JPH0336512B2

JPH0336512B2 -

Info

Publication number: JPH0336512B2
Application number: JP63028591A
Authority: JP
Inventors: Yoshuki Takasaki
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1988-02-09
Filing date: 1988-02-09
Publication date: 1991-05-31
Also published as: JPH01202283A

Description

【発明の詳細な説明】

（技術分野）本発明は、バシルス属菌による新規な糖転移酵
素Ａの製造方法に関するものである。（従来技術）糖を転移する酵素には、転移酵素（トランスフ
エラーゼ）によるものと、加水分解酵素（ヒドロ
ラーゼ）の逆反応によるものがある。また、転移
酵素は移転する残基の種類により７種に分けられ
る。このうち、糖転移に係る酵素は、オリゴ糖ま
たは多糖を供与体として、その糖残基を、他の単
糖、オリゴ糖、各種アルコールなど、適当な受容
体に転移する酵素であり、この中に、グルコース
残基、キシロース残基、ガラクトース残基など、
種々の糖を、それぞれ転移する酵素がある。ま
た、転移がおこる結合の種類によつても分けられ
る。糖転移酵素を工業的に応用している例として、
サイクロデキストリン・グルカノトランスフエラ
ーゼによる、サイクロデキストリンの生産、同酵
素を用いたカツプリング・シユガーの生産や、グ
ルコシル・ステビオシドの生産などがある。また
加水分解酵素の逆反応を利用しているものとし
て、プルラナーゼを利用した分岐サイクロデキス
トリンの生産、グルコアミラーゼを用いたイソマ
ルトースの生産などがある。本発明者は、ある種の糖転移酵素が、グルコア
ミラーゼによる澱粉分解において、グルコースの
増収に顕著な効果のあることを認めた。グルコースは、現在、澱粉をα−アミラーゼで
液化し、次いで、グルゴアミラーゼで糖化するこ
とにより製造されている。グルコアミラーゼは、澱粉のα−１、４−グル
コシド結合とα−１、６−グルコシド結合の両結
合を加水分解することができるので、希薄な澱粉
溶液の場合は、これをほぼ完全にグルコースまで
分解することができる。しかし、工業的規模で
は、30〜35％の高濃度の澱粉のもとで糖化が行わ
れるため、グルコアミラーゼ自体のもつ、逆合成
作用などにより、生成したグルコースの重合化が
おこり、このため、グルコースの収量は、通常、
93〜95％程度である。そして、残りはマルトー
ス、イソマルトース、パノース、その他のより高
分子のオリゴ糖として残存する。従つて、これら
残存するオリゴ糖を分解してグルコースを増収す
ることは、ブドウ糖製造における長年の念願であ
つた。（発明が解決しようとする問題点）グルコアミラーゼによる、澱粉糖化において、
α−１、６−グルコシド結合分解能をもつプルラ
ナーゼを存在させて澱粉を糖化すると、糖化反応
が促進され、かつ、グルコースが0.5〜２％増収
することができることが知られている（特公昭54
−29570、57−39、57−174089他）。また、ある種
のα−アミラーゼによつてもグルコースを増収す
ることができる（特公昭61−19498）。プルラナーゼはプルランのほか、アミロペクチ
ン、またはその派生物中のα−１、６−グルコシ
ド結合を分解する酵素であり、プルランからは最
終的にマルトトリオースを生成する。しかし、プ
ルラナーゼは逆合成もすることが知られており、
例えば、マルトトリオースから六糖（G6）など
を生成する。このため、プルラナーゼを、グルコ
アミラーゼによる澱粉糖化に併用した場合、グル
コースの増収が認められる反面、プルラナーゼの
持つ逆合成作用により、グルコアミラーゼによつ
て分解され難いオリゴも生成するという問題があ
つた。（問題点を解決するための手段）本発明者は、グルコアミラーゼを用いて、澱粉
を糖化するに際し、グルコースの増収に有効な新
規酵素の探索を行つてきた結果、土壌中より分離
し、バシルス属と同定した細菌の生産する酵素が
グルコースの増収に極めて顕著な効果を示すこと
を認めた。この酵素は、可溶性澱粉に作用させる
と、マルトースを主成分とする糖化物を生成する
が、マルトース以上のマルトオリゴ糖に作用させ
ると、より小さい分子量のマルトオリゴ糖と、よ
り大きい分子量の、種々のマルトオリゴ糖を生成
する。すなわち、分解と糖転移を同時に行う、新
規な糖転移酵素であることを認めた。例えば、本
酵素を、マルトトリオース（G3）に作用させた
ときは、グリコシル基がα−１、４−グルコシド
結合で結合した、マルトース（G2）、マルトテト
ラオース（G4）、マルトペンタオース（G5）、マ
ルトヘキサオース（G6）など、一連のマルトオ
リゴ糖を生成する。第１図は、本酵素を１％のマ
ルトトリオースに作用させて得られる生成糖のう
ち、マルトヘプタオース（G7）までの組成量を
示す液体クロマトグラムであるが、更に、高分子
量のマルトオリゴ糖も生成された。よく似た作用
をする酵素として、４−α−Ｄ−グルカノトラン
スフエラーゼ（EC2.4.1.25）が知られているが、
この酵素とは、下記に詳述するように、作用、温
度耐性、分子量などの性質において、大きな差異
が認められた。本発明はこの知見に基づいてなさ
れたものである。（構成）本発明は、糖転移酵素Ａを生産するバシルス属
菌を培養し、培養物から糖転移酵素Ａを採取する
ことを特徴とする糖転移酵素Ａの製造方法に関す
るものである。以下に、本発明の方法を更に具体的に説明す
る。本発明の糖転移酵素Ａは以下に記載する酵素的
性質を持つている。 (1) 作用可溶性澱粉、アミロース、アミロペクチンな
どに作用させると、主としてマルトースを生成
するが、この他、マルトトリオース、マルトテ
トラオース、マルトペンタオース、マルトヘキ
サオースなど、一連のマルトオリゴ糖を生成す
る。しかし、グルコースの生成は少ない。ま
た、マルトトリオース以上のマルトオリゴ糖に
作用させても、マルトース以上の一連のマルト
オリゴ糖を生成すが、グルコースの生成は少な
い。第１図に、本酵素を１％のマルトトリオース
に作用させた場合の生成糖のうち、マルトヘプ
タオースまでの糖組成を示したが、これよりも
更に分子量の大きいオリゴ糖も生成される。ま
た、マルトテトラオース以上のマルトオリゴ糖
に作用させたときもよく似た組成の分解物を生
成する。すなわち、本酵素は分解と同時に転移
作用により、基質分子から、分子量のより小さ
いマルトオリゴ糖と、分子量のより大きいマル
トオリゴ糖を生成するという、いわゆる基質分
子の再配分を行う糖転移酵素の一種である。よ
く似た作用をする酵素として、４−α−Ｄ−グ
ルカノトランスフエラーゼ（EC2.4.1.25）が知
られているが、この酵素の場合、マルトトリオ
ースを基質としたとき、グルコースが生成する
｛活性測定法として利用されている（赤堀四郎
他編、酵素ハンドブツク、第272ページ、朝倉
書店）｝。しかし、本発明の酵素の場合、第１図
から明らかなように、グルコースの生成は少な
く、そして、反応初期に、主として、マルトー
スとマルトテトラオースが生成する。このこと
は、本酵素による転移がグルコシル単位で多く
おこつていることを示している。また、本酵素
は、弱いながら、マルトースに対しても作用し
て、マルトースよりも分子量の大きい種々のマ
ルトオリゴ糖を生成する。また、本酵素を、マ
ルトペンタオース（G5）に作用させたとき、
反応の比較的初期から、マルトテトラオース
（G4）、次いで、マルトトリオース（G3）、マ
ルトース（G2）と、転移物として、マルトヘ
キサオース（G6）、次いで、マルトヘプタオー
ス（G7）、マルトオクタオース（G8）などが
生成することから、グルコシル基の他に、マル
トシル基やマルトトリオシル基単位でも転移す
ると考えられる。また、高分子の可溶性澱粉に
作用して、主としてマルトースを生成すること
や、プルランなどにも作用して還元力を増加す
ることなどから、水も受容体になると考えられ
る。これに対し、バシルス・ズブチルスの生産す
る４−α−Ｄ−グルカノトランスフエラーゼ
は、マルトシルからマルトペンタオシル単位で
転移すると報告されている｛Journal of
Biological Chemistry、243、4732（1968）｝。 (2) 作用PHおよび最適作用PH PH約３〜約９の広い範囲で作用し、最適作用
PHは５付近に認められた（第３図、１％可溶性
澱粉、0.1M酢酸緩衝液または燐酸緩衝液、１
×10^-2M塩化カルシウムの下で、50℃で、１時
間反応）。 (3) 作用温度範囲および最適作用温度約80℃の温度まで作用し、最適作用温度は約
60℃に認められた｛第４図、１％可溶性澱粉、
2.5×10^-2M酢酸緩衝液（PH５）の下で、30分
間反応｝。 (4) 熱安定性酵素水溶液を50、55、60℃で、それぞれ10分
間加熱処理してのち、残存活性を測定した。そ
の結果、それぞれ、約０％、約30％、約80％失
活した。50℃では、30分間加熱しても殆ど失活
が認められなかつた。一方、バシルス・ズブチ
リスの４−α−Ｄ−グルカノトランスフエラー
ゼは熱に不安定で、50℃、15分の加熱で、約50
％失活すると報告されている｛Journal of
Biological Chemistry、243、4732、（1968）｝。 (5) PH安定性 PH約4.5〜約７で安定であつた（5x10^-2M酢
酸緩衝液またはトリス緩衝液の下で、室温で３
時間放置後、残存活性を測定）。 (6) 安定化剤および賦活剤カルシウムおよび鉄イオンの存在は酵素を安
定化する。またカルシウム・イオンは酵素活性
を増加する。前記バシルス・ズブチリスの酵素
ではこのような性質は認められていない
｛Journal of Biological Chemistry、243、
4732（1968）｝。 (7) 阻害剤 1x10^-3Mの銅、水銀、銀イオンにより強く阻
害される。 (8) 分子量セフアデツクスＧ−200を用いたゲルろ過法
により測定した分子量は約50万であつた。前
記、バシルス・ズブチリスの酵素は、７〜８万
と報告されている。｛Journal of Biological
Chemistry、243、4732（1968）｝。 (9) 精製方法本酵素は、培養上澄に硫酸アンモニウムを70
％飽和になるように加え、生成する沈澱区分を
遠心分離により集め、透析、濃縮後、セフアデ
ツクスＧ−200カラムクロマトグラフイー、同
カラムによる再クロマトグラフイーにより、均
一まで生成することができる。 (10) 力価測定法 1x10^-2M塩化カルシウムを含む0.1M酢酸緩
衝液（PH5.0）に溶解した２％可溶性澱粉（ま
たはプルラン）溶液0.5mlに、適量の酵素を加
え、蒸溜水で全量１mlとし、60℃で反応させ
る。この条件で、１分間に1μMのグルコース
に相当する還元力を生成する酵素量を1A単位
（プルランを基質とするとき1P単位）とした。
精製酵素の場合、Ｐ単位／Ａ単位は、約1/4で
ある。（発明な効果）第１表は、30％濃度のデキストリンを、PH4.5、
温度60℃で、市販アスペルギルス・ニガーのグル
コアミラーゼを用いて、72時間糖化したときの、
グルコース収量に対する、本発明の酵素および市
販バシルス属プルラナーゼの効果を示している。

【表】表から明らかなように、グルコアミラーゼ単独
では、95.2％のグルコースしか得られなかつた
が、本発明の酵素を存在させたときは、97.1％の
収量でグルコースが得られた。この収量は、プル
ラナーゼを用いた場合の収量（97.2％）とほぼ同
じあつた。しかし、本発明の酵素の場合、二糖類
（G2）はプルラナーゼの場合よりも少し多いが、
三糖類（G3）以上のオリゴ糖はプルラナーゼの
場合よりも少ないという特徴がみられた。糖化液中に高分子量のオリゴ糖が存在すると、
糖液の濾過性が悪くなり、また濁りを生ずる原因
になるので、高分子のオリゴ糖はできるだけ少な
いことが望ましい。従つて、本発明の酵素はグル
コースの増収という効果のほかに、分子量の大き
いオリゴ糖の少ない糖液が得られるという利点が
ある。第２図はグルコアミラーゼ単独および本発明の
酵素を併用したときの液化澱粉糖化の時間経過を
示しているが、図から明らかなように、本酵素が
存在すると糖化が促進されるという効果も認めら
れた。このことは、グルコアミラーゼを節減でき
ることを意味している。グルコアミラーゼによる澱粉糖化に本発明の酵
素が果たす役割は、次ぎのように理解することが
できる。すなわち、グルコアミラーゼの基質に対
する親和性（反応性）は、グルコースの重合度に
より大きく影響されることが知られており、分子
量の小さい基質よりも、大きい基質に対して親和
性が大きい。グルコアミラーゼによる澱粉糖化の
後期には、グルコアミラーゼによつて分解し難い
種々の重合度のオリゴ糖が生成するが、本発明の
酵素は、分解と転移作用を通じて、グルコアミラ
ーゼの分解し易い基質を供給することにより、分
解率が向上し、グルコースが増収できるものと考
えられる。したがつて、このような転移作用を持
つ酵素は、本発明で例示した酵素と同様に、グル
コースの増収を達成することができる。しかし、
このような転移作用のない、例えば、バシルス・
ズブチリス（Bacillus subtilis）、バシルス・リ
ケニフオルミス（Bacillus licheniformis）やア
スペルギルス・オリーゼ（Aspergillus oryzae）
などのα−アミラーゼを用いても、グルコースの
増収効果は認められなかつた。一方、プルラナーゼによる糖化反応の促進は、
グルコアミラーゼの弱い分岐結合（α−１、６−
グルコシド結合）切断能を補うことにあると考え
られているので、本発明の酵素とはグルコースの
増収機構が異なつている。したがつて、両者の澱
粉糖化物の糖組成は、当然、異なると考えられ
る。本発明の酵素を生産する例示菌として、土壌中
より分離したバシルス・メガテリウム（Bacillus
megaterium）を挙げる。本菌株は下記の酵素的
性質を持つている。 (1) 形態：桿菌、運動性あり (2) 芽胞：胞子嚢；非膨出、胞子；楕円形、位
置；中立〜亜端立 (3) グラム染色：＋ (4) カタラーゼ：＋ (5) Ｖ−Ｐ反応：− PH5.0 (6) 嫌気下での生育：− (7) 澱粉分解：＋ (8) ゼラチン液化：＋ (9) 卵黄反応：− (10) グルコースより酸生産：＋ (11) グルコースよりガス生産：− (12) PH5.7での生育：＋ (13) 50℃での生育：− (14) クエン酸塩の利用：＋ (15) ５％NaCl存在下での生育：＋ (16) 硝酸塩還元：− 以上の菌学的性質について、Bergey's
Manual of Determinative Bacteriologyの８版
（The William ＆ Wilkins Co.、1974）を参
照し、本菌をバシルス・メガテリウム（Bacillus
megaterium）と固定した。本菌は工業技術院微
生物工業技術研究所ににFERM BP−1672とし
て寄託されている。本菌株を用いて、本発明の酵素を生産するに
は、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・
ステイープ・リカーのような有機窒素源、尿素、
塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、燐酸アン
モニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムのよう
な無機窒素化合物、そして、炭素源としては、可
溶性澱粉、デキストリン、砂糖、マルトース、グ
ルコースなどが使用される。この他、少量のリン
酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などを添加
した培地をPH５〜８に調整し、通常、30℃で１〜
４日間、好気的に培養される。酵素は殆ど菌体外
に生産されるので、培養後、濾過または遠心分離
により除菌し、上澄液を濃縮するか、または、硫
酸ナトリウム、硫酸アンモニウムなどで塩析沈澱
させるか、または、メタノール、エタノール、プ
ロパノール、イソプロパノール、アセトンのよう
な有機溶剤を加えて、酵素を沈澱させ回収する。本菌株は、本発明の酵素以外に、マルトース生
成アミラーゼを生産する。この酵素は、グルコー
スの増収作用は持たず、本発明の酵素の活性測定
においては妨害となるので、培養液または粗酵素
の場合、プルランを基質として用いると、本発明
の酵素を正確に測定することができる。本発明の酵素をグルコアミラーゼと併用して、
澱粉を糖化する反応は、通常、液化澱粉濃度30〜
35（Ｗ／Ｖ）％、PH４〜５、温度55〜60℃で、２
〜４日間行われる。次に、実施例により本発明の詳細を説明する。実施例１ポリペプトン２％、可溶性澱粉２％、
K₂HPO₄0.3％、MgSO₄・7H₂O0.1％からなる培
地（PH５）300mlを２リツトル容三角フラスコに
入れ、常法により、殺菌後、バシルスメガテリウ
ム（Bacillus megaterium）FERM BP−1672接
種し、30℃で、４日間振盪培養した。培養後、遠心分離した上澄液について、酵素の
生成量を測定した結果は、培地ml当たり1.5P単位
であつた。該培養上澄に、硫酸アンモニウムを70％飽和に
なるように加え、生成した沈澱を遠心分離により
集め蒸溜水に溶解し、蒸溜水に対し透析したもの
を、以下の糖化実験に使用した。実施例２基質として市販デキストリン（日本資料(株)製、
NSD DE約13）、グルコアミラーゼは日本フイ
ン・シユガー(株)から市販されているアスペルギル
ス・ニガー（Aspergillus niger）起源のものを
用いた。また、プルラナーゼはノボ・ジヤパン(株)
から販売されているバシルス・アシドプルリテイ
カス（Bacillus acidopululiticus）起源のものを
使用した。反応液の組成を、第２表に示す。

【表】それぞれ、全量10mlとし、PH4.5、60℃で65よ
び72時間糖化した（本酵素使用の試料３において
は、CaCl₂を1x10^-2M量添加した｝。糖化液の糖
組成は高速液体クロマトグラフ法により定量し
た。得られた結果を第３表に示す。

【表】表から明らかなように、本酵素を使用した場
合、無添加の場合に比べグルコースの収量が約２
％増加した。そして、この増加はプルラナーゼを
用いと場合とほぼ同じであつた。本酵素を用いた
場合、プルラナーゼ使用の場合に比べ、二糖類は
少し多いが、三糖類以上のものは少なかつた。実施例３トウモロコシ澱粉を細菌α−アミラーゼで液化
した液化澱粉（DE約13）を固形分として３ｇ、
グルコアミラーゼを固形分当たり0.1％、および
これに実施例１で調製した酵素0.75単位、
CaCl₂1x10^-2M添加したもの、それぞれ、全量10
mlとし、PH4.5、60℃で反応させた。経時的に一
定量をとり、液体クロマトグラフ法により、生成
したグルコースを定量した。結果を第２図に示
す。図がら明らかなように、本酵素が存在すると
き、存在しない場合に比べ、糖化反応が促進され
た。また、グルコースも高い収量で得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、転移酵素Ａを１％マルト・トリオー
スに作用させたときの生成物の糖組成を示してい
る。第２図は、グルコアミラーゼによる液化澱粉
糖化において、転移酵素Ａの影響を示している。
第３図は、転移酵素Ａの最適作用PHを示してい
る。第４図は、転移酵素Ａの最適作用温度を示し
ている。

Claims

【特許請求の範囲】１下記の酵素的性質を有する糖転移酵素Ａを生
産するバシルス属に属する微生物を培養し、培養
物から前記糖転移酵素Ａを採取することを特徴と
する糖転移酵素Ａの製造法。 (1) マルトース以上のマルトオリゴ糖に作用させ
たとき、加えた基質より重合度の大きな一連の
マルトオリゴ糖を生成し、かつグルコースの生
成量が少ない。 (2) マルトース以上のマルトオリゴ糖の混合物に
作用させたとき、基質分子間の再配分を行い重
合度の高い一連のマルトオリゴ糖を生成する。 (3) 最適作用PHが５付近である。 (4) 最適作用温度が約60℃である。 (5) 50℃30分間の熱処理で安定である。 (6) カルシウムおよび鉄イオンの存在で安定化さ
れる。 (7) 銅、水銀、銀イオンにより阻害される。 (8) 分子量が約50万である。