JPH0787966A - 細胞毒素及びその応用 - Google Patents
細胞毒素及びその応用Info
- Publication number
- JPH0787966A JPH0787966A JP5269155A JP26915593A JPH0787966A JP H0787966 A JPH0787966 A JP H0787966A JP 5269155 A JP5269155 A JP 5269155A JP 26915593 A JP26915593 A JP 26915593A JP H0787966 A JPH0787966 A JP H0787966A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cytotoxin
- cells
- monoclonal antibody
- cell
- preparation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
- G01N33/56972—White blood cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/21—Interferons [IFN]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/52—Assays involving cytokines
- G01N2333/525—Tumor necrosis factor [TNF]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 細胞毒素に対するモノクローナル抗体を用い
た該細胞毒素の製造法が提供される。 【構成】 賦活化された末梢血液単核細胞で免疫したマ
ウスの脾細胞とマウスのミエローマ細胞とを融合して得
られるハイブリドーマから、細胞毒素に対するモノクロ
ーナル抗体が得られ、このモノクローナル抗体を用いる
ことによって、ポリアクリルアミドＳＤＳゲル電気泳動
による測定で１７，０００±５００Ｄの分子量を有する
細胞毒素を調製することができる。
た該細胞毒素の製造法が提供される。 【構成】 賦活化された末梢血液単核細胞で免疫したマ
ウスの脾細胞とマウスのミエローマ細胞とを融合して得
られるハイブリドーマから、細胞毒素に対するモノクロ
ーナル抗体が得られ、このモノクローナル抗体を用いる
ことによって、ポリアクリルアミドＳＤＳゲル電気泳動
による測定で１７，０００±５００Ｄの分子量を有する
細胞毒素を調製することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、ヒトの単核細胞に由
来する細胞毒素、ＣＴ、を精製した形で提供せんとする
ものである。この発明は、本質的に均質な形で精製され
たＣＴを調製する方法を提供せんとするものである。ま
た、この発明は、ＣＴ結合能力を有する抗体の産出ハイ
ブリドーマを選抜するためのスクリーニング用の免疫検
定法を提供せんとするものである。更に、この発明によ
って、ＣＴに特異的なモノクローナル抗体ＣＴ−１を提
供せんとするものである。更に、またこの発明は、ウイ
ルス感染腫瘍標的ヒト細胞の選択的な処理に有用である
ＣＴ、その塩若しくは誘導体と医薬用助剤とよりなる医
薬品組成物を提供せんとするものである。
来する細胞毒素、ＣＴ、を精製した形で提供せんとする
ものである。この発明は、本質的に均質な形で精製され
たＣＴを調製する方法を提供せんとするものである。ま
た、この発明は、ＣＴ結合能力を有する抗体の産出ハイ
ブリドーマを選抜するためのスクリーニング用の免疫検
定法を提供せんとするものである。更に、この発明によ
って、ＣＴに特異的なモノクローナル抗体ＣＴ−１を提
供せんとするものである。更に、またこの発明は、ウイ
ルス感染腫瘍標的ヒト細胞の選択的な処理に有用である
ＣＴ、その塩若しくは誘導体と医薬用助剤とよりなる医
薬品組成物を提供せんとするものである。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】細胞毒
性を有する蛋白が、種々の単核細胞により、刺激に反応
して、分泌されることが知られている。Ｔ−細胞、恐ら
くヘルパー及びサプレッサーサブセットの両方ともがそ
れらによって認識される抗体及びマイトジエンレクチン
に対して細胞毒を有する蛋白を分泌することにより対応
することができる（Ｇ．Ａ．Ｇｒａｎｇｅｒ及びＷ．
Ｐ．Ｋｏｌｂ，Ｊ．Ｉｍｍｉｎｏｌ．１０１、１１１−
１２０（１９６８）；Ｎ．Ｈ．Ｒｕｄｄｌｅ及びＢ．
Ｈ．Ｗａｋｓｍａｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１２８、１
２６７−１２７５（１９６８）；Ｄ．Ｄ．Ｅａｒｄｌｅ
ｙ，Ｆ．Ｗ．Ｓｈｅｎ，Ｒ．Ｋ．Ｇｅｒｓｈｏｎ及び
Ｎ．Ｈ．Ｒｕｄｄｌｅ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２４，
１１９９−１２０２（１９８０））。天然キラー細胞は
適当な標的細胞と一緒にインキュベートすると細胞毒作
用を有する蛋白を分泌する（Ｓ．Ｃ．Ｗｒｉｇｈｔ及び
Ｂ．Ｂｏｎａｖｉａ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２９、４
３３−４３９、（１９８２））が、一方ある種のＢリン
パ球継代系は自然発生的に細胞毒作用を有する蛋白を産
出することが知られている（Ｗ．Ｒｏｓｅｎａｕ，Ｄ．
Ｓｔｉｔｅｓ及びＳ．Ｊｅｍｔｒｕｄ，Ｃｅｌｌ．Ｉｍ
ｍｕｍｏｌ．４３、２３５−２４４、（１９７９））。
リンパ球培養物中で産出される蛋白は、通常リンフォト
キシンと呼ばれ、また、腫瘍壊死因子という用語はしば
しば、単球又はマクロファージの培養物中に産出された
細胞毒作用を有する蛋白に使用される。このような細胞
障害性（＝細胞毒作用を有する）蛋白は選択的に腫瘍細
胞を破壊することができるという事実は既に報告されて
いる（Ｊ．Ｏ．Ｒｕｎｄｅｌ及びＣ．Ｈ．Ｅｖａｎｓ，
Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ，３，９−１８、（１
９８１））。今までのところＢリンパ球系細胞により自
然発生的に産出された単一タンパクのみが僅かにその特
性が解明されているにすぎない。均質な状態にまで精製
したところその分子量は、おおよそ２００００ダルトン
であると推定されている（Ｂ．Ｂ．Ａｇｇａｒｗａｌ，
Ｂ．Ｍｏｆｆａｔ及びＲ．Ｎ．Ｈａｒｋｉｎｓ，Ｊ，Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９、６８９−６９１（１９８
４））。
性を有する蛋白が、種々の単核細胞により、刺激に反応
して、分泌されることが知られている。Ｔ−細胞、恐ら
くヘルパー及びサプレッサーサブセットの両方ともがそ
れらによって認識される抗体及びマイトジエンレクチン
に対して細胞毒を有する蛋白を分泌することにより対応
することができる（Ｇ．Ａ．Ｇｒａｎｇｅｒ及びＷ．
Ｐ．Ｋｏｌｂ，Ｊ．Ｉｍｍｉｎｏｌ．１０１、１１１−
１２０（１９６８）；Ｎ．Ｈ．Ｒｕｄｄｌｅ及びＢ．
Ｈ．Ｗａｋｓｍａｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１２８、１
２６７−１２７５（１９６８）；Ｄ．Ｄ．Ｅａｒｄｌｅ
ｙ，Ｆ．Ｗ．Ｓｈｅｎ，Ｒ．Ｋ．Ｇｅｒｓｈｏｎ及び
Ｎ．Ｈ．Ｒｕｄｄｌｅ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２４，
１１９９−１２０２（１９８０））。天然キラー細胞は
適当な標的細胞と一緒にインキュベートすると細胞毒作
用を有する蛋白を分泌する（Ｓ．Ｃ．Ｗｒｉｇｈｔ及び
Ｂ．Ｂｏｎａｖｉａ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２９、４
３３−４３９、（１９８２））が、一方ある種のＢリン
パ球継代系は自然発生的に細胞毒作用を有する蛋白を産
出することが知られている（Ｗ．Ｒｏｓｅｎａｕ，Ｄ．
Ｓｔｉｔｅｓ及びＳ．Ｊｅｍｔｒｕｄ，Ｃｅｌｌ．Ｉｍ
ｍｕｍｏｌ．４３、２３５−２４４、（１９７９））。
リンパ球培養物中で産出される蛋白は、通常リンフォト
キシンと呼ばれ、また、腫瘍壊死因子という用語はしば
しば、単球又はマクロファージの培養物中に産出された
細胞毒作用を有する蛋白に使用される。このような細胞
障害性（＝細胞毒作用を有する）蛋白は選択的に腫瘍細
胞を破壊することができるという事実は既に報告されて
いる（Ｊ．Ｏ．Ｒｕｎｄｅｌ及びＣ．Ｈ．Ｅｖａｎｓ，
Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ，３，９−１８、（１
９８１））。今までのところＢリンパ球系細胞により自
然発生的に産出された単一タンパクのみが僅かにその特
性が解明されているにすぎない。均質な状態にまで精製
したところその分子量は、おおよそ２００００ダルトン
であると推定されている（Ｂ．Ｂ．Ａｇｇａｒｗａｌ，
Ｂ．Ｍｏｆｆａｔ及びＲ．Ｎ．Ｈａｒｋｉｎｓ，Ｊ，Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９、６８９−６９１（１９８
４））。
【０００３】
【課題を解決するための手段】この発明により、細胞毒
素（＝細胞障害抗体＝ＣＴ）と呼ばれる精製された細胞
障害性蛋白と、当該蛋白を効率的に単球又はセンダイウ
イルスなどのウイルスを用いて単球より誘導された細胞
中に作出する方法を提出せんとするものである。更に、
この発明により、末梢血液の単核細胞により天然に産出
されるＣＴを精製し、本質的に均質なものとして調製す
る方法を提供せんとするものである。当該精製ＣＴは、
約１７０００ダルトンの分子量を有する。部分精製又は
粗製のＣＴ調製物を注入したマウスから得られる当該Ｃ
Ｔに対するモノクローナル抗体を用いて、当該ＣＴは単
離できる。更に、この発明により、かかる抗−ＣＴ抗体
を産出する細胞系を定着させる技術を提供せんとするも
のである。この細胞系（Ｃｅｌｌ−ｌｉｎｅ）は、上記
のようにして免疫化したマウスの脾臓の単核食細胞から
誘導された多数のハイブリドーマからのスクリーニング
により好都合に定着させうる。ＣＴに対して特異的なモ
ノクローナル抗体もまた本発明により提供せんとするも
のである。当該モノクローナル抗体は、上記の方法によ
り定着したハイブリドーマ細胞系により産出され、ＣＴ
を実質的に均質な精製された形で単離するために使用さ
れる。上記のようにして得られた精製細胞障害抗体、す
なわち、ＣＴは、特異的な抗−ＣＴ抗体により識別され
る。分析用ポリアクリルアミドＳＤＳゲル電気泳動によ
り、それはおおよそ１７０００±５００ダルトンの分子
量を有すると決定された。更にまた、この発明は、Ｃ
Ｔ、その塩若しくはその誘導体と、医薬品として使用可
能な賦形剤よりなる、ウイルス感染腫瘍標的ヒト細胞を
選択的に処理するための医薬品組成物を提供せんとする
ものである。
素（＝細胞障害抗体＝ＣＴ）と呼ばれる精製された細胞
障害性蛋白と、当該蛋白を効率的に単球又はセンダイウ
イルスなどのウイルスを用いて単球より誘導された細胞
中に作出する方法を提出せんとするものである。更に、
この発明により、末梢血液の単核細胞により天然に産出
されるＣＴを精製し、本質的に均質なものとして調製す
る方法を提供せんとするものである。当該精製ＣＴは、
約１７０００ダルトンの分子量を有する。部分精製又は
粗製のＣＴ調製物を注入したマウスから得られる当該Ｃ
Ｔに対するモノクローナル抗体を用いて、当該ＣＴは単
離できる。更に、この発明により、かかる抗−ＣＴ抗体
を産出する細胞系を定着させる技術を提供せんとするも
のである。この細胞系（Ｃｅｌｌ−ｌｉｎｅ）は、上記
のようにして免疫化したマウスの脾臓の単核食細胞から
誘導された多数のハイブリドーマからのスクリーニング
により好都合に定着させうる。ＣＴに対して特異的なモ
ノクローナル抗体もまた本発明により提供せんとするも
のである。当該モノクローナル抗体は、上記の方法によ
り定着したハイブリドーマ細胞系により産出され、ＣＴ
を実質的に均質な精製された形で単離するために使用さ
れる。上記のようにして得られた精製細胞障害抗体、す
なわち、ＣＴは、特異的な抗−ＣＴ抗体により識別され
る。分析用ポリアクリルアミドＳＤＳゲル電気泳動によ
り、それはおおよそ１７０００±５００ダルトンの分子
量を有すると決定された。更にまた、この発明は、Ｃ
Ｔ、その塩若しくはその誘導体と、医薬品として使用可
能な賦形剤よりなる、ウイルス感染腫瘍標的ヒト細胞を
選択的に処理するための医薬品組成物を提供せんとする
ものである。
【０００４】用語『塩』とは、ＣＴのカルボキシル基又
はアミノ基のいずれか一方又は双方の塩を意味し、また
用語『誘導体』とは、当該ＣＴのポリペプチド側鎖の共
有結合修飾を意味する。ＣＴ、その塩若しくはその誘導
体用の賦形剤は、その用法に従い適宜選択して使用す
る。即ち、局所処理用としては、クリーム又はローショ
ン用のものが、また注射用若しくは経口投与用として
は、ＣＴ、その塩若しくはその誘導体を安定化できるヒ
ト血清アルブミンなどを加えうる液体用のものが使用可
能である。当該精製ＣＴは、１０ピコグラム／ｍｌの低
い濃度で、腫瘍及びウイルスに感染した細胞に対して効
果的に細胞障害性を示す。治療に際しては、ＣＴの用量
は、標的組織中で、上記の濃度またはそれ以上となるよ
うに調整する。
はアミノ基のいずれか一方又は双方の塩を意味し、また
用語『誘導体』とは、当該ＣＴのポリペプチド側鎖の共
有結合修飾を意味する。ＣＴ、その塩若しくはその誘導
体用の賦形剤は、その用法に従い適宜選択して使用す
る。即ち、局所処理用としては、クリーム又はローショ
ン用のものが、また注射用若しくは経口投与用として
は、ＣＴ、その塩若しくはその誘導体を安定化できるヒ
ト血清アルブミンなどを加えうる液体用のものが使用可
能である。当該精製ＣＴは、１０ピコグラム／ｍｌの低
い濃度で、腫瘍及びウイルスに感染した細胞に対して効
果的に細胞障害性を示す。治療に際しては、ＣＴの用量
は、標的組織中で、上記の濃度またはそれ以上となるよ
うに調整する。
【０００５】当該ＣＴは、代謝ブロッカー、例えば、シ
クロヘキシミド（ＣＨＩ）、アクチノマイシンＤ又はマ
イトマイシンＣの存在下では細胞に効果的に障害性を示
すが、これらの薬剤の不存在下では、多種類の細胞はそ
の作用に対して耐性を示す。ウイルス感染によって、細
胞は、当該ＣＴにより殺滅され易くなる。例えば、ＶＳ
Ｖ感染ＳＶ−８０細胞の殺滅は有効に増強さされるが、
未感染ＳＶ−８０細胞には作用を示さない。ウイルス感
染細胞の殺滅作用は、ＩＦＮ（インターフェロン）類、
主としてＩＦＮ−γであるが、これらインターフェロン
を実質的な濃度で投与すると、相乗的に効果が高まる。
それ故に、当該ＣＴを治療に使用する際には、適当なＩ
ＦＮを含有する医薬品組成物は大変有利であり、また、
ＣＨＩ、アクチノマイシンＤ又はマイトマイシンＣなど
の代謝ブロッカーを含有する医薬品組成物も同様であ
る。
クロヘキシミド（ＣＨＩ）、アクチノマイシンＤ又はマ
イトマイシンＣの存在下では細胞に効果的に障害性を示
すが、これらの薬剤の不存在下では、多種類の細胞はそ
の作用に対して耐性を示す。ウイルス感染によって、細
胞は、当該ＣＴにより殺滅され易くなる。例えば、ＶＳ
Ｖ感染ＳＶ−８０細胞の殺滅は有効に増強さされるが、
未感染ＳＶ−８０細胞には作用を示さない。ウイルス感
染細胞の殺滅作用は、ＩＦＮ（インターフェロン）類、
主としてＩＦＮ−γであるが、これらインターフェロン
を実質的な濃度で投与すると、相乗的に効果が高まる。
それ故に、当該ＣＴを治療に使用する際には、適当なＩ
ＦＮを含有する医薬品組成物は大変有利であり、また、
ＣＨＩ、アクチノマイシンＤ又はマイトマイシンＣなど
の代謝ブロッカーを含有する医薬品組成物も同様であ
る。
【０００６】ＣＴに対する抗体を産出するハイブリドー
マ細胞は、フランス国パリ市パスツール研究所の国際菌
株保存センター（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｕｌ
ｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に１９８５年７月１
６日に寄託し、その番号は、第１−４７２番であり、発
明者等らは細胞系ＣＴ（Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ＣＴ）と
称呼している。この発明を、以下に例を挙げて説明す
る。図１には、ＣＴの単離方法を模式的に示す。図に示
した如く、この発明による方法は、適当な実験動物（例
えばマウスなど）をクロマトグラフ的手段を用いて精製
したＣＴ調製物で免疫化し、次いで、図２ａ及び同ｂに
示した技術を用いて、ＣＴ−中和性及びＣＴ−結合抗体
の血清力価をモニターすることを含む工程よりなる。当
該免疫化したマウスの脾臓の単核食細胞から誘導された
ハイブリドーマについて、図３に示した手順によりＣＴ
−結合抗体の産出に関しスクリーニングした。上記抗体
を産出すると判明したハイブリドーマをクローン化し、
産出されたモノクローナル抗体を免疫吸着剤カラムに適
用した。当該カラムにより、ＰＢＭＣ中にコンカナバリ
ンＡ（ＣｏｎＡ）及びホルボール−１２−０−ミリステ
ート１３アセテート（ＴＰＡ）に誘導されたリンフォカ
イン類の調製物から、ＣＴの親和力純化を行ない、次い
で、制御された細孔を有するガラス上のクロマトグラフ
ィーにより部分精製した。緊要な工程は、大量のハイブ
リドーマ培養物をＣＴに対する抗体の僅かな産出につい
て検出するためのスクリーニングであった。そのために
開発された技術（図３）は、固相ＣＴ−結合検定法を含
み、それは、かかる量の抗体の存在に関しハイブリドー
マ培養物を迅速スクリーニングを可能とするものであ
り、次いで、ＣＴの細胞障害性作用にたいして、シクロ
ヘキシミンを用いて感作した細胞を用いる生物検定法に
よって、当該固相に結合したＣＴを高感度で検出するこ
とができるものである。
マ細胞は、フランス国パリ市パスツール研究所の国際菌
株保存センター（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｕｌ
ｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に１９８５年７月１
６日に寄託し、その番号は、第１−４７２番であり、発
明者等らは細胞系ＣＴ（Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ＣＴ）と
称呼している。この発明を、以下に例を挙げて説明す
る。図１には、ＣＴの単離方法を模式的に示す。図に示
した如く、この発明による方法は、適当な実験動物（例
えばマウスなど）をクロマトグラフ的手段を用いて精製
したＣＴ調製物で免疫化し、次いで、図２ａ及び同ｂに
示した技術を用いて、ＣＴ−中和性及びＣＴ−結合抗体
の血清力価をモニターすることを含む工程よりなる。当
該免疫化したマウスの脾臓の単核食細胞から誘導された
ハイブリドーマについて、図３に示した手順によりＣＴ
−結合抗体の産出に関しスクリーニングした。上記抗体
を産出すると判明したハイブリドーマをクローン化し、
産出されたモノクローナル抗体を免疫吸着剤カラムに適
用した。当該カラムにより、ＰＢＭＣ中にコンカナバリ
ンＡ（ＣｏｎＡ）及びホルボール−１２−０−ミリステ
ート１３アセテート（ＴＰＡ）に誘導されたリンフォカ
イン類の調製物から、ＣＴの親和力純化を行ない、次い
で、制御された細孔を有するガラス上のクロマトグラフ
ィーにより部分精製した。緊要な工程は、大量のハイブ
リドーマ培養物をＣＴに対する抗体の僅かな産出につい
て検出するためのスクリーニングであった。そのために
開発された技術（図３）は、固相ＣＴ−結合検定法を含
み、それは、かかる量の抗体の存在に関しハイブリドー
マ培養物を迅速スクリーニングを可能とするものであ
り、次いで、ＣＴの細胞障害性作用にたいして、シクロ
ヘキシミンを用いて感作した細胞を用いる生物検定法に
よって、当該固相に結合したＣＴを高感度で検出するこ
とができるものである。
【０００７】図４は、モノクローナル抗体（Ａ）より構
築された免疫吸着剤と、他の無関係な二種類のモノクロ
ーナル抗体（Ｂ及びＣ）によるインターフェロン−γの
結合に対するＣＴ−結合能を比較することにより、上述
の如く分離したモノクローナル抗体（すなわちＡ）の結
合力の選択性を示す。図から明らかな如く、ＣＴに対す
るもの（図４Ａ中のＣＴ−１）のみが三種類のうちでＣ
Ｔと結合することを示している。また、この図は、細胞
毒素調製物−ＩＦＮ−γ中の検出可能な量の他の蛋白と
は結合せずにＣＴとのこの結合は発生することを示して
いる。後者に対するモノクローナル抗体は、同一の実験
条件下で、同Ｂに示した如く、ＣＴとは全く結合せず
に、ＩＮＦ−γと効率的に結合する。
築された免疫吸着剤と、他の無関係な二種類のモノクロ
ーナル抗体（Ｂ及びＣ）によるインターフェロン−γの
結合に対するＣＴ−結合能を比較することにより、上述
の如く分離したモノクローナル抗体（すなわちＡ）の結
合力の選択性を示す。図から明らかな如く、ＣＴに対す
るもの（図４Ａ中のＣＴ−１）のみが三種類のうちでＣ
Ｔと結合することを示している。また、この図は、細胞
毒素調製物−ＩＦＮ−γ中の検出可能な量の他の蛋白と
は結合せずにＣＴとのこの結合は発生することを示して
いる。後者に対するモノクローナル抗体は、同一の実験
条件下で、同Ｂに示した如く、ＣＴとは全く結合せず
に、ＩＮＦ−γと効率的に結合する。
【０００８】図５のＣ欄には、当該モノクローナル抗体
から構築した免疫吸着剤上で精製したＣＴを、ＳＤＳの
存在下でアクリルアミドゲル上で電気泳動させたのち、
クーマシーブル−染色により検出したものを示す。（ま
た、Ａ欄には、当該ＣＴを精製して得たリンフォカイン
の粗製調製物中の蛋白のパターンを、Ｂ欄には、無関係
の抗体（ＤＮＰに対するもの）から構築した免疫吸着剤
上に上記の粗製調製物を適用したときの蛋白結合の不存
在を、Ｄ欄には、分子量標準物質を示す。）図６には、
図５Ｄに示した分子量標準物質の、アクリルアミドゲル
上の、移動性との比較において、このＣＴの推定分子量
を示す。当該ＣＴの選択的細胞障害性と、そのＩＦＮに
よる増幅については図７に示す。尚、図中の●印は、Ｖ
ＳＶ感染ＳＶ−８０細胞に対する種々な濃度での効果
を、○印は感染１６時間前に１０単位／ｍｌのＩＦＮ−
γで、△印は同１００単位／ｍｌのＩＦＮ−γでこれら
の細胞を処理した時の増強作用を、■印で示される未感
染細胞によるＣＴへの耐性又は□印で示されるＩＦＮ−
γを１００単位／ｍｌでそれら（未感染細胞）を処理し
た場合のＣＴへの耐性との比較において示す。
から構築した免疫吸着剤上で精製したＣＴを、ＳＤＳの
存在下でアクリルアミドゲル上で電気泳動させたのち、
クーマシーブル−染色により検出したものを示す。（ま
た、Ａ欄には、当該ＣＴを精製して得たリンフォカイン
の粗製調製物中の蛋白のパターンを、Ｂ欄には、無関係
の抗体（ＤＮＰに対するもの）から構築した免疫吸着剤
上に上記の粗製調製物を適用したときの蛋白結合の不存
在を、Ｄ欄には、分子量標準物質を示す。）図６には、
図５Ｄに示した分子量標準物質の、アクリルアミドゲル
上の、移動性との比較において、このＣＴの推定分子量
を示す。当該ＣＴの選択的細胞障害性と、そのＩＦＮに
よる増幅については図７に示す。尚、図中の●印は、Ｖ
ＳＶ感染ＳＶ−８０細胞に対する種々な濃度での効果
を、○印は感染１６時間前に１０単位／ｍｌのＩＦＮ−
γで、△印は同１００単位／ｍｌのＩＦＮ−γでこれら
の細胞を処理した時の増強作用を、■印で示される未感
染細胞によるＣＴへの耐性又は□印で示されるＩＦＮ−
γを１００単位／ｍｌでそれら（未感染細胞）を処理し
た場合のＣＴへの耐性との比較において示す。
【０００９】
【実施例】次の実施例は、この発明の説明の為のみに記
載するものであり、勿論これにこの発明が限定されるも
のでないことを云うまでもない。１．ＣＴの誘導 ：ヒトの末梢血液単核細胞 （ＢＰＭＣ）を新鮮な献血血液のいわゆる“バッフィコ
ート”から“ファイコール−ハイパーク”（Ｆｉｃｏｌ
ｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ；ファルマシャ社製、スエーデン国
アプサラ市）上で単離し、分画遠心により血小板を除去
する。当該細胞を１０7 細胞／ｍｌの濃度で懸濁させ３
７℃でＭＥＭアルファ培地（ギブコ社製、ニューヨーク
市グランドアイランド）中でインキュベートする。ＣＴ
は、これらの細胞中に下記のうちのいずれか一つの方法
で誘導する：
載するものであり、勿論これにこの発明が限定されるも
のでないことを云うまでもない。１．ＣＴの誘導 ：ヒトの末梢血液単核細胞 （ＢＰＭＣ）を新鮮な献血血液のいわゆる“バッフィコ
ート”から“ファイコール−ハイパーク”（Ｆｉｃｏｌ
ｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ；ファルマシャ社製、スエーデン国
アプサラ市）上で単離し、分画遠心により血小板を除去
する。当該細胞を１０7 細胞／ｍｌの濃度で懸濁させ３
７℃でＭＥＭアルファ培地（ギブコ社製、ニューヨーク
市グランドアイランド）中でインキュベートする。ＣＴ
は、これらの細胞中に下記のうちのいずれか一つの方法
で誘導する：
【００１０】Ａ．マウスの免疫化するのに使用する調製
物の植物凝集素（ＰＨＡ）を用いてＰＢＭＣを賦活する
ことにより誘導する方法。 細胞の賦活前に、リンフォカイン（０．２μｇ／ｍｌ）
の粗製調製物の存在下でまず１２時間インキュベートす
る。この処理によってＣＴの産出は起こらないが、引き
続いての賦活（刺激）に対する細胞の応答性を著るしく
増大させる。ＰＨＡ（５μｇ／ｍｌ；デイフコ社製、デ
トロイト市）を加えて、当該ＰＢＭＣを更に２４時間イ
ンキュベートする。培養物を収集し、２５００ｒｐｍで
１５分間遠心分離し、細胞残渣を除去し、以下に記載す
る如くＣＴを濃縮し、富化させるために処理をする。
物の植物凝集素（ＰＨＡ）を用いてＰＢＭＣを賦活する
ことにより誘導する方法。 細胞の賦活前に、リンフォカイン（０．２μｇ／ｍｌ）
の粗製調製物の存在下でまず１２時間インキュベートす
る。この処理によってＣＴの産出は起こらないが、引き
続いての賦活（刺激）に対する細胞の応答性を著るしく
増大させる。ＰＨＡ（５μｇ／ｍｌ；デイフコ社製、デ
トロイト市）を加えて、当該ＰＢＭＣを更に２４時間イ
ンキュベートする。培養物を収集し、２５００ｒｐｍで
１５分間遠心分離し、細胞残渣を除去し、以下に記載す
る如くＣＴを濃縮し、富化させるために処理をする。
【００１１】Ｂ．免疫吸着剤上によるＣＴ精製に使用す
るリンフォカイン調製物のＣｏｎＡを用いての有利に誘
導化する方法。 痕跡量のＰＨＡを精製によって充分に除去することは困
難であることが知られている。従って、以下の方法を用
いても良い。当該細胞をまず０．２５μｇ／ｍｌのＣｏ
ｎ Ａで１２時間処理をする。この濃度では、Ｃｏｎ
Ａは、ＣＴの有意な分泌は誘導しないが、引き続いての
Ｃｏｎ Ａの高濃度による細胞の賦活への応答性が増加
する。ポルボール−１２−０−ミリステート１３アセテ
ート（ＴＰＡ）を５ｎｇ／ｍｌの濃度となるまで加え、
３時間後にＣｏｎ Ａを１０μｇ／ｍｌの濃度となるま
で加える。当該細胞を２４時間インキュベートし、更に
５μｇ／ｍｌのＣｏｎＡを含む新しい培地に移しかえ、
更に２４時間インキュベートする。培養物をあわせ、遠
心分離し、メチル−α−Ｄマンノシド（シグマ社製、ミ
ズリー州セントルイス市）を５０ｍＭの濃度まで加え、
当該培地を更に次に記載する方法で免疫吸着剤上での精
製のために処理する。
るリンフォカイン調製物のＣｏｎＡを用いての有利に誘
導化する方法。 痕跡量のＰＨＡを精製によって充分に除去することは困
難であることが知られている。従って、以下の方法を用
いても良い。当該細胞をまず０．２５μｇ／ｍｌのＣｏ
ｎ Ａで１２時間処理をする。この濃度では、Ｃｏｎ
Ａは、ＣＴの有意な分泌は誘導しないが、引き続いての
Ｃｏｎ Ａの高濃度による細胞の賦活への応答性が増加
する。ポルボール−１２−０−ミリステート１３アセテ
ート（ＴＰＡ）を５ｎｇ／ｍｌの濃度となるまで加え、
３時間後にＣｏｎ Ａを１０μｇ／ｍｌの濃度となるま
で加える。当該細胞を２４時間インキュベートし、更に
５μｇ／ｍｌのＣｏｎＡを含む新しい培地に移しかえ、
更に２４時間インキュベートする。培養物をあわせ、遠
心分離し、メチル−α−Ｄマンノシド（シグマ社製、ミ
ズリー州セントルイス市）を５０ｍＭの濃度まで加え、
当該培地を更に次に記載する方法で免疫吸着剤上での精
製のために処理する。
【００１２】Ｃ．ヒトの末梢血液単核細胞等中に効率的
にＣＴを誘導する方法。 上記の単核細胞に変えて、単核細胞群より分離した単球
又はセンダイウイルス（２００ＨＡ単位／ｍｌ）をこれ
らの細胞に処理した単球に似た性質を有するＵｇ３７な
どの培養細胞も使用出来る。これらの細胞を１２時間イ
ンキュベートしてＣＴを産出せしめる。細胞培養物を遠
心分離し、以下に記載する方法で精製するために処理を
する。
にＣＴを誘導する方法。 上記の単核細胞に変えて、単核細胞群より分離した単球
又はセンダイウイルス（２００ＨＡ単位／ｍｌ）をこれ
らの細胞に処理した単球に似た性質を有するＵｇ３７な
どの培養細胞も使用出来る。これらの細胞を１２時間イ
ンキュベートしてＣＴを産出せしめる。細胞培養物を遠
心分離し、以下に記載する方法で精製するために処理を
する。
【００１３】２．ＣＴの定量：ＣＴの定量は、生物検定
法（Ｄ．Ｗａｌｌａｃｈ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ １．１３
２，２４６４−２４６９（１９８４））を用いて、その
細胞障害性作用を定量する。検査すべき試料を、一連の
希釈濃度で、シクロヘキシミド（ＣＨＩ５０μｇ／ｍ
ｌ）と同時にＳＶ−８０細胞の融合性培養物を含有する
ミクロ−ウェルへと適用する。細胞の殺滅程度は、細胞
による中性赤色（色素）の摂取量の測定による分析で、
２０時間後に、マイクロＥＬＩＳＡ自動読取り装置（ダ
イナテック社製、バージニア州アレキサンドリア市）を
用いて定量化する。
法（Ｄ．Ｗａｌｌａｃｈ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ １．１３
２，２４６４−２４６９（１９８４））を用いて、その
細胞障害性作用を定量する。検査すべき試料を、一連の
希釈濃度で、シクロヘキシミド（ＣＨＩ５０μｇ／ｍ
ｌ）と同時にＳＶ−８０細胞の融合性培養物を含有する
ミクロ−ウェルへと適用する。細胞の殺滅程度は、細胞
による中性赤色（色素）の摂取量の測定による分析で、
２０時間後に、マイクロＥＬＩＳＡ自動読取り装置（ダ
イナテック社製、バージニア州アレキサンドリア市）を
用いて定量化する。
【００１４】３．ＣＴのクロマトグラフを用いた富化：
ＣＴの粗製の調製物はまず制御された細孔を有するガラ
ス（ＣＰＧ；ＰＧ−３５０−２００シグマ社製、ミゾリ
ー州セントルイス市）に吸着させて濃縮し、次いで０．
５Ｍのテトラメチルアンモニウムクロライド（ＴＭＡ
Ｃ）で脱着させ、更にアミコンＰＭ−１０膜（アミコン
社製、マサチューセッツ州デンバー市）で限外濾過して
濃縮する。マウスの免疫のために適用するＣＴ調製物
は、更に次ぎ二方法のうちのいずれか一方の手順で精製
する：
ＣＴの粗製の調製物はまず制御された細孔を有するガラ
ス（ＣＰＧ；ＰＧ−３５０−２００シグマ社製、ミゾリ
ー州セントルイス市）に吸着させて濃縮し、次いで０．
５Ｍのテトラメチルアンモニウムクロライド（ＴＭＡ
Ｃ）で脱着させ、更にアミコンＰＭ−１０膜（アミコン
社製、マサチューセッツ州デンバー市）で限外濾過して
濃縮する。マウスの免疫のために適用するＣＴ調製物
は、更に次ぎ二方法のうちのいずれか一方の手順で精製
する：
【００１５】（Ａ）ＣＰＧ−濃縮ＣＴ調製物を、非変性
条件下で７．５％アクリルアミドゲルを用いた電気泳動
により分画する（Ｓ．Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ及びＺ．Ｊ．Ｌ
ｕｃａｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３，８１３−８２
３，（１９７４），Ｊ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ，Ｃ．Ｅ．Ｃａ
ｒｍａｃｋ，Ｒ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｇ．Ａ．Ｇｒａｎ
ｇｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１４，１６３
−１７６（１９７７））。ゲルのスライスから溶出され
たフラクションで、細胞障害性を示すものをプールし、
ＰＭ−１０膜で限外濾過して濃縮しマウスへ注入する。
条件下で７．５％アクリルアミドゲルを用いた電気泳動
により分画する（Ｓ．Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ及びＺ．Ｊ．Ｌ
ｕｃａｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３，８１３−８２
３，（１９７４），Ｊ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ，Ｃ．Ｅ．Ｃａ
ｒｍａｃｋ，Ｒ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｇ．Ａ．Ｇｒａｎ
ｇｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１４，１６３
−１７６（１９７７））。ゲルのスライスから溶出され
たフラクションで、細胞障害性を示すものをプールし、
ＰＭ−１０膜で限外濾過して濃縮しマウスへ注入する。
【００１６】（Ｂ）ＣＰＧ−濃縮ＣＴ調製物をＩＭＮａ
Ｃｌ、３０％のエチレングリコール、１０ｍＭの燐酸ソ
ーダ及び０．１ｍＭ ＥＤＴＡで平衡状態として、二回
連続してウルトロゲルＡｃＡ４４上で分画する。各分画
後、細胞障害性を示すフラクションをプールし、ＰＭ−
１０膜上で濃縮する。ウルトロゲルカラムから二度目に
回収された細胞障害性蛋白を、ＬＫＢ８１００−１カラ
ムを用いて庶糖溶液中に構築された１％アムフォリン勾
配（ｐＨ３．５〜１０）に、分離用等電点電気泳動によ
る高次精製のために適用する。最大細胞障害性活性を示
すフラクションで、約ｐＨ６．４でピークを示すものを
プールし、濃縮し、ＰＢＳで平衡化し、次いでマウスに
注入する。
Ｃｌ、３０％のエチレングリコール、１０ｍＭの燐酸ソ
ーダ及び０．１ｍＭ ＥＤＴＡで平衡状態として、二回
連続してウルトロゲルＡｃＡ４４上で分画する。各分画
後、細胞障害性を示すフラクションをプールし、ＰＭ−
１０膜上で濃縮する。ウルトロゲルカラムから二度目に
回収された細胞障害性蛋白を、ＬＫＢ８１００−１カラ
ムを用いて庶糖溶液中に構築された１％アムフォリン勾
配（ｐＨ３．５〜１０）に、分離用等電点電気泳動によ
る高次精製のために適用する。最大細胞障害性活性を示
すフラクションで、約ｐＨ６．４でピークを示すものを
プールし、濃縮し、ＰＢＳで平衡化し、次いでマウスに
注入する。
【００１７】ＣＴによる免疫化と細胞融合：４ケ月齢の
ＣＢ６系雌マウスにＣＴ調製物１０μｇの試料を注射す
る。一手順Ａにより富化したＣＴで５回注射し、手順Ｂ
により富化したＣＴで５回注射し、手順Ｂにより富化し
たＣＴで更に２回注射する。第１回の免疫化では、蛋白
を完全フロイントアジュバントに乳化させ、マウスの肉
跡に（０．５ｍｌ／マウス）注射する。第２回の注射
は、３週間後に行ない、残りの注射は１〜２週間間隔で
行ない、すべてアルミナゲルをアジュバントとして皮下
に（０．３μｇ／０．２５ｍｌ／マウス）注入する。免
疫化を１ケ月間中止し、ＣＴに対する血清抗体がもっと
も高い力価を示したマウスに対して２回腹腔内に１日間
間隔で、手順Ｂで富化した１０μｇのＣＴを注入する。
第２回の免疫化の１日後に、マウスを屠殺し、その脾臓
の食細胞をミエローマ細胞と融合させる。当該融合細胞
をマイクロタイター（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）プレート
上の多数のウェル（孔）に分配し、ＨＡＴ含有組織培養
用培地上でハイブリドーマを選抜する。ＣＴに対する抗
体を産出することが明らかとなったハイブリドーマは、
軟寒天培地中でクローン化する。マウスの腹水中でこれ
らの細胞を成育させるために、マウス１匹あたり１０ 7
細胞の濃度で腹腔内に、０．５ｍｌのプリスタン（Ｐｒ
ｉｓｔａｎ）の腹腔内注入２〜４週間後にこれらの細胞
を接種する。
ＣＢ６系雌マウスにＣＴ調製物１０μｇの試料を注射す
る。一手順Ａにより富化したＣＴで５回注射し、手順Ｂ
により富化したＣＴで５回注射し、手順Ｂにより富化し
たＣＴで更に２回注射する。第１回の免疫化では、蛋白
を完全フロイントアジュバントに乳化させ、マウスの肉
跡に（０．５ｍｌ／マウス）注射する。第２回の注射
は、３週間後に行ない、残りの注射は１〜２週間間隔で
行ない、すべてアルミナゲルをアジュバントとして皮下
に（０．３μｇ／０．２５ｍｌ／マウス）注入する。免
疫化を１ケ月間中止し、ＣＴに対する血清抗体がもっと
も高い力価を示したマウスに対して２回腹腔内に１日間
間隔で、手順Ｂで富化した１０μｇのＣＴを注入する。
第２回の免疫化の１日後に、マウスを屠殺し、その脾臓
の食細胞をミエローマ細胞と融合させる。当該融合細胞
をマイクロタイター（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）プレート
上の多数のウェル（孔）に分配し、ＨＡＴ含有組織培養
用培地上でハイブリドーマを選抜する。ＣＴに対する抗
体を産出することが明らかとなったハイブリドーマは、
軟寒天培地中でクローン化する。マウスの腹水中でこれ
らの細胞を成育させるために、マウス１匹あたり１０ 7
細胞の濃度で腹腔内に、０．５ｍｌのプリスタン（Ｐｒ
ｉｓｔａｎ）の腹腔内注入２〜４週間後にこれらの細胞
を接種する。
【００１８】マウス血清及びハイブリドーマ成育培地中
のＣＴに対する抗体の定量： 成育培地： マウスの血清中のＣＴに対する抗体の水準
は、これら（抗体）の中和及び結合能（活性）の測定に
より決定される。
のＣＴに対する抗体の定量： 成育培地： マウスの血清中のＣＴに対する抗体の水準
は、これら（抗体）の中和及び結合能（活性）の測定に
より決定される。
【００１９】ＣＴ中和能：（図２ａ） ＣＴ試料（５０μｌのダルベコー修正イーグル培地で２
％のＦＣＳを含有するもの（ＤＭＥＭ−２％ＦＣＳ）中
に１０単位を含む）をマウス血清（５０μｌ）のサンプ
ルと共に３７℃で４時間インキュベートし、ＤＭＥＭ−
２％ＦＣＳ中に段階的に希釈する。更に４℃で１２−１
６時間インキュベートし、次いでＣＴ活性を２倍希釈液
を８連制で測定する。
％のＦＣＳを含有するもの（ＤＭＥＭ−２％ＦＣＳ）中
に１０単位を含む）をマウス血清（５０μｌ）のサンプ
ルと共に３７℃で４時間インキュベートし、ＤＭＥＭ−
２％ＦＣＳ中に段階的に希釈する。更に４℃で１２−１
６時間インキュベートし、次いでＣＴ活性を２倍希釈液
を８連制で測定する。
【００２０】ＣＴ結合能：（図２ｂ） 粗製濃縮ＣＴ（３０μｌ、１０4 単位／ｍｌ）の試料
を、マウスの血清のサンプルと共に円すい形の底を持つ
マイクロ−タイターウェル（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）中で
３７℃で４時間インキュベートし、ＤＭＥＭ−２％ＦＣ
Ｓ中で段階的に希釈する。正常なマウスの血清（ＰＢＳ
に１：４０の割合で希釈したものを２０μｌ）を加え、
次いでマウスのＦ（ａｂ）′2 に対する山羊の抗血清６
０μｌを加える。更に、３７℃で３０分間、４℃で一晩
インキュベートし、１２００ｇで４℃で５分間遠心分離
する。当該免疫沈澱物は、冷ＰＢＳで二回すすぎ、末緩
衝食塩水で一回すすぎ、５０μｌのＮＨ4 ＯＨを加えて
可溶化し、ＣＴ活性を８連制で、２倍希釈液について測
定する。
を、マウスの血清のサンプルと共に円すい形の底を持つ
マイクロ−タイターウェル（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）中で
３７℃で４時間インキュベートし、ＤＭＥＭ−２％ＦＣ
Ｓ中で段階的に希釈する。正常なマウスの血清（ＰＢＳ
に１：４０の割合で希釈したものを２０μｌ）を加え、
次いでマウスのＦ（ａｂ）′2 に対する山羊の抗血清６
０μｌを加える。更に、３７℃で３０分間、４℃で一晩
インキュベートし、１２００ｇで４℃で５分間遠心分離
する。当該免疫沈澱物は、冷ＰＢＳで二回すすぎ、末緩
衝食塩水で一回すすぎ、５０μｌのＮＨ4 ＯＨを加えて
可溶化し、ＣＴ活性を８連制で、２倍希釈液について測
定する。
【００２１】ＣＴ結合モノクローナルの検体のため固相
検定法：（図３に示した如く、ハイブリドーマ成育培養
物のＣＴ−結合抗体のスクリーニングに適用される）。
ＰＶＣマイクロタイタープレート（ダイナテック、バー
ジニア州アレキサンドリア市）を、マウスのＦ（ａｂ）
2 に対する親和性純化山羊抗体（ＰＢＳ中に８０μｇ／
ｍｌ、８０μｌ／ウェル）で、次いでハイブリドーマ成
育培地（５０μｌ／ウェル）で、最後に粗製の濃縮ＣＴ
調製物（１０4 単位／ｍｌ、５０μｌ／ウェル）の試料
でインキュベートする。各インキュベーション期間は、
（４℃で）１２〜１４時間で、次いで各プレートをＰＢ
Ｓを用いて３回すすぐ。プレートは更に一回末緩衝食塩
水ですすぎ、結合しているＣＴをＮＨ4 ＯＨ（７５ｍＭ
を含む０．１％ＦＣＳ２０μｌ／ウェル）を適用して溶
解させる。ＤＭＥＭ−１０％ＦＣＳ中の０．０４ＭＮａ
−Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４、１００μｌ加え、溶出した
細胞障害活性を４連制で、２倍希釈のＣＨＩ−感作ＳＶ
８０細胞を用いて定量する。
検定法：（図３に示した如く、ハイブリドーマ成育培養
物のＣＴ−結合抗体のスクリーニングに適用される）。
ＰＶＣマイクロタイタープレート（ダイナテック、バー
ジニア州アレキサンドリア市）を、マウスのＦ（ａｂ）
2 に対する親和性純化山羊抗体（ＰＢＳ中に８０μｇ／
ｍｌ、８０μｌ／ウェル）で、次いでハイブリドーマ成
育培地（５０μｌ／ウェル）で、最後に粗製の濃縮ＣＴ
調製物（１０4 単位／ｍｌ、５０μｌ／ウェル）の試料
でインキュベートする。各インキュベーション期間は、
（４℃で）１２〜１４時間で、次いで各プレートをＰＢ
Ｓを用いて３回すすぐ。プレートは更に一回末緩衝食塩
水ですすぎ、結合しているＣＴをＮＨ4 ＯＨ（７５ｍＭ
を含む０．１％ＦＣＳ２０μｌ／ウェル）を適用して溶
解させる。ＤＭＥＭ−１０％ＦＣＳ中の０．０４ＭＮａ
−Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４、１００μｌ加え、溶出した
細胞障害活性を４連制で、２倍希釈のＣＨＩ−感作ＳＶ
８０細胞を用いて定量する。
【００２２】ＣＴの免疫吸着剤による精製：モノクロー
ナル抗体を、腹水から硫酸アンモニア（５０％）を用
い、沈澱させ精製する。ＩｇＭイソタイプを更に水に対
して透析して精製し、次いでＰＢＳ中に沈澱したＩｇＭ
を溶解させる。当該免疫グロブリン、各１０ｍｇずつ
を、予じめアミノカプロン酸で誘導化し、Ｎ−ヒドロキ
シ サクシニイミドで活性化したトリスアクリルＧＦ２
０００（ＬＫＢ）１ｇとカップリングさせる。末カップ
リングの抗体は、５０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ
２．８）で、次いで０．１５ＭＮＨ4 ＯＨで当該樹脂を
洗浄することにより除去する。
ナル抗体を、腹水から硫酸アンモニア（５０％）を用
い、沈澱させ精製する。ＩｇＭイソタイプを更に水に対
して透析して精製し、次いでＰＢＳ中に沈澱したＩｇＭ
を溶解させる。当該免疫グロブリン、各１０ｍｇずつ
を、予じめアミノカプロン酸で誘導化し、Ｎ−ヒドロキ
シ サクシニイミドで活性化したトリスアクリルＧＦ２
０００（ＬＫＢ）１ｇとカップリングさせる。末カップ
リングの抗体は、５０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ
２．８）で、次いで０．１５ＭＮＨ4 ＯＨで当該樹脂を
洗浄することにより除去する。
【００２３】ＣＴの免疫吸着剤での精製の為に、当該樹
脂試料０．５ｍｌを０．５ＭのＴＭＡＣの存在下でＣＴ
調製物３ｍｌと４℃で２時間混合する。次いで、当該樹
脂を小さなカラムに充填し、末結合の蛋白を０．５Ｍの
ＴＭＡＣ溶液で更に洗浄する。当該カラムを次いで０．
５Ｍ ＴＭＡＣ中の０．５％ＮＰ−４０で洗浄し、更に
１０ｍＭの燐酸ソーダ緩衝液ｐＨ７．４を含む１Ｍ Ｎ
ａＣｌで、更に、末緩衝の食塩水で洗浄し、結合したＣ
Ｔを０．２ＭのＮＨ4 ＯＨを適用して溶出させ、１０分
間以内の溶出物を１Ｍの酢酸で中和する。免疫親和性の
精製手順はすべて４℃で実施する。
脂試料０．５ｍｌを０．５ＭのＴＭＡＣの存在下でＣＴ
調製物３ｍｌと４℃で２時間混合する。次いで、当該樹
脂を小さなカラムに充填し、末結合の蛋白を０．５Ｍの
ＴＭＡＣ溶液で更に洗浄する。当該カラムを次いで０．
５Ｍ ＴＭＡＣ中の０．５％ＮＰ−４０で洗浄し、更に
１０ｍＭの燐酸ソーダ緩衝液ｐＨ７．４を含む１Ｍ Ｎ
ａＣｌで、更に、末緩衝の食塩水で洗浄し、結合したＣ
Ｔを０．２ＭのＮＨ4 ＯＨを適用して溶出させ、１０分
間以内の溶出物を１Ｍの酢酸で中和する。免疫親和性の
精製手順はすべて４℃で実施する。
【００２４】ＳＤＳゲル電気泳動による精製ＣＴの分析 図５は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１５％）上
で分析した細胞毒素の粗製調製物中の蛋白のパターンを
示す。抗体Ｕ１３−６（ＤＮＰに対するもの）から構築
された免疫吸着剤で、それに粗製ＣＴを適用したものか
らのアンモニア溶出フラクションはＢ欄に、ＣＴ−１免
疫吸着剤カラムによる粗製調製物から精製したＣＴはＣ
欄に、分子量標準物質（フォスフォリラーゼ９４Ｋ、牛
血清アルブミン６７Ｋ、オボアルブミン４３Ｋ、炭酸デ
ヒドラターゼ３０Ｋ、大豆トリプシンインヒビター２
０．１Ｋ及びリゾチーム１４．４Ｋダルトン）はＤ欄に
示す。尚、オボアルブミンから大豆トリプシンインヒビ
ターについては図６にその相対的位置関係をＣＴの推定
分子量との関係において示す。図５Ｃ欄は、精製ＣＴ
が、単一のポリペプチドから構成され、その推定分子量
即ち図６に示す如く既知分子量の他の蛋白の当該アクリ
ルアミドゲル上の移動度からの推定分子量は、約１７．
５Ｋｄ（ダルトン）の精製蛋白であることを示す。
で分析した細胞毒素の粗製調製物中の蛋白のパターンを
示す。抗体Ｕ１３−６（ＤＮＰに対するもの）から構築
された免疫吸着剤で、それに粗製ＣＴを適用したものか
らのアンモニア溶出フラクションはＢ欄に、ＣＴ−１免
疫吸着剤カラムによる粗製調製物から精製したＣＴはＣ
欄に、分子量標準物質（フォスフォリラーゼ９４Ｋ、牛
血清アルブミン６７Ｋ、オボアルブミン４３Ｋ、炭酸デ
ヒドラターゼ３０Ｋ、大豆トリプシンインヒビター２
０．１Ｋ及びリゾチーム１４．４Ｋダルトン）はＤ欄に
示す。尚、オボアルブミンから大豆トリプシンインヒビ
ターについては図６にその相対的位置関係をＣＴの推定
分子量との関係において示す。図５Ｃ欄は、精製ＣＴ
が、単一のポリペプチドから構成され、その推定分子量
即ち図６に示す如く既知分子量の他の蛋白の当該アクリ
ルアミドゲル上の移動度からの推定分子量は、約１７．
５Ｋｄ（ダルトン）の精製蛋白であることを示す。
【図１】ＣＴの製造工程を示す。
【図２】ＣＴに対する抗体の検出方法の手順を示す。
【図３】ＣＴ結合モノクローナル抗体の固相検定法の手
順を示す。
順を示す。
【図４】この発明によるモノクローナル抗体の結合能に
ついての他のモノクローナル抗体の比較結果を示す。
ついての他のモノクローナル抗体の比較結果を示す。
【図５】ＣＴ粗製物、精製ＣＴなどのポリアクリルアミ
ドゲル上の電気泳動による蛋白のパターンを示す。
ドゲル上の電気泳動による蛋白のパターンを示す。
【図６】この発明のＣＴの推定分子量を図５Ｄ欄の分子
量標準物質との比較において示す。
量標準物質との比較において示す。
【図７】この発明によるＣＴの細胞死滅能を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/16 38/36 39/00 39/395 Ｋ Ｃ０７Ｋ 16/00 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ａ 9282−4Ｂ 21/08 9161−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｎ Ｙ 33/577 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ａ６１Ｋ 37/46 9050−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (17)
- 【請求項１】 ポリアクリルアミドＳＤＳゲル電気泳動
による測定で１７，０００±５００Ｄの分子量を有する
細胞毒素を特異的に認識し結合するモノクローナル抗体
を発現するハイブリドーマセルラインであって、賦活さ
れた末梢血液単核細胞、単球細胞もしくは単球細胞様細
胞から得られる純粋なもしくは不純なヒト細胞毒素調製
物で免疫したマウスの脾細胞と、マウスのミエローマ細
胞との融合により形成される該ハイブリドーマセルライ
ン。 - 【請求項２】 ハイブリドーマセルラインがＣＮＣＭ１
−４７２である請求項１のハイブリドーマセルライン。 - 【請求項３】 ポリアクリルアミドＳＤＳゲル電気泳動
による測定で１７，０００±５００Ｄの分子量を有する
精製された細胞毒素の製造方法であって： （イ）該細胞毒素を含む調製物を用意し； （ロ）当該調製物から当該細胞毒素を制御された細孔を
有するガラスビーズに吸着させ； （ハ）当該制御された細孔を有するガラスビーズから純
度を高めた状態で当該細胞毒素を脱着させ； （ニ）当該細胞毒素に対するモノクローナル抗体よりな
る免疫吸着剤に、脱着した細胞毒素を接触させ；次い
で、 （ホ）該免疫吸着剤から該細胞毒素を溶出する；ことを
含む上記製造方法。 - 【請求項４】 当該細胞毒素を工程（ハ）において脱着
するのに際し、０．５Ｍテトラメチルアンモニウムクロ
ライドを含む脱着緩衝液を用いる、請求項３の製造方
法。 - 【請求項５】 当該細胞毒素を０．２ＭＮＨ4 ＯＨを用
いて当該免疫吸着剤から溶出させる、請求項３又は４の
製造方法。 - 【請求項６】 工程（イ）の調製物が賦活化した末梢血
液の単核細胞からの調製物である、請求項３又は５の製
造方法。 - 【請求項７】 当該細胞をリンフォカインとインキュベ
ートした後、植物凝集素を用いて賦活する、請求項３か
ら５のいずれかの製造方法。 - 【請求項８】 コンカナバリン−Ａそれ自体では、細胞
毒素の有意な分泌を誘導しない量を用いて、当該細胞を
インキュベートした後、コンカナバリン−Ａで賦活す
る、請求項３から６のいずれかの製造方法。 - 【請求項９】 当該細胞をセンダイウイルスで賦活す
る、請求項３から６のいずれかの製造方法。 - 【請求項１０】 ポリアクリルアミドＳＤＳゲル電気泳
動による測定で１７，０００±５００Ｄの分子量を有す
る精製された細胞毒素の製造方法であって：該細胞毒素
に対するモノクローナル抗体を含む免疫吸着剤に、該細
胞毒素を含む調製物を接触させ；次いで免疫吸着剤から
該細胞毒素を溶出させる；ことを含む上記製造方法。 - 【請求項１１】 ポリアクリルアミドＳＤＳゲル電気泳
動による測定で１７，０００±５００Ｄの分子量を有す
る細胞毒素に結合する抗体の産生に関する多数のハイブ
リドーマ培養物のスクリーニング用の固相免疫検定法で
あって： （イ）マウスの免疫グロブリンの抗体であって親和性を
純化させた抗体で、蛋白結合支持手段を被膜し； （ロ）被験ハイブリドーマの成長培養体を当該被膜支持
手段中でインキュベートし、次いで洗浄し； （ハ）細胞毒素の試料を当該支持手段中でインキュベー
トし、次いで洗浄し；次いで （ニ）支持手段に結合した細胞毒素を溶解し、生物検定
法によりその量を測定する；ことを含む上記固相免疫検
定法。 - 【請求項１２】 当該生物検定法が、代謝ブロッカーを
用いて細胞毒素の細胞毒作用に感作した細胞を用意し、
当該細胞を細胞毒素に暴露させ、細胞の死亡の程度測定
する、請求項１１の検定法。 - 【請求項１３】 代謝ブロッカーがシクロヘキシイミド
である請求項１２の検定法。 - 【請求項１４】 代謝ブロッカーがアクチノマイシンＤ
である請求項１２の検定法。 - 【請求項１５】 代謝ブロッカーがマイトマイシンＣで
ある請求項１２の検定法。 - 【請求項１６】 ポリアクリルアミドＳＤＳゲル電気泳
動による測定で１７，０００±５００Ｄの分子量を有す
る細胞毒素の単離方法であって： （イ）該細胞毒素の不純な調製物で免疫化することによ
って、該細胞毒素に対するモノクローナル抗体を調製
し；次いで （ロ）該モノクローナル抗体から免疫吸着剤を構築し、
該免疫吸着剤を用いて該細胞毒素の粗調製物から該細胞
毒素を単離する；ことを含む上記単離方法。 - 【請求項１７】 ポリアクリルアミドＳＤＳゲル電気泳
動による測定で１７，０００±５００Ｄの分子量を有す
る本質的に均質な形態にある細胞毒素を有効成分として
含有する、ウイルス感染細胞の治療用医薬組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IL73883A IL73883A (en) | 1984-12-20 | 1984-12-20 | Monoclonal antibodies against tnf-alpha,hybridomas producing them and method for the purification of tnf-alpha |
| IL73883 | 1984-12-20 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60286811A Division JPS61191620A (ja) | 1984-12-20 | 1985-12-19 | 細胞毒素及びその応用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0787966A true JPH0787966A (ja) | 1995-04-04 |
Family
ID=11055557
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60286811A Pending JPS61191620A (ja) | 1984-12-20 | 1985-12-19 | 細胞毒素及びその応用 |
| JP5269155A Pending JPH0787966A (ja) | 1984-12-20 | 1993-10-27 | 細胞毒素及びその応用 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60286811A Pending JPS61191620A (ja) | 1984-12-20 | 1985-12-19 | 細胞毒素及びその応用 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6090923A (ja) |
| EP (1) | EP0186833B2 (ja) |
| JP (2) | JPS61191620A (ja) |
| AU (1) | AU601144B2 (ja) |
| CA (1) | CA1337518C (ja) |
| DE (5) | DE122004000017I1 (ja) |
| IL (1) | IL73883A (ja) |
| NL (1) | NL300142I2 (ja) |
| ZA (1) | ZA859757B (ja) |
Families Citing this family (60)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5019385A (en) * | 1984-11-09 | 1991-05-28 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Novel lymphopine LK 2 and pharmaceutic compositions containing same |
| DE3631229A1 (de) * | 1986-09-13 | 1988-03-24 | Basf Ag | Monoklonale antikoerper gegen humanen tumornekrosefaktor (tnf) und deren verwendung |
| JP3155961B2 (ja) * | 1987-12-30 | 2001-04-16 | 煕 中島 | 抗ビリルビンモノクローナル抗体固定担体およびその製造方法 |
| EP0409901A4 (en) * | 1988-04-15 | 1991-10-30 | Research Corporation Technologies, Inc | Lak cell cytotoxin |
| US20030225254A1 (en) | 1989-08-07 | 2003-12-04 | Rathjen Deborah Ann | Tumour necrosis factor binding ligands |
| JP3443119B2 (ja) | 1989-08-07 | 2003-09-02 | ペプテック リミテッド | 腫瘍壊死因子結合リガンド |
| IL99120A0 (en) * | 1991-08-07 | 1992-07-15 | Yeda Res & Dev | Multimers of the soluble forms of tnf receptors,their preparation and pharmaceutical compositions containing them |
| ES2121907T3 (es) * | 1992-08-28 | 1998-12-16 | Bayer Ag | Uso de anticuerpos monoclonales anti-tnf para el tratamiento de meningitis bacterianas. |
| US7166423B1 (en) | 1992-10-21 | 2007-01-23 | Miltenyi Biotec Gmbh | Direct selection of cells by secretion product |
| JP3731891B2 (ja) * | 1992-10-21 | 2006-01-05 | ミルテンイ，ステファン | 分泌生成物による細胞の直接選択 |
| IL114615A0 (en) | 1995-07-16 | 1995-11-27 | Yeda Res & Dev | Modulators of the function of fas receptors and other proteins |
| US6090382A (en) * | 1996-02-09 | 2000-07-18 | Basf Aktiengesellschaft | Human antibodies that bind human TNFα |
| MX336813B (es) | 1996-02-09 | 2016-02-02 | Abbvie Biotechnology Ltd | Anticuerpos humanos que ligan el tnfa humano. |
| IL126024A0 (en) * | 1998-03-19 | 1999-05-09 | Yeda Res & Dev | Modulators of the function of receptors of the tnf/ngf receptor family and other proteins |
| IL178921A0 (en) * | 1998-12-24 | 2007-03-08 | Yeda Res & Dev | Caspase-8 interacting proteins |
| CA2817619A1 (en) | 2001-06-08 | 2002-12-08 | Abbott Laboratories (Bermuda) Ltd. | Methods of administering anti-tnf.alpha. antibodies |
| US20050271663A1 (en) * | 2001-06-28 | 2005-12-08 | Domantis Limited | Compositions and methods for treating inflammatory disorders |
| US20060073141A1 (en) * | 2001-06-28 | 2006-04-06 | Domantis Limited | Compositions and methods for treating inflammatory disorders |
| JP2005509647A (ja) * | 2001-11-06 | 2005-04-14 | アプライド リサーチ システムズ エーアールエス ホールディング ナームロゼ フェンノートシャップ | エストロゲン応答性乳癌の治療方法 |
| US20030206898A1 (en) | 2002-04-26 | 2003-11-06 | Steven Fischkoff | Use of anti-TNFalpha antibodies and another drug |
| US20040033228A1 (en) | 2002-08-16 | 2004-02-19 | Hans-Juergen Krause | Formulation of human antibodies for treating TNF-alpha associated disorders |
| US20040091490A1 (en) * | 2002-08-28 | 2004-05-13 | Robert Johnson | Stable pH optimized formulation of a modified antibody |
| WO2004019860A2 (en) * | 2002-08-28 | 2004-03-11 | Pharmacia Corporation | Formulations of modified antibodies and methods of making the same |
| MY150740A (en) | 2002-10-24 | 2014-02-28 | Abbvie Biotechnology Ltd | Low dose methods for treating disorders in which tnf? activity is detrimental |
| US7285269B2 (en) | 2002-12-02 | 2007-10-23 | Amgen Fremont, Inc. | Antibodies directed to tumor necrosis factor |
| ES2425749T3 (es) | 2004-03-31 | 2013-10-17 | The General Hospital Corporation | Método para determinar la respuesta del cáncer a tratamientos dirigidos al receptor del factor de crecimiento epidérmico |
| TW201705980A (zh) | 2004-04-09 | 2017-02-16 | 艾伯維生物技術有限責任公司 | 用於治療ＴＮＦα相關失調症之多重可變劑量療法 |
| NZ595225A (en) | 2005-05-16 | 2013-05-31 | Abbott Biotech Ltd | Use of tnf inhibitor for treatment of erosive polyarthritis |
| CN102887955A (zh) | 2006-04-05 | 2013-01-23 | 艾博特生物技术有限公司 | 抗体纯化 |
| US9605064B2 (en) | 2006-04-10 | 2017-03-28 | Abbvie Biotechnology Ltd | Methods and compositions for treatment of skin disorders |
| US9399061B2 (en) | 2006-04-10 | 2016-07-26 | Abbvie Biotechnology Ltd | Methods for determining efficacy of TNF-α inhibitors for treatment of rheumatoid arthritis |
| WO2008063213A2 (en) | 2006-04-10 | 2008-05-29 | Abbott Biotechnology Ltd. | Uses and compositions for treatment of psoriatic arthritis |
| CN101687009A (zh) | 2007-05-11 | 2010-03-31 | 宾夕法尼亚大学理事会 | 治疗皮肤溃疡的方法 |
| EP2977452A3 (en) | 2007-05-11 | 2016-05-25 | Thomas Jefferson University | Methods of treatment and prevention of neurodegenerative diseases and disorders |
| JP2010528647A (ja) * | 2007-06-06 | 2010-08-26 | ドマンティス リミテッド | ポリペプチド、抗体可変ドメインおよびアンタゴニスト |
| WO2008154543A2 (en) | 2007-06-11 | 2008-12-18 | Abbott Biotechnology Ltd. | Methods for treating juvenile idiopathic arthritis |
| EP2225276B1 (en) | 2007-12-31 | 2014-04-23 | Bayer Intellectual Property GmbH | Antibodies to tnf alpha |
| CA2711984A1 (en) | 2008-01-15 | 2009-07-23 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Powdered protein compositions and methods of making same |
| EP2228652A1 (en) | 2009-03-11 | 2010-09-15 | Medizinische Universität Wien | Improvement of tumour treatment |
| US9062106B2 (en) | 2011-04-27 | 2015-06-23 | Abbvie Inc. | Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins |
| EP3281640A1 (en) | 2011-06-17 | 2018-02-14 | President and Fellows of Harvard College | Frizzled 2 as a target for therapeutic antibodies in the treatment of cancer |
| US20140227293A1 (en) | 2011-06-30 | 2014-08-14 | Trustees Of Boston University | Method for controlling tumor growth, angiogenesis and metastasis using immunoglobulin containing and proline rich receptor-1 (igpr-1) |
| US9067990B2 (en) | 2013-03-14 | 2015-06-30 | Abbvie, Inc. | Protein purification using displacement chromatography |
| WO2013158273A1 (en) | 2012-04-20 | 2013-10-24 | Abbvie Inc. | Methods to modulate c-terminal lysine variant distribution |
| WO2013158279A1 (en) | 2012-04-20 | 2013-10-24 | Abbvie Inc. | Protein purification methods to reduce acidic species |
| WO2013176754A1 (en) | 2012-05-24 | 2013-11-28 | Abbvie Inc. | Novel purification of antibodies using hydrophobic interaction chromatography |
| HK1211981A1 (en) | 2012-09-02 | 2016-06-03 | Abbvie Inc. | Methods to control protein heterogeneity |
| US9512214B2 (en) | 2012-09-02 | 2016-12-06 | Abbvie, Inc. | Methods to control protein heterogeneity |
| HK1207960A1 (en) | 2013-03-12 | 2016-02-19 | Abbvie Inc. | Human antibodies that bind human tnf-alpha and methods of preparing the same |
| US9499614B2 (en) | 2013-03-14 | 2016-11-22 | Abbvie Inc. | Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosaccharides |
| WO2014159579A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-02 | Abbvie Inc. | MUTATED ANTI-TNFα ANTIBODIES AND METHODS OF THEIR USE |
| US9017687B1 (en) | 2013-10-18 | 2015-04-28 | Abbvie, Inc. | Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography |
| US9937231B2 (en) | 2013-03-27 | 2018-04-10 | The General Hospital Corporation | Methods and agents for treating Alzheimer's disease |
| US9598667B2 (en) | 2013-10-04 | 2017-03-21 | Abbvie Inc. | Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins |
| US9181337B2 (en) | 2013-10-18 | 2015-11-10 | Abbvie, Inc. | Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same |
| US9085618B2 (en) | 2013-10-18 | 2015-07-21 | Abbvie, Inc. | Low acidic species compositions and methods for producing and using the same |
| US8946395B1 (en) | 2013-10-18 | 2015-02-03 | Abbvie Inc. | Purification of proteins using hydrophobic interaction chromatography |
| US20150139988A1 (en) | 2013-11-15 | 2015-05-21 | Abbvie, Inc. | Glycoengineered binding protein compositions |
| EP3194581A4 (en) | 2014-09-15 | 2018-04-25 | Children's Medical Center Corporation | Methods and compositions to increase somatic cell nuclear transfer (scnt) efficiency by removing histone h3-lysine trimethylation |
| WO2022123293A1 (ko) | 2020-12-09 | 2022-06-16 | 에이치케이이노엔 주식회사 | 항 OX40L 항체, 항 OX40L 및 항 TNFα 이중 특이성 항체 및 이들의 용도 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60208924A (ja) * | 1984-04-02 | 1985-10-21 | Asahi Chem Ind Co Ltd | ヒト腫瘍壊死因子に対する抗体 |
| JPS6156197A (ja) * | 1984-05-31 | 1986-03-20 | ジエネンテク，インコ−ポレイテツド | リンホトキシンの細胞溶解活性を中和する抗体 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4843841B1 (ja) * | 1969-09-06 | 1973-12-21 | ||
| GB1541435A (en) * | 1975-02-04 | 1979-02-28 | Searle & Co | Immunological materials |
| JPS58501544A (ja) * | 1981-09-08 | 1983-09-16 | ザ ロツクフエラ− ユニヴア−シテイ | エンドトキシン誘発メディエ−タ−（ショック検定）によるリポプロティンリパ−ゼの抑圧 |
| US5700466A (en) * | 1981-09-08 | 1997-12-23 | The Rockefeller University | Method of ameliorating or preventing septic shock using a monoclonal antibody specific to cachectin/tumor necrosis factor |
| JPS58138383A (ja) † | 1982-02-13 | 1983-08-17 | Nippon Shinyaku Co Ltd | 生理活性物質の製法 |
| EP0117705A3 (en) * | 1983-02-24 | 1985-09-25 | The Regents Of The University Of California | Monoclonal antibody specific for monocytes and blast cells |
| US4879226A (en) * | 1984-04-06 | 1989-11-07 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Novel human physiologically active polypeptide |
| US5672347A (en) * | 1984-07-05 | 1997-09-30 | Genentech, Inc. | Tumor necrosis factor antagonists and their use |
| GR851626B (ja) * | 1984-07-05 | 1985-11-26 | Genentech Inc | |
| JPS61124392A (ja) * | 1984-11-22 | 1986-06-12 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 遺伝子組換体の産生する生理活性物質の精製法 |
| US4684623A (en) * | 1985-05-02 | 1987-08-04 | The Board Of Trustees Of The Cetus Corporation | Use of tumor necrosis factor as a weight regulator |
| DE69427928T3 (de) * | 1993-03-05 | 2012-05-10 | Bayer Healthcare Llc | Humane monoklonale anti-TNF alpha Antikörper |
-
1984
- 1984-12-20 IL IL73883A patent/IL73883A/xx not_active IP Right Cessation
-
1985
- 1985-12-13 DE DE200412000017 patent/DE122004000017I1/de active Pending
- 1985-12-13 DE DE3586536T patent/DE3586536T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-13 EP EP85115918A patent/EP0186833B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-13 DE DE19853586536 patent/DE122004000005I1/de active Pending
- 1985-12-13 DE DE198585115918T patent/DE186833T1/de active Pending
- 1985-12-13 DE DE200412000007 patent/DE122004000007I1/de active Pending
- 1985-12-18 AU AU51424/85A patent/AU601144B2/en not_active Expired
- 1985-12-18 CA CA000498017A patent/CA1337518C/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-19 JP JP60286811A patent/JPS61191620A/ja active Pending
- 1985-12-20 ZA ZA859757A patent/ZA859757B/xx unknown
-
1991
- 1991-11-13 US US07/794,365 patent/US6090923A/en not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-10-27 JP JP5269155A patent/JPH0787966A/ja active Pending
-
2004
- 2004-02-12 NL NL300142C patent/NL300142I2/nl unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60208924A (ja) * | 1984-04-02 | 1985-10-21 | Asahi Chem Ind Co Ltd | ヒト腫瘍壊死因子に対する抗体 |
| JPS6156197A (ja) * | 1984-05-31 | 1986-03-20 | ジエネンテク，インコ−ポレイテツド | リンホトキシンの細胞溶解活性を中和する抗体 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE122004000005I1 (de) | 2006-06-08 |
| AU5142485A (en) | 1986-06-26 |
| EP0186833B2 (en) | 2001-11-28 |
| NL300142I1 (nl) | 2004-04-01 |
| US6090923A (en) | 2000-07-18 |
| DE3586536T2 (de) | 1993-02-18 |
| IL73883A0 (en) | 1985-03-31 |
| CA1337518C (en) | 1995-11-07 |
| DE122004000007I1 (de) | 2004-07-01 |
| DE122004000017I1 (de) | 2005-06-16 |
| EP0186833B1 (en) | 1992-08-19 |
| AU601144B2 (en) | 1990-09-06 |
| EP0186833A2 (en) | 1986-07-09 |
| EP0186833A3 (en) | 1987-05-27 |
| DE3586536D1 (de) | 1992-09-24 |
| DE186833T1 (de) | 1986-12-18 |
| IL73883A (en) | 1990-12-23 |
| DE3586536T3 (de) | 2002-05-08 |
| JPS61191620A (ja) | 1986-08-26 |
| ZA859757B (en) | 1986-09-24 |
| NL300142I2 (nl) | 2005-08-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH0787966A (ja) | 細胞毒素及びその応用 | |
| US4002602A (en) | Ubiquitous immunopoietic polypeptide (UBIP) and methods | |
| FI77877C (fi) | Foerfarande foer framstaellning och rening av human le-formig interferonprotein. | |
| Yamamoto et al. | Antigenicity of mouse interferons: distinct antigenicity of the two L cell interferon species | |
| Bellini et al. | Immune reactivity of the purified hemagglutinin of measles virus | |
| EP0169234A1 (en) | IMMUNOTEST FOR BIOLOGICALLY EFFECTIVE HUMAN INTERFERON GAMMA. | |
| EP0124896B1 (de) | Verfahren zur Gewinnung von Viren bzw. Virusantigenen und deren Anwendung in Diagnose und Therapie (Impfstoff) | |
| US4167557A (en) | Ubiquitous immunopoietic polypeptide (UBIP) and methods | |
| Uzé et al. | Murine tumor cells expressing the gene for the human interferon αβ receptor elicit antibodies in syngeneic mice to the active form of the receptor | |
| Cooper et al. | Isolation of separate Fc receptors for IgG complexed to antigen and native IgG from a murine leukaemia | |
| Wesierska‐Gadek et al. | Autoantibodies against different histone hi subtypes in systemic lupus erythematosus sera | |
| Ekramoddoullah et al. | Partial characterization of an antigenic site of high molecular weight basic antigen, a ryegrass pollen allergen, using a monoclonal antibody | |
| Burton et al. | Progesterone-binding globulin from the serum of pregnant guinea pigs, a polydisperse glycoprotein | |
| JP2888443B2 (ja) | ヒト白血球インターフェロン亜種の抗体の製造法及び測定法 | |
| JP2519561B2 (ja) | 酸性糖タンパク質 | |
| Fujita et al. | Isolation and partial characterization of the major glycoproteins of horse and swine erythrocyte membranes | |
| US5071956A (en) | Protein with vascular activity derived from monocytes and its analogues, a process for its extraction and their uses for therapeutic purposes and for the preparation of antibodies | |
| Su et al. | Monoclonal antibodies to porcine tumor necrosis factor alpha: Development of an enzyme-linked immunosorbent assay | |
| Ishaq et al. | Purification and identification of antigenic polypeptides of Sm and RNP antigens of goat liver | |
| US6372219B1 (en) | Parasite-derived anti-inflammatory immunomodulatory protein | |
| Khabiri et al. | Leishmanin skin test in guinea pig with a single purified protein of Leishmania major | |
| JP2690956B2 (ja) | 生体由来のタンパク質 | |
| Dalton et al. | [70] Preparation and absorption of antiserum against human leukocyte interferon | |
| JPH022937A (ja) | 酵素標識抗体の分離精製方法 | |
| JPS6339900A (ja) | 精製ヒト脈管形成因子、その製造方法並びにそれを含有する医薬製剤 |