JPH0786507B2 - リガンドの測定方法 - Google Patents

リガンドの測定方法

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JPH0786507B2 JP60269558A JP26955885A JPH0786507B2 JP H0786507 B2 JPH0786507 B2 JP H0786507B2 JP 60269558 A JP60269558 A JP 60269558A JP 26955885 A JP26955885 A JP 26955885A JP H0786507 B2 JPH0786507 B2 JP H0786507B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、リガンドの測定方法、そしてより詳細には、
共有結合的に結合したアビジン試薬で標識された当該リ
ガンドに対する特異結合物質およびビオチン標識酵素試
薬を用いる方法に関する。
従来の技術 米国特許第4,228,237号明細書は、酵素標識アビジン試
薬および当該リガンドに対するビオチン標識特異結合物
質を用いたリガンド測定方法に関し、後者の場合は、そ
の特異結合物質を酵素標識アビジンに結合させるための
ビオチン・ブリツジを供与するのに用いられる。
より高い特異酵素活性の複合体（コンプレツクス）およ
び接合体（コンジユゲート）を用いることは多くの場合
に有利であり、それ故に、この成果を達成するための方
法が望まれかつ必要とされている。
発明の概要 本発明は、リガンドの測定方法、そしてより詳細には、
共有結合的に結合したアビジン試薬で標識された当該リ
ガンドに対する特異結合物質およびビオチン標識酵素試
薬を用いる方法に関する。
この方法は、リガンドに対する特異結合物質を含有する
不溶相を提供することよりなる。この不溶相は次の試薬
でインキユベートされる。
すなわち、 （ｉ） リガンドを含有すると思われる媒質、 （ii） （ａ′）アビジンと共有結合的に連結した当該
リガンドに対する特異結合物質、（ｂ′）ビオチン標識
酵素と複合した試薬（ａ′）、または（ｃ′）アビジン
と共有結合的に連結したリガンドまたは（ｄ′）ビオチ
ン標識酵素と複合した試薬（ｃ′）よりなる群から選択
される可溶性試薬、および （iii） 試薬が（ａ′）または（ｃ′）である場合に
は可溶性ビオチン標識酵素。未反応試薬はインキユベー
シヨン後に不溶相から分離され、次にその分離された未
反応試薬かまたは分離された不溶相の酵素活性を測定し
てリガンドを測定する。
詳細な説明 本発明のビオチン−アビジン系は任意の通常の不均質結
合法に利用しうるが、非拮抗的および拮抗的結合法が好
ましい。
一般に、特異結合反応の成分（リガンドに対する特異結
合物質と適宜の試薬を含有する不溶相）は、得られる酵
素活性を次の検出反応系で容易に測定しうるようにする
方法または順序で一緒に添加することができる。
本発明により測定しうるリガンドは特異結合物質を用意
することのできる特異有機物である。特異結合物質は、
他の物質は排除して当該リガンドに対する特異結合親和
性を有する任意の物質ないし物質群である。非拮抗的方
法を用いる場合は、本発明方法に使用される不溶相に含
まれる特異結合物質およびアビジン試薬に結合した特異
結合物質は同一であつてもよいし、または異なつてもよ
い。
リガンドという用語に包含される包括的物質群には、例
えば抗原、抗体およびハプテンならびに天然の受容体を
有するかまたは受容体を作ることのできる物質、例えば
DNAプローブなどが含まれる。
リガンドが抗原である場合には、抗原の検出に用いられ
る特異結合物質は通常、その抗原を背椎動物の血流に導
入した際に産生される対応する抗体である。本発明によ
り測定されうる抗原例としては、例えばポリペプチドお
よびタンパクホルモン、ヒトIgEおよびα１フエトプロ
テイン、肝癌および胎児副腎癌患者の血清にも存在する
胎児抗原などが含まれる。逆にリガンドが抗体である場
合には、その誘発抗原を特異結合物質として用いること
ができる。抗体力価の検定は、例えば梅毒、風疹のよう
な感染症および溶血性連鎖球菌が原因する感染症などの
診断に特に有用である。
リガンドがハプテン（すなわちそれ自体は抗体形成を誘
発しないタンパク不含物質）である場合、そのハプテン
の検出に用いられる特異結合物質は、そのハプテンを抗
原性担体に結合させて脊椎動物の血流に導入した際に産
生される抗体である。本発明により測定しうるハプテン
例としては、ステロイド例えばエストロン、エストラジ
オール、テストステロン、プレグナンジオールおよびプ
ロゲステロンなど、ビタミン例えばB12および葉酸な
ど、トリヨードチロニン、チロキシン、ヒスタミン、セ
ロトニン、ジゴキシン、プロスタグランジン、アドレナ
リン、ノルアドレナリン、モルフイン、植物ホルモンお
よび抗生物質例えばペニシリンなどが含まれる。
リガンドが天然の受容体、または作られた受容体を有す
る物質である場合、その受容体をリガンドに対し特異的
な形で単離することのできるときには、その受容体をリ
ガンドを測定するための特異結合物質として使用するこ
とができる。天然の受容体を有するリガンド例としては
例えばチロキシン、多くのステロイド、ポリペプチドお
よびニユーロポリペプチド例えばインシユリン、ガスト
リン、アンギオテンシン、エンドルフイン、各種阿片
剤、その他多数の例が挙げられる。このリガンド群に対
する受容体は通常タンパクである。
測定すべきリガンドを含んでいると思われる液状試料媒
質が選択される。測定すべきリガンドを含有するものと
推定される液状媒質は天然または合成の液体であつても
よい。多くの場合に、その液体は生物学的流体であろ
う。本発明によりリガンドを検査することのできる生物
学的流体としては例えば全血、血清、血漿、尿、漿液お
よび脳脊髄液などが挙げられる。
検体中のリガンドを曝露させそしてそれを結合させるべ
き特異結合物質を含む適当な不溶相を調製する。適当な
不溶相には生化学分析に用いられる任意の通常の不活性
支持体または担体が含まれる。本発明に用いられるいく
つかの典型的な固体担体または支持体物質には不溶性で
有機もしくは一部無機のポリマー例えばセルロース、ニ
トロセルロース、アガロース、ポリプロピレン、ポリス
チレン、架橋デキストラン、ナイロンおよびガラス誘導
体が含まれ得る。かかる支持体の共通構造としては例え
ばビーズ、ボール、ヘーパーデイスク、チユーブ、微量
力価検定プレート、フイルム、混合スチツク、およびス
ライドなどが挙げられる。
測定すべきリガンドに対する特異結合物質を含む不溶相
の調製は既知方法により行うことができる。例えば、特
異結合物質は、架橋、共有結合または物理吸着により固
体担体に結合させることができる。例えば、測定すべき
リガンドが抗原である場合には、不溶相の調製は、チユ
ーブまたはプレートを適宜の抗体で単にコーテイングす
ることによつて行うことができる。ナイロンビーズが用
いられる場合には、適当な抗体を「FEBS Letters」、4
8、226（1974）に記載されたFaulstichらの方法により
ビーズに共有結合することもできる。
不溶相に結合されたリガンドと反応させるべきものは、
アビジン試薬と共有結合したリガンドに対する特異結合
物質およびそれ自体ビオチン標識されている酵素試薬で
ある。特異結合物質に共有結合されるアビジン試薬に
は、卵白から得られるアビジンまたは、ストレプトマイ
セス・アビジニ（streptomyces avidinii）からのスト
レパビジン（strepavidin）が含まれる。
アビジン試薬は、外部の二価および多価結合試薬の添加
により、または場合によつては、当該技術分野において
よく知られた標準的条件下に存在する官能基を直接縮合
することにより、特異結合物質またはリガンドに共有結
合することができる。このような結合試薬には、グルタ
ールアルデヒド、カルボジイミド、ジイソシアネートお
よびヘテロ官能性架橋剤例えばＮ−γ−マレイミドブチ
リルオキシスクシンイミド（GMBS）（これによつて分裂
不可能な結合が形成される）またはチオリンカー例えば
Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）−プ
ロピオネート（SPDP）（これは分裂可能なタイプの結合
の形成に用いることができる）などが含まれる。
その他の結合試薬は式R1−Ｓ−Ｓ−Ａ−Ｚ〔式中、R1は
２−ピリジル、５−ニトロ−２−ピリジルまたは４−ピ
リジルであり、Ａは１〜10個の炭素原子、好ましくは１
〜６個の炭素原子を有する炭化水素残基であり、そして
Ｚは基 （式中ｎは２または３であり、R1は前記のR1と同じ意味
を有しまたそれに等しく、そしてR2はメチルまたはエチ
ルである）またはこれらの基の酸付加塩である〕で示さ
れる。炭化水素残基Ａは好ましくは脂肪族残基であるが
芳香族残基であつてもよい。このような結合剤およびそ
れらの製造は米国特許第4,149,003号明細書に明らかに
されており、それを言及により本明細書の一部として含
める。
分裂可能なブリツジによる特異結合物質とアビジン試薬
の共有結合は米国特許第4,231,999号明細書（その記載
を言及により本明細書の一部として含める）に明らかに
されている方法により行うことができる。
広範囲にわたる様々な酵素がビオチン標識酵素試薬の調
製に用いられるが、ある種の酵素が好ましい。例えば、
リガンドの定性測定では、酵素は好ましくは呈色反応に
よつて検出されるべきである。
本発明に用いるのに適した酵素には、国際生化学者連盟
（the International Union of Biochemists;略称I.U.
B.）によるオキシドレダクターゼ、ハイドロラーゼおよ
びリアーゼとして分類されているものが含まれる。オキ
シドレダクターゼの中でも、供与体のCHOH基、アルデヒ
ドもしくはケト基またはCHNH2基に作用するもの（それ
ぞれ1.1、1.2および1.4）および受容体として過酸化水
素に作用するもの（1.11）が好ましい。特に好ましいオ
キシドレダクターゼには例えばグルコースオキシダーゼ
および西洋ワサビペルオキシダーゼが含まれる。ハイド
ロラーゼの中でも特に興味深いのは、エステル結合（有
機エステルおよび無機エステルの両方）に作用するも
の、およびグリコシル化合物特にグリコシドハイドロラ
ーゼに作用するもの（すなわちそれぞれ3.1および3.2）
である。特に好ましいハイドロラーゼには例えばアルカ
リ性ホスフアターゼおよびβ−ガラクトシダーゼが含ま
れる。
ビオチン標識酵素試薬の調製は典型的には、遊離アミノ
基と反応してアミド結合を形成するビオチンＮ−ヒドロ
キシスクシンイミドエステル（BHNS）を用いることによ
り、あるいは過沃素酸塩で酸化されたグリコタンパクか
らのアルデヒド基と反応してヒドラゾンを形成するビオ
チンヒドラジドを用いて行いうる。
特に好ましい非拮抗的結合法は「サンドイツチ」法であ
り、その場合、結合反応の成分は、リガンドに対する特
異結合物質を含む不溶相と次の試薬とよりなる。すなわ
ち、 （ｉ） リガンドを含有すると思われる測定された量の
液体媒質、 （ii） リガンドに対するアビジン標識特異結合物質、
および （iii） ビオチン標識酵素。
別法として、試薬（ii）および（iii）の代わりにアビ
ジン標識特異結合物質とビオチン標識酵素との予め形成
された複合体を用いてもよい。このような試薬は不溶相
に結合したリガンドとインキユベーシヨンする前に適量
の試薬（ii）および（iii）を単に混ぜ合わせるだけで
調製することができる。
非拮抗的結合法においては、不溶相を一定の条件の下に
前記試薬と相互の存在下にインキユベートしてもよく、
あるいは不溶相を正しい順序で個別に試薬とインキユベ
ートしてもよい。後者の方法の方が一般には好ましい。
不溶相を正しい順序で個別の試薬とインキユベートする
場合には、結合過程を多数回、例えば２または３回のイ
ンキユベーシヨン時間にわけて行うことができる。
３段階インキユベーシヨン法では、不溶相をまずリガン
ド試薬、すなわち、そのリガンドを含有すると思われる
測定された量の液体媒質と反応させる。次に未反応試薬
を除き、そしてそのリガンドに対するアビジン標識特異
結合物質を添加する。そのアビジン標識特異結合物質の
反応後、未反応アビジン標識試薬を除去しそしてビオチ
ン標識酵素を添加する。ビオチン標識酵素の反応後、未
反応試薬を不溶相から分離しそして不溶相かまたは分離
された未反応ビオチン標識酵素の酵素活性を適当な検出
反応により測定する。不溶相の酵素活性は液体媒質中の
リガンド量に直接関連付けられるのに対し、分離された
未反応ビオチン標識酵素の酵素活性はリガンド量と反比
例関係にある。
アビジン標識特異結合物質をビオチン標識酵素と予め反
応させてある場合には、結合過程は、個々のアビジン標
識およびビオチン標識酵素試薬をビオチン標識酵素に結
合したアビジン標識試薬で置換することにより２段階で
行うことができる。
前述の非拮抗的結合法で定量的な結果を得るには、試薬
と混合される不溶相の量を、液体媒質中に存在すると推
定されるリガンドの総量と結合を形成しうる量よりも一
般的に多くする。その量は実際上は、そのリガンドが液
体中に可及的最高濃度で存在するとの仮定に基づき前述
の基準に合致するよう選択される。非拮抗的方法と慣用
のラジオイムノアツセイ（RIA）とは、前者では測定す
べきリガンドが過剰の標識結合物質との反応により直接
検定されるのに対し後者では測定すべきリガンドが限ら
れた量の結合物質に対して標識リガンドと拮抗する点で
異なつている。非拮抗的結合は、多重的結合部位を有す
る高分子量リガンドの検出に特に適している。
拮抗的結合法を用いる場合、結合反応の成分は、当該リ
ガンドに対する特異結合物質を含有する不溶相および次
の試薬よりなる。
（ｉ） （Ａ）リガンドを含むものと思われる測定され
た量の液体媒質および（Ｂ）既知量のアビジン標識リガ
ンド、および （ii） ビオチン標識酵素。
別方式として、（Ｂ）はビオチン標識酵素に結合したア
ビジン標識リガンドであつてもよく、そうすることによ
つて試薬（ii）が不要となる。この複合体試薬は前述の
如く調製される。
試薬（ｉ）および（ii）を用いる拮抗的結合検定では、
不溶相を試薬と相互の存在下にインキユベートしてもよ
く、あるいは不溶相を特定の順序で個別的に試薬とイン
キユベートしてもよい。後者の方式では、不溶相をま
ず、（Ａ）リガンドを含有すると思われる測定された量
の液体媒質および（Ｂ）既知量のアビジン標識リガンド
よりなる試薬とインキユベートする。測定すべきリガン
ドと不溶化特異結合物質の結合部位に対するアビジン標
識リガンドとの間に拮抗が成立する。平衡後、未反応試
薬を除去しそしてビオチン標識酵素試薬を添加する。ビ
オチン標識酵素試薬の反応後、未反応試薬を不溶相から
分離し、そして不溶相かまたは分離された未反応ビオチ
ン標識酵素の酵素活性を適当な検出反応により測定す
る。不溶相の酵素活性は液体媒質中のリガンド量と反比
例関係にあるのに対し、分離された未反応ビオチン標識
酵素の酵素活性はリガンド量に直接関係付けられる。
アビジン標識リガンドをビオチン標識酵素と予め反応さ
せる場合、結合過程は、不溶相を、（Ａ）リガンドを含
むものと思われる測定された量の液体媒質と（Ｂ）既知
量の、ビオチン標識酵素に結合したアビジン標識リガン
ドとよりなる試薬と単にインキユベートすることにより
１回のインキユベーシヨン時間で行うことができる。
拮抗結合法で定量的結果を得るには、１検体あたりの不
溶相特異結合物質量は通常、液体中に存在すると推定さ
れるリガンドの総量を結合しうる量よりも少くし、また
アビジン標識リガンドまたはビオチン標識酵素に結合し
たアビジン標識リガンドの総量よりも少くする。実際の
応用にあたつては、この量は、液体媒質中に存在しうる
リガンドの総量が実際にそこにあるものとの仮定に基づ
いて、前記基準に合致するように選択される。一般に、
液体媒質に接触させるアビジン標識リガンド、またはビ
オチン標識酵素に結合したアビジン標識リガンドの量
は、液体媒質中の測定すべきリガンドの最低量を超えな
い。拮抗的結合法は結合部位をほとんど持たないリガン
ドの検出に特に適している。
非拮抗的結合法（すなわち「サンドイツチ」法）を用い
て本発明により測定されるリガンドは、特異結合物質含
有不溶相およびアビジン標識特異結合物質の両者と結合
するために少くとも２つの結合部位を有する必要があ
る。拮抗的結合法を用いる場合は前述の基準は不要であ
る。
本発明における酵素活性の測定は、使用する特定の酵素
に適した検出反応系で行われる。異なる酵素の検定法間
のみならず、特定の酵素に対する種々の検定法において
さえも相違があるので検定法を一般的に記述することは
できない。しかしながら、本発明に用いられる酵素に適
した広範囲にわたる様々な媒質、条件および基質は、Be
rgmeyerの「Methods of Enzymatic Analysis」、Academ
ic Press,New York（1965）にみることができる。
特異結合物質と共有結合的に連結したアビジンの比は1:
1に限定する必要はなく、また各各のアビジンはビオチ
ン４分子を結合しうることから、今や、ビオチン標識酵
素−アビジン標識特異結合物質の使用により従来から認
識されているよりも高い酵素−特異結合物質比を得るこ
とが可能である。従つて得られるリガンドの検定法は、
得られた複合体または接合体がより高い酵素特異的な活
性を有しているために、感度および正確度も一段と高
い。
具体的態様の記述 以下の実施例は当業者が本発明をより明瞭に理解しかつ
実施できるための具体的な記述であるが、本発明の範囲
を限定するものではない。
実施例 Ｉ ２本鎖DNAに対するヒト抗体（IgG）の測定手順を「サン
ドイツチ」法を用いて行つた。
（ａ） アビジンに共有結合的に連結された、ヒト抗体
（IgG）に対するアフイニテイ精製ヤギ抗体（IgG）の調
製 Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロ
ピオネート（SPDP）によりアビジンに共有結合的に連結
されたヒト抗体（IgG）に対する精製ヤギ抗体（IgG）を
次のようにして精製した。
1.0mlの0.05Mホスフエート緩衝液（pH7.4）に溶解した
3.7mgの卵白アビジンとエタノール中の0.256M SPDP100m
lを合一した。得られた混合物を20℃で１時間撹拌し、
そして未反応SPDPをSephadex G−25カラムでのゲル過
により除去した。
1.0mlの0.05Mホスフエート緩衝液（pH7.4）に溶解した
2.1mgのヤギ抗−ヒトIgG（アフイニテイ精製物）とエタ
ノール中の0.256M SPDP100mlを合一した。得られた混合
物を20℃で１時間撹拌しそして未反応SPDPをSephadex G
−100カラムでのゲル過により除去した。
125の0.1M酢酸ナトリウム（pH4.5）を400容量（pH
5.0）中の1.25mgのSPDP−ヤギ抗−ヒトIgGに添加した。
これに50の0.1Mジチオスレイトール（DTT）を添加し
た。得られた混合物を撹拌し、次いで20℃で15分間イン
キユベートした。未反応DTTをSephadex G−25カラムで
のゲル過により除去した。
0.73mgのSPDPヤギ抗−ヒトIgG（還元型）に1.24mgのSPD
Pアビジンを添加した。得られた混合物を20℃で1.5時間
ゆるやかに撹拌した。次に得られた接合体を４℃で貯蔵
した。
（ｂ） ２本鎖DNAに対するヒト抗体（IgG）の測定ヒト
２本鎖DNAでコーテイングした微量力価測定ポリスチレ
ンウエル（250μ容量）に２本鎖DNAに対する抗体（Ig
G）を含有する100μのヒト血清検体を添加した。次に
ウエルおよび検体を20℃で２〜４時間インキユベートし
た後、洗浄緩衝液で２回洗浄した。各ウエルに、前記
（ａ）の、ヒトIgGに対するヤギ抗体（IgG）−アビジン
接合体試薬希釈物100μを添加し、そして各ウエルを2
0℃で１時間インキユベートした。過剰の試薬を吸引に
より除去し、そして各ウエルを洗浄緩衝液で２回洗浄し
た。次に各ウエルに、商業的に入手しうるビオチン標識
アルカリ性ホスフアターゼ試薬100μを添加した。次
に各ウエルを20℃で30分間ビオチン標識アルカリ性ホス
フアターゼ試薬とインキユベートし、その後過剰のビオ
チン試薬を吸引により除去しそして各ウエルを洗浄緩衝
液で２回洗浄した。
各ウエルに100μのｐ−ニトロフエニルホスフエート
基質試薬を添加しそして20℃で30分間インキユベートし
た後、100μの2N H2SO4を添加した。410nmでの光学密
度（O.D.）を読んで酵素濃度を得た。
実施例 II ヒト絨毛ゴナドトロピン（hCG）の測定手順を次の方法
により行うことができた。
（ａ） ストレプタビジンに共有結合的に連結された。
hCGに対するマウス・モノクローナル抗体（IgG）（α−
サブユニツト特異的、Ｆab′断片）の調製 10.0mg（0.166μモル）のストレプタビジンを1.0mlのホ
スフエート緩衝食塩水（pH7.2）に溶解する。これにテ
トラヒドロフラン（THF）中のＮ−γ−マレイミドブチ
リルオキシスクシンイミド（GMBS）の5mM溶液33μを
滴加しそして20℃で1.5時間ゆるやかに撹拌する。
α−hCGに対する精製マウス・モノクローナル抗体50mg
を2.5mlの0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.5）に溶解す
る。これにアセテート緩衝液中のペプシンの10mg/ml溶
液100μを添加し、ゆるやかに混合し、そして37℃で
一夜（約16時間）消化した。その混合物を300μの2M
トロメタミン（Tris）で中和する。消化物をＧ−200カ
ラム（1.5×30cm）にかけ、そして0.01Tris緩衝食塩水
（pH7.3）で溶出する。2.5ml画分ずつ集めそして280nm
で監視する。第１主ピークはＦ（ab′）２である。ピー
ク画分をプールしそして5ml（約6mg/ml）まで濃縮す
る。これに0.5mlの1M Tris−HCl（pH7.5）、50μの0.
2Mエチレンジニトリロ四酢酸（EDTA）ジナトリウム塩お
よび1M Tris−HCl（pH7.5）中の0.1Mジチオスレイトー
ル50μを添加する。ゆるやかに混合しそして20℃で１
時間インキユベートする。
混合物をＧ−200カラムにかけそしてペプシン消化物に
ついてと同様に溶出する。Ｆab′断片を含む第１主ピー
ク画分をプールする。直後に、プールされたＦab′マウ
ス抗α−hCG溶液をGMBS処理ストレプタビジンと混合し
そして20℃で３時間ゆるやかに撹拌する。過剰のマレイ
ミドを50μの10mMメルカプトエタノールでクエンチす
る。Sephadex G−200カラムでのゲル過により、接合
体を未反応成分から分離する。燐酸塩緩衝液（PBS）で
溶出して280nmで監視する。第１主ピークはマウス抗α
−hCG Fab′−ストレプタビジン接合体を含有する。
（ｂ） ヒト絨毛ゴナドトロピン（hCG）の測定 hCGに対するアフイニテイ精製マウス・モノクローナル
抗体（IgG）（β−サブユニツト特異的）でコーテイン
グしたポリスチレン微量力価測定ウエルに、100μの
患者血清検体またはhCG標準を添加する。ウエルを20℃
で３時間インキユベートした後、実施例Ｉに記載の吸引
−洗浄手順を行う。各ウエルに作用濃度の100μの接
合体を添加しそして20℃で１時間インキユベートする。
次いで吸引を行い、そして100μのビオチン−アルカ
リ性ホスフエート接合体を添加して洗浄する。インキユ
ベーシヨン後、実施例Ｉに記載の酵素基質反応を行う。
標準曲線を用いて検体のhCG値を測定する。
実施例 III 膵臓小島細胞に対する自家抗体を検出するための手順を
次のようにして行うことができる。
（ａ） アビジンに共有結合的に連結されたヒト抗体
（IgG）に対するアフイニテイ精製ヤギ抗体（IgG）の調
製 ストレプトマイセス・アビジニよりのアビジンを次の手
順によりヒトIgGに対するアフイニテイ精製ヤギ抗体に
接合する。
ヒトIgGに対する3.4mg（0.023μモル）のアフイニテイ
精製ヤギ抗体を0.5mlの0.01M燐酸塩緩衝液（PBS）に溶
解する。撹拌しながら、N,N−ジメチルホルムアミド（D
MF）中の3.0μ（0.30μモル）のＮ−スクシンイミジ
ル−Ｓ−アセチルチオアセテート（SATA）を添加し、そ
して反応混合物を20℃で20分間インキユベートする。反
応混合物を1mM EDTAを含む0.05M燐酸ナトリウム緩衝液
（pH6.5）を用いて15c.c.のSephadex G−25カラムでの
クロマトグラフイにかける。0.9mgのヤギ抗−ヒトIgG−
SATAを含有する画分のpHをpH7.5に調節しそして0.4M NH
2OH・HClおよび0.02M EDTAを含む100μの0.05M燐酸ナ
トリウム緩衝液（pH7.5）を添加する。混合物を室温で
1.5時間撹拌しそして４℃で貯蔵する。
1mg（0.016μモル）のストレプタビジンを1.0mlの0.05M
燐酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）に溶解し、そしてジメ
チルスルホキシド中の2.4mM N−スクシンイミジル−３
−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（SPDP）27μ
（0.065μモル）を添加する。反応混合物を20℃で１時
間撹拌し、そして0.05M−塩基性燐酸ナトリウム（pH4.
3）を用いて15c.c.Sephadex G−25カラムでのクロマト
グラフイーにかける。
0.4mgのヤギ抗−ヒトIgG−SATA（0.8mg/ml）に0.48mgの
ストレプタビジン−SPDP（0.53mg/ml）を添加し、そし
て室温で1.5時間撹拌する。接合体を20℃で貯蔵する。
（ｂ） 膵臓小島細胞に対するヒト自家抗体の検出患者
血清検体を0.05Mホスフエート緩衝食塩水（pH7.4）中に
希釈したもの〔1:2、1:8〕25μを、サル膵臓組織の４
ミクロン厚切片を重層したスライドの組織切片にのせ
る。スライドを１時間加湿室内でインキユベートする。
次にスライドをPBS中で２回洗浄しそして組織切片上に
塗被されたPBS中で希釈されたストレプタビジン接合体
と共に20℃で１時間インキユベートした。インキユベー
シヨン後、スライドをPBS中で２回洗浄し、PBS中で希釈
された1mlのビオチン標識グルコースオキシダーゼ（商
業的に入手可能）を添加し、そして20℃で更に１時間イ
ンキユベートする。スライドをPBSで２回洗浄し、プロ
ツトし、そして0.1M NaH2PO4緩衝液（pH6.9）中の0.000
5％ニトロブルーテトラゾリウム、0.0075％グルコース
および0.0002％フエナジンメトサルフエートを1.0ml添
加する。20℃で30分間インキユベートし、PBSで２回洗
浄し、そして適当な固定媒質（mountingmedia）で固定
する。膵臓切片を光学顕微鏡を用いて評価する。ランゲ
ルハンス小島細胞の細胞質染色を観察することにより陽
性染色の測定を行う。各切片を染色強度に応じて０、１
＋、２＋、３＋、４＋などというように点数付けする。
結果は力価として報告される。
実施例 IV 患者血清検体中のヒトIgE測定のための拮抗的イムノア
ツセイを次のようにして行うことができる。
（ａ） アフイニテイ精製ヒトIgEに対するストレプタ
ビジンの接合 これは、実施例IIIにおけるストレプタビジンへのヒトI
gGの接合についての記載と同様にして行われる。
（ｂ） 患者血清検体中のヒトIgEの測定 ヒトIgEに対する家兎抗体の個別量でコーテイングした
ウエルにPBSに希釈した患者血清または標準100μを添
加する。PBS中のIgE−ストレプタビジン接合体50μを
添加し、そしてその混合物を一夜（約16時間）20℃でイ
ンキユベートする。吸引しそしてウエルをPBSで十分洗
浄してから100μのビオチン標識西洋ワサビペルオキ
シダーゼを添加する。20℃で１時間インキユベートす
る。吸引しそして前述の如く洗浄し、そして、0.3％ｏ
−フエニレンジアミン、2HClおよび0.02％ハイドロジエ
ンペルオキシダーゼ・シトレート−ホスフエート緩衝剤
（pH5.2）を含有する200μの基質緩衝液を添加する。
20℃で30分間インキユベートし、そして50μの2N H2S
O4を添加することにより反応を停止する。IgE濃度は492
nmにおける吸光度値に反比例することになろう。
実施例 Ｖ DNAハイブリダイゼゼーシヨンによるアデノウイルス検
出は次のようにして行うことができる。
（ａ） ２種類の区別されるアデノウイルス由来１本鎖
DNA断片の形成 これはM.Virtanenらの「Lancet」、Vol.I、p.831（198
3）に記載されている。
（ｂ） M13mp7フアージ由来１本鎖アデノウイルスDNA
断片のストレプタビジンへの接合 30mgのストレプタビジンを1.0mlの0.01M燐酸塩緩衝液
（PBS）（pH7.3）に溶解する。撹拌しながらN,N−ジメ
チルホルムアミド（DMF）中の0.1M N−スクシンイミジ
ル−Ｓ−アセチルチオアセテート（SATA）10μを添加
し、そして20℃で20分間インキユベートする。混合物を
1M Tris−HCl（pH8.0）を用いてSephadex G−25カラム
を通して溶出し、そしてタンパクピーク画分を約1.0ml
に濃縮する。
1mgのDNAを100μの2M NH2NH2/1M NaHSO3（pH6.3）に
混合しそして37℃で75分間インキユベートする。1.4ml
の0.1M燐酸ナトリウム緩衝液（pH7.6）を添加し、そし
て２回にわたりこの緩衝液（1.0）に対して24時間透
析する。次いで0.05M NaClに対して更に12時間透析す
る。誘導体化したDNAを過剰エタノールで析出させそし
て洗浄し、そして100μの1M Tris−HCl（pH8.0）に再
溶解する。
1.0mlの1M Tris−HCl（pH8.0）中のSATA誘導体化ストレ
プタビジン12mgを4.0mgのブロモピルビン酸で処理し、
そして15分間インキユベートする。調製されたポリヌク
レオチド5mgと混合しそして20℃で１時間放置する。ス
トレプタビジン標識プローブを0.015Mクエン酸ナトリウ
ムを含む0.15M NaCl（SSC）を用いてSephadex G−100カ
ラムで溶出する。
（ｃ） サンドイツチハイブリダイゼーシヨン pBR322プラスミドDNAを0.3NaOH中100℃で５分間変性す
る。０℃に冷却し、そして等量の2M酢酸アンモニウムと
混合する。3mmニトロセルロースフイルタ（150ng/フイ
ルタ）にかける。ハイブリダイゼーシヨンする前にフイ
ルタを0.015Mクエン酸ナトリウム含有0.15NaCl（SS
C）、0.02％フイコールおよび0.25％SDSと予めインキユ
ベートする。試料のDNAを7mM NaOH中で５分間沸騰させ
ることにより変性させる。冷却および中和後、0.02％フ
イコールおよびストレプタビジン標識プローブを含有す
るSSC中で1:4に希釈する。各ハイブリダイゼーシヨン反
応系は、固定化されたDNAを有するフイルタおよび400μ
の試料／プローブ混合物を含有する。37℃で16時間イ
ンキユベートする。フイルタを0.02％フイコールおよび
ビオチン標識ペルオキシダーゼを含むSSC中、20℃で２
時間十分洗浄する。フイルタを0.02％フイコール含有SS
Cで十分洗浄し、そして10mMイミダゾール含有0.1M Tris
−HCl（pH7.4）10ml、10μの30％H2O2および2mlエタ
ノール中の3,3′−ジアニシジン中で展開する。フイル
タをTris−HCl中ですすぎそして保存する。

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】リガンドを含有すると思われる媒質中のリ
    ガンドを測定する方法であって、 （ａ）そのリガンドに対する特異結合物質を含有する不
    溶相を用意し、 （ｂ）その不溶相を次の試薬、すなわち、 （ｉ）リガンドを含有すると思われる媒質、 （ii）（ａ′）アビジンと共有結合的に連結した当該リ
    ガンドに対する特異結合物質、（ｂ′）ビオチン標識酵
    素と複合した前記試薬（ａ′）、（ｃ′）アビジンと共
    有結合的に連結したリガンド、または（ｄ′）ビオチン
    標識酵素と複合した試薬（ｃ′）よりなる群より選択さ
    れる可溶性試薬、および （iii）前記試薬が（ａ′）または（ｃ′）である場合
    には可溶性ビオチン標識酵素 とインキュベーションし、 （ｃ）インキュベーション後、未反応試薬を前記不溶相
    から分離し、そして （ｄ）前記分離された未反応試薬または前記分離された
    不溶相の酵素活性を測定してリガンドを測定する ことよりなる前記方法。
  2. 【請求項２】段階（ｂ）が前記不溶相を、試薬（ｉ）、
    （ii）および場合により試薬（iii）と相互の存在下に
    インキュベートすることよりなる特許請求の範囲第１項
    に記載の方法。
  3. 【請求項３】段階（ｂ）が前記不溶相を、試薬（ｉ）、
    （ii）および場合により試薬（iii）と示された順序で
    インキュベートすることよりなる特許請求の範囲第１項
    に記載の方法。
  4. 【請求項４】更に、段階（ｃ）において各インキュベー
    ションの後、未反応試薬を前記不溶相から分離し、そし
    て段階（ｄ）が前記不溶相かまたは分離された未反応ビ
    オチン標識酵素の酵素活性を測定することよりなる特許
    請求の範囲第３項記載の方法。
  5. 【請求項５】前記リガンドが、抗原、抗体、ハプテン、
    または生物中に受容体を有する他の物質よりなる群より
    選択される特許請求の範囲第１項に記載の方法。
  6. 【請求項６】前記不溶相、前記試薬（ii）および場合に
    より前記試薬（iii）が、インキュベーションの際それ
    ぞれ液体媒質中のリガンド総量に対し過剰に存在する特
    許請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載の方法。
  7. 【請求項７】リガンドを含有すると思われる媒質中のリ
    ガンドを測定する方法であって、 （ａ）そのリガンドに対する特異結合物質を含有する不
    溶相を用意し、 （ｂ）その不溶相を次の試薬、すなわち （ｉ）（Ａ）リガンドを含有すると思われる液体媒質
    と、（Ｂ）（ａ′）アビジンと共有結合的に結合した当
    該リガンドに対する特異結合物質、（ｂ′）ビオチン標
    識酵素と複合した前記試薬（ａ′）、（ｃ′）アビジン
    と共有結合的に連結したリガンド、または（ｄ′）ビオ
    チン標識酵素と複合した試薬（ｃ′）よりなる群より選
    択される既知量の可溶性試薬、および （ii）前記試薬が（ａ′）または（ｃ′）である場合は
    可溶性酵素標識アビジン とインキュベーションし、 （ｃ）インキュベーション後、未反応試薬を前記不溶相
    から分離し、そして （ｄ）前記不溶相または分離された未反応試薬の酵素活
    性を測定しそれによって前記活性を前記液体媒質中のリ
    ガンド量に関係づける ことよりなる特許請求の範囲第１項記載の方法。
  8. 【請求項８】段階（ｂ）が前記不溶相を試薬（ｉ）およ
    び場合により（ii）と示された順序でインキュベートす
    ることよりなり、段階（ｃ）が未反応試薬を各インキュ
    ベーション後に前記不溶相から分離することよりなり、
    そして段階（ｄ）が前記不溶相かまたは分離された未反
    応ビオチン標識酵素の酵素活性を測定することよりなる
    特許請求の範囲第７項記載の方法。
  9. 【請求項９】前記リガンドが、抗原、抗体、ハプテン、
    または生物中に受容体を有する他の物質よりなる群より
    選択される特許請求の範囲第７または８項に記載の方
    法。
  10. 【請求項１０】前記測定すべきリガンド、前記試薬
    （ａ′）または前記試薬（ｂ′）および場合により試薬
    （ii）がインキュベーションの際それぞれ前記不溶相に
    対し過剰に存在し、そして試薬（ａ′）または（ｂ′）
    の量は、液体媒質中の測定すべきリガンドの最低量を越
    えない特許請求の範囲第７または８項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】（ａ）当該リガンドに対する特異結合物
    質、 （ｂ）結合試薬と反応させることにより前記特異結合物
    質に共有結合されたアビジン標識基、および （ｃ）前記共有結合されたアビジン標識基に結合したビ
    オチン標識酵素基 よりなるリガンド測定用試薬。
  12. 【請求項１２】結合試薬が式R1−Ｓ−Ｓ−Ａ−Ｚ〔式中
    R1は２−ピリジル、５−ニトロ−２−ピリジルまたは４
    −ピリジルであり、Ａは１〜10個の炭素原子を有する炭
    化水素残基であり、そしてＺは （式中ｎは２または３であり、R1は前記R1と同じ意味を
    有しまたそれに等しく、そしてR2はメチルまたはエチル
    である）から選択される基またはこれらの基の酸付加塩
    である〕で示される化合物である特許請求の範囲第11項
    記載の試薬。
  13. 【請求項１３】前記結合試薬がＮ−スクシンイミジル−
    ３−（２−ピリジルチオ）プロピオネートである特許請
    求の範囲第11項記載の試薬。
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