JPH0789925B2 - 強耐熱性プルラナーゼ - Google Patents
強耐熱性プルラナーゼInfo
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- JPH0789925B2 JPH0789925B2 JP21832387A JP21832387A JPH0789925B2 JP H0789925 B2 JPH0789925 B2 JP H0789925B2 JP 21832387 A JP21832387 A JP 21832387A JP 21832387 A JP21832387 A JP 21832387A JP H0789925 B2 JPH0789925 B2 JP H0789925B2
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は耐熱性に優れたプルラナーゼに関する。
（従来の技術） アミロペクチン，グリコーゲン，分岐オリゴ糖などのα
−1,6−結合のみを加水分解する酵素（α−1,6−グルコ
シダーゼ）としては，プルラナーゼやイソアミラーゼな
どが知られている。これらは，例えばグルコアミラーゼ
との併用により澱粉性基質からグルコースの製造に，そ
して，β−アミラーゼやマルトトリオース以上のマルト
オリゴ糖生成酵素との併用により澱粉性基質からマルト
ース，マルトトリオース，マルトテトラオース，マルト
ペンタオース，マルトヘキサオースなどのマルトオリゴ
糖の製造において，これらの糖の増収に有効であること
が認められている。澱粉性基質からの上記糖の製造時の
反応温度は，反応速度，基質溶解性および微生物汚染防
止などの点から，高いことが望ましい。しかし，これま
で知られるα−1,6−グルコシダーゼの至適温度および
安定温度範囲は低く，通常40℃から50℃前後である。高
温で作用するこの種の酵素としては，わずかに，バシラ
ス アシドプルリティクス（Bacillus acidopullulytic
us）およびクロストリジウム サーモヒドロスルフリウ
ム（Clostridium thermohydrosulfurium）由来のプルラ
ナーゼが知られているにすぎない（それぞれ特公昭62−
25037号公報；およびApplied and Environmental Micro
biology（1985）49巻,1168〜1173頁）。前者の酵素の至
適温度は約65℃〜70℃であり，後者の至適温度は約85℃
であることが知られている。これらの他にも高温で好適
に働き，耐熱性に優れたα−1,6−グルコシダーゼが求
められている。
−1,6−結合のみを加水分解する酵素（α−1,6−グルコ
シダーゼ）としては，プルラナーゼやイソアミラーゼな
どが知られている。これらは，例えばグルコアミラーゼ
との併用により澱粉性基質からグルコースの製造に，そ
して，β−アミラーゼやマルトトリオース以上のマルト
オリゴ糖生成酵素との併用により澱粉性基質からマルト
ース，マルトトリオース，マルトテトラオース，マルト
ペンタオース，マルトヘキサオースなどのマルトオリゴ
糖の製造において，これらの糖の増収に有効であること
が認められている。澱粉性基質からの上記糖の製造時の
反応温度は，反応速度，基質溶解性および微生物汚染防
止などの点から，高いことが望ましい。しかし，これま
で知られるα−1,6−グルコシダーゼの至適温度および
安定温度範囲は低く，通常40℃から50℃前後である。高
温で作用するこの種の酵素としては，わずかに，バシラ
ス アシドプルリティクス（Bacillus acidopullulytic
us）およびクロストリジウム サーモヒドロスルフリウ
ム（Clostridium thermohydrosulfurium）由来のプルラ
ナーゼが知られているにすぎない（それぞれ特公昭62−
25037号公報；およびApplied and Environmental Micro
biology（1985）49巻,1168〜1173頁）。前者の酵素の至
適温度は約65℃〜70℃であり，後者の至適温度は約85℃
であることが知られている。これらの他にも高温で好適
に働き，耐熱性に優れたα−1,6−グルコシダーゼが求
められている。
（発明の目的） 本発明の目的は，反応の至適温度が高く，かつ耐熱性に
優れたα−1,6−グルコシダーゼを提供することにあ
る。本発明の他の目的は，上記優れた性質を有し，マル
トオリゴ糖の製造に有効なプルラナーゼを提供すること
にある。
優れたα−1,6−グルコシダーゼを提供することにあ
る。本発明の他の目的は，上記優れた性質を有し，マル
トオリゴ糖の製造に有効なプルラナーゼを提供すること
にある。
（発明の要旨） 本発明の強耐熱性プルラナーゼは，次の性質を有する。
作用および基質特異性：プルランに作用し，主として
マルトトリオースを生成する。また，アミロペクチン，
β−限界デキストリンおよび可溶性澱粉のα−1,6−グ
ルコシド結合を分解する。
マルトトリオースを生成する。また，アミロペクチン，
β−限界デキストリンおよび可溶性澱粉のα−1,6−グ
ルコシド結合を分解する。
至適pH範囲:6.2〜6.5 安定pH範囲:35℃において3.2〜9.5である。
作用適温の範囲:5％プルランを基質とした場合の至適
温度は75〜80℃；そして５％可溶性澱粉を基質とした場
合の至適温度は80〜85℃である。
温度は75〜80℃；そして５％可溶性澱粉を基質とした場
合の至適温度は80〜85℃である。
熱安定性:pH6.8において10分間保持した場合90℃まで
安定である。
安定である。
分子量：ソジウムドデシルサルフェイド電気泳動によ
る分子量は55,000である。
る分子量は55,000である。
プルランに対するミハエリス定数（Km）:5.1mg/ml。
本発明のプルラナーゼは，バシラス（Bacillus）属菌，
特に高度好熱菌バシラス フラボカルダリウス（Bacill
us flavocaldarius）KP1228株（微工研菌寄第9542号;FE
RM P−9542）により生産される。この菌株は本発明者ら
により伊豆峰自噴泉から分離・採取された新菌株である
（昭和59年度日本農芸化学大会講演要旨集542頁）。こ
の菌株は，本発明のプルラナーゼとは別に耐熱性のエキ
ソ−オリゴ−1,6−グルコシダーゼを産生することが発
明者らにより明らかにされている（昭和60年度日本農芸
化学大会講演要旨集375頁）。この菌株の菌学的性質を
表１に示す。表１において特に記載のない限り培養温度
は60℃である。
特に高度好熱菌バシラス フラボカルダリウス（Bacill
us flavocaldarius）KP1228株（微工研菌寄第9542号;FE
RM P−9542）により生産される。この菌株は本発明者ら
により伊豆峰自噴泉から分離・採取された新菌株である
（昭和59年度日本農芸化学大会講演要旨集542頁）。こ
の菌株は，本発明のプルラナーゼとは別に耐熱性のエキ
ソ−オリゴ−1,6−グルコシダーゼを産生することが発
明者らにより明らかにされている（昭和60年度日本農芸
化学大会講演要旨集375頁）。この菌株の菌学的性質を
表１に示す。表１において特に記載のない限り培養温度
は60℃である。
培養条件 上記菌株の培地は格別である必要はなく，通常と培地が
用いられる。炭素源としては，可溶性澱粉，アミロペク
チン，アミロース，デキストリンなどが用いられる。コ
ーン，馬鈴薯，甘露などを用いることもできる。窒素源
としてはペプトン，酵母エキス，肉エキス，大豆粉，コ
ーンディスティラーズソリュブルなどが用いられる。無
機塩類としては,K2HPO4,KH2PO4,CaCl2,MgSO4,Na2HPO4,
（NH4）2HPO4などが用いられる。例えば，次の培地が好
適に用いられる。
用いられる。炭素源としては，可溶性澱粉，アミロペク
チン，アミロース，デキストリンなどが用いられる。コ
ーン，馬鈴薯，甘露などを用いることもできる。窒素源
としてはペプトン，酵母エキス，肉エキス，大豆粉，コ
ーンディスティラーズソリュブルなどが用いられる。無
機塩類としては,K2HPO4,KH2PO4,CaCl2,MgSO4,Na2HPO4,
（NH4）2HPO4などが用いられる。例えば，次の培地が好
適に用いられる。
培養pHは6.3〜8.7,好ましくは6.8〜8.0,培養温度は51〜
82℃，好ましくは76℃前後であり，約18時間好気的に攪
拌または振盪しながら培養を行う。本発明のプルラナー
ゼは主として細胞内に蓄積される。
82℃，好ましくは76℃前後であり，約18時間好気的に攪
拌または振盪しながら培養を行う。本発明のプルラナー
ゼは主として細胞内に蓄積される。
酵素の採取法 上記培養液から本発明酵素を採取・精製するには既知の
精製法が単独もしくは併用して利用されうる。例えば，
培養液中の菌体を破砕し，抽出を行った後，硫安などに
よる塩析を行う。これをCM−セファデックス，ハイドロ
キシアパタイト，フェニルセファロースなどのカラムに
かけて精製を行う。精製法の一例を次に示す。
精製法が単独もしくは併用して利用されうる。例えば，
培養液中の菌体を破砕し，抽出を行った後，硫安などに
よる塩析を行う。これをCM−セファデックス，ハイドロ
キシアパタイト，フェニルセファロースなどのカラムに
かけて精製を行う。精製法の一例を次に示す。
（１）培養液から菌体を遠心分離によって集め，アルミ
ナ粉砕を行い，適当な緩衝液で抽出を行う。（２）得ら
れた抽出液を硫酸アンモニウム（0.2〜0.5M）で塩析す
る。（３）得られた粗酵素を,DEAE−セファデックスＡ
−50カラムクロマトグラフィー（pH8.0）にかける。
（４）次に,CM−セファデックスＣ−50カラムクロマト
グラフィーにかける（pH6.0;0〜0.8M NaCl濃度勾配）。
（５）ハイドロキシアパタイト（バイオゲルHTP）クロ
マトグラフィーにかける（pH6.8;リン酸緩衝液５〜300m
M濃度勾配）。（６）フェニルセファロースCL−4Bカラ
ムクロマトグラフィーにかける（pH6.8〜7.5;エチレン
グリコール０〜50％，（NH4）2SO41〜0Mの濃度勾配）。
（７）CM−セファデックスＣ−50カラムクロマトグラフ
ィーにかける（pH6.0;0〜0.3M NaCl濃度勾配）。このよ
うな方法で精製したときの各ステップにおける酵素の純
化の度合を表２に示す。表２における活性は後述の活性
測定法により測定した値である。ステップ１の値は菌体
732g（湿重量）をアルミナ粉砕し，抽出し遠心分離にか
けて得られる上清液を濃縮し，これを試料としたときの
測定値である。このようにして，ステップ７では11.5単
位/mg蛋白質の（当初の酵素上清液に比較して1040倍に
鈍化された）精製酵素が得られる。以下，後述の酵素の
性質は，この精製酵素を用いて調べられた。
ナ粉砕を行い，適当な緩衝液で抽出を行う。（２）得ら
れた抽出液を硫酸アンモニウム（0.2〜0.5M）で塩析す
る。（３）得られた粗酵素を,DEAE−セファデックスＡ
−50カラムクロマトグラフィー（pH8.0）にかける。
（４）次に,CM−セファデックスＣ−50カラムクロマト
グラフィーにかける（pH6.0;0〜0.8M NaCl濃度勾配）。
（５）ハイドロキシアパタイト（バイオゲルHTP）クロ
マトグラフィーにかける（pH6.8;リン酸緩衝液５〜300m
M濃度勾配）。（６）フェニルセファロースCL−4Bカラ
ムクロマトグラフィーにかける（pH6.8〜7.5;エチレン
グリコール０〜50％，（NH4）2SO41〜0Mの濃度勾配）。
（７）CM−セファデックスＣ−50カラムクロマトグラフ
ィーにかける（pH6.0;0〜0.3M NaCl濃度勾配）。このよ
うな方法で精製したときの各ステップにおける酵素の純
化の度合を表２に示す。表２における活性は後述の活性
測定法により測定した値である。ステップ１の値は菌体
732g（湿重量）をアルミナ粉砕し，抽出し遠心分離にか
けて得られる上清液を濃縮し，これを試料としたときの
測定値である。このようにして，ステップ７では11.5単
位/mg蛋白質の（当初の酵素上清液に比較して1040倍に
鈍化された）精製酵素が得られる。以下，後述の酵素の
性質は，この精製酵素を用いて調べられた。
活性測定法 5mMのエチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）を含有する4
0mM K−リン酸バッファー（pH6.8）に基質としてプルラ
ンが１％となるように添加し，これに活性が未知の酵素
液0.1ml（0.02〜0.05単位）を加え，総量を0.25mlとす
る。これを75℃で20分間インキュベートし，冷却して酵
素反応を停止させる。還元力の上昇をソモギーネルソン
（SomogyiNelson）法で測定する。酵素の１単位は,1分
間に１μmolのホルミル基を生成する酵素量とする。
0mM K−リン酸バッファー（pH6.8）に基質としてプルラ
ンが１％となるように添加し，これに活性が未知の酵素
液0.1ml（0.02〜0.05単位）を加え，総量を0.25mlとす
る。これを75℃で20分間インキュベートし，冷却して酵
素反応を停止させる。還元力の上昇をソモギーネルソン
（SomogyiNelson）法で測定する。酵素の１単位は,1分
間に１μmolのホルミル基を生成する酵素量とする。
酵素の性質 本発明酵素の理化学的性質を以下に示す。
作用および基質特異性 −１基質特異性 プルランの代わりに下記基質を含有するリン酸緩衝液に
それぞれ本酵素を加えて，活性測定法に準じて酵素反応
を行い，生じたホルミル基のモル数を測定した。ただ
し，α−限界デキストリン（１）と（２），デキストリ
ンは3,5−ジニトロサリチル酸法で，パノース，イソマ
ルトースはグルコースＢテスト試薬（和光純薬）を用
い，その他の基質の場合は，ソモギーネルソン法により
生成ホルミリ基のモル数を測定した。種々の基質を用い
て実験を行った結果を表３に示す。
それぞれ本酵素を加えて，活性測定法に準じて酵素反応
を行い，生じたホルミル基のモル数を測定した。ただ
し，α−限界デキストリン（１）と（２），デキストリ
ンは3,5−ジニトロサリチル酸法で，パノース，イソマ
ルトースはグルコースＢテスト試薬（和光純薬）を用
い，その他の基質の場合は，ソモギーネルソン法により
生成ホルミリ基のモル数を測定した。種々の基質を用い
て実験を行った結果を表３に示す。
表３において，α−限界デキストリン（１）はヒト睡液
腺α−アミラーゼを用いて，そしてα−限界デキストリ
ン（２）はバシラス サチリス（Bacillus subtilis）
の生産するα−アミラーゼを用いて，それぞれ調製され
た。
腺α−アミラーゼを用いて，そしてα−限界デキストリ
ン（２）はバシラス サチリス（Bacillus subtilis）
の生産するα−アミラーゼを用いて，それぞれ調製され
た。
−２作用機作 プルランを基質として同様の条件下で酵素反応を行い,2
0分後,40分後および60分後に反応液を採取してペーパー
クロマトグラフィーを行った。展開溶媒としては,n−ブ
タノール−ピリジン−H2O（6:4:3）を用いた。その結果
を第１図に示す。第１図において,G1〜G6は，それぞれ
グルコース数が１〜６個のマルトオリゴ糖の展開位置を
示す。IG2はイソマルトースの，そしてPAはパノースの
展開位置を示す。第１図から，本酵素はプルランに作用
し，主としてマルトトリオースを生成し，パノースおよ
びイソマルトースは生成しないことがわかる。
0分後,40分後および60分後に反応液を採取してペーパー
クロマトグラフィーを行った。展開溶媒としては,n−ブ
タノール−ピリジン−H2O（6:4:3）を用いた。その結果
を第１図に示す。第１図において,G1〜G6は，それぞれ
グルコース数が１〜６個のマルトオリゴ糖の展開位置を
示す。IG2はイソマルトースの，そしてPAはパノースの
展開位置を示す。第１図から，本酵素はプルランに作用
し，主としてマルトトリオースを生成し，パノースおよ
びイソマルトースは生成しないことがわかる。
次に，プルランを基質として，別に同様の条件下で酵素
反応を行い,10分後,60分後および120分後にそれぞれ反
応液10μｌを採取して高速液体クロマトグラフィーにか
けた。高速液体クロマトグラフィーのカラムとしてはJa
sco Finepak SIL NH2カラムを使用し，溶離液としては
アセトニトリル−H2O（6:4）を用いた。溶離液を1ml/分
の割合で流し,Jasco RID−300 R1検出器で検出した。得
られたチャートを第２図（ａ），（ｂ）および（ｃ）に
示す。第２図において,1はマルトトリオースのピーク
を，そして２は63−α−マルトトリオシルマルトトリオ
ースのピークを示す。
反応を行い,10分後,60分後および120分後にそれぞれ反
応液10μｌを採取して高速液体クロマトグラフィーにか
けた。高速液体クロマトグラフィーのカラムとしてはJa
sco Finepak SIL NH2カラムを使用し，溶離液としては
アセトニトリル−H2O（6:4）を用いた。溶離液を1ml/分
の割合で流し,Jasco RID−300 R1検出器で検出した。得
られたチャートを第２図（ａ），（ｂ）および（ｃ）に
示す。第２図において,1はマルトトリオースのピーク
を，そして２は63−α−マルトトリオシルマルトトリオ
ースのピークを示す。
前記−１（基質特異性）および−２（作用機作）の
実験結果から，本酵素は，プルラン，アミロペクチン，
β−限界デキストリン，可溶性澱粉などの澱粉様α−グ
ルカンに作用することがわかる。良好な基質はプルラン
およびβ−限界デキストリンである。プルランからはマ
ルトースおよび少量の63−α−マルトトリオシルマルト
トリオースを生成する。アミロース，グリコーゲン，α
−限界デキストリン，パノース，イソマルトースおよび
デキストリンは分解しない。本酵素は，上記基質および
生成物の特性から，イソプルラナーゼとは異なり典型的
なプルラナーゼであることがわかる。生成物としては，
マルトトリオースのダイマーである63−α−マルトトリ
オシルマルトトリオースの存在が確認されていることか
ら，本酵素は基質をエンドタイプに加水分解することが
わかる。
実験結果から，本酵素は，プルラン，アミロペクチン，
β−限界デキストリン，可溶性澱粉などの澱粉様α−グ
ルカンに作用することがわかる。良好な基質はプルラン
およびβ−限界デキストリンである。プルランからはマ
ルトースおよび少量の63−α−マルトトリオシルマルト
トリオースを生成する。アミロース，グリコーゲン，α
−限界デキストリン，パノース，イソマルトースおよび
デキストリンは分解しない。本酵素は，上記基質および
生成物の特性から，イソプルラナーゼとは異なり典型的
なプルラナーゼであることがわかる。生成物としては，
マルトトリオースのダイマーである63−α−マルトトリ
オシルマルトトリオースの存在が確認されていることか
ら，本酵素は基質をエンドタイプに加水分解することが
わかる。
至適pH範囲および安定pH範囲 本酵素を用い,pH3.0〜9.2の範囲のpH条件下で活性測定
法の方法に準じて酵素反応を行った。但し，使用したバ
ッファーは,pH3.0〜7.2の範囲ではマクルベインバッフ
ァー（Mcllvain's buffer），そしてpH6.5〜9.2の範囲
では50mMグリシン−NaCl−NaOHバッファーである。その
相対活性を第３図に示す。第３図から，至適pHは75℃に
おいて約6.2〜6.5であることがわかる。
法の方法に準じて酵素反応を行った。但し，使用したバ
ッファーは,pH3.0〜7.2の範囲ではマクルベインバッフ
ァー（Mcllvain's buffer），そしてpH6.5〜9.2の範囲
では50mMグリシン−NaCl−NaOHバッファーである。その
相対活性を第３図に示す。第３図から，至適pHは75℃に
おいて約6.2〜6.5であることがわかる。
本酵素を所定のpHのバッファーに溶解し35℃で15時間保
持した後，残存活性を測定した。pHは第４図に示す12種
に設定した。その結果を第４図に示す。使用したバッフ
ァーは,pH2.5〜7.2ではマクルベインバッファー,pH7.5
〜9.5では50mMグリシン−NaCl−NaOHバッファーであ
る。マクルベインバッファーの反応系での測定値を第７
図に●で，グリシン−NaCl−NaOHバッファーの反応系で
の測定値を第７図に▲で示す。安定pH範囲は35℃で3.2
〜9.5であることがわかる。
持した後，残存活性を測定した。pHは第４図に示す12種
に設定した。その結果を第４図に示す。使用したバッフ
ァーは,pH2.5〜7.2ではマクルベインバッファー,pH7.5
〜9.5では50mMグリシン−NaCl−NaOHバッファーであ
る。マクルベインバッファーの反応系での測定値を第７
図に●で，グリシン−NaCl−NaOHバッファーの反応系で
の測定値を第７図に▲で示す。安定pH範囲は35℃で3.2
〜9.5であることがわかる。
作用適温の範囲 本酵素を用いプルラン（５％）を基質とし,35〜100℃の
範囲において14種類の温度条件下で，活性測定法に準じ
て酵素反応を行った。その相対活性を第５図に実線で示
す。第５図からプルラン（５％）を基質としたときの至
適温度は75〜80℃であることがわかる。
範囲において14種類の温度条件下で，活性測定法に準じ
て酵素反応を行った。その相対活性を第５図に実線で示
す。第５図からプルラン（５％）を基質としたときの至
適温度は75〜80℃であることがわかる。
次に，可溶性澱粉（５％）を基質とし,45〜100℃の範囲
において11種類の温度条件下で，同様に酵素反応を行っ
た。その相対活性を第５図に破線で示す。第５図から可
溶性澱粉（５％）を基質としたときの至適温度は80〜85
℃であることがわかる。
において11種類の温度条件下で，同様に酵素反応を行っ
た。その相対活性を第５図に破線で示す。第５図から可
溶性澱粉（５％）を基質としたときの至適温度は80〜85
℃であることがわかる。
94℃において，プルランを基質とした場合には，至適活
性の67％，可溶性澱粉を基質とした場合には，至適活性
の55％の活性を示す。反応温度が100℃近くとなっても
いずれの場合にも至適活性の約50％の活性を示す。
性の67％，可溶性澱粉を基質とした場合には，至適活性
の55％の活性を示す。反応温度が100℃近くとなっても
いずれの場合にも至適活性の約50％の活性を示す。
pH,温度などによる失活の条件 本酵素は，第４図から,35℃においてpH3.0以下で15時間
で失活することが明らかである。
で失活することが明らかである。
本酵素をpH6.8のリン酸バッファーに溶解させ所定温度
で10分間保持した後，その残存活性を測定した。保持温
度は，第６図に示す６種類に設定された。それぞれの残
存活性を第６図に示す。第６図からこの酵素は上記条件
下で90℃まで安定であることがわかる。100℃近くにお
いても約50％の活性が残存することがわかる。
で10分間保持した後，その残存活性を測定した。保持温
度は，第６図に示す６種類に設定された。それぞれの残
存活性を第６図に示す。第６図からこの酵素は上記条件
下で90℃まで安定であることがわかる。100℃近くにお
いても約50％の活性が残存することがわかる。
分子量 ソジウムドデシルサルフェイト（SDS）電気泳動におい
て，単一のタンパクバンドが検出される。SDS電気泳動
法による分子量は約55000である。
て，単一のタンパクバンドが検出される。SDS電気泳動
法による分子量は約55000である。
Km値 プルランを基質とした場合のKm値は5.1mg/mlである。但
し酵素反応は活性測定法に準じて行った。
し酵素反応は活性測定法に準じて行った。
既知酵素との比較 本酵素と，これまでに報告されているプルラナーゼとの
比較を行った。
比較を行った。
表４に本酵素および各種プルラーゼの特徴（分子量，至
適pH,至適温度および安定温度）を示す。
適pH,至適温度および安定温度）を示す。
表４から，本酵素は，反応の至適温度が75〜85℃と高い
ため，バシラス アシドプルリティクス由来のプルラナ
ーゼ以下６種の酵素とは異なることがわかる。本酵素
は，クロストリジウム サーモヒドロスルフリウム由来
のプルラナーゼと至適温度において類似するが,pH6.8に
おいて10分間保持したときの熱安定性が90℃と該プルラ
ナーゼの80℃よりも10℃高い。さらに至適pHが6.2〜6.5
であり，クロストリジウム サーモヒドロスルフリウム
由来のプルラナーゼよりも中性側であることが異なる。
このように，本発明のプルラナーゼは，既知のプルラナ
ーゼのいずれとも異なる新規酵素であり，かつ最も耐熱
性が高く高温で機能するプルラナーゼであることが明ら
かになった。
ため，バシラス アシドプルリティクス由来のプルラナ
ーゼ以下６種の酵素とは異なることがわかる。本酵素
は，クロストリジウム サーモヒドロスルフリウム由来
のプルラナーゼと至適温度において類似するが,pH6.8に
おいて10分間保持したときの熱安定性が90℃と該プルラ
ナーゼの80℃よりも10℃高い。さらに至適pHが6.2〜6.5
であり，クロストリジウム サーモヒドロスルフリウム
由来のプルラナーゼよりも中性側であることが異なる。
このように，本発明のプルラナーゼは，既知のプルラナ
ーゼのいずれとも異なる新規酵素であり，かつ最も耐熱
性が高く高温で機能するプルラナーゼであることが明ら
かになった。
実施例 （Ａ）Bacillus flavocaldarius KP1228株の培養：デキ
ストリン2.0％，ペプトン1.2％，酵母エキス0.3％，肉
エキス0.05％,K2HPO40.3％,KH2PO40.1％およびCaCl20.0
1mMを含有する溶液（pH7.5）を培地とし,Bacillus flav
ocaldarius KP1228株の培養を行った。培養は76℃で約1
8時間，回転振盪培養法により行った。
ストリン2.0％，ペプトン1.2％，酵母エキス0.3％，肉
エキス0.05％,K2HPO40.3％,KH2PO40.1％およびCaCl20.0
1mMを含有する溶液（pH7.5）を培地とし,Bacillus flav
ocaldarius KP1228株の培養を行った。培養は76℃で約1
8時間，回転振盪培養法により行った。
（Ｂ）酵素の採取および調製：（Ａ）項で得られた培養
液を遠心分離にかけ，菌体732g（湿重量）を得た。これ
をアルミナ粉砕した後，リン酸緩衝液（pH7.0）で抽出
を行った。抽出液を濃縮し，得られた粗酵素液を硫酸ア
ンモニウム（0.2〜0.5M）で塩析にかけた。得られた粗
酵素をまず,DEAE−セファデックスＡ−50カラムクロマ
トグラフィー（pH8.0）にかけ，次に,CM−セファデック
スＣ−50カラムクロマトグラフィーにかけた（pH6.0;0
〜0.8M NaCl濃度勾配）。さらに，ハイドロキシアパタ
イト（バイオゲルHTP）クロマトグラフィー（pH6.8;リ
ン酸緩衝液５〜300mM濃度勾配），フェニルセファロー
スCL−4Bカラムクロマトグラフィー（pH6.8〜7.5;エチ
レングリコール０〜50％，（NH4）2SO41〜0Mの濃度勾
配），およびCM−セファデックスＣ−50カラムクロマト
グラフィー（pH6.0〜0.3M NaCl濃度勾配）に順次かけ
て，精製酵素を得た。この酵素は，上記活性測定法を用
いて測定すると11.5単位/mg蛋白質であることがわかっ
た。蛋白の定量はLowryらの方法を採用した。
液を遠心分離にかけ，菌体732g（湿重量）を得た。これ
をアルミナ粉砕した後，リン酸緩衝液（pH7.0）で抽出
を行った。抽出液を濃縮し，得られた粗酵素液を硫酸ア
ンモニウム（0.2〜0.5M）で塩析にかけた。得られた粗
酵素をまず,DEAE−セファデックスＡ−50カラムクロマ
トグラフィー（pH8.0）にかけ，次に,CM−セファデック
スＣ−50カラムクロマトグラフィーにかけた（pH6.0;0
〜0.8M NaCl濃度勾配）。さらに，ハイドロキシアパタ
イト（バイオゲルHTP）クロマトグラフィー（pH6.8;リ
ン酸緩衝液５〜300mM濃度勾配），フェニルセファロー
スCL−4Bカラムクロマトグラフィー（pH6.8〜7.5;エチ
レングリコール０〜50％，（NH4）2SO41〜0Mの濃度勾
配），およびCM−セファデックスＣ−50カラムクロマト
グラフィー（pH6.0〜0.3M NaCl濃度勾配）に順次かけ
て，精製酵素を得た。この酵素は，上記活性測定法を用
いて測定すると11.5単位/mg蛋白質であることがわかっ
た。蛋白の定量はLowryらの方法を採用した。
（Ｃ）マルトトリオースの調製： （Ｃ）−１プルランを１％の割合で含有する40mMリン酸
バッファー（pH6.8）0.25mlに（Ｂ）項で得られた酵素
液（酵素0.05単位を含有する）を加えて，活性測定法に
準じて２時間酵素反応を行った。反応液を高速液体クロ
マトグラフィーにかけたところ，マルトトリオースおよ
び微量の63−α−マルトトリオシルマルトトリオースの
存在が確認された。
バッファー（pH6.8）0.25mlに（Ｂ）項で得られた酵素
液（酵素0.05単位を含有する）を加えて，活性測定法に
準じて２時間酵素反応を行った。反応液を高速液体クロ
マトグラフィーにかけたところ，マルトトリオースおよ
び微量の63−α−マルトトリオシルマルトトリオースの
存在が確認された。
（Ｃ）−２プルランを１％の割合で含有する40mMリン酸
バッファー（pH6.8）0.25mlに（Ｂ）項で得られた酵素
液（酵素0.05単位を有する）を加え,75℃で２時間反応
を行った。反応液の酵素を失活させた後，脱塩し，濃縮
して無色透明な澱粉糖液を得た。この澱粉糖液の生成物
組成を高速液体クロマトグラフィーで確認したところ，
マルトトリオースの含量は，全含有炭水化物に対する重
量％で88％であった。
バッファー（pH6.8）0.25mlに（Ｂ）項で得られた酵素
液（酵素0.05単位を有する）を加え,75℃で２時間反応
を行った。反応液の酵素を失活させた後，脱塩し，濃縮
して無色透明な澱粉糖液を得た。この澱粉糖液の生成物
組成を高速液体クロマトグラフィーで確認したところ，
マルトトリオースの含量は，全含有炭水化物に対する重
量％で88％であった。
（発明の効果） 本発明によれば，このように，バシラス フラボカルダ
リウス KP1228株から，新規プルラナーゼが得られる。
本酵素は，耐熱性が90℃と非常に高く，これまでに知ら
れているプルラナーゼのうちでは最も耐熱性に優れた酵
素である。この酵素の至適pHは，中性付近であるため，
例えば，中性付近で好適に作用するアミラーゼを組み合
わせて，澱粉系基質からマルトオリゴ糖（食品用，試薬
用，医薬用などに使用される）を製造するのに有利であ
る。高温で効果的に働くため反応温度として高温を採用
し，効果的にマルトオリゴ糖を製造することが可能であ
る。
リウス KP1228株から，新規プルラナーゼが得られる。
本酵素は，耐熱性が90℃と非常に高く，これまでに知ら
れているプルラナーゼのうちでは最も耐熱性に優れた酵
素である。この酵素の至適pHは，中性付近であるため，
例えば，中性付近で好適に作用するアミラーゼを組み合
わせて，澱粉系基質からマルトオリゴ糖（食品用，試薬
用，医薬用などに使用される）を製造するのに有利であ
る。高温で効果的に働くため反応温度として高温を採用
し，効果的にマルトオリゴ糖を製造することが可能であ
る。
第１図は，プルランを基質とし本酵素を用いて酵素反応
を行ったときの反応液のペーパークロマトグラフィーの
結果を示す図，第２図はプルランを基質とし本酵素を用
いて酵素反応を行ったときの反応生成物を経時的に示す
高速液体クロマトグラフィーのチャート，第３図は本発
明酵素の至適pHを示すグラフ，第４図は本酵素の安定pH
範囲を示すグラフ，第５図は本酵素の至適温度を示すグ
ラフ，そして第６図は本酵素の安定温度範囲を示すグラ
フである。
を行ったときの反応液のペーパークロマトグラフィーの
結果を示す図，第２図はプルランを基質とし本酵素を用
いて酵素反応を行ったときの反応生成物を経時的に示す
高速液体クロマトグラフィーのチャート，第３図は本発
明酵素の至適pHを示すグラフ，第４図は本酵素の安定pH
範囲を示すグラフ，第５図は本酵素の至適温度を示すグ
ラフ，そして第６図は本酵素の安定温度範囲を示すグラ
フである。
Claims (3)
- 【請求項１】次の性質を有する耐熱性に優れたプルラナ
ーゼ。 作用および基質特異性：プルランに作用し，主として
マルトトリオースを生成する。また，アミロペクチン，
β−限界デキストリンおよび可溶性澱粉のα−1,6−グ
ルコシド結合を分解する。 至適pH範囲:6.2〜6.5 安定pH範囲:35℃において3.2〜9.5である。 作用適温の範囲:5％プルランを基質とした場合の至適
温度は75〜80℃；そして５％可溶性澱粉を基質とした場
合の至適温度は80〜85℃である。 熱安定性:pH6.8において10分間保持した場合90℃まで
安定である。 分子量：ソジウムドデシルサルフェイド電気泳動によ
る分子量は55,000である。 プルランに対するミハエリス定数（Km）:5.1mg/ml。 - 【請求項２】バシラス（Bacillus）属菌から得られる特
許請求の範囲第１項に記載のプルラナーゼ。 - 【請求項３】バシラス フラボカルダリウス（Bacillus
flavocaldarius）KP1228株から得られる特許請求の範
囲第１項または第２項に記載のプルラナーゼ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21832387A JPH0789925B2 (ja) | 1987-08-31 | 1987-08-31 | 強耐熱性プルラナーゼ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21832387A JPH0789925B2 (ja) | 1987-08-31 | 1987-08-31 | 強耐熱性プルラナーゼ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6460378A JPS6460378A (en) | 1989-03-07 |
| JPH0789925B2 true JPH0789925B2 (ja) | 1995-10-04 |
Family
ID=16718048
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21832387A Expired - Lifetime JPH0789925B2 (ja) | 1987-08-31 | 1987-08-31 | 強耐熱性プルラナーゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0789925B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN119351379B (zh) * | 2024-12-11 | 2025-10-31 | 昆明理工大学 | 一种普鲁兰酶PulW310B及其在合成高聚合度麦芽寡糖中的用途 |
-
1987
- 1987-08-31 JP JP21832387A patent/JPH0789925B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6460378A (en) | 1989-03-07 |
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