JPH0780904B2 - 新規ポリペプチド，ｄｎａおよびその用途 - Google Patents
新規ポリペプチド，ｄｎａおよびその用途Info
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- JPH0780904B2 JPH0780904B2 JP2057751A JP5775190A JPH0780904B2 JP H0780904 B2 JPH0780904 B2 JP H0780904B2 JP 2057751 A JP2057751 A JP 2057751A JP 5775190 A JP5775190 A JP 5775190A JP H0780904 B2 JPH0780904 B2 JP H0780904B2
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- glycoprotein
- ribosome
- cyanoborohydride
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/655—Somatostatins
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/22—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は新規ポリペプチド，それをコードするDNAおよ
びその用途に関する。
びその用途に関する。
従来の技術 上皮成長因子（epidermal growth factor,EGF）や神経
成長因子（nerve growth factor,NGF）の発見以来、多
くの細胞成長因子が単離され、その構造が明らかにされ
ている。
成長因子（nerve growth factor,NGF）の発見以来、多
くの細胞成長因子が単離され、その構造が明らかにされ
ている。
細胞成長因子は細胞の分化および増殖の機構の解明に役
立ち、さらにヒトEGFのように医薬として期待されるも
のもあり、その研究は近年ますますさかんになりつゝあ
る。
立ち、さらにヒトEGFのように医薬として期待されるも
のもあり、その研究は近年ますますさかんになりつゝあ
る。
ヒトNGFの遺伝子は単離されているが、組換えDNA技術を
用いる大量生産に関する報告はほとんどない。
用いる大量生産に関する報告はほとんどない。
発明が解決しようとする課題 動物細胞の成長作用等が有する新規ポリペプチドを得れ
ば、新しい研究に途を開くことができる。
ば、新しい研究に途を開くことができる。
また、上記作用等を有する新規ポリペプチドは、医薬と
して利用することが期待できる。
して利用することが期待できる。
課題を解決するための手段 本発明者らは、新規のポリペプチドを見出す目的で、神
経成長因子（NGF）をコードするDNAをプローブとして用
いて、これとハブリダイズするDNAをヒトグリオーマのc
DNAライブラリーの中からクローニングした。その結
果、新規ポリペプチドをコードするDNA（cDNA）を取得
することに成功した。当該cDNAを宿主により発現させ、
当該ポリペプチドを生産することが期待される。また当
該ポリペプチドは動物細胞の分化，成長，増殖，生存維
持などに関連する研究のための試薬として用いることが
期待され、また医薬としても期待される。
経成長因子（NGF）をコードするDNAをプローブとして用
いて、これとハブリダイズするDNAをヒトグリオーマのc
DNAライブラリーの中からクローニングした。その結
果、新規ポリペプチドをコードするDNA（cDNA）を取得
することに成功した。当該cDNAを宿主により発現させ、
当該ポリペプチドを生産することが期待される。また当
該ポリペプチドは動物細胞の分化，成長，増殖，生存維
持などに関連する研究のための試薬として用いることが
期待され、また医薬としても期待される。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究した
結果、本発明を完成した。
結果、本発明を完成した。
すなわち、本発明は（１）、分子中にアミノ酸配列 TyrAlaGluHisLysSerHisArgGlyGluTyrSerValCysAspSerGl
uSerLeuTrpValThrAspLysSerSerAlaIleAspIleArgGlyHisG
lnValThrValLeuGlyGluIleLysThrGlyAsnSerProValLysGln
TyrPheTyrGluThrArgCysLysGluAlaArgProValLysAsnGlyCy
sArgGlyIleAspAspLysHisTrpAsnSerGlnCysLysThrSerGlnT
hrTyrValArgAlaLeuThrSerGluAsnAsnLysLeuValGlyTrpArg
TrpIleArgIleAspThrSerCysValCysAlaLeuSerArgLysIleGl
yArg 〔以下、このアミノ酸配列を式［II］と略称することも
ある。〕を含有し、動物細胞の分化、成長、増殖あるい
は生存維持の作用を有するポリペプチド（Ｉ）。
uSerLeuTrpValThrAspLysSerSerAlaIleAspIleArgGlyHisG
lnValThrValLeuGlyGluIleLysThrGlyAsnSerProValLysGln
TyrPheTyrGluThrArgCysLysGluAlaArgProValLysAsnGlyCy
sArgGlyIleAspAspLysHisTrpAsnSerGlnCysLysThrSerGlnT
hrTyrValArgAlaLeuThrSerGluAsnAsnLysLeuValGlyTrpArg
TrpIleArgIleAspThrSerCysValCysAlaLeuSerArgLysIleGl
yArg 〔以下、このアミノ酸配列を式［II］と略称することも
ある。〕を含有し、動物細胞の分化、成長、増殖あるい
は生存維持の作用を有するポリペプチド（Ｉ）。
（２）、上記（１）記載のポリペプチド（Ｉ）をコード
するDNA, （３）、上記（２）記載のDNAを含有するベクター， （４）、上記（３）記載のベクターで形質転換された形
質転換体，および （５）、上記（４）記載の形質転換体を培地に培養し、
培養物中に上記（１）記載のポリペプチド（Ｉ）を生成
蓄積せしめることを特徴とする当該ポリペプチド（Ｉ）
の製造法である。
するDNA, （３）、上記（２）記載のDNAを含有するベクター， （４）、上記（３）記載のベクターで形質転換された形
質転換体，および （５）、上記（４）記載の形質転換体を培地に培養し、
培養物中に上記（１）記載のポリペプチド（Ｉ）を生成
蓄積せしめることを特徴とする当該ポリペプチド（Ｉ）
の製造法である。
本発明のポリペプチド（Ｉ）としては、式［II］のアミ
ノ酸配列であるポリペプチド，式［II］のアミノ酸配列
のＣ末端にさらにスレオニン残基を有するアミノ酸配列
であるポリペプチドが挙げられる。さらに、本発明のポ
リペプチド（Ｉ）としては、式［II］のアミノ酸配列の
Ｎ末端に数個のアミノ酸残基を有するおよび／またはそ
のＣ末端に数個のアミノ酸残基を有するポリペプチドが
挙げられる。
ノ酸配列であるポリペプチド，式［II］のアミノ酸配列
のＣ末端にさらにスレオニン残基を有するアミノ酸配列
であるポリペプチドが挙げられる。さらに、本発明のポ
リペプチド（Ｉ）としては、式［II］のアミノ酸配列の
Ｎ末端に数個のアミノ酸残基を有するおよび／またはそ
のＣ末端に数個のアミノ酸残基を有するポリペプチドが
挙げられる。
後述の実施例において、大腸菌により発現されたポリペ
プチド（Ｉ）は、Ｃ末端にThrが付加した次のアミノ酸
配列（II′）： TyrAlaGluHisLysSerHisArgGlyGluTyrSerValCysAspSerGl
uSerLeuTrpValThrAspLysSerSerAlaIleAspIleArgGlyHisG
lnValThrValLeuGlyGluIleLysThrGlyAsnSerProValLysGln
TyrPheTyrGluThrArgCysLysGluAlaArgProValLysAsnGlyCy
sArgGlyIleAspAspLysHisTrpAsnSerGlnCysLysThrSerGlnT
hrTyrValArgAlaLeuThrSerGluAsnAsnLysLeuValGlyTrpArg
TrpIleArgIleAspThrSerCysValCysAlaLeuSerArgLysIleGl
yArgThr （II′） を有するものが製造された。
プチド（Ｉ）は、Ｃ末端にThrが付加した次のアミノ酸
配列（II′）： TyrAlaGluHisLysSerHisArgGlyGluTyrSerValCysAspSerGl
uSerLeuTrpValThrAspLysSerSerAlaIleAspIleArgGlyHisG
lnValThrValLeuGlyGluIleLysThrGlyAsnSerProValLysGln
TyrPheTyrGluThrArgCysLysGluAlaArgProValLysAsnGlyCy
sArgGlyIleAspAspLysHisTrpAsnSerGlnCysLysThrSerGlnT
hrTyrValArgAlaLeuThrSerGluAsnAsnLysLeuValGlyTrpArg
TrpIleArgIleAspThrSerCysValCysAlaLeuSerArgLysIleGl
yArgThr （II′） を有するものが製造された。
また、後述の実施例において、動物細胞で発現されたポ
リペプチド（Ｉ）は、アミノ酸配列（II）または（I
I′）を有すると考えられる。
リペプチド（Ｉ）は、アミノ酸配列（II）または（I
I′）を有すると考えられる。
本発明のポリペプチド（Ｉ）としては、上記したポリペ
プチドの他に、同一の活性を有する上記ポリペプチドの
一部；または上記のアミノ酸配列の一部が他のアミノ酸
もしくはアミノ酸配列で置換，付加もしくは挿入されか
つ同じ活性を有するポリペプチドも含まれる。
プチドの他に、同一の活性を有する上記ポリペプチドの
一部；または上記のアミノ酸配列の一部が他のアミノ酸
もしくはアミノ酸配列で置換，付加もしくは挿入されか
つ同じ活性を有するポリペプチドも含まれる。
なお、遺伝子組換え技術を用いてポリペプチド（Ｉ）を
製造する場合に、該ポリペプチド（Ｉ）をコードする遺
伝子の上流の開始コンドATGに対応するメチオニン残基
がポリペプチド（Ｉ）のＮ末端に付加しているものでも
よい。
製造する場合に、該ポリペプチド（Ｉ）をコードする遺
伝子の上流の開始コンドATGに対応するメチオニン残基
がポリペプチド（Ｉ）のＮ末端に付加しているものでも
よい。
本発明のポリペプチド（Ｉ）をコードするDNAは、たと
えば（ｉ）ポリペプチド（Ｉ）産生細胞からメッセンジ
ャーRNA（mRNA）を分離し、（ii）該mRNAから単鎖の相
補DNA（cDNA）を、次いで二重鎖DNAを合成し、（iii）
該相補DNAをファージまたはプラスミドに組み込み、（i
v）得られた組み換えファージまたはプラスミドで宿主
を形質転換し、（ｖ）得られた形質転換体を培養後、形
質転換体から適当な方法、たとえばプラークハイブリダ
イゼーションまたはコロニーハイブリダイゼーションに
より目的とするDNAを含有するファージまたプラスミド
を単離し、（vi）そのファージまたはプラスミドから目
的とするクローン化DNAを切り出し、（vii）該クローン
化DNAを適当なプラスミドにサブクローニングすること
により取得することができる。
えば（ｉ）ポリペプチド（Ｉ）産生細胞からメッセンジ
ャーRNA（mRNA）を分離し、（ii）該mRNAから単鎖の相
補DNA（cDNA）を、次いで二重鎖DNAを合成し、（iii）
該相補DNAをファージまたはプラスミドに組み込み、（i
v）得られた組み換えファージまたはプラスミドで宿主
を形質転換し、（ｖ）得られた形質転換体を培養後、形
質転換体から適当な方法、たとえばプラークハイブリダ
イゼーションまたはコロニーハイブリダイゼーションに
より目的とするDNAを含有するファージまたプラスミド
を単離し、（vi）そのファージまたはプラスミドから目
的とするクローン化DNAを切り出し、（vii）該クローン
化DNAを適当なプラスミドにサブクローニングすること
により取得することができる。
ポリペプチド（Ｉ）をコードするmRNAは、種々のポリペ
プチド（Ｉ）産生細胞、例えばヒト，ラットなどの動物
の細胞，組織，器官から、より具体的にはヒトグリオー
マ，ヒトグリア細胞，ヒト胎盤，ラットグリオーマ，腎
臓，肝臓，心臓，脳，脾臓，胸腺，肺，顎下腺などから
得ることができる。
プチド（Ｉ）産生細胞、例えばヒト，ラットなどの動物
の細胞，組織，器官から、より具体的にはヒトグリオー
マ，ヒトグリア細胞，ヒト胎盤，ラットグリオーマ，腎
臓，肝臓，心臓，脳，脾臓，胸腺，肺，顎下腺などから
得ることができる。
ポリペプチド（Ｉ）産生細胞からmRNAを調製する方法と
しては、たとえばグアニジンチオシアネート法［Chirgw
in,J.M.ら，バイオケミストリー（Biochemistry），18,
5294（1979）］などが挙げられる。
しては、たとえばグアニジンチオシアネート法［Chirgw
in,J.M.ら，バイオケミストリー（Biochemistry），18,
5294（1979）］などが挙げられる。
このようにして得られたmRNAを鋳型とし、逆転写酵素を
用いて、たとえばOkayama,H.らの方法〔モレキュラー
セルラー アンド バイオロジー（Mol.Cell.Biol.），
２,161（1982）および同誌，３,280（1983）〕やGuble
r,U.とHoffman,B.J.の方法〔ジーン（Gene），25,263
（1983）〕に従いcDNAを合成し、得られたcDNAをプラス
ミドやファージに組み込み、ヒトcDNAのライブラリーを
調製する。
用いて、たとえばOkayama,H.らの方法〔モレキュラー
セルラー アンド バイオロジー（Mol.Cell.Biol.），
２,161（1982）および同誌，３,280（1983）〕やGuble
r,U.とHoffman,B.J.の方法〔ジーン（Gene），25,263
（1983）〕に従いcDNAを合成し、得られたcDNAをプラス
ミドやファージに組み込み、ヒトcDNAのライブラリーを
調製する。
cDNAを組み込むプラスミドとしては、たとえばpBR322
〔ジーン（Gene），２,95（1977）〕,pBR325〔ジーン
（Gene），４,121（1978）〕,pUC12〔ジーン（Gene），
19,259（1982）〕,pUC13〔ジーン（Gene），19,259（19
82）〕,pUC18〔Gene,33,103（1985）〕,pUC19〔Gene,3
3,103（1985）〕,pCU118〔Methods in Enzymology,153,
3（1987）〕,pCU119〔Methods in Enzymology,153,3（1
987）〕などが挙げられるが、その他のものであって
も、宿主内で複製保持されるものであれば、いずれも用
いることができる。また、cDNAを組み込むファージベク
ターとしては、たとえばλgt 11〔Young,R.,and Davis.
R.,プロシージング オブ ザ ナショナル アカデミ
ー オブ サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）U.S.A.8
0,1194（1983）〕などが挙げられるが、その他のもので
あっても、宿主内で増殖できるものであればよい。
〔ジーン（Gene），２,95（1977）〕,pBR325〔ジーン
（Gene），４,121（1978）〕,pUC12〔ジーン（Gene），
19,259（1982）〕,pUC13〔ジーン（Gene），19,259（19
82）〕,pUC18〔Gene,33,103（1985）〕,pUC19〔Gene,3
3,103（1985）〕,pCU118〔Methods in Enzymology,153,
3（1987）〕,pCU119〔Methods in Enzymology,153,3（1
987）〕などが挙げられるが、その他のものであって
も、宿主内で複製保持されるものであれば、いずれも用
いることができる。また、cDNAを組み込むファージベク
ターとしては、たとえばλgt 11〔Young,R.,and Davis.
R.,プロシージング オブ ザ ナショナル アカデミ
ー オブ サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）U.S.A.8
0,1194（1983）〕などが挙げられるが、その他のもので
あっても、宿主内で増殖できるものであればよい。
プラスミドにcDNAを組み込む方法としては、たとえばMa
niatis,T.らモレキュラー クローニング，ア・ラボラ
トリー・マニュアル（Molecular Cloning,A Laboratory
Manual）,Cold Spring Harbor Laboratory,p.239（198
2）に記載の方法などが挙げられる。また、ファージベ
クターにcDNAを組み込む方法としては、たとえばHyunh,
T.V.らの方法（デイー エヌ エー クローニング、ア
プラクティカル アプローチ（DNA cloning,a practi
cal approach），１,49（1985）〕などが挙げられる。
このようにして得られたプラスミドやファージ・ベクタ
ーは、適当な宿主たとえば大腸菌などに導入する。
niatis,T.らモレキュラー クローニング，ア・ラボラ
トリー・マニュアル（Molecular Cloning,A Laboratory
Manual）,Cold Spring Harbor Laboratory,p.239（198
2）に記載の方法などが挙げられる。また、ファージベ
クターにcDNAを組み込む方法としては、たとえばHyunh,
T.V.らの方法（デイー エヌ エー クローニング、ア
プラクティカル アプローチ（DNA cloning,a practi
cal approach），１,49（1985）〕などが挙げられる。
このようにして得られたプラスミドやファージ・ベクタ
ーは、適当な宿主たとえば大腸菌などに導入する。
上記大腸菌の例としてはたとえばEscherichiacoli K12
DH1〔プロシージング オブ ザ ナショナル アカデ
ミー オブ サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci）U.S.A.
60,160（1968）〕,JM103〔ヌクレイック アシッズ リ
サーチ（Nucl.Acids Res.），９,309（1981）〕,JA221
〔ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー（J.
Mol.Biol.），120,517（1978）〕,HB101〔ジャーナル
オブ モレキュラー バイオロジー（J.Mol.Biol.），4
1,459（1969）〕,C600〔ジェネティックス（Genetic
s），39,440（1954）〕などが挙げられる。
DH1〔プロシージング オブ ザ ナショナル アカデ
ミー オブ サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci）U.S.A.
60,160（1968）〕,JM103〔ヌクレイック アシッズ リ
サーチ（Nucl.Acids Res.），９,309（1981）〕,JA221
〔ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー（J.
Mol.Biol.），120,517（1978）〕,HB101〔ジャーナル
オブ モレキュラー バイオロジー（J.Mol.Biol.），4
1,459（1969）〕,C600〔ジェネティックス（Genetic
s），39,440（1954）〕などが挙げられる。
プラスミドで宿主を形質転換する方法としては、たとえ
ばManiatis,T.ら，モレキュラー クローニング（Molec
ular Cloning）,Cold Spring Harbor Laboratory,p.239
（1982）に記載のカルシウムクロライド法あるいはカル
シウムクロライド／ルビジウムクロライド法などが挙げ
られる。また、ファージ・ベクターにはたとえば、増殖
させた大腸菌にインビトロパッケージング法を用いて導
入することができる。
ばManiatis,T.ら，モレキュラー クローニング（Molec
ular Cloning）,Cold Spring Harbor Laboratory,p.239
（1982）に記載のカルシウムクロライド法あるいはカル
シウムクロライド／ルビジウムクロライド法などが挙げ
られる。また、ファージ・ベクターにはたとえば、増殖
させた大腸菌にインビトロパッケージング法を用いて導
入することができる。
ポリペプチド（Ｉ）cDNAを含有するcDNAライブラリーは
上記の方法などで得ることが出来るが、市販品として購
入することも可能であり、例えばヒトグリオーマ由来の
cDNAライブラリー，ヒト胎盤由来のcDNAライブラリーな
どはクローンテックラボラトリーズ（Clontech Labora
tories,Inc.,米国）から入手することが出来る。cDNAラ
イブラリーからポリペプチド（Ｉ）cDNAをクローニング
する方法としては、例えばラベル化したプローブを用い
たプラークハイブリダイゼーション法またはコロニーハ
イブリダイゼーション法（Maniatis et al,Molecular C
loning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Labo
ratory,1982〕などが挙げられる。
上記の方法などで得ることが出来るが、市販品として購
入することも可能であり、例えばヒトグリオーマ由来の
cDNAライブラリー，ヒト胎盤由来のcDNAライブラリーな
どはクローンテックラボラトリーズ（Clontech Labora
tories,Inc.,米国）から入手することが出来る。cDNAラ
イブラリーからポリペプチド（Ｉ）cDNAをクローニング
する方法としては、例えばラベル化したプローブを用い
たプラークハイブリダイゼーション法またはコロニーハ
イブリダイゼーション法（Maniatis et al,Molecular C
loning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Labo
ratory,1982〕などが挙げられる。
上記のハイブリダイゼーションにおけるプローブに用い
るDNAとしては、ポリペプチド（Ｉ）をコードするDNAと
ハイブリダイズするDNAであれば何でもよく、例えばNGF
をコードするcDNA,ゲノムDNA,化学合成DNAおよびこれら
の部分DNA,あるいはNGFのアミノ酸配列に基づいて化学
合成したオリゴヌクレオチド等が挙げられる。上記のNG
Fとしては、例えばマウスNGF〔Proc.Matl.Acad.Sci.,6
8,2417（1971）;Nature,302,538（1983）〕，ヒトNGF
〔Nature,303,821（1983）〕，その他の動物のNGFが挙
げられる。
るDNAとしては、ポリペプチド（Ｉ）をコードするDNAと
ハイブリダイズするDNAであれば何でもよく、例えばNGF
をコードするcDNA,ゲノムDNA,化学合成DNAおよびこれら
の部分DNA,あるいはNGFのアミノ酸配列に基づいて化学
合成したオリゴヌクレオチド等が挙げられる。上記のNG
Fとしては、例えばマウスNGF〔Proc.Matl.Acad.Sci.,6
8,2417（1971）;Nature,302,538（1983）〕，ヒトNGF
〔Nature,303,821（1983）〕，その他の動物のNGFが挙
げられる。
このようにしてクローン化されたポリペプチド（Ｉ）cD
NAは必要があればプラスミド、例えばpBR322,pUC12,pUC
13,pUC18,pUC19,pUC118,pUC119などにサブクローニング
してポリペプチド（Ｉ）cDNAを得ることができる。
NAは必要があればプラスミド、例えばpBR322,pUC12,pUC
13,pUC18,pUC19,pUC118,pUC119などにサブクローニング
してポリペプチド（Ｉ）cDNAを得ることができる。
このようにして得られたDNAの塩基配列を、たとえばマ
キサム・ギルバート（Maxam−Gilbert）法〔Maxam,A.M.
and Gilbert,W.,プロシージング オブ ザ ナショナ
ル アカデミー オブ サイエンス（Proc.Natl.Acad.S
ci.）U.S.A.74,560（1977）〕あるいはジデオキシ法〔M
essing,J.ら ヌクレイック アシッズ リサーチ（Nuc
l.Acids Res.），９,309（1981）〕によって決定し、
ポリペプチド（Ｉ）cDNAの存在を確認する。その結果、
ポリペプチド（Ｉ）をコードする全領域がカバーされて
いない場合には、該DNA断片をプローブとして用いたプ
ラークハイブリダイゼーションまたはコロニーハイブリ
ダイゼーションによってcDNAの再クローニングを行い、
カバーされていない領域を得る。
キサム・ギルバート（Maxam−Gilbert）法〔Maxam,A.M.
and Gilbert,W.,プロシージング オブ ザ ナショナ
ル アカデミー オブ サイエンス（Proc.Natl.Acad.S
ci.）U.S.A.74,560（1977）〕あるいはジデオキシ法〔M
essing,J.ら ヌクレイック アシッズ リサーチ（Nuc
l.Acids Res.），９,309（1981）〕によって決定し、
ポリペプチド（Ｉ）cDNAの存在を確認する。その結果、
ポリペプチド（Ｉ）をコードする全領域がカバーされて
いない場合には、該DNA断片をプローブとして用いたプ
ラークハイブリダイゼーションまたはコロニーハイブリ
ダイゼーションによってcDNAの再クローニングを行い、
カバーされていない領域を得る。
以上のようにして、ポリペプチド（Ｉ）をコードするDN
Aが得られる。
Aが得られる。
本発明のポリペプチド（Ｉ）をコードするDNAを含むDNA
は、上記の方法の他に、ヒト，ラット，マウスなどのゲ
ノムDNAのライブラリーからのクローニングによって得
ることもできる。また、このようにしてクローニングさ
れたDNAの塩基配列から明らかにされたポリペプチド
（Ｉ）のアミノ酸配列に基づいてポリペプチド（Ｉ）を
コードするDNAを化学合成することによって取得しても
よい。
は、上記の方法の他に、ヒト，ラット，マウスなどのゲ
ノムDNAのライブラリーからのクローニングによって得
ることもできる。また、このようにしてクローニングさ
れたDNAの塩基配列から明らかにされたポリペプチド
（Ｉ）のアミノ酸配列に基づいてポリペプチド（Ｉ）を
コードするDNAを化学合成することによって取得しても
よい。
本発明のポリペプチド（Ｉ）をコードするDNAとして
は、ポリペプチド（Ｉ）をコードするDNAであれば何れ
でもよく、具体例としてはたとえば次の式［III］の塩
基配列で表わされるDNA,次の式［III］の塩基配列の
３′末端にさらにACAが付加されたDNAが挙げられるが、
この場合、これらのDNAの一部の塩基が除去あるいは置
換されたものでもよい。また、これらのDNAに他の塩基
が付加あるいは挿入されたものでもよい。なお、塩基の
除去，置換，付加においては、アミノ酸の発現に対応す
るコドン単位で行なわれるのが好ましい。
は、ポリペプチド（Ｉ）をコードするDNAであれば何れ
でもよく、具体例としてはたとえば次の式［III］の塩
基配列で表わされるDNA,次の式［III］の塩基配列の
３′末端にさらにACAが付加されたDNAが挙げられるが、
この場合、これらのDNAの一部の塩基が除去あるいは置
換されたものでもよい。また、これらのDNAに他の塩基
が付加あるいは挿入されたものでもよい。なお、塩基の
除去，置換，付加においては、アミノ酸の発現に対応す
るコドン単位で行なわれるのが好ましい。
TACGCGGAGC ATAAGAGTCA CCGAGGGGAG TACTCGGTAT GTGACA
GTGA GAGTCTGTGG GTGACCGACA AGTCATCGGC CATCGACATT C
GGGGACACC AGGTCACGGT GCTGGGGGAG ATCAAAACGG GCAACTC
TCC CGTCAAACAA TATTTTTATG AAACGCGATG TAAGGAAGCC AG
GCCGGTCA AAAACGGTTG CAGGGGTATT GATGATAAAC ACTGGAAC
TC TCAGTGCAAA ACATCCCAAA CCTACGTCCG AGCACTGACT TCA
GAGAACA ATAAACTCGT GGGCTGGCGG TGGATACGGA TAGACACGT
C CTGTGTGTGT GCCTTGTCGA GAAAAATCGG AAGA 〔以下、この塩基配列を式［III］と略称することもあ
る。〕 上記のようにして得られたポリペプチド（Ｉ）をコード
するDNAは目的によりそのまゝ、あるいは制限酵素で切
断して使用することができる。
GTGA GAGTCTGTGG GTGACCGACA AGTCATCGGC CATCGACATT C
GGGGACACC AGGTCACGGT GCTGGGGGAG ATCAAAACGG GCAACTC
TCC CGTCAAACAA TATTTTTATG AAACGCGATG TAAGGAAGCC AG
GCCGGTCA AAAACGGTTG CAGGGGTATT GATGATAAAC ACTGGAAC
TC TCAGTGCAAA ACATCCCAAA CCTACGTCCG AGCACTGACT TCA
GAGAACA ATAAACTCGT GGGCTGGCGG TGGATACGGA TAGACACGT
C CTGTGTGTGT GCCTTGTCGA GAAAAATCGG AAGA 〔以下、この塩基配列を式［III］と略称することもあ
る。〕 上記のようにして得られたポリペプチド（Ｉ）をコード
するDNAは目的によりそのまゝ、あるいは制限酵素で切
断して使用することができる。
本発明で言うポリペプチド（Ｉ）を取得する方法として
は、ヒトを含む動物の主体から単離する方法、ペプ
チド合成によって調製する方法，遺伝子組換え技術を
用いて生産する方法，などが挙げられるが、工業的には
が望ましい。
は、ヒトを含む動物の主体から単離する方法、ペプ
チド合成によって調製する方法，遺伝子組換え技術を
用いて生産する方法，などが挙げられるが、工業的には
が望ましい。
遺伝子組換え技術を用いてポリペプチド（Ｉ）を生産す
るための発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば
細菌，放線菌，酵母，糸状菌，昆虫細胞および動物細胞
の発現系が挙げられる。
るための発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば
細菌，放線菌，酵母，糸状菌，昆虫細胞および動物細胞
の発現系が挙げられる。
発現方法としては、遺伝子産物を細胞内に生成，蓄積
させる方法，遺伝子産物を細胞外に分泌させ、培地中
に蓄積させる方法．遺伝子産物をペリプラズムに分泌
させる方法、などが挙げられる。
させる方法，遺伝子産物を細胞外に分泌させ、培地中
に蓄積させる方法．遺伝子産物をペリプラズムに分泌
させる方法、などが挙げられる。
上記のおよびにおいて、ポリペプチド（Ｉ）を分泌
させるためには、ポリペプチド（Ｉ）をコードするDNA
の５′末端にシグナルペプチドをコードするDNAまたは
シグナルペプチドとプロペプチド（プレプロ）をコード
するDNAを連結させる。上記のシグナルペプチドとして
はポリペプチド（Ｉ）を分泌できるものなら何でもよ
く、例えばEscherichia coliのエンテロトキシンのシグ
ナルペプチドおよびその変異体,Bacillus amyloliquefa
ciensの中性プロテアーゼおよびα−アミラーゼのシグ
ナルペプチド、Bacillus brevisのmiddle wall protein
のシグナルペプチド,Saccharomyces cerevisiaeのイン
ベルターゼ，フォスファターゼ，α−ファクターおよび
キラー因子のシグナルペプチド,Aspergillus awamoriの
グルコアミラーゼのシグナルペプチド，ポリペプチド
（Ｉ）のシグナルペプチド卵白リゾチームのシグナルペ
プチドおよびその変異体，ヒトインターロイキン−２の
シグナルペプチド，ヒト，マウス，ラット，ニワトリお
よびウシのNGFのシグナルペプチドなどが挙げられる。
また、プロペプチドとしては、例えばSaccharomyces ce
revisiaeのα−ファクター，キラー因子のプロペプチ
ド,Aspergillus awamoriのグルコアミラーゼのプロペプ
チド，ポリペプチド（Ｉ）のプロペプチド，ヒトエンド
セリン，ヒト，マウス，ラット，ニワトリおよびウシの
NGFのプロペプチドなどが挙げられる。
させるためには、ポリペプチド（Ｉ）をコードするDNA
の５′末端にシグナルペプチドをコードするDNAまたは
シグナルペプチドとプロペプチド（プレプロ）をコード
するDNAを連結させる。上記のシグナルペプチドとして
はポリペプチド（Ｉ）を分泌できるものなら何でもよ
く、例えばEscherichia coliのエンテロトキシンのシグ
ナルペプチドおよびその変異体,Bacillus amyloliquefa
ciensの中性プロテアーゼおよびα−アミラーゼのシグ
ナルペプチド、Bacillus brevisのmiddle wall protein
のシグナルペプチド,Saccharomyces cerevisiaeのイン
ベルターゼ，フォスファターゼ，α−ファクターおよび
キラー因子のシグナルペプチド,Aspergillus awamoriの
グルコアミラーゼのシグナルペプチド，ポリペプチド
（Ｉ）のシグナルペプチド卵白リゾチームのシグナルペ
プチドおよびその変異体，ヒトインターロイキン−２の
シグナルペプチド，ヒト，マウス，ラット，ニワトリお
よびウシのNGFのシグナルペプチドなどが挙げられる。
また、プロペプチドとしては、例えばSaccharomyces ce
revisiaeのα−ファクター，キラー因子のプロペプチ
ド,Aspergillus awamoriのグルコアミラーゼのプロペプ
チド，ポリペプチド（Ｉ）のプロペプチド，ヒトエンド
セリン，ヒト，マウス，ラット，ニワトリおよびウシの
NGFのプロペプチドなどが挙げられる。
上記の方法の他に、他の蛋白とポリペプチド（Ｉ）との
融合蛋白として生産されたのち、適当なプロテアーゼで
切断することによってポリペプチド（Ｉ）を得ることも
できる。
融合蛋白として生産されたのち、適当なプロテアーゼで
切断することによってポリペプチド（Ｉ）を得ることも
できる。
上記のポリペプチド（Ｉ）をコードするDNAを含むDNA、
例えばポリペプチド（Ｉ）をコードするDNA,シグナルペ
プチドとポリペプチド（Ｉ）をコードするDNA,シグナル
ペプチド，プロペプチドとポリペプチド（Ｉ）をコード
するDNAなどの５′末端に開始コドンを、下流に終止コ
ドンを付加し、これをベクター中のプロモーターの下流
に挿入することによってポリペプチド（Ｉ）発現ベクタ
ーを構築する。
例えばポリペプチド（Ｉ）をコードするDNA,シグナルペ
プチドとポリペプチド（Ｉ）をコードするDNA,シグナル
ペプチド，プロペプチドとポリペプチド（Ｉ）をコード
するDNAなどの５′末端に開始コドンを、下流に終止コ
ドンを付加し、これをベクター中のプロモーターの下流
に挿入することによってポリペプチド（Ｉ）発現ベクタ
ーを構築する。
ポリペプチド（Ｉ）の発現に用いるベクターとしては、
各種の宿主で機能するものであれば何でも良く、例えば
大腸菌（E.coli）ではpBR322,pBR325,pUC12,pUC13,pUC1
8,pUC19,pUC118,pUC119,これらの誘導体が、バチルス属
菌としてBacillus subtilisではpUB110,pC194,pE194,pT
B5,これらの誘導体が、Bacillus brevisではpUB110,pHY
481,pC194,pHY500,pNU200,これらの誘導体が、酵母とし
てSaccharomyces cerevisiaeではpSH19,pSH15,これらの
誘導体が、Schizosaccharomyces pombeではpDB248,pPA
−4,これらの誘導体が、動物細胞ではレトロウイルスベ
クター，ワクシニアウイルスベクター，ウシパピローマ
ウイルスベクター,SV40系ベクター（例えばpKSV−10,pS
V2−dhfr,pTB389など）などが挙げられる。
各種の宿主で機能するものであれば何でも良く、例えば
大腸菌（E.coli）ではpBR322,pBR325,pUC12,pUC13,pUC1
8,pUC19,pUC118,pUC119,これらの誘導体が、バチルス属
菌としてBacillus subtilisではpUB110,pC194,pE194,pT
B5,これらの誘導体が、Bacillus brevisではpUB110,pHY
481,pC194,pHY500,pNU200,これらの誘導体が、酵母とし
てSaccharomyces cerevisiaeではpSH19,pSH15,これらの
誘導体が、Schizosaccharomyces pombeではpDB248,pPA
−4,これらの誘導体が、動物細胞ではレトロウイルスベ
クター，ワクシニアウイルスベクター，ウシパピローマ
ウイルスベクター,SV40系ベクター（例えばpKSV−10,pS
V2−dhfr,pTB389など）などが挙げられる。
プロモーターとしては、各種の宿主で機能するものであ
ればいかなるものでもよく、例えばE.coliでは、trpプ
ロモーター,lacプロモーター,tacプロモーター，λPLプ
ロモーター,recAプロモーター,T7プロモーターなどが、
Bacillus subtillisではSPO1プロモーター,P1プロモー
ター，中性プロテアーゼ遺伝子のプロモーターなどが、
Bacillus brevisでは菌体外主要蛋白質遺伝子のプロモ
ーター,SPO1プロモーターなどが、Saccharomyces cerev
isiaeではGLDプロモーター,PHO5プロモーター,GAL10プ
ロモーター,GAL1プロモーター,PGKプロモーター，α−
ファクタープロモーターなどが、Schizosaccharomyces
pombeではGLDプロモーター,SV40プロモーターなどが、
動物細胞ではSV40プロモーター,LTRプロモーター，メタ
ロチオネインプロモーターなどが、それぞれ挙げられ
る。
ればいかなるものでもよく、例えばE.coliでは、trpプ
ロモーター,lacプロモーター,tacプロモーター，λPLプ
ロモーター,recAプロモーター,T7プロモーターなどが、
Bacillus subtillisではSPO1プロモーター,P1プロモー
ター，中性プロテアーゼ遺伝子のプロモーターなどが、
Bacillus brevisでは菌体外主要蛋白質遺伝子のプロモ
ーター,SPO1プロモーターなどが、Saccharomyces cerev
isiaeではGLDプロモーター,PHO5プロモーター,GAL10プ
ロモーター,GAL1プロモーター,PGKプロモーター，α−
ファクタープロモーターなどが、Schizosaccharomyces
pombeではGLDプロモーター,SV40プロモーターなどが、
動物細胞ではSV40プロモーター,LTRプロモーター，メタ
ロチオネインプロモーターなどが、それぞれ挙げられ
る。
発現の効率を高めるために、酵母ではポリペプチド
（Ｉ）をコードするDNAの下流にターミネーター（例、P
GKターミネーター）を用いたり、動物細胞ではエンハン
サー,RNAスプライシングのシグナル，ポリＡ付加のシグ
ナル，選択マーカーなどを用いることが望ましい。
（Ｉ）をコードするDNAの下流にターミネーター（例、P
GKターミネーター）を用いたり、動物細胞ではエンハン
サー,RNAスプライシングのシグナル，ポリＡ付加のシグ
ナル，選択マーカーなどを用いることが望ましい。
発現ベクターを構築する方法自体は公知であり、例えば
Molecular cloning,Cold Spring Harbor Laboratory（1
982）に記載されている。
Molecular cloning,Cold Spring Harbor Laboratory（1
982）に記載されている。
このようにして作製したポリペプチド（Ｉ）発現ベクタ
ーを用いて宿主を形質転換する。
ーを用いて宿主を形質転換する。
宿主としてはEscherichia coli,バチルス属菌（Bacillu
s subtilis,Bacillus brevis）などの細菌,Streptomyce
s lividansなどの放線菌,Saccharomyces cerevisiae,Sc
hizosaccharomyces pombe,Pichia pastorisなどの酵母,
Aspergillus orizae,Aspergillus nidulans,Aspergillu
s nigerなどの糸状菌，サル細胞COS−7,Vero,チャイニ
ーズハムスター細胞（CHO），マウスＬ細胞などの動物
細胞が挙げられる。さらに具体的には、Escherichia co
liではE.coli DH1,E.coli JM103,E.coli JA221,E.coli
HB101,E.coli C600,E.coli MV1184,これらの変異株が、
Bacillus subtilisではB.subtilis MI114,B.subtilis 1
A274,これらの変異株が、Bacillus brevisではB.brevis
47,B. brevis47−5,B.brevis HPD31,これらの変異株が、Sacch
aromyces cerevisiaeではS.cerevisiae AH22R-,S.cerev
isiae NA74−3Aρ−,S.cerevisiae TB39ρ−，これらの
変異株が、Schizosaccharomyces pombeではS.pombe ATC
C38399,S.pombe TH168,これらの変異株が挙げられる。
s subtilis,Bacillus brevis）などの細菌,Streptomyce
s lividansなどの放線菌,Saccharomyces cerevisiae,Sc
hizosaccharomyces pombe,Pichia pastorisなどの酵母,
Aspergillus orizae,Aspergillus nidulans,Aspergillu
s nigerなどの糸状菌，サル細胞COS−7,Vero,チャイニ
ーズハムスター細胞（CHO），マウスＬ細胞などの動物
細胞が挙げられる。さらに具体的には、Escherichia co
liではE.coli DH1,E.coli JM103,E.coli JA221,E.coli
HB101,E.coli C600,E.coli MV1184,これらの変異株が、
Bacillus subtilisではB.subtilis MI114,B.subtilis 1
A274,これらの変異株が、Bacillus brevisではB.brevis
47,B. brevis47−5,B.brevis HPD31,これらの変異株が、Sacch
aromyces cerevisiaeではS.cerevisiae AH22R-,S.cerev
isiae NA74−3Aρ−,S.cerevisiae TB39ρ−，これらの
変異株が、Schizosaccharomyces pombeではS.pombe ATC
C38399,S.pombe TH168,これらの変異株が挙げられる。
ポリペプチド（Ｉ）をコードするDNAを含むDNA,例えば
ポリペプチド（Ｉ）発現プラスミドを用いて宿主を形質
転換する方法は公知であり、例えばCohenらの方法〔Pro
c.Natl.Acad.Sci.U.S.A,69,2110（1972）〕によって、B
acillus subtilisは、例えばプロトプラスト法〔Mol.Ge
n.Genet.,168,111（1979）〕やコンピテント法〔J.Mol.
Biol.,56,209（1971）〕によって、Bacillus brevis
は、例えばTakahashiらの方法〔J.Bacteriol.,156,1130
（1983）〕によって、 Saccharomyces serevisiaeおよび Schizosaccharomyces pombeは例えばHinnenらの方法〔P
roc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,75,1927（1978）〕やリチウ
ム法〔J.Bacteriol.,153,163（1983）〕によって、動物
細胞は例えばGrahamの方法〔Virology,52,456（197
3）〕によってそれぞれ形質転換することができる。
ポリペプチド（Ｉ）発現プラスミドを用いて宿主を形質
転換する方法は公知であり、例えばCohenらの方法〔Pro
c.Natl.Acad.Sci.U.S.A,69,2110（1972）〕によって、B
acillus subtilisは、例えばプロトプラスト法〔Mol.Ge
n.Genet.,168,111（1979）〕やコンピテント法〔J.Mol.
Biol.,56,209（1971）〕によって、Bacillus brevis
は、例えばTakahashiらの方法〔J.Bacteriol.,156,1130
（1983）〕によって、 Saccharomyces serevisiaeおよび Schizosaccharomyces pombeは例えばHinnenらの方法〔P
roc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,75,1927（1978）〕やリチウ
ム法〔J.Bacteriol.,153,163（1983）〕によって、動物
細胞は例えばGrahamの方法〔Virology,52,456（197
3）〕によってそれぞれ形質転換することができる。
以上のようにしてポリペプチド（Ｉ）をコードするDNA
を含むDNAで形質転換された形質転換体が得られる。
を含むDNAで形質転換された形質転換体が得られる。
宿主が細菌，放線菌，酵母，糸状菌である形質転換体を
培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が
適当であり、その中には該形質転換体の成育に必要な炭
素源，窒素源，無機物その他が含有せしめられる。炭素
源としては、たとえばグルコース，デキストリン，可溶
性澱粉，ショ糖など、窒素源としては、たとえばアンモ
ニウム塩類，硝酸塩類，アミノ酸，コーンスティープ，
リカー，ペプトン，ガゼイン，肉エキス，大豆粕，バレ
イショ抽出液などの無機または有機物質，無機物として
は塩化カルシウム，リン酸二水素ナトリウム，塩化マグ
ネシウムなどが挙げられる。
培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が
適当であり、その中には該形質転換体の成育に必要な炭
素源，窒素源，無機物その他が含有せしめられる。炭素
源としては、たとえばグルコース，デキストリン，可溶
性澱粉，ショ糖など、窒素源としては、たとえばアンモ
ニウム塩類，硝酸塩類，アミノ酸，コーンスティープ，
リカー，ペプトン，ガゼイン，肉エキス，大豆粕，バレ
イショ抽出液などの無機または有機物質，無機物として
は塩化カルシウム，リン酸二水素ナトリウム，塩化マグ
ネシウムなどが挙げられる。
培地のpHは約５〜８が望ましい。
宿主がEscherichia coliの場合、用いる培地は、たとえ
ばグルコース，カザミノ酸を含むM9培地〔Miller.J.Ex
p.Mol.Genet.,p.431,Cold Spring Harbor Laboratory,N
ew York,1972〕が好ましい。培養は通常約14〜43℃で約
３〜24時間行い、必要により、通気や攪拌を加えること
もできる。
ばグルコース，カザミノ酸を含むM9培地〔Miller.J.Ex
p.Mol.Genet.,p.431,Cold Spring Harbor Laboratory,N
ew York,1972〕が好ましい。培養は通常約14〜43℃で約
３〜24時間行い、必要により、通気や攪拌を加えること
もできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約30〜40℃で約
16〜96時間行い、必要により通気や攪拌を加えることも
できる。
16〜96時間行い、必要により通気や攪拌を加えることも
できる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地として
は、たとえばBurkholder最小培地〔Bostian.K.L.ら,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA,77,4505（1980）〕が挙げられ
る。培地のpHは約５〜８に調整するのが好ましい。培養
は通常約20℃〜35℃で約24〜144時間行い、必要に応じ
て通気や攪拌を加える。
は、たとえばBurkholder最小培地〔Bostian.K.L.ら,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA,77,4505（1980）〕が挙げられ
る。培地のpHは約５〜８に調整するのが好ましい。培養
は通常約20℃〜35℃で約24〜144時間行い、必要に応じ
て通気や攪拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地と
しては、たとえば約５〜20％胎児牛血清を含むMEM培地
〔Science,122,501（1952）〕,DMEM培地〔Virology,８,
396（1959）〕,RPMI1640培地〔J.Am.Med.Assoc.,199,51
9（1967）〕,199培地〔Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,73,1
（1950）〕などが挙げられる。pHは約６〜８であるのが
好ましい。培養は通常約30℃〜40℃で約15〜60時間行
い、必要に応じて通気や攪拌を加える。
しては、たとえば約５〜20％胎児牛血清を含むMEM培地
〔Science,122,501（1952）〕,DMEM培地〔Virology,８,
396（1959）〕,RPMI1640培地〔J.Am.Med.Assoc.,199,51
9（1967）〕,199培地〔Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,73,1
（1950）〕などが挙げられる。pHは約６〜８であるのが
好ましい。培養は通常約30℃〜40℃で約15〜60時間行
い、必要に応じて通気や攪拌を加える。
本発明のポリペプチド（Ｉ）は細胞内または細胞外に生
成、蓄積する。細胞内ポリペプチド（Ｉ）を培養物から
抽出するに際しては、培養後公知の方法で細胞を集め、
塩酸グアニジンや尿素などの蛋白変性剤を含む緩衝液や
トライトンＸ−100などの界面活性剤を含む緩衝液中に
細胞を懸濁させたのち、遠心分離によりポリペプチド
（Ｉ）を含む上澄液を得る方法、あるいは超音波処理，
リゾチームなどの酵素処理や凍結融解法によって細胞を
破壊したのち、遠心分離によりポリペプチド（Ｉ）を含
む上澄液を得る方法などを適宜用い得る。
成、蓄積する。細胞内ポリペプチド（Ｉ）を培養物から
抽出するに際しては、培養後公知の方法で細胞を集め、
塩酸グアニジンや尿素などの蛋白変性剤を含む緩衝液や
トライトンＸ−100などの界面活性剤を含む緩衝液中に
細胞を懸濁させたのち、遠心分離によりポリペプチド
（Ｉ）を含む上澄液を得る方法、あるいは超音波処理，
リゾチームなどの酵素処理や凍結融解法によって細胞を
破壊したのち、遠心分離によりポリペプチド（Ｉ）を含
む上澄液を得る方法などを適宜用い得る。
これらの上澄液や細胞外に生成，蓄積したポリペプチド
（Ｉ）を分離，精製するには自体公知の分離，精製法を
適切に組み合わせて実施すればよい。
（Ｉ）を分離，精製するには自体公知の分離，精製法を
適切に組み合わせて実施すればよい。
これらの公知の分離，精製法としては、塩析や溶媒沈澱
法などの溶解度の差を利用する法，透析法，限外ろ過
法，ゲルろ過法およびSDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法，イ
オン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する
方法，アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的
親和性を利用する方法，逆相高速液体クロマトグラフィ
ーなどの疎水性の差を利用する方法，等電点電気泳動法
などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
法などの溶解度の差を利用する法，透析法，限外ろ過
法，ゲルろ過法およびSDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法，イ
オン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する
方法，アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的
親和性を利用する方法，逆相高速液体クロマトグラフィ
ーなどの疎水性の差を利用する方法，等電点電気泳動法
などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
以上の様にして得られたポリペプチド（Ｉ）が活性を示
さない場合には、そのまゝ使用し、活性を示さない場合
には酵素的あるいは非酵素的方法で活性化して用いるこ
とができる。
さない場合には、そのまゝ使用し、活性を示さない場合
には酵素的あるいは非酵素的方法で活性化して用いるこ
とができる。
本発明のポリペプチド（Ｉ）は、エンザイムイムノアッ
セイ，ラジオイムノアッセイなどで定量することができ
る。
セイ，ラジオイムノアッセイなどで定量することができ
る。
ポリペプチド（Ｉ）は動物細胞の分化，成長および増殖
の促進，生存維持，遺伝子発現の上昇，蛋白質および酵
素の誘導などの作用を有するので、これらの作用を指標
にしてポリペプチド（Ｉ）の活性を測定することができ
る。またポリペプチド（Ｉ）はNGFと同様のもしくは類
似の作用を有することも期待される。
の促進，生存維持，遺伝子発現の上昇，蛋白質および酵
素の誘導などの作用を有するので、これらの作用を指標
にしてポリペプチド（Ｉ）の活性を測定することができ
る。またポリペプチド（Ｉ）はNGFと同様のもしくは類
似の作用を有することも期待される。
上記の作用の具体例としては、例えばPC12細胞における
神経突起の伸長（neurite outgrowth）を促進する作用
［L.A.Greene,Brain Research,133,350（1977）;R.Heum
ann et al.Experimental Cell Research,145,179（198
3）］，ニワトリ胚の知覚神経節（脊髄後根神経節,dors
al root genglia）の生存（survival）を促進する作用
［A.M.Davies ＆ R.M.Lindsay,Developmental Biology,
111,62（1985）］などが挙げられる。
神経突起の伸長（neurite outgrowth）を促進する作用
［L.A.Greene,Brain Research,133,350（1977）;R.Heum
ann et al.Experimental Cell Research,145,179（198
3）］，ニワトリ胚の知覚神経節（脊髄後根神経節,dors
al root genglia）の生存（survival）を促進する作用
［A.M.Davies ＆ R.M.Lindsay,Developmental Biology,
111,62（1985）］などが挙げられる。
本発明のポリペプチド（Ｉ）は動物細胞の分化，成長，
増殖，生存維持などに関連する研究のための試薬として
有用である。ポリペプチド（Ｉ）をこれらの研究のため
に用いるには、たとえばポリペプチド（Ｉ）を動物細胞
培養用培地1mlあたり約0.1〜1000ng、さらに好ましくは
約１〜100ngとなる量を加えることが好ましい。ポリペ
プチド（Ｉ）を添加された培地に動物細胞を培養して、
動物細胞の分化，成長，増殖，生存維持などを測定する
ことができる。
増殖，生存維持などに関連する研究のための試薬として
有用である。ポリペプチド（Ｉ）をこれらの研究のため
に用いるには、たとえばポリペプチド（Ｉ）を動物細胞
培養用培地1mlあたり約0.1〜1000ng、さらに好ましくは
約１〜100ngとなる量を加えることが好ましい。ポリペ
プチド（Ｉ）を添加された培地に動物細胞を培養して、
動物細胞の分化，成長，増殖，生存維持などを測定する
ことができる。
また、組織・器官の損傷の修復にも関与することが予想
され、医薬としても期待される。
され、医薬としても期待される。
さらに、ポリペプチド（Ｉ）をコードするDNAは、ポリ
ペプチド（Ｉ）mRNAの検出・定量およびNGF遺伝子のク
ローニングのためのプローブとして利用できる。
ペプチド（Ｉ）mRNAの検出・定量およびNGF遺伝子のク
ローニングのためのプローブとして利用できる。
プローブとして用いる方法としては、例えばポリペプチ
ド（Ｉ）をコードするDNA（約300bp）の0.5μｇをAmers
ham社（イギリス）のニックトランスレーションキット
を用いて〔α−32P〕dCTP（＞400Ci/mmol）（アマシャ
ム社）でラベル化する（約107cpm）。プラークハイブリ
ダイゼーションによるクローニングの時にはフィルター
１枚当り上記のラベル化されたプローブの0.005μｇ（1
05cpm）を用いてハイブリダイゼーションを行う。
ド（Ｉ）をコードするDNA（約300bp）の0.5μｇをAmers
ham社（イギリス）のニックトランスレーションキット
を用いて〔α−32P〕dCTP（＞400Ci/mmol）（アマシャ
ム社）でラベル化する（約107cpm）。プラークハイブリ
ダイゼーションによるクローニングの時にはフィルター
１枚当り上記のラベル化されたプローブの0.005μｇ（1
05cpm）を用いてハイブリダイゼーションを行う。
なお、本明細書および図面において、塩基やアミノ酸な
どを略号で表示する場合、IUPAC−IUB Commision on Bi
ochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野に
おける慣用略号に基づくものであり、その例を次に挙げ
る。また、アミノ酸に関し光学異性体がありうる場合
は、特に明示しなければＬ−体を示すものとする。
どを略号で表示する場合、IUPAC−IUB Commision on Bi
ochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野に
おける慣用略号に基づくものであり、その例を次に挙げ
る。また、アミノ酸に関し光学異性体がありうる場合
は、特に明示しなければＬ−体を示すものとする。
DNA デオキシリボ核酸 Ａ アデニン Ｃ シトシン Ｇ グアニン Ｔ チミン Ala アラニン Arg アルギニン Asn アスパラギン Asp アスパラギン酸 Cys システイン Gln グルタミン Glu グルタミン酸 Gly グリシン His ヒスチジン Ile イソロイシン Leu ロイシン Lys リジン Met メチオニン Phe フェニルアラニン Pro プロリン Ser セリン Thr スレオニン Trp トリプトファン Tyr チロシン Val バリン Boc ｔ−ブチルオキシカルボニル MeBzl ｐ−メチルベンジル Bzl ベンジル −Ｐ ペプチド固相合成用ポリスチレン樹脂 PAM ｐ−オキシメチルフェニルアセトアミドメチル
樹脂 AcOH 酢酸 OBzl ベンジルエステル Tos トシル Br−Ｚ ２−ブロモベンジルオキシカルボニル Cl−Ｚ ２−クロロベンジルオキシカルボニル 後述の参考例で得られた微生物，後述の実施例で得られ
た形質転換体は、財団法人発酵研究所（IFO）に寄託さ
れ、また、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所
（FRI）にブダペスト条約に基づく寄託として寄託され
ている。受託番号および受託日を次の第１表に示す。
樹脂 AcOH 酢酸 OBzl ベンジルエステル Tos トシル Br−Ｚ ２−ブロモベンジルオキシカルボニル Cl−Ｚ ２−クロロベンジルオキシカルボニル 後述の参考例で得られた微生物，後述の実施例で得られ
た形質転換体は、財団法人発酵研究所（IFO）に寄託さ
れ、また、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所
（FRI）にブダペスト条約に基づく寄託として寄託され
ている。受託番号および受託日を次の第１表に示す。
実施例 以下に参考例，実施例を挙げて本発明をさらに具体的に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。
参考例１（Saccharomyces cerevisiae TB39ρ−の創
製） Saccharomyces cerevisiae NA74−3A（a,pho9,his4,leu
2）（IFO 10430,FERM BP−1947）（日本特願昭63-28371
6号明細書参照）とS.cerevisiae DK−13D（α,leu2,trp
1,his3）［Molecular and Cellular Biology,４,771（1
984）］とを交雑し、そのうちの１株をエチジウムブロ
マイドで処理することによって、呼吸能欠損株S.cerevi
siae TB39ρ−（α,MAta,leu2,his3,pho9,ρ−）（IFO
10467,FERM BP-2399）を得た。
製） Saccharomyces cerevisiae NA74−3A（a,pho9,his4,leu
2）（IFO 10430,FERM BP−1947）（日本特願昭63-28371
6号明細書参照）とS.cerevisiae DK−13D（α,leu2,trp
1,his3）［Molecular and Cellular Biology,４,771（1
984）］とを交雑し、そのうちの１株をエチジウムブロ
マイドで処理することによって、呼吸能欠損株S.cerevi
siae TB39ρ−（α,MAta,leu2,his3,pho9,ρ−）（IFO
10467,FERM BP-2399）を得た。
参考例２（抗Ｎ末ペプチド抗体の作製） （１）H-Tyr-Ala-Glu-His-Lys-Ser-His-Arg-Gly-Glu-Ty
r-Ser-Val-Cys-OHの合成 本ペプチドの合成は自動ペプチド合成機430A（アプライ
ド・バイオシステムズ社製）を用いた固相合成法にて行
なった。プログラムは「スタンダードー１」を用いた。
基本的な合成過程等は、メリーフィールド アール ビ
ー（Merrifield,R.B.）（1969）アドバンス オブ エ
ンザイモロジー（Adv.Enzymol.）32,221−296の方法に
準じている。レジンにはBoc−Cys（MeBzl）・PAM−Ｐ
（0.5mmol/g）を用い、カルボキシル末端から順次合成
した。Boc−アミノ酸としてBoc−Val,Boc−Ser（Bzl）,
Boc−Tyr（Br−Ｚ）,Boc−Glu（OBzl）,Boc−Gly,Boc−
Arg（Tos）,Boc−His（Tos）,Boc−Lys（Cl−Ｚ）,Boc
−Alaを用いた。アミノ末端Tyrまで合成したのち、ペプ
チドレジンを合成機から取り出し、乾燥した。
r-Ser-Val-Cys-OHの合成 本ペプチドの合成は自動ペプチド合成機430A（アプライ
ド・バイオシステムズ社製）を用いた固相合成法にて行
なった。プログラムは「スタンダードー１」を用いた。
基本的な合成過程等は、メリーフィールド アール ビ
ー（Merrifield,R.B.）（1969）アドバンス オブ エ
ンザイモロジー（Adv.Enzymol.）32,221−296の方法に
準じている。レジンにはBoc−Cys（MeBzl）・PAM−Ｐ
（0.5mmol/g）を用い、カルボキシル末端から順次合成
した。Boc−アミノ酸としてBoc−Val,Boc−Ser（Bzl）,
Boc−Tyr（Br−Ｚ）,Boc−Glu（OBzl）,Boc−Gly,Boc−
Arg（Tos）,Boc−His（Tos）,Boc−Lys（Cl−Ｚ）,Boc
−Alaを用いた。アミノ末端Tyrまで合成したのち、ペプ
チドレジンを合成機から取り出し、乾燥した。
ペプチドレジン1gに1.5mlのｐ−クレゾールおよび0.5ml
の1,2−エタンジチオールを加え、さらに約8mlの液体フ
ッ化水素を加えて、０℃で２時間反応させた。反応終了
後、デシケーター中でフッ化水素を減圧除去し、0.1％
の２−メルカプトエタノールを含むジエチルエーテル
で、続いてジエチルエーテルで洗い、大部分の混在試薬
を除去した。ペプチドを10mlの３％酢酸で抽出し、ろ過
により抽出液中に混入しているレジンを除いた。ろ液を
セファデックス（Sephadex）Ｇ−25を用いるゲルろ過に
より精製した。ゲルろ過条件は、カラムサイズ2.8×60c
m;検出波長280nm;溶媒３％酢酸；流速40ml/hrであっ
た。
の1,2−エタンジチオールを加え、さらに約8mlの液体フ
ッ化水素を加えて、０℃で２時間反応させた。反応終了
後、デシケーター中でフッ化水素を減圧除去し、0.1％
の２−メルカプトエタノールを含むジエチルエーテル
で、続いてジエチルエーテルで洗い、大部分の混在試薬
を除去した。ペプチドを10mlの３％酢酸で抽出し、ろ過
により抽出液中に混入しているレジンを除いた。ろ液を
セファデックス（Sephadex）Ｇ−25を用いるゲルろ過に
より精製した。ゲルろ過条件は、カラムサイズ2.8×60c
m;検出波長280nm;溶媒３％酢酸；流速40ml/hrであっ
た。
ペプチドを含むフラクションを集めて凍結乾燥し、得ら
れた粉末標品について逆相高速液体クロマトグラフィー
によりさらに精製した。カラムYMCパック、Ａ−324ODS1
0×250mm;カラム温度25℃；溶出溶媒A0.1％−トリフル
オロ酢酸−99.9％蒸留水；溶出溶媒B0.1％−トリフルオ
ロ酢酸−99.9％アセトニトリル；溶出プログラム０分
（90％Ａ＋10％Ｂ）,30分（60％Ａ＋40％Ｂ）；溶出速
度2ml/分，検出波長230nm。本条件下で保持時間23.0分
に溶出された主ピーク画分を集めて、バイオラッドAG1
×８（AcOH型、1.8×5cm）のカラムに通し、洗液も集
め、アセトニトリルを留去した後、凍結乾燥した。白色
粉末56mgを得た。得られた目的物は上記高速液体クロマ
トグラフィーと同一条件で23.0分に鋭い単一のピークを
示した。エルマン ジ エル（Elman,G.L.）（1959）ア
ーキテクチュアル バイオケミストリー アンド バイ
オフィジクス（Arch.Biochem.Biophys.）82,70−77法に
よる遊離のSH基の定量:114％。
れた粉末標品について逆相高速液体クロマトグラフィー
によりさらに精製した。カラムYMCパック、Ａ−324ODS1
0×250mm;カラム温度25℃；溶出溶媒A0.1％−トリフル
オロ酢酸−99.9％蒸留水；溶出溶媒B0.1％−トリフルオ
ロ酢酸−99.9％アセトニトリル；溶出プログラム０分
（90％Ａ＋10％Ｂ）,30分（60％Ａ＋40％Ｂ）；溶出速
度2ml/分，検出波長230nm。本条件下で保持時間23.0分
に溶出された主ピーク画分を集めて、バイオラッドAG1
×８（AcOH型、1.8×5cm）のカラムに通し、洗液も集
め、アセトニトリルを留去した後、凍結乾燥した。白色
粉末56mgを得た。得られた目的物は上記高速液体クロマ
トグラフィーと同一条件で23.0分に鋭い単一のピークを
示した。エルマン ジ エル（Elman,G.L.）（1959）ア
ーキテクチュアル バイオケミストリー アンド バイ
オフィジクス（Arch.Biochem.Biophys.）82,70−77法に
よる遊離のSH基の定量:114％。
アミノ酸分析値 Ser 1.65（２）;Glu 2.13（２）;Gly
1.00（１）;Ala 1.04（１）;1/2Cys 0.82（１）;Val 1.
03（１）;Tyr 1.97（２）;Lys 0.95（１）;His 1.72
（２）,Arg 1.00（１）。回収率74％。
1.00（１）;Ala 1.04（１）;1/2Cys 0.82（１）;Val 1.
03（１）;Tyr 1.97（２）;Lys 0.95（１）;His 1.72
（２）,Arg 1.00（１）。回収率74％。
1/2Cysは過ギ酸酸化法により定量した。カッコ内は理論
値を示す。
値を示す。
（２）Ｎ末ペプチドとヘモシアニンとの複合体の作製 上記（１）で得られたＮ末ペプチド（5mg）とヘモシア
ニン（10mg）とを4mlの0.2Mリン酸緩衝液（pH7.3）に溶
解し、氷水中で冷却した2.5％グルタールアルデヒド400
μｌを１滴づつ攪拌しながら加えた。氷冷下で３時間攪
拌後、蒸留水に対して透析し、Ｎ末ペプチドとヘモシア
ニンとの複合体を得た。
ニン（10mg）とを4mlの0.2Mリン酸緩衝液（pH7.3）に溶
解し、氷水中で冷却した2.5％グルタールアルデヒド400
μｌを１滴づつ攪拌しながら加えた。氷冷下で３時間攪
拌後、蒸留水に対して透析し、Ｎ末ペプチドとヘモシア
ニンとの複合体を得た。
（３）Ｎ末ペプチドとウシ血清アルブミンとの複合体の
作製 ウシ血清アルブミン（BSA）（132mg）を3mlの0.1Mリン
酸緩衝液（pH7.5）に溶解した（Ａ液）。11.2mgのＮ−
（γ−マレイミドブチルオキシ）サクシンイミド（GMB
S）を200μｌのジメチルホルムアミド溶液で溶解した
（Ｂ液）。スターラーで攪拌しながらＡ液にＢ液を滴下
し、混合液を30℃で30分間反応させたのち、0.1Mリン酸
緩衝液（pH6.5）−0.1M NaClを溶出液としたSephadexG
−25（1.5cm×20cm）で精製し、マレイミド基を導入し
たウシ血清アルブミンを得た。
作製 ウシ血清アルブミン（BSA）（132mg）を3mlの0.1Mリン
酸緩衝液（pH7.5）に溶解した（Ａ液）。11.2mgのＮ−
（γ−マレイミドブチルオキシ）サクシンイミド（GMB
S）を200μｌのジメチルホルムアミド溶液で溶解した
（Ｂ液）。スターラーで攪拌しながらＡ液にＢ液を滴下
し、混合液を30℃で30分間反応させたのち、0.1Mリン酸
緩衝液（pH6.5）−0.1M NaClを溶出液としたSephadexG
−25（1.5cm×20cm）で精製し、マレイミド基を導入し
たウシ血清アルブミンを得た。
実施例１で得られたペプチド（5mg）を0.1Mリン酸緩衝
液−5mM EDTAに溶解し、これにマレイミド基を導入した
ウシ血清アルブミン（20mg）を加え（全容量5ml以
下）、30℃で60分間反応を行った。これにPBS（phospha
te buffered saline）を加えて12mlにし、Ｎ末ペプチド
血清アルブミンとの複合体を得た。
液−5mM EDTAに溶解し、これにマレイミド基を導入した
ウシ血清アルブミン（20mg）を加え（全容量5ml以
下）、30℃で60分間反応を行った。これにPBS（phospha
te buffered saline）を加えて12mlにし、Ｎ末ペプチド
血清アルブミンとの複合体を得た。
（４）抗ポリペプチド（Ｉ）Ｎ末ペプチド抗体の作製 上記（２）で得られたＮ末ペプチドとヘモシアニンとの
複合体をFreundのcomplete adjuvantとよく混合し、そ
の混合物をウサギの皮下に注射した。以後、２週間おき
に上記（３）で得られたＮ末ペプチドとウシ血清アルブ
ミンとの複合体をFreundのincomplete adjuvantと混合
し、その混合物を同じウサギに注射した。
複合体をFreundのcomplete adjuvantとよく混合し、そ
の混合物をウサギの皮下に注射した。以後、２週間おき
に上記（３）で得られたＮ末ペプチドとウシ血清アルブ
ミンとの複合体をFreundのincomplete adjuvantと混合
し、その混合物を同じウサギに注射した。
上記の方法で免疫したウサギから採取して得られた血液
を遠心分離し、抗ポリペプチド（Ｉ）Ｎ末ペプチド抗体
を得た。
を遠心分離し、抗ポリペプチド（Ｉ）Ｎ末ペプチド抗体
を得た。
実施例１（ポリペプチド（Ｉ）cDNAのクローニング） E.coli Y1090にヒトグリオーマ由来のλgt 11cDNAライ
ブラリー（Clontech Laboratories,Inc.）を感染させた
のち、約６×105個のファージをNZCYM培地（Molecular
Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Lab
oratory,1982に記載）にまき、37℃で５時間培養した。
次にナイロン膜をプレート上にのせ、１分間放置後、プ
レートからはずした。このナイロン膜を0.5M NaOH−1.5
M NaCl,ついで1.5M NaCl−0.5M Tris−HClpH8.0に浸
し、さらに２×SSC［Melecular Cloning,A Laboratory
Manual,Cold Spring Harbor Laboratory（1982）参照］
に浸し、風乾後、80℃で２時間放置した。
ブラリー（Clontech Laboratories,Inc.）を感染させた
のち、約６×105個のファージをNZCYM培地（Molecular
Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Lab
oratory,1982に記載）にまき、37℃で５時間培養した。
次にナイロン膜をプレート上にのせ、１分間放置後、プ
レートからはずした。このナイロン膜を0.5M NaOH−1.5
M NaCl,ついで1.5M NaCl−0.5M Tris−HClpH8.0に浸
し、さらに２×SSC［Melecular Cloning,A Laboratory
Manual,Cold Spring Harbor Laboratory（1982）参照］
に浸し、風乾後、80℃で２時間放置した。
ヒトβNGF〔Nature,303,821（1983）〕をコードするDNA
（約0.38kb）を化学合成し、ニックトランスレーション
によって［α−32P］dCTPでラベル化することによって
プローブを作製した。
（約0.38kb）を化学合成し、ニックトランスレーション
によって［α−32P］dCTPでラベル化することによって
プローブを作製した。
上記で得られたナイロン膜とプローブを用いてMolecula
r Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor L
aboratory,1982に記載の方法に従ってハイブリダイゼー
ションを行った。即ち、プローブを含むハイブリゼーシ
ョン溶液にナイロン膜を浸し、65℃で16時間保温した。
該ナイロン膜を室温において２×SSC−0.1％SDSで洗浄
したのち、60℃において１×SSC−0.1％SDSで洗浄し
た。次にオートラジオグラフィーによって陽性クローン
を得た。
r Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor L
aboratory,1982に記載の方法に従ってハイブリダイゼー
ションを行った。即ち、プローブを含むハイブリゼーシ
ョン溶液にナイロン膜を浸し、65℃で16時間保温した。
該ナイロン膜を室温において２×SSC−0.1％SDSで洗浄
したのち、60℃において１×SSC−0.1％SDSで洗浄し
た。次にオートラジオグラフィーによって陽性クローン
を得た。
このようにして得られたクローンλβGN1321からEcoRI
でcDNAを切り出し、プラスミドpUC118（宝酒造株式会社
製）のEcoRI部位に挿入し、プラスミドpUNK5を得た。得
られたプラスミドpUNK5を用いて、Cohenらの方法（前
出）に従って、Escheichia coli MV 1184〔宝酒造株式
会社から入手した。〕を形質転換し、形質転換体Escher
ichia coli MV1184/pUNK5（IFO 14832,FERM BP−2304）
を得た。
でcDNAを切り出し、プラスミドpUC118（宝酒造株式会社
製）のEcoRI部位に挿入し、プラスミドpUNK5を得た。得
られたプラスミドpUNK5を用いて、Cohenらの方法（前
出）に従って、Escheichia coli MV 1184〔宝酒造株式
会社から入手した。〕を形質転換し、形質転換体Escher
ichia coli MV1184/pUNK5（IFO 14832,FERM BP−2304）
を得た。
このプラスミドpUNK5に含まれるポリペプチド（Ｉ）cDN
Aを含む全長約0.73kbのcDNAの制限酵素地図を第１図に
示す。第１図中の は非翻訳領域を、 は、プロペプチドをコードする領域を、 は式［II］のアミノ酸配列のＣ末端にさらにスレオニン
残基を有するアミノ酸配列であるポリペプチドをコード
する領域をそれぞれ示す。
Aを含む全長約0.73kbのcDNAの制限酵素地図を第１図に
示す。第１図中の は非翻訳領域を、 は、プロペプチドをコードする領域を、 は式［II］のアミノ酸配列のＣ末端にさらにスレオニン
残基を有するアミノ酸配列であるポリペプチドをコード
する領域をそれぞれ示す。
上記で得られたcDNAの塩基配列をジデオキシ法〔Messin
g et al.,Nucl.Acid.Res.,９,309（1981）〕によって決
定した。決定された塩基配列およびこれにより翻訳され
たアミノ酸配列を第２図に示す。第２図において、アミ
ノ酸配列の−１からＮ末端側はプロペプチドの一部であ
り、１から118または１から119は式［II］のアミノ酸配
列であるポリペプチドまたは式［II］のアミノ酸配列の
Ｃ末端にさらにスレオニン残基を有するアミノ酸配列で
あるポリペプチドをそれぞれ示す。
g et al.,Nucl.Acid.Res.,９,309（1981）〕によって決
定した。決定された塩基配列およびこれにより翻訳され
たアミノ酸配列を第２図に示す。第２図において、アミ
ノ酸配列の−１からＮ末端側はプロペプチドの一部であ
り、１から118または１から119は式［II］のアミノ酸配
列であるポリペプチドまたは式［II］のアミノ酸配列の
Ｃ末端にさらにスレオニン残基を有するアミノ酸配列で
あるポリペプチドをそれぞれ示す。
上記により決定されたポリペプチド（Ｉ）のアミノ酸配
列をUllrich et al.,Nature,303,821（1983）に示され
たヒトβNGFのアミノ酸配列と比較し第３図に示す。第
３図において、上段は本発明のポリペプチド（Ｉ）のう
ちの119個のアミノ酸配列を、下段はヒトβNGFのアミノ
酸配列をそれぞれ示す。同じアミノ酸残基の部分を四角
で囲った。また、図中−は単に結合手を示す。
列をUllrich et al.,Nature,303,821（1983）に示され
たヒトβNGFのアミノ酸配列と比較し第３図に示す。第
３図において、上段は本発明のポリペプチド（Ｉ）のう
ちの119個のアミノ酸配列を、下段はヒトβNGFのアミノ
酸配列をそれぞれ示す。同じアミノ酸残基の部分を四角
で囲った。また、図中−は単に結合手を示す。
該比較から明らかな如く、本発明のポリペプチド（Ｉ）
のうちの119個のアミノ酸配列は、上記ヒトβNGFのアミ
ノ酸配列と約60％の相同性を有する。
のうちの119個のアミノ酸配列は、上記ヒトβNGFのアミ
ノ酸配列と約60％の相同性を有する。
さらに、上記により決定されたポリペプチド（Ｉ）のう
ちの119個のアミノ酸配列をAngeletti et al.,Proceedi
ngs of National Academy of Sciences,USA,68,2417（1
971）;Scott et al.,Nature,302,538（1983）に示され
たマウスβNGFのアミノ酸配列と比較すると、約60％の
相同性を有する。
ちの119個のアミノ酸配列をAngeletti et al.,Proceedi
ngs of National Academy of Sciences,USA,68,2417（1
971）;Scott et al.,Nature,302,538（1983）に示され
たマウスβNGFのアミノ酸配列と比較すると、約60％の
相同性を有する。
以上の比較から、本発明のポリペプチド（Ｉ）は新規ポ
リペプチドであると考えられる。
リペプチドであると考えられる。
実施例２（ポリペプチド（Ｉ）cDNAの再クローニング） 実施例１で得られたpUNK5に含まれるポリペプチド
（Ｉ）cDNAの５′末端側を含むEcoRI−AhaIII断片（約
0.44kb）をプローブとして、ヒトグリオーマ由来のcDNA
ライブラリー（Clontech Labaratories,Inc.）の中から
実施例１と同様の方法でクローン化を行った。得られた
多くの陽性クローンの１つλHNT31からEcoRIでcDNAを切
り出し、、プラスミドpUC119（宝酒造）のEcoRI部位に
挿入し、プラスミドpHNT2を得た。pHNT2に挿入されてい
るポリペプチド（Ｉ）cDNA（約1.1kb）の制限酵素地図
を第４図に示す。第４図中の はシグナルペプチドをコードする領域を、 はプロペプチドをコードする領域を、 は式［II］のアミノ酸配列のＣ末端にさらにスレオニン
残基を有するアミノ酸配列であるポリペプチドをコード
する領域をそれぞれ示す。
（Ｉ）cDNAの５′末端側を含むEcoRI−AhaIII断片（約
0.44kb）をプローブとして、ヒトグリオーマ由来のcDNA
ライブラリー（Clontech Labaratories,Inc.）の中から
実施例１と同様の方法でクローン化を行った。得られた
多くの陽性クローンの１つλHNT31からEcoRIでcDNAを切
り出し、、プラスミドpUC119（宝酒造）のEcoRI部位に
挿入し、プラスミドpHNT2を得た。pHNT2に挿入されてい
るポリペプチド（Ｉ）cDNA（約1.1kb）の制限酵素地図
を第４図に示す。第４図中の はシグナルペプチドをコードする領域を、 はプロペプチドをコードする領域を、 は式［II］のアミノ酸配列のＣ末端にさらにスレオニン
残基を有するアミノ酸配列であるポリペプチドをコード
する領域をそれぞれ示す。
上記で得られたcDNAの塩基配列をジデオキシ法（前出）
によって決定した。決定された塩基配列およびこれによ
り翻訳されるアミノ酸配列を第５図に示す。第５図にお
いてSignalはシグナルペプチドを、Proはプロペプチド
をMatureはポリペプチド（Ｉ）（成熟蛋白）をそれぞれ
示す。
によって決定した。決定された塩基配列およびこれによ
り翻訳されるアミノ酸配列を第５図に示す。第５図にお
いてSignalはシグナルペプチドを、Proはプロペプチド
をMatureはポリペプチド（Ｉ）（成熟蛋白）をそれぞれ
示す。
実施例３（大腸菌用のポリペプチド（Ｉ）発現ベクター
の構築） 実施例１で得られたプラスミドpUNK5に挿入されている
ポリペプチド（Ｉ）cDNAには、ポリペプチド（Ｉ）のＮ
末端の11番目のチロシン残基をコードする領域付近にSc
aI部位が、ポリペプチド（Ｉ）の終止コドンの50塩基下
流付近にNsiI部位が存在する（第２図，第４図，第５図
参照）。そこでpUNK5より0.3kb ScaI−NsiI断片を単離
し、これにアダプターNGFTE−１（35mer）,NGFTE−２
（33mer）,NGFTE−３（7mer）,NGFTE−４（15mer）をT4
DNAリガーゼで連結したのち制限酵素NdeIとBamHIで処理
し、0.3kb NdeI−BamHI断片を得た（第６図参照）。
の構築） 実施例１で得られたプラスミドpUNK5に挿入されている
ポリペプチド（Ｉ）cDNAには、ポリペプチド（Ｉ）のＮ
末端の11番目のチロシン残基をコードする領域付近にSc
aI部位が、ポリペプチド（Ｉ）の終止コドンの50塩基下
流付近にNsiI部位が存在する（第２図，第４図，第５図
参照）。そこでpUNK5より0.3kb ScaI−NsiI断片を単離
し、これにアダプターNGFTE−１（35mer）,NGFTE−２
（33mer）,NGFTE−３（7mer）,NGFTE−４（15mer）をT4
DNAリガーゼで連結したのち制限酵素NdeIとBamHIで処理
し、0.3kb NdeI−BamHI断片を得た（第６図参照）。
該アダプターを次に示す。
一方、T7プロモーターを有する発現ベクターpET−3C［R
osenberg et al.,Gene,56,125（1987）］をNbeIとBamHI
で切断し、4.4kb NdeI−BamHI断片を単離した。
osenberg et al.,Gene,56,125（1987）］をNbeIとBamHI
で切断し、4.4kb NdeI−BamHI断片を単離した。
上記で得られた4.4kb NdeI−BamHI断片と0.3kb NdeI−B
amHI断片をT4DNAリガーゼで連結したのち、Escherichia
coli DH1に導入し、得られたアンピシリン耐性の形質
転換株［Escherichia coli DH1/pENGFT102］から単離し
たプラスミドをpENGFT102と命名した（第６図）。
amHI断片をT4DNAリガーゼで連結したのち、Escherichia
coli DH1に導入し、得られたアンピシリン耐性の形質
転換株［Escherichia coli DH1/pENGFT102］から単離し
たプラスミドをpENGFT102と命名した（第６図）。
実施例４（形質転換体の作成および発現） 実施例３で得られたポリペプチド（Ｉ）発現ベクターpE
NGFT102を用いてEscherichia coli BL21（DE3）［Gene,
56,125（1987）］の形質転換を行い、形質転換体E.coli
BL21（DE3）/pENGFT102（IFO 14874,FERM BP−2420）
を得た。
NGFT102を用いてEscherichia coli BL21（DE3）［Gene,
56,125（1987）］の形質転換を行い、形質転換体E.coli
BL21（DE3）/pENGFT102（IFO 14874,FERM BP−2420）
を得た。
形質転換体E.coli BL21（DE3）/pENGFT102を、50μg/ml
アンピシリンおよび0.2％グルコースを含む5mlのLB培地
で試験管で37℃,16時間培養した。得られた培養液の1ml
の20mlの同じ培地を含む200ml容フラスコに移し、37℃
で培養し、Klett値が170〜200になった時IPTGを終濃度
0.4mMになるように加え、さらに３時間培養した。得ら
れた培養液の30μｌから集めた菌体を30μｌのサンプル
緩衝液［50mM Tris・HCl pH6.8−2mM EDTA−１％SDS−
１％メルカプトエタノール−８％グリセロール−0.025
％ブロムフェノールブルー］に懸濁し、100℃,5分間加
熱したのち0.1％SDSを含む16％ポリアクリルアミドゲル
で電気泳動した。泳動後のゲルをクーマシーブリリアン
トブル（Coomassie brilliant blue）で染色したとこ
ろ、前記ベクターpET−3Cを用いてE.coli BL21（DE3）
を形質転換して得られたE.coli BL21（DE3）/pET−3Cで
は認められない15キロダルトン（kDa）の蛋白質がE.col
i BL21（DE3）/pENGFT102では認められ、その生産量は
全蛋白質の約10％であった。また、該蛋白質は、ウサギ
抗マウスNGF抗体（Collaborative Research,Inc.米国）
を用いたWestern blottingでも検出された。
アンピシリンおよび0.2％グルコースを含む5mlのLB培地
で試験管で37℃,16時間培養した。得られた培養液の1ml
の20mlの同じ培地を含む200ml容フラスコに移し、37℃
で培養し、Klett値が170〜200になった時IPTGを終濃度
0.4mMになるように加え、さらに３時間培養した。得ら
れた培養液の30μｌから集めた菌体を30μｌのサンプル
緩衝液［50mM Tris・HCl pH6.8−2mM EDTA−１％SDS−
１％メルカプトエタノール−８％グリセロール−0.025
％ブロムフェノールブルー］に懸濁し、100℃,5分間加
熱したのち0.1％SDSを含む16％ポリアクリルアミドゲル
で電気泳動した。泳動後のゲルをクーマシーブリリアン
トブル（Coomassie brilliant blue）で染色したとこ
ろ、前記ベクターpET−3Cを用いてE.coli BL21（DE3）
を形質転換して得られたE.coli BL21（DE3）/pET−3Cで
は認められない15キロダルトン（kDa）の蛋白質がE.col
i BL21（DE3）/pENGFT102では認められ、その生産量は
全蛋白質の約10％であった。また、該蛋白質は、ウサギ
抗マウスNGF抗体（Collaborative Research,Inc.米国）
を用いたWestern blottingでも検出された。
実施例５［動物細胞用のポリペプチド（Ｉ）発現ベクタ
ーの構築］ 実施例２で得られたプラスミドpHNT2よりポリペプチド
（Ｉ）cDNAを含有する1.1kb E.coRI断片を単離した。一
方、発現ベクターpTB389（特開昭64-2572に記載）をEco
RIで切断し、上記のポリペプチド（Ｉ）cDNAを含有する
1.1kb EcoRI断片とT4DNAリガーゼで連結させ、Escheric
hia coli DH1［Molecular Cloning,A Laboratory Manua
l,Cold Spring Harbor Laboratory,p.505（1982）］の
形質転換を行った。得られたアンピシリン耐性の形質転
換体［Eschrichia coli DH1/pNTK26］からプラスミドを
単離し、これをpNTK26と命名した。
ーの構築］ 実施例２で得られたプラスミドpHNT2よりポリペプチド
（Ｉ）cDNAを含有する1.1kb E.coRI断片を単離した。一
方、発現ベクターpTB389（特開昭64-2572に記載）をEco
RIで切断し、上記のポリペプチド（Ｉ）cDNAを含有する
1.1kb EcoRI断片とT4DNAリガーゼで連結させ、Escheric
hia coli DH1［Molecular Cloning,A Laboratory Manua
l,Cold Spring Harbor Laboratory,p.505（1982）］の
形質転換を行った。得られたアンピシリン耐性の形質転
換体［Eschrichia coli DH1/pNTK26］からプラスミドを
単離し、これをpNTK26と命名した。
プラスミドpTB505（特開昭62-175182に記載）よりエー
ベルソンマウス白血病ウイルス（Ａ−MuLV）LTR領域を
含む1.1kb ClaI−HindIII断片を単離した。一方、プラ
スミドpNTK26を制限酵素ClaIとHindIIIで切断して小さ
い断片を除去したのち上記のＡ−MuLVLTR領域を含む1.1
kb ClaI−HindIII断片とT4DNAリガーゼで連結させ、Esc
herichia coli DH1の形質転換体を行ない、アンピシリ
ン耐性の形質転換体Escherichia coli DH1/pNTL145（IF
O 14873,FERM BP−2421）を得た。このようにして得ら
れた形質転換体からプラスミドpNTL145を単離した（第
７図）。
ベルソンマウス白血病ウイルス（Ａ−MuLV）LTR領域を
含む1.1kb ClaI−HindIII断片を単離した。一方、プラ
スミドpNTK26を制限酵素ClaIとHindIIIで切断して小さ
い断片を除去したのち上記のＡ−MuLVLTR領域を含む1.1
kb ClaI−HindIII断片とT4DNAリガーゼで連結させ、Esc
herichia coli DH1の形質転換体を行ない、アンピシリ
ン耐性の形質転換体Escherichia coli DH1/pNTL145（IF
O 14873,FERM BP−2421）を得た。このようにして得ら
れた形質転換体からプラスミドpNTL145を単離した（第
７図）。
実施例６［動物細胞用のポリペプチド（Ｉ）発現ベクタ
ーの構築］ 実施例２で得られたプラスミドpHNT2より、ポリペプチ
ド（Ｉ）cDNAの中のシグナルペプチド，プロペプチドお
よびポリペプチド（Ｉ）をコードする領域を含む0.86kb
EcoRI−AhaIII断片を単離した（AhaIIIについては第４
図および第５図参照）。得られた本断片の５′末端（Ec
oRI）をKlenow Fragmentで平滑化したのち、両末端にXh
oIリンカーpCCTCGAGGをT4リガーゼで連結し、XhoIで処
理して0.86kb XhoI断片を得た。
ーの構築］ 実施例２で得られたプラスミドpHNT2より、ポリペプチ
ド（Ｉ）cDNAの中のシグナルペプチド，プロペプチドお
よびポリペプチド（Ｉ）をコードする領域を含む0.86kb
EcoRI−AhaIII断片を単離した（AhaIIIについては第４
図および第５図参照）。得られた本断片の５′末端（Ec
oRI）をKlenow Fragmentで平滑化したのち、両末端にXh
oIリンカーpCCTCGAGGをT4リガーゼで連結し、XhoIで処
理して0.86kb XhoI断片を得た。
一方、動物細胞用発現ベクターpKSV−10（Pharmacia）
を制限酵素BglIIで切断したのち、Klenow Fragmentで両
末端（XhoI）を平滑化した。
を制限酵素BglIIで切断したのち、Klenow Fragmentで両
末端（XhoI）を平滑化した。
これにXhoIリンカー（前出）を付与し、上記の0.86kb X
hoI断片とT4DNAリガーゼで連結させ、Escherichia coli
DH1の形質転換を行った。得られたアンピシリン耐性の
形質転換体［Escherichia coli DH1/pNTS101］からプラ
スミドpNTS101を単離した（第８図）。
hoI断片とT4DNAリガーゼで連結させ、Escherichia coli
DH1の形質転換を行った。得られたアンピシリン耐性の
形質転換体［Escherichia coli DH1/pNTS101］からプラ
スミドpNTS101を単離した（第８図）。
実施例７［ポリペプチド（Ｉ）cDNAの動物細胞での発
現］ サルCOS−７細胞を10％胎児牛血清を含むDMEM培地（Dul
becco′s Modified Eagle′s Medium）（Flow Laborato
ries）で単層培養したのち、同培地で培地交換した。交
換の４時間後に公知の方法［Graham et al.,Virology,5
2,456（1973）］に従い、発現ベクターpTB389,10μｇの
ポリペプチド（Ｉ）発現ベクターpNTK26またはpNTL145
を含むカルシウムホスフエートゲルを調製し、細胞に添
加し、形質転換体COS7/pTB389,COS−7/pNTK26およびCOS
−7/pNTL145をそれぞれ得た。この細胞を炭酸ガス培養
器中で４時間培養し、グリセロール処理［Gorman et a
l.,Science,221,551（1983）］したのち、３日間培養し
た。培養後の培養液を遠心分離して培養上清を得た。
現］ サルCOS−７細胞を10％胎児牛血清を含むDMEM培地（Dul
becco′s Modified Eagle′s Medium）（Flow Laborato
ries）で単層培養したのち、同培地で培地交換した。交
換の４時間後に公知の方法［Graham et al.,Virology,5
2,456（1973）］に従い、発現ベクターpTB389,10μｇの
ポリペプチド（Ｉ）発現ベクターpNTK26またはpNTL145
を含むカルシウムホスフエートゲルを調製し、細胞に添
加し、形質転換体COS7/pTB389,COS−7/pNTK26およびCOS
−7/pNTL145をそれぞれ得た。この細胞を炭酸ガス培養
器中で４時間培養し、グリセロール処理［Gorman et a
l.,Science,221,551（1983）］したのち、３日間培養し
た。培養後の培養液を遠心分離して培養上清を得た。
Brain Research,133,350（1977）およびExperimental C
ell Research,145,179（1983）に記載されている方法に
従って、上記で得られた培養上清の存在下でPC12細胞を
培養し、神経突起が細胞の直径の２倍以上に伸長した細
胞の割合を計算した。その結果を第２表に示す。
ell Research,145,179（1983）に記載されている方法に
従って、上記で得られた培養上清の存在下でPC12細胞を
培養し、神経突起が細胞の直径の２倍以上に伸長した細
胞の割合を計算した。その結果を第２表に示す。
上記と同様の方法で得られた培養上清を用いて、初代培
養中隔野および前脳基底部神経細胞のアセチルコリン量
に対する作用〔垣花満，寿野正広，神経化学，27,166
（1988）〕を調べた。
養中隔野および前脳基底部神経細胞のアセチルコリン量
に対する作用〔垣花満，寿野正広，神経化学，27,166
（1988）〕を調べた。
胎生17日目のラット胎仔脳より中隔野および前脳基底部
を採取し、Hatanakaらの方法 〔Develop.Brain Res.,30,47（1986）〕に従い神経細胞
を単離した。Poly−Ｌ−ornithine（100μg/ml）で前処
理した48−wellプレートに約１×106cells/cm2/wellの
割合でseedingした。無血清のDME/F12/N2培養液（500μ
ｌ）で24時間培養した。吸引除去後DME/F12/10％FCS（5
00μｌ）および検体の培養上清を添加した。２日後培養
液を同培養液750μｌへ変え再度培養上清を添加し、さ
らに２日間培養した。培養上清の添加は２種類の方法で
行った。培養上清を最終濃度が10％となるように前半の
２日間は50μｌを、後半の２日間は75μｌを添加した。
和光純薬より購入したマウスNGF（7S−NGF）を用いると
きは、0.1％ovalbumin/PBSで希釈し、その10μｌを添加
した。
を採取し、Hatanakaらの方法 〔Develop.Brain Res.,30,47（1986）〕に従い神経細胞
を単離した。Poly−Ｌ−ornithine（100μg/ml）で前処
理した48−wellプレートに約１×106cells/cm2/wellの
割合でseedingした。無血清のDME/F12/N2培養液（500μ
ｌ）で24時間培養した。吸引除去後DME/F12/10％FCS（5
00μｌ）および検体の培養上清を添加した。２日後培養
液を同培養液750μｌへ変え再度培養上清を添加し、さ
らに２日間培養した。培養上清の添加は２種類の方法で
行った。培養上清を最終濃度が10％となるように前半の
２日間は50μｌを、後半の２日間は75μｌを添加した。
和光純薬より購入したマウスNGF（7S−NGF）を用いると
きは、0.1％ovalbumin/PBSで希釈し、その10μｌを添加
した。
培養上清添加４日後培養液を吸引除去し、冷却した0.3N
PCA500μｌおよびACh測定用の内標EHC（ethylhomochol
ine）を20−60pmol/20μｌ添加した。穏やかに攪拌後、
500μｌをエッペンドルフマイクロチューブに移した。
以後既報にしたがい操作し、HPLC/ECD（High performan
ce liquid chromatography electrochemical detector
system）を用いてACh量を測定した。ACh抽出後の細胞を
1N NaOH 500μｌに溶解しタンパク量の測定を行った（B
io−Rad Protein Assay）。統計処理にはDunnett′s t
−testを用いた。
PCA500μｌおよびACh測定用の内標EHC（ethylhomochol
ine）を20−60pmol/20μｌ添加した。穏やかに攪拌後、
500μｌをエッペンドルフマイクロチューブに移した。
以後既報にしたがい操作し、HPLC/ECD（High performan
ce liquid chromatography electrochemical detector
system）を用いてACh量を測定した。ACh抽出後の細胞を
1N NaOH 500μｌに溶解しタンパク量の測定を行った（B
io−Rad Protein Assay）。統計処理にはDunnett′s t
−testを用いた。
得られた結果を第３表に示す。
実施例８（酵母用のポリペプチド（Ｉ）発現ベクターの
構築） ヒトリゾチーム発現ベクターpGEL125（ヨーロッパ特許
出願公開第255,233号公報に記載の方法で製造され
る。）をHindIIIで切断し、Klenow Fragmentで平滑化し
たのち、T4DNAリガーゼで結合させることによってHindI
II部位を持たないプラスミドpGEL125Hを得た。次に、pG
EL125HをXhoIで切断し、XhoI−HindIIIアダプター ５′TCGAGGCCA CCGGTTCGA5′ とT4DNAリガーゼで連結させたのち、8.3kb HindIII−Ba
mHI断片を得た。プラスミドp69A〔Cell,30,933（198
2）〕よりα−ファクター遺伝子を含む1.6kb EcoRI断片
を単離し、Klenow Fragmentで平滑化したのち、BamHIリ
ンカー５′CCGGATCCGG3′とT4DNAリガーゼで連結し、Ba
mHIとHindIIIで処理した。得られた0.9kbBamHI−HindII
I断片（α−ファクター遺伝子のプロモーターとプレ・
プロ領域コードするDNAを含む）と上記の8.3kb HindIII
−BamHI断片とをT4DNAリガーゼで連結させ、この反応液
を用いてE.coli DH1を形質転換した。得られたアンピシ
リン耐性の形質転換体から単離したプラスミドをpALFA1
03（9.2kb）と命名した。
構築） ヒトリゾチーム発現ベクターpGEL125（ヨーロッパ特許
出願公開第255,233号公報に記載の方法で製造され
る。）をHindIIIで切断し、Klenow Fragmentで平滑化し
たのち、T4DNAリガーゼで結合させることによってHindI
II部位を持たないプラスミドpGEL125Hを得た。次に、pG
EL125HをXhoIで切断し、XhoI−HindIIIアダプター ５′TCGAGGCCA CCGGTTCGA5′ とT4DNAリガーゼで連結させたのち、8.3kb HindIII−Ba
mHI断片を得た。プラスミドp69A〔Cell,30,933（198
2）〕よりα−ファクター遺伝子を含む1.6kb EcoRI断片
を単離し、Klenow Fragmentで平滑化したのち、BamHIリ
ンカー５′CCGGATCCGG3′とT4DNAリガーゼで連結し、Ba
mHIとHindIIIで処理した。得られた0.9kbBamHI−HindII
I断片（α−ファクター遺伝子のプロモーターとプレ・
プロ領域コードするDNAを含む）と上記の8.3kb HindIII
−BamHI断片とをT4DNAリガーゼで連結させ、この反応液
を用いてE.coli DH1を形質転換した。得られたアンピシ
リン耐性の形質転換体から単離したプラスミドをpALFA1
03（9.2kb）と命名した。
プラスミドpAFLA103より、α−ファクターのプロモータ
ーおよびプレ・プロ領域をコードするDNAを含む0.9kb B
amHI−HindIII断片を単離し、これをファージベクターM
13mp18に挿入した。α−ファクターのプロ領域をコード
するDNAの３′末端（HindIII部位）の24塩基上流に新た
にHindIII部位を作る目的で、プロ領域第81位のセリン
のコドンTCTをAGCに変換した。即ち、上記の0.9kb BamH
I−HindIII断片を有するM13mp18とプライマー５′TTTAT
CCAAGCTTACCCCTTC3′を用いて部位特異的変異（Amersha
m社のキットを使用）を行い、目的とするクローンを得
た。得られたクローンから変異前のものよりも24bp短い
0.9kb BamHI−HindIII断片を単離し、pGEL125H由来の8.
3kb BamHI−HindIII断片（前出）と連結させ、プラスミ
ドpALFA310を得た。
ーおよびプレ・プロ領域をコードするDNAを含む0.9kb B
amHI−HindIII断片を単離し、これをファージベクターM
13mp18に挿入した。α−ファクターのプロ領域をコード
するDNAの３′末端（HindIII部位）の24塩基上流に新た
にHindIII部位を作る目的で、プロ領域第81位のセリン
のコドンTCTをAGCに変換した。即ち、上記の0.9kb BamH
I−HindIII断片を有するM13mp18とプライマー５′TTTAT
CCAAGCTTACCCCTTC3′を用いて部位特異的変異（Amersha
m社のキットを使用）を行い、目的とするクローンを得
た。得られたクローンから変異前のものよりも24bp短い
0.9kb BamHI−HindIII断片を単離し、pGEL125H由来の8.
3kb BamHI−HindIII断片（前出）と連結させ、プラスミ
ドpALFA310を得た。
プラスミドpGLD p31−RcT（ヨーロッパ特許出願公開−0
235430）よりPGKターミネーターを含む−02.9kb AhaIII
−SalI断片を単離した。この断片にXhoIリンカーpCCTCG
AGGをT4DNAリガーゼで結合させたのち制限酵素XhoIとSa
lIで処理し、PGKターミネーターを含む0.29kb XhoI−Sa
lI断片を得た。この0.29kb XhoI−SalI断片をプラスミ
ドpALFA310（前出）のα−ファクターのプロ領域をコー
ドするDNAの下流にあるXhoI部位に挿入し、プラスミドp
ALFA310Tを得た。
235430）よりPGKターミネーターを含む−02.9kb AhaIII
−SalI断片を単離した。この断片にXhoIリンカーpCCTCG
AGGをT4DNAリガーゼで結合させたのち制限酵素XhoIとSa
lIで処理し、PGKターミネーターを含む0.29kb XhoI−Sa
lI断片を得た。この0.29kb XhoI−SalI断片をプラスミ
ドpALFA310（前出）のα−ファクターのプロ領域をコー
ドするDNAの下流にあるXhoI部位に挿入し、プラスミドp
ALFA310Tを得た。
実施例２で得られたプラスミドpHNT2から、ポリペプチ
ド（ｌ）cDNAを含む1.1kb EcoRI断片を単離した。この
1.1kb EcoRI断片をAhaIIIで切断したのち、XhoIリンカ
ーを付与し、ScaIで切断して0.36kb ScaI−XhoI断片を
得た。この0.36kb ScaI−XhoI断片に合成DNA とXhoI−HindaIIIアダプター（前出）を連結し、HindII
Iで処理してポリペプチド（Ｉ）をコードする0.4kb Hin
dIII断片を得た。
ド（ｌ）cDNAを含む1.1kb EcoRI断片を単離した。この
1.1kb EcoRI断片をAhaIIIで切断したのち、XhoIリンカ
ーを付与し、ScaIで切断して0.36kb ScaI−XhoI断片を
得た。この0.36kb ScaI−XhoI断片に合成DNA とXhoI−HindaIIIアダプター（前出）を連結し、HindII
Iで処理してポリペプチド（Ｉ）をコードする0.4kb Hin
dIII断片を得た。
ポリペプチド（Ｉ）をコードする0.4kb HindIII断片を
プラスミドpALFA310Tのα−ファクターのプレ・プロ領
域をコードするDNAの３′末端に位置するHindIII部位に
挿入することによってポリペプチド（Ｉ）発現ベクター
pANT341Tを得た（第９図）。
プラスミドpALFA310Tのα−ファクターのプレ・プロ領
域をコードするDNAの３′末端に位置するHindIII部位に
挿入することによってポリペプチド（Ｉ）発現ベクター
pANT341Tを得た（第９図）。
実施例９〔形質転換体の作成およびポリペプチド（Ｉ）
cDNAの発現〕 実施例８で得られたポリペプチド（Ｉ）発現ベクターpA
NT341Tを用いてリチウム法〔J.Bacterial.,153,163（19
83）〕によって参考例１で得られたSaccharomyces cerv
isiaeTB39ρ−（IFO 10467,FERM BP−2399）の形質転換
を行い、形質転換体S.cerevisiae TB39ρ−/pANT341T
（IFO 10475,FERM BP−2530）を得た。
cDNAの発現〕 実施例８で得られたポリペプチド（Ｉ）発現ベクターpA
NT341Tを用いてリチウム法〔J.Bacterial.,153,163（19
83）〕によって参考例１で得られたSaccharomyces cerv
isiaeTB39ρ−（IFO 10467,FERM BP−2399）の形質転換
を行い、形質転換体S.cerevisiae TB39ρ−/pANT341T
（IFO 10475,FERM BP−2530）を得た。
形質転換体S.cerevisiae TB39ρ−/pANT341を、試験管
中のバークホルダー（Burkholder）〔アメリカン・ジャ
ーナル・オブ・ボタニー（Amer.J.Bot.）30,206（194
3）〕の改変培地（１当り89gのショ糖,11gのグルコー
ス,5.6gのアスパラギン,0.44gのKH2PO4を含有）5mlに接
種し、30℃で３日間振とう下で培養した。得られた培養
液1mlを4mlの上記培地を含む試験管に移し、30℃で１日
振とう下で培養した。この培養液2mlを上記培地18mlを
含む200ml容エーレンマイヤー（Erlenmeyer）フラスコ
に移し、30℃で３日間振とう下で培養した。
中のバークホルダー（Burkholder）〔アメリカン・ジャ
ーナル・オブ・ボタニー（Amer.J.Bot.）30,206（194
3）〕の改変培地（１当り89gのショ糖,11gのグルコー
ス,5.6gのアスパラギン,0.44gのKH2PO4を含有）5mlに接
種し、30℃で３日間振とう下で培養した。得られた培養
液1mlを4mlの上記培地を含む試験管に移し、30℃で１日
振とう下で培養した。この培養液2mlを上記培地18mlを
含む200ml容エーレンマイヤー（Erlenmeyer）フラスコ
に移し、30℃で３日間振とう下で培養した。
得られた培養液を遠心分離し、その上清（750μｌ）に
トリクロル酢酸を加えて蛋白を沈でんさせた。沈でんを
Sample buffer〔Laemmli,Nature,227,680（1970）〕に
懸濁し、100℃で５分間加熱したのち0.5％SDSを含む15
％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行った。
トリクロル酢酸を加えて蛋白を沈でんさせた。沈でんを
Sample buffer〔Laemmli,Nature,227,680（1970）〕に
懸濁し、100℃で５分間加熱したのち0.5％SDSを含む15
％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行った。
Burnetteの方法（Analytical Biochemistry,112,195（1
981）〕に従ってゲル上の蛋白をニトロセルロース膜に
移した。
981）〕に従ってゲル上の蛋白をニトロセルロース膜に
移した。
ウサギ抗マウスNGF抗体（Collaborative Research IN
C.,米国）とアフィニティー精製HRP結合ヤギ抗ウサギIg
G（バイオ・ラッド社，米国）を用いたWesternブロッテ
ィングを行った。その結果、ポリペプチド（Ｉ）に相当
する分子量約15キロダルトン（kDa）のバンドが検出さ
れた。一方、S.cervisiae TB39ρ−/pALFA310Tの培養上
清の場合には同バンドは検出されなかった。
C.,米国）とアフィニティー精製HRP結合ヤギ抗ウサギIg
G（バイオ・ラッド社，米国）を用いたWesternブロッテ
ィングを行った。その結果、ポリペプチド（Ｉ）に相当
する分子量約15キロダルトン（kDa）のバンドが検出さ
れた。一方、S.cervisiae TB39ρ−/pALFA310Tの培養上
清の場合には同バンドは検出されなかった。
実施例10〔大腸菌によるポリペプチド（Ｉ）の生産〕 実施例３で得られたポリペプチド（Ｉ）発現ベクターpE
NGFT102およびT7リゾチーム発現ベクターpLysSを用い
て、Bscherichia coli BL21（DE3）〔Gene,56,125（198
7）〕の形質転換を行い、形質転換体E.coli BL21（DE
3）/pLysS,pENGFT102（IFO14903,FERM BP−2529）を得
た。
NGFT102およびT7リゾチーム発現ベクターpLysSを用い
て、Bscherichia coli BL21（DE3）〔Gene,56,125（198
7）〕の形質転換を行い、形質転換体E.coli BL21（DE
3）/pLysS,pENGFT102（IFO14903,FERM BP−2529）を得
た。
形質転換体E.coli BL21（DE）/pLysS,pENGFT102を50μg
/mlのアンピシリン,10μg/mlのクロラムフェニコール,
0.2％グルコースを含むLB培地〔１％トリプトン（Difc
o）,0.5％酵母エキス,0.5％NaCl〕で37℃、16時間振と
う下で培養した。得られた培養液12.5mlを250mlの同じ
培地を含む１容エーレンマイヤー（Erlenmeyer）フラ
スコに移し、30℃で３時間振とう下で培養すると培養液
のKlett値は170になった。この培養液にisopropyl−β
−Ｄ（−）−thiogalactopyronosideを最終0.1mMになる
ように添加し、さらに30℃で３時間振とう下で培養し
た。得られた培養液30μｌから集めた菌体を２倍濃度の
Sample buffer〔Laemmli,Nature,227,680（1970）〕（3
0μｌ）に懸濁し、100℃で５分間加熱したのち0.1％SDS
を含む16％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行っ
た。Burnetteの方法〔Analytical Biochemistry,112,19
5（1981）〕に従ってゲル上の蛋白をニトロセルロース
フィルターに移し、ウサギ抗マウスNGF抗体（Collabora
tive Research）とアフィニティー精製HRP結合ヤギ抗ウ
サギIgG（バイオ・ラッド，米国）とを用いたWesternブ
ロッティングを行った結果、15キロダルトン（kDa）の
ポリペプチド（Ｉ）が認められた。
/mlのアンピシリン,10μg/mlのクロラムフェニコール,
0.2％グルコースを含むLB培地〔１％トリプトン（Difc
o）,0.5％酵母エキス,0.5％NaCl〕で37℃、16時間振と
う下で培養した。得られた培養液12.5mlを250mlの同じ
培地を含む１容エーレンマイヤー（Erlenmeyer）フラ
スコに移し、30℃で３時間振とう下で培養すると培養液
のKlett値は170になった。この培養液にisopropyl−β
−Ｄ（−）−thiogalactopyronosideを最終0.1mMになる
ように添加し、さらに30℃で３時間振とう下で培養し
た。得られた培養液30μｌから集めた菌体を２倍濃度の
Sample buffer〔Laemmli,Nature,227,680（1970）〕（3
0μｌ）に懸濁し、100℃で５分間加熱したのち0.1％SDS
を含む16％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行っ
た。Burnetteの方法〔Analytical Biochemistry,112,19
5（1981）〕に従ってゲル上の蛋白をニトロセルロース
フィルターに移し、ウサギ抗マウスNGF抗体（Collabora
tive Research）とアフィニティー精製HRP結合ヤギ抗ウ
サギIgG（バイオ・ラッド，米国）とを用いたWesternブ
ロッティングを行った結果、15キロダルトン（kDa）の
ポリペプチド（Ｉ）が認められた。
上記と同様の方法で得られた泳動後のゲルをクーマシー
ブリリアントブルー（Coomassie brilliant blue）で染
色したところ、ポリペプチド（Ｉ）に相当する15kDaの
蛋白が認められ、その生産量は全蛋白の約10％と概算さ
れた。
ブリリアントブルー（Coomassie brilliant blue）で染
色したところ、ポリペプチド（Ｉ）に相当する15kDaの
蛋白が認められ、その生産量は全蛋白の約10％と概算さ
れた。
実施例11〔ポリペプチド（Ｉ）の単離〕 実施例10で得られたE.coli BL21（DE3）/pLysS,pENGFT1
02の培養液3.75lを遠心分離し、菌体17g（wet）を得
た。この菌体を375mlの50mM Tris・HCl（pH8.0）に懸濁
し、凍結，融解したのち超音波処理（海上電気,2A,2
分）を３回行った。この処理液を遠心分離し、その沈で
んを60mlの5M塩酸グアニジン−5mM EDTA−1mM PMSF−0.
1mM APMSF−20mMジチオスレイトール（DTT）−50mMナト
リウムリン酸緩衝液（pH6.0）に溶解した。得られた溶
液を2M塩酸グアニジン−5mM EDTA−0.1mMAPMSF−5mM DT
T−25mMナトリウムリン酸緩衝液（pH6.0）で平衡化され
たSephacrylS−200でゲルろ過し、Westernブロッティン
グ（前出）によってポリペプチド（Ｉ）が検出されたフ
ラクションを集め、溶出液（300ml）を得た。この溶出
液をYM5メンブレン（アミコン社）を装着した限外ろ過
装置を用いて濃縮し、得られた濃縮液50mlを上記と同様
の方法でゲルろ過し、328mgの精製ポリペプチド（Ｉ）
を含有する溶液164mlを得た。SDS−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動で純度を調べた結果、得られたポリペプチ
ド（Ｉ）精製標品はほぼ単一であった。
02の培養液3.75lを遠心分離し、菌体17g（wet）を得
た。この菌体を375mlの50mM Tris・HCl（pH8.0）に懸濁
し、凍結，融解したのち超音波処理（海上電気,2A,2
分）を３回行った。この処理液を遠心分離し、その沈で
んを60mlの5M塩酸グアニジン−5mM EDTA−1mM PMSF−0.
1mM APMSF−20mMジチオスレイトール（DTT）−50mMナト
リウムリン酸緩衝液（pH6.0）に溶解した。得られた溶
液を2M塩酸グアニジン−5mM EDTA−0.1mMAPMSF−5mM DT
T−25mMナトリウムリン酸緩衝液（pH6.0）で平衡化され
たSephacrylS−200でゲルろ過し、Westernブロッティン
グ（前出）によってポリペプチド（Ｉ）が検出されたフ
ラクションを集め、溶出液（300ml）を得た。この溶出
液をYM5メンブレン（アミコン社）を装着した限外ろ過
装置を用いて濃縮し、得られた濃縮液50mlを上記と同様
の方法でゲルろ過し、328mgの精製ポリペプチド（Ｉ）
を含有する溶液164mlを得た。SDS−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動で純度を調べた結果、得られたポリペプチ
ド（Ｉ）精製標品はほぼ単一であった。
上記の精製ポリペプチド（Ｉ）を含有する溶液をUltrap
ore RPSCカラム（0.46×7.5cm,ALTEX社）に負荷し、ト
リフルオロ酢酸−アセトニトリル系を溶出溶媒とする高
速液体クロマトグラフィー（HPLC）を行って、単一なポ
リペプチド（Ｉ）を得た。得られたポリペプチド（Ｉ）
のＮ末端アミノ酸配列を気相プロテインシークェンサー
（アプライドバイオシステム モデル470A）を用いて決
定した。その結果、精製ポリペプチド（Ｉ）のＮ末端ア
ミノ酸配列はＮ末端にメチオニンが付加されていること
のほかはcDNAの塩基配列から推定したポリペプチド
（Ｉ）のＮ末端アミノ酸配列と一致した（第４表）。
ore RPSCカラム（0.46×7.5cm,ALTEX社）に負荷し、ト
リフルオロ酢酸−アセトニトリル系を溶出溶媒とする高
速液体クロマトグラフィー（HPLC）を行って、単一なポ
リペプチド（Ｉ）を得た。得られたポリペプチド（Ｉ）
のＮ末端アミノ酸配列を気相プロテインシークェンサー
（アプライドバイオシステム モデル470A）を用いて決
定した。その結果、精製ポリペプチド（Ｉ）のＮ末端ア
ミノ酸配列はＮ末端にメチオニンが付加されていること
のほかはcDNAの塩基配列から推定したポリペプチド
（Ｉ）のＮ末端アミノ酸配列と一致した（第４表）。
上記で得られた精製標品のアミノ酸組成をニンヒドリン
法で求めた。その結果、精製標品の実測値はＮ末端にメ
チオニンが付加されたポリペプチド（Ｉ）から計算した
理論値とほぼ一致した。
法で求めた。その結果、精製標品の実測値はＮ末端にメ
チオニンが付加されたポリペプチド（Ｉ）から計算した
理論値とほぼ一致した。
上記の精製ポリペプチド（Ｉ）を含有する溶液（蛋白濃
度2mg/ml）を蛋白濃度が10μg/mlになるように2M塩酸グ
アニジン−5mM EDTA−0.1mM APMSF−5mM DTT−25mMナト
リウムリン酸緩衝液（pH6.0）で希釈し、50倍量の1mM E
DTA−50mM NaHCO3−Na2CO3（pH10.0）に対して４℃で16
時間透析し、さらに同じbufferに対して４時間透析し
た。得られた透析内液のPC12細胞に対する作用をBrain
Research,133,350（1979）およびExperimental Cell Re
search,145,179（1983）に記載されている方法に従って
調べた。その結果、該透析内液の添加によって、PC12細
胞の６％に神経突起が観察され、２％が細胞体の直径の
２倍以上の長さの神経突起を有していた。一方、対照と
なる1mM EDTA−50mM NaHCO3−Na2CO3（pH10.0）では神
経突起を有する細胞は0.5％以下であった。
度2mg/ml）を蛋白濃度が10μg/mlになるように2M塩酸グ
アニジン−5mM EDTA−0.1mM APMSF−5mM DTT−25mMナト
リウムリン酸緩衝液（pH6.0）で希釈し、50倍量の1mM E
DTA−50mM NaHCO3−Na2CO3（pH10.0）に対して４℃で16
時間透析し、さらに同じbufferに対して４時間透析し
た。得られた透析内液のPC12細胞に対する作用をBrain
Research,133,350（1979）およびExperimental Cell Re
search,145,179（1983）に記載されている方法に従って
調べた。その結果、該透析内液の添加によって、PC12細
胞の６％に神経突起が観察され、２％が細胞体の直径の
２倍以上の長さの神経突起を有していた。一方、対照と
なる1mM EDTA−50mM NaHCO3−Na2CO3（pH10.0）では神
経突起を有する細胞は0.5％以下であった。
上記と同様の方法で得られた精製ポリペプチド（Ｉ）に
はニワトリ胚の脊髄後根神経節（dorsal root gangli
a）の生存（survival）を促進する活性（前出）が認め
られた。
はニワトリ胚の脊髄後根神経節（dorsal root gangli
a）の生存（survival）を促進する活性（前出）が認め
られた。
実施例12［ポリペプチド（Ｉ）cDNAの動物細胞での発
現］ サルCOS−７細胞を10％胎児牛血清を含むDMEM培地（Dul
becco′s Modified Eagle′s Medium）で炭酸ガス培養
器中で単層培養したのち、同培地で培地交換を行った。
その４時間後に公知の方法〔Graham et al.,Virology,
52,456（1973）〕に従い、10μｇのpTB389（特開昭64-2
572に記載）または10μｇのpNTL145（実施例５参照）を
含むカルシウムホスフェートゲルを調製し、細胞に添加
した。この細胞を４時間培養し、グリセロール処理〔Go
rman et al.,Science,211,551（1983）〕したのち、1
0％胎児牛血清を含むDMEM培地で16時間培養した。培地
を0.5％胎児牛血清を含むDMEM培地に交換したのち、細
胞をさらに２日間培養し、その培養液を遠心分離した。
得られたpTB389でトランスフェクトされたCOS-7細胞の
培養上清（サンプル１）およびpNTL145でトランスフェ
クトされたCOS−７細胞の培養上清（サンプル２）を以
下の実験に用いた。
現］ サルCOS−７細胞を10％胎児牛血清を含むDMEM培地（Dul
becco′s Modified Eagle′s Medium）で炭酸ガス培養
器中で単層培養したのち、同培地で培地交換を行った。
その４時間後に公知の方法〔Graham et al.,Virology,
52,456（1973）〕に従い、10μｇのpTB389（特開昭64-2
572に記載）または10μｇのpNTL145（実施例５参照）を
含むカルシウムホスフェートゲルを調製し、細胞に添加
した。この細胞を４時間培養し、グリセロール処理〔Go
rman et al.,Science,211,551（1983）〕したのち、1
0％胎児牛血清を含むDMEM培地で16時間培養した。培地
を0.5％胎児牛血清を含むDMEM培地に交換したのち、細
胞をさらに２日間培養し、その培養液を遠心分離した。
得られたpTB389でトランスフェクトされたCOS-7細胞の
培養上清（サンプル１）およびpNTL145でトランスフェ
クトされたCOS−７細胞の培養上清（サンプル２）を以
下の実験に用いた。
各サンプル（0.5ml）にトリクロロ酢酸を加えて蛋白を
沈でんさせた。その沈でんをsample buffer〔Nature,22
7,680（1970）〕に溶解したのち100℃で５分間加熱し、
0.5％SDSを含む17％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行った。Burnetteの方法〔Analytical Biochemistry,11
2,195（1981）〕に従い蛋白質をゲルからニトロセルロ
ース膜に移し、抗ポリペプチド（Ｉ）Ｎ末ペプチド抗体
（参考例２で得られたもの。）とアフィニティー精製HR
P結合ヤギ抗ウサギ1gG（バイオ・ラッド社，米国）を用
いてWesternブロッティングを行った。その結果、pNTL1
45でトランスフェクトされたCOS−７細胞の培養上清
（サンプル２）ではポリペプチド（Ｉ）のバンドが約15
キロダルトンに相当する位置に認められたが、pTB389で
トランスフェクトされたCOS−７細胞の培養上清（サン
プル１）ではポリペプチド（Ｉ）のバンドは検出されな
かった。上記の抗ポリペプチド（Ｉ）Ｎ末ペプチド抗体
のかわりに抗マウスNGF抗体（Collaborative Research,
米国）を用いても、ポリペプチド（Ｉ）のバンドが認め
られた。
沈でんさせた。その沈でんをsample buffer〔Nature,22
7,680（1970）〕に溶解したのち100℃で５分間加熱し、
0.5％SDSを含む17％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行った。Burnetteの方法〔Analytical Biochemistry,11
2,195（1981）〕に従い蛋白質をゲルからニトロセルロ
ース膜に移し、抗ポリペプチド（Ｉ）Ｎ末ペプチド抗体
（参考例２で得られたもの。）とアフィニティー精製HR
P結合ヤギ抗ウサギ1gG（バイオ・ラッド社，米国）を用
いてWesternブロッティングを行った。その結果、pNTL1
45でトランスフェクトされたCOS−７細胞の培養上清
（サンプル２）ではポリペプチド（Ｉ）のバンドが約15
キロダルトンに相当する位置に認められたが、pTB389で
トランスフェクトされたCOS−７細胞の培養上清（サン
プル１）ではポリペプチド（Ｉ）のバンドは検出されな
かった。上記の抗ポリペプチド（Ｉ）Ｎ末ペプチド抗体
のかわりに抗マウスNGF抗体（Collaborative Research,
米国）を用いても、ポリペプチド（Ｉ）のバンドが認め
られた。
８日令鷄胚より知覚神経節（脊髄後根神経節;dorsal ro
ot ganglion,DRG）を単離し、0.1％トリプシン（ブタ膵
臓結晶トリプシン，和光）in CMF（calcium-magnesium
free）−PBSで37℃,20分間処理することにより細胞を分
散した。10％胎児牛血清（FCS）添加DMEM中で２時間，
プラスチック培養皿上で前培養を行い、非神経細胞を接
着させた後、接着していない細胞を遠心により集め、ポ
リ−Ｌ−オルニチンをコートした24ウェルプレートに10
4あるいは105細胞／ウェルの割合で播種した。培養液は
10％FCS,1μM Ara−C,50μg/mlカナマイシンを含むDME
M:Ham′sF12＝1:1混合培養液を用い、DMEMに対して透析
した各サンプルを直ちに加え培養した。培養４日後、生
存している神経細胞の数を各ウェルあたり10視野につい
て測定した。なお、生存した神経細胞は、表面が平滑
で、さらに細胞体直径の２倍以上の長さの神経突起を持
つことを指標した。
ot ganglion,DRG）を単離し、0.1％トリプシン（ブタ膵
臓結晶トリプシン，和光）in CMF（calcium-magnesium
free）−PBSで37℃,20分間処理することにより細胞を分
散した。10％胎児牛血清（FCS）添加DMEM中で２時間，
プラスチック培養皿上で前培養を行い、非神経細胞を接
着させた後、接着していない細胞を遠心により集め、ポ
リ−Ｌ−オルニチンをコートした24ウェルプレートに10
4あるいは105細胞／ウェルの割合で播種した。培養液は
10％FCS,1μM Ara−C,50μg/mlカナマイシンを含むDME
M:Ham′sF12＝1:1混合培養液を用い、DMEMに対して透析
した各サンプルを直ちに加え培養した。培養４日後、生
存している神経細胞の数を各ウェルあたり10視野につい
て測定した。なお、生存した神経細胞は、表面が平滑
で、さらに細胞体直径の２倍以上の長さの神経突起を持
つことを指標した。
培養３日目に神経細胞の形態を比較した。
105個の細胞を各ウェルに入れ、各サンプルを10％（培
養液の体積比）に加えた場合、サンプル２では生存して
いる神経細胞が多数認められ、神経突起が密に分布して
いるのに対し、サンプル１では多数の死細胞（輪郭不
整，神経突起を持たず浮遊している細胞）が認められ、
生存している細胞サンプル２より少なかった。
養液の体積比）に加えた場合、サンプル２では生存して
いる神経細胞が多数認められ、神経突起が密に分布して
いるのに対し、サンプル１では多数の死細胞（輪郭不
整，神経突起を持たず浮遊している細胞）が認められ、
生存している細胞サンプル２より少なかった。
播種細胞数104個／ウェルの培養において、サンプル濃
度10％,5％ではいずれのサンプルの場合も神経突起は良
好な発達を示した。しかしながらサンプル濃度２％にお
いては、サンプル２ではよく発達した神経突起を持つ神
経細胞が認められるのに対し、サンプル１では神経突起
の発達は貧弱で、細胞体も小さかった。
度10％,5％ではいずれのサンプルの場合も神経突起は良
好な発達を示した。しかしながらサンプル濃度２％にお
いては、サンプル２ではよく発達した神経突起を持つ神
経細胞が認められるのに対し、サンプル１では神経突起
の発達は貧弱で、細胞体も小さかった。
播種細胞数104個／ウェルの培養について、培養４日目
に生存している神経細胞を計数した（第10図）。第10図
中の白丸（○）はpTB389でトランスフェクトされたCOS
−７細胞の培養上清（サンプル１）を、黒丸（●）はpN
TL145でトランスフェクトされたCOS−７細胞の培養上清
（サンプル２）をそれぞれ示す。サンプル２はサンプル
１と比較して知覚神経節細胞の生存を増強し、その効果
は濃度依存的であった。
に生存している神経細胞を計数した（第10図）。第10図
中の白丸（○）はpTB389でトランスフェクトされたCOS
−７細胞の培養上清（サンプル１）を、黒丸（●）はpN
TL145でトランスフェクトされたCOS−７細胞の培養上清
（サンプル２）をそれぞれ示す。サンプル２はサンプル
１と比較して知覚神経節細胞の生存を増強し、その効果
は濃度依存的であった。
実施例13［ラットポリペプチド（Ｉ）遺伝子のクローニ
ング］ 実施例２で得られたプラスミドpHNT2から、ポリペプチ
ド（Ｉ）cDNAを含む1.1kb EcoRIDNA断片を単離し、オリ
ゴラベリング反応（oligolabelling reaction）（Nippo
n Gene）によってラベル化してプローブを得た。
ング］ 実施例２で得られたプラスミドpHNT2から、ポリペプチ
ド（Ｉ）cDNAを含む1.1kb EcoRIDNA断片を単離し、オリ
ゴラベリング反応（oligolabelling reaction）（Nippo
n Gene）によってラベル化してプローブを得た。
ラット（５週齢）の各臓器からGuanidium−CsCl法によ
り全RNAを調製し、oligo-dTセルロースを用いてpolyRNA
を取得した。上記のプローブを用いて各組織から得られ
たpolyRNAのNorthernブロッティングを行ったところ、
腎臓，肝臓，心臓，脳，脾臓，胸腺，肺および顎下腺で
1.4kbのポリペプチド（Ｉ）のメッセンジャーRNA（mRN
A）が検出された。以上の結果から、ポリペプチド
（Ｉ）遺伝子はラットにも存在し、多くの組織で発現し
ていることが示唆された。
り全RNAを調製し、oligo-dTセルロースを用いてpolyRNA
を取得した。上記のプローブを用いて各組織から得られ
たpolyRNAのNorthernブロッティングを行ったところ、
腎臓，肝臓，心臓，脳，脾臓，胸腺，肺および顎下腺で
1.4kbのポリペプチド（Ｉ）のメッセンジャーRNA（mRN
A）が検出された。以上の結果から、ポリペプチド
（Ｉ）遺伝子はラットにも存在し、多くの組織で発現し
ていることが示唆された。
実施例１で得られたプラスミドpUNK5からヒトのポリペ
プチド（Ｉ）をコードする0.45kbEcoRI−AhaIII断片を
単離し、これをプローブとしてラットゲノムDNAのサザ
ンハイブリダイゼーションを行なった。本プローブは約
7.4kbのEcoRI断片，約3.8kbのBglII断片，および約3.8k
bのHindIII断片とハイブリダイズし、ラットにもポリペ
プチド（Ｉ）遺伝子が存在することが示唆された。
プチド（Ｉ）をコードする0.45kbEcoRI−AhaIII断片を
単離し、これをプローブとしてラットゲノムDNAのサザ
ンハイブリダイゼーションを行なった。本プローブは約
7.4kbのEcoRI断片，約3.8kbのBglII断片，および約3.8k
bのHindIII断片とハイブリダイズし、ラットにもポリペ
プチド（Ｉ）遺伝子が存在することが示唆された。
そこで、実施例２で得られたプラスミドpHNT2よりポリ
ペプチド（Ｉ）cDNAを含む1.1kbEcoRI断片を単離し、こ
れをプローブとしてラットのポリペプチド（Ｉ）遺伝子
のクローニングを行った。用いたラットゲノムDNAライ
ブラリーは、雌ラット（Sprague−Dawley）の肝臓由来D
NAをHaeIIIで部分消化しEcoRIリンカーを用いてCharon4
Aファージに組み込んだものであり、Clontech社から購
入した。このファージライブラリーを大腸菌LE392株に
感染させ、１プレート当り約５×105個のプラークを形
成させた。10枚の独立したプレートから常法〔Naniatis
et al,Molecular Cloning−a Laboratory Manual〕に
従いファージDNAをニトロセルロース膜に移し、上記の
プローブでハイブリダイズさせた。その結果７個の陽性
クローンを得ることができた。その内の１つの陽性クロ
ーン（λrNGF2−８）は約12kbの挿入DNA断片を含んでい
た。サザンハイブリダイゼーションの結果、該DNA断片
中の0.95kb BglII−HindIII断片中にポリペプチドをコ
ードする領域が存在することが推定された。そこで該0.
95kb BglII−HindIII断片をプラスミドpUC118（宝酒
造）にサブクローニングし、プラスミドpRNT18を得た。
pRNT18を用いてEscherichia coliDH1の形質転換を行
い、形質転換体Escherichia coli DH1/pRNT18（IFO 149
34,FERM BP−2618）を得た。
ペプチド（Ｉ）cDNAを含む1.1kbEcoRI断片を単離し、こ
れをプローブとしてラットのポリペプチド（Ｉ）遺伝子
のクローニングを行った。用いたラットゲノムDNAライ
ブラリーは、雌ラット（Sprague−Dawley）の肝臓由来D
NAをHaeIIIで部分消化しEcoRIリンカーを用いてCharon4
Aファージに組み込んだものであり、Clontech社から購
入した。このファージライブラリーを大腸菌LE392株に
感染させ、１プレート当り約５×105個のプラークを形
成させた。10枚の独立したプレートから常法〔Naniatis
et al,Molecular Cloning−a Laboratory Manual〕に
従いファージDNAをニトロセルロース膜に移し、上記の
プローブでハイブリダイズさせた。その結果７個の陽性
クローンを得ることができた。その内の１つの陽性クロ
ーン（λrNGF2−８）は約12kbの挿入DNA断片を含んでい
た。サザンハイブリダイゼーションの結果、該DNA断片
中の0.95kb BglII−HindIII断片中にポリペプチドをコ
ードする領域が存在することが推定された。そこで該0.
95kb BglII−HindIII断片をプラスミドpUC118（宝酒
造）にサブクローニングし、プラスミドpRNT18を得た。
pRNT18を用いてEscherichia coliDH1の形質転換を行
い、形質転換体Escherichia coli DH1/pRNT18（IFO 149
34,FERM BP−2618）を得た。
上記の0.95kb BglII−HindIII断片を種々の制限酵素で
切断し、各断片をpUC118,M13mp18などにサブクローニン
グしたのち、それらの塩基配列をシークナーゼ（東洋
紡）を用いて決定した（第11図）。その結果、該0.95kb
BglII−HindIII断片中に、ラットポリペプチド（Ｉ）
のシグナル配列、プロ領域および成熟蛋白質をコードす
る領域が含まれていること，また、イントロンが存在し
ないことが明らかになった。
切断し、各断片をpUC118,M13mp18などにサブクローニン
グしたのち、それらの塩基配列をシークナーゼ（東洋
紡）を用いて決定した（第11図）。その結果、該0.95kb
BglII−HindIII断片中に、ラットポリペプチド（Ｉ）
のシグナル配列、プロ領域および成熟蛋白質をコードす
る領域が含まれていること，また、イントロンが存在し
ないことが明らかになった。
また、塩基配列から予想されるラットポリペプチド
（Ｉ）のアミノ酸配列をヒトポリペプチド（Ｉ）と比較
すると、シグナル配列およびプロ領域には11ケ所の相違
点が認められたが、成熟蛋白〔ポリペプチド（Ｉ）〕に
は相違点はなく、ヒトとラットの間でポリペプチド
（Ｉ）のアミノ酸配列は完全に一致することが明らかに
なった。
（Ｉ）のアミノ酸配列をヒトポリペプチド（Ｉ）と比較
すると、シグナル配列およびプロ領域には11ケ所の相違
点が認められたが、成熟蛋白〔ポリペプチド（Ｉ）〕に
は相違点はなく、ヒトとラットの間でポリペプチド
（Ｉ）のアミノ酸配列は完全に一致することが明らかに
なった。
実施例14［ポリペプチド（Ｉ）cDNAのクローニング］ ポリペプチド（Ｉ）cDNAから、シグナル配列、プロ領域
およびポリペプチド（Ｉ）をコードするDNA断片（0.83k
b）を単離し、プローブを作成した。得られたプローブ
を用いて、実施例１および実施例２と同様の方法でヒト
胎盤cDNAライブラリー（Clontech Labaratories,Inc.）
から0.73kbおよび1.1kbのポリペプチド（Ｉ）cDNAをク
ローン化した。得られたポリペプチド（Ｉ）cDNAの塩基
配列は実施例１及び実施例２でクローン化されたポリペ
プチド（Ｉ）cDNAの塩基配列と一致した。
およびポリペプチド（Ｉ）をコードするDNA断片（0.83k
b）を単離し、プローブを作成した。得られたプローブ
を用いて、実施例１および実施例２と同様の方法でヒト
胎盤cDNAライブラリー（Clontech Labaratories,Inc.）
から0.73kbおよび1.1kbのポリペプチド（Ｉ）cDNAをク
ローン化した。得られたポリペプチド（Ｉ）cDNAの塩基
配列は実施例１及び実施例２でクローン化されたポリペ
プチド（Ｉ）cDNAの塩基配列と一致した。
実施例15［ポリペプチド（Ｉ）発現ベクターの導入によ
るポリペプチド（Ｉ）産生動物細胞株の樹立］ １）発現ベクターの構築 実施例２で得られたプラスミドpHNT2よりポリペプチド
（Ｉ）cDNAのシグナルペプチド．プロペプチドおよびポ
リペプチド（Ｉ）をコードする領域を含む0.86kb EcoRI
−AhaIII断片を単離した。一方、IL−2cDNA発現用プラ
スミドpTB399［Cell Struct.Funct.12,205（1987）］を
BglIIで切断したのちDNAポリメラーゼKlenow断片で処理
し、さらにEcoRIで切断してIL−2cDNA部分の除去された
断片（約3.8kb）を得た。
るポリペプチド（Ｉ）産生動物細胞株の樹立］ １）発現ベクターの構築 実施例２で得られたプラスミドpHNT2よりポリペプチド
（Ｉ）cDNAのシグナルペプチド．プロペプチドおよびポ
リペプチド（Ｉ）をコードする領域を含む0.86kb EcoRI
−AhaIII断片を単離した。一方、IL−2cDNA発現用プラ
スミドpTB399［Cell Struct.Funct.12,205（1987）］を
BglIIで切断したのちDNAポリメラーゼKlenow断片で処理
し、さらにEcoRIで切断してIL−2cDNA部分の除去された
断片（約3.8kb）を得た。
これに、上記0.86kbEcoRI−AhaIII断片をT4DNAリガーゼ
反応により連結させプラスミドpTB1091を得た。
反応により連結させプラスミドpTB1091を得た。
次に、hygromycin B耐性遺伝子を含む1.0kb BamHI断片
をプラスミドpLG89［Gene25,179（1983）］より切り出
し、プラスミドpTB6［Cell Struct.Funct.12,205（198
7］のneomycin耐性遺伝子をコードする領域（1.0kb Bgl
II−SmaI）と置換して、HSV TK遺伝子プロモーターをも
つhygromycin耐性遺伝子発現用ベクターpTB681を構築し
た。pTB681をPvuIIで切断して得られた1.8kb断片にHind
IIIリンカーを付与したのち、これを先に述べたポリペ
プチド（Ｉ）発現用ベクターpTB1091のHindIII部位に挿
入して、hygromycin耐性遺伝子を有するポリペプチド
（Ｉ）発現用ベクターpTB1139を構築した（第12図）。
をプラスミドpLG89［Gene25,179（1983）］より切り出
し、プラスミドpTB6［Cell Struct.Funct.12,205（198
7］のneomycin耐性遺伝子をコードする領域（1.0kb Bgl
II−SmaI）と置換して、HSV TK遺伝子プロモーターをも
つhygromycin耐性遺伝子発現用ベクターpTB681を構築し
た。pTB681をPvuIIで切断して得られた1.8kb断片にHind
IIIリンカーを付与したのち、これを先に述べたポリペ
プチド（Ｉ）発現用ベクターpTB1091のHindIII部位に挿
入して、hygromycin耐性遺伝子を有するポリペプチド
（Ｉ）発現用ベクターpTB1139を構築した（第12図）。
２）ポリペプチド（Ｉ）産生動物細胞株の樹立 マウスＬ細胞（TK欠損株）を直径6cmのファルコンシャ
ーレに播種し（７×105／シャーレ）、10％FCSを含むイ
ーグルMEM培地で培養した。翌日、発現用ベクターpTB11
39（10μｇ）をGrahamらの方法［Virology,52,456（197
3）］に従って細胞にトランスフェクトしたのち、上記
培地にて２日間培養した。この細胞をトリプシン処理し
て新たなシャーレに再播種し、hygromycin B（シグマ
社）500μg/mlを含む10％FCS−MEMにて培養を続ける
と、２〜３週間後コロニー状に増殖したhygromycin耐性
細胞が得られた。このようにして得られたhygromycin耐
性Ｌ細胞を、公知の方法（例えばリミテッドダイリュー
ション法）に従ってクローニングし、クローンＬ−H1−
1,L−H6−1,L−H11−1,L−H13−1,L−H14−１（IFO 502
23,FERM BP−2754）,L−H18−1,L−H19−1,L−H35−1,L
−H36−１およびＬ−H43−１を得た。
ーレに播種し（７×105／シャーレ）、10％FCSを含むイ
ーグルMEM培地で培養した。翌日、発現用ベクターpTB11
39（10μｇ）をGrahamらの方法［Virology,52,456（197
3）］に従って細胞にトランスフェクトしたのち、上記
培地にて２日間培養した。この細胞をトリプシン処理し
て新たなシャーレに再播種し、hygromycin B（シグマ
社）500μg/mlを含む10％FCS−MEMにて培養を続ける
と、２〜３週間後コロニー状に増殖したhygromycin耐性
細胞が得られた。このようにして得られたhygromycin耐
性Ｌ細胞を、公知の方法（例えばリミテッドダイリュー
ション法）に従ってクローニングし、クローンＬ−H1−
1,L−H6−1,L−H11−1,L−H13−1,L−H14−１（IFO 502
23,FERM BP−2754）,L−H18−1,L−H19−1,L−H35−1,L
−H36−１およびＬ−H43−１を得た。
分離した各クローンの細胞を24穴プレートに播種して培
養し、細胞がほぼコンフルエントになったとき、0.1％F
CSを含むMEM0.5ml/wellで培地交換した。２日間培養し
たのち、培養上清をSDS−ポリアクリルアミド電気泳動
にかけ、ポリペプチド（Ｉ）のＮ末ペプチド抗体（参考
例２）を用いたウェスタンブロッティングにより、ポリ
ペプチド（Ｉ）を検出した。
養し、細胞がほぼコンフルエントになったとき、0.1％F
CSを含むMEM0.5ml/wellで培地交換した。２日間培養し
たのち、培養上清をSDS−ポリアクリルアミド電気泳動
にかけ、ポリペプチド（Ｉ）のＮ末ペプチド抗体（参考
例２）を用いたウェスタンブロッティングにより、ポリ
ペプチド（Ｉ）を検出した。
その結果、上記各クローンの培地中に約1mg/lのポリペ
プチド（Ｉ）が生産されていることが分った。
プチド（Ｉ）が生産されていることが分った。
発明の効果 本発明のポリペプチド（Ｉ）をコードするDNAは、NGFや
ポリペプチド（Ｉ）のmRNAの検出・定量,NGF遺伝子のク
ローニングのためのプローブとして利用できることが考
えられるため、研究用試薬として有利に用いることがで
きる。
ポリペプチド（Ｉ）のmRNAの検出・定量,NGF遺伝子のク
ローニングのためのプローブとして利用できることが考
えられるため、研究用試薬として有利に用いることがで
きる。
また、本発明のポリペプチド（Ｉ）は、細胞の分化，成
長，増殖の促進，生存維持；遺伝子発現の上昇；蛋白
質，酵素の誘導などの機構を研究するための試薬として
有利に用いることができる。
長，増殖の促進，生存維持；遺伝子発現の上昇；蛋白
質，酵素の誘導などの機構を研究するための試薬として
有利に用いることができる。
第１図は、実施例１で得られた、プラスミドpUNK5に含
まれるポリペプチド（Ｉ）cDNAを含むDNAの制限酵素地
図を示す。 第２図は、実施例１で得られた、プラスミドpUNK5に含
まれるポリペプチド（Ｉ）cDNAの塩基配列およびこれか
ら翻訳されるアミノ酸配列を示す。 第３図は、実施例１で述べた、本発明のポリペプチド
（Ｉ）のアミノ酸配列（上段）とヒトβNGFのアミノ酸
配列（下段）との比較を示す。 第４図は、実施例２で得られた、プラスミドpHNT2に含
まれるポリペプチド（Ｉ）cDNAを含有するDNAの制限酵
素地図を示す。 第５図は、実施例２で得られた、プラスミドpHNT2に含
まれるポリペプチド（Ｉ）cDNAを含有するDNAの塩基配
列およびこれから翻訳されるアミノ酸配列を示す。 第６図は、実施例３で得られた、大腸菌用のポリペプチ
ド（Ｉ）発現ベクターpENGFT102の構築図を示す。 第７図は、実施例５で得られた、動物細胞用のポリペプ
チド（Ｉ）発現ベクターpNTK26およびpNTL145の構築図
を示す。 第８図は、実施例６で得られた、動物細胞用のポリペプ
チド（Ｉ）発現ベクターpNTS101の構築図を示す。 第９図は、実施例８で得られた、酵母用のポリペプチド
（Ｉ）発現ベクターpANT341Tの構築図を示す。 第10図は、実施例12で得られた、ニワトリ胚知覚神経細
胞の存在に及ぼす各サンプルの影響を示す。 第11図は、実施例13で得られた、ラットポリペプチド
（Ｉ）遺伝子の塩基配列およびこれから翻訳されるアミ
ノ酸配列を示す。 第12図は、実施例15で得られた、ポリペプチド（Ｉ）発
現プラスミドpBT1139の構築図を示す。
まれるポリペプチド（Ｉ）cDNAを含むDNAの制限酵素地
図を示す。 第２図は、実施例１で得られた、プラスミドpUNK5に含
まれるポリペプチド（Ｉ）cDNAの塩基配列およびこれか
ら翻訳されるアミノ酸配列を示す。 第３図は、実施例１で述べた、本発明のポリペプチド
（Ｉ）のアミノ酸配列（上段）とヒトβNGFのアミノ酸
配列（下段）との比較を示す。 第４図は、実施例２で得られた、プラスミドpHNT2に含
まれるポリペプチド（Ｉ）cDNAを含有するDNAの制限酵
素地図を示す。 第５図は、実施例２で得られた、プラスミドpHNT2に含
まれるポリペプチド（Ｉ）cDNAを含有するDNAの塩基配
列およびこれから翻訳されるアミノ酸配列を示す。 第６図は、実施例３で得られた、大腸菌用のポリペプチ
ド（Ｉ）発現ベクターpENGFT102の構築図を示す。 第７図は、実施例５で得られた、動物細胞用のポリペプ
チド（Ｉ）発現ベクターpNTK26およびpNTL145の構築図
を示す。 第８図は、実施例６で得られた、動物細胞用のポリペプ
チド（Ｉ）発現ベクターpNTS101の構築図を示す。 第９図は、実施例８で得られた、酵母用のポリペプチド
（Ｉ）発現ベクターpANT341Tの構築図を示す。 第10図は、実施例12で得られた、ニワトリ胚知覚神経細
胞の存在に及ぼす各サンプルの影響を示す。 第11図は、実施例13で得られた、ラットポリペプチド
（Ｉ）遺伝子の塩基配列およびこれから翻訳されるアミ
ノ酸配列を示す。 第12図は、実施例15で得られた、ポリペプチド（Ｉ）発
現プラスミドpBT1139の構築図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 15/09 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 9282−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２３０４ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２４２０ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２４２１ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２５３０ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２５２９ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２３９９ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２６１８ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２７５４
Claims (17)
- 【請求項１】リボソームを不活化する天然の糖タンパク
質と同様のリボソーム抑制活性を有し、前記天然の糖タ
ンパク質よりも長い生体内持続性を有する、リボソーム
を不活化する修飾糖タンパク質であって、前記修飾糖タ
ンパク質が、分子量20,000〜30,000のリボソームを不活
化する糖タンパク質を過ヨウ素酸塩水溶液およびシアノ
ボロヒドリド水溶液でpH5〜７の水溶液中で、温度０〜1
5℃、暗所で0.2〜24時間に亘って処理することにより得
られることを特徴とするリボソーム不活化する修飾糖タ
ンパク質。 - 【請求項２】過ヨウ素酸塩およびシアノボロヒドリドで
の処理の間、糖タンパク質のチオール基の少なくとも一
つが保護されていることを特徴とする特許請求の範囲第
１項記載のリボソームを不活化する修飾糖タンパク質。 - 【請求項３】該水溶液が反応性Ａ−鎖を１〜10mg/ml、
アルカリ性過ヨウ素酸塩を10〜50mM、シアノボロヒドリ
ドを10〜200mM含む特許請求の範囲第１項記載のリボソ
ームを不活化する修飾糖タンパク質。 - 【請求項４】リボソームを不活化する天然の糖タンパク
質と同様のリボソーム抑制活性を有し、前記天然の糖タ
ンパク質よりも長い生体内持続性を有する、リボソーム
を不活化する修飾糖タンパク質の製造方法であって、分
子量20,000〜30,000のリボソームを抑制する糖タンパク
質を、過ヨウ素酸塩水溶液およびシアノボロヒドリド水
溶液でpH5〜７の水溶液中で温度０〜15℃、暗所で0.2〜
24時間に亘って処理することを特徴とするリボソームを
不活化する修飾糖タンパク質の製造方法。 - 【請求項５】該水溶液が反応性Ａ−鎖を１〜10mg/ml、
アルカリ性過ヨウ素酸塩を10〜50mM、シアノボロヒドリ
ドを10〜200mM含む特許請求の範囲第４項記載の方法。 - 【請求項６】上記処理に先立ち、糖タンパク質をSH基を
保護する試薬で処理し、IO4 -イオンおよびシアノボロヒ
ドリドによる処理ののち、このSH基を解放することを特
徴とする特許請求の範囲第５項記載の方法。 - 【請求項７】SH基の保護試薬が2,2′−ジニトロ−5,5′
−ジチオ−ジベンゾイン酸又は３−（２−ピリジルジス
ルファニル）プロピオン酸であり、SH基の脱保護を２−
メルカプト−エタノールによっておこなうことを特徴と
する特許請求の範囲第６項記載の方法。 - 【請求項８】リボソームを不活化する天然の糖タンパク
質と同様のリボソーム抑制活性を有し、前記天然の糖タ
ンパク質よりも長い生体内持続性を有し、分子量20,000
〜30,000のリボソームを不活化する糖タンパク質を過ヨ
ウ素酸塩水およびシアノボロヒドリド水溶液で、pH5〜
７の水溶液中で、温度０〜15℃、暗所で0.2〜24時間に
亘って処理することにより得られる前記修飾糖タンパク
質と、抗体又は抗体分画との結合により得られる生体中
での持続性を有する免疫毒素。 - 【請求項９】過ヨウ素酸塩およびシアノボロヒドリドで
の処理の間、糖タンパク質のチオール基の少なくとも一
つが保護されていることを特徴とする特許請求の範囲第
８項記載の免疫毒素。 - 【請求項１０】該水溶液が反応性Ａ−鎖を１〜10mg/m
l、アルカリ性過ヨウ素酸塩を10〜50mM、シアノボロヒ
ドリドを10〜200mM含む特許請求の範囲第８項記載の免
疫毒素。 - 【請求項１１】上記結合がジスルフィドブリッジによっ
ておこなわれている特許請求の範囲第８項ないし第10項
のいずれか一項記載の免疫毒素。 - 【請求項１２】上記結合を１−エチル−３−（３−ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミドによる活性化され
た３−（２−ピリジルジスルファニル）プロピオン酸、
又はＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチ
オ）プロピオン酸塩から選ばれるヘテロ２官能性反応性
剤を用いておこなう特許請求の範囲第８項ないし第10項
のいずれか一項記載の免疫毒素。 - 【請求項１３】リボソームを不活化する天然の糖タンパ
ク質と同様のリボソーム抑制活性を有し、分子量20,000
〜30,000のリボソームを不活化する糖タンパク質を過ヨ
ウ素酸塩水およびシアノボロヒドリド水溶液でpH5〜７
の水溶液中で、温度０〜15℃、暗所で0.2〜24時間に亘
って処理することにより得られる前記修飾糖タンパク質
と、抗体又は抗体分画との結合により得られる生体中で
の持続性を有する免疫毒素を有効成分として含む抗ガン
剤組成物。 - 【請求項１４】過ヨウ素酸塩およびシアノボロヒドリド
での処理の間、糖タンパク質のチオール基の少なくとも
一つが保護されていることを特徴とする特許請求の範囲
第13項記載の抗ガン剤組成物。 - 【請求項１５】該水溶液が反応性Ａ−鎖を１〜10mg/m
l、アルカリ性過ヨウ素酸塩を10〜50mM、シアノボロヒ
ドリドを10〜200mM含む特許請求の範囲第13項記載の抗
ガン剤組成物。 - 【請求項１６】上記結合がジスルフィドブリッジによっ
ておこなわれている特許請求の範囲第13項ないし第15項
のいずれか一項記載の抗ガン剤組成物。 - 【請求項１７】上記結合を１−エチル−３−（３−ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミドによる活性化され
た３−（２−ピリジルジスルファニル）プロピオン酸、
又はＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチ
オ）プロピオン酸塩から選ばれるヘテロ２官能性反応性
剤を用いておこなう特許請求の範囲第13項ないし第15項
のいずれか一項記載の抗ガン剤組成物。
Applications Claiming Priority (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1-58983 | 1989-03-10 | ||
| JP5898389 | 1989-03-10 | ||
| JP12771089 | 1989-05-19 | ||
| JP1-127710 | 1989-05-19 | ||
| JP1-193654 | 1989-07-26 | ||
| JP19365489 | 1989-07-26 | ||
| JP1-263613 | 1989-10-09 | ||
| JP26361389 | 1989-10-09 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03204897A JPH03204897A (ja) | 1991-09-06 |
| JPH0780904B2 true JPH0780904B2 (ja) | 1995-08-30 |
Family
ID=27463714
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2057751A Expired - Lifetime JPH0780904B2 (ja) | 1989-03-10 | 1990-03-08 | 新規ポリペプチド，ｄｎａおよびその用途 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6709837B1 (ja) |
| EP (1) | EP0386752B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0780904B2 (ja) |
| KR (1) | KR0132425B1 (ja) |
| AT (1) | ATE111521T1 (ja) |
| CA (1) | CA2011833C (ja) |
| DE (1) | DE69012377T2 (ja) |
| DK (1) | DK0386752T3 (ja) |
| ES (1) | ES2059854T3 (ja) |
| HK (1) | HK34896A (ja) |
| IE (1) | IE65361B1 (ja) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5656435A (en) * | 1989-08-28 | 1997-08-12 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Antibodies to peptides having NGF-like activity, said antibodies having no substantial cross-reactivity with NGF, and use thereof |
| US5180820A (en) * | 1989-08-30 | 1993-01-19 | Barde Yves Alain | Brain-derived neurotrophic factor |
| GR1000980B (el) * | 1989-08-30 | 1993-03-31 | Max Planck Gesellschaft | Νευροτροφινη-3,ενας νεος neυροτροφικος παραγοντας που σχετιζεται με τον παραγοντα αναπτυξης νευρων και τον νευροτροφικο παραγοντα που προερχεται απο τον εγκεφαλο. |
| US6933276B1 (en) | 1989-08-30 | 2005-08-23 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating peripheral neuropathies using neurotrophin-3 |
| US5235043A (en) * | 1990-04-06 | 1993-08-10 | Synergen, Inc. | Production of biologically active, recombinant members of the ngf/bdnf family of neurotrophic proteins |
| US6511823B1 (en) * | 1990-08-20 | 2003-01-28 | American Cyanamid Corporation | Heparin binding neurotrophic factor gene sequence |
| ATE154389T1 (de) * | 1991-02-18 | 1997-06-15 | Takeda Chemical Industries Ltd | Verfahren zur herstellung von menschlichem ngf-2 |
| US5389529A (en) * | 1991-06-12 | 1995-02-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Modified lamβ signal sequence and processes for producing recombinant neurotrophins |
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