JPS603396B2

JPS603396B2 - テトラゾリウム塩化合物およびその化合物を用いる脱水素酵素の吸光光度定量法

Info

Publication number: JPS603396B2
Application number: JP21461881A
Authority: JP
Inventors: 匡宣志賀
Original assignee: DOJINDO LAB
Current assignee: DOJINDO LAB
Priority date: 1981-12-26
Filing date: 1981-12-26
Publication date: 1985-01-28
Also published as: JPS58113181A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は新規なテトラゾリゥム塩化合物およびその化合
物を用いる脱水素酵素の吸光光度定量法に関し、更に詳
しくは一般式で表わされるテトラゾリウム塩化合物およ
びその化合物を用いる脱水素酵素の吸光光度定量法に関
する。

ただし式中の記号の意味はつぎのようである。Ｙ：炭素
数２〜４の直鎖式、または側鎖を有しても良く、さらに
必要に応じ１個の水酸基を有してもよいアルキレン基。

ＲＩ：炭素数１〜４のアルキル基、またはヒドロキシェ
チル基。

Ｒ２：炭素数１〜４で、必要に応じ１〜２個の水酸基ま
たは１個のフェニル基を有しても良いアルキル基。

×：塩素原子、または臭素原子。

Ｗ：水素原子。

Ｚ：４，５−ジメチルー２−チアゾリル基。

なお、のベンゼン環における置換位置は３位または４位である。

本発明に係わる上記一股式（１）を有する化合物は文献
未萩の新規物質であり、水素を受容してホルマザンを生
ずるため脱水素酵素の定量に用いることができるという
大きな特色がある。

すなわち従来のテトラゾＩＪゥム塩化合物が脱水素酵素
の定量のために用いられていたが、これが還元されて生
じるホルマザンは、非水溶性のため実用上かなり不便で
あった。ところで、今日ではホルマザン生成反応を利用
した脱水素酵素定量は広く普及し、特に臨床検査の分丹
野では極めて繁用される様になり、そのため現実には自
動分析器を用いての定量操作を行う機会が増してきてい
る。

ところがその際に公知のテトラゾリウム塩を用いた場合
は、操作中に生ずるホルマザンが水に不溶のため、これ
が分析器のチューブ内壁等に付着したり枕着したりする
ため検査の自動化に大きな支障となっている。このよう
な欠点を解消するためには、水に可溶性のホルマザンを
作ることが先決である。本発明はこの問題の解決に成功
したものである。以下に、本発明化合物の様に水素を受
容して生じるホルマザンが水溶性である事が臨床検査上
いかに有用であるかを今少し詳しく説明する。脱水素酵
素、たとえば乳酸脱水素酵素（以下「ＬＤＨ」と略記す
る。

）、アルコール脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素等
は、これまでテトラゾＩＪゥム塩化合物を用いて定量分
析が行われてきた。すなわちテトラゾリウム塩化合物は
、これら各種脱水素酵素の作用により遊離した水素を中
間電子運搬体を介して受容することによりホルマザンを
生成する。そして、ここに生成したホルマザンの吸光度
を測定することにより脱水素酵素が定量できるのである
。ところで、これらの脱水素酵素のうちＬＤＨはすべて
の体細胞に分布し特に心筋、肝臓、骨格筋、腎臓等に多
く存在し、かつ心筋梗塞、悪性種傷、肝疾患、進行性筋
委縮、血管内溶血、巨赤芽球性貧血などの疾患の場合に
は血清ＬＤＨ活性が著しく上昇することが知られている
。従って血中のＬＤＨ活性を測定することにより臨床上
、上記疾患の診断に対する極めて有意義な知見を得るこ
とができる。従釆は上述の様にテトラゾリウム塩化合物
、たとえば３，３′−（３，３−ジメトキシー４．４′
−ビフエニ、リレン）ービス〔２−（４−ニトロフエニ
ル）−５−フェニル‐汎テトラゾＩＪゥム塩化合物〕（
以下「ニト。

ＴＢ」と略記する。）などがこの目的のための水素受容
体として一般に用いられている。しかしながらこのニト
ロＴＢが水素を受容して生じるホルマザンは水に全く溶
けず、これは実用上いろんな問題があった。特に自動分
析法の普及に伴い、オートアナライザーが繁用されてい
るが、その場合生成ホルマザンが分析器のチューブ等へ
沈着し、爾後の操作に支障を及ぼすことは致命的な欠点
であった。そのため現在では界面活性剤等の分散剤を用
いて該不溶性ホルマザンを分散させた上で吸光光度定量
しているが、これは単に操作を繁雑化するのみにとどま
らず、測定値に誤差を生じさせる原因ともなり極めて好
ましからぬことであった。これらの欠点を除去するため
には、生成ホルマザンが水に溶け易い化合物を使用する
必要がある。

その目的のためには、たとえば３一（４−ヨードフエニ
ル）一２−（４ーニトロフエニル）一５‐フェニル‐が
テトラゾリゥム塩化物のような、生成ホルマザンの水溶
性を若干上昇させた化合物も用いられているが、吸光光
度測定の目的のためには、該ホルマザンにおいてもなお
水溶性が小さすぎ実用上満足すべきもではない。本発明
者らは、溶解性が良く安定した測定値を与えるホルマザ
ンを生じさせる化合物について種々の研究を重ねた結果
、前記一般式（１）を有する化合物が水溶性の優れた水
素受容体であることを見いだして本発明を完成した。

従来においても、化合物の水溶性化法についてはいるい
ると検討されており、中でもスルホン酸基の導入による
水溶性の向上はある程度試みられている。

しかしこのようなスルホン酸議導体は精製が困難である
事や、テトラゾリウム塩の状態ではむしろ水溶性が低下
するなどの問題点があった。これに対し、４級アンモニ
ウム塩を側鎖に持つ本発明化合物は、これから生じるホ
ルマザンが水溶性に富むという極めて有利な特徴を有す
るため、この化合物を用いることによって自動分析装置
への付着や沈殿の心配がなく、安定した測定値が得られ
る定量方法が確立されたのである。本発明に係わる前記
一般式（１）を有する化合物は常法により製造すること
ができる。例をあげると、３（または４）ーヒドロキシ
ベンズアルデヒドーこ塩基性下でェピクロルヒドリン、
または炭素数が２ないし４のジハロゲン化アルキルを反
応させ、対応する３（または４）−アルコキシベンズア
ルデヒド類をまず合成する。なお、オキシラン擬を有す
るアルコキシベンズアルデヒド化合物の場合は、水袷下
で塩酸、臭素酸と反応させハロヒドリン化合物としても
良い。さて、ここで得られたアルコキシベンズアルデヒ
ド類は、次いでこれにフェニルヒドラジン類を作用させ
、対応するヒドラゾン化合物とする。このうちオキシラ
ン環を有するヒドラゾン化合物は、ジアルキルアミンと
反応させ側鎖に３級アミンを有するヒドラゾン化合物と
する。また側鎖にハロゲンを有するヒドラゾン化合物は
ジアルキルアミンと反応させても良い。次いで、ヒドラ
ゾン化合物を塩基性下で４，５ージメチルチアゾールの
ジアゾニウム塩とカップリング反応を行いホルマザンと
した後、側鎖に３級ァミンを有するホルマザンはハロゲ
ン化ァルキルと、また側鎖にハロゲンを持つホルマザン
は３級ァミンと反応させ、対応する４級アンモニウム塩
化合物を合成する。

次いで、このような４級アンモニウム塩を側鎖に有する
ホルマザンを亜硝酸ｎーブチル，Ｎ−ブロムコハク酸ィ
ミド（以下「Ｎ茂」と略記する。）等の酸化剤を用いて
酸化し、目的とするテトラゾリウム塩化合物を得る。こ
れらの詳細は実施例においてさらに具体的にのべる。次
に、このようにして得られた一般式（１）を有する化合
物を用いる脱水素酵素の吸光光度定量法につき説明する
。

すなわち、脱水素酵素をリン酸緩衝液やトリスー塩酸緩
衝液などの中で該酵素に対応する基質と接触させる。こ
こで生成する水素は一旦ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド（以下「ＮＡＤ」と略記する。）に受容され、
次いでジアフオラーゼやフエナジンメトサルフエート（
以下「ＰＭＳ」と略記する。）などの中間電子運搬体を
介して、本発明のテトラゾリウム塩化合物に水素が受容
され、ここにおいて従来のホルマザンには認められない
高度の水溶性をもったホルマザンを生成する。そのため
、生じた反応溶液の吸光度を直接測定することのみによ
って、正確に目的酵素の活性値を定量することができる
。以下に実施例をあげて本発明を更に具体的に説明する
が、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例に制
約されるものではない。

実施例１（一般式（１）においてＹがエチレン、Ｒ１，Ｒ２がエ
チル基、×が臭素原子、Ｗが水素原子、Ｚが４，５−ジ
メチルー２ーチアゾリル基で、置換ァルコキシ基がベン
ゼン環の４位に置換した化合物の合成法。

）４−ヒドロキシベンズアルデヒド３５夕と１，２ージ
プロモエタン２７０夕をテトラヒドロフランに溶かし、
これに水酸化ナトリウム溶液を加え、加熱還流させた後
減圧蒸留して４一（２ープロモェトキシ）ペンスアルデ
ヒド４１．４夕を得る。

次に、この４一（２−プロモエトキシ）ペンズアルデヒ
ド４０夕とフエニルヒドラジン１８．９夕をメタノール
中で加温混合し４−（２ープロモェトキシ）ペンズアル
デヒドフェニルヒドラゾン４２．６夕を合成する。得ら
れたヒドラゾン１８夕をテトラヒドロフラン、メタノー
ルの混合溶媒に溶解し、冷却しながら、水酸化カリウム
溶液を加える。これに２ーアミノ−４，５ジメチルチア
ゾールの塩酸塩９．４夕と塩酸、亜硝酸ナトリウムを用
いて合成したジアゾニゥム塩酸塩水溶液を少しづつ滴下
し２時間境拝する。反応溶液にメタノールを加え一夜放
置して炉過し、３一（４，５−ジメチルー２−チアゾリ
ル）一２ーフヱニルー５一〔４一（２−プロモェトキシ
）フェニル〕ホルマザン２１夕を得る。得られたホルマ
ザン２０夕をトリェチルアミンとテトラヒドロフランの
混合溶媒に溶かし加熱還流して新出してきた結晶を炉取
し、ホルマザン側鎖の４級アンモニウム塩１３．４夕を
得る。この４級アンモニウム塩１２夕をメタノールに溶
解し、これにＮ斑４．６夕を少しずつ加え潰拝する。反
応溶液に活性炭を加え炉過し炉液を減圧濃縮して、目的
とするテトラゾリウム臭化物を得る。融点１６７〜１
７１℃（分解）元素分析値（％）Ｃ数日３４Ｎ６０ＳＢｒ２０日
Ｎ理論値４８．９１５．３７１３．１６実
測値４９．３８５．４１１２．９６１日−
ＮＭＲ（ムーＤＭＳＯ）６胸（ＴＭＳ）１．１０（ｔ，
Ｊ＝６．７ＨＺ，班）３．１２〜４．３５（ｍ，１冊
）７．０８〜７．７５（ｍ，岬）８．０６〜８，５
１（ｍ，瓜）ＩＲ（肌−１）２８７０（一ＣＨ）１５８５（−Ｃ＝Ｎ−）１４６０
（一ＣＨ）１２２０（一ＣＯＣ−）実施例２（一般式（１）におけるＹがブチレン、ＲＩがメチル基
、Ｒ２がペンジル基、Ｘが臭素原子、Ｗが水素原子、Ｚ
が４，５−ジメチル−２−チアゾリル基で、置換ァルコ
キシ基がベンゼン環の３位に置換した化合物の合成法。

）３−ヒドロキシベンズアルデヒド４６夕と、１，４ー
ジクロロブタン２４０夕をテトラヒドロフランに溶かし
、これに水酸化ナトリウム溶液を加え加熱還流させた後
減圧蒸留して、３−（４ークロロブトキシ）ペンズアル
デヒド４５夕を得る。

次にこの３−（４−クロロブトキシ）ペンズアルデヒド
１０夕とフェニルヒドラジン５．１夕をメタノール中で
加温混合し一夜放置したあと氷袷下に冷却し損拝しなが
らジメチルアミン１０．６夕をメタノールに溶かして加
え反応させ、徐々に室温にもどした後溶媒留去し、３−
（４−ジメチルアミノプトキシ）ペンズアルデヒドフエ
ニルヒドラゾン１３．５夕を得る。得られたヒドラゾン
６夕をメタノールに溶解し、冷却しながら水酸化カリウ
ム溶液を加える。これに２ーアミノ−４，５ジメチルチ
アゾールの塩酸塩３．２夕と塩酸、亜硝酸を用いて合成
したジアゾニウム塩酸塩水溶液を徐々に滴下し２時間損
拝する。反応溶液に水を加え一夜放置したあと炉過し、
３−（４，５−ジメチル−２ーチアゾ１」ル）一２ーフ
エニル−５一〔３一（４−ジメチルアミノブトキシ）フ
エニル〕ホルマザン４．６夕を得る。臭化ペンジル２５
夕とホルマザン４夕をテトラヒドロフランに溶かし、酸
化鋼粉末を加えて加熱還流して結晶を炉取し、メタノー
ルに溶かして炉過し炉液を減圧濃縮してホルマザン側鎖
の４級アンモニウム塩２．５夕を得る。この４級アンモ
ニウム塩２夕をメタノールに溶解し、それにＮ斑０．６
９夕を加え損泣する。反応溶液に活性炭を加え炉過し炉
液を濃縮して、目的とするテトラゾリウム臭化物を得る
。融点１５９〜１６３ｏｏ（分解）元素分析値（％）ＣＭ日２６Ｎ６０ＳＢｒ２，舷Ｏ○
ＨＮ理論値５１．８２５．３３１１．
７０実測値５１．７７５．２１１１．９４Ｉ
Ｈ−ＮＭＲ（６６ −ＤＭＳＯ）６脚（ＴＭＳ）１．０
５〜１．７２（ｍ，山Ｈ）３１．５〜４．４６（ｍ，
１９Ｈ）４．９１（Ｓ，２Ｈ）６．８５〜７．４６
（ｍ，山Ｈ）７．５２〜８．００（ｍ，班）８．０５
〜８．５１（ｍ，印）ＩＲ（肌−１）２球０（一ＣＨ）
１６００（−ＣニＮ一）１４６５（一ＣＨ）１２１
５（一ＣＯＣ−）実施例３（実施例２で得られた化合物を用いる脱水素酵素の吸光
光度定量法。

）３７０に予備加溢したグリシン−乳酸塩溶液（グリシ
ン＝０．７２％，ｄｌ−乳酸＝０．４２％，ｐＨ＝９．
６）４の‘に同加温で３０分間予備加溢した標準血清を
０〜８２．肌Ｕ／の‘加え横拝する。

１分後に実施例２で得られた化合物の０．０７０６％水
溶液を１泌加えて櫨拝し、さらに１分後ＮＡＤ−ＰＭＳ
溶液（ＮＡＤ＝２％，ＰＭＳ＝０．２％，午血清アルブ
ミン蟹分５＝０．１５％，ｐＨ＝７．４のリン酸緩衝液
）０．１叫を加えて櫨拝し、３７０に正確に８分間保つ
。

ただちに０．１規定塩酸１の‘を加え、５１節帆で吸光
度を測定する。対照には血清の代わりに精製水を用いた
。その結果は図１に示す様に原点を通り良好な直線性の
検量線が得られ、これにより血清の酵素活性を正確に求
めることができる。実施例４（一般式（１）においてＹが２−ヒドロキシプロピレン
、Ｒ１，Ｒ２が２ーヒドロキシヱチル基、×が臭素原子
、Ｗが水素原子、Ｚが４，５ージメチルー２−チァゾリ
ル基で、置換アルコキシ基がベンゼン環の４位に置換し
た化合物の合成法。

）４ーヒドロキシベンズアルデヒド１１４夕とヱピクロ
ルヒドリン１７０夕をテトラヒドロフランに溶かし、こ
れに水酸化ナトリウム溶液を加え加熱還流させた後減圧
蒸留して、４ーオキシランメトキシベンズアルデヒド１
００夕を得る。次に、この４ーオキシランメトキシベン
ズアルデヒド２５夕とフェニルヒドラジン１５．２夕を
メタノール中で加温混合し、４ーオキシランメトキシベ
ンズアルデヒドフェニルヒドラゾン３１２を合成する。
このヒドラゾン１５夕をメタノールに分散させ損梓しな
がらジヱタノールアミン１８夕を加え加温後、更にメタ
ノールを加え冷却しながら水酸化カリウム溶液を加える
。これに２ーアミノー４，５−ジメチルチアゾールの塩
酸塩９．５夕と塩酸、亜硝酸ナトリウムを用いて合成し
たジアゾニウム塩酸塩水溶液を少しずつ滴下し損拝する
。反応溶液に水を加え一夜放置して炉過し、３一（４，
５ージメチルー２ーチアゾリル）一２ーフエニル−５一
｛４一〔２ーヒドロキシ−３ージ（２ーヒドロキシヱチ
ル）アミノプロポキシ〕フエニル｝ホルマザン１８．３
夕を得る。得られたホルマザン１１夕をエチレンブロモ
ヒドリンとテトラヒドロフランの混合溶媒に溶かし加熱
濃伴して濃縮し、それにテトラヒドロフランを加えてホ
ルマザン側鎖の４級アンモニウム塩９．６夕を得る。こ
の４級アンモニウム塩８．５夕をメタノールに溶解し、
それにＮＢＳ３．１夕を少しずつ加え境拝する。反応溶
液に活性炭を加え炉遇し、炉液を濃縮して目的とするテ
トラゾリウム臭化物を得る。融点１１６〜１２２０元素分析値（％）Ｃ玖日３６Ｎ５０５Ｂｒ２０日
Ｎ理論値４８．３７５．４１１０．４５実
測値４８．７４５．５６１０．０２１日−
ＮＭＲ（ムーＤＭＳＯ）６脚（ＴＭＳ）３，２６〜４．
６３（ｍ，２砥）７．０２〜７，５９（ｍ，』Ｈ）
８．００〜８．４５（ｍ，粥）ＩＲ（仇−１＞３２４０（一ＯＨ）２８７５（一ＣＨ）１６００（
一Ｃ＝Ｎ−）１４５０＜−ＣＨ）

【図面の簡単な説明】

図１は実施例３によるところの５１．跡ｍにおける吸光
度とＬＤＨ活性値の関係を表わす。第１図

Claims

【特許請求の範囲】１一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされるテトラゾリウム塩化合物。ただし式中の記号の意味はつぎのようである。Ｙ：炭素
数２〜４の直鎖式、または側鎖を有しても良く、さらに
必要に応じ１個の水酸基を有しても良いアルキレン基。Ｒ＾１：炭素数１〜４のアルキル基、またはヒドロキシ
エチル基。Ｒ＾２：炭素数１〜４で、必要に応じ１〜２個の水酸基
、または１個のフエニル基を有しても良いアルキル基。Ｘ：塩素原子、または臭素原子。Ｗ：水素原子。Ｚ：４，５−ジメチル−２−チアゾリル基。なお、▲数式、化学式、表等があります▼ のベンゼン環における置換位置は３位、または４位である。２一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされるテトラゾリウム塩化合物を用いる脱水素
酵素の吸光光度定量法。ただし式中の記号の意味はつぎのようである。Ｙ：炭素
数２〜４の直鎖式、または側鎖を有しても良く、さらに
必要に応じ１個の水酸基を有しても良いアルキレン基。Ｒ＾１：炭素数１〜４のアルキル基、またはヒドロキシ
エチル基。Ｒ＾２：炭素数１〜４で、必要に応じ１〜２個の水酸基
または１個のフエニル基を有しても良いアルキル基。Ｘ：塩素原子、または臭素原子。Ｗ：水素原子。Ｚ：４，５−ジメチル−２−チアゾリル基。なお、▲数式、化学式、表等があります▼ のベンゼン環における置換位置は３位、または４位である。