JPH0768263B2 - α―アミラーゼ基質としてのインドフェノール置換マルトオリゴシド - Google Patents
α―アミラーゼ基質としてのインドフェノール置換マルトオリゴシドInfo
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- JPH0768263B2 JPH0768263B2 JP4508489A JP50848992A JPH0768263B2 JP H0768263 B2 JPH0768263 B2 JP H0768263B2 JP 4508489 A JP4508489 A JP 4508489A JP 50848992 A JP50848992 A JP 50848992A JP H0768263 B2 JPH0768263 B2 JP H0768263B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/20—Carbocyclic rings
- C07H15/203—Monocyclic carbocyclic rings other than cyclohexane rings; Bicyclic carbocyclic ring systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/40—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving amylase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、マルトシドまたはマルトトリオシドの還元末
端がα配置で置換インドフェノール残基に結合してい
る、マルトシドとマルトオリゴシドに関する。さらに本
発明は、α−アミラーゼの直接的測定、特に膵臓のα−
アミラーゼの測定に用いる合成酵素基質としてのこれら
の化合物の使用、並びにそのために適当な試薬に関す
る。
端がα配置で置換インドフェノール残基に結合してい
る、マルトシドとマルトオリゴシドに関する。さらに本
発明は、α−アミラーゼの直接的測定、特に膵臓のα−
アミラーゼの測定に用いる合成酵素基質としてのこれら
の化合物の使用、並びにそのために適当な試薬に関す
る。
α−アミラーゼ（E.C.3.2.1.1）は、主に1,4−α−グル
コシド結合を加水分解することによって、1,4−グルコ
シド結合をしたオリゴ糖および多糖を、マルトースとマ
ルトオリゴシドに分解する。工業的な醗酵技術での使用
に加えて、臨床分析や診断の分野において、当該酵素は
かなりの重要性を有する。特に膵臓のα−アミラーゼの
測定は診断上かなりの重要性を有する。なぜならば、数
多くの疾病において、体液中、例えば血清、尿、十二指
腸の分泌液中の当該酵素量が著しく変化するからであ
る。
コシド結合を加水分解することによって、1,4−グルコ
シド結合をしたオリゴ糖および多糖を、マルトースとマ
ルトオリゴシドに分解する。工業的な醗酵技術での使用
に加えて、臨床分析や診断の分野において、当該酵素は
かなりの重要性を有する。特に膵臓のα−アミラーゼの
測定は診断上かなりの重要性を有する。なぜならば、数
多くの疾病において、体液中、例えば血清、尿、十二指
腸の分泌液中の当該酵素量が著しく変化するからであ
る。
α−アミラーゼの測定方法およびこれらに好適な合成酵
素基質は数多く知られている。
素基質は数多く知られている。
EP−A0346912は、α−若しくはβ−配置で、ニトロ基又
ニトロビニル基によってパラ位が置換されているフェニ
ル残基に還元末端が結合しているマルトオリゴシドを開
示している。これらのマルトオリゴシドは、ヒドロラー
ゼ、リパーゼ、エステラーゼ、α−グルコシダーゼ、又
はグルコアミラーゼの活性の測定に好適な基質であるこ
とが述べられている。
ニトロビニル基によってパラ位が置換されているフェニ
ル残基に還元末端が結合しているマルトオリゴシドを開
示している。これらのマルトオリゴシドは、ヒドロラー
ゼ、リパーゼ、エステラーゼ、α−グルコシダーゼ、又
はグルコアミラーゼの活性の測定に好適な基質であるこ
とが述べられている。
EP−A0319933は、非還元末端が保護基よってブロックさ
れておらず、かつ還元末端が、α−若しくはβ−配置
で、置換若しくは非置換のフェニル残基と結合している
マルトトオリゴシドを開示している。置換されたフェニ
ル残基の例としては、ハロゲン−、ヒドロキシル−、ア
ルキル−、アルコキシカルボニル−、ニトロ−、及びフ
ェノール−置換フェニル残基を挙げることができる。こ
のフェニル残基は一つの若しくは幾つかのニトロ基によ
って置換されているのが好ましい。上記の型のβ結合し
たマルトオリゴシドは、補助酵素、例えばα−グルコシ
ダーゼとβ−グルコシダーゼの存在下でα−アミラーゼ
を測定するのに適していると記述されている。α−アミ
ラーゼの補助酵素の非存在下での直接的測定については
開示されていない。
れておらず、かつ還元末端が、α−若しくはβ−配置
で、置換若しくは非置換のフェニル残基と結合している
マルトトオリゴシドを開示している。置換されたフェニ
ル残基の例としては、ハロゲン−、ヒドロキシル−、ア
ルキル−、アルコキシカルボニル−、ニトロ−、及びフ
ェノール−置換フェニル残基を挙げることができる。こ
のフェニル残基は一つの若しくは幾つかのニトロ基によ
って置換されているのが好ましい。上記の型のβ結合し
たマルトオリゴシドは、補助酵素、例えばα−グルコシ
ダーゼとβ−グルコシダーゼの存在下でα−アミラーゼ
を測定するのに適していると記述されている。α−アミ
ラーゼの補助酵素の非存在下での直接的測定については
開示されていない。
日本明細書（64−42497）は、次の式： 〔式中、X1からX6は水素原子若しくはハロゲン原子、又
はニトロ、シアノ、アジド、アシル、スルホン酸、ニト
ロソ、スルホニル、スルホキシル、チオシアノ、イソチ
オシアノ、イソニトリル、イミノ、アゾ、ジアゾ、アル
キル、アリル、アリール基を意味し、そしてX3とX4及び
／又はX5とX6は結合することが可能であり、かつ縮合芳
香環を形成することができる。〕を有するインドフェノ
ール残基でβ−配置で還元末端が置換されているマルト
オリゴシドを開示している。
はニトロ、シアノ、アジド、アシル、スルホン酸、ニト
ロソ、スルホニル、スルホキシル、チオシアノ、イソチ
オシアノ、イソニトリル、イミノ、アゾ、ジアゾ、アル
キル、アリル、アリール基を意味し、そしてX3とX4及び
／又はX5とX6は結合することが可能であり、かつ縮合芳
香環を形成することができる。〕を有するインドフェノ
ール残基でβ−配置で還元末端が置換されているマルト
オリゴシドを開示している。
さらに、これらの化合物の製造方法、並びにα−及びβ
−グルコシダーゼの存在下におけるα−アミラーゼ基質
としてのそれらの使用が開示されている。かかる化合物
であるフェノールインド−３′−クロロフェニル−β−
マルトペンタオシド、ヘキサデカアセチル−（フエノー
ルインド−３′,5′−ジクロロフェニル）−β−マルト
ペタオシド、フェノールインド−３′,5′−ギクロロフ
ェニル−β−マルトヘプタオシド、ヘキサデカアセチル
−（2,5−ジメチルフェノールインド−３′−クロロフ
ェニル−β）−ペンタオシド、及びヘキサデカアセチル
−（１−ナフトールインド−３′−クロロフェニル）−
β−ペンタオシドの製造例中に具体的な開示がある。
−グルコシダーゼの存在下におけるα−アミラーゼ基質
としてのそれらの使用が開示されている。かかる化合物
であるフェノールインド−３′−クロロフェニル−β−
マルトペンタオシド、ヘキサデカアセチル−（フエノー
ルインド−３′,5′−ジクロロフェニル）−β−マルト
ペタオシド、フェノールインド−３′,5′−ギクロロフ
ェニル−β−マルトヘプタオシド、ヘキサデカアセチル
−（2,5−ジメチルフェノールインド−３′−クロロフ
ェニル−β）−ペンタオシド、及びヘキサデカアセチル
−（１−ナフトールインド−３′−クロロフェニル）−
β−ペンタオシドの製造例中に具体的な開示がある。
EP−A0263435は、次の式： 〔式中、上記化合物の還元末端の置換基Ｒは、α−配置
であり、ｎは０または１であり、そしてＲは次の基： （式中、R1からR6は無関係にハロゲン、NO2、SO3H、 であり、ここでR7は低級アルキル基である） から選ばれる置換芳香族基である〕を有する芳香族基で
置換されたグリコシド、その立体異性体、光学異性体お
よび幾何異性体並びにこれらの異性体の混合物を開示し
ている。これらの基質はα−アミラーゼに対する直接的
に基質であるもの（換言すれば、補助酵素の存在を必要
としない）として開示されている。実施例は、特に２−
クロロ−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシ
ド、４−クロロ−２−ニトロ−１−ナフチル−α−マル
トトリオシド、および２−ホルミル−４−ニトロフェニ
ル−α−Ｄ−アルトトリオシドの製造を開示する。これ
に加えて、当該基質および関連基質の製造方法について
も開示する。EP−A0263435に開示された化合物は、約38
5〜450nmの波長で最大吸光度を有する。
であり、ｎは０または１であり、そしてＲは次の基： （式中、R1からR6は無関係にハロゲン、NO2、SO3H、 であり、ここでR7は低級アルキル基である） から選ばれる置換芳香族基である〕を有する芳香族基で
置換されたグリコシド、その立体異性体、光学異性体お
よび幾何異性体並びにこれらの異性体の混合物を開示し
ている。これらの基質はα−アミラーゼに対する直接的
に基質であるもの（換言すれば、補助酵素の存在を必要
としない）として開示されている。実施例は、特に２−
クロロ−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシ
ド、４−クロロ−２−ニトロ−１−ナフチル−α−マル
トトリオシド、および２−ホルミル−４−ニトロフェニ
ル−α−Ｄ−アルトトリオシドの製造を開示する。これ
に加えて、当該基質および関連基質の製造方法について
も開示する。EP−A0263435に開示された化合物は、約38
5〜450nmの波長で最大吸光度を有する。
特開平２−306990号公報は発色団としてのインドフェニ
ル残基とオリゴグルコシドにおいて非置換のOH−基を有
し、２〜10個のグルコース単位を有するインドフェニル
−α−グルコシドを開示している。かかる開示例は、補
助酵素であるα−グルコシダーゼの存在下において測定
が行われるフェノールインド−３′−クロロフェニル−
α−Ｄ−マルトペンタオシドについてのものである。
ル残基とオリゴグルコシドにおいて非置換のOH−基を有
し、２〜10個のグルコース単位を有するインドフェニル
−α−グルコシドを開示している。かかる開示例は、補
助酵素であるα−グルコシダーゼの存在下において測定
が行われるフェノールインド−３′−クロロフェニル−
α−Ｄ−マルトペンタオシドについてのものである。
特開平２−306991号公報は、α−若しくはβ−結合と２
〜10個のグルコース単位を有するインドフェニル−グル
コシドの環状アセタールを開示する。かかるインドフェ
ニル−グルコシドの環状アセタールは発色団としてのイ
ンドフェニル基を持ち、グルコースのC4位とC6の非還元
末端のOH基がアルキル若しくはアルキリデン残基で置換
されている。５〜７個のグルコース単位の化合物が好ま
しいと言及されている。開示例は、補助酵素であるα−
グルコシダーゼとβ−グルコシダーゼの存在下において
測定が行われる、イソプロピリデン−フェノールインド
フェニル−α−マルトペンタオシドについてのものであ
る。
〜10個のグルコース単位を有するインドフェニル−グル
コシドの環状アセタールを開示する。かかるインドフェ
ニル−グルコシドの環状アセタールは発色団としてのイ
ンドフェニル基を持ち、グルコースのC4位とC6の非還元
末端のOH基がアルキル若しくはアルキリデン残基で置換
されている。５〜７個のグルコース単位の化合物が好ま
しいと言及されている。開示例は、補助酵素であるα−
グルコシダーゼとβ−グルコシダーゼの存在下において
測定が行われる、イソプロピリデン−フェノールインド
フェニル−α−マルトペンタオシドについてのものであ
る。
日本明細書03/085996は、発色団としてのインドフェニ
ル残基と非置換若しくはアシル基で置換されたOH基を有
し、かつグルコースのC4位とC6位の非還元末端のOH基が
所望によりアルキリデン基で置換されている、３〜８個
のグルコース単位を有するインドフェニル−β−マルト
オリゴシドを開示している。開示例は、補助酵素である
α−グルコシダーゼとβ−グルコシダーゼの存在下にお
いて測定が行われる、イソプロピリデン−フエノールイ
ンドフエニル−β−Ｄ−マルトペンタオシドについての
ものである。
ル残基と非置換若しくはアシル基で置換されたOH基を有
し、かつグルコースのC4位とC6位の非還元末端のOH基が
所望によりアルキリデン基で置換されている、３〜８個
のグルコース単位を有するインドフェニル−β−マルト
オリゴシドを開示している。開示例は、補助酵素である
α−グルコシダーゼとβ−グルコシダーゼの存在下にお
いて測定が行われる、イソプロピリデン−フエノールイ
ンドフエニル−β−Ｄ−マルトペンタオシドについての
ものである。
しかしながら、上述のすべての方法とα−アミラーゼ測
定用の酵素基質は欠点を有している。例えば、糖の還元
末端の置換基がα−又はβ−配置で結合する上述の５個
以上のグルコース単位の化合物は、補助酵素の存在下で
のαアミラーゼの測定に好適であるにすぎず、直接的基
質とはならない。他の物質は、感度が低くかつ最大光度
が好ましくない波長にある故に基質としては好ましくな
い。例えば、α−アミラーゼ試験が500nmの波長で行わ
れる場合、ヘモグロビンやビリルビンのような体液中に
存在する物質に起因する妨害が起こり得ることが知られ
ている。
定用の酵素基質は欠点を有している。例えば、糖の還元
末端の置換基がα−又はβ−配置で結合する上述の５個
以上のグルコース単位の化合物は、補助酵素の存在下で
のαアミラーゼの測定に好適であるにすぎず、直接的基
質とはならない。他の物質は、感度が低くかつ最大光度
が好ましくない波長にある故に基質としては好ましくな
い。例えば、α−アミラーゼ試験が500nmの波長で行わ
れる場合、ヘモグロビンやビリルビンのような体液中に
存在する物質に起因する妨害が起こり得ることが知られ
ている。
かくして、本発明の目的は、長波長領域、つまり約550n
m以上において吸収し、かつ補助酵素を必要とすること
なくα−アミラーゼで直接切断され得るα−アミラーゼ
基質を提供することである。
m以上において吸収し、かつ補助酵素を必要とすること
なくα−アミラーゼで直接切断され得るα−アミラーゼ
基質を提供することである。
本発明によるこの目的は、一般式I: 〔式中、 Glucはグルコース分子であり、そしてインドフェニル基
はα−配置で糖に結合され、 ｎは１または２であり、 R1は水素、直鎖状または分枝鎖状の炭素原子数１−６の
アルキルまたはアルコイル基、炭素原子数３−６のシク
ロアルキルまたはシクロアルコイル基、ベンゾイル、ベ
ンジルまたはフェニル基であり、 R2は水素であり、 あるいは、R1とR2は一緒になってメチレン橋を形成し、
その水素原子のそれぞれは独立して炭素原子数１−５の
アルキル基またはフェニル基で置換されていてもよく、 R3、R4、R5、R6は互いに独立して水素、ハロゲン（Ｆ、
Cl、Br）、ニトロ、アセトアミドまたはシアノ基、スル
ホン酸、スルフィン酸またはカルボン酸基もしくは対応
する酸アルキルエステルおよび酸アミド基、アルコキシ
基、所望により置換された直鎖状または分枝鎖状の炭素
原子数１−６のアルキル基、所望により置換された炭素
原子数３−６のシクロアルキル基または所望により置換
されたアリール基であり、あるいはR3とR4および／また
はR5とR6は互いに結合して縮合環を形成することがで
き、 ＸおよびＹは互いに独立して水素、ハロゲン（Ｆ、Cl、
Br）、ニトロ、アセトアミドまたはシアノ基、スルホン
酸、スルフィン酸またはカルボン酸基もしくは対応する
酸アルキルエステルおよび酸アミド基、アルコキシ基、
置換された直鎖状または分枝鎖状の炭酸原子数１−６の
アルキル基、所望により置換された炭素原子数３−６の
シクロアルキル基または所望により置換されたアリール
基である、 ただし、ＸとＹは同時に水素であることはない〕 を有する化合物により達成される。
はα−配置で糖に結合され、 ｎは１または２であり、 R1は水素、直鎖状または分枝鎖状の炭素原子数１−６の
アルキルまたはアルコイル基、炭素原子数３−６のシク
ロアルキルまたはシクロアルコイル基、ベンゾイル、ベ
ンジルまたはフェニル基であり、 R2は水素であり、 あるいは、R1とR2は一緒になってメチレン橋を形成し、
その水素原子のそれぞれは独立して炭素原子数１−５の
アルキル基またはフェニル基で置換されていてもよく、 R3、R4、R5、R6は互いに独立して水素、ハロゲン（Ｆ、
Cl、Br）、ニトロ、アセトアミドまたはシアノ基、スル
ホン酸、スルフィン酸またはカルボン酸基もしくは対応
する酸アルキルエステルおよび酸アミド基、アルコキシ
基、所望により置換された直鎖状または分枝鎖状の炭素
原子数１−６のアルキル基、所望により置換された炭素
原子数３−６のシクロアルキル基または所望により置換
されたアリール基であり、あるいはR3とR4および／また
はR5とR6は互いに結合して縮合環を形成することがで
き、 ＸおよびＹは互いに独立して水素、ハロゲン（Ｆ、Cl、
Br）、ニトロ、アセトアミドまたはシアノ基、スルホン
酸、スルフィン酸またはカルボン酸基もしくは対応する
酸アルキルエステルおよび酸アミド基、アルコキシ基、
置換された直鎖状または分枝鎖状の炭酸原子数１−６の
アルキル基、所望により置換された炭素原子数３−６の
シクロアルキル基または所望により置換されたアリール
基である、 ただし、ＸとＹは同時に水素であることはない〕 を有する化合物により達成される。
上記定義においてアリール基はフェニルまたはナフチル
基であることが好ましい。アルコキシ基は１個または数
個の酸素橋を含むことができ、従ってそれは例えばポリ
エチレングリコール鎖であり得る。アルキル、シクロア
ルキルおよびアリール基は所望により置換され、すなわ
ち、されらは酵素定量試験で一般に使用される条件下に
おいてα−アミラーゼと反応しない置換基（例えば、ハ
ロゲン）をもつことができる。
基であることが好ましい。アルコキシ基は１個または数
個の酸素橋を含むことができ、従ってそれは例えばポリ
エチレングリコール鎖であり得る。アルキル、シクロア
ルキルおよびアリール基は所望により置換され、すなわ
ち、されらは酵素定量試験で一般に使用される条件下に
おいてα−アミラーゼと反応しない置換基（例えば、ハ
ロゲン）をもつことができる。
一般式Ｉの化合物は、驚いたことに、それらがα−アミ
ラーゼにより直接（つまり、補助酵素の不在下で）切断
されて、同時に約550nm以上の長波長域において吸収す
るので、α−アミラーゼの合成酵素基質として非常に都
合がよい。本発明による物質の使用可能性は、インドフ
ェノール残基のＸおよびＹの両位置に水素原子が存在す
る同様の構造をもつ化合物がα−アミラーゼによって直
接切断されないことを考慮すると、より一層意外なこと
である。
ラーゼにより直接（つまり、補助酵素の不在下で）切断
されて、同時に約550nm以上の長波長域において吸収す
るので、α−アミラーゼの合成酵素基質として非常に都
合がよい。本発明による物質の使用可能性は、インドフ
ェノール残基のＸおよびＹの両位置に水素原子が存在す
る同様の構造をもつ化合物がα−アミラーゼによって直
接切断されないことを考慮すると、より一層意外なこと
である。
化合物Ｉの非還元末端における置換基R1とR2は、好まし
くは水素原子である。しかしながら、化合物Ｉをこれら
の位置で置換基によりブロックすることも可能である。
このような置換基の導入はDE−39 29 355に詳細に記載
されている。従って、残基R1およびR2は、対応する未置
換化合物Ｉから出発して、これらをエーテル化条件下で
ジアルコキシ化合物（好ましくは、ジアルコキシエタン
または対応するベンジル誘導体）と反応させて、R1とR2
が一緒になって所望により置換されたメチレン基を形成
する一般式Ｉの化合物を形成させることにより、導入す
ることができる。
くは水素原子である。しかしながら、化合物Ｉをこれら
の位置で置換基によりブロックすることも可能である。
このような置換基の導入はDE−39 29 355に詳細に記載
されている。従って、残基R1およびR2は、対応する未置
換化合物Ｉから出発して、これらをエーテル化条件下で
ジアルコキシ化合物（好ましくは、ジアルコキシエタン
または対応するベンジル誘導体）と反応させて、R1とR2
が一緒になって所望により置換されたメチレン基を形成
する一般式Ｉの化合物を形成させることにより、導入す
ることができる。
所望の置換基はまた、例えば対応するオルトエステル、
酸塩化物、酸無水物といった活性化カルボン酸から、ま
たは酵素的に活性化エステルから（J.A.C.S 110（198
8）,584−589）、またはアセタールから、あるいは例え
ばMitsunobu反応（Tetrahedron Letters Vol.30（198
9）,325−326）により脱水剤を使って直接カルボン酸か
ら、未保護基質に導入することができる。特に、中間生
成物として対応オルトエステルを経て進行する酵素的製
法、およびMitsunobu反応による製法が好適である。オ
ルトエステルは対応するニトリルから製造することが好
ましい（例えば、Houben Weyl,Vol.VI/3（1965）,300−
313）。これらの保護基質の精製は、例えばイオン交換
やHPLCのようなクロマトグラフィーを用いて実施するこ
とができる。
酸塩化物、酸無水物といった活性化カルボン酸から、ま
たは酵素的に活性化エステルから（J.A.C.S 110（198
8）,584−589）、またはアセタールから、あるいは例え
ばMitsunobu反応（Tetrahedron Letters Vol.30（198
9）,325−326）により脱水剤を使って直接カルボン酸か
ら、未保護基質に導入することができる。特に、中間生
成物として対応オルトエステルを経て進行する酵素的製
法、およびMitsunobu反応による製法が好適である。オ
ルトエステルは対応するニトリルから製造することが好
ましい（例えば、Houben Weyl,Vol.VI/3（1965）,300−
313）。これらの保護基質の精製は、例えばイオン交換
やHPLCのようなクロマトグラフィーを用いて実施するこ
とができる。
一般式Ｉにおいて、ｎは１まは２であり、かくして本発
明化合物はマルトシドまたはマルトトリオシドである。
これよりも高級のマルトオリゴシドはもはや直接的気質
としてα−アミラーゼに受け入れられない。本発明によ
る化合物は好ましくはマルトトリオシドである。
明化合物はマルトシドまたはマルトトリオシドである。
これよりも高級のマルトオリゴシドはもはや直接的気質
としてα−アミラーゼに受け入れられない。本発明によ
る化合物は好ましくはマルトトリオシドである。
Ｉのインドフェノール残基のフェニル環上の基Ｘおよび
Ｙは、互いに独立して、Ｈ、Ｆ、ClまたはBr、アセトア
ミド、ニトロ、またはシアノ基、スルホン酸、スルフィ
ン酸またはカルボン酸基もしくは対応する酸アルキルエ
ステルおよび酸アミド基、アルコキシ基（１個または数
個の酸素橋をもつ、例えばポリエチレングリコール
鎖）、所望により置換された直鎖状または分枝鎖状の炭
素原子数１−６のアルキル基、所望により置換された炭
素原子数３−６のシクロアルキル基または所望により置
換されたアリール基である。ただし、ＸとＹが同時に水
素であることはない。基ＸおよびＹの一方または両方が
水素で、他方の基が水素と異なる置換基を表す式Ｉの化
合物が一般に好適である。また、ＸとＹの少なくとも１
つはハロゲンであることが好ましく、特にＸがハロゲン
で、Ｙが水素であることが好適である。ハロゲンは塩素
を表す場合が最も好適である。
Ｙは、互いに独立して、Ｈ、Ｆ、ClまたはBr、アセトア
ミド、ニトロ、またはシアノ基、スルホン酸、スルフィ
ン酸またはカルボン酸基もしくは対応する酸アルキルエ
ステルおよび酸アミド基、アルコキシ基（１個または数
個の酸素橋をもつ、例えばポリエチレングリコール
鎖）、所望により置換された直鎖状または分枝鎖状の炭
素原子数１−６のアルキル基、所望により置換された炭
素原子数３−６のシクロアルキル基または所望により置
換されたアリール基である。ただし、ＸとＹが同時に水
素であることはない。基ＸおよびＹの一方または両方が
水素で、他方の基が水素と異なる置換基を表す式Ｉの化
合物が一般に好適である。また、ＸとＹの少なくとも１
つはハロゲンであることが好ましく、特にＸがハロゲン
で、Ｙが水素であることが好適である。ハロゲンは塩素
を表す場合が最も好適である。
一般式Ｉ中の基R3、R4、R5およびR6はインドフェノール
残基のベンゾキノン環上に存在しうる置換基を表す。こ
の場合に、R3、R4、R5およびR6は互いに独立して水素、
ハロゲン（Ｆ、Cl、Br）、ニトロ、アセトアミドまたは
シアノ基、スルホン酸基、スルフィン酸基またはカルボ
ン酸基もしくは対応する酸アルキルエステルおよび酸ア
ミド基、アルコキシ基、所望に置換された直鎖状または
分枝鎖状の炭素原子数１−６のアルキル基、所望により
置換された炭素原子数３−６のシクロアルキル基または
所望により置換されたアリール基であり、R3とR4および
／またはR5とR6は一緒に結合して縮合環を形成すること
ができ、アルコキシ基は１個または数個の酸素橋をもつ
ことができる。基R3とR4および／または基R5とR6が一緒
に結合する場合は、縮合環が形成される。このような置
換パターンを有する生成化合物Ｉも直接的α−アミラー
ゼ基質として適している。
残基のベンゾキノン環上に存在しうる置換基を表す。こ
の場合に、R3、R4、R5およびR6は互いに独立して水素、
ハロゲン（Ｆ、Cl、Br）、ニトロ、アセトアミドまたは
シアノ基、スルホン酸基、スルフィン酸基またはカルボ
ン酸基もしくは対応する酸アルキルエステルおよび酸ア
ミド基、アルコキシ基、所望に置換された直鎖状または
分枝鎖状の炭素原子数１−６のアルキル基、所望により
置換された炭素原子数３−６のシクロアルキル基または
所望により置換されたアリール基であり、R3とR4および
／またはR5とR6は一緒に結合して縮合環を形成すること
ができ、アルコキシ基は１個または数個の酸素橋をもつ
ことができる。基R3とR4および／または基R5とR6が一緒
に結合する場合は、縮合環が形成される。このような置
換パターンを有する生成化合物Ｉも直接的α−アミラー
ゼ基質として適している。
好ましくは、R3とR5は水素を表し、R4とR6はハロゲン、
特に塩素を表す。一般式Ｉの化合物のうち、２′,2,6−
トリクロロ−インドフェニル−α−マルトトリオシドが
最適であり、この化合物はその長波長吸光度の結果とし
て645nmの測定波長で測定可能であり、かつ補助酵素の
不在下でα−アミラーゼにより顕著に切断され得る。
特に塩素を表す。一般式Ｉの化合物のうち、２′,2,6−
トリクロロ−インドフェニル−α−マルトトリオシドが
最適であり、この化合物はその長波長吸光度の結果とし
て645nmの測定波長で測定可能であり、かつ補助酵素の
不在下でα−アミラーゼにより顕著に切断され得る。
本発明化合物は既知の方法で製造され、ここでは好適な
方法として３つの異なる方法を説明する。第１の好適な
方法はマルトースまたはマルトトリオースから出発す
る。これらの化合物を酢酸ナトリウム触媒の存在下に既
知方法で（例えば、無水酢酸との反応により）過アセチ
ル化し、これにより一般式II: 〔式中、Ac−Glucは過アセチル化グルコースを表し、化
合物IIの還元末端におけるアセチル基は糖にβ−配置で
結合される〕を有する化合物を製造する。
方法として３つの異なる方法を説明する。第１の好適な
方法はマルトースまたはマルトトリオースから出発す
る。これらの化合物を酢酸ナトリウム触媒の存在下に既
知方法で（例えば、無水酢酸との反応により）過アセチ
ル化し、これにより一般式II: 〔式中、Ac−Glucは過アセチル化グルコースを表し、化
合物IIの還元末端におけるアセチル基は糖にβ−配置で
結合される〕を有する化合物を製造する。
その後、化合物IIを、酸触媒の存在下で、一般式III: 〔式中、ＸおよびＹは上記の意味を有する〕を有する置
換ｐ−ニトロフェノールと反応させる。この反応に適す
る酸触媒は例えばアルキルスルホン酸またはアリールス
ルホン酸（例えば、ｐ−トルエンスルホン酸）あるいは
好ましくはルイス酸触媒（例えば、BF3.OEt2）である。
この反応はｐ−ニトロフェノールIIIによる糖の還元末
端のアセチル基の立体特異的置換反応であり、ｐ−ニト
ロフェニル基が生成化合物IVの糖に対してα−配置で結
合されるようないわゆるSN2反応機構により進行する。
換ｐ−ニトロフェノールと反応させる。この反応に適す
る酸触媒は例えばアルキルスルホン酸またはアリールス
ルホン酸（例えば、ｐ−トルエンスルホン酸）あるいは
好ましくはルイス酸触媒（例えば、BF3.OEt2）である。
この反応はｐ−ニトロフェノールIIIによる糖の還元末
端のアセチル基の立体特異的置換反応であり、ｐ−ニト
ロフェニル基が生成化合物IVの糖に対してα−配置で結
合されるようないわゆるSN2反応機構により進行する。
その後、化合物IVのニトロ基を既知の方法で（例えば、
Pd−Ｃ存在下での接触水素化により）アミノ基に還元す
る。次に、アセチル基を、例えばアンモニアの存在下で
のアルカリけん化により、生成化合物から切断する。
Pd−Ｃ存在下での接触水素化により）アミノ基に還元す
る。次に、アセチル基を、例えばアンモニアの存在下で
のアルカリけん化により、生成化合物から切断する。
脱アセチル化生成物は最後に、一般式V: 〔式中、R3、R4、R5およびR6は上記の意味を有する〕を
有する所望により置換されたｐ−ベンゾキノンと反応さ
せる。この方法では、一般式VI: 〔式中、インドフェノール残基はα−配置で糖に結合さ
れる〕を有する化合物が得られる。この反応はトリフル
オロ酢酸の存在下にジメチルホルムアミドまたはジオキ
サンもしくはこれらの混合物のような無水排プロトン性
溶媒中で行うことが好ましい。
有する所望により置換されたｐ−ベンゾキノンと反応さ
せる。この方法では、一般式VI: 〔式中、インドフェノール残基はα−配置で糖に結合さ
れる〕を有する化合物が得られる。この反応はトリフル
オロ酢酸の存在下にジメチルホルムアミドまたはジオキ
サンもしくはこれらの混合物のような無水排プロトン性
溶媒中で行うことが好ましい。
糖の非還元末端におけるグルコース残基の４および６位
の水素原子は、所望により、すでに上に詳述したように
別の工程で基R1およびR2により置換することができる。
の水素原子は、所望により、すでに上に詳述したように
別の工程で基R1およびR2により置換することができる。
別法として、一般式Ｉの化合物は、過アセチル化β−マ
ルトースまたはβ−マルトトリオースを、一般式VII: 〔式中、Ｘ、Ｙ、R3、R4、R5およびR6は上記の意味を有
する〕を有するインドフェノールと反応させることによ
り製造される。生成物のその後の処理（すなわち脱アセ
チル化と、場合により、非還元末端での誘導体化）は第
１の方法と同様に行う。
ルトースまたはβ−マルトトリオースを、一般式VII: 〔式中、Ｘ、Ｙ、R3、R4、R5およびR6は上記の意味を有
する〕を有するインドフェノールと反応させることによ
り製造される。生成物のその後の処理（すなわち脱アセ
チル化と、場合により、非還元末端での誘導体化）は第
１の方法と同様に行う。
本発明化合物の第３の製法では、最初に上記方法の一つ
により一般式VIII: 〔式中、各記号は上記の意味を有する〕を有するインド
フェノール−α−グルコシド誘導体を合成し、この化合
物をその後シクロデキストリン−グルコシルトランスフ
ェラーゼおよびシクロデキストリン、アミロースまたは
デンプンの共存下で“トリミング（trimming）”するこ
とにより本発明のマルトシドまたはマルトトリオシド誘
導体に変換する。
により一般式VIII: 〔式中、各記号は上記の意味を有する〕を有するインド
フェノール−α−グルコシド誘導体を合成し、この化合
物をその後シクロデキストリン−グルコシルトランスフ
ェラーゼおよびシクロデキストリン、アミロースまたは
デンプンの共存下で“トリミング（trimming）”するこ
とにより本発明のマルトシドまたはマルトトリオシド誘
導体に変換する。
糖の還元末端での置換基の配置において本発明化合物と
異なるβ−マルトオリゴシド誘導体の製法は、対応する
インドフェニル−β−グルコシド誘導体に関する日本の
明細書64−42497に詳細に記載されている。本発明によ
るα−マルトオリゴシド誘導体の製法は、原理的に、そ
れが過アセチル化β−マルトオリゴシド誘導体から出発
する点で相違するにすぎず、β−化合物の製造は過アセ
チル化α−マルトオリゴシド誘導体から出発する。
異なるβ−マルトオリゴシド誘導体の製法は、対応する
インドフェニル−β−グルコシド誘導体に関する日本の
明細書64−42497に詳細に記載されている。本発明によ
るα−マルトオリゴシド誘導体の製法は、原理的に、そ
れが過アセチル化β−マルトオリゴシド誘導体から出発
する点で相違するにすぎず、β−化合物の製造は過アセ
チル化α−マルトオリゴシド誘導体から出発する。
置換基の種類が本発明の物質と異なるα−マルトオリゴ
シド誘導体の製法はEP−A 0 263 435に記載されてい
る。
シド誘導体の製法はEP−A 0 263 435に記載されてい
る。
本発明はまた、請求項１に記載した一般式Ｉの化合物を
α−アミラーゼの基質として使用することからなる、合
成酵素基質を用いて水溶液（特に体液）中のα−アミラ
ーゼの活性を定量する方法に関する。この方法では、R1
およびR2が水素を表すか、または一緒になってメチレン
橋（その水素原子は互いに独立して炭素原子数１−５の
アルキル基またはフェニル基で置換され得る）を形成す
る化合物Ｉを使用することが好ましい。さらに、インド
フェニル基のフェニル環上の置換基ＸおよびＹの一方は
水素で、他方の置換基は水素でないことが好適である。
その上、基ＸおよびＹの少なくとも１つはハロゲンを表
すことが好ましい。酵素基質として２′,2,6−トリクロ
ロ−インドフェニル−α−マルトトリオシドを使用する
ことが特に好ましい。
α−アミラーゼの基質として使用することからなる、合
成酵素基質を用いて水溶液（特に体液）中のα−アミラ
ーゼの活性を定量する方法に関する。この方法では、R1
およびR2が水素を表すか、または一緒になってメチレン
橋（その水素原子は互いに独立して炭素原子数１−５の
アルキル基またはフェニル基で置換され得る）を形成す
る化合物Ｉを使用することが好ましい。さらに、インド
フェニル基のフェニル環上の置換基ＸおよびＹの一方は
水素で、他方の置換基は水素でないことが好適である。
その上、基ＸおよびＹの少なくとも１つはハロゲンを表
すことが好ましい。酵素基質として２′,2,6−トリクロ
ロ−インドフェニル−α−マルトトリオシドを使用する
ことが特に好ましい。
本発明による方法はα−アミラーゼ活性の直接定量、す
なわちα−グルコシダーゼやβ−グルコシダーゼのよう
な補助酵素の不在下での活性の定量を可能にする。
なわちα−グルコシダーゼやβ−グルコシダーゼのよう
な補助酵素の不在下での活性の定量を可能にする。
さらに、本発明方法を使用することにより、唾液α−ア
ミラーゼのための特異的阻害剤系を用いて唾液α−アミ
ラーゼの存在下に膵臓α−アミラーゼの活性を特異的に
定量することが可能である。１種または数種のモノクロ
ーナル抗体を含む阻害剤系は、例えばDE 39 29 355に開
示されている。適当な抗体は例えばEP−A 0 191 284、E
P−A 0 150 309およびEP−A 0 209 154に記載されてい
る。膵臓α−アミラーゼは、本発明による酵素基質と阻
害剤物質を併用することにより非常に選択的にかつ正確
に定量され得る。
ミラーゼのための特異的阻害剤系を用いて唾液α−アミ
ラーゼの存在下に膵臓α−アミラーゼの活性を特異的に
定量することが可能である。１種または数種のモノクロ
ーナル抗体を含む阻害剤系は、例えばDE 39 29 355に開
示されている。適当な抗体は例えばEP−A 0 191 284、E
P−A 0 150 309およびEP−A 0 209 154に記載されてい
る。膵臓α−アミラーゼは、本発明による酵素基質と阻
害剤物質を併用することにより非常に選択的にかつ正確
に定量され得る。
本発明はさらに、酵素基質として一般式Ｉを有する化合
物を含む、合成酵素基質によるα−アミラーゼの直接
的、特異的定量のための試薬に関する。本発明による試
薬は、R1およびR2が水素を表すか、または一緒になって
メチレン橋（その水素原子は互いに独立して炭素原子数
１−５のアルキル基またはフェニル基で置換され得る）
を形成する化合物Ｉを含むことが好ましい。さらに、一
般式Ｉを有する基質中の置換基ＸおよびＹの一方は水素
で、他方の置換基は水素と異なることが好適である。そ
の上、基ＸおよびＹの少なくとも１つはハロゲンを表す
ことが好ましい。基質として２′,2,6−トリクロロ−イ
ンドフェニル−α−マルトトリオシドを含む本発明試薬
が時に好ましい。酵素試験溶液中の本発明物質の最終濃
度は、好ましくは１−10mmol/l、特に３−7mmol/lであ
る。本発明試薬はさらにα−アミラーゼのための活性化
剤、例えばアジ化物またはチオシアン酸塩を含むことが
できる。活性化剤は好ましくは50−700mmol/l、特に100
−500mmol/lの最終濃度で使用される。さらに、本発明
試薬は１種または数種のモノクローナル抗体を含む唾液
α−アミラーゼのための特異的阻害剤系を含むこともで
きる。この場合には、膵臓α−アミラーゼの選択的定量
を行うことが可能である。
物を含む、合成酵素基質によるα−アミラーゼの直接
的、特異的定量のための試薬に関する。本発明による試
薬は、R1およびR2が水素を表すか、または一緒になって
メチレン橋（その水素原子は互いに独立して炭素原子数
１−５のアルキル基またはフェニル基で置換され得る）
を形成する化合物Ｉを含むことが好ましい。さらに、一
般式Ｉを有する基質中の置換基ＸおよびＹの一方は水素
で、他方の置換基は水素と異なることが好適である。そ
の上、基ＸおよびＹの少なくとも１つはハロゲンを表す
ことが好ましい。基質として２′,2,6−トリクロロ−イ
ンドフェニル−α−マルトトリオシドを含む本発明試薬
が時に好ましい。酵素試験溶液中の本発明物質の最終濃
度は、好ましくは１−10mmol/l、特に３−7mmol/lであ
る。本発明試薬はさらにα−アミラーゼのための活性化
剤、例えばアジ化物またはチオシアン酸塩を含むことが
できる。活性化剤は好ましくは50−700mmol/l、特に100
−500mmol/lの最終濃度で使用される。さらに、本発明
試薬は１種または数種のモノクローナル抗体を含む唾液
α−アミラーゼのための特異的阻害剤系を含むこともで
きる。この場合には、膵臓α−アミラーゼの選択的定量
を行うことが可能である。
さらに、本発明は、特にα−アミラーゼの酵素活性の直
接的定量に用いる、合成酵素基質としての一般式Ｉを有
する化合物の使用に関する。
接的定量に用いる、合成酵素基質としての一般式Ｉを有
する化合物の使用に関する。
図面を参照しながら、以下の実施例で本発明をさらに詳
しく説明することにする。
しく説明することにする。
図面において、図１は実施例２で試験したα−アミラー
ゼ基質の化学構造式を示す。
ゼ基質の化学構造式を示す。
実施例１ ２′,2,6−トリクロロ−インドフェニル−α−マルトト
リオシドの合成 ａ）デカ−アセチル−（２−クロロ４−ニトロフェニ
ル）−α−マルトトリオシド 無水トルエン450mlと無水ジクロロエタン100mlの混合物
中で、湿気を遮断して、0.1molの過アセチル化β−マル
トトリオシド、0.3molの２−クロロ−４−ニトロフェノ
ールおよび25mlのBF3.OEt2を45℃で32時間撹拌する。こ
の後ジクロロメタン500mlを加え、飽和Na2CO3溶液800ml
と共に振とうする。MgSO4で乾燥後、有機相を濃縮す
る。残留物をシリカゲル（移動溶媒：酢酸エチル／ヘキ
サン2:1）でクロマトグラフィーにかける。
リオシドの合成 ａ）デカ−アセチル−（２−クロロ４−ニトロフェニ
ル）−α−マルトトリオシド 無水トルエン450mlと無水ジクロロエタン100mlの混合物
中で、湿気を遮断して、0.1molの過アセチル化β−マル
トトリオシド、0.3molの２−クロロ−４−ニトロフェノ
ールおよび25mlのBF3.OEt2を45℃で32時間撹拌する。こ
の後ジクロロメタン500mlを加え、飽和Na2CO3溶液800ml
と共に振とうする。MgSO4で乾燥後、有機相を濃縮す
る。残留物をシリカゲル（移動溶媒：酢酸エチル／ヘキ
サン2:1）でクロマトグラフィーにかける。
収量:27g（25％） TLC:Rf0.59（シリカゲル；トルエン／アセトン7/4） ｂ）デカ−アセチル−（２−クロロ−４−アミノフェニ
ル）−α−マルトトリオシド 1a）からの生成物6.5g（mmol）をジオキサン160ml、メ
タノール60ml、氷酢酸2mlの混合物に溶かし、0.65gの10
％Pd−Ｃを加える。0.9バールで７時間水素化する。濾
過により触媒を除き、溶媒を除いた後、残留物をシリカ
ゲル（移動溶媒：トルエン／アセトン7:3）でクロマト
グラフィーにかける。
ル）−α−マルトトリオシド 1a）からの生成物6.5g（mmol）をジオキサン160ml、メ
タノール60ml、氷酢酸2mlの混合物に溶かし、0.65gの10
％Pd−Ｃを加える。0.9バールで７時間水素化する。濾
過により触媒を除き、溶媒を除いた後、残留物をシリカ
ゲル（移動溶媒：トルエン／アセトン7:3）でクロマト
グラフィーにかける。
収量:1.6g（25％） TLC:Rf＝0.42（シリカゲル；トルエン／アセトン7/4） ｃ）２−クロロ−４−アミノフェニル−α−マルトトリ
オシド 1b）からの生成物1g（1mmol/l）をメタノール50ml、水5
mlおよび25％アンモニア10mlに加え、室温で20時間撹拌
する。溶媒を除き、生成物をこれ以上精製せずに以後の
工程で反応させる。
オシド 1b）からの生成物1g（1mmol/l）をメタノール50ml、水5
mlおよび25％アンモニア10mlに加え、室温で20時間撹拌
する。溶媒を除き、生成物をこれ以上精製せずに以後の
工程で反応させる。
収量:680mg TLC:Rf＝0.47（シリカゲル；ブタノール／氷酢酸／水10
/3/5） ｄ）２′,2,6−トリクロロ−インドフェニル−α−マル
トトリオシド 1c）からの生成物680mgを無水ジメチルホルムアミド10m
lに溶かし、無水ジオキサン30ml、トリフルオロ酢酸0.2
ml、2,6−ジクロロベンゾキノン1g（5.8mmol）およびス
パチュラ３杯のモレキュラーシーブを加える。この混合
物を湿気を遮断して室温で２時間撹拌する。その後、こ
れを濾過し、濃縮し、残留物を水にとり、再度濾過す
る。瀘液をゲルクロマトグラフィー（LH20、移動溶媒：
水）で予備処理する。最後に、分離用HPLC（RP18;勾
配：水／イソプロパノール;0.1％トリフルオロ酢酸:80/
20％→65/35％）で精製する。
/3/5） ｄ）２′,2,6−トリクロロ−インドフェニル−α−マル
トトリオシド 1c）からの生成物680mgを無水ジメチルホルムアミド10m
lに溶かし、無水ジオキサン30ml、トリフルオロ酢酸0.2
ml、2,6−ジクロロベンゾキノン1g（5.8mmol）およびス
パチュラ３杯のモレキュラーシーブを加える。この混合
物を湿気を遮断して室温で２時間撹拌する。その後、こ
れを濾過し、濃縮し、残留物を水にとり、再度濾過す
る。瀘液をゲルクロマトグラフィー（LH20、移動溶媒：
水）で予備処理する。最後に、分離用HPLC（RP18;勾
配：水／イソプロパノール;0.1％トリフルオロ酢酸:80/
20％→65/35％）で精製する。
収量:60mg（８％） TLC:Rf＝0.62（シリカゲル；ブタノール／氷酢酸／水10
/3/5） 実施例２ α−アミラーゼの直接定量のための基質としての２′,
2,6−トリクロロ−インドフェニル−α−マルトトリオ
シドの使用 ヒト膵臓α−アミラーゼ（HPA）とヒト唾液α−アミラ
ーゼ（HSA）のアミラーゼ活性を次の表および図１に示
した基質を用いて試験した。次の試薬類を使用した： 試薬1: NaCl 57.1mmol/l 酢酸カルシウム 5.6mmol/l を含む ４−モルホリノ−エタンスルホネート （＝MES）緩衝液 61.6mmol/lpH6.0 試薬2: 基質（表に記載した） 49.3mmol/l 試薬１はさらに、所望により、表に記載した活性化剤
と、唾液α−アミラーゼの阻害剤としての細胞系NCACC
84122003（MAB I）およびNCACC 84111301（MAB II）に
より産生された抗体を含む。定量を行うために、1.00ml
の試薬１を0.02mlの試料と混合し、37℃でプレインキュ
ベートする。続いて、0.10mlの試薬２を加え、混合し、
そして１、２および３分後にそれぞれの測定波長（表を
参照）で吸光度を読み取る。吸光度／分の平均を算出す
る。
/3/5） 実施例２ α−アミラーゼの直接定量のための基質としての２′,
2,6−トリクロロ−インドフェニル−α−マルトトリオ
シドの使用 ヒト膵臓α−アミラーゼ（HPA）とヒト唾液α−アミラ
ーゼ（HSA）のアミラーゼ活性を次の表および図１に示
した基質を用いて試験した。次の試薬類を使用した： 試薬1: NaCl 57.1mmol/l 酢酸カルシウム 5.6mmol/l を含む ４−モルホリノ−エタンスルホネート （＝MES）緩衝液 61.6mmol/lpH6.0 試薬2: 基質（表に記載した） 49.3mmol/l 試薬１はさらに、所望により、表に記載した活性化剤
と、唾液α−アミラーゼの阻害剤としての細胞系NCACC
84122003（MAB I）およびNCACC 84111301（MAB II）に
より産生された抗体を含む。定量を行うために、1.00ml
の試薬１を0.02mlの試料と混合し、37℃でプレインキュ
ベートする。続いて、0.10mlの試薬２を加え、混合し、
そして１、２および３分後にそれぞれの測定波長（表を
参照）で吸光度を読み取る。吸光度／分の平均を算出す
る。
計算： 試験混合物中の最終濃度は次の通りである： MES緩衝液,pH6.0 55 mmol/l NaCl 51 mmol/l 酢酸カルシウム ５ mmol/l 基質 4.44mmol/l 任意の活性化剤 アジ化ナトリウム 152 mmol/l またはチオシアン酸カリウム 400 mmol/l MAB I 約５−８ mg/l MAB II 約２−３ mg/l 試料としてヒト膵臓アミラーゼ（HPA）を使用する。測
定はそれぞれの場合に示した測定波長において37℃で行
う。結果を表に示す。
定はそれぞれの場合に示した測定波長において37℃で行
う。結果を表に示す。
得られた結果から、フェニル環の２′位に水素以外の置
換基、特にハロゲン、をもつインドフェニル誘導体のみ
が直接的アミラーゼ基質を構成することが分かる。２位
に置換基が存在しない場合は、アミラーゼ切断が起こら
ない。
換基、特にハロゲン、をもつインドフェニル誘導体のみ
が直接的アミラーゼ基質を構成することが分かる。２位
に置換基が存在しない場合は、アミラーゼ切断が起こら
ない。
実施例３ ａ）イソプロピリデン−２−クロロ−４−ニトロフェニ
ル−α−Ｄ−マルトトリオシド 実施例1a）からのデカ−アセチル−（２−クロロ−４−
ニトロフェニル）−α−マルトトリオシド14.25gをメタ
ノール450mlに溶かす。水45mlと濃アンモニア水溶液90m
lをこれに加え、室温で16時間撹拌する。これを濃縮
し、得られた２−Cl−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マ
ルトトリオシドをDMF15mlに溶かす。1.25ml（10mmol）
の2,2−ジメトキシプロパン（Merck802936）と172mg（1
mmol）の無水ｐ−トルエン−スルホン酸を順次加える。
撹拌しながら48℃で80分間反応させる。その後混合物を
15ml（0.24mol/l）のNaHCO3溶液に滴下する。この混合
物を40mlずつの酢酸エチルと共に２回振とうする。水相
を濃縮し、続いてセファデックスLH20カラム（Pharmaci
a）でクロマトグラフィーにかける。
ル−α−Ｄ−マルトトリオシド 実施例1a）からのデカ−アセチル−（２−クロロ−４−
ニトロフェニル）−α−マルトトリオシド14.25gをメタ
ノール450mlに溶かす。水45mlと濃アンモニア水溶液90m
lをこれに加え、室温で16時間撹拌する。これを濃縮
し、得られた２−Cl−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マ
ルトトリオシドをDMF15mlに溶かす。1.25ml（10mmol）
の2,2−ジメトキシプロパン（Merck802936）と172mg（1
mmol）の無水ｐ−トルエン−スルホン酸を順次加える。
撹拌しながら48℃で80分間反応させる。その後混合物を
15ml（0.24mol/l）のNaHCO3溶液に滴下する。この混合
物を40mlずつの酢酸エチルと共に２回振とうする。水相
を濃縮し、続いてセファデックスLH20カラム（Pharmaci
a）でクロマトグラフィーにかける。
溶離剤：水。適当な画分を凍結乾燥する。
収量:150mg TLC:Rf＝0.51（シリカゲルTLC,Merck5735,移動溶媒:1−
ブタノール／氷酢酸／水＝10/3/5） ｂ）イソプロピリデン−２−クロロ−４−アミノフェニ
ル−α−Ｄ−マルトトリオシド 実施例3a）からのイソプロピリデン−２−クロロ−４−
ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド150mgをメ
タノール10mlとテトラヒドロフラン25mlに溶かし、30mg
のPd/活性炭（10％Pd,Merck807104）を加える。
ブタノール／氷酢酸／水＝10/3/5） ｂ）イソプロピリデン−２−クロロ−４−アミノフェニ
ル−α−Ｄ−マルトトリオシド 実施例3a）からのイソプロピリデン−２−クロロ−４−
ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド150mgをメ
タノール10mlとテトラヒドロフラン25mlに溶かし、30mg
のPd/活性炭（10％Pd,Merck807104）を加える。
激しく撹拌しながら過度の圧力をかけずに２時間水素化
する。全混合物を濾過して触媒を除き、蒸発させ、30分
後に高真空ポンプで乾燥する。
する。全混合物を濾過して触媒を除き、蒸発させ、30分
後に高真空ポンプで乾燥する。
収量:140mg TLC:Rf＝0.44（シリカゲル,Merck5735,移動溶媒:1−ブ
タノール／氷酢酸／水＝10/3/5） ｃ）イソプロピリデン−２′,2,6−トリクロロ−インド
フェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド 実施例3b）からのイソプロピリデン−２−クロロ−４−
アミノフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド140mg（0.2
mmol）を1.5mlの蒸留した無水ジメチルホルムアミドに
溶かす。これに3mlの無水ジオキサンと３滴のBF3−エチ
ルエーテルを加える。これを10℃に冷却し、0.22g（1.2
mmol）の2,6−ジクロロベンゾキソンを加える。10℃で1
5分間撹拌し、その後室温まで温めてさらに60分間撹拌
する。
タノール／氷酢酸／水＝10/3/5） ｃ）イソプロピリデン−２′,2,6−トリクロロ−インド
フェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド 実施例3b）からのイソプロピリデン−２−クロロ−４−
アミノフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド140mg（0.2
mmol）を1.5mlの蒸留した無水ジメチルホルムアミドに
溶かす。これに3mlの無水ジオキサンと３滴のBF3−エチ
ルエーテルを加える。これを10℃に冷却し、0.22g（1.2
mmol）の2,6−ジクロロベンゾキソンを加える。10℃で1
5分間撹拌し、その後室温まで温めてさらに60分間撹拌
する。
この反応混合物に40mlのジエチルエーテルを加えると、
生成物が析出する。これを濾過し、残留物をジエチルエ
ーテルで洗う。セファデックスLH20（Pharmacia）にか
け、水で溶離して生成物を得る。
生成物が析出する。これを濾過し、残留物をジエチルエ
ーテルで洗う。セファデックスLH20（Pharmacia）にか
け、水で溶離して生成物を得る。
TLC:Rf＝0.60（シリカゲル,Merck5735,移動溶媒:1−ブ
タノール／氷酢酸／水＝10/3/5） 実施例４ ２′−クロロ−２−メチル−インドフェニル−α−マル
トトリオシドの合成 1c）からの生成物3.5gを15mlの無水ジメチルホルムアミ
ドに溶かし、60mlの無水ジオキサン、1.3mlのBF3−エチ
ルエーテル、2.45g（20mmol）の２−メチル−４−ベン
ゾキノンおよびスパチュラ１杯のモレキュラーシーブを
加える。この混合物を湿気を遮断して一夜（16時間）室
温で撹拌する。続いて200mlの酢酸エチルを加え、これ
から形成された沈殿物をG4フリットを通して吸引する。
残留物を水に溶かし、セファデックスLH20カラムにかけ
て精製する。
タノール／氷酢酸／水＝10/3/5） 実施例４ ２′−クロロ−２−メチル−インドフェニル−α−マル
トトリオシドの合成 1c）からの生成物3.5gを15mlの無水ジメチルホルムアミ
ドに溶かし、60mlの無水ジオキサン、1.3mlのBF3−エチ
ルエーテル、2.45g（20mmol）の２−メチル−４−ベン
ゾキノンおよびスパチュラ１杯のモレキュラーシーブを
加える。この混合物を湿気を遮断して一夜（16時間）室
温で撹拌する。続いて200mlの酢酸エチルを加え、これ
から形成された沈殿物をG4フリットを通して吸引する。
残留物を水に溶かし、セファデックスLH20カラムにかけ
て精製する。
収量:230mg TLC:Rf＝0.44（シリカゲル;1−ブタノール／氷酢酸／水
＝10/3/5） 実施例５ ２′−クロロ−2,6−ジメチル−インドフェニル−α−
マルトトリオシドの合成 1c）からの生成物500mgを無水ジメチルホルムアミド5m
l、無水ジオキサン10ml、BF3−エチルエーテル0.2mlに
溶かし、0.55g（3mmol）の2,6−ジメチル−４−ベンゾ
キソンとスパチュラ２杯のモレキュラーシーブを加え
る。この混合物を湿気を遮断して一夜室温で撹拌する。
続いて20mlの酢酸エチルと20mlのジエチルエーテルを加
え、形成された沈殿物をG4フリットを通して吸引する。
この橙赤色の残留物を水に溶かし、セファデックスLH20
カラムにかけて精製する。
＝10/3/5） 実施例５ ２′−クロロ−2,6−ジメチル−インドフェニル−α−
マルトトリオシドの合成 1c）からの生成物500mgを無水ジメチルホルムアミド5m
l、無水ジオキサン10ml、BF3−エチルエーテル0.2mlに
溶かし、0.55g（3mmol）の2,6−ジメチル−４−ベンゾ
キソンとスパチュラ２杯のモレキュラーシーブを加え
る。この混合物を湿気を遮断して一夜室温で撹拌する。
続いて20mlの酢酸エチルと20mlのジエチルエーテルを加
え、形成された沈殿物をG4フリットを通して吸引する。
この橙赤色の残留物を水に溶かし、セファデックスLH20
カラムにかけて精製する。
収量:35mg TLC:Rf＝0.44（シリカゲル;1−ブタノール／氷酢酸／水
＝10/3/5） 実施例６ α−アミラーゼの直接定量のための基質としての実施例
４および５により製造した物質の使用 手順は実施例２と同様である。結果を表２に示す。
＝10/3/5） 実施例６ α−アミラーゼの直接定量のための基質としての実施例
４および５により製造した物質の使用 手順は実施例２と同様である。結果を表２に示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ラオシェア，エリ ドイツ連邦共和国 Ｗ―8000 ミュンヘン 70 ガルディニシュトラーセ 71 (56)参考文献 特開 平２−306990（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−306991（ＪＰ，Ａ)
Claims (27)
- 【請求項１】一般式I: 〔式中、 Glucはグルコース分子であり、そしてインドフェニル基
はα−配置で糖に結合され、 ｎは１または２であり、 R1は水素、直鎖状または分枝鎖状の炭素原子１−６のア
ルキルまたはアルコイル基、炭素原子数３−６のシクロ
アルキルまたはシクロアルコイル基、ベンゾイル、ベン
ジルまたはフェニル基であり、 R2は水素であり、 あるいは、R1とR2は一緒になってメチレン橋を形成し、
その水素原子のそれぞれは独立して炭素原子数１−５の
アルキル基またはフェニル基で置換されていてもよく、 R3、R4、R5、R6は互いに独立して水素、ハロゲン（Ｆ、
Cl、Br）、ニトロ、アセトアミドまたはシアノ基、スル
ホン酸基、スルフィン酸基またはカルボン酸基もしくは
対応する酸アルキルエステル基および酸アミド基、アル
コキシ基、置換または非置換の直鎖状または分枝鎖状の
炭素原子数１−６のアルキル基、置換または非置換の炭
酸原子数３−６のシクロアルキル基または置換または非
置換のアリール基であり、あるいはR3とR4および／また
はR5とR6は互いに結合して縮合環を形成することがで
き、 ＸおよびＹは互いに独立して水素、ハロゲン（Ｆ、Cl、
Br）、ニトロ、アセトアミドまたはシアノ基、スルホン
酸、スルフィン酸またはカルボン酸基もしくは対応する
酸アルキルエステルおよび酸アミド基、アルコキシ基、
置換または非置換の直鎖状または分枝鎖状の炭酸原子数
１−６のアルキル基、置換または非置換の炭素原子数３
−６のシクロアルキル基または置換または非置換のアリ
ール基である、 ただし、ＸとＹは同時に水素であることはない〕 で表される化合物。 - 【請求項２】R1およびR2が水素を表す、請求項１記載の
化合物。 - 【請求項３】ｎが２である、請求項１または２記載の化
合物。 - 【請求項４】２つの基ＸおよびＹのうち一方が水素で、
他方が水素と異なる、請求項１−３のいずれか１つに記
載の化合物。 - 【請求項５】基ＸおよびＹの少なくとも１つがハロゲン
を表す、請求項１−４のいずれか１つに記載の化合物。 - 【請求項６】ハロゲンが塩素である、請求項５記載の化
合物。 - 【請求項７】R3とR5が水素で、R4とR6がハロゲンを表
す、請求項１−６のいずれか１つに記載の化合物。 - 【請求項８】R4とR6が塩素を表す、請求項７記載の化合
物。 - 【請求項９】２′,2,6−トリクロロ−インドフェニル−
α−マルトトリオシド。 - 【請求項１０】請求項１記載の一般式Ｉを有する化合物
の製造方法であって、（ａ）マルトースまたはマルトト
リオースを既知の方法で過アセチル化し、これにより一
般式II: 〔式中、Ac−Glucは過アセチル化グリコースを表し、化
合物IIの還元末端におけるアセチル基は糖にβ−配置で
結合される〕を有する化合物を形成し、 （ｂ）化合物IIを、酸触媒の存在下で一般式III: 〔式中、ＸおよびＹは請求項１記載の意味を有する〕の
置換ｐ−ニトロフェノールと反応させ、これにより一般
式IV: 〔式中、ｐ−ニトロフェニル基は糖にα−配置で結合さ
れる〕を有する化合物を形成し、 （ｃ）化合物IVのニトロ基を既知の方法でアミノ基に還
元し、 （ｄ）工程（ｃ）から得られた化合物のアセチル基を除
去し、 （ｅ）工程（ｄ）から得られた化合物を、一般式V: 〔式中、R3、R4、R5およびR6は請求項１記載の意味を有
する〕を有する置換または非置換のｐ−ベンゾキノンと
反応させ、これにより一般式VI: 〔式中、インドフェニル基は糖にα−配置で結合され
る〕を有する化合物を形成し、所望により （ｆ）基R1およびR2によるマルトースまたはマルトトリ
オース残基 の非還元末端における４および６位の置換を既知の方法
で導入し、これにより一般式I: 〔式中、全ての記号は請求項１記載の意味を有する〕を
有する化合物を形成することからなる方法。 - 【請求項１１】請求項１記載の一般式Ｉを有する化合物
をα−アミラーゼの基質として使用することからなる、
合成酵素基質による水溶液（特に体液）中のα−アミラ
ーゼ活性の定量方法。 - 【請求項１２】R1およびR2が水素を表す化合物Ｉを使用
する、請求項11記載の方法。 - 【請求項１３】２つの基ＸおよびＹのうち一方が水素
で、他方が水素と異なる化合物Ｉを使用する、請求項11
または12記載の方法。 - 【請求項１４】２′,2,6−トリクロロ−インドフェニル
−α−マルトトリオシドを酵素基質として使用する、請
求項13記載の方法。 - 【請求項１５】α−アミラーゼ活性の定量を補助酵素の
存在下で行う、請求項11−14のいずれか１つに記載の方
法。 - 【請求項１６】唾液α−アミラーゼのための特異的阻害
剤系を使って唾液α−アミラーゼの存在下に膵臓α−ア
ミラーゼの活性を特異的に定量する、請求項11−15のい
ずれか１つに記載の方法。 - 【請求項１７】阻害剤系として１種または数種のモノク
ローナル抗体を使用する、請求項16記載の方法。 - 【請求項１８】合成酵素基質として請求項１記載の一般
式Ｉを有する化合物を含む、合成酵素基質によるα−ア
ミラーゼの特異的直接定量のための試薬。 - 【請求項１９】R1およびR2が水素を表す化合物Ｉを基質
として含む、請求項18記載の試薬。 - 【請求項２０】２つの基ＸおよびＹのうち一方が水素
で、他方が水素と異なる化合物Ｉを基質として含む、請
求項18または19記載の試薬。 - 【請求項２１】２′,2,6−トリクロロ−インドフェニル
−α−マルトトリオシドを基質として含む、請求項20記
載の試薬。 - 【請求項２２】活性化剤をさらに含む、請求項18−21の
いずれか１つに記載の試薬。 - 【請求項２３】活性化剤がアジド塩またはチオシアン酸
塩である、請求項22記載の試薬。 - 【請求項２４】唾液α−アミラーゼのための特異的阻害
剤系を含む、請求項18−23のいずれか１つに記載の試
薬。 - 【請求項２５】阻害剤系が１種または数種のモノクロナ
ール抗体からなる、請求項24記載の試薬。 - 【請求項２６】合成酵素基質としての請求項１−９のい
ずれか１つに記載の化合物の使用方法。 - 【請求項２７】α−アミラーゼの酵素活性の直接定量の
ための、請求項26記載の使用方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4113238A DE4113238A1 (de) | 1991-04-23 | 1991-04-23 | Indophenol-substituierte maltooligoside als (alpha)-amylase-substrate |
| DE4113238.6 | 1991-04-23 | ||
| PCT/EP1992/000888 WO1992018515A1 (de) | 1991-04-23 | 1992-04-22 | INDOPHENOL-SUBSTITUIERTE MALTOOLIGOSIDE ALS α-AMYLASE-SUBSTRATE |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05507094A JPH05507094A (ja) | 1993-10-14 |
| JPH0768263B2 true JPH0768263B2 (ja) | 1995-07-26 |
Family
ID=6430179
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4508489A Expired - Lifetime JPH0768263B2 (ja) | 1991-04-23 | 1992-04-22 | α―アミラーゼ基質としてのインドフェノール置換マルトオリゴシド |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0510620A1 (ja) |
| JP (1) | JPH0768263B2 (ja) |
| AT (1) | ATE140232T1 (ja) |
| DE (2) | DE4113238A1 (ja) |
| DK (1) | DK0536371T3 (ja) |
| ES (1) | ES2089520T3 (ja) |
| GR (1) | GR3020514T3 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US5766872A (en) * | 1995-11-20 | 1998-06-16 | Dade International Inc. | Method for eliminating hemolysis interference in an amylase analysis |
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02306990A (ja) * | 1989-05-22 | 1990-12-20 | Fuji Photo Film Co Ltd | インドフェニル―α―配糖体、その製法及びα―アミラーゼ活性測定用試薬への利用 |
| JPH02306991A (ja) * | 1989-05-22 | 1990-12-20 | Fuji Photo Film Co Ltd | インドフェニル配糖体の環状アセタール誘導体、その製法及びα―アミラーゼ活性測定用試薬への利用 |
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|---|---|---|---|---|
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1991
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-
1992
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- 1992-04-22 EP EP92106895A patent/EP0510620A1/de active Pending
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-
1996
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