JPH0786110B2

JPH0786110B2 - アミノメチルフルオレセイン誘導体

Info

Publication number: JPH0786110B2
Application number: JP58208438A
Authority: JP
Inventors: カ−チス・リ−・キルケモ; モハメド・トイブル・シ−プチヤンドラ−
Original assignee: アボットラボラトリーズ
Priority date: 1982-11-08
Filing date: 1983-11-08
Publication date: 1995-09-20
Anticipated expiration: 2010-09-20
Also published as: ES527082A0; EP0110186A1; JPS59104388A; US4510251A; ES8501531A1; CA1217478A; JPH0762019B2; JPH0741482A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は例えば血清、血漿、髄液、羊水及び尿の様な物
流体中の配位子の測定のための方法及び試薬に関する。
本発明は又、蛍光分極免疫評価分析で試薬として使用出
来る新規な種類のアミノメチルフルオレセイン誘導体に
関する。

配位子測定を目的とする競争結合免疫評価分析は、配位
子とトレーサーと名付けた標識付き試薬に対して特異性
を持つた抗体上の限られた数の受容体結合サイトに対す
る、試験試料の配位子とトレーサーとの間の競争（配
合）に基づいている。試料の配位子濃度が抗体と特異的
に結合するトレーサーの量をきめている。生成したトレ
ーサー−抗体配合体（corjugate）は定量的に測定出
来、その量は試験試料中の配位子の量に逆に関係する。
蛍光分極技術は蛍光標識を付された化合物が直線偏光
（平面偏光）によつて励起させられた時、その回転速度
に逆比例する偏光度を持つ蛍光を発するという原理に基
づいている。従つて、蛍光標識を有するトレーサー−抗
体配合体の様な分子が直線偏光によつて励起された時
は、光が吸収され放出される時間の間は蛍光（原子）団
が回転をさまたげられているので放出される光は高度に
偏光（分極）したままである。“遊離の”（即ち、抗体
と結合していない）トレーサー化合物が直線偏光によつ
て励起された時は、その回転が対応するトレーサー−抗
体配合体よりも極めて早く且つ分子がより不規則に配置
しているので、従つて放出された光は偏光が解消してい
る。従つて、蛍光偏光（分極）は競争結合免疫評価分析
で生成したトレーサー−抗体配合体の量を測定する定量
的手段を提供する。

本発明は式（Ｉ）但し、R₁はであり、（同式中のＲ′は水素又はＲ″で示される基で
あり、Ｒ″は配位子類似体であり、その実質的割合が配
位子と同一の空間及び極性の構成を有し、受容体の結合
サイトに対して該配位子と競争し得る一種以上の決定基
又はエピトープサイトを有する一価または多価の基であ
る）； R₂は水素又はR₁で示される基であり；及び R₃は水素、アミノ又はカルボニルである；の新規な種類のフルオレセイン誘導体及び生物学上許容
し得るその塩に関する。

本発明の化合物は蛍光偏光（分極）免疫評価分析の試薬
として有用である。

本明細書で使用する用語“配位子”（liyand）はそれに
対して結合した蛋白質−通常は抗体−を得ること又は形
成させることの出来る特に低分子量のハプテンを指すも
のとする。ハプテンは動物中に注射した時に抗体形成を
誘発しないが、抗体とは反応する一般に低分子量の蛋白
質の無い化合物である。先ずハプテンを蛋白質と配合さ
せ且つ配合生成物を動物に注射するとハプテンに対する
抗体が一般に出来る。得られた抗体は従来の抗体分離技
術で分離される。

本発明の方法で測定可能な配位子は非常に広汎な分子量
の範囲にわたつている。高分子量配位子も測定可能であ
るが、最良の結果を得るには、本発明の方法を一般に50
から4000の範囲の低分子量の配位子の測定を使用するの
が一般に好ましい。100乃至2000の範囲の分子量を持つ
配位子の測定がより好ましい。

本発明の方法に依つて測定出来る配位子の代表例には、
例えばエストリオール、エストロン、エストラジオー
ル、コルチゾール、テストステロン、プロゲステロン、
ケノデオキシコール酸、ジゴキシン、コール酸、ジキト
キシン、デオキシコール酸、リトコール酸及びそれらの
エステル及びアミド誘導体の様なステロイド；例えばＢ
−12、葉酸、チロキシン、トリヨードチロキシン、ヒス
タミン、セロトニン、PGE、PGF、PGAの様なプロスタグ
ランジンの様なビタミン；テオフイリンの様な抗端息
薬；ドキソルビシン及びメトトレキセートの様な抗新生
物薬；デイソピラミド、リドカイン、プロカインアミ
ド、プロプラノロール、キニジン、Ｎ−アセチルプロカ
インアミドの様な抗不整脈薬；フエノバビタール、フエ
ニトン、プリミドン、バルプロ酸、カルバマゼピン及び
エトサクシミドの様な抗ケイレン葉；ペニシリン、セフ
アロスポリン、エリスロマイシン、バンコマイシン、ゲ
ンタミシン、アミカシン、クロラムフエニコール、スト
レプトマイシン、及びトブラマイシンの様な抗生物質；
サルチル酸塩（サリチラート）の様な抗関節炎症薬；ノ
ルトリプチリン、アミトリプチリン、イミプラミン及び
デシプラミンを含む三環式化合物の様な抗制うつ薬；及
びそれらの代謝産物と共に類似物がある。更に、モルフ
イン、ヘロイン、ヒドロモルホン、オキシモルホン、メ
タポン（metapon）コデイン、ヒドロユドン、ジヒドロ
コデイン、ジヒドロヒドロキシコデイノン、ホロコジン
（pholocodine）、デキストロメトルフアン、フエナゾ
シン及びデオニン及びそれらの代謝産物の様な悪用され
た薬も本発明の方法によつて測定出来る。

本明細書中で使用する用語「配位子類似体（ligand-ana
log）」は、その実質的割合が配位子（リガンド）と同
一の空間及び極性の構成を有し、受容体の結合サイトに
対して該配位子と競争し得る一種以上の決定基（デター
ミナント）又はエピトープサイトを有する一価または多
価の基である。そのような配位子類似体の特徴は、この
類似体が抗体によって配位子として認識されるように、
対象の配位子と構造上十分な類似性を持つことにある。
多くは、この配位子類似体は、その分子表面の主要部分
について対象の配位子と同一かまたは実質的に同一の構
造及び荷電分布（空間の及び極性の構成）を有するであ
ろう。しばしばハプテンについての結合サイトが配位子
との結合に使用されるものと抗体の生産のために抗原を
準備するのと同一なので、抗体に対して鋳型（テンプレ
ート）の役割を果す配位子類似体の同一の部分がトレー
サー中の配位子類似体にさらされるであろう。

配位子類似体は式（II）（但しｎは０又は１である）のアルミメチルフルオレセ
イン誘導体との配合に適した官能性又は官能性にした配
位子として記述されるであろう。

好ましい官能基の代表としては、例えば、活性化された
酸、即ち活性エステル、酸クロライド、及びアミド；イ
ソシアネート、イソチオシアネート、及び置換ハロアル
キル誘導体が包含される。

本発明のトレーサーは一般にそのプロトン化された状態
とイオン化された状態の間の平衡（状態）で存在してお
り、本発明の方法で有効なのはイオン化された状態であ
る。従つて本発明はプロトン化された状態か又はイオン
化された状態のトレーサーより成り、且つ便宜上、本発
明のトレーサーを構造的に本明細書中ではプロトン化さ
れた状態で代表させておく。本発明のトレーサーがイオ
ン化された状態で存在する時は、トレーサーが生物学上
許容し得る塩の形態で存在する。本明細書中で使用され
ている如く、“生物学上許容し得る塩”とは、本発明の
方法で使用された時にトレーサーがイオン化された状態
で存在する、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウ
ム及び類似物の様な塩を指す。一般に本発明のトレーサ
ーが溶液中で塩として存在する時は、緩衝液を用いた
時、即ち燐酸ナトリウム緩衝液の共存下で得られる特定
の塩として存在する時は、本発明のトレーサーは一般に
そのナトリウム塩としてイオン化された状態で存在する
であろう。

本発明のトレーサーは以下の方法に従つて調製出来る。

フルオレセインを硫酸の存在下でクロロアセトアミドメ
タノールで処理すると式（III）のクロロアセトアミド
誘導体が得られる。

このクロロアセトアミド誘導体を酸及びエタノールの共
存下で加水分解して式（IV）；（但しＡは、例えば、一例として、塩化水素、トリフル
オロアセテート、アセテート、トリクロロアセテート及
び類似物の様な３より小なpHを持つ酸塩である）のアミ
ノメチルフルオレセイン誘導体の酸塩が得られる。

式（IV）のアミノメチルフルオレセイン誘導体を式
（Ｖ）；Ｒ″−Ｙ（Ｖ）（但しＹは活性化されたエステル基である）の配位子類
似体の活性化されたエステルで適当な溶媒中で処理する
と式（VI）；の化合物が得られる。

本発明のトレーサーの調製反応を進行させる反応温度は
臨界的ではない。温度は反応を開始させ且つ維持するの
に充分なものであるべきである。通常は便宜上及び経済
性から、室温で充分である。本発明のトレーサーの調製
では反応物の比率は狭い範囲に限定されるものではな
い。

取扱い及び生成物回収の容易さのために、本発明のトレ
ーサーの調製プロセスは不活性溶媒の存在で実施する。
好適な不活性溶媒には、実質上出発物質と反応せず且つ
充分に出発物質を溶解する溶媒であつて、例えばクロロ
ホルム、ピリジン及び類似物が包含される。最高の生成
物収率を得るために、反応を好ましくは中性又は塩基性
条件で進める。好適な塩基には、例えばトリエチルアミ
ン、ピリジン、及び類似物が包含される。反応生成物
は、本発明の方法に利用する前に、一般に薄層又はカラ
ム・クロマトグラフイーを用いて精製する。

本発明の方法によれば、測定すべき配位子を含んだ試料
を式（VI）のトレーサーの生物学上許容し得る塩及び配
位子及びトレーサーに対して特異性のある抗体と混合す
る。試料中の配位子とトレーサーが限られた抗体のサイ
トに向かって競争し、その結果、配位子−抗体複合体及
びトレーサー−抗体複合体が形成される。トレーサー及
び抗体の濃度を一定にしておけば、生成した配位子−抗
体複合体のトレーサー−抗体複合体に対する比は試料中
に存在する配位子の量に直接比例する。従って、蛍光灯
によって混合物を励起させ且つトレーサー及びトレーサ
ー−抗体複合体から放出される蛍光の偏光（分極）を測
定すれば、試料中の配位子の量を定量的に定めることが
出来る。

理論上は、抗体と複合体形成していないトレーサーの蛍
光分極は低く、ゼロに近い。特定の抗体との複合体形成
に依り、かくして形成されたトレーサー−抗体複合体で
は、比較的小さなトレーサー分子よりも抗体分子の回転
がゆっくりしていると考えられ、測定される偏光（分
極）が増える。従って、抗体のサイトをトレーサーと配
位子とを競争させた時は、トレーサー−抗体複合体の実
測される蛍光偏光分極はトレーサーとトレーサー−抗体
のものの間の値となる。試料が高濃度の配位子を含有し
ている時は、実測した（偏光）分極値は遊離の配位子の
それ、即ち低い値に近くなつている。試験試料が低濃度
の配位子を含む時は、分極値は結合した配位子のそれ、
即ち高い値に近くなる。免疫評価分析の反応混合物を垂
直及び水平偏光した光で逐次的に励起し且つ放出される
光の垂直成分だけを分析すれば、反応混合物の蛍光の
（偏光）分極を正確に求めることが出来る。測定すべき
配位子の（偏光）分極と濃度との厳密な関係は既知濃度
のキヤリビレーターを測定して定める。配位子の濃度は
この方法で作成した標準カーブから外挿出来る。

本発明の方法を実施するpHは、式（VI）のトレーサーが
そのイオン化された状態で存在するのに充分なものでな
ければならぬ。pHは約３乃至12、より通常は５乃至10の
範囲、最も好ましくは約６乃至８の範囲とすることが出
来る。評価分析実施の間、所定のpHにして維持するため
に様々の緩衝液が使用可能である。代表的な緩衝液には
硼酸塩、燐酸塩、炭酸塩、トリス、バルビタール及び類
似物がある。使用される特定の緩衝液が本発明にとつて
決定的なのではなく、それぞれの評価分析に於て使用さ
れる抗体及び測定すべき配位子についてみると特定の緩
衝液が好ましいこととなろう。緩衝液のカチオン部分は
溶液中のトレーサー塩のカチオン部分によつて一般には
きまるであろう。

本発明の方法は温和な温度で且つ好ましくは恒温で実施
される。温度は通常は約０°乃至50℃、より普通には約
15°乃至40℃の範囲であろう。

評価分析可能な配位子濃度は一般に約10^-2乃至10
^-13Ｍ、より普通は約10^-4乃至10^-10Ｍの範囲であろう。
これより高い濃度の配位子は原試料を稀釈して評価分析
出来よう。対象とする配位子の濃度範囲以外に、評価分
析が定性的か、半定量的か、定量的かのいずれであると
いう様な判断、使用する装置、及びトレーサー及び抗体
の特徴が通常は使用するトレーサー及び抗体の濃度をき
める因子となる。他の試薬、即ちトレーサー及び抗体の
濃度は評価分析の感度を最適化するように通常はなつて
いるので、個々の試薬の濃度は実験的に定められるであ
ろう。トレーサー及び抗体の濃度は当業界の通常の技術
を有する人によつて容易に定められる。

以下の例示的な、非限定的な実施例は当業者に本発明の
範囲の特定のトレーサーが調整可能の方法を更に詳しく
示すためのものである。実施例１及び２はフルオレセイ
ンアミノメチル誘導体の合成法を示し、そして実施例３
〜７はさらなる合成による該誘導体からのトレーサーの
製法を示す。実施例８〜10は蛍光偏光免疫分析法におけ
る該トレーサーの作用効果を立証するためのデータを示
す。

実施例1. 25mlの濃硫酸中の5g（15.1mMol）のフルオレセインに、
定常撹拌しつつ、1.88g（14.6mMol）のクロロアセテイ
ミドメタノールを加えた。16時間後に得られた混合物を
500mlの水に注いだ。生成した沈でんを過により捕集
した。沈でんをメタノール：塩化メチレンの1:1混合物
に溶解させた。得られた混合物に無水の硫酸マグネシウ
ムを加え且つ粗生成物を、10％メタノール/10％ベンゼ
ン/80％塩化メチレンの混合物を溶離剤として用いたク
ロマトグラフイーで更に精製し4.2g（64％収率）の次式
のフルオレセインのクロロアセトアミド誘導体を得た。

実施例2. 実施例１で調製したクロロアセテイミイドフルオレセイ
ン誘導体に95％エタノール20ml及び3mlの濃塩酸を加え
た。得られた混合物を一晩還流し、反応完了後、得られ
た混合物を濃縮して粗生成物を得た。粗生成物を溶離剤
に塩化メチレン：メタノール（7:3）の７対３混合物を
用いるシリカゲルクロマトグラフイーを用いて精製し、
次式の４−アミノメチルフルオレセイン誘導体の2g（73
％収率）を得た。

実施例3. テトラヒドロフランに溶解した100mg（0.4mMol）の８−
カルボキシメチルテオフイリンに、85mg（0.52mMol）の
カルボニルジイミジゾールを加えた。反応を15分間進行
させた時、151mg（0.38mMol）の実施例２で調製した４
−アミノメチルフルオレセイン誘導体を2mlのジメチル
ホルムアミドに溶かして反応混合物に加えた。反応を完
結させた後、真空下で溶媒を除去し粗生成物を得て、こ
れを塩化メチレン中の15％のメタノール混合物を用いる
予備薄層クロマトグラフイーを用いて精製し、次式のテ
オフイリンアミノメチルフルオレセイン誘導体120mg（5
4％収率）を得た。

実施例4. 2mlのテトラヒドロフラン中の61mg（0.14mMol）のコル
チゾール−３−カルボキシメチルオキシムに16mg（0.14
mMol）のＮ−ヒドロキシスクシンイミド及び36mg（0.17
mMol）のジシクロヘキシルカルボジイミドを加えた。反
応を３時間進行させて後、反応混合物を過し、液を
テトラヒドロフラン：メタノールの8:2混合物5ml中の実
施例２で調製した50mg（0.12mMol）の４−アミノメチル
フルオレセイン誘導体に加えた。得られた混合物を一晩
撹拌し、ついで濃縮して粗生成物を得た。これを塩化メ
チレン：メタノールの9:1混合物を用いる予備薄層クロ
マトグラフイーによつて精製し、次式のコルチゾール−
アミノメチルフルオレセイン誘導体25mg（25％収率）を
得た。

実施例5. 2mlのジメチルアミド及び10mg（0.99mMol）のトリエチ
ルアミン中に実施例２と同様に調製した39.4mg（0.99mM
ol）の４−アミノメチルフルオレセイン誘導体を含む溶
液に、100mg（0.11mMol）のＮ−アセチルチロキシンの
Ｎ−ヒドロキシスクシイミド活性エステルを加えた。反
応完了後、エーテル：ヘキサンの2:1混合物25mlを反応
混合物に加え、粗生成物を沈でんさせた。粗生成物を塩
化メチレン：メタノール：ベンゼンの8:1:1混合物を使
用する予備薄層クロマトグラフイーを用いて精製し、次
式のチロキシン−アミノメチルフルオレセイン誘導体50
mg（43％収率）を得た。

実施例6. テトラヒドロフラン：ジメチルホルムアミドの9:1混合
物の50ml中に、実施例２と同様に調製した50mg（0.12mM
ol）の４−アミノメチルフルオレセイン誘導体を含む混
合物に、41.4mg（0.13mMol）の５−（２−クロロホルム
ミルエチル）−５−フエニルバルビツル酸を加えた。反
応混合物を一晩撹拌し、次に真空下で濃縮し生成物を得
た。この生成物をメタノールの塩化メチレン中の５％混
合物中で予備薄層クロマトグラフイーによつて精製し、
次式のフエニルバルビタールアミノメチルフルオレセイ
ン誘導体10mg（12％収率）を得た。

実施例7. 1mlのテトラヒドロフランに溶解した40mg（0.11mMol）
のエストリオール−６−カルボキシメチルオキシムに16
mg（0.14mMol）のＮ−ヒドロキシスクシンイミド及び29
mg（0.14mMol）のジシクロヘキシルカルボジイミドを加
えた。反応混合物を室温で５時間撹拌し、エストリオー
ルの活性エステルを生成させ且つジシクロヘキシル尿素
を過に依り除去した。かく生成したエストリオールの
活性エステルをテトラヒドロフラン：メタノールの9:1
混合物5ml中に実施例２で調製した42mg（0.11mMol）の
４−アミノメチルフルオレセイン誘導体を含む混合物に
加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌し、真空下で溶媒
を除去して粗生成物を得た。この粗生成物を溶媒として
塩化メチレン：メタノールの9:1混合物を用いて予備薄
層クロマトグラフイーを用いて精製し、次式のエストリ
オール−アミノメチルフルオレセイン誘導体31mg（41％
収率）を得た。

先述の如く、本発明のトレーサーは蛍光偏光（分極）免
疫評価分析で使用する有効な試薬である。以下の実施例
は蛍光偏光（分極）技術を利用した免疫評価分析での本
発明のトレーサーの適合性を例示するものである。かゝ
る評価分析は次の一般的方法に従つて実施される。

１）標準又は試験血清の計量した容積を試験管に入
れ、緩衝液で稀釈する；２）任意的に界面活性剤をも含む本発明の既知濃度の
トレーサーを次の各試験管に加える；３）既知濃度の抗血清を試験管に加える；４）反応混合物を室温で恒温放置し；且つ５）抗体に結合したトレーサーの量を試料中の配位子
の尺度として、蛍光偏光（分極）法によつて測定する。

実施例8. エストリオール評価分析 A.必要な用器等； 1.牛のガンマーグロブリン0.01％及びナトリウムアジド
0.01％を含む0.1M燐酸ナトリウムより成り、pH7.35のBG
G緩衝液。

2.実施例７で調製したエストリオールカルボキシメチル
オキシムアミノメチルフルオレセインより成る、BBG緩
衝液中大約60nMの濃度のトレーサー。

3.エストリオールに対して高められ、BGG緩衝液で適切
に稀釈されている抗血清。

4.9Mのカリウムチオシアネートより成る前処理溶液。

5.人の血清又はエストリオールを含んだその他の生物流
体試料。

6.キユベツト（分光セル）として使用される10×75mmの
ガラス培養管のキユベツト。

7.±0.001単位の精度で蛍光偏光（分極）を測定可能な
蛍光計。

B.評価分析方法 1.小容積の試料（21.6μｌ）を、25μｌの抗体溶液及び
25μｌの前処理溶液と共に予備稀釈容器中にピユペツト
で計量して入れた。最終容積が大約500μｌとなる様にB
GG緩衝液で調節した。

2.予備稀釈容器中の上記の混合物175μｌをキユベツト
に加え、BGG緩衝液を用いて最終容積を0.99mlとした。

3.内容物を良く混合した。３分後、バツクグランド測定
を実施した。

4.25μｌのトレーサーと共に、追加の予備稀釈混合物17
5μｌを評価分析キユベツトに加え、BGG緩衝液でその容
積を0.99mlとした。（キユベツト中の全容積は大約2.0m
lであつた。） 5.容積増加と共に内容物を良く混合し、且つ７分間定温
放置した。

6.適切な装置（蛍光計）を用いて蛍光偏光（分極）値を
測つた。

7.すべての定温放置は35℃で実施した。

C.0から50ng/mlの間の濃度でエストリオールを含んでい
る一連の血清標準品の結果は次のとおりである。

エストリオール濃度（ng/ml）分極 0 .310 2 .304 5 .299 15 .281 30 .250 50 .218 蛍光の分極はエストリオール濃度が増加するにつれて、
規則的に減少してゆき、標準カーブを描くことが出来る
ように見える。同一の方法で処理を行つた未知試料は標
準カーブを参照して定量測定出来る。

上記の方法を用いて、55の未知試料を評価分析し、その
結果をアマーシヤム・アマレツクス（登録商標）−エス
トリオール（未配合）エストロール R1A−キツト（Ame
rsham Amerlex‐Estriol（unconjuated）Estrol R1A-
kit）を用いる放射化免疫評価分析法と相関させた。相
関係数は0.857であつた。

ある種の試料ではバツクグランド値を減少させるため
に、有機溶剤抽出を用いることが出来る。試料及び２倍
容積の適当な有機溶剤を激しく撹拌する。有機溶剤の一
部を除去し、蒸発乾固して再懸濁させる。適当な有機溶
剤は酢酸エチルである。BGG緩衝液を抽出したエストリ
オールの再懸濁に用いる。抽出後、再懸濁させた物質を
上述の如く評価分析する。

実施例9. コルチゾール評価分析 A.必要な用器等； 1.牛のガンマ−グロブリン0.01％及びナトリウムアジド
0.01％を含む0.1M燐酸ナトリウムより成り、pH7.5のBGG
緩衝液。

2.実施例４で調製したコルチゾール−３−カルボキシメ
チルオキシム−アミノメチルフルオレセインより成る、
BGG緩衝液中大約80nMの濃度のトレーサー。

4.水に0.5％のリチウムドデシルサルフエートを含む試
料前処理溶液。

5.人の血清又はコルチゾールを含んだその他の生物流体
試料。

B.評価分析方法 1.25μｌの試料及び100μｌのBGG緩衝液を稀釈容器中に
ピユペツトで計量することに依つてキユベツト中に小容
積の試料を分散させた。次に25μｌの稀釈した上記試料
をキユベツトに、次に25μｌの試料前処理溶液及び950
μｌのBGG緩衝液をキユベツトにピペツトで秤量して入
れ、バルクグランド蛍光強度を次に蛍光計で読み取つ
た。

2.それぞれ25μｌのトレーサー及び抗体、及び975μｌ
のBGG緩衝液と共に更に25μｌの稀釈試料をキユベツト
に加えた。内容物を完全に混合し室温で15分間定温放置
した。キユベツト中の試料は原試料の10μｌに相当する
ものであつた。

3.（バツクグランドを適切に差引いた）蛍光偏光（分
極）を蛍光計で読み取り、未知試料の濃度決定のための
標準カーブを作成した。

C.0から60μg/dlの間のコルチゾール濃度の一連の標準
試料の結果を次に示す。それぞれの濃度では２回評価分
析して平均してある。

コルチゾール濃度（μg/dl）分極 0 .179 2.0 .170 5.0 .154 10.0 .135 25.0 .105 60.0 .070 蛍光の分極はコルチゾール濃度が増加するにつれて、規
則的に減少してゆき、標準カーブを描くことが出来るよ
うに見える。同一の方法で処理した未知試料は標準カー
ブを参照して定量測定出来る。11人の患者の血清を上記
の方法を用いて分析し、得られた結果をカルダレラ等
（Caldarella,et.al.）のClin.Chem.28巻第３号538頁
（1982年）のHPLP参照法と相関させた。相関係数は0.99
5であつた。

上述の結果から明かな如く、本発明のトレーサーは蛍光
分極免疫評価分析に於ける有効な試薬である。上述の方
法の特徴の外に、本発明のトレーサは高度の熱安定性、
高度の結合分極、高い量子収率を有し、且つ比較的に容
易に調製、精製出来る。

蛍光分極免疫評価分析に於ける試料として有用である外
に、本発明のチロキシンアミノメチルフルオレセイン誘
導体は、次の実施例の方法によつて、不飽和チロキシン
と結合する蛋白質サイト（“Ｔ摂取”）を測定する蛍光
分極評価分析に於けるトレーサーとして利用出来る。

実施例10. A.試薬 1.前処理溶液−0.1Mの燐酸ナトリウム緩衝液（pH7.25）
に0.15％のナトリウムドデシルサルフエート、0.564Mの
トリエチレンジアミン（DABCO）、及び0.1％のナトリウ
ムアジドを含む溶液。

2.T₄−フルオレセイン・トレーサー−実施例５で調製し
た化合物５より成り、0.1Mの燐酸ナトリウム緩衝液中に
0.005％のナトリウムドデシルサルフエート、0.1％の牛
のガンマ−グロブリン、及び0.1％のナトリウムアジド
を含む緩衝媒体中で2.4×10^-7Ｍの濃度で使用する。

3.T摂取キヤリビレーター−０、0.5、1.0、1.5、2.0、
及び2.5の摂取値を有する（４％の人の血清マトリツク
ス中の）羊のアンチ−Ｔ抗血清。1.0の摂取値は通常の
血清のＴ摂取に相当する。

4.稀釈緩衝液:0.1％の牛のガンマ−グロブリン及び0.1
％のナトリウムアジドを含む0.1Mの燐酸ナトリウム。

分極した蛍光の測定はすべて分極分光蛍光計〔｛アボツ
ト（Abbott）の登録商標｝フルオレセンス・ポーラリゼ
ーシヨン・アナライザー（Fluorescence Polarization
Analyzer）。

B.評価分析プロトコール 1.未知試料の１μｌを25μｌの前処理溶液に加え、得ら
れた混合物を稀釈緩衝液で1mlに稀釈した。得られた評
価分析溶液を混合し、分極蛍光バツクグランドを測定す
る。

2.工程１の評価分析溶液に、既知試料の次の１μｌ、25
μｌの前処理溶液、25μｌのT₄フルオレセイン・トレー
サー、及び緩衝液を加え2mlの容積にする。得られた溶
液を混合し、分極蛍光を測定する。

3.トレーサーの結合に依る蛍光分極は、混合物の最終分
極蛍光強度からバツクグランドの分極蛍光強度を差引い
て求める。

4.得られた分極値は各試料のＴ摂取に比例している。

5.公知のＴ摂取値のキヤリビレーターを用いて作成した
標準カーブと比較して、試料の蛍光分析からＴ摂取値を
求める。

この発明は特定の改良に関して記述して来てあるが、そ
の詳細は限定的なものとして解釈すべきではない。何故
ならば、様々の等価物、変更、改良が本発明の精神及び
範囲から外れることなく存在することは明白であり、か
ゝる等価の態様は本発明の中に含まれるものと理解され
たい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者モハメド・トイブル・シ−プチヤンドラ− アメリカ合衆国イリノイ州リバテイビル・バ−ジイツク640 (56)参考文献特開昭54−112870（ＪＰ，Ａ)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式（Ｉ）但し、R₁はであり（ここでＲ″は配位子類似体であり、その実質的
割合が配位子と同一の空間及び極性の構成を有し、受容
体の結合サイトに対して該配位子と競争し得る一種以上
の決定基又はエピトープサイトを有する一価または多価
の基である） R₂は水素又はR₁で示される基であり； R₃は水素、アミノ又はカルボニルである；の化合物及び生物学上許容し得るその塩。
【請求項２】R₂が水素である特許請求の範囲第１項記載
の化合物。
【請求項３】R₃が水素である特許請求の範囲第１項記載
の化合物。
【請求項４】Ｒ″が配位子類似体であり、その実質的割
合が配位子と同一の空間及び極性の構成を有し、受容体
の結合サイトに対して該配位子と競争し得る一種以上の
決定基又はエピトープサイトを有する一価または多価の
基である特許請求の範囲第２項記載の化合物。
【請求項５】式（化合物３）を有する特許請求の範囲第４項記載の化合物。
【請求項６】式（化合物４）を有する特許請求の範囲第４項記載の化合物。
【請求項７】式（化合物５）を有する特許請求の範囲第４項記載の化合物。
【請求項８】式（化合物６）を有する特許請求の範囲第４項記載の化合物。
【請求項９】式（化合物７）を有する特許請求の範囲第４項記載の化合物。
【請求項１０】試料中の配位子の測定方法において、該
試料を式（Ｉ′）〔但し、R₄はであり（ここでＲ″は配位子類似体であり、その実質的
割合が配位子と同一の空間及び極性の構成を有し、受容
体の結合サイトに対して該配位子と競争し得る一種以上
の決定基又はエピトープサイトを有する一価または多価
の基である） R₂は水素又はR₄で示される基であり； R₃は水素、アミノ又はカルボニルである；〕及び生物学上許容し得るその塩のトレーサー、及び該配
位子及び該トレーサーを特異的に確認出来る抗体と混合
し、且つ次に試料中の配位子の量の尺度として蛍光偏光
（分極）技術によって抗体と結合したトレーサーの量を
測定することを特徴とする試料中の配位子の測定方法。
【請求項１１】R₂が水素である特許請求の範囲第10項記
載の方法。
【請求項１２】Ｒ″が50から4000の範囲の分子量を有す
る特許請求の範囲第11項記載の方法。
【請求項１３】Ｒ″が次式のコルチゾール類似体である特許請求の範囲第12項記載
の方法。
【請求項１４】Ｒ″が次式のエストリオール類似体である特許請求の範囲第12項記
載の方法。