した。得られた粗生成物は水- テトラヒドロフランで
精製を行ない、47％の収率でホルマザンを得た。
【００２０】得られたホルマザン4.5gをメタノール150m
l に溶解し、濃塩酸5.2ml 及び亜硝酸ブチル3.2gを加
え、室温で一夜撹拌した。次いでメタノールを留去し、
残渣にテトラヒドロフランを加え、生じた沈殿を濾取し
た。粗生成物をメタノール- テトラヒドロフランで精製
し、51％の収率でテトラソリウム塩を得た。
l に溶解し、濃塩酸5.2ml 及び亜硝酸ブチル3.2gを加
え、室温で一夜撹拌した。次いでメタノールを留去し、
残渣にテトラヒドロフランを加え、生じた沈殿を濾取し
た。粗生成物をメタノール- テトラヒドロフランで精製
し、51％の収率でテトラソリウム塩を得た。
【００２１】得られた化合物の元素分析結果を、同様に
して得られた化合物ａ及びｂと共に表１に示す。
して得られた化合物ａ及びｂと共に表１に示す。
【００２２】
【表１】
【００２３】実施例２ 化合物ｃ0.1mM 及び1-メトキシ-5- メチルフェナジニウ
ムメチルスルフェート（以下1-メトキシＰＭＳと略記す
る）5 μM を含有する50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0 ）
5ml に、5mM の還元型ニコチン酸アミドアデニンジヌク
レオチド（以下ＮＡＤＨと略記する）をそれぞれ 0、1
0、30及び50μl 加え、 5分間室温で反応させた後、吸
光度を測定した。得られた吸収スペクトルを図１にａ〜
ｄで示す。図１においてａ〜ｄはそれぞれ上記ＮＡＤＨ
添加量の 0〜50μl に対応する。
ムメチルスルフェート（以下1-メトキシＰＭＳと略記す
る）5 μM を含有する50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0 ）
5ml に、5mM の還元型ニコチン酸アミドアデニンジヌク
レオチド（以下ＮＡＤＨと略記する）をそれぞれ 0、1
0、30及び50μl 加え、 5分間室温で反応させた後、吸
光度を測定した。得られた吸収スペクトルを図１にａ〜
ｄで示す。図１においてａ〜ｄはそれぞれ上記ＮＡＤＨ
添加量の 0〜50μl に対応する。
【００２４】次いで各測定試料にそれぞれ4M水酸化ナト
リウム水溶液を 100μl を添加し、再度吸光度を測定し
た。得られた吸収スペクトルは図１にそれぞれａ〜ｄに
対応してａ’〜ｄ’で示す。水酸化ナトリウム添加前の
吸収スペクトルの極大は 433nmであったが、水酸化ナト
リウム添加後は 580nmに移行していた。
リウム水溶液を 100μl を添加し、再度吸光度を測定し
た。得られた吸収スペクトルは図１にそれぞれａ〜ｄに
対応してａ’〜ｄ’で示す。水酸化ナトリウム添加前の
吸収スペクトルの極大は 433nmであったが、水酸化ナト
リウム添加後は 580nmに移行していた。
【００２５】実施例３ 化合物ｃ0.1mM 及び1-メトキシＰＭＳ5 μM を含有する
50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0 ）5ml に、5mM ＮＡＤＨ
をそれぞれ 0、10、20、30、40及び50μl 添加し、 5分
間室温で反応させた後吸光度を測定した。その後、4M水
酸化ナトリウムを 100μl 添加し、再度吸光度を測定し
た。ＮＡＤＨ濃度と 433nm及び 580nmにおける吸光度と
の関係を図２に示す。両者ともＮＡＤＨと吸光度との間
には原点を通る直線性の検量線が得られた。
50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0 ）5ml に、5mM ＮＡＤＨ
をそれぞれ 0、10、20、30、40及び50μl 添加し、 5分
間室温で反応させた後吸光度を測定した。その後、4M水
酸化ナトリウムを 100μl 添加し、再度吸光度を測定し
た。ＮＡＤＨ濃度と 433nm及び 580nmにおける吸光度と
の関係を図２に示す。両者ともＮＡＤＨと吸光度との間
には原点を通る直線性の検量線が得られた。
【００２６】
【発明の効果】本発明の水溶性テトラゾリウム化合物を
用いることにより、得られるホルマザンの水溶性がさら
に向上し、測定機器への沈着がなく、自動分析装置によ
る測定が可能であり、またpHにより吸収スペクトルのが
異なり、高感度の測定が可能である。
用いることにより、得られるホルマザンの水溶性がさら
に向上し、測定機器への沈着がなく、自動分析装置によ
る測定が可能であり、またpHにより吸収スペクトルのが
異なり、高感度の測定が可能である。
【図１】本発明のテトラゾリウム化合物による生成ホル
マザンの吸光スペクトル。
マザンの吸光スペクトル。
【図２】吸光スペクトル測定により得られた還元型ニコ
チン酸アミドアデニンジヌクレオチドの検量線。
チン酸アミドアデニンジヌクレオチドの検量線。
【手続補正書】
【提出日】平成６年４月１８日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の名称
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の名称】 新規水溶性テトラゾリウム化合物 ─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年７月１日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【書類名】 明細書
【発明の名称】 新規水溶性テトラゾリウム化合物
【特許請求の範囲】
【化１】 （式中、Ｒ1 及びＲ2 はそれぞれ独立に水素原子又はニ
トロ基で、Ｍはアルカリ金属又はアンモニウムである）
で示される新規水溶性テトラゾリウム化合物。
トロ基で、Ｍはアルカリ金属又はアンモニウムである）
で示される新規水溶性テトラゾリウム化合物。
【化２】 （式中、Ｒ1 及びＲ2 はそれぞれ独立に水素原子又はニ
トロ基で、Ｍはアルカリ金属又はアンモニウムである）
で示される新規水溶性テトラゾリウム化合物を用いるこ
とを特徴とする脱水素酵素の定量方法。
トロ基で、Ｍはアルカリ金属又はアンモニウムである）
で示される新規水溶性テトラゾリウム化合物を用いるこ
とを特徴とする脱水素酵素の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規水溶性テトラゾリウ
ム化合物に関し、特に脱水素酵素と反応させて生成した
ホルマザンの吸光度により脱水素酵素を定量分析する方
法に関するものである。
ム化合物に関し、特に脱水素酵素と反応させて生成した
ホルマザンの吸光度により脱水素酵素を定量分析する方
法に関するものである。
【０００２】乳酸脱水素酵素（以下、ＬＤＨと略称す
る）、アルコール脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素
などの各種脱水素酵素は従来テトラゾリウム塩を用いて
定量分析が行なわれていた。
る）、アルコール脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素
などの各種脱水素酵素は従来テトラゾリウム塩を用いて
定量分析が行なわれていた。
【０００３】すなわち、テトラゾリウム塩は、これら各
種脱水素酵素の作用により遊離した水素を中間電子運搬
体を介して受容しホルマザンとなる。そのホルマザンの
吸光度を測定することにより脱水素酵素を定量すること
ができる。
種脱水素酵素の作用により遊離した水素を中間電子運搬
体を介して受容しホルマザンとなる。そのホルマザンの
吸光度を測定することにより脱水素酵素を定量すること
ができる。
【０００４】特に、これらの脱水素酵素のうちＬＤＨは
全ての体細胞に分布し、特に心筋、肝臓、骨格筋、腎臓
に多く、心筋梗塞、悪性腫瘍、肝疾患、進行性筋萎縮、
血管内溶血、巨赤芽球性貧血などの疾患の場合には、血
清ＬＤＨ活性が著しく上昇することが知られている。従
って血中のＬＤＨ活性を測定することにより、臨床上、
診断に対する極めて有意義な知見を得ることができる。
この目的の水素受容体としては、従来 3,3'-［3,3'- ジ
メトキシ-( 1,1'-ビフェニル)- 4,4'-ジイル］- ビス
［2-( 4-ニトロフェニル)-5-フェニル- 2Hテトラゾリウ
ム塩化物］（以下ニトロＴＢと略称する）などが一般的
に用いられている。
全ての体細胞に分布し、特に心筋、肝臓、骨格筋、腎臓
に多く、心筋梗塞、悪性腫瘍、肝疾患、進行性筋萎縮、
血管内溶血、巨赤芽球性貧血などの疾患の場合には、血
清ＬＤＨ活性が著しく上昇することが知られている。従
って血中のＬＤＨ活性を測定することにより、臨床上、
診断に対する極めて有意義な知見を得ることができる。
この目的の水素受容体としては、従来 3,3'-［3,3'- ジ
メトキシ-( 1,1'-ビフェニル)- 4,4'-ジイル］- ビス
［2-( 4-ニトロフェニル)-5-フェニル- 2Hテトラゾリウ
ム塩化物］（以下ニトロＴＢと略称する）などが一般的
に用いられている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、このニ
トロＴＢが水素を受容して生じるホルマザンは水に溶け
ず、実用上不便であった。特に自動分析においては、生
成したホルマザンがチューブやセルなど計測系に付着す
る難点があった。これらの欠点を除去するためには、水
溶性のホルマザンを生成するテトラゾリウム塩を使用す
ることが必要となっていた。
トロＴＢが水素を受容して生じるホルマザンは水に溶け
ず、実用上不便であった。特に自動分析においては、生
成したホルマザンがチューブやセルなど計測系に付着す
る難点があった。これらの欠点を除去するためには、水
溶性のホルマザンを生成するテトラゾリウム塩を使用す
ることが必要となっていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】このような問題を解決す
るために、水溶性のテトラゾリウム化合物がいくつか提
案されている（特開昭56-61366号、 特開昭56-61367号各
公報）。これらはいずれも水溶性のホルマザンを生成
し、自動分析装置での利用が可能であるが、本発明者ら
は、溶解性の良好なホルマザンを生じさせる化合物につ
いてさらに研究を重ねた結果、上記とは異なる特定の水
溶性テトラゾリウム化合物が優れた水素受容体で、且つ
このものから生じるホルマザンが水溶性で、自動分析装
置への付着や沈殿を起こさない測定が可能なことを見出
した。
るために、水溶性のテトラゾリウム化合物がいくつか提
案されている（特開昭56-61366号、 特開昭56-61367号各
公報）。これらはいずれも水溶性のホルマザンを生成
し、自動分析装置での利用が可能であるが、本発明者ら
は、溶解性の良好なホルマザンを生じさせる化合物につ
いてさらに研究を重ねた結果、上記とは異なる特定の水
溶性テトラゾリウム化合物が優れた水素受容体で、且つ
このものから生じるホルマザンが水溶性で、自動分析装
置への付着や沈殿を起こさない測定が可能なことを見出
した。
【０００７】すなわちこのような化合物は、一般式
（１）、
（１）、
【化３】 （式中、Ｒ1 及び Ｒ2 はそれぞれ独立に水素原子又は
ニトロ基で、Ｍはアルカリ金属又はアンモニウムであ
る）で示される新規水溶性テトラゾリウム化合物であ
る。
ニトロ基で、Ｍはアルカリ金属又はアンモニウムであ
る）で示される新規水溶性テトラゾリウム化合物であ
る。
【０００８】上記一般式（１）から生じるホルマザンは
酸性から中性の状態では 430〜440nmに極大吸収を有す
る黄色のホルマザンであるが、pH12以上では 580〜590
nmに極大吸収を有する青色のホルマザンとなる。そのた
め、生成したホルマザンのpHを調整することにより 2波
長領域での測定が可能であり、特に長波長領域での測定
は、ビリルビンやヘモグロビンなどの生体成分の妨害を
受け難く、安定した測定が可能であり、臨床検査上有意
義である。
酸性から中性の状態では 430〜440nmに極大吸収を有す
る黄色のホルマザンであるが、pH12以上では 580〜590
nmに極大吸収を有する青色のホルマザンとなる。そのた
め、生成したホルマザンのpHを調整することにより 2波
長領域での測定が可能であり、特に長波長領域での測定
は、ビリルビンやヘモグロビンなどの生体成分の妨害を
受け難く、安定した測定が可能であり、臨床検査上有意
義である。
【０００９】本発明の前記一般式（１）の化合物は常法
によって製造することができる。例えば、次の一般式
（２）
によって製造することができる。例えば、次の一般式
（２）
【００１０】
【化４】
【００１１】（式中 Ｒ1 、Ｒ2 はそれぞれ独立に水素
原子又はニトロ基を表わす）で示されるフェニルヒドラ
ジン類にアルデヒド化合物をアルコール溶媒中で反応さ
せて、一般式（３）
原子又はニトロ基を表わす）で示されるフェニルヒドラ
ジン類にアルデヒド化合物をアルコール溶媒中で反応さ
せて、一般式（３）
【００１２】
【化５】
【００１３】（式中 Ｒ1 、Ｒ2 は前と同じ）で示され
るヒドラゾンを得、次いで対応するジアゾニウム塩を水
溶媒中塩基性条件下で反応させて一般式（４）
るヒドラゾンを得、次いで対応するジアゾニウム塩を水
溶媒中塩基性条件下で反応させて一般式（４）
【００１４】
【化６】
【００１５】（式中 Ｒ1 、Ｒ2 は前と同じ）で示され
るホルマザンを得る。ここで塩基性化剤としては水酸化
ナトリウム、水酸化カリウムなどが用いられる。
るホルマザンを得る。ここで塩基性化剤としては水酸化
ナトリウム、水酸化カリウムなどが用いられる。
【００１６】次いで得られた一般式（４）のホルマザン
を亜硝酸ブチル又は次亜塩素酸ナトリウム等の酸化剤を
用いアルコール溶媒中で酸化し、前記一般式（１）のテ
トラゾリウム化合物を得ることができる。
を亜硝酸ブチル又は次亜塩素酸ナトリウム等の酸化剤を
用いアルコール溶媒中で酸化し、前記一般式（１）のテ
トラゾリウム化合物を得ることができる。
【００１７】
【実施例】以下の実施例においては一般式（１）のＲ1
及びＲ2 の両者が水素（化合物ａ）、いずれか一方が N
O 2 （化合物ｂ）及び両者が NO 2 （化合物ｃ）のものを
合成し、脱水酵素を反応させた時の吸収スペクトルを示
すが、本発明はその利用に月これらの実施例に限定され
るものではない。
及びＲ2 の両者が水素（化合物ａ）、いずれか一方が N
O 2 （化合物ｂ）及び両者が NO 2 （化合物ｃ）のものを
合成し、脱水酵素を反応させた時の吸収スペクトルを示
すが、本発明はその利用に月これらの実施例に限定され
るものではない。
【００１８】実施例１ （化合物ｃの合成）2,4-ジニトロフェニルヒドラジン1
1.9g 及び4-フォルミル- 1,3-ベンゼンジスルホン酸 2
ナトリウム塩−水和物9.3gをメタノール500ml に懸濁さ
せ、 4時間加熱還流させた。次いで溶媒メタノールを3/
5 程度留去し、沈殿物を濾取してヒドラゾン化合物を収
率69％で得た。
1.9g 及び4-フォルミル- 1,3-ベンゼンジスルホン酸 2
ナトリウム塩−水和物9.3gをメタノール500ml に懸濁さ
せ、 4時間加熱還流させた。次いで溶媒メタノールを3/
5 程度留去し、沈殿物を濾取してヒドラゾン化合物を収
率69％で得た。
【００１９】得られたヒドラゾン化合物7.4gを250ml の
水に溶解し、 5℃に冷却した。別にp-ヨードアニリンを
常法によりジアゾ化しヒドラゾン水溶液に加えた。この
反応混合液を内温 0〜5 ℃に保持しながら、NaOH 2.4g
を水20ml溶解した水溶液を滴下し、滴下終了後一夜室温
で撹拌した。反応混合液に塩酸を加え、生じた沈殿物を
濾取した。得られた粗生成物は水- テトラヒドロフラン
で精製を行ない、47％の収率でホルマザンを得た。
水に溶解し、 5℃に冷却した。別にp-ヨードアニリンを
常法によりジアゾ化しヒドラゾン水溶液に加えた。この
反応混合液を内温 0〜5 ℃に保持しながら、NaOH 2.4g
を水20ml溶解した水溶液を滴下し、滴下終了後一夜室温
で撹拌した。反応混合液に塩酸を加え、生じた沈殿物を
濾取した。得られた粗生成物は水- テトラヒドロフラン
で精製を行ない、47％の収率でホルマザンを得た。
【００２０】得られたホルマザン4.5gをメタノール150m
l に溶解し、濃塩酸5.2ml 及び亜硝酸ブチル3.2gを加
え、室温で一夜撹拌した。次いでメタノールを留去し、
残渣にテトラヒドロフランを加え、生じた沈殿を濾取し
た。粗生成物をメタノール- テトラヒドロフランで精製
し、51％の収率でテトラソリウム塩を得た。
l に溶解し、濃塩酸5.2ml 及び亜硝酸ブチル3.2gを加
え、室温で一夜撹拌した。次いでメタノールを留去し、
残渣にテトラヒドロフランを加え、生じた沈殿を濾取し
た。粗生成物をメタノール- テトラヒドロフランで精製
し、51％の収率でテトラソリウム塩を得た。
【００２１】得られた化合物の元素分析結果を、同様に
して得られた化合物ａ及びｂと共に表１に示す。
して得られた化合物ａ及びｂと共に表１に示す。
【００２２】
【表１】
【００２３】実施例２ 化合物ｃ0.1mM 及び1-メトキシ-5- メチルフェナジニウ
ムメチルスルフェート（以下1-メトキシＰＭＳと略記す
る）5 μM を含有する50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0 ）
5ml に、5mM の還元型ニコチン酸アミドアデニンジヌク
レオチド（以下ＮＡＤＨと略記する）をそれぞれ 0、1
0、30及び50μl 加え、 5分間室温で反応させた後、吸
光度を測定した。得られた吸収スペクトルを図１にａ〜
ｄで示す。図１においてａ〜ｄはそれぞれ上記ＮＡＤＨ
添加量の 0〜50μl に対応する。
ムメチルスルフェート（以下1-メトキシＰＭＳと略記す
る）5 μM を含有する50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0 ）
5ml に、5mM の還元型ニコチン酸アミドアデニンジヌク
レオチド（以下ＮＡＤＨと略記する）をそれぞれ 0、1
0、30及び50μl 加え、 5分間室温で反応させた後、吸
光度を測定した。得られた吸収スペクトルを図１にａ〜
ｄで示す。図１においてａ〜ｄはそれぞれ上記ＮＡＤＨ
添加量の 0〜50μl に対応する。
【００２４】次いで各測定試料にそれぞれ4M水酸化ナト
リウム水溶液を 100μl を添加し、再度吸光度を測定し
た。得られた吸収スペクトルは図１にそれぞれａ〜ｄに
対応してａ’〜ｄ’で示す。水酸化ナトリウム添加前の
吸収スペクトルの極大は 433nmであったが、水酸化ナト
リウム添加後は 580nmに移行していた。
リウム水溶液を 100μl を添加し、再度吸光度を測定し
た。得られた吸収スペクトルは図１にそれぞれａ〜ｄに
対応してａ’〜ｄ’で示す。水酸化ナトリウム添加前の
吸収スペクトルの極大は 433nmであったが、水酸化ナト
リウム添加後は 580nmに移行していた。
【００２５】実施例３ 化合物ｃ0.1mM 及び1-メトキシＰＭＳ5 μM を含有する
50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0 ）5ml に、5mM ＮＡＤＨ
をそれぞれ 0、10、20、30、40及び50μl 添加し、 5分
間室温で反応させた後吸光度を測定した。その後、4M水
酸化ナトリウムを 100μl 添加し、再度吸光度を測定し
た。ＮＡＤＨ濃度と 433nm及び 580nmにおける吸光度と
の関係を図２に示す。両者ともＮＡＤＨと吸光度との間
には原点を通る直線性の検量線が得られた。
50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0 ）5ml に、5mM ＮＡＤＨ
をそれぞれ 0、10、20、30、40及び50μl 添加し、 5分
間室温で反応させた後吸光度を測定した。その後、4M水
酸化ナトリウムを 100μl 添加し、再度吸光度を測定し
た。ＮＡＤＨ濃度と 433nm及び 580nmにおける吸光度と
の関係を図２に示す。両者ともＮＡＤＨと吸光度との間
には原点を通る直線性の検量線が得られた。
【００２６】
【発明の効果】本発明の水溶性テトラゾリウム化合物を
用いることにより、得られるホルマザンの水溶性がさら
に向上し、測定機器への沈着がなく、自動分析装置によ
る測定が可能であり、またpHにより吸収スペクトルのが
異なり、高感度の測定が可能である。
用いることにより、得られるホルマザンの水溶性がさら
に向上し、測定機器への沈着がなく、自動分析装置によ
る測定が可能であり、またpHにより吸収スペクトルのが
異なり、高感度の測定が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のテトラゾリウム化合物による生成ホル
マザンの吸光スペクトル。
マザンの吸光スペクトル。
【図２】吸光スペクトル測定により得られた還元型ニコ
チン酸アミドアデニンジヌクレオチドの検量線。
チン酸アミドアデニンジヌクレオチドの検量線。
Claims (2)
- 【請求項１】 一般式（１）、 【化１】 （式中、Ｒ1 及びＲ2 はそれぞれ独立に水素原子又はニ
トロ基で、Ｍはアルカリ金属又はアンモニウムである）
で示される水溶性テトラゾリウム化合物。 - 【請求項２】 テトラゾリウム化合物を用いて脱水素酵
素を定量する方法において、テトラゾリウム化合物とし
て一般式（１）、 【化２】 （式中、Ｒ1 及びＲ2 はそれぞれ独立に水素原子又はニ
トロ基で、Ｍはアルカリ金属又はアンモニウムである）
で示される水溶性テトラゾリウム化合物を用いることを
特徴とする脱水素酵素の定量方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23925393A JP2592436B2 (ja) | 1993-09-01 | 1993-09-01 | 新規水溶性テトラゾリウム化合物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23925393A JP2592436B2 (ja) | 1993-09-01 | 1993-09-01 | 新規水溶性テトラゾリウム化合物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0770092A true JPH0770092A (ja) | 1995-03-14 |
| JP2592436B2 JP2592436B2 (ja) | 1997-03-19 |
Family
ID=17042016
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23925393A Expired - Lifetime JP2592436B2 (ja) | 1993-09-01 | 1993-09-01 | 新規水溶性テトラゾリウム化合物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2592436B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997038985A1 (en) * | 1996-04-18 | 1997-10-23 | Dojindo Laboratories Co., Ltd. | Water-soluble tetrazolium salt compounds |
| JPH11196896A (ja) * | 1998-01-06 | 1999-07-27 | Doujin Kagaku Kenkyusho:Kk | スーパーオキシドジスムターゼ活性および活性酸素の測定法 |
| WO2005023786A1 (ja) * | 2003-07-14 | 2005-03-17 | Dojindo Laboratories | 水溶性テトラゾリウム化合物 |
| JP2019502655A (ja) * | 2015-11-09 | 2019-01-31 | ハンジョウ ジェニファー バイオーテック カンパニー リミテッドＨａｎｇｚｈｏｕ Ｊｅｎｎｉｆｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ． | モノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物及び用途 |
| WO2024202448A1 (ja) * | 2023-03-27 | 2024-10-03 | テルモ株式会社 | 生体成分濃度測定試薬、測定方法およびセンサ |
-
1993
- 1993-09-01 JP JP23925393A patent/JP2592436B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997038985A1 (en) * | 1996-04-18 | 1997-10-23 | Dojindo Laboratories Co., Ltd. | Water-soluble tetrazolium salt compounds |
| US6063587A (en) * | 1996-04-18 | 2000-05-16 | Dojindo Laboratories Co., Ltd. | Water-soluble tetrazolium salt compounds |
| JPH11196896A (ja) * | 1998-01-06 | 1999-07-27 | Doujin Kagaku Kenkyusho:Kk | スーパーオキシドジスムターゼ活性および活性酸素の測定法 |
| WO2005023786A1 (ja) * | 2003-07-14 | 2005-03-17 | Dojindo Laboratories | 水溶性テトラゾリウム化合物 |
| CN100396671C (zh) * | 2003-07-14 | 2008-06-25 | 株式会社同仁化学研究所 | 水溶性四唑鎓化合物 |
| JP2019502655A (ja) * | 2015-11-09 | 2019-01-31 | ハンジョウ ジェニファー バイオーテック カンパニー リミテッドＨａｎｇｚｈｏｕ Ｊｅｎｎｉｆｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ． | モノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物及び用途 |
| WO2024202448A1 (ja) * | 2023-03-27 | 2024-10-03 | テルモ株式会社 | 生体成分濃度測定試薬、測定方法およびセンサ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2592436B2 (ja) | 1997-03-19 |
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