JPH08505280A

JPH08505280A - インターロイキン１βプロテアーゼおよびインターロイキン１βプロテアーゼ阻害剤

Info

Publication number: JPH08505280A
Application number: JP3515380A
Authority: JP
Inventors: エー．ブラック，ロイ; アール．スリース，ポール; アール．クロンヘイム，シャーリー
Original assignee: スターリングウィンスロップインコーポレイティド
Priority date: 1991-08-30
Filing date: 1991-09-12
Publication date: 1996-06-11
Anticipated expiration: 2013-05-28
Also published as: JP2759895B2; NO317129B1; JP2001192397A; AU657701B2; IL166791A0; IE913268A1; HU220098B; JPH1028588A; NZ239895A; FI935020L; IL99598A0; RU94028712A; DE69133354D1; HK1014013A1; ATE257517T1; AU8537391A; EP1378573A1; PT99118B; JP3445572B2; CA2111100A1

Abstract

(57)【要約】ヒト前駆IL-1βおよび下記式：Ｒ₁−Asp−Ｒ₂−Ｒ₃（式中、Ｒ₁とＲ₃は独立してＤまたはＬの異性体のアミノ酸であり、Ｒ₂はAlaまたはGlyであり、その特定のプロテアーゼ切断部位がAspとＲ₂の間にある）で表される基質に対してプロテアーゼ生物活性を有する単離ポリペプチドおよびその誘導体を開示する。インターロイキン１βプロテアーゼ活性を阻害する阻害化合物、組成物および方法も開示する。上記阻害化合物は、Ｎ末端保護基および電気的陰性脱離基に連結されたＣ末端Asp残基を有する１〜約５個のアミノ酸のアミノ酸配列を有し、そのアミノ酸配列は配列Ala-Tyr-Val-His-Aspに相当する。

Description

【発明の詳細な説明】インターロイキン１βプロテアーゼおよびインターロイキン１βプロテアーゼ阻害剤発明の技術分野本発明は不活性の前駆インターロイキン−１β（IL-1β）ポリペプチド類を切断して活性の成熟IL-1βポリペプチドにする生物活性を有するインターロイキン１βプロテアーゼ酵素（IL-1βpro）に関する。さらに詳しくは本発明はヒトIL- 1βのＮ末端におけるアミノ酸配列を含む特定のアミノ酸配列を切断することができる、単離されたIL-1βproポリペプチドとその誘導体に関する。さらに本発明はIL-1βproの活性を阻害しその結果IL-1アンタゴニストとして機能できる一群の化合物を提供するものである。発明の要約本発明は特定のプロテアーゼ切断部位に対してタンパク質分解活性を有する単離されたポリペプチドに関し、そのプロテアーゼ活性は、下記式：Ｒ₁−Asp−Ｒ₂−Ｒ₃ （式中、Ｒ₁とＲ₃は、独立して、ＤまたはＬの異性体の任意のアミノ酸であり、Ｒ₂はAlaまたはGlyであり、および特異的プロテアーゼ切断部位はAspとＲ₂の間に位置する）で表される配列からなるアミノ酸配列を有する基質ペプチドに対して特異的である。その基質ペプチドは好ましくは少なくとも８個のアミノ酸の長さを有する。その単離されたポリペプチドは、前駆IL-1βポリペプチドをAsp116 残基とAla117残基の間の切断部位で切断して成熟IL-1βポリペプチドを生成するので、インターロイキン１βプロテアーゼ（IL-1βpro）と呼ばれている。さらに本発明には、本願に記載されている単離DNA配列を含有する組換え発現ベクターおよびその組換え発現ベクターを含有する宿主細胞が含まれる。また本発明は、Ｎ末端保護基および電気的陰性脱離基に連結されたＣ末端Asp 残基を有する１〜約５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含有する置換ペプチドIL-1β阻害化合物を提供するものである。そのアミノ酸配列は、アミノ酸配列 Ala-Tyr-Val-His-Aspの少なくとも一部分に相当することが好ましい。本発明の阻害化合物は、式：Ｚ−Ｑ₂−Asp−Ｑ₁ （式中、ＺはＮ末端保護基であり；Ｑ₂は配列Ｑ₂−Aspが、配列Ala-Tyr-Val-His -Aspすなわち配列表I.D.No.3の残基112〜116の少なくとも一部分に相当するような０〜４個のアミノ酸であり；およびＱ₁は電気的陰性脱離基で構成されている）で表される。Ｚは、好ましくは、Ｃ₁−Ｃ₆アルキルケトン、ベンジル、アセチル、アルコキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルまたはＣ₁−Ｃ₆アルキルカルボニルである。さらに好ましくはＺはｔ−ブトキシカルボニル（t-Boc）、アセチルカルボニルまたはベンジルオキシカルボニル（Cbz）である。Ｑ₁としてはＣ₁−Ｃ₃アルキル、アルデヒド、ジアゾメチルケトンまたはハロメチルケトンが好ましい。さらに好ましくはＱ₁はアルデヒドまたはフルオロメチルケトンである。本発明はさらに可逆および不可逆のIL-1βpro阻害剤を提供するものである。不可逆阻害剤は、Ｎ末端保護基、およびジアゾメチルケトンまたはハロメチルケトンに連結されたＣ末端Asp残基を有する１〜約５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含有し、そのアミノ酸配列は少なくとも配列Ala-Tyr-Val-His-AspすなわちSeq.I.D.No.3の残基112〜116の一部分に相当する。可逆IL-1β阻害剤は、Ｎ末端保護基、およびアルデヒド部分に連結されたＣ末端Asp残基を有する１〜約５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含有し、そのアミノ酸配列は少なくとも配列Ala-Tyr-Val-His-AspすなわちSeq.I.D.No.3の残基〜112〜116の一部分に相当する。また本発明は、治療を要する哺乳類に対し本発明の阻害化合物の有効量を投与することからなる、該哺乳類においてインターロイキン１βの生理作用を阻害する方法を提供するものである。本発明はさらに生理的に許容される担体と本発明の阻害化合物からなる医薬組成物を提供するものである。さらに本発明は治療を要する哺乳類に対し本発明の阻害化合物の抗炎症的有効量を投与することからなる、該哺乳類の自己免疫疾患に関連する炎症を治療する方法を提供するものである。本発明にはさらに関節炎の治療法、感受性の個体の自己免疫疾患の治療法、創傷治癒の改善法、および放射線治療の有害な副作用を減少させる方法が含まれる。これらの方法はすべて、適切な医薬担体中の単離IL-1βプロテアーゼまたはその生物学的に活性な誘導体の治療上有効な量を投与することで構成されている。図面の簡単な説明本願の開示事項の一部分を構成する図面は次のとおりである。図１は、IL-1βproの生物活性を有しかつヒト成熟IL-1βまたはその生物活性フラグメントに相当するポリペプチドに対する、DNA（Seq.I.D.No.1）と対応するアミノ酸配列（Seq.I.D.No.2）を示す。図２はMarchら、Nature（London），315（6021）巻、641〜647頁、1985年に発表されたpreIL-1β(Seq.I.D.No.3)のアミノ酸配列である。そのアミノ酸残基にはイニシエーターのメチオニンから始まって番号がつけてある（配列の下に）。図３はIL-1βpro阻害剤のBoc-Asp-CH₂Fの存在下および不在下にIL-1βproによって生成される生成物のウェスタンブロット分析の結果を示す。その生成物はSD S-PAGEに付し、ニトロセルロースに転移させ次いで成熟IL-1βのCOOH末端に対する抗体でプローブした。レーン３は25μＭの阻害剤とともにインキュベートした preIL-1βであり、レーン４は10μＭの阻害剤とともにインキュベートした pre IL-lβであり、レーン５は５μＭの阻害剤とともにインキュベートしたpreIL-1 βであり、レーン６は１μＭの阻害剤とともにインキュベートしたpreIL-1βである。発明の詳細な説明Ｉ．インターロイキン１βプロテアーゼ本発明の発明者らは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法などの方法を利用して、哺乳類のIL-1βproポリペプチドとその活性フラグメントを単離し、精製し、特性を決定し、そして発現させた。組換えIL-1βpro酵素を多量を入手できたので、本発明の発明者らはIL-１βpr o活性を阻害しその結果IL-1のアンタゴニストとして機能することができる阻害化合物を見つけることができた。さらにIL-1βproを使用するとIL-1アゴニスト活性がある。したがって本発明は、下記式：Ｒ₁−Asp−Ｒ₂−Ｒ₃ （式中、Ｒ₁とＲ₃は独立してＤまたはＬの異性体のアミノ酸であり、Ｒ₂はAlaまたはGlyであり、特異的プロテアーゼ切断部位が AspとＲ₂の間にある）で表される配列からなるアミノ酸配列を有する基質ペプチドに対しタンパク質分解活性を有する、哺乳類IL-1βproポリペプチド、その誘導体、類似体および対立変異体に関する。その基質ペプチドとしては少なくとも８個のアミノ酸の長さのものが好ましい。Ｒ₂としてはGlyが最も好ましい。哺乳類のIL-1βproとして、好ましいのはヒトIL-1βproであり、本願に記載のアミノ酸配列を有する基質ペプチドに対する基質特異性を有している。ヒトIL-1βpro ポリペプチドまたはその誘導体として好ましいのはヒト前駆IL-1βポリペプチドを切断してヒト成熟IL-1βポリペプチドを生成する生物活性を有するポリペプチドである。 IL-1βproはさらに図１に示すcDNA（Seq.I.D.No.1）とアミノ酸配列（Seq.I.D .No.2）を有することが特徴である。全長の（前駆）IL-1βproは404個のアミノ酸で構成されている。精製IL-1βproはアミノ酸120で始まるAsn-Pro-Ala-Met-Pr o配列で始まる。分子量を分析した結果、成熟IL-113proのＣ末端はアミノ酸297 の近傍である。しかし分子量の測定によればこの成熟酵素のＣ末端はアミノ酸27 8の近傍〜アミノ酸315の近傍である。本発明には、ヒト前駆IL-1βポリペプチドをAsp116とAla117残基の間の切断部位でタンパク質加水分解反応で切断する生物活性を示す、単離されたIL-1βproポリペプチドまたはその誘導体、類似体もしくは対立変異体が含まれる。本願に用いる場合、“IL-1βpro”という用語は、図１に示すアミノ酸配列とこれに加えてIL-1βpro生物活性を示すこの配列の対立変異体、誘導体、類似体、およびフラグメントを含むものとする。 IL-1βpro生物活性は、例えば前駆IL-1βポリペプチドを用いてIL-1活性を検定することによって測定される。前駆IL-1βは不活性であるが一方成熟IL-1βは活性なIL-1ポリペプチドである。IL-1β pro活性の測定法はBlackらの文献のII．に記載されている。要約すれば、この方法では、約５μｌの前駆IL-1β（preIL-1β）（Blackらの文献のＩに記載されているようにして製造した10〜50μｇ／ml）を、10μｌの、IL-1βproポリペプチドまたはIL-1βpro生物活性を有すると推測される他の物質とともにインキュベートすることによって実施される。このインキュベーションは約37℃で約１時間続け、15μｌの２×SDS試料緩衝液を添加し続いて５分間沸騰させることによって終了させる。沸騰させた試料はSDES−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動させ次に、Blackらの文献のＩに記載されている16F5のようなIL-1βＣ−末端特異的モノクローナル抗体を用いてウェスタンブロット上に置く。また図１はIL-1βpro生物活性を有する404個のアミノ酸の配列をコードするヌクレオチド配列を示す。本発明にはさらに、ヒト前駆IL-1βポリペプチドをその Asp116とAla117の残基の間の切断部位にてタンパク質分解反応で切断する生物活性を示すIL-1βproまたはその誘導体、類似体もしくは対立変異体をコードする単離DNA配列が含まれる。この単離DNA配列は、図１に示すヌクレオチド配列において、ヌクレオチド１から始まりヌクレオチド1232まで延びる配列と、ヌクレオチド374から始まりヌクレオチド1232まで延びる配列と、ヌクレオチド374から始まり851近傍〜962近傍のヌクレオチドまで延びる配列と、図１のヌクレオチド１〜ヌクレオチド1232の配列と検出可能にハイブリダイズし、且つヒト前駆IL-1β ポリペプチドをAsp116とAla117残基の間の切断部位でタンパク質分解反応で切断する生物活性を示すポリペプチドをコードするDNA配列と、並びに遺伝暗号の縮重のために上記のDNA挿入断片およびDNA配列のいずれかによってコードされる哺乳類IL-1βproポリペプチドをコードするDNA配列とからなる群より選ばれる。ヌクレオチド１からヌクレオチド856までの図１に示すヌクレオチド配列と検出可能にハイブリダイズする本発明のDNA配列は、高度のすなわち厳しい緊縮条件下でハイブリッドを形成する。厳しいすなわち高度の緊縮条件には、例えば６ ×SSC溶液中約68℃にて一夜ハイブリッド形成を行い次いで0.6×SSC溶液中約68 ℃で洗浄する条件が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、〔Synthecell社（米国、メリーランド州、ロックビル）によるような通常のホスホジエステル法によって〕合成できるが、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、図１に示す塩基18〜36および塩基16 8〜196それぞれに相補的な開始コドン（TACCGGCTGTTCCAGGAC,Seq.I.D.No.4）または（TACCTATTCTGGGCTCGA,Seq.I.D.No.5）；図１に示す塩基374〜392に相補的な、成熟IL-1βproのＮ末端（TTGGTCGATACGGGTGT,Seq.I.D.No.6）；図１に示す塩基890〜908に相補的なプロテアーゼ切断後のＣ末端近傍部（CACCACACCAAATTTC TA,Seq.I.D.No.7）；または図１に示す塩基1205〜1229に相補的な、終止コドンのすぐ５′側の領域（ATGGAGAAGGGTCCTGTA,Seq.I.D.No.8）；における少なくとも18個の塩基のユニーク領域に対して相補的である。 IL-1βproまたはその活性部位の一次アミノ酸構造は、他の化学的部分、例えばグリコシル基、脂質、リン酸基、アセチル基などと共有結合または凝集による接合体を形成するか、またはアミノ酸配列の変異体もしくは誘導体を創製することによって修飾することができる。IL-1βproの共有結合誘導体は、IL-1βproのアミノ酸側鎖に、またはIL-1βproポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端に、特定の官能基を連結することによって製造される。本発明の適用範囲内のIL-1βproの他の誘導体としては、Ｎ末端またＣ末端の融合のような組換え培養での合成などによるIL-1βprc またはそのフラグメントと他のタンパク質またはポリペプチドとの共有結合または凝集による接合体が含まれる。例えば接合されるポリペプチドはIL-1βproポリペプチドのＮ末端領域におけるシグナル（またはリーダー）ポリペプチドの配列でもよく、この配列は、IL-1βproのポリペプチドのその合成部位から細胞膜もしくは細胞壁の外側もしくは内側の部位への転移を翻訳と同時にもしくは翻訳後に誘導する（例えば酵母のα因子のリーダー）。IL-1βproポリペプチド融合体にはIL-1βproの精製および同定を容易にするために添加されるポリペプチドを含有させてもよい（例えばポリ−His）。さらにIL-1βproのアミノ酸配列はペプチドAsp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lysに連結することができる（Hoppら、Bio technology，６巻、1204頁、1988年）。またこのペプチドは高度に抗原性の配列であり、かつ特定のモノクローナル抗体が可逆的に捕捉するエピトープを提供して、発現された組換えポリペプチドの迅速な検定と容易な精製が可能になる。この特異的なリーダー配列は、Asp-Lys対の直後の残基においてウシ粘膜内エンテロキナーゼによって切断される。さらに、このリーダー配列をそのＮ−末端にもっている融合ポリペプチドは、イー・コリ（E.coli）宿主細胞内での分解に対しては抵抗性でありうる。本発明には、さらに関連する未変性パターンのグリコシル化を受けているかまたは受けていないIL-1βproポリペプチドが含まれる。酵母または哺乳類の発現系（例えばC0S-7細胞）で発現されるIL-1βproは、分子量およびグリコシル化のパターンが未変性のヒトIL-1βproポリペプチドと類似しているかまたは有意に異なっていてもよい。このことは発現系の選択に依存している。例えばイー・コリのような細菌発現系でのIL-1βproポリペプチドの発現によって非グリコシル化分子が生成する。ヒトIL-1βproの機能的に変異した類似体は、例えばオリゴヌクレオチドの合成と連結によるか、または部位特異的突然変異誘発法によって、不活性化Ｎ−グリコシル化部位を用いて合成することができる。IL-1βpro誘導体は、酵母の発現系を用いて、均一な還元型の炭水化物の形態で発現することができる。真核ポリペプチドにおけるＮ−グリコシル化部位は、アミノ酸トリプレット、Asn−Φ −Ω（但しΦはProを除くいずれかのアミノ酸でありおよびΩはSerまたはThrである）であることが特徴である。この配列において、炭水化物の残基が、Asnの側鎖に共有結合で連結されている。またIL-1βpro類似体または誘導体は、IL-1βproのDNA配列の突然変異で得ることができる。IL-1βpro突然変異誘導体は、本願で述べるように、IL-1βproと実質的に相同であるが、欠失、挿入もしくは置換のために未変性のIL-1βproと異なるアミノ酸配列をもっているポリペプチドある。 IL-1βproは、哺乳類の遺伝子から発現され、恐らく１個以上の多エクソン遺伝子（multi-exon gene）でコードされている。本発明にはさらに、異なるmRNA の転写に続くスプライシング現象によると考えられ、且つ本願に開示されたcDNA と同一もしくは類似の領域を共有している別のmRNA構造体が含まれる。 IL-1βproポリペプチドの生物学的に均等な（bioequivalent）類似体（IL-1β pro生物活性を有するポリペプチドと定義する）は、例えばアミノ酸残基またはアミノ酸配列の種々の置換体を作るか、または生物活性のためには必要でない末端もしくは内部の残基もしくは配列を欠失させることによって構築することができる。例えばCys残基を欠失させるかまたは他のアミノ酸で置換して、復元時に間違った分子内のジスルフィド架橋が生成するのを防止することができる。突然変異を誘発させる他の方法には、二塩基アミノ酸残基を修飾してKEX2プロテアーゼ活性が存在する酵母系内での発現を増大させる方法がある。一般に置換は、置換される残基に似ている生理化学的特性を有するアミノ酸で置換することによって保存的に行われる。さらなる置換を、IL-1βproの生物活性のために必要な“コア配列（coresequence）”の外側で行ってもよい。IL-1β proのサブユニットは末端または内部の残基もしくは配列を欠失させることによって構築することができる。得られるポリペプチドは本願に定義するIL-1βpro の生物活性をもっていなければならない。 “IL-1βpro”、“ヒトIL-1βプロテアーゼ”という用語には、限定はされないが、ヒトIL-1βproと実質的に同一であり、且つまたは本願に記載されているI L-1βproに関連する基質特異的タンパク質分解生物活性を示すIL-1βproの類似体またはサブユニットが含まれる。 “実質的に同一”という用語は、アミノ酸配列を説明するのに用いる場合、特定の配列が、１つ以上の置換、欠失または付加によって、開示された基準配列から変わりうることを意味する。しかし、最終的な作用は基準のヒトIL-1βproポリペプチドに特有の同じプロテアーゼ生物活性である。例えば誘導体は、IL-1β proに特有の特定のプロテアーゼ生物活性に対して必要な“コア配列”またはアミノ酸配列からなる切断型の配列をもっている場合がある。実質に同一のIL-1β pro誘導体はヒトIL-1βproの対応する配列に対する類似性は約30％より大きく、かつIL-1βpro生物活性をもっている。もっているアミノ酸配列の類似度は小さいが同等の生物活性（基質特異性を含む）を有するポリペプチドは均等物とみなされる。この誘導体ポリペプチドは、ヒトIL-1βproポリペプチドに対するアミノ酸配列の相同性が80％より大きい方がさらに好ましい。類似度％は、例えばウイコンシン大学Genetics Computer Groupから入手できるGAPコンピュータープログラムバージョン6.0を用いて配列情報を照合することによって決定することができる。このGAPプログラムは、SmithおよびWaterman（ Adv.Appl.Math；２巻、482頁、1981年）が改訂したNeedlemanおよびWunsch（J.M ol.Biol.，48巻、443頁、1970年）の整合法（alignment method）を使用している。要約すると、GAPプログラムでは、類似度を、同じ整合記号（aligned symbo l）の数を２つの配列の中の短かい方の記号の合計数で割り算して得られる数と定義している。GAPプログラムの好ましい省略時のパラメーターには次のものが含まれている。すなわち（１）アミノ酸に対する重み付け比較マトリックス（Sc hwartzおよびDayhoff編集、Atlas of Protein Sequence and Structure，Nation al Biomedical Research Foundation 353〜358頁、1979年参照）；（２）各ギャップに対して3.0のペナルティーおよび各ギャップにおける各記号に対して追加の0.10のペナルティー；および（３）エンドギャップにはペナルティーなしである。 “生物学的に活性な”という用語は本願で用いる場合、Asp残基とAla残基またはGly残基との間のペプチド結合における特定のアミノ酸残基を切断するIL-1βp ro生物活性を意味する。 “組換えの”という用語は本願で用いられる場合、ポリペプチドが組換え（例えば微生物または哺乳類の）発現系から誘導されることを意味する。“微生物の ”という用語は細菌または真菌（例えば酵母）の発現系を意味する。生成物として“組換え微生物の”生成物は未変性の内在性物質を実質的に含有していない、微生物発現系で産生されるペプチドと定義する。大部分の細菌発現系（例えばイー・コリ）で発現されるポリペプチドはグリカンを含有していない。酵母で発現されるポリペプチドは哺乳類の細胞で発現されるポリペプチドとは異なるグリコシル化のパターンを有する場合がある。 IL-1βproプロテアーゼは高度に限定された基質特異性をもっている。ヒト前駆IL-1βポリペプチドは残基115〜118としてアミノ酸配列His-Asp-Ala-Proをもっている。ヒトIL-1βproはこの配列を残基116と117との間（Asp-Ala）で切断してヒト成熟IL-1βポリペプチドを生成する。部位特異的突然変異誘発によってヒト前駆IL-1βポリペプチドのAsp-116をAlaに変化させると、変異体IL-1βポリペプチド誘導体の切断が防止された。単離されたヒトIL-1βproは、基質の前駆IL-1βポリペプチドの三次構造を、その基質ポリペプチドを沸騰水中で変性させることによって変化させた場合でも、その特異的基質部位で切断することができた。前駆ヒトIL-1βはその溶液を15 分間沸騰させることによって変性させた。変性は、ヒトIL-1βproの、ヒト前駆I L-1βを切断して成熟IL-1βにすることができる性能にほとんど影響を与えなかった。したがって基質ポリペプチドの三次構造は、酵素IL-1βプロによる反応に対して有意には関与していない。 IL-1βproの生物活性はプロテアーゼ検定法で測定した。IL-1βpro酵素は塩感受性であるため、塩濃度が50mMより大きい試料は最初に脱塩させた。試料は例えば、予め遠心分離を行った１mlのBlogel P-6DG（BioRad）のカラム（10mMトリス −HCｌ、５mMジチオトレイトールpH8.1で平衡化した）に100μｌの試料を入れ、 1876×ｇで５分間遠心分離することによって脱塩することができる。検定は、精製ヒトIL-1β前駆体５μｌ（30ng）とIL-1βプロテアーゼ生物活性について試験される試料10μｌの混合物を60分間37℃でインキュベートすることによって行った。対照の試料は内在性IL-1について検査するため同様にインキュベートした。対照試料の混合物には、IL-1β前駆物質の代わりに10mMトリス−HClpH8.1と５mM ジチオトレイトール５μｌを含有させた。対照試料のインキュベーションは、試料緩衝液中にSDS（ドデシル硫酸ナトリウム）を加え続いて５分間煮沸させることによって終結させた。インキュベートした検定混合物はすべて、0.75mmの厚さのSDS、14％ポリアクリルアミドのスラブゲル上に、Laemmli，Nature，277巻、680頁、1970年に記載されているような不連続系を用いて電気泳動を行った。電気泳動に続いて、タンパク質をニトロセルロース（Sartorlus）に転移させ次に精製IL-1βCOOH末端特異的モノクローナル抗体（すなわち16F5）の20μｇ／ml溶液を用いてプローブすることによってウェスタンブロットを実施した。ブロットは、西洋ワサビペルオキシダーゼColor Developing Reagent（BioRad社）を用いて顕色させた。精製成熟IL-β100ngを、ウェスタンブロットの対照17,500ダルトンマーカーとして使用した。ヒトIL-1βpro酵素はAmerican Type Culture Collection（ATCC）から入手できるTHP-1細胞から得て精製した。Matsushima，Biochemi-stry，25巻、3424頁、 1986年に記載されているようにして、約120ｌの細胞を培養して次いでリポ糖、ヒドロキシ尿素およびシリカで16時間刺激した。細胞を遠心分離によって収穫し、ハンクスの平衡塩類溶液で洗浄し、次いで再度遠心分離に付した。得られた細胞を、10mMトリス−HCｌ、５mMジチオトレイトールpH8.1中に、10⁸／mlの密度で再懸濁させた。懸濁させた細胞の凍結と融解を３回行い、細胞溶液を使用するまで−80℃で貯蔵した。精製する前に、細胞溶液を融解し次いで４℃にて、47,800 ×ｇで20分間遠心分離した。上澄液をさらに精製するために採取した。凍結−融解法を４回繰返してIL-1βproの活性の50％以上が上澄み液中に放出された。それ以上凍結−融解をしても可溶性物質の収率は増大しなかった。ヒトIL-1βプロポリペプチドは、下記の６ステップの工程で精製した。クロマトグラフィーのステップはすべてPharmacia社のFPLC Systemを用いて４℃で行った。DEAE-Sephacel 、ヒドロキシアパタイト、およびBlue Agarose ゲルを0.1％Triton X-100と10％仔ウシ血清で前処理してタンパク質がゲルに非特異的に吸収されるのを防止した。さらにBlue Agaroseカラムを８Ｍ尿素で洗浄して非共有結合で吸収された染料を除去した。１．約500〜600mlの細胞溶液上澄み液を、10mMトリス−HCｌおよび５mMジチオトレイトールpH8.1（“緩衝液Ａ”）で１：２に希釈して細胞溶液のイオン強度を＜20mMに低下させた。pHは8.1に調節した。希釈した細胞溶解液の上澄み液を、緩衝液Ａと平衡化したDEAE-Sephacelカラム（20×4.4cm、Pharmacia Fine Che micals社）に加えた。流量は120ml／時間であった。カラムをカラム容積の２倍の緩衝液Ａで洗浄し、次いで緩衝液Ａ中のNaCfｌの濃度を０から300mMまでの範囲に変化させた直線勾配の液（カラムの３倍の容積）で溶離した。15mlづつの画分を収集しIL-1βプロの活性について分析しさらに精製するために貯蔵した。IL -1βpro活性を有する部分は0.07〜0.13Ｍ NaCｌで溶離された。このステップで汚染タンパク質の79％が除去された。大部分の汚染タンパク質は0.15〜0.25NaC ｌで溶出した。このステップは、0.06〜0.11Ｍ NaCｌで溶出する内在性成熟IL-1 βおよび0.12〜0.18Ｍ NaCｌで溶出する内在性前駆IL-1βを部分的に除去するのにさらに有用である。２．DEAEカラムから集めた活性画分を50mMリン酸カリウム緩衝液、５mMジチオトレイトール、pH7.0（“緩衝液Ｂ”）で希釈した。ヒドロキシアパタイトの14 ×3cmのカラム（HA Ultrogel，IBF Biotech-nics）を緩衝液Ｂで平衡化した。希釈した画分を上記の平衡化したヒドロキシアパタイトのカラムに60ml／時間の流量で加えた。そのカラムをカラムの２倍の容積の緩衝液Ｂで洗浄し、次に50〜20 0mM のリン酸カリウムの範囲の直線勾配液（４倍カラムの容積）で溶離した。画分は 10mlづつの容積として収集し、IL-1βpro活性について分析し、さらに精製するために貯蔵した。IL-1βproは0.085〜0.113Ｍのリン酸カリウムで溶出した。汚染ポリペプチドの40％は該プロテアーゼの前に溶出し、40％は該プロテアーゼより後に溶出した。さらに内在性成熟IL-1βは0.05〜0.08Ｍのリン酸カリウムで溶出した。３．20×l.6cmのBlue Agaroseのカラム（Gibco-BRL）を緩衝液Ａで平衡化した。ヒドロキシアパタイトのカラムから得た活性を有する画分を緩衝液Ａで１：３の比率で希釈してイオン強度を30mMに低下させた。このことはIL-1βproをカラムに結合させるために必要であった。希釈した画分を30ml／時間の流量でBlue A garoseカラムに加えた。そのカラムを３倍容積の緩衝液Ａで洗浄した。タンパク質は、0.1〜1Ｍの範囲のNaClを含有する緩衝液Ａの直線勾配液の５倍カラム容積で溶離した。10mlづつの画分を集めIL-1βproの活性について分析し、さらに精製するために貯蔵した。IL-1βproは0.5〜0.68Ｍ NaClで溶出した。汚染タンパク質の80％はこのステップで除去されたが、その中20％は早期に溶出し残りの60 ％はカラムに結合されていた。４．95×2.5cmのSephadex G-75カラム（Pharmacia Fine Chemi-cals）を緩衝液Ａで平衡化させ、最初にフェリチン（MW 400,000）、卵アルブミン（MW 43,00 0）、大豆トリプシン阻害剤（MW 20,000）およびDNP−アスパラギン酸（MW 300 ）で校正した。プロテアーゼ活性を有するBlue Agaroseカラムの画分をプールし、Centriprep-10濃縮器（Amicon社）で濃縮して約２mlの容積にし、次にSephade xG-75カラムに加えた。タンパク質が緩衝液Ａにより、20ml／時間の流量で溶出した。４mlづつの画分を集め、プロテアーゼ活性を有する画分をさらに精製するためプールした。IL-1βpro活性を有する画分は196と22 0mlの間で溶出した。この位置は大豆トリプシン阻害剤の溶出位置と同一であったが、このことはヒトIL-1βproが約20,000ダルトンの分子量をもっていることを示唆している。このステップによって汚染タンパク質の90％以上が調製物から除去された。したがってこのSephadexステップによって、出発タンパク質汚染物の99.8％以上がIL-1βproから分離している。しかしこれら画分のPAGE（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）分析を行うと、IL-1βの生物活性とは無関係のいくつかのタンパク質バンドが依然として現われた。５．プロテアーゼ活性を有するSephadexカラムからの画分をプールし、予め処理したCentriprep 10濃縮器で濃縮して500μｌの容積まで濃縮した。Sephadexプールのタンパク質濃度は低かった（＜30μｇ／ml）ので、ウシ血清アルブミンによる該centriprepの前処理のために、濃縮中のIL-1βpro活性の損失が減少した。処理されたcentriprepを使用する前に充分洗浄したので、試料のアルブミンによる汚染が防止された。前処理は、15mlの１％ウシ血清アルブミン（BSA）をcen triprepで30分間遠心分離し、残留溶液をデカントし、10mMトリス−HCｌで洗浄することによって実施した。MonoP5/20 FPLCクロマトフォーカシングカラム（Ph armacia Fine Chemi-cals社）を25mMトリスーアセテートおよび５mMジチオトレイトールpH8.3緩衝液と平衡化させた。濃縮溶液を500μｌの25mMトリス−アセテートおよび５mMジチオトレイトールpH8.3と混合し（１：１ｖ／ｖ）、Mono P5/2 0 FPLCカラムに加えた。タンパク質がPoly-buffer 96:Polybuffer 74（３：７） pH5.0（Pharmacia社）を用い15ml／時間の流量で溶出させた。１mlづつの画分を集め、pHを生物学的プロテアーゼ活性について分析した。このクロマトフォーカシングステップによってIL-1βproの純度をさらに100倍に増大させ、IL-1βproの生物活性に関連する単一タンパク質のバンドを視覚化することができた。IL-1βpr oは上記クロマトフォーカシングカラムからpH6.95〜6.70の間に溶出した。上記画分をBSAで前処理したCentricon 10濃縮器（amicon社）で1μｌ〜50μｌまで濃縮した。６．上記画分をポリアクリルアミドゲル（PAGE）の電気泳動にかけ、続いてポリ二フッ化ビニルのメンブランペーパー〔PVDF，Milli-pore社Immobilin-P（登録商標）〕上に300mAにて30分間エレクトロブロッティングを行った。そのPVDF 膜をクーマシー・ブルーで染色した。分子量が約45,000、43,000、36,000、22,0 00および18,000ダルトンの５つの主要バンドがあった。22,000ダルトンのバンドがIL-1βpro活性と関連があったので配列を決定した。 22,000ダルトンのバンドのＮ末端の配列から本願に記載のアミノ酸配列が得られた。成熟ヒトIL-1βproのcDNAまたはその活性フラグメントをこのＮ末端アミノ酸配列と３段階ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法を用いてクローン化した。第１段階のPCR工程では、充分に縮重したPCRプライマーを設計し、Ｎ−末端アミノ酸配列で製造した。その縮重プライマーを使用し、THP-1細胞mRNAから製造したc DNAライブラリー由来のIL-１βpro特異的配列を増幅した。ランダムプライムを行った第１ストランドのTHP-1 cDNAライブラリーはメーカー（Amersham社）の指示にしたがって構築した。混合オリゴヌクレオチドのプライマー増幅を、“PCR Protocols”（Innis,Gelfand，SninskyおよびWhite編集）Academic Press，Inc ．社、ニューヨーク、46〜53頁、1990年のLeeらの論文“cDNA Cloning Using De generatePrimers”に記載の方法にしたがって実施した。Primer #1は、IL-1βpr o DNA（ヌクレオチド1〜17）とクロスハイブッド形成を行いかつEcoＲＩ制限部位を含有するように設計した。プライマー＃１は次の配列：５′−GTCGAATTCAA（T/C）CCNGCNATGCCNAC−３′（Seq.I.D.No.9 ）をもっていた。プライマー＃２はIL-1βpro DNA（ヌクレオチド31〜47に相補的）とクロスハイブリダイズし、且つXbaＩ制限部位を含有するように設計した。プライマー＃２は次の配列：５′−GTCTCTAGAAG（T/C）TTNAC（A/G）TTNCC（T/C）TC−３′（ Seq.I.D.No.10）をもっていた。 PCR増幅は、Leeらの後記文献に記載されているようにして、 100μｌの緩衝液中テルムス・アクアテイカス（thermus aquaticus）ポリメラーゼ（Perkin-El mer Cetus）を用いて30サイクル行った。63bpの増幅されたフラグメントがPCR増幅から得られた。この増幅されたフラグメントをpGem-4ベクター（Promega社）にサブクローン化した。10個の単離物のDNA配列分析を行ったところ、精製とＮ末端分析による測定の結果、このフラグメントがIL-1βproのＮ末端の最初の16 個のアミノ酸をコードすることを示した。 PCR工程の第２段階では、ヌクレオチド1〜17（図１）とNotＩ制限部位からなるプライマー＃３および20個のＴ残基とNotＩ制限部位を有するプライマー＃４とを製造した。プライマー＃３と＃４を上記のTHP-1 cDNAライブラリーに添加し、次にPCR増幅を94℃で１分間、50℃で１分間および72℃で１分間のサイクルを６回行った。17塩基のオリゴヌクレオチドプローブ（図１に示すヌクレオチド16 〜32に相補的）を用いて、PCRで増幅されたクローンをサザーン分析したところ、約1000bpの位置に１つのバンドが見出されこれはIL-1βpro生物活性をもっていることも分かった。そのl000bp DNAをゲル精製し、第２ラウンドの同じPCRに付し、配列決定を行うためにpGem-5にサブクローン化した。このクローンのヌクレオチド配列を図１に示す。 PCRクローニングの第３段階において、全長のIL-1βproクローンを、末梢血液の好中球で調製したcDNAライブラリーから単離した。本発明の発明者らは好中球がIL-1βpro mRNAを発現することを見出した。本発明の発明者らは、1367および1360個の塩基対のIL-1βpro特異的挿入断片をそれぞれ有する２種のクローン（p48とp214）を単離した。図１に示すDNA配列は全IL-1βproクローンの複合体である。本発明の発明者らが見出したIL-1βproクローンのすべてがコードするアミノ酸配列は同一であった IL-1βpro cDNAはほゞ1373個の塩基対の長さを有し、mRNAのポリ（Ａ）尾部に対応するＡヌクレオチドのストレッチを含有している。これらのＡ残基に対して、1316と1335の塩基対において２つのポリアデニル化シグナルAATAAが先行している。この配列は404個のアミノ酸からなる読取り枠を有し、この読取り枠は、ヌクレオチド18に位置するイニシエーターのMetコドンで始まり、ヌクレオチド1 230に位置する終止コドンで終っている。また翻訳の開始は、ヌクレオチド66に位置する読取り枠内のMetコドンで開始できた。両方のイニシエーターMetコドンは共通のコザック翻訳開始配列（consensus Kozak translation initiation seq uence）をもっている。51位のMet残基で開始されるポリペプチドも生物活性をもっている。 IL-1βproは細胞質酵素である。精製された酵素のＮ末端アミノ酸はAsn（120 ）であるから、そのプロテアーゼはＮ末端プロセシング受けて、別のイニシエーターコドンが使用される場合、119個のアミノ酸または69個のアミノ酸が除去されることになる。欠失分析を行った結果、少なくとも107個のアミノ酸がＣ末端から除去されたことを示した。しかし約107個のＣ末端のアミノ酸は、プロテアーゼとしての生物活性を確保するために除去することができる前に、プロテアーゼを適正に折畳むために全Ｃ末端が必要なようである。図１に示すDNA配列は哺乳類の細胞（例えばCOS-7細胞）内で発現された。哺乳類の細胞の発現を行うために、合成オリゴヌクレオチドプライマーを製造してIL -1βproの全コーディングドメインを増幅した。５′プライマー（５′−ATATCGG TACCGCCTCCAGCATGCCTCCGGCAATGCCCACATC−３′）（Seq.I.D.No.11）は、Asp718 制限部位とその酵素のＮ末端に融合されたイニシエーターMet残基（ヌクレオチド1〜20）とを含有している。３′プライマー（５′−CTGCTAGATCTGCCCGCAGACATTCATACAG-３′）（Seq.I.D. No.12）はBgｌII制限部位を含有し、図１に示すヌクレオチド883〜902に相補的である。PCRで生成したフラグメントを、Mosleyら、Cell，59巻、335〜348頁、1 989年に記載されているようにしてPDC303哺乳類ベクターに連結した。ヒトIL-1βproは組換えDNA法で製造する方が好ましい。組換えDNA発現系は、ヒトIL-1βproポリペプチドまたは生物活性を有するその誘導体をコードするクローンを発現ベクターに挿入する。その発現ベクターは宿主細胞に挿入される。その宿主細胞のタンパク質合成機構が組換えヒトIL-1βproポリペプチドを合成する。哺乳類IL-1βproポリペプチドまたはその誘導体を発現するのに適切な宿主細胞には、適正なプロモーターの制御下にある原核生物、酵母または高等真核細胞が含まれる。原核生物にはグラム陰性またはグラム陽性の細菌、例えばイー・コリまたは桿菌がある。形質転換に用いるのに適した原核宿主細胞には、例えばイー・コリ、バシラス・サチリス（Bacillus Subtilis）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）およびシュードモナス（Pseudo-monas）族ストレプトミセス（Streptomyces）族、およびスタフィロコッカス（Staphyloco ccus）族に属する色々の他の種が含まれる。高等真核細胞には、以下に述べる哺乳動物起源の樹立細胞系が含まれる。また、細胞を含有しない翻訳系を採用して、本願に開示したDNA構築体由来のRNAを用いて、哺乳類IL-1βproポリペプチドまたはその誘導体を製造することもできる。細菌、真菌、酵母および哺乳類細胞の宿主とともに使用する適切なクローニングベクターと発現ベクターは、例えばPouwelsら、Cloning Vectors:A laboratoryManual，Elsevier，ニューヨーク、1985年に記載されている。 IL-1βproポリペプチドまたはその誘導体が酵母宿主細胞で発現される場合には、IL-1βproポリペプチドまたはその誘導体の発現をコードするヌクレオチド配列（例えば構造遺伝子）はリーダー配列を含有している。このリーダー配列は、酵母宿主細胞によって翻訳されたポリペプチドの細胞外分泌を改善することができる。あるいは、イー・コリのような原核宿主細胞において、IL-1βproポリペプチドまたはその誘導体は、原核宿主細胞内での組換えポリペプチドの発現を容易にするためにＮ末端のメチオニン残基をもっている。Ｎ末端のMetは、発現された組換えIL-1βproポリペプチドまたはその誘導体から切断することができる。さらに原核宿主細胞は発現とジススルフィドプロセシングに用いることができる。組換えIL-1βpro構造遺伝子のヌクレオチド配列またはその誘導体を保持する組換え発現ベクターは、適切な宿主微生物または哺乳類細胞系の実質的に均質な培養物にトランスフェクトまたは形質転換される。適切な宿主細胞の例としては、イー・コリのような細菌、エス・セレビシエ（S.cerevisiae）のような酵母またはチャイニーズハムスターの卵巣（CH0）の細胞のような哺乳類細胞系がある。形質転換された宿主細胞は、IL-1βproもしくはその誘導体の構造遺伝子のヌクレオチド配列で形質転換またはトランスフェクトされた細胞である。発現されたIL-1βproポリペプチドは、宿主細胞の性質と宿主細胞内に挿入された遺伝子構造体によって、宿主細胞内に位置しているかおよび／または培養物上澄み液中に分泌される。原核宿主細胞にトランスフェクトされた発現ベクターは一般に１つ以上の選択可能な表現型マーカーをもっている。選択可能な表現型マーカーは例えば抗生物質耐性を与えるか、または独立栄養の必要条件および宿主によって認識されて宿主内での増幅を確実に行う複製開始点を与えるタンパク質をコードする遺伝子である。原核宿主細胞に対する他の有用な発現ベクターには、市販されてるプラスミド由来の細菌起源の選択可能なマーカーが含まれる。この選択可能なマーカーはクローニングベクターpBR322（ATCC37017）の遺伝要素を含有していてもよい。pBR 322はアンピシリンとテトラサイクリンの耐性の遺伝子を含有しているので形質転換された細胞を同定する簡単な手段を提供する。pBR322の“骨格”部分に、適切なプロモーターとIL-1βproの構造遺伝子の配列が結合される。その外の市販のベクターとしては、例えばpKK223-3（Pharmacia FineChemicals社、スエーデン、アプサラ）およびpGEMl（Promega Bio-tec社、米国、ウイスコンシン州、マディソン）がある。プロモーター配列は、組換え原核宿主細胞発現ベクターに通常用いられる。通常用いられるプロモーターの配列としては、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系（Changら、Nature，275巻、615頁、1978年およびGoeddelら、Nature，281巻、544頁、1979年）、トリプトファン（trp）プロモーター系（Goeddelら、Nucl.Acids Res.，８巻、4057頁、1980年；およびヨーロッパ特許願公開第Ａ36,776号）およびtacプロモーター（Maniatis，Molecular C loning:A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory、 412頁、1982年）がある。特に有用な原核宿主細胞発現系はファージＰ_LプロモーターとcI875ts 熱不安定性レプレッサー配列を利用する。Ｐ_Lプロモーターの誘導体を取込んでいるAmerican Type Culture Collectionから入手可能なプラスミドベクターとしてはプラスミドpHUB2〔イー・コリ菌株JMB9（ATCC37092）に内在している〕およびpPLc28〔イー・コリRRl（ATCC53082）中に内在している〕がある。ヒトIL-1βproポリペプチドと誘導体ポリペプチドは酵母宿主細胞、好ましくはサッカロミセス（Saccharomyces）属の酵母宿主細胞（例えばエス・セレビシエ）中に発現させることができる。他の属の酵母例えばピキア（Pichia）またはクルイベロマイセス（Kluyveromyces）のような属の酵母も使用できる。酵母のベクターは、２μ酵母プラスミド由来の複製開始点の配列、自己複製配列（ARS ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列および転写終結のための配列をもっていることが多い。好ましくは酵母ベクターは複製開始点の配列と選択可能なマーカーをもっている。酵母ベクター用に適切なプロモーター配列には、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Hitzemanら、J.Biol.Che m.，255巻、2073頁、1980年）、または他の解糖酵素（Hessら、J.Adv.EnzymeReg .，７巻、149頁、1968年；およびHollandら、Biochem.，17巻、4900頁、1978年）例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース −６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼのプロモーターが含まれる。酵母の発現に用いるのに適切な他のベクターとプロモーターはHitzemanのヨーロッパ特許出願公開第Ａ73,657号明細書に記載されている。酵母ベクターは、例えばイー・コリ内で選択と複製を行うためにpBR322由来の DNA配列（Amｐ^r遺伝子と複製開始点）を用いて構築することができる。酵母発現構造体に含めることができる他の酵母DNA配列としては、グルコース抑制ADH2プロモーターとα因子分泌リーダーである。ADH2プロモーターについては、Russellら、J.Biol.Chem.，258巻、2674頁、1982年とBeier ら、Nature，300巻、724巻、1982年に報告されている。酵母α因子リーダー配列は異種のポリペプチドの分泌を誘導する。α因子のリーダー配列はプロモーター配列と構造遺伝子配列の間に挿入されることが多い（例えば、Kurjanら、Cell， 30巻、933頁、1982年；およびBitterら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81巻、5330 頁、1984年参照）。リーダー配列は、その３′末端の近くを修飾して１つ以上の制限部位を含有させることができる。このことによって、リーダー配列と構造遺伝子の融合が容易になる。酵母の形質転換法は当該技術分野の当業者にとって公知である。この方法の一例がHinnenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75巻、1929頁、1978年に報告されている。そのHinnenらの方法は、選択培地中でTrp⁺形質転換体について選択し、その選択培地は0.67％の酵母窒素塩基（yeast nitrogen base）、0.5％カザアミノ酸、２％グルコース、10μｇ／mlアデニンおよび20μｇ／mlのウラシルを含有している。 ADH2プロモーター配列を含有するベクターで形質転換された酵母宿主細胞は“ リッチ（rich）”培地中で増殖して発現を起こす。リッチ培地の例としては、１％の酵母エキス、２％のペプトン、および80μｇ／mlのアデニンと80μｇ／mlの muacilを補充した１％グルコースからなる培地である。グルコースが培地から消耗されるとADH2プロモーターの脱抑制が起こる。哺乳類または昆虫の宿主細胞培養系も組換えIL-1βproポリペプチドまたはその誘導体を発現するのに利用できる。適切な哺乳類宿主細胞系の例としては、サルの腎臓細胞のCOS-7系（Gluzman，Cell，23巻、175 頁、1981年）、Ｌ細胞類、C127細胞類、3T3細胞類、チャイニーズハムスター卵巣（CH0）細胞類、Hela細胞類、およびBHK細胞系がある。適切な哺乳類発現ベクターは、複製開始点のような非転写要素、プロモーター配列、構造遺伝子に連結されたエンハンサー、リボソーム結合部位のような他の５′または３′側の隣接非転写配列、ポリアデニル化部、スプライスドナー部位とスプライスアクセプター部位、および転写終結配列を含有している。哺乳類宿主細胞発現ベクター中の転写制御配列と翻訳制御配列はウイルスソースによって提供される。例えば通常用いられる哺乳類細胞のプロモーターの配列とエンハンサーの配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス40（SV40）およびヒトサイトメガロウイルス由来の配列である。SV40ウイルスゲノム由来のDNA配列、例えばSV40オリジン、初期および後期のプロモーター、エンハンサー、スプライスおよびポリアデニル化部位が、哺乳類宿主細胞中での構造遺伝子配列の発現に必要な他の遺伝要素を提供するために使用される。ウイルスの初期および後期のプロモーターはともに、ウイルスの複製開始点も含有するフラグメントとしてウイルスゲノムから容易に得られるので特に有用である（Fierら、Nature，273巻、113頁、1978年）。SV40ウイルスの複製開始部位に位置しているHindIII部位からBglＩ部位へ延びる約250bpの配列がある場合、より大きいかまたはより小さいSV40も使用できる。さらに、哺乳類ゲノムのIL-1βproのプロモーターすなわち制御配列および／またはシグナル配列は、これらの制御配列が、選択された宿主細胞と相容性ならば利用することができる。代表的なベクターは、0kayamaおよびBerg，Mol.Cell. Biol.；３巻、280頁、1983年に開示されているようにして構築することができる。精製ヒトIL-1βproポリペプチドまたはその誘導体は、形質転換された宿主細胞を、IL-1βproポリペプチドまたはその誘導体を発現するのに必要な培養条件下で培養することによって製造される。その発現されたポリペプチド類は培地または細胞抽出液から精製される。例えば培養された形質転換宿主細胞からの上澄み液は、組換えIL-1βproペプチドを培地へ分泌する。IL-1βproポリペプチドまたはその誘導体は、市販のタンパク質濃縮濾過器、例えばAmiconまたはMillipor e Pelliconの限界濾過装置を用いて濃縮される。濃縮ステップに続いて、得られた濃縮物は精製マトリックスに加えることができる。例えば、適切な精製マトリックスはIL-1βpro阻害剤またはIL-1βproポリペプチドもしくはその誘導体に対し特異的な抗体分子であり、適切な支持体に結合されている。あるいはアニオン交換樹脂を利用することができる。例えば側鎖のジエチルアミノエチル（DEAE）基を有するマトリックスまたは基質がある。これらのマトリックスは、タンパク質精製に通常利用されるアクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースなどの種類のマトリックスである。あるいはカチオン交換のステップを利用できる。適切なカチオン交換体としては、スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を有する種々の不溶性マトリックスがある。スルホプロピル基が好ましい。最終的に、疎水性のRP-HPLC媒体、例えばメチル基などの脂肪族の側鎖の基を有するシリカゲルを使用する１つ以上の逆相高性能液体クロマトグラフィー（RP -HPLC）のステップは、IL-1βproポリペプチド組成物をさらに精製するのに利用できる。上記精製ステップのいくつかまたはすべてを種々組合わせて均一な組換えタンパク質を提供するのに利用することもできる。あるいは本願に記載の精製方法に使用されるステップのいくつかまたはすべても利用できる。細菌の培養で産生された組換えポリペプチドは通常、最初に宿主細胞を破砕し、細胞のペレットから不溶性のポリペプチドを抽出するかまたは上澄み液から可溶性ポリペプチドを抽出し、続いて一回以上の濃縮、塩析、イオン交換クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーのステップによって単離される。最終的に、最後の精製ステップとして逆相高性能液体クロマトグラフィー（RP -HPLC）を利用できる。微生物細胞は、凍結−融解サイクリング法、音波処理法、機械的破砕法または細胞溶解剤の使用を含む簡便な方法で破砕することができる。形質転換された酵母宿主細胞は一般に、IL-1βproポリペプチドを、分泌されるポリペプチドとして発現する。このことによって精製は簡単になる。酵母宿主細胞の醗酵によって分泌された組換えポリペプチドはUrdalら、J.Chromatog.，2 96巻、171頁、1984年に開示されているのと類似の方法で精製することができる。Urdalらは分離用HPLCカラムで組換えヒトIL-2を精製するのに用いる２種の逐次逆相HPLCステップを報告している。 II．インターロイキン１βプロテアーゼ阻害剤前駆IL-1βの生物活性型へのプロセシングに関与するプロテアーゼの単離と特性決定はIL-1βのプロセシングに対する阻害剤を設計するのに役立つ。というのは、大量のIL-1βproを入手できることはIL-1アンタゴニスト活性を有する化合物を見つけるのに有用なスクリーニング媒体として役立つからである。このようなIL-1アンタゴニストまたはIL-1βpro阻害剤は炎症および移植拒絶反応を治療するのに有用である。本発明の阻害剤は、Ｎ末端保護基と、電気的陰性脱離基に連結されているＣ末端Asp残基とを有する１〜約５個のアミノ酸残基からなる置換化合物であり、そのアミノ酸配列は配列Ala-Tyr-Val-His- Asp（preIL-1βの残基112〜116の配列を示す）の少なくとも一部分に相当する。 preIL-1βのアミノ酸配列はSeq.I.D.No.3およびMarch,C.J.ら、Nature（Londo n），315（6021）巻、641〜647頁、1985年からとった図２に示してある。成熟IL -1βはpreIL-1βのＣ末端の153個のアミノ酸残基によって表される。したがって IL-1βのＮ末端はSeq.I.D.No.3の117位のAla残基である。アミノ酸残基はフルネーム（例えばアラニン）または三文字名（例えばAla）で表すことができる。天然産のアミノ酸はＬ異性体なので異性体（例えばＬまたはＤ）の表示なしで示す。Ｄ異性体はそのように示す。 “に相当する”という語句は本願で用いる場合、置換によって本発明の化合物の阻害活性を大きく変えない限り、阻害化合物の特定の配列が、開示された配列と１つ以上の保存的置換によって異なっていてもよいことを意味する。阻害活性を大きく変えない置換の例は、Seq.I.D.No.3の112位のAlaのSerまたはGlyによる置換；Seq.I.D.No.3の113位のTyrのPheによる置換；Seq.I.D.No.3の 114位のVal のLeu，IleまたはMetによる置換；およびSeq.I.D.No.3の115位のHis のPhe，ProまたはLys，Arg，HisもしくはTyrのごとき正電荷を有するアミノ酸による置換；またはＤ異性体の使用である。本発明の阻害化合物のＣ末端のアミノ酸残基はアスパラギン酸（Asp）である。Aspは式CH₂-CO0Hで表される側鎖をもっている。Aspの側鎖のカルボキシル基は本発明の化合物の合成を容易に行えるように保護される。 Asp側鎖の保護基としては例えばベンジル、置換ベンジル、ホルミルメチルまたはｔ−ブチルの部分がある。ベンジル置換基はAsp 側鎖の保護部分の酸不安定性を増大する。代表的な置換ベンジル基は２，４，６ −トリメチルベンジルと４−メトキシベンジルである。好ましい実施態様では、Asp側鎖の保護部分はエステル結合によってAsp側鎖に接続され、その結合は天然産の細胞内エステラーゼ酵素によって切断される。このようにして、高い脂質溶解性を有する保護されたAspが細胞に入れるようになり、エステラーゼで切断されて、IL-1βproが主として存在している細胞質中に留まる電荷を有し水溶性の脱保護されたAspが生成する。本願で用いる“Ｎ末端保護基”という語句は、本発明の配列のＮ末端アミノ酸残基のアミノ基に連結されている化学基を意味する。このような保護基は公知なので当該技術分野の当業者にとって明らかなことである（GrossおよびMeienhofe r編集The Peptides，Acade-mic Press社ニューヨーク、３〜81頁、1981年）。Ｎ末端保護基は他の種類のプロテアーゼ阻害剤とともに使用されている（例えば米国特許第4,652,552号および同4,636,492号参照）。 “電気的陰性脱離基”という語句は、本願で用いる場合、酵素活性部位におけるアミノ酸残基による求核性攻撃を受け易い化学基を意味し、この基はIL-1βpr oを修飾して、IL-1βproがpreIL-1βと相互に作用してpreIL-1βを切断できないようにする。本発明の化合物は、可逆もしくは不可逆の方式でIL-1βproの触媒活性を阻害する。本願で用いる場合、“不可逆の”という用語は酵素と阻害剤の間に共有結合が生成することを意味する。 IL-1βpro活性の可逆性は電気的陰性脱離基の機能である。電気的陰性脱離基がジアゾアルキルケトンの場合、IL-1βproの阻害は不可逆的であるので、その化合物は不可逆阻害剤である。電気的陰性脱離基がアルデヒドの場合、IL-1βpr oの阻害は可逆的であるのがその化合物は可逆阻害剤である。本発明の化合物は、下記式：Ｚ−Ｑ₂−Asp−Ｑ₁ （式中、ＺはＮ末端保護基であり；Ｑ₂は、配列Ｑ₂−Aspが配列Ala-Tyr-Val-His-AspすなわちSeq.I.D.No.3の残基 112〜116の少なくとも一部に相当するような０〜約４個のアミノ酸であり；およびＱ₁は、電気的陰性脱離基である）で表される。好ましい実施態様において、ＺはＣ₁−Ｃ₆アルキル、ベンジル、アセチル、Ｃ₁ −Ｃ₆アルコキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルまたはＣ₁−Ｃ₆アルキルカルボニルである。“アルキル”という用語は本願で用いる場合、１〜６個の炭素原子を有する線状または分枝の、本願で定義されているように任意に置換されている連鎖を意味する。代表的なアルキル基には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシルなどが含まれる。さらに好ましい実施態様では、Ｚはｔ−ブトキシカルボニル（t-Boc）、アセチルまたはベンジルオキシカルボニル（Cbz）である。Ｑ₂は好ましくは１個のアミノ酸である。Ｑ₂としてはHis，Phe,ProまたはTyr が好ましい。さらに好ましくはＱ₂はHisまたはPheである。Ｑ₁は好ましくはアルデヒド、ジアゾアルキルケトンまたはハロアルキルケトンである。電気的陰性脱離基に関連して本願で用いる場合、“アルキル”という用語は、１〜３個の炭素原子を有する線状もしくは分枝の連鎖ラジカルを意味し、本願で定義されているように任意に置換されていてもよい。代表的なアルキル基としてはメチル、エチル、プロピルなどがある。さらに好ましくはＱ₁はアルデヒドまたはフルオロメチル（CH₂F）ケトンである。本発明の化合物は、当該技術分野の当業者にとって公知で明らかになっている方法にほゞ相当する方法で製造される（例えばKettner，C.A.ら、A rch.Biochem.Biophys.162巻、56頁、1974年；米国特許第4,582,821号；同第4,64 4,055号；Kettner,C.A.ら、Arch.Biochem.Biophys.,165巻、739頁、1974年；Dak in,H.D.およびWest,R.,J.Biol.Chem.，78巻、91頁、1982年；Rasnick,D.,Anal.B iochem.，149巻、461頁、1985年参照）。電気的陰性脱離基のフルオロメチル基を有する化合物は、ラスニック法（Rasn ick procedure）で合成することが好ましい。電気的陰性脱離基のフッ素でないハロアルキルケトンを有する化合物はケットナー法（Kettner procedure）にしたがって合成される。Ｎ−保護のアミノ酸またはペプチドはＮ−メチルモルホリンと非フッ素ハロギ酸アルキルと反応してペプチド酸無水物を生成する。この無水物は次に不活性の非プロトン性溶媒中ジアゾアルカンと反応させてペプチド−ジアゾメタンケトンを生成させる。次にそのジアゾメタンケトンをHCｌ，HBrまたはHIの無水溶液と反応させて所望のＮ−保護のＣ末端ハロアルキルケトンのペプチドまたはアミノ酸を生成させる。電気的陰性脱離基のフルオロアルキルケトン基を有する化合物はラスニック法にしたがって合成される。Ｎ−保護ペプチドを有機溶媒中、無水フルオロ酢酸とトリアルキルアミンと反応させペプチド無水物を生成させる。次にこの無水物を４−ジメチルアミノピリジンのような触媒と反応させ、生成した反応混合物を約２時間約25℃に保持してCO₂を放出させる。得られた反応混合物を有機溶媒で抽出し、有機相を洗浄して乾燥した。有機溶媒を除去して油状物を生成させ、それをシリカゲルのカラムに注入した。次にＮ−保護フルオロアルキルケトンペプチドを上記ゲルから溶出させて精製した。電気的陰性脱離基のフルオロアルキルケトン基を有する化合物は、Ｎ末端保護基を除去し、他の保護されたアミノ酸を有する化合物の脱保護したものを連結することによってＮ末端方向に延長することができる（Bodanszky,The Practice of Peptide Synthesis,Springer-Verlag，ベルリン、1984年）。あるいは、脱保護された化合物をアセチル化してＮ−末端アセチル保護基を有する化合物が得られる（Stewartら、Solid Phase Peptide Synthesis,Pierce Chemical Co.，米国、イリノイ州、ロックフォード、1984年）。 III．治療方法と医薬組成物本発明は、適切な希釈剤および担体中にIL-1βproポリペプチドおよびその誘導体の有効量を含有する治療用組成物の使用方法を提供するものである。治療用に、精製されたIL-1βproまたはその生物活性を有する誘導体は、適応症に適切な方式で治療するため、患者、好ましくはヒトに投与される。したがって、例えば自己免疫を抑制するために投与されるIL-1βpro組成物は、ボーラス注射（bol us injection）、連続注入、移植物からの徐放出などの適切な方法で投与することができる。一般にIL-1βproの治療剤は、精製されたポリペプチドを生理的に許容される担体、賦形剤または希釈剤とともに含有する医薬組成物の形態で投与される。かような担体は、使用される投与量及び濃度で患者に対して非毒性で、医薬として許容される組成物を製造するのに利用される通常の賦形剤のいずれかを含有している。本発明の阻害化合物は、生物活性を有するIL-1βが生成するのを防止することによってインターロイキン１βの生理作用を阻害するのに有用である。IL-1βpr oの阻害作用によって活性IL-1βのレベルが低下して、同時に生物学的に不活性の化合物であるpreIL-1βが増大する。また本発明の阻害化合物は、増大したIL-1活性で仲介されることが多い自己免疫疾患関連の炎症のような機能不全状態を治療するのに有用である。炎症障害の治療または自己免疫症状の予防を必要とする哺乳類には、本発明の阻害化合物の有効量を、単独でまたは医薬組成物の形態で投与する。本発明の医薬組成物は、非経口注射、固形もしくは液体の形態の経口投与、直腸もしくは局所の投与などに用いるため、１種以上の非毒性で生理的に許容される、担体、アジュバント、または本願では総合的に担体と呼んでいるビヒクルとともに組成物に処方される１種以上の本発明の化合物を含有している。一回の投与または分割投与で宿主に投与される本発明の阻害化合物の一日当りの合計投与量は、例えば約0.1mg〜約160.0mg／kg体重の量である。投与単位組成物は、一日当りの投与量を調合するのに使用する量の整数分の一の量を含有している。しかし特定の患者に対する特定の投与量のレベルは、体重、一般健康状態、性別、食事、投与の時間と経路、吸収と排泄の速度、他の医薬との組合わせ、および治療中の特定の疾患の重症度を含む各種の因子に依存していることは理解されるであろう。実施例実施例１：IL-1βproの基質特異性この実施例は精製されたヒトIL-1βpro酵素が一群のアミノ酸配列を切断する基質特異性の範囲を示す。ヒト前駆IL-1β中の切断部位に相当する領域（His115 〜Pro118）中の個々のアミノ酸を変化させて、各種のペプチド基質を製造した。これらペプチド基質の反応性を、前駆IL-1β配列のAla112〜Ser121に相当するペプチドに対比して示した。基質ペプチドは、Applied Biosystems 430Aペプチド合成器を用いるか、またはHoughtenの手動Ｔ−バッグ法（Proc.Nat.Acad.Sci.USA，82巻、5131〜5135頁、1985年）によって固相法（Merrifield，J.Amer,Chem.Soc.，86巻、304〜305頁、1964年）で合成した。４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂を使用した。基質ペプチドは、樹脂から切断する前に、捕そく剤としてのアニソールの存在下、液体HFにより（HF：アニソール＝９：１）アセチル化した（０℃、１時間）。HFを蒸発させた後、基質ペプチド樹脂の混合物をジエチルエーテルで洗浄し次に15％（ｗ／ｖ）酢酸で抽出し、凍結乾燥し、VydacC18、2.2cm×25cmカラムの逆相高性能液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）で精製した。トリフルオロ酢酸（0.1％ )水溶液が移動相の溶媒Ａであり、トリフルオロ酢酸（0.1％）アセトニトリル溶液が移動相の溶媒Ｂであった。精製した基質ペプチドは、Beckman 6300システム、RP-HPLCおよびマススペクトル法を用いアミノ酸分析を行って特性値を決定した。マススペクトルは、イオン化ガスとしてもセノンを用いかつ試料マトリックスとしてグリセリン／チオグリセリン（１：１）を用いるVGTrio-2システムでの高速原子衝突法か、またはBi o-Ion20質量分析計による²⁵²Cfプラズマ脱離質量分析法（Tsarbopoulos，Peptid eRes.，２巻、258〜266頁、1989年参照）によって得た。各場合において、測定されたペプチド基質の質量は理論値と一致した。標準濃度のペプチド溶液は、約２〜３mgのペプチド基質を水に溶解し、その溶液をWaters.Sep-Pak C18カートリッジに充填し、水５mlで３回洗浄することによって調製した。ペプチド基質をアセトニトリルで溶出し次いで蒸発乾固した。各基質は使用する前にアミノ酸分析を行って１mMに標定した。精製ヒトIL-1βpro酵素（10μｌ）、水（10μｌ）中のペプチド基質、および25％ｖ／ｖグリセリン含有の10mMトリス緩衝液pH8.0（10μｌ）を混合し、その混合物を37℃で４時間インキュベートした。１Ｍグリシン／HCｌ緩衝液pH2.0（10μｌ）を添加することによって反応をクエンチした。次いで試料は、Vydac C18カラム（0.46cm×25cm）を用い、100％溶媒Ａから70％溶媒Ａ／30 ％溶媒Ｂまでの直線勾配液で１ml／minの流量にて30分間かけて溶離するRP-HPLC を使って分析した。溶出液は、280nm波長光を吸収する生成物について監視した。基質と生成物の合計のピーク面積に対して生成物のペプチドのピーク面積を比較することによってペプチドの切断度が得られた。というのは、基質と生成物の合計したピークの下の面積は、一定で、IL-1βpro酵素によって切断された量とは無関係であったからである。ペプチド生成物のピークの同一性は、アミノ酸分析と質量分析によって確認した。表１は、精製IL-1βpro酵素で消化した一連の８種のペプチド基質の相対反応性を示す。切断部位は、対応するヒト前駆IL-1βアミノ酸残基とともに以下のように記載することができる。 P₂ P₁ P₁′P₂′ His-Asp-Ala-Pro ペプチド１のＬ−アスパラギン酸残基を、アスパラギン（ペプチド２）、グルタミン酸（ペプチド３）またはＤ−アスパルテート（ペプチド４）に変えると、IL -1βproの基質を切断する性能に大きな影響を与えた。これらのデータは、この酵素が基質を切断できるためには、P1位にＬ−アスパルテート残基が必要であることを確認している。ペプチド５と６は、ヒト前駆IL-1β切断部位のP1′位が変化している。アラニンをグリシンで置換すると（ペプチド５）、反応性がペプチド１の3.4倍の基質になる。しかし同じ残基をバリンに変えると（ペプチド６）、タンパク質分解による切断が有効に防止される。P1′にグリシン残基を有するペプチドは一層容易に切断されるということは、ヒト前駆IL-1βポリペプチド中のアラニン残基は基質の結合性については重要ではないが、P1′位のバリン残基による結果はＰ′位置において立体許容性（steric torerance）が低いことを示している。したがってIL-1βpro酵素またはその誘導体は、Asp-GlyとAsp-Alaの残基間以外の部位を切断しないようである。ペプチド７と８はそれぞれP2とP2′の部位の変化を示す。ペプチド１のプロリンをアラリンに変化させると、ヒトIL-1βproによってやはり切断されるが、ヒトIL-lβ未変性配列を有するペプチドと比べるとその効率がわずか１／２の基質が得られた。ペプチド１のヒスチジンをフェニルアラニンで置換した場合も同様な結果が得られた。これらのデータは、ヒトIL-1βproの酵素が両方の残基の保存的置換を許容し、かつP2とP2′の位置がP1とP1′の位置のアミノ酸ほどには活性に対して重要でないことを示唆している。実施例２：基質の長さの影響この実施例では、ヒトIL-1βpro酵素のペプチド基質を切断する性能に対する基質ペプチドの長さの影響を示す。実験は実施例１に記載されているのと同様にして行った。ヒト前駆IL-1βのIL-1βpro切断部位のアミノ酸配列に相当する５種の基質ペプチドを製造した。結果を表２に示す。８個のアミノ酸のペプチド（Ac-Tyr-Val-His-Asp-Ala-Pro-Val-Arg-NH₂）は最も効率的に切断されるが、４個および６個のアミノ酸のペプチドは切断されなかった。したがってIL-1βproには基質ペプチドを切断するのに必要なアミノ酸残基の最小数がある。実施例３：IL-1βプロテアーゼ阻害剤の合成Ａ．Boc-Asp-CH₂Fの合成 Boc-Asp-0H（8.11mmofl）と無水フルオロ酢酸（16.2mmoｌ）をベンゼン（30ml ）中に懸濁させて調製した懸濁液を、室温にてトリエチルアミン（16.2mmoｌ）で処理した。触媒の４−ジメチルアミノピリジン（0.41mmoｌ）を上記溶液に添加し、その反応液を室温で約２時間撹拌した。反応混合物に約100mlのベンゼンを添加した。その有機溶液を、１Ｎ HCｌ（2×50ml）、飽和No.HC0₃（2×50ml ）、および飽和NaCｌ（2×50ml）で洗浄し、次に無水MgS0₄で乾燥した。次いで溶媒を減圧下蒸発させることによって除去した。得られた油状物をシリカゲル（ 60〜200メッシュ）の2.5×80cmのカラムに注入した。２％メタノール含有クロロホルムによって標題の化合物が溶出された。Ｂ．Boc-His-Asp-CH₂F，Boc-Tyr-Asp-CH₂FおよびBoc-Phe-Asp-CH₂Fの合成上述の実施例３Ａの方法にしたがって製造したBoc-Asp-CH₂Fをトリフルオロ酢酸（TFA）に溶解し、得られた混合物を約23℃で約５分間撹拌する。次に冷エーテルを混合物に添加する。エーテルを蒸発させ次にトルエンを加えて残留TFAを共蒸発させる。脱保護されたペプチド（H-Asp-CH₂F）がTFA塩として得られる。その脱保護ペプチドは、カップリング剤としてジシクロヘキシルカルボジイミドを用いる標準対称無水物法（Bodanszkyの上記文献）を使用して保護アミノ酸（すなわち、Boc-His0H，Boc-ProOH，Boc-TyrOH，Boc-Phe0H）にカップリングさせる。Ｃ．Ac-His-Asp-CH₂F，Ac-Pro-Asp-CH₂F，Ac-Tyr-Asp-CH₂FおよびAc-Phe-Asp-CH ₂Fの合成 Boc保護基を、実施例３Ｂの方法で製造した化合物から、上述のようにトリフルオロ酢酸を用いて除去する。次に脱保護された化合物を各々標準の方法にしたがって無水酢酸とジイソプロピルアミン（DIAE）でアセチル化する（Stuartらの上記文献）。Ｄ．Cbz-His-Asp-CH₂F，Cbz-Pro-Asp-CH₂F，Cbz-Tyr-Asp-CH₂FおよびCbz-Phe-As p-CH₂Fの合成実施例３Ａの方法にしたがって製造したBoc-Asp-CH₂Fから、Boc保護基を上述のようにTFAを用いて除去する。市販元（Bachem社、米国、ペンシルバニア州、フィラデルフィア）から入手できるベンジルオキシカルボニル保護アミノ酸（すなわち、Cbz-His-0H，Cbz-Phe-0H，Cbz-Tyr-0H，Cbz-Pro-0H）を、対称無水物カップリング法を用いて、上記の脱保護されたAspにカップリングさせる（Bodan- szkyの上記文献）。実施例４：IL-1βpro活性の阻害 Boc-Asp-CH₂Fを、preIL-1βのIL-1βpro接触分解反応を阻害する性能について生体外検定法を用いて試験した（Blackら、J.Biol.Chem.，263（19）巻、9437頁、1988年）。この試験の結果を図３に示す。Boc-Asp-CH₂Fは実施例１Ａの方法にしたがって製造した。Ａ．preIL-1βの製造前駆物質preIL-1βポリペプチドを標準の組換えDNA法を用いてイー・コリから得た（Blackの上記文献）。組換えpreIL-1βはファージＰ_LプロモーターとCI857^tS 熱不安定性リプレッサーの制御下イー・コリ中に発現された。標準の組換えDN A法を用いて、下記のDNAセグメントを連結することによってpLNIL-1βFを構築した。すなわち（１）ベクター（アンピシリン耐性を与える）、コドン134−269およびHull-1βの３′非コーディング領域を含有する、NcoＩ／HindIIIで消化されたpLNIL-1β（12）の6160個の塩基対；（２）IL-1βの残基１〜６、およびNcoＩとSstＩの相補的末端をコードする相補的合成オリゴヌクレオチド；および（３）残基７−133をコードする、プラスミドIL-1β-6（１）由来の380個の塩基対の SstＩ／HindIII制限フラグメントである。その連結混合物をテトラサイクリン耐性の宿主RPI:pRK248cＩ^ts（12）に形質転換し、正しく組立てられたプラスミドを、アンピシリンとテトラサイクリンの両者に対して耐性の形質転換体から単離したDNAの制限分析によって同定した。pLNIL-1βＦを含有する形質転換体のpreI L-1β産生についての試験は、超誘導培地中、0.5のＡ₆₀₀まで増殖させ１〜20時間温度を30℃から42℃まで上昇させて抑制解除した培養物のSDS-PAGE分析によって行った。約31,000ダルトンのタンパク質が、pLNIL-１βＦを含有する培養物由来の試料に明らかになったが、 IL-1βコーディング領域が欠けている対照培養物中にはこのようなタンパク質はなかった。抗−IL-1βモノクローナル抗体（MAb）および標準としての精製組換え成熟IL-1βを用いる免疫ドットブロット分析法によって、培養物がほゞ2.5〜5 .0μｇ／mlのpreIL-1βを含有していることが分かった。Ｂ．preIL-1βのイー・コリからの抽出転移させたイー・コリ培養物2.5ｌ由来の細胞ペレットを、５mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、500μｇ／mlのリゾチームおよび１mMのフェニルメタンスルホニル（PMSF）を含有する30mMトリス−HCｌ緩衝液（pH9.5）20ml中に再懸濁させた。その細胞懸濁液はPolytronホモジナイザー（Brinkmann Instruments社）を使ってホモジナイズし、ドライアイス／メタノール浴中迅速に凍結させ次いで融解させた。次に、150mMのNaCｌとｌmMのPMSFを含有する30mMトリス−HCｌ緩衝液（pH8.0）200mlを上記懸濁液に添加し、次にその懸濁液をホモジナイズして均一なホモジネートを得た。その均一懸濁液を４℃で30分間インキュベートし、次いで４℃で60分間3800×ｇで遠心分離した。上澄み液の画分を注意深くデカントし、濾過して粒子状物質を除去した。ペレットは、150mM NaCｌ、８Ｍ尿素および１mM PMSFを含有する30mMトリス−HCｌ緩衝液（pH8.0）100mlで再抽出した。上記のトリス抽出液と尿素抽出液の両者はかなりな量のpreIL-1βを含有しいたので両者を下記のようにして精製した。Ｃ．preIL-1βの精製クロマトグラフィによる処理はすべて４℃で実施した。全画分は、タンパク質濃度について検定し、適切な場合、伝導率を測定した。各クロマトグラフィーのステップが終ってから、画分を、ドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミドゲル電気泳動法SDS-PAGE（ポリアクリルアミドの10〜20％勾配液による）、続いて銀染色法、および精製した成熟IL-1βに対して生成したMAbを用いるウェスタンブロット法によって分析した。抽出液を水で１：４に希釈し、pHを8.1に調節し、次いでその物質を100ml/ｈの流量で25×2.5cmのＱ−セファロースカラムに注入した。トリスによる抽出液に対しては、カラムは10mMトリス−HCｌ（pH8.1）中で平衡化させた。尿素による抽出液に対しては、カラムは10mMトリス−HCｌ（pH8.1）、２Ｍ尿素中で平衡化させた。カラムを、８倍カラム容積の10mMトリス−塩酸（pH8.1）で洗浄し、次に捕捉されたタンパク質は、10ｍトリス−HCｌ（pH8.1）中0〜1.5Ｍ NaCｌの範囲の直線勾配液（３倍カラムの容積）で溶離した。7.5mlづつの画分を収集し、精製の次のステップまで４℃で貯蔵した。 preIL-1βを含有している（ウェスタンブロット分析法で測定とき）Ｑ−セファロース画分は、プールし10mMトリス−HCｌ（pH8.1）で1：10に希釈した。カラムを４倍カラム容積の出発緩衝液で洗浄した。上記のトリス−HCｌ溶液を、0.2Ｍの（NH₄）₂S0₄を含有する10mMトリス−HCｌ緩衝液（pH8.1）内で予め平衡化させたフェニルーセファロースCL-4Bの20×5cm カラムに注入した。そのカラムを３倍カラム容積の出発緩衝液で洗浄し、次いで物質を、最初、10mMトリス−HCｌ緩衝液（pH8.1）中0.2Ｍと０Ｍの（NH₄）₂S0₄ 溶液で作った（NH₄）₂S0₄の減少直線勾配液の４倍カラム容積で溶離した。最後に物質を２倍カラム容積の10mMトリス−HCｌ（pH8.1）で溶離した。部分的に精製されたpreIL-1βを含有する画分をプールし、PBSに対して透析し、使用するまで−70℃で貯蔵した。Ｄ．preIL-1βのタンパク質加水分解処理５μｌのpreIL-1β（PBS中約50μｇ／ml）を10μｌの精製IL-1βpro（PBS中15 〜75μｇ／ml）と混合し、37℃で30分間インキュベートした。試料をドライアイス上に置くかまたはSDS試料緩衝液を添加して、インキュベーションを終結させた。PMSFを１mMの濃度まで添加し、次に試料を水に対して透析させた。透析を終ってから、試料をSpeed-Vac濃縮器で濃縮乾固し、次いでSDS試料緩衝液に溶解した。Ｅ．タンパク質分解生成物のウェスタンブロット分析 SDS-PAGEを12％ポリアクリルアミドゲルを使って実施した。ゲルを転移緩衝液〔0.192Ｍグリシン、0.025Ｍトリス−HCｌ（pH8.3）、20％ｖ／ｖメタノール〕中に入れ、次いでタンパク質を、Hoeffer転移装置のニトロセルロース（Sartori us）上に電気泳動させた（最大電圧で１時間）。続いてそのニトロセルロースを、３％のウシ血清アルブミンを含有する20mMリン酸ナトリウムpH7.4（PBS）中に室温で少なくとも15分間入れた。本発明の発明者らは、そのブロットをプローブするのに成熟IL-1βに特異的なMabを使用した。Mabを９μｇ／mlの濃度まで添加し、インキュベーションを30分間続けた。そのブロットをPBSで３回すすぎ、西洋ワサビペルオキシダーゼの展開剤（Bio-Rad社）６mgを２mlのメタノールに溶解し、これを過酸化水素（10mlのトリス緩衝食塩水に希釈した60μｌ）と混合して得た溶液で展開した。データは、Boc-Asp-CH₂Fが、５μＭの濃度で、preIL-1βから成熟IL-1βが生成するのを完全に阻害し、１μＭの濃度で成熟IL-１βの生成を部分的に阻害することを示している。実施例５：COS-7細胞にトランスフェクトされたときのIL-1βproの生物活性本発明の発明者らは、アミノ酸120〜404に相当するcDNAを哺乳類細胞発現ベクター（pDC303）に挿入した。このプラスミドは、前駆IL-1βをコードするcDNAを含有する第２の哺乳類発現プラスミドとともに、COS-7細胞（サル腎臓）中に共トランスフェクトされた。２日後、細胞に³⁵Ｓで放射能標識を付け、IL-1β特異的タンパク質を細胞溶解液から免疫沈降させた。この免疫沈降物をSDS-PAGEとオートラジオグラフィーによって分析した。その結果、本発明の発明者らは、COS- 7細胞がIL-1βproをコードするプラスミドとともに共トランスフェクトされた場合のみ、トランスフェクトされたC0S-7細胞が前駆IL-1βを成熟IL-1βにプロセスできることを見出した。対照プラスミドで共トランスフェクトされた細胞またはモックトランスフェクトされた細胞（Cells mock transfected）は前駆IL-1β のプロセシングを示さなかった。したがって、Ｎ末端119アミノ酸を欠いているI L-1βproによって、細胞は、前駆IL-1βをプロセスして、このタンパク質の成熟型にすることができる。配列の表（１）一般情報：（ｉ）出願人：ブラック，ロイエイスリース，ポールアールクロンヘイム，シャーリーアール（ii）発明の名称：インターロイキン１βプロテアーゼおよびインターロイキン１βプロテアーゼ阻害剤（iii）配列の数：24 （iv）通信宛先：（Ａ）受信人：DRESSLER,G0LDSMITH,SH0RE,SUTKER＆MILNAM0W （Ｂ）通り：ステットソン 180エヌ（Ｃ）市：シカゴ（Ｄ）州：イリノイ（Ｅ）国：米国（Ｆ）ZIP ：60601 （ｖ）コンピューターの読取り可能な形態：（Ａ）媒体の種類：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：IBM PCコンパチブル（Ｃ）動作システム：PC-D0S/MS-D0S （Ｄ）ソフトウェア：Patent In Release # 1.24 （vi）本願のデータ：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日：（Ｃ）分類：（Viii）弁護士／弁理士の情報：（Ａ）姓名：KATZ,MARTIN L. （Ｂ）登録番号：25011 （Ｃ）参照／摘要番号：IMMUNEX2108 （ix）電気通信の情報：（Ａ）電話：3126165400 （Ｂ）テレファックス：3126165460 （Ｃ）テレックス：9102211206 （２）SEQ IDNO:1の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：1659個の塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）ストランデッドネス（STRANDEDNESS）：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（xi）配列の種類：SEQ ID NO:1：（２）SEQ ID N0:2の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：404個のアミノ酸（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：線状（ii）分子の種類：ペプチド（xi）配列の種類：SEQ ID N0:2：（２）SEQ ID N0:3の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：269個のアミノ酸（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：線状（ii）分子の種類：ペプチド（xi）配列の種類：SEQ ID N0:3：（２）SEQ ID N0:4の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：18個の塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）ストランデッドネス：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ii）分子の種類：DNA （xi）配列の種類：SEQ IDN0:4： 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【手続補正書】【提出日】１９９４年２月２２日【補正内容】請求の範囲１．プロテアーゼ活性が、下記式：Ｒ₁−Asp−Ｒ₂−Ｒ₃ （式中、Ｒ₁とＲ₃は、独立して、ＤまたはＬの異性体のアミノ酸であり、Ｒ₂はA laまたはGlyであり、そして特定のプロテアーゼ切断部位がAspとＲ₂の間に位置する）で表される配列からなるアミノ酸配列を有する基質ペプチドに対して特異的である、前記特定のプロテアーゼ切断部位に対してプロテアーゼ活性を有する単離されたポリペプチド。２．インターロイキン−１βプロテアーゼ活性を有し、かつａ．Seq.I.D.No.1において、ヌクレオチド１で始まりヌクレオチド1232まで延びる配列と、ヌクレオチド374で始まりヌクレオチド1232まで延びる配列と、およびヌクレオチド374で始まりヌクレオチド約851〜約962まで延びる配列とからなるヌクレオチド配列群から選択されるDNA挿入断片；ｂ．上記のDNA挿入断片の１つ以上と検出可能にハイブリッドを形成し、かつヒト前駆インターロイキン−１βポリペプチドを、Asp116とAla117の残基の間の切断部位でタンパク質分解反応で切断する生物活性を示すポリペプチドをコードまたは発現するDNA配列；およびｃ．遺伝暗号の縮重のために、上記のDNA挿入断片と配列のいずれかによってコードされる哺乳類インターロイキン−１βプロテアーゼポリペプチドをコードするDNA配列：からなるDNA配列でコードされる単離インターロイキン−１βプロテアーゼポリペプチド。３．哺乳類プロ酵素インターロイキン−１βをコードする単離DNA配列。４．DNA配列が：ａ．Seq.I.D.No.1において、ヌクレオチド１から始まりヌクレオチド1232まで延びる配列と、ヌクレオチド374から始まりヌクレオチド1232まで延びる配列と、ヌクレオチド374から始まりヌクレオチド約851〜約962まで延びる配列とからなるヌクレオチド配列群から選択されるDNA挿入断片；ｂ．上記のDNA挿入断片の１つ以上と検出可能にハイブリッドを形成し、かつヒト前駆インターロイキン−１βポリペプチドを、Asp116とAla117の残基の間の切断部位でタンパク質分解反応で切断する生物活性を示すポリペプチドをコードまたは発現するDNA配列；およびｃ．遺伝暗号の縮重のために、上記のDNA挿入断片と配列のいずれかによってコードされる哺乳類インターロイキン−１βプロテアーゼポリペプチドをコードするDNA配列：からなる請求項３記載の単離DNA配列。５．請求項３記載のDNA配列を含有する組換え発現ベクター。６．ａ）請求項５記載のベクターを含有する適切な宿主細胞を、発現を促進する条件下で培養する工程；ｂ）工程ａ）の細胞からインターロイキン−１βプロテアーゼを抽出する工程；及びｃ）工程ｂ）のプロテアーゼを精製する工程；からなる、哺乳類インターロイキン−１βプロテアーゼ酵素またはその類似体もしくは誘導体の製造方法。７．Ｎ末端保護基および電気的陰性脱離基に連結されたＣ末端Asp残基を有する１〜約５個のアミノ酸残基のアミノ酸配列を有し、そのアミノ酸配列が、配列Ala-Tyr-Val-His-Asp、すなわちSeq.I.D.No.3の残基1 12〜116の少なくとも一部分に実質的に相当する化合物。８．下記式：Ｚ−Ｑ₂−Asp−Ｑ₁ （式中、ＺはＮ末端保護基であり；Ｑ₂は、配列Ｑ₂−Aspが配列Ala-Tyr-Val-His -AspすなわちSeq.I.D.No.3の残基112〜116の少なくとも一部分に実質的に相当するような０〜４個のアミノ酸であり；およびＱ₁は電気的陰性脱離基である）で表される請求項７記載の化合物。９．生理的に許容される担体と請求項８記載の化合物とからなる医薬組成物。 10．治療を要するヒト以外の哺乳類に請求項８に記載の化合物の有効な阻害量を投与することからなる、該ヒト以外の哺乳類中のIL-1βプロテアーゼ活性を阻害する方法。 11．治療を要するヒト以外の哺乳類に請求項８に記載の化合物の有効量を投与することからなる、該ヒト以外の哺乳類の炎症を治療するかまたは自己免疫疾患を予防および治療する方法。 12．Boc-Asp-CH₂F，Boc-His-Asp-CH₂F，Boc-Phe-Asp-CH₂F，Boc-Pro-Asp-CH₂F ，Boc-Tyr-Asp-CH₂F，Ac-His-Asp-CH₂F，Ac-Phe-Asp-CH₂F，Ac-Pro-Asp-CH₂F，A c-Tyr-Asp-CH₂F，Cb₃-His-Asp-CH₂F，Cb₃-Phe-Asp-CH₂F，Cb₃-Pro-Asp-CH₂F，およびCb₃-Tyr-Asp-CH₂Fからなる群から選択され、Bocがｔ−ブトキシカルボニルであり、Acがアセチルであり、およびCb₃がべンジルオキシカルボニルである化合物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 38/46 ＡＤＡＡＧＺＣ０７Ｋ 7/06 8318−4Ｈ 14/47 Ｃ１２Ｎ 9/99 9152−4Ｂ 15/09 ＺＮＡ //(Ｃ１２Ｎ 9/50 Ｃ１２Ｒ 1:91）Ａ６１Ｋ 37/54 ＡＢＥＡＢＡＡＧＺ (72)発明者クロンヘイム，シャーリーアール. アメリカ合衆国，ワシントン 98125，シアトル，サーティシックススノースイースト 11526

Claims

【特許請求の範囲】１．プロテアーゼ活性が、下記式：Ｒ₁−Asp−Ｒ₂−Ｒ₃ （式中、Ｒ₁とＲ₃は、独立して、ＤまたはＬの異性体のアミノ酸であり、Ｒ₂はA laまたはGlyであり、そして特定のプロテアーゼ切断部位がAspとＲ₂の間に位置する）で表される配列からなるアミノ酸配列を有する基質ペプチドに対して特異的である、前記特定のプロテアーゼ切断部位に対してプロテアーゼ活性を有する単離されたポリペプチド。２．IL-1βpro活性を有し、かつａ．Seq.I.D.No.1において、ヌクレオチド１で始まりヌクレオチド1232まで延びる配列と、ヌクレオチド374で始まりヌクレオチド1232まで延びる配列と、およびヌクレオチド374で始まりヌクレオチド約851〜約962まで延びる配列とからなるヌクレオチド配列群から選択されるDNA挿入断片；ｂ．上記のDNA挿入断片の１つ以上と検出可能にハイブリッドを形成し、かつヒト前駆IL-1βポリペプチドを、Asp116とAla117の残基の間の切断部位でタンパク質分解反応で切断する生物活性を示すポリペプチドをコードまたは発現するDN A配列；およびｃ．遺伝暗号の縮重のために、上記のDNA挿入断片と配列のいずれかによってコードされる哺乳類IL-1βproポリペプチドをコードするDNA配列：からなるDNA配列でコードされる単離IL-1βproポリペプチド。３．哺乳類IL-1βpro酵素をコードする単離DNA配列。４．DNA配列が：ａ．Seq.I.D.No.1において、ヌクレオチド１から始まりヌクレオチド1232まで延びる配列と、ヌクレオチド374から始まりヌクレオチド1232まで延びる配列と、ヌクレオチド374から始まりヌクレオチド約851〜約962まで延びる配列とからなるヌクレオチド配列群から選択されるDNA挿入断片；ｂ．上記のDNA挿入断片の１つ以上と検出可能にハイブリッドを形成し、かつヒト前駆IL-1βポリペプチドを、APsll6とAla117の残基の間の切断部位でタンパク質分解反応で切断する生物活性を示すポリペプチドをコードまたは発現するDN A配列；およびｃ．遺伝暗号の縮重のために、上記のDNA挿入断片と配列のいずれかによってコードされる哺乳類IL-1βproポリペプチドをコードするDNA配列：からなる請求項３記載の単離DNA配列。５．請求項３記載のDNA配列を含有する組換え発現ベクター。６．請求項５記載のベクターを含有する適切な宿主細胞を、発現を促進する条件下で培養することからなる、哺乳類IL-1βpro酵素またはその類似体もしくは誘導体の製造方法。７．適切な医薬用担体中に請求項１に記載の単離ポリペプチドを含有する医薬組成物を、創傷部位に投与することからなる、創傷部位の創傷の治癒を改善し、関節炎を治療し、自己免疫病を治療しまたは放射線治療の有害な作用の治療を行う方法。８．IL-1βpro cDNAの配列に相補的な少なくとも15個のヌクレオチドの配列からなり、IL-1βpro mRNAの翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド。９．Ｎ末端保護基および電気的陰性脱離基に連結されたＣ末端Asp残基を有する１〜約５個のアミノ酸残基のアミノ酸配列を有し、そのアミノ酸配列が、配列 Ala-Tyr-Val-His-Asp、すなわちSeq.I.D.No.3の残基112〜116の少なくとも一部分に実質的に相当する化合物。 10．下記式：Ｚ−Ｑ₂−ASP−Ｑ₁ （式中、ＺはＮ末端保護基であり；Ｑ₂は、配列Ｑ₂−Aspが配列Ala-Tyr-Val-His -AspすなわちSeq.I.D.No.3の残基112〜116の少なくとも一部分に実質的に相当するような０〜４個のアミノ酸であり；およびＱ₁は電気的陰性脱離基である）で表される請求項９記載の化合物。 11．生理的に許容される担体と請求項10記載の化合物とからなる医薬組成物。 12．治療を要する哺乳類に請求項10に記載の化合物の有効な阻害量を投与することからなる、該哺乳類中のIL-1βプロテアーゼ活性を阻害する方法。 13．治療を要する哺乳類に請求項10に記載の化合物の有効量を投与することからなる、該哺乳類の炎症を治療するかまたは自己免疫疾患を予防および治療する方法。 14．Boc-Asp-CH₂F，Boc-His-Asp-CH₂F，Boc-Phe-Asp-CH₂F，Boc-Pro-Asp-CH₂F ，Boc-Tyr-Asp-CH₂F，Ac-His-Asp-CH₂F，Ac-Phe-Asp-CH₂F，Ac-Pro-Asp-CH₂F，A c-Tyr-Asp-CH₂F，Cb₃-His-Asp-CH₂F，Cb₃-Phe-Asp-CH₂F，Cb₃-Pro-ASP-CH₂F、およびCb₃-Tyr-Asp-CH₂Fからなる群から選択され、Bocがｔ−ブトキシカルボニルであり、Acがアセチルであり、およびCb₃がベンジルオキシカルボニルである化合物。