JPS60208924A - ヒト腫瘍壊死因子に対する抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト型腫瘍壊死因子に対して特異性があるモ
ノクロナル抗体に関スる。

従来、ある抗原に対する特異抗体の取得は、抗原で免疫
した動物から抗血清を得ることにより達成さＪＬ（きた
。しかし、この抗血清中の特異抗体ｉｆ、他の抗体群と
の混合状態にあり、−必要な特異抗体を他の抗体群から
分離することは非常に困難である。また、得られた特異
抗体も、）°４なる抗原決定＾１７　ＶＣ対して反応′
ノる性質の異なる特異抗体の混合物である。さらに、一
つの抗原決定基に対しても結合力の異なイ）種々の特異
抗体が産生されてくる。以上の理由から、従来の抗血清
からの特異抗体と抗原との反応は混合反応であり、用途
上種種の制限をうけてきた。

分子生物学の分野における研究は、現在では上記の詫問
題を解決しうる抗体の代替源を提供している。リンパ球
細胞と哺乳動物（例えばマウスやラット）に由来する骨
髄肺細胞との間の融合は、試験管内において増殖し、複
製可能な雑種細胞を産み出すことができるということ（
コーラ−とミルシュタイン、ネイチャー、２５６巻、４
９５〜４９７頁、１９７５年参照）が発見されている。

このような雑種細胞は、予め決った喘異性のある抗体を
分泌するという特質を有する。この％異性というのは、
融合に関与したリンパ球によって産生された抗体の持つ
特異性である。雑種細胞は、クロ／化し、また安定な培
養条件下で培養を続けることにより、ある抗原決定Ｊｉ
ｉＫ対しでのみ特異性をもった抗体を自む試料を無限に
産生じ続ける。このようにして産生された抗体は、当該
技術分野においてモノクロナル抗体として知られている
。

上述した雑種細胞を造り出す一般的方法としては、哺乳
動物（通常にはマウスかラットであるが、必ずしもこの
２者には限らない）に抗原を投与、免疫し、抗原に対し
抗体を分泌する白血球細胞を多く産生させるのに充分な
抗原投与回数と免疫時間の経過ののち、動物を殺し、肺
臓細胞の懸濁液を調製する。これらの細胞と骨髄腫細胞
との融合は、融合促進剤（例えば、ポリエチレングリコ
ール）の存在下で両者を接触させることによって達成さ
れる。極〈僅かの細胞だけが融合して雑種細胞ができる
。免疫反応の結果として、異なる抗原決定基に対し、て
、それぞれ抗体を分泌している複数の異なるす７７球が
でき、これらの形質は雑種細胞へ遺伝的に伝達されてゆ
く。慎重なスクリーニングを行うことによって、培養雑
種細胞群の中から所望の特異性を持った抗体を分泌する
細胞を分離することができる。このような細胞はクロン
化して培養しうる。

この技術の利点は、免疫させる抗原又は免疫物質に含ま
れる抗原性のある不純物中の、他の抗原決定基に対応す
る抗体を含まない、特異性のある抗体源を提供すること
にある。

本発明は、ヒト型腫瘍壊死因子（以下ヒ）ＴＮＦという
）に対するモノクロナル抗体に関する。ヒ）　ＴＮＦは
網内系賦活化作用を有する種々の物質、例えば各種ダラ
ム陽性菌や工／トドキシンによって、マクロファージ系
細胞群より誘導されることが知られている。

網内系賦活化作用を有する種々の物質によシ誘導され、
抗腫瘍細胞能力などの生理活性を有する物質の存在は多
数報告されている。例えばＣａｒｓｗｅｌｌらは、ＣＤ
−Ｉ　５ｗ１ｓｓ　？ウスにＢａｃｉｌｌｕｓ　Ｃａｌ
ｍｅｔｔｅ　Ｇｕｅｒｉｎ　（Ｂ　ＣＧ　）を投与し、
その２週間後に工／トドキシンを静脈内注射して得られ
る該マウスの血清が、培養した細胞に対して殺細胞作用
を有すること、およびＭｅｔｈ　Ａ　ｓａｒｃｏｍａで
担癌させた（ＢＡＬＢ／Ｃｘ　５．７　ＢＬ／６　）　
Ｆｌマウスの腫瘍を出血性壊死に至らしめる現象を見出
し、ＴＭＦと名づけた（　Ｐｒｏｃ　、Ｎａｔ、　Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ　７２巻（Ａ９）、３６６
６頁、（１９７５年）〕。その後、１ｅｅｄら［Ｊ−Ｉ
ｎｉｍｕｎｏｌ、１２５巻（／１６４　）、１６７１負
、（１９８０年）〕アよびＭａ　ｔ　ｔ　ｅｗｓら［Ｂ
ｒ、Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　４２巻、４１６負、（１９８
０年）〕は、前記Ｃａｒｓｗｅｌｌ　らの方法に準じて
調製したウザギ血漬からＴＮＦの精製を試みｔ、それぞ
れＪｊｆｉ、抽清に比べて約２０１３０倍および約１０
００倍ａ７製されたものを得ている。しかし、いずれの
場合にも精製されたものに関し７では動物実験において
抗腫瘍効果を確認していない。

またＲｕｆｆらしＪ−Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１１５巻
、３９５頁、（１９７５年）〕ハ、ヒト末梢血単球およ
び骨髄性半球性白血病想者由来の白血病細胞より、’１
’　Ｎ　Ｆ様の活性を有する因子を見出したとの報告を
しでいるが、動物実験における抗腫瘍効果すら確認され
ていないなど、その本体については明確ではない。

本発明者らは、ヒト由来の活性化マクロファージを含む
組絨培養系に防発される、制癌作用を有する蛋白性の生
理活性物質について鋭意研究を続けていたが、分子量約
４．０万、等電点約６．０の優れた抗腫瘍活性を有する
新しい蛋白性生理活性物質を見出し、発明を完成するに
至り、すでに出願を行っている。

この抗腫瘍活性を有する生理活性物質、すなわち、ヒ）
ＴＮＩＩＩきわめて微振で強い生理活性を有するために
、大きな注目をあつめ、その分離精製および定量分析の
手段として、特異抗体の獲得が望まれていたが、ＴＮＦ
は種％異性が少ないために抗原性が低く、精製度の低い
１゛ＮＦを抗原として用いた場合には、特異的な反応性
を有するモノクロナル抗体を得ることはできなかった。

本発明者らは、ヒトのＴＮＦに対して特異的な抗体を得
るために種々の検討を行なった結果、精製したヒト型Ｔ
ＮＦを抗原としてマウスを免疫することにより、抗体産
生細胞を得、該細胞と骨髄腫細胞との雑種細胞により、
はじめて、ヒトのＴＮＦに対して特異性を有するモノク
ロナル抗体を安定に製造できることを見出して、本発明
を完成した。

すなわち、本発明はヒト型腫瘍壊死因子に対して特異性
を有するモノクロナル抗体に関するものである。本発明
にかかるモノクロナル抗体はＴＮＦの分離精製やイムノ
アッセイなどに使用できる。

以下、細胞融合方法について具体的に説明を加える。

（ａ）　抗体産生細胞の調製 抗体産生細胞の調製は常法に準じ０行えはよい。すなわ
ち、抗原である、ヒ）ＴＮＦで動物を免疫し、その動物
の抗体産生細胞を取得する方法ｅこよノ１ばよい。

動物としては、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、
ヒツジ、ウマ、ウシなどが例示され、抗体産細胞として
は肝細胞、す／ノ（節細胞、末梢血細胞などが使用され
る。

（ｂ）　骨髄腫細胞の調整 細胞融合方法において使用される骨髄腫細胞には特に限
定ｅまなく、多くのマウス、ラット、ウサギ、ヒトなど
の動物の細胞株が適用できる。

使用する細胞株は好ましくは薬剤抵抗性のものであって
、未融合の骨髄腫細胞が選択培地で生存できず、雑種細
胞のみが増殖するようにすべきである。最も普通に用い
られるものは、８−アザグアニン抵抗性の細胞株で、こ
れはヒボキサンチンログアニン・ホスホリボシル・トラ
ンスフェラーゼを欠損し、ヒボキサンチン−アミノプテ
リンーテミジｙ（ＨＡＴ）培地中では生育できない性質
を有する。また、使用する細胞株はいわゆる「非分泌型
」のものであることが好ましい。たとえば、マウス骨髄
胤株ＭＯＰＣ−２１由来のＰ３／Ｘ６３　Ａｇ８Ｕｌ　
（Ｐ３Ｕ１）、Ｐ３　／Ｘ　６３−Ａｇ・６・５・３、
Ｐ３／Ｎ８１−Ｎ３ｌ−１−Ａ、Ｓｐ　２１０−Ａｇ　
１４、ラット骨髄腫細胞２１０−ＲＣＹ３−Ａｇ１−２
−３などが好適に用いることができる。

（Ｃ）　細胞融合 通常イーグル最少基本培地（ＭＥＭ）、ロズウエル・バ
ーク・メモリアル・イ／ステイチュ一ト（Ｉｔｌ）Ｍｔ
　）　１６４０培地などの培地中で１〜５　Ｘ　１　（
Ｊ７個の骨髄腫細胞と抗体産生細胞１〜５　Ｘ　１０８
個を混合（混合比は通常１：４〜１：１０）、細胞融合
が行われる。融合促進剤としては、平均分子量が１，０
００〜６，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
が好ましいが、他にウィルスなども使用できる。ＰＥＧ
の使用濃度は通常３０〜５０％である。

（ｄ）　雑種細胞の選択的増殖 細胞融合を終えた細胞に、２０％ウシ胎児血清自有ＲＰ
Ｍ１１６４０培地などで適当に希釈し、マイクロタイタ
ーフレートに１０５〜１０６程度に植えつける。各ウェ
ルに選択培地（たとえばＩＩ　Ａ　ｉ’培地）を加え、
以後適当に選択培地の交換を行ない、培養する。骨髄腫
細胞として８−アザグアニン抵抗性株を用いれば、未融
合σ）骨髄腫細胞はＩＩ　Ａ　Ｔ培地中では１０日Ｉｃ
らいまでに全部死滅し、また抗体産生細胞は正常細胞な
のでインビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　）では長時間化ず
ｊで外ない。したがって、培養１０〜１４日ぐらいから
生育してくるものはすべて雑種細胞である。

（ｅ）　抗体産生雑種細胞の検索 雑種細胞のスクリーニングは常法によればよく、特に限
定はない。たとえば、雑種細胞の増殖したウェルの上清
の一部を採取し、ヒ）ＴＮＦ又は固定化ヒ）ＴＮＦと反
応させたのち、酵素、ラジオアイソトープ、螢光物質、
発光物質で標識した第２抗体との反応によって、標識量
を測定し、抗ヒトＴＮＦ抗体の存在を検定することがで
へる。

（ｆ）　クロー二／グ 各ウェル中にＶ′ｉ２種以上の雑種細胞が生育している
８Ｊ能性があるので、限界希釈法などによす、クロー二
／グを行ない、モノクロナル抗体産生雑種細胞を取得す
る。

（ｇ）　抗体取得 最も純粋なモノクロナル抗体は、所望の雑種細胞を１０
％程度のウシ胎児血清を含むＲＰＭ１１６４０培地など
の適当な培養液で培養し、その培養上清液から得ること
ができる。

一方、さらに大量の抗体を取得するためには、骨髄肺細
胞の由来動物と同系の動物にブリスタ／（２Ｈ６ｒ　ｔ
　ｏ　ｌ　１４−テトラメチルペンタデカン）などの鉱
物油を復腔内投与し、その後雑種細胞を投与することに
より、インビボ（堕ｖｉｖｏ　）で雑種細胞を大量に増
殖させればよい。

この場合、ｌＯ〜１８日位で腹水腫瘍を形成し、血清お
よび腹水中に高濃度の抗体が生ずる。

ここで、本発明にいう抗原ヒ）ＴＮＦとは、下記に示す
アミノ酸組成を有する。

アミノ酸　含有ｉｌｌ＜モ／Ｌ％） アスパラギ／＋アスパラギ／酸　７．８トレオニン　３
．６ セリン　８，２ グルタミ／＋グルタミン酸　１２．９ グリシン　７．１ アラ二ノ８．５ バリン　７，８ シスチン　１．４ トリプトフアン　１．４ イソロイシン　５．０ ロイシフ　１１．４ チロシ／４．６ フェニルアラニン　２．７ リジン　３．９ ヒスチジン　２．０ アルギニ１５．３ プロリ／６．５ ポリペプチドのサブユニットからなる構造を有し、かつ
、下記特性を有する蛋白質である。

ａ）分子量　４０，０００±４，０００（ゲル濾過法） ２０．０００±４，０００（ＳＤＳ −ポリアクリルアミド電気泳動 法） ｂ）等電点　６．０±０．５（等電点電気泳動法）Ｃ）
本文定義のＬ−Ｍ細胞を用いる評価における比活性がＩ
　Ｘ　１０’単位／ｍ９蛋白質更に、本発明の物質は、
実験例４に記載のＭｅｔｌ＋　Ａ　ｓａｒｃｏｍａ担癌
１３　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　Ｃ系マウスを用いる生物計画に
おいて、１匹肖り１００〜２００単位を腫瘍内に投与し
た場合の活性が（＋）以上である。

本発明における抗原ヒトＴＮＦは、ヒト由来活性化マク
ロファージより誘導される。ヒ］・由来活性化マクロフ
ァージとは肺臓または肺組織マクロファージなどの組織
マクロファージ、分化誘導能を有する物質共存下で培養
した末梢血単球もしくは−ある種の骨髄性単球性白血病
患者の白血病細胞から樹立された株細胞などを用いるこ
とができる。株細胞としてはＨＬ−６０細胞ＣＮａｔｕ
ｒｅ　２７０巻、３４７頁（１９７７年）〕Ｔ　１１　
Ｐ　−１細胞（Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ２６巻、
１７１貞（１９８０年ン〕などがあけられる。分化誘導
能をイＪする物質としては１２−０−テトラゾカッ１ル
ホルボールー１３−アセテート、ホルボール−１２，１
３−ジデカノエート、ホルボール−１２，１３−ジベン
ゾエートなどのホルボールニスデル類、メゼレインなど
のジテルペン類、テレオシジ／、ビタミンＡ酸、ビタミ
ンＡアルコールなどのビタミンＡ誘導体、ジメチルスル
ホキシド、ペプト／またはカゼイ／加水分解物などが好
適に用いられる。

本発明における活性化マクロファージはグラム陰性菌由
来の工／トドキシ／もしくはダラム陽性菌または酵母の
菌体壁を共存下に培養することによりヒトＴＮＦをより
多量に産生ずる。

本発明における抗原を得るためのヒ）ＴＮＦの好ましい
精製法の骨子は、活性化マクロファージの培養液を次の
工程にＨすことである。

（ｉ）　電気泳動的等電点分画法 （２）塩基性陰イオン交換体クロマトグラフィ（３）　
ゲル濾過 （４）　アフイニテイクロマトグラフイー（５）　ゲル
濾過 抗原−物質として精製したヒ）ＴＮＦの物性は、以下に
記載する実験方法１〜８の各方法によって測定したもの
である。

実験方法 １）分子量測定法 Ａ）　七７アクリルＳ−２００（ファルマシア社製、ス
エーテン）のカラム（１，５Ｘ　１００ｃｍ）を用い、
０．１Ｍ塩化ナトリウム／　５０　ｍ　Ｍリン酸紗衝液
（ｐＨ７，４）にでケル濾過を行ったところ、分子ｆｉ
ｔは４０，０００±４．０００であった。

Ｂ）　Ｓｅｇｒｅｓｔらの方法ＣＭｅｔｈｏｄ　ｉｎ　
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ２８−Ｂ巻、５４頁（１９７２年
）〕に従い、トリス／クリシン／８１）Ｓ（ｐｉ（８，
３）でＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲルに１０μｇＯ）
試料を付与し、電気泳動を行ったところ、分子ｉ　２０
，０００士４，０００の位置に、染色バンドと活性を示
した。

２）等重点測定法 アト−株式会社製の等電点電気泳動装置（８，１−１（
１７ｌ　Ｅ　Ｃ型）を用い、ファルマライト（ファルマ
シア社製、−（４〜６．５）とグリセロールを含む５％
ポリアクリルアミド平板ゲル（厚みｌ　ｍｍ、長さ１０
ｃｍ、中１０ｃｍ）を作成した。

陽極側に０．０４Ｍ、ＤＬ−グルタミン酸、陰極側に０
．２Ｍ、Ｌ−ヒスチジンを使用して、７００■で５０分
間の曲泳動を行った。続いて試料５０μｇを付与し、７
００ｖで１時間、５００ｖで１６時間泳動を行った。泳
動終了後ゲルを２．５朋巾で切出し、次いで各ゲル片を
０．１５　Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２　Ｍ　）リ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，２）０．２　ｍｌで抽出し、
各抽出液についてＬ−Ｍ細胞を用いた活性評価を行った
ところ、ヒトＴＮＦの等電点ｉ１ｔ　６．０±０．５で
あった。

３）Ｌ−Ｍ細胞を用いる活性評価 Ｌ−Ｍ細胞を用いる活性評価は、Ｒｕｆｆ［Ｌｙｍｐｈ
ｏｋｉｎｅ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　２巻、Ｅ　−Ｐ　ｉ　ｃ
　ｋ編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　２３５頁（
１９８０年）〕あるいは（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１
２６巻、２３５頁（１９８１年）〕の方法に準じ、本発
明名らが改良したものであり、本発明による生理活性物
質がＬ−Ｍ細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション、ＣＣＬｌ、２）を殺す効果を測定するもの
である。すなわち、順次培地で希釈したＫ　ｊｔ！ｌＯ
，ｉ　ｍｔと１０５＋／ｍの０度のＬ−Ｍ細胞の培地懸
濁液０．１厩を９６穴の組織培養用マイクロスレート（
フロー・ラボラトリ−社）に加えた。培地はＩＶ／Ｖ％
のウシ胎児血清を含ムイーグルのミニマム・エツセ／シ
ャル培地（その組成は、たとえは、「組織培養」中井準
之助他ＭＡ犯、朝食書店、１９６７都に記載されている
）を用いた。マイクロプレートを５％の炭酸カスを含む
突気中、３７°Ｃで４８時間培養し／こ。培養糸冬了後
、クルタルアルデヒドを加え細胞ｋｌｔｉｆｆｌした。

固定波、マイクロプレートを洗浄、乾燥して、０．　（
１　５　％メチレンブルー溶液をＱ．　１　ｍＡ加え、
生き残った細胞を染色し７た。余分なメチレンフルーを
洗い流し乾燥した後、残ったメチジ／ブルーを０．３６
Ｎ塩酸溶液で抽出し、その６　６　５　ｎｍにおける吸
光度をタイターチック・マルチスキャン（フロー・ラボ
ラトリ−社）で測定した。この吸光度は、生き残った細
胞数に比例する。Ｌ−Ｍ細胞の５０％を殺すために必要
な生理活性蓋を１単位／　ｍＡと定。

義し、試料を加えない対照の吸光度の５０％の値に相当
する試料の希釈率を、グラフあるいは計算によってめ、
その希釈率の逆数を試料の生理活性量（単位／　ｍｌで
表記する）とした。

一方、蛋白質量は、Ｂｒａｎｆｏｒｄらの方法（Ａｎａ
ｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ．　７　２巻、２４８頁（１９７６年）
〕により、クーマシー・プリリア／ト・ブルー０２５０
を用いる色素結合法から算出した。

本発明における抗原ヒ）　’Ｉ’　Ｎ　ＦＯ比活性Ｈ、
Ｉ　Ｘ　１　０６単位／〜蛋白質であった。

４）　Ｍｅｔｈ　Ａ　ｓａｒｃｏｍａ担陥マウスを用い
る活性評価 ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹部皮肉に２×１０５コのＭｅｔ
ｈ　Ａ　ｓａｒｃｏｍａ細胞を移植し、７日後移殖した
腫瘍の大きさが直径７〜８朋となり、出血性壊死がなく
良好な血行状態にある腫瘍を有するマウスを選び、触瘍
内に生理食塩水で希釈した。、ｏｓｍＪの試料を注射し
、２４時間後に次の判定基準に則シ壊死反応の判定を行
った。

（−）：変化なし （＋）：かすかな出血性壊死 （−１＋）　：中等度の出血性壊死 （移植癌表面の真中から５０％以上に わたって壊死） （＋１４）　：顕著な出血性壊死 （移植癌の中央部が重度に壊死し、周 囲の癌組織がわずかに残った状態） また、試料投寿後２０日目に癌が完全に退縮したかどう
かを観察し完治率をめた。

以上の方法により測定したヒトＴＮＦの活性を下表に示
す。

（以下余白） １００　６　２１３０　２／６ ２００　６　０１２３　３／６ １．０００　６　０　０　１　５　６／６対照（生理食
塩水）６　６０００　０／６※完治率：完全に癌が退縮
したマウス数／実験マウス数 ５）アミノ酸組成決定 本発明におけるヒ）ＴＮＦを用いて次の検討を行なった
。

試料調製用の厚み１ｎ、長ざ１１ｃｒＩＬ、中１５傭の
ボリア、クリルアミド１５％を含む５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミド平板ゲルを作成した。作成法の詳細は、アト−
株式会社「スラブ型５ＤＳ−アクリルアミドゲル電気泳
動」のパンフレットによった。装置はアト−株式会社＄
１！５Ｊ−１０６０・ＳＤＨ型を用いた。

該平板ゲル１板当シ、本発明におりるヒトＴＮＦを４０
０μｇ付与した。付与に際して前処理として、１％ＳＤ
Ｓ水溶液１００μノと４０％蔗糖水溶 該平板ゲル１枚当シ、ヒトＴＮＦを２００μｇ付与した
。セｊ与に際して前処理として、１％ＳＤＳ水溶液１０
０μｌと４０％蔗糖水溶液５０μｌに２００μｇのヒト
Ｔ　Ｎ　Ｆを含む５００μノの水溶液を混合し、５０°
０３０分の熱処理を行なりた。′電気泳動ｒＪｌ　５０
　Ｖ定電圧で、４時間３０分を賛した。この操作を５回
くりかえして行った。泳動後、一部をクーマシー・ブリ
リアント・ブルー０２５０で５分間染色を行ない、脱色
後明瞭に見える染色バンドを中心に２．５ｎ間隔で５本
に切出しを行なった。次いで１％の重炭酸アンモニウム
１．５　ｒｎｌＯ中に該ゲル片を浸漬して、４°０２４
時間抽出を行なった。抽出後、ピペットにて抽出液を取
り出し、同液で洗浄を行なって、各２．５　ｍｌすりの
抽出液を５スライス分、取得した。得られた抽出液は、
確認のためＬ−Ｍ細胞を用いる活性評価を行なった。中
心のバンドの部分に活性の多くが回収された。

該抽出試料溶液をセファデックスＧ２５のカラム（０，
９Ｘ１０ａａ）に付し、脱塩を行なった。

次いでトミー精工社製、遠心真空乾燥機コ／セントレー
タ−（ＥＣ−１０）を用いて、２５℃、２時間１．５０
０　ｒｐｍで乾燥を行ない、アミノ酸組成用分析試料と
した。

試料を真空中にて、４Ｍメタ／スルホン酸で１１０℃、
２４時間加水分解を行ない、高速アミノ酸分析計（日立
、８３５型）を用いてアミノ酸組成（モル％）を測定し
た。

なお、システィンは加水分解後、空気酸化してシスチ／
に変換した。

ヒ）ＴＮＦのアミノ酸組成Ｕ以下に示すととくの値であ
った。

アミノ酸　含有率（モ／Ｌ％） アスパラギ／＋アスパラギｙ酸７．８ トレオニン　３．６ セリン　８．２ グルタミン＋グルタミ／酸　１２．９ グリシ／７．１ アラニア８．５ バリン　７．８ シスチ／１．４ トリプトファン　１．４ イソロイシン　５．０ ロイシン　１１．４ チロシ／４．６ フェニルアラニン　２．７ リジン　３．９ ヒスチジン　２．０ アルギニン　５．３ プ　ロ　リ　／　６．５ 以上説明したように、本発明におりるヒトＴＮＦは極め
て優れた抗朧瘍効果を有し、その作用は種特異性が少な
く、しかも広範囲な効果を持ち、加えて毒性がほとんど
認められないことから、極めて有用な抗腫瘍剤として期
待できるものである。

上述のヒ）ＴＮＦｔ：を種特異性が少ないため罠、抗原
性に乏しく、抗体を得ることが困難であったが、不純物
をできるだけ除去し、高度に精製したヒトＴＮＦを用い
ることによって、はじめてヒトＴＮＦに対するモノクロ
ナル抗体を作成することが可能となった。

本発明によれば、ヒト型腫瘍壊死因子（ヒトＴ　Ｎ　Ｆ
　）　ｖｃ対して特異性があることを特徴とするモノク
ロナル抗体が雑種細胞系によって提供される。

本発明を下記の実験結果によって説明するが、これらは
例示であって、本発明がこれらに限定されるものではな
いことは当然である。

実施例 抗原の精製 ＴＨＰ−１細胞を１．５Ｘ１０’個／１の濃度にて、５
％牛脂児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地に分散させた
のち、径１０ｃｍのプンスチツク・シャ」しに２０ａＪ
ずつ分注した。３７℃に加温した該細胞溶液に、１２−
０−テトラデカノイルホルボール−１３−ジアセテート
およびビタミンＡ酸をそｉＬそれ最終濃度１μｇ／−お
よび０．５μｇ／ｖｔｄとなるように添加し、５％炭酸
ガス培養器中にて、３７℃、１時間培養した。

１時間後、シャーレ中の培養液を除去し、０゜５μｇ　
／ＷＬｌヒタミ／Ａ酸、１０　ｇｑ／１ｎｌポリペプト
ンを含有する５％牛脂児血清−ＲＰ　Ｍ　ｌ−１６４０
培地２０威で置換え、あらに２４時間３７℃にて培養を
行った後、培地を除去し、２０１１１のＲＰＭＩ−１６
４０培地２０１１ｔｌに置換し、７２時間さらに培養を
継続した。

その後、培養液を集め、３０　Ｕ　Ｕ　ｒｐｍにて３０
分間、遠心処理を行って、細胞沈渣を除去したのち、Ｌ
−Ｍ細胞に対する細胞障害性を検討し、１８０単位／Ｉ
Ｌｌの活性を有する培養液を得た。

つぎに培養液４ノの精製実験例を例示する。

精製工程ｌ（等電点電気泳動） 該培養液４１を、限外濾過法にて１０倍に濃縮したのち
、Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ■〔キャリヤー・ア／フオライツ
（Ｃａｒｒｉｅｒ　°ａｍｐｈｏｌｙｔｅｓ　）　〕（
Ｌ　ＫＢ社製、スウエーデ／）−蔗糖密度勾配カラム（
４４０ＷＬｌ）に添加したのち、約４２時間通電し、泳
動を行ったのち、カラムの下端より細いチューブでシー
／を乱さないように約２１Ｌｌ／分の　。

流速で分画した。

ｐＨ５，５〜６．５の分画を採取したのち、ＰＨを約７
．４ＩＣ調整したのち、透析にて、Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ
■および蔗糖を除去した。

精製工程２（陰イオン交換クロマトグラフィー） 該分画液０．５１に２１の０．０２　Ｍ　）リス−塩酸
緩衝液（ｐＨ７，８）を加えた後、０．０２Ｍ塩化ナト
リウムを含む０．０２Ｍ１−リス−塩酸緩衝液（ＦＪ（
７，８）で充分に平衡化した塩基性陰イオ／交換体ＤＥ
ＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社製）の
カラム（１０Ｘ９０ｆｆｉ）に徐々に付した。次いで１
．５７のカラム平衡化緩衝液（０，０２Ｍ塩化ナトリウ
ムを含む０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液、…７．８）で
洗浄した後、０、０５　Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０
２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）ＩＡ！で洗浄後
、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２　Ｍ　トリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７，２）を用いて溶出を行なった。

流速は０．５　ｌ／　ｂｒとし、溶出液は５ＯＷＬｌず
つ分画して活性画分を集めた。該活性画分に同容量の０
．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）を加えて希
釈した後、０．２１／ｈｒの流速でＤＥＡＥ−セフブロ
ースＣＩ、−６Ｂのカラム（１０Ｘ１３ｃｘ）に付した
。

次いで０．０５　Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍト
リス−塩酸緩衝液（，１１７，８）　２　ｌを用いて、
流速２０　ｍｌ　／　ｌ＋ｒで洗浄を行なった後、０．
１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２　Ｍ　）リス−塩酸
緩衝液（ＰＩ３７．２　）　１　／を用いて、流速２０
ｍ／Ｖ／ｈｒで溶出を行なった。溶出液は２５ｍ１ずつ
分画して活性画分を集めた。この段階で活性の回収率は
６０％、精製度は３００倍であった。

精製工程３（ゲル濾過） １３、１　Ｍ塩化ツートリウムを含む０．００５Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，４）で充分に平衡化したセフアクリ
ルＳ−２００（ファルマシア社製）のカラム（５Ｘ８０
ｃＩｎ、）に該濃縮液を付し、同緩衝液にてゲル濾過溶
出を行った。流速Ｖｉ４　ｍｌ　／　ｈｒで、４　ｒｎ
ｌずつ分画して活性画分を採取し、活性画分を限外濾過
によシ濃縮した。精製工程１〜３を通しての活性回収率
は４５％、精製度は４　Ｘ　１０３倍であった。

精製工程４（アフイニテイクロマトグラフイー） ゲル濾過によって得られた活性画分の濃縮液をＺｎ２＋
キレートセフアロースカラムに付した。

キレートセファロース（イミノジ酢酸固定化樹脂）を充
填したカラム（ｔ、６ｘｌｏｃ１ｎ）に、１■／ｄの塩
化亜鉛水溶液６０ｒｎｌを流速１０ｍ１／ｈｒで流した
。次いで０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，４）で充分に平衡化した後、前工程
で得られた濃縮液を流速１０ｍ／ｈｒで付し、史に６０
ｄの同緩衝液で溶出した非吸着画分を採取した。Ｌ−Ｍ
細胞に対する障害的１／ロアｊこり）　１ｉｌｎ分にの
み回収された。

精製工程１〜４を通（７ての活ｔ←回収率に１３０％、
ネル裂度目Ｉ　Ｘ　１０’倍であった。

精製上程５（ゲル濾過） ＡｉＪ精製上程で侍し）わだ活性画分全濃縮し、０．１
５Ｍ塩化ナトリウムを含むｏ、ｕｏ５Ｍリン酸緩衝液（
ｐ）４７．４）で充分に平衡化したトヨパールｌ］Ｗ−
５５（東洋ソーダ株式会社）のカラム（１，５Ｘ９０ｃ
ｒｎ）に旬した。同緩衝液にて流速４ｍε／！１ｒでゲ
ル濾過溶出を行ない、活性画分をｌ：Ｊ’取した０全精
製工程を通し７ての油性の回収率は２０％、精製度ｆ−
ｉ２×１０４倍であった。このようにして得られたヒ１
−ＴＮＦの比活性は８Ｘ　］　（１５１１ｉもン／　ｍ
ｙ蛋白賀であった。

上述の（とくオａ製したヒトｒ　Ｎ　Ｆ　ｆ：ｉセルロ
ーフ了セテー　ト膜′屯気諏動にてγ−クロプリン領域
に体動さｉｌだ。葦たヒ）　’ｆ　Ｎ　Ｉ”は各種レク
チン同定化ｆｌ（１ｉａｒ　（Ｃｏｎ　Ａ−セファロー
ス、ＷＧＡ−セファロース（以上　ファルマシア社製）
、ＲＣＡ　−Ｉ−ゲル、Ｕ　Ｅ　Ａ　−１−ゲル、ＬＰ
Ａ−■−ゲル（以上　Ｅ、　Ｙ、ラボラトリ−社製））
に対して吸着性を示さなかった。

さらに、このようにして得られたヒトＴＮＴ−１各ａｔ
同系移植マウス癌およびヌードマウス移植ヒト癌に対し
て腫瘍内および静脈内投与においで優れた制癌効果を示
した。すなわち、マウス由来の結腸癌Ｃｏ１ｏｎ　２６
を移植したＢＡＬＢ／Ｃ系マウスあるいは神経弁ｋＮｅ
ｕｒｏ　２　ａを移植したＡ糸マウスに、ヒ）ＴＮＦ５
，０００〜ｔｏ、ｏｕｏ単位を１回ないし３回静脈内投
与した試験において、灼照群（生理食塩水没−ＩＥｊｒ
Ｒ）に比して有意な癌の増殖抑制と退縮が認められた。

また、ヒト由来の肺癌ＰＣ−１０、神鮭芽腫Ｇ　ＯＴ　
Ｏを移植したＢＡＬＢ／Ｃ系ヌードマウスに、ヒトＴ　
Ｎ　Ｆ　１０．０　（１０〜３（Ｊ、０００単位を１回
ないし７回静脈内投与した試験において、対照群（生理
食塩水投与！１１′）に比して有意な癌の増殖抑制と退
縮が認められた。

動物の免疫 上述のごとく精製したヒ）ＴＮＦ　１００μｇを、フロ
イント・コンプリート・アジュバントに乳濁化させ、マ
ウス１３ＡＬＩ３／Ｃ♂群の皮下に２週間の間隔をあ６
７１で投与し、免疫を行なっＣ０ これらのマウス中で、最も高い血清抗ヒトＴＮＦ抗体価
をもつたマウスにヒトｉ”ＮＦ１００μｇを静脈内注射
し、免疫を完了した。

細胞融合 最終免疫の３Ｈ後に、マウスを殺し、肺臓を取シ出し、
細断したのちステンレスメツシュにて濾過することによ
って得た絆細胞をイーグルのミニマルエツセ／シャル培
地（ＭＥＭ）で３回洗浄し、マウス骨髄腫細胞（Ｐ３／
Ｘ６３−Ａｇ　８　Ｕ　１　）　をＭＥＭで１回洗い、
肝細胞と骨髄膝組１ｊｉ！とを１０＝１で混合して遠心
後、ベレットに４４％ポリエチレングリコール２０００
゜Ｍ　Ｅ　Ｍ溶液１Ｍを徐々に加え、１分間遠心管をゆ
っくり回転させ工細胞融合を行った。１分後Ｍ　Ｅ　Ｍ
　ｌ　ｍεを加えてゆっくり回転させ、さらに３０秒ご
とにＭＥＭを１１１Ｌｌづつ加えて最終的に８１１Ｌｌ
とした。再ひ遠心し、ペレットを２υ％ウシ胎児血清含
有ロズウエル・パーク・メモリアル・インステイチュー
ト（ＲＰＭＩ）１６４０培地に骨髄腫細胞として５　Ｘ
　１０’個／　０．１　ｍｌになるように懸濁し、９６
ウエルマイクロプレートに０．１　ｄっり植えクリた。

１日後、ＩＩ　Ａ　Ｔ培地を各ウェルに０．１１Ｍづつ
添加し、その後３〜４日ごとに半分量をＨＡ　Ｔ培地で
交換したところ、７１目ぐらいからいくりかのウェルで
雑種細胞の生育が認められ、２〜３週間後Ｖｒ：、ｔＩ
′ｉはは全ウェルで雑種細胞が増殖した。

抗体産生細胞の検索とクロー二／グ 雑種細胞の生育してきたウェルの培養上清０、１　ｍｌ
をとり、ポリスチレン製の９６穴マイクロプレート上に
固定したヒトＴＮＦとインキュベーションし、これと結
合するものを探したところ、５〜１０％の確率でヒ）Ｔ
ＮＦに対して結合能をもつ抗体を分泌しているウェルを
認めることができた。結合能の高いものをいくつが選ひ
、９６ウエルマイクロプレートに１個／ウェルの濃度て
細胞を植えつける限界希釈法によリフロー二／グを行な
い、８個のクローンが得られた。

クロー二／グした細胞を１０％ウシ胎児血清含廟ＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地を用いて９６ウエルプレート→２４ウ
エルプレート→２５−フラスコとスケールアンプして培
養し、培養上清を集めた。

各上清を、１，０００単位／縦のヒトｉ’　Ｎ　Ｆ溶液
と混合したのち、Ｌ−Ｍ細胞を用いる活性評価を行なっ
たところ、１クローンのみがヒトＴＮＦの活性を阻害し
た。この雑種細胞はＰ３ＴＴと名づけた。この細胞は液
体窒素温度にで保存可能でありで、本発明者に常に保存
し、ているが、さらＶ（、ＪＩｉｌ、　Ｂ省工業技術院
微生物工業技術研究’７す１１１’Ｃ寮’ＩＬ”　Ａ−
、め寄託依頼引を郵送した（書留郵イ＾１１．　ｉ暴１
．　リｊＪ％　ｂ　：４　ｆｉ　Ｕ　号　）次に、２Ｍ
１０６個以上の却ｊ胞を、グリスタン０、５　ｍｌで予
め処理したマウスＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　Ｃ腹腔内に投与
し、腹水腫瘍をつくらせて腹水を採取し７だ。この腹水
は１万倍希釈においても１００単位のヒ）ＴＮＦのＬ−
Ｍ細胞に対する細胞障害活性を完全に抑制した。

またＰ３ＴＴ由来の抗体は、ヒトの肺マクロファージか
ら得られる抗腫瘍活性物質の活性（Ｌ−Ｍ細胞障害活性
にて評価）を抑制するのに対シて、ウサギ、マウス、モ
ルモット、ハムスターに由来するＴＮＦのＬ−Ｍ細胞の
障害活性は全く抑制しなかった。

以上、詳細に述へてきたように、本発明にかかるＰ３Ｔ
Ｔに由来するモノクロナル抗体はヒ）ＴＮＦに対して特
異的に反応するものであって、と）ＴＮＦの分離Ｍ製に
応用可能であるのみならず、酵素やラジオアイソトープ
を用いたイムノアッセイにてヒトＴＮＦの定量分析に広
く応用可能である。

手続補正書 昭；ＩＦ１５９年７月２６日 特許庁長官　志賀　学　殿 １　事件の表示 特願昭５９−６５２５５号 ２　発明の名称 ヒト腫瘍壊死因子九対する抗体 ３　補正をする者 事件との関係・特ｔｒ出願人 （ＯＯＸ）　旭化成工業株式会社 ４代理人 郵（更ｄず号１０５ 東京都港区虎）門−丁目２ｔｉ２９号虎ノ門産業ピル５
ｖ＠６　補正の内容 明純書の浄ｄ（内容に変更なし）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ヒト型腫瘍壊死因子に対して特異性があるモノクロナル
   抗体