JPH079428B2 - 免疫分析方法 - Google Patents
免疫分析方法Info
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- JPH079428B2 JPH079428B2 JP60090938A JP9093885A JPH079428B2 JP H079428 B2 JPH079428 B2 JP H079428B2 JP 60090938 A JP60090938 A JP 60090938A JP 9093885 A JP9093885 A JP 9093885A JP H079428 B2 JPH079428 B2 JP H079428B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- liposome
- immunoassay
- complement
- test substance
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
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- Health & Medical Sciences (AREA)
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- Epidemiology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔発明の技術分野〕 本発明は、試料中に存在する微量の被検物質を特異的に
定量分析するリポソーム免疫分析用試薬を用いた免疫分
析方法に関する。
定量分析するリポソーム免疫分析用試薬を用いた免疫分
析方法に関する。
近年、ガンに関する研究が進展してくるにつれて各種の
腫瘍マーカーが見出されるようになった。例えばα−フ
ェトプロテイン（AFP）、ガン胎児性抗原（CEA）、塩基
性フェトプロティン（BFP）および膵ガン胎児性抗原（P
OA）などがその代表例として挙げることができる。これ
らの腫瘍マーカーの濃度は正常人の場合、非常に低い
（例えば、CEAの場合：数ng/ml以下）。一方、腫瘍患者
の場合には正常人の10倍程度以上の値を示すことが多
い。いずれにしても、腫瘍マーカーの分析定量には、非
常に高い検出感度が要求される。
腫瘍マーカーが見出されるようになった。例えばα−フ
ェトプロテイン（AFP）、ガン胎児性抗原（CEA）、塩基
性フェトプロティン（BFP）および膵ガン胎児性抗原（P
OA）などがその代表例として挙げることができる。これ
らの腫瘍マーカーの濃度は正常人の場合、非常に低い
（例えば、CEAの場合：数ng/ml以下）。一方、腫瘍患者
の場合には正常人の10倍程度以上の値を示すことが多
い。いずれにしても、腫瘍マーカーの分析定量には、非
常に高い検出感度が要求される。
この要求を満すために、従来は、放射性物質で標識化し
た抗原または抗体を用いる放射線免疫分析法（RIA）が
開発された。しかしながら、RIAは取扱いが面倒で廃棄
処理も問題になる。そこで、放射性物質の代りに酵素や
螢光物質など種々の物質で標識化した抗原あるいは抗体
を使用する免疫分析法が提案されたが、これらにおいて
も遊離抗体と結合抗体を何らかの方法で分離しなければ
ならないという欠点を有していた。また、Rosent-thal
A・F,Vargas,M.G.and Klass C.S.（1976）Clin.Chem.2
2,1899に発表されたEMIT法は、分離工程の不要な均一系
で測定できる画期的な手法であるが、原理的に高分子量
のタンパク質抗原あるいは抗体には適用できない。
た抗原または抗体を用いる放射線免疫分析法（RIA）が
開発された。しかしながら、RIAは取扱いが面倒で廃棄
処理も問題になる。そこで、放射性物質の代りに酵素や
螢光物質など種々の物質で標識化した抗原あるいは抗体
を使用する免疫分析法が提案されたが、これらにおいて
も遊離抗体と結合抗体を何らかの方法で分離しなければ
ならないという欠点を有していた。また、Rosent-thal
A・F,Vargas,M.G.and Klass C.S.（1976）Clin.Chem.2
2,1899に発表されたEMIT法は、分離工程の不要な均一系
で測定できる画期的な手法であるが、原理的に高分子量
のタンパク質抗原あるいは抗体には適用できない。
ところで、Haxby,J.A,Kinsky,C.B.and kinsky S.C.（19
68）Biochemistry,61 300で、脂溶性の抗原を膜内に取
り込みグルコースを封入したリポソームを調製し、抗原
抗体反応によるリポソームの破壊に伴うグルコースの流
出数を測定することにより、抗体の定量を行う手法が発
表された。
68）Biochemistry,61 300で、脂溶性の抗原を膜内に取
り込みグルコースを封入したリポソームを調製し、抗原
抗体反応によるリポソームの破壊に伴うグルコースの流
出数を測定することにより、抗体の定量を行う手法が発
表された。
しかしながら、腫瘍マーカーを測定するためには、マー
カー自身あるいはこれらのマーカーに対する抗体、すな
わちタンパク質である免疫グロブリンをリポソーム上に
担持させねばならない。ところが、現在まで、脂溶性の
タンパク質を担持したリポソームを用いることは可能で
あったが、親水性のタンパク質を担持したリポソームを
用いる抗原または抗体の免疫分析法は報告されていな
い。それは、親水性のタンパク質をリポソームに担持せ
しめる技術が確立されていなかったからである。
カー自身あるいはこれらのマーカーに対する抗体、すな
わちタンパク質である免疫グロブリンをリポソーム上に
担持させねばならない。ところが、現在まで、脂溶性の
タンパク質を担持したリポソームを用いることは可能で
あったが、親水性のタンパク質を担持したリポソームを
用いる抗原または抗体の免疫分析法は報告されていな
い。それは、親水性のタンパク質をリポソームに担持せ
しめる技術が確立されていなかったからである。
また、特開昭56-132564号“免疫分析用生成物および方
法”においては、抗原あるいは抗体を担持し内部に酵素
を封入したリポソームを用いて免疫分析を行う方法が開
示されているが、そこでは、タンパク質の担持方法とし
てグルタルアルデヒド等の二官能性架橋試薬を用いる方
法を提案している。本発明者らの研究によると、このよ
うな架橋試薬で抗体をリポソームに担持すると、一般に
抗体の活性が低下し、抗原抗体反応に伴うリポソームの
破壊が引起されなくなることが判明した。
法”においては、抗原あるいは抗体を担持し内部に酵素
を封入したリポソームを用いて免疫分析を行う方法が開
示されているが、そこでは、タンパク質の担持方法とし
てグルタルアルデヒド等の二官能性架橋試薬を用いる方
法を提案している。本発明者らの研究によると、このよ
うな架橋試薬で抗体をリポソームに担持すると、一般に
抗体の活性が低下し、抗原抗体反応に伴うリポソームの
破壊が引起されなくなることが判明した。
更に、従来の免疫分析技術は、総じて、分析に長時間を
要し、しかも大量の試料を自動的に測定することができ
ないという欠点を有していた。
要し、しかも大量の試料を自動的に測定することができ
ないという欠点を有していた。
本発明は、試料中の微量な被検物質を高精度及び高感度
に分析するための免疫分析方法を提供することを目的と
する。
に分析するための免疫分析方法を提供することを目的と
する。
本発明者らは、上記目的を達成するべく鋭意研究を重ね
た結果、補体活性により溶解作用を受けるリポソーム上
に活性を低下させることなく被検物質に対する第１抗体
の少なくとも一部を固定化し、さらにリポソーム内に標
識物質を封入してなるリポソーム免疫分析用試薬を、予
め一定時間、被検物質を含む試料と反応させ、その後に
被検物質に対する第２抗体及び補体を作用させることに
より本発明の目的が達成できることを見出した。尚この
場合第１抗体は酵素処理により補給結合部位を除去して
置く。
た結果、補体活性により溶解作用を受けるリポソーム上
に活性を低下させることなく被検物質に対する第１抗体
の少なくとも一部を固定化し、さらにリポソーム内に標
識物質を封入してなるリポソーム免疫分析用試薬を、予
め一定時間、被検物質を含む試料と反応させ、その後に
被検物質に対する第２抗体及び補体を作用させることに
より本発明の目的が達成できることを見出した。尚この
場合第１抗体は酵素処理により補給結合部位を除去して
置く。
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明の免疫分析方法に用いるリポソーム免疫分析用試
薬におけるリポソームは、リン脂質及び糖脂質の少なく
とも一方とコレステロールとから構成される。これらの
構成比としてはリン脂質及び糖脂質に対してコレステロ
ールが10〜500モル％含まれることが安定なリポソーム
を得る上で好ましい。そして、リン脂質中の脂肪酸残基
は、炭素原子数が12〜18であることが好ましく、更には
偶数であることがより好ましい。
薬におけるリポソームは、リン脂質及び糖脂質の少なく
とも一方とコレステロールとから構成される。これらの
構成比としてはリン脂質及び糖脂質に対してコレステロ
ールが10〜500モル％含まれることが安定なリポソーム
を得る上で好ましい。そして、リン脂質中の脂肪酸残基
は、炭素原子数が12〜18であることが好ましく、更には
偶数であることがより好ましい。
リポソーム内に封入される標識物質は、親水性であっ
て、リポソーム外に溶出された際に定量可能な物質でな
ければならない。かかる物質としては、例えば、高濃度
では自己消光により螢光は示さないが、低濃度（10-3M
以下）で非常に強い螢光を発するカルボキシフルオレセ
インのような螢光性化合物；リポソーム外で酸化反応に
より発光するルミノールやルシフェリンのような発光性
化合物；可視部あるいは紫外部に特異的な吸収帯を有す
る吸光性化合物（水溶性色素等）；酸化酵素の作用によ
り分解され酸素消費あるいは過酸化水素生成をもたらす
グルコース及びシュークロースなどの糖類；テトラペン
チルアンモニウムのような比較的大きなイオン性化合
物；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）の
ような補酵素類；メチルビオロゲンを初めとするラジカ
ル化合物などが望ましい。これらの化合物は、検出方
法、感度及びリポソームの安定性等の因子を勘案した上
で、適宜に選択される。
て、リポソーム外に溶出された際に定量可能な物質でな
ければならない。かかる物質としては、例えば、高濃度
では自己消光により螢光は示さないが、低濃度（10-3M
以下）で非常に強い螢光を発するカルボキシフルオレセ
インのような螢光性化合物；リポソーム外で酸化反応に
より発光するルミノールやルシフェリンのような発光性
化合物；可視部あるいは紫外部に特異的な吸収帯を有す
る吸光性化合物（水溶性色素等）；酸化酵素の作用によ
り分解され酸素消費あるいは過酸化水素生成をもたらす
グルコース及びシュークロースなどの糖類；テトラペン
チルアンモニウムのような比較的大きなイオン性化合
物；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）の
ような補酵素類；メチルビオロゲンを初めとするラジカ
ル化合物などが望ましい。これらの化合物は、検出方
法、感度及びリポソームの安定性等の因子を勘案した上
で、適宜に選択される。
本発明の免疫分析方法に用いられるリポソーム免疫分析
用試薬は、このようなリポソーム及び標識物質から例え
ば次の如き方法で製造される。まず、所望の脂質と架橋
剤とを溶媒中で反応させることにより、リポソーム上に
固定化される抗体あるいは抗体の一部と結合し得る官能
基を脂質分子に導入して官能性脂質とする。次いで、得
られた官能性脂質とコレステロール及び必要であれば他
の脂質の適当量をフラスコに入れ、溶媒を加えて溶解・
混合させた後、溶媒を留去し、吸引乾燥する。しかる
後、壁面に薄膜が形成されたフラスコ内に所定の標識物
質の水溶液を加え、密栓をして振とうし、リポソームの
懸濁液を得る。
用試薬は、このようなリポソーム及び標識物質から例え
ば次の如き方法で製造される。まず、所望の脂質と架橋
剤とを溶媒中で反応させることにより、リポソーム上に
固定化される抗体あるいは抗体の一部と結合し得る官能
基を脂質分子に導入して官能性脂質とする。次いで、得
られた官能性脂質とコレステロール及び必要であれば他
の脂質の適当量をフラスコに入れ、溶媒を加えて溶解・
混合させた後、溶媒を留去し、吸引乾燥する。しかる
後、壁面に薄膜が形成されたフラスコ内に所定の標識物
質の水溶液を加え、密栓をして振とうし、リポソームの
懸濁液を得る。
一方、リポソームに固定化される抗体あるいは抗体の一
部は必要ならば架橋剤により架橋基を導入した後、還元
剤（例えばジチオトレイトール;DTT）で処理して修飾す
る。これら、リポソーム懸濁液と必要に応じて修飾され
た抗体あるいは抗体の一部とを適当な緩衝液中で反応せ
しめることにより、本発明の免疫分析法に用いるリポソ
ーム免疫分析用試薬が得られる。
部は必要ならば架橋剤により架橋基を導入した後、還元
剤（例えばジチオトレイトール;DTT）で処理して修飾す
る。これら、リポソーム懸濁液と必要に応じて修飾され
た抗体あるいは抗体の一部とを適当な緩衝液中で反応せ
しめることにより、本発明の免疫分析法に用いるリポソ
ーム免疫分析用試薬が得られる。
上記製造法における架橋剤としては、例えば、Ｎ−サク
シンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネー
ト（SPDP）、Ｎ−サクシンイミジル４−（ｐ−マレイミ
ドフェニル）ブチレート（SMPB）、Ｎ−サクシンイミジ
ル４−（ｐ−マレイミドフェニル）アセテート（SMP
A）、Ｎ−サクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェ
ニル）プロピオネート（SMPP）、Ｎ−（γ−マレイミド
ブチリルオキシ）サクシンイミド（GMBS）、Ｎ−（ε−
マレイミドカプロイルオキシ）サクシンイミド（EMCS）
及びジサクシンイミジルスペレート（DSS）が挙げられ
る。
シンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネー
ト（SPDP）、Ｎ−サクシンイミジル４−（ｐ−マレイミ
ドフェニル）ブチレート（SMPB）、Ｎ−サクシンイミジ
ル４−（ｐ−マレイミドフェニル）アセテート（SMP
A）、Ｎ−サクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェ
ニル）プロピオネート（SMPP）、Ｎ−（γ−マレイミド
ブチリルオキシ）サクシンイミド（GMBS）、Ｎ−（ε−
マレイミドカプロイルオキシ）サクシンイミド（EMCS）
及びジサクシンイミジルスペレート（DSS）が挙げられ
る。
例えば、SPDPは、次式： で示され、温和な条件下で反応して、第一アミノ基を有
する化合物どうしを結合する架橋剤である。
する化合物どうしを結合する架橋剤である。
SMPBは、次式： で示され、SPDPと同様な反応で抗体を固定化できるが、
最終生成物中に−Ｓ−Ｓ−結合を含まず（−Ｓ−結合の
み）、血清などの還元的雰囲気下でも安定である。
最終生成物中に−Ｓ−Ｓ−結合を含まず（−Ｓ−結合の
み）、血清などの還元的雰囲気下でも安定である。
本発明の免疫分析方法に用いる補体は格別限定されない
が、通常補体価の高いモルモット血清が好ましい。しか
し場合に応じてウサギ，マウス，ヒト等の血清を使用し
てもよい。
が、通常補体価の高いモルモット血清が好ましい。しか
し場合に応じてウサギ，マウス，ヒト等の血清を使用し
てもよい。
また本発明で用いられる被検物質に対する第２抗体の動
物種は、特に限定されないが、補体を取り込み易いウサ
ギがより好ましいが、この第２抗体は補体結合部位を有
した形状でなければならない。一方、リポソーム上に固
定化される抗体は、酵素処理で補体結合部位を除去した
場合にはその抗体の動物種は特に限定されないが、除去
しない場合にはモルモット補体に対して安定なヤギの抗
体が望ましい。
物種は、特に限定されないが、補体を取り込み易いウサ
ギがより好ましいが、この第２抗体は補体結合部位を有
した形状でなければならない。一方、リポソーム上に固
定化される抗体は、酵素処理で補体結合部位を除去した
場合にはその抗体の動物種は特に限定されないが、除去
しない場合にはモルモット補体に対して安定なヤギの抗
体が望ましい。
このようにして得られたリポソーム免疫分析用試薬を用
いて行なう本発明による免疫分析方法で定量が可能な被
検物質は、腫瘍マーカー（前述のAFP,BFP,CEA,及びPOA
等）免疫グロブリン（IgA,IgE,IgG及びIgM等）、ホルモ
ン（インシュリン，T3等及び薬物等の抗原があげられ、
さらにはそれらに対応する抗体も本発明の免疫分析方法
が適応できる被検物質であって、その対象は広範囲に亘
る。これらの被検物質は、以下のような過程で定量分析
が行われる。
いて行なう本発明による免疫分析方法で定量が可能な被
検物質は、腫瘍マーカー（前述のAFP,BFP,CEA,及びPOA
等）免疫グロブリン（IgA,IgE,IgG及びIgM等）、ホルモ
ン（インシュリン，T3等及び薬物等の抗原があげられ、
さらにはそれらに対応する抗体も本発明の免疫分析方法
が適応できる被検物質であって、その対象は広範囲に亘
る。これらの被検物質は、以下のような過程で定量分析
が行われる。
まず、被検物質が適宜希釈されて試料とされる。この試
料にリポソーム免疫分析用試薬を加えることにより、被
検物質に対する抗体の少なくとも一部分が固定化された
前記リポソーム免疫分析用試薬とさらに別に加えられた
被検物質に対する第２抗体とで被検物質が挾みこまれ、
そこに補体が作用することで、リポソーム免疫分析用試
薬内に封入されていた標識物質が遊出する。この標識物
質の遊出は、被検物質の濃度に対応して生起するため、
遊出した標識物質を測定することにより被検物質の定量
分析を行なうことができる。
料にリポソーム免疫分析用試薬を加えることにより、被
検物質に対する抗体の少なくとも一部分が固定化された
前記リポソーム免疫分析用試薬とさらに別に加えられた
被検物質に対する第２抗体とで被検物質が挾みこまれ、
そこに補体が作用することで、リポソーム免疫分析用試
薬内に封入されていた標識物質が遊出する。この標識物
質の遊出は、被検物質の濃度に対応して生起するため、
遊出した標識物質を測定することにより被検物質の定量
分析を行なうことができる。
そして実際の定量分析においては、あらかじめ既知の濃
度の被検物質を用いて検量線を作製しておき、これをも
とにして同じ条件で未知の濃度の被検物質との反応によ
り流出した標識物質を測定して、定量分析を行なう。
度の被検物質を用いて検量線を作製しておき、これをも
とにして同じ条件で未知の濃度の被検物質との反応によ
り流出した標識物質を測定して、定量分析を行なう。
本発明者らは、このような分析過程において、あらかじ
めリポソーム免疫分析用試薬を充分に被検物質と反応さ
せた後に、第２抗体及び補体を加えることで分析用試薬
としての感度が飛躍的に数百倍も向上することを見出し
たのである。
めリポソーム免疫分析用試薬を充分に被検物質と反応さ
せた後に、第２抗体及び補体を加えることで分析用試薬
としての感度が飛躍的に数百倍も向上することを見出し
たのである。
これより、リポソーム免疫分析用試薬と被検物質との反
応を充分に進行させないままで、第２抗体及び補体をリ
ポソーム免疫分析用試薬とほぼ同時に加えることによ
り、標識物質を流出させて定量する方法では不可能であ
った微量な被検物質の検出定量が、本発明の分析方法に
よりはじめて可能になった。このリポソーム免疫分析用
試薬と被検物質との充分な反応に要する時間は、それぞ
れ濃度被検物質の種類、リポソームの特性、反応条件、
さらにはリポソーム免疫分析用試薬に固定化された抗体
の種類、純度、固定化形態等によって異なる。よって、
個々の場合に応じてあらかじめ特定の濃度に調製された
被検物質と同種の物質を含む試料を用いて予備測定を行
なうことにより、リポソーム免疫分析用試薬と被検物質
との最適反応時間等は適宜規定される。
応を充分に進行させないままで、第２抗体及び補体をリ
ポソーム免疫分析用試薬とほぼ同時に加えることによ
り、標識物質を流出させて定量する方法では不可能であ
った微量な被検物質の検出定量が、本発明の分析方法に
よりはじめて可能になった。このリポソーム免疫分析用
試薬と被検物質との充分な反応に要する時間は、それぞ
れ濃度被検物質の種類、リポソームの特性、反応条件、
さらにはリポソーム免疫分析用試薬に固定化された抗体
の種類、純度、固定化形態等によって異なる。よって、
個々の場合に応じてあらかじめ特定の濃度に調製された
被検物質と同種の物質を含む試料を用いて予備測定を行
なうことにより、リポソーム免疫分析用試薬と被検物質
との最適反応時間等は適宜規定される。
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、こ
れらの実施例は本発明の範囲を何ら制限するものではな
い。
れらの実施例は本発明の範囲を何ら制限するものではな
い。
実施例1. ヤギ抗−ヒト免疫グロブリンIgG抗体を固定化したリポ
ソーム免疫分析用試薬を用いたヒトIgGの測定を行なっ
た。
ソーム免疫分析用試薬を用いたヒトIgGの測定を行なっ
た。
まずヤギ抗−ヒトIgG抗体固定化リポソーム免疫分析用
試薬の調製をした。この時に用いた試薬はジパルミトイ
ルホスファチジルコリン（DPPC）、コレステロール，ジ
バルミトイルホスファチジルエタノールアミン（DPPE）
およびジチオトレイトール（DTT）がシグマ社製であ
り、Ｎ−サクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）
プロピオネート（SPDP）およびセファテックスG-25ファ
インはファルマシア社製であった。他の試薬は市販品
（特級）を精製せずに使用した。なお、水は全てイオン
交換水を用いた。
試薬の調製をした。この時に用いた試薬はジパルミトイ
ルホスファチジルコリン（DPPC）、コレステロール，ジ
バルミトイルホスファチジルエタノールアミン（DPPE）
およびジチオトレイトール（DTT）がシグマ社製であ
り、Ｎ−サクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）
プロピオネート（SPDP）およびセファテックスG-25ファ
インはファルマシア社製であった。他の試薬は市販品
（特級）を精製せずに使用した。なお、水は全てイオン
交換水を用いた。
そして以下に示す工程により、リポソーム免疫分析用試
薬の調製を行なった。
薬の調製を行なった。
ａ）ジチオピリジル−DPPE（DTP-DPPE）の調製密栓付三
角フラスコに70mgのDPPEを分取し、25mlのクロロホルム
／メタノール（5:1）溶液に溶解し、60μｌのトリエタ
ノールアミン及び50mgのSPDPを添加後窒素置換した。室
温で１時間反応させた後、ロータリーエバポレーターで
溶媒を除去した。乾燥物を5mlのクロロホルム／メタノ
ール（10:1）に溶解させ、シリカゲルカラムを用いて精
製した。生成物画分を回収し、エバポレーターで約5ml
まで濃縮した。収率は80〜95％であった。保存は窒素封
入下−20℃で行った。
角フラスコに70mgのDPPEを分取し、25mlのクロロホルム
／メタノール（5:1）溶液に溶解し、60μｌのトリエタ
ノールアミン及び50mgのSPDPを添加後窒素置換した。室
温で１時間反応させた後、ロータリーエバポレーターで
溶媒を除去した。乾燥物を5mlのクロロホルム／メタノ
ール（10:1）に溶解させ、シリカゲルカラムを用いて精
製した。生成物画分を回収し、エバポレーターで約5ml
まで濃縮した。収率は80〜95％であった。保存は窒素封
入下−20℃で行った。
ｂ）リポソームの調製 使用する脂質はすべてクロロホルムまたはクロロホルム
／メタノール（2/1）に溶解した。まず、5mMDPPC（200
μｌ）、10mMコレステロール（100μｌ）及び1mM DTP-D
PPE（50μｌ）を10mlのナシ型フラスコに入れ、更に2ml
のクロロホルムを加えて良く混合した。水浴中（約50
℃）でロータリーエバポレーターにより溶媒を除去し
た。再び2mlのクロロホルムを添加し、充分攪拌後、再
度ロータリーエバポレーターにより溶媒を蒸発させた。
この操作を数回繰り返すと、フラスコ壁面に薄膜が形成
された。フラスコをデシケーター中に移し真空ポンプで
約１時間吸引し、溶媒を完全に除去した。次に、100μ
ｌの0.2Mカルボキシフルオレセイン（CF;イーストマン
・コダック社製,pH7.4）を添加し、フラスコ内部を窒素
で置換した後に密栓して、60℃程度の水浴中に約１分間
浸漬した。続いて、Vortexミキサーを用い、壁面の脂質
薄膜が完全に消失するまでフラスコを激しく振とうし
た。この操作により、リポソーム懸濁液が調製された。
ゼラチン−ベロナール緩衝液（以下、GVB-と略記）を少
量添加し、リポソーム懸濁液を完全に遠心チュープに移
した。４℃,15,000rpmで20分間遠心し、遊離のCFを除去
した。上清が透明になるまでGVB-を用いての操作を繰り
返した。最後に2mlのGVB-及び５μｌの10％NaN3を加
え、Vortexミキサーで懸濁させ、窒素封入後、冷蔵庫に
保存した。
／メタノール（2/1）に溶解した。まず、5mMDPPC（200
μｌ）、10mMコレステロール（100μｌ）及び1mM DTP-D
PPE（50μｌ）を10mlのナシ型フラスコに入れ、更に2ml
のクロロホルムを加えて良く混合した。水浴中（約50
℃）でロータリーエバポレーターにより溶媒を除去し
た。再び2mlのクロロホルムを添加し、充分攪拌後、再
度ロータリーエバポレーターにより溶媒を蒸発させた。
この操作を数回繰り返すと、フラスコ壁面に薄膜が形成
された。フラスコをデシケーター中に移し真空ポンプで
約１時間吸引し、溶媒を完全に除去した。次に、100μ
ｌの0.2Mカルボキシフルオレセイン（CF;イーストマン
・コダック社製,pH7.4）を添加し、フラスコ内部を窒素
で置換した後に密栓して、60℃程度の水浴中に約１分間
浸漬した。続いて、Vortexミキサーを用い、壁面の脂質
薄膜が完全に消失するまでフラスコを激しく振とうし
た。この操作により、リポソーム懸濁液が調製された。
ゼラチン−ベロナール緩衝液（以下、GVB-と略記）を少
量添加し、リポソーム懸濁液を完全に遠心チュープに移
した。４℃,15,000rpmで20分間遠心し、遊離のCFを除去
した。上清が透明になるまでGVB-を用いての操作を繰り
返した。最後に2mlのGVB-及び５μｌの10％NaN3を加
え、Vortexミキサーで懸濁させ、窒素封入後、冷蔵庫に
保存した。
ｃ）ヤギ抗−ヒトIgG抗体の修飾 2mlのヤギ抗−ヒトIgG抗体（約15mg/ml）に10μｌの10m
M SPDP（エタノール溶液）を加え、十分攪拌してそのま
ま室温で30分間反応させた。反応後、反応液を予め生理
食塩水で飽和させたセファデックスG-25ファインのゲル
を充填したカラム（ゲル体積：約15ml）に展開し、0.1M
酢酸緩衝液（pH4.5,0.85％NaCl含有）溶出させた。最初
のタンパク質フラクション（約2ml）に更に2mlの酢酸緩
衝液を加え、窒素置換後ジチオトレイトール（約30mg）
を添加した。充分に攪拌して20分間室温で反応させた。
反応後、予め0.01M HEPES緩衝液で飽和させたセファデ
ックスG-25ファインのゲルを充填してあるカラム（ゲル
体積：約30ml）に反応液を展開し、前記HEPES緩衝液で
溶出した。最初のタンパク質フラクション（約2ml）を
集め、窒素置換後、使用するまで冷蔵庫に保存した。
M SPDP（エタノール溶液）を加え、十分攪拌してそのま
ま室温で30分間反応させた。反応後、反応液を予め生理
食塩水で飽和させたセファデックスG-25ファインのゲル
を充填したカラム（ゲル体積：約15ml）に展開し、0.1M
酢酸緩衝液（pH4.5,0.85％NaCl含有）溶出させた。最初
のタンパク質フラクション（約2ml）に更に2mlの酢酸緩
衝液を加え、窒素置換後ジチオトレイトール（約30mg）
を添加した。充分に攪拌して20分間室温で反応させた。
反応後、予め0.01M HEPES緩衝液で飽和させたセファデ
ックスG-25ファインのゲルを充填してあるカラム（ゲル
体積：約30ml）に反応液を展開し、前記HEPES緩衝液で
溶出した。最初のタンパク質フラクション（約2ml）を
集め、窒素置換後、使用するまで冷蔵庫に保存した。
ｄ）ヤギ抗−ヒトIgG抗体固定化リポソーム（免疫分析
用試薬）の調製 前述のようにして調製したリポソーム懸濁液と等量の修
飾抗体を混合し、窒素置換後密栓して室温でゆっくり振
とうしながら１晩反応させた。その後前記HEPES緩衝
液、次いでGVB-で洗浄して、未反応の抗体および漏出し
たCFを除去した。こうして調製したヤギ抗−ヒトIgG抗
体固定化リポソーム免疫分析用試薬に反応に用いたリポ
ソーム懸濁液の量に相当するGVB-および10μｌの10％Na
N3を添加し、懸濁・窒素置換後、使用するまで冷蔵庫中
に保存した。
用試薬）の調製 前述のようにして調製したリポソーム懸濁液と等量の修
飾抗体を混合し、窒素置換後密栓して室温でゆっくり振
とうしながら１晩反応させた。その後前記HEPES緩衝
液、次いでGVB-で洗浄して、未反応の抗体および漏出し
たCFを除去した。こうして調製したヤギ抗−ヒトIgG抗
体固定化リポソーム免疫分析用試薬に反応に用いたリポ
ソーム懸濁液の量に相当するGVB-および10μｌの10％Na
N3を添加し、懸濁・窒素置換後、使用するまで冷蔵庫中
に保存した。
このようにして調製したヤギ抗−ヒトIgG抗体固定化リ
ポソーム免疫分析用試薬を用いて以下のようにしてヒト
IgGの測定を行なった。
ポソーム免疫分析用試薬を用いて以下のようにしてヒト
IgGの測定を行なった。
あらかじめ既知の濃度となるように適当量のGVB+（0.1m
M ngCl2及び0.03mM CaCl2を含有したGVB-）で希釈した
ヒトIgGを試料とし、これを25μｌずつＵ型マイクロプ
レート（96穴；ヌンク社製）のwellに注入した。次い
で、上記の方法で調製したヤギ抗−ヒトIgG抗体固定化
リポソーム免疫分析用試薬を前記試料に５μｌずつ注入
し37℃で30分間接触反応させた。その後第２抗体として
ウサギ抗−ヒトIgG抗体（Miles社製;400倍希釈）及び補
体としてモルモット血清（0.5CH50）を各々25μｌずつ
添加し37℃で１時間作用させた。
M ngCl2及び0.03mM CaCl2を含有したGVB-）で希釈した
ヒトIgGを試料とし、これを25μｌずつＵ型マイクロプ
レート（96穴；ヌンク社製）のwellに注入した。次い
で、上記の方法で調製したヤギ抗−ヒトIgG抗体固定化
リポソーム免疫分析用試薬を前記試料に５μｌずつ注入
し37℃で30分間接触反応させた。その後第２抗体として
ウサギ抗−ヒトIgG抗体（Miles社製;400倍希釈）及び補
体としてモルモット血清（0.5CH50）を各々25μｌずつ
添加し37℃で１時間作用させた。
反応後、各wellに100μｌの0.01M EDTA−ベロナール緩
衝液を加えて反応を停止し、プレート用螢光分光光度計
（コロナ電子社製、MTP-12F）で各wellの螢光を測定し
た（Ex:490nm,Em:520nm）。なお、測定値は、第２抗体
及び補体の代わりに10％TritonX-100及びGVB-を25μｌ
及び50μｌずつ添加したwellの螢光と、ヒトIgGの代わ
りに25μｌのGVB+を添加したものの差を100％とした相
対遊出率で表示した。
衝液を加えて反応を停止し、プレート用螢光分光光度計
（コロナ電子社製、MTP-12F）で各wellの螢光を測定し
た（Ex:490nm,Em:520nm）。なお、測定値は、第２抗体
及び補体の代わりに10％TritonX-100及びGVB-を25μｌ
及び50μｌずつ添加したwellの螢光と、ヒトIgGの代わ
りに25μｌのGVB+を添加したものの差を100％とした相
対遊出率で表示した。
結果を第１図の曲線ａに示す。図からわかるように10-3
乃至10-8（g/ml）の濃度範囲で標識物質の遊出が認めら
れた。そしてこの中で10-6乃至10-8（g/ml）の濃度範囲
で特性を示した線を検量線として用いることにより、こ
のような微量な範囲内での未知の濃度の試料の定量分析
が行なえることがわかる。すなわち本発明の免疫分析方
法は従来の分析方法と比較して非常な高感度化をはかる
ことができた。
乃至10-8（g/ml）の濃度範囲で標識物質の遊出が認めら
れた。そしてこの中で10-6乃至10-8（g/ml）の濃度範囲
で特性を示した線を検量線として用いることにより、こ
のような微量な範囲内での未知の濃度の試料の定量分析
が行なえることがわかる。すなわち本発明の免疫分析方
法は従来の分析方法と比較して非常な高感度化をはかる
ことができた。
比較例１ 実施例１と同様にして、あらかじめ既知の濃度となるよ
うに適当量のGVB＋で希釈したヒトIgGを試料とし、これ
を25μｌずつＵ型マイクロプレートのwellに注入した。
うに適当量のGVB＋で希釈したヒトIgGを試料とし、これ
を25μｌずつＵ型マイクロプレートのwellに注入した。
次いで実施例１で用いたのと同じ方法で調製したヤギ抗
ヒトIgG抗体固定化リポソーム免疫分析用試薬（GVB+で1
00倍に希釈）を５μｌ、及び第２抗体であるウサギ抗−
ヒトIgG抗体（Miles社製;400倍希釈）を25μｌ、さらに
補体（モルモット血清；0.5CH50）を25μl5分間ですべ
て添加した。反応は37℃に保った中で1.5時間行なっ
た。その後実施例１と同様な処理を施し、同じ方法で相
対遊出率を測定した。結果を第１図の曲線ｂに示した。
図からわかるようにおよそ10-1乃至10-7（g/ml）の範囲
で遊出が認められたが、実施例１の場合と比較すると定
量できる濃度が10-5乃至10-6程度とより高濃度側であ
り、測定可能な範囲もせまく、実施例１で示したような
低濃度における検出すなわち高感度性を有していなかっ
た。
ヒトIgG抗体固定化リポソーム免疫分析用試薬（GVB+で1
00倍に希釈）を５μｌ、及び第２抗体であるウサギ抗−
ヒトIgG抗体（Miles社製;400倍希釈）を25μｌ、さらに
補体（モルモット血清；0.5CH50）を25μl5分間ですべ
て添加した。反応は37℃に保った中で1.5時間行なっ
た。その後実施例１と同様な処理を施し、同じ方法で相
対遊出率を測定した。結果を第１図の曲線ｂに示した。
図からわかるようにおよそ10-1乃至10-7（g/ml）の範囲
で遊出が認められたが、実施例１の場合と比較すると定
量できる濃度が10-5乃至10-6程度とより高濃度側であ
り、測定可能な範囲もせまく、実施例１で示したような
低濃度における検出すなわち高感度性を有していなかっ
た。
実施例２ 試料に10-7g/mlの濃度のヒトIgGを用いて、実施例１で
は30分間であった。第２抗体及び補体を添加する前のリ
ポソーム免疫分析用試薬と試料中の被検物質との接触反
応時間を増減して、その影響を調べた。この時の反応温
度は37℃に保った。また反応後には、第２抗体及び補体
を添加し37℃で１時間反応させた後、実施例１と同様に
処理して流出した標識物質の測定を行なった。その結果
を第２図に示す。図からわかるように、10-7g/mlという
同一の被検物質濃度を有した試料の場合でも、第２抗体
及び補体を添加する前の試料とリポソーム免疫分析用試
薬との反応時間の長短により標識物質の相対遊出率には
非常な差が生じる。すなわち被検物質を含有した試料に
リポソーム免疫分析試薬及び第２抗体と補体とを同時に
加えた場合の相対遊出率がおよそ３％程度であるのに対
して被検物質とリポソーム免疫分析用試薬だけをあらか
じめ接触反応させその後に補体及び第２抗体を作用させ
た場合に、その被検物質とリポソーム免疫分析用試薬と
の反応時間を15分程度以上とればおよそ20倍近くの標識
物質の流出が得られ、これより大幅な精度の向上が得ら
れる。もちろん本実施例の場合においてリポソーム免疫
分析用試薬と被検物質との間での充分な反応に必要な時
間がおよそ15分間だったのであり、被検物質の種類や用
いるリポソーム免疫分析用試薬の特性等によってこの時
間は適宜選択される。
は30分間であった。第２抗体及び補体を添加する前のリ
ポソーム免疫分析用試薬と試料中の被検物質との接触反
応時間を増減して、その影響を調べた。この時の反応温
度は37℃に保った。また反応後には、第２抗体及び補体
を添加し37℃で１時間反応させた後、実施例１と同様に
処理して流出した標識物質の測定を行なった。その結果
を第２図に示す。図からわかるように、10-7g/mlという
同一の被検物質濃度を有した試料の場合でも、第２抗体
及び補体を添加する前の試料とリポソーム免疫分析用試
薬との反応時間の長短により標識物質の相対遊出率には
非常な差が生じる。すなわち被検物質を含有した試料に
リポソーム免疫分析試薬及び第２抗体と補体とを同時に
加えた場合の相対遊出率がおよそ３％程度であるのに対
して被検物質とリポソーム免疫分析用試薬だけをあらか
じめ接触反応させその後に補体及び第２抗体を作用させ
た場合に、その被検物質とリポソーム免疫分析用試薬と
の反応時間を15分程度以上とればおよそ20倍近くの標識
物質の流出が得られ、これより大幅な精度の向上が得ら
れる。もちろん本実施例の場合においてリポソーム免疫
分析用試薬と被検物質との間での充分な反応に必要な時
間がおよそ15分間だったのであり、被検物質の種類や用
いるリポソーム免疫分析用試薬の特性等によってこの時
間は適宜選択される。
実施例３ 補体結合部位を除去することにより部分化したウサギ抗
−ヒトCEA抗体（Fab′）を固定化したリポソーム免疫分
析用試薬を用いてヒトCEAの測定を行なった。
−ヒトCEA抗体（Fab′）を固定化したリポソーム免疫分
析用試薬を用いてヒトCEAの測定を行なった。
（ａ）従来法（免疫実験操作法p1166,1974）に基いて、
ウサギ抗−ヒトCEA抗体（Dako社製）の補体結合部位を
ペプシン処理で除去することにより抗体のF(ab′)2を調
製した。濃度は約2mg/mlであった。このF(ab′)2を2ml
とりさらに２−メルカプトエチルアミンを10mg加えて、
窒素雰囲気下で37℃に保ちながら90分間反応させた。反
応後、Sephadex G-25fine（ファルマシア社製）カラム
を用いて0.01M HEPES緩衝液（pH7.45）で溶出させて抗
体のFab′を得た。この抗体のFab′約100μｇを実施例
１と同様に調製したリポソーム懸濁液1mlに混合し、１
晩室温で振とうすることにより部分化されたウサギ抗−
ヒトCEA抗体（Fab′）を固定化したリポソーム免疫分析
用試薬を得た。
ウサギ抗−ヒトCEA抗体（Dako社製）の補体結合部位を
ペプシン処理で除去することにより抗体のF(ab′)2を調
製した。濃度は約2mg/mlであった。このF(ab′)2を2ml
とりさらに２−メルカプトエチルアミンを10mg加えて、
窒素雰囲気下で37℃に保ちながら90分間反応させた。反
応後、Sephadex G-25fine（ファルマシア社製）カラム
を用いて0.01M HEPES緩衝液（pH7.45）で溶出させて抗
体のFab′を得た。この抗体のFab′約100μｇを実施例
１と同様に調製したリポソーム懸濁液1mlに混合し、１
晩室温で振とうすることにより部分化されたウサギ抗−
ヒトCEA抗体（Fab′）を固定化したリポソーム免疫分析
用試薬を得た。
（ｂ）ヒトCEAの測定 （ａ）で調製したリポソーム免疫分析用試薬を用いて、
実施例１で示したのと同様の方法でヒトCEAを測定し
た。すなわち、あらかじめ既知の濃度となるように適当
量のGVB+で希釈したヒトCEAを試料とし、これを25μｌ
ずつＵ型マイクロプレートのwellに注入した。次いで、
上記部分化されたウサギ抗−ヒトCEA抗体（Fab′）を固
定化したリポソーム免疫分析用試薬をGVB+で100倍希釈
して、前記試料に５μｌずつ注入し37℃で30分間反応さ
せた。その後第２抗体としてウサギ抗−ヒトCEA/抗体
（Dako社製;100倍希釈）及び補体としてモルモット血清
（0.5CH50）を各々25μｌずつ添加し、37℃で１時間反
応させた。反応後、実施例１と同様にして標識物質であ
るカルボキシフルオレセインの相対遊出率を測定した。
結果を第３図に示す。図に明らかなように、0.1〜20ng/
mlの範囲でヒトCEAの定量が可能なことが確認された。
実施例１で示したのと同様の方法でヒトCEAを測定し
た。すなわち、あらかじめ既知の濃度となるように適当
量のGVB+で希釈したヒトCEAを試料とし、これを25μｌ
ずつＵ型マイクロプレートのwellに注入した。次いで、
上記部分化されたウサギ抗−ヒトCEA抗体（Fab′）を固
定化したリポソーム免疫分析用試薬をGVB+で100倍希釈
して、前記試料に５μｌずつ注入し37℃で30分間反応さ
せた。その後第２抗体としてウサギ抗−ヒトCEA/抗体
（Dako社製;100倍希釈）及び補体としてモルモット血清
（0.5CH50）を各々25μｌずつ添加し、37℃で１時間反
応させた。反応後、実施例１と同様にして標識物質であ
るカルボキシフルオレセインの相対遊出率を測定した。
結果を第３図に示す。図に明らかなように、0.1〜20ng/
mlの範囲でヒトCEAの定量が可能なことが確認された。
本発明に係る免疫分析では、まず被検物質を含んだ試料
とリポソーム免疫分析用試薬とを充分に反応させた後
に、さらに被検物質に対する第２抗体及び補体を作用さ
せることで、被検物質の定量における精度、感度を大幅
に向上できる。
とリポソーム免疫分析用試薬とを充分に反応させた後
に、さらに被検物質に対する第２抗体及び補体を作用さ
せることで、被検物質の定量における精度、感度を大幅
に向上できる。
第１図は、本発明の免疫分析方法における被検物質濃度
と標識物質の相対遊出率との関係（曲線ａ）及び本発明
の免疫分析方法によらない場合における被検物質濃度と
標識物質の相対遊出率との関係（曲線ｂ）を表した特性
図、第２図は、被検物質とリポソーム免疫分析用試薬と
の反応時間に対する標識物質の相対遊出率の変化を表し
た特性図、第３図は、本発明の免疫分析方法において他
のリポソーム免疫分析用試薬を用いた場合の被検物質濃
度と標識物質の相対遊出率との関係を表した特性図であ
る。
と標識物質の相対遊出率との関係（曲線ａ）及び本発明
の免疫分析方法によらない場合における被検物質濃度と
標識物質の相対遊出率との関係（曲線ｂ）を表した特性
図、第２図は、被検物質とリポソーム免疫分析用試薬と
の反応時間に対する標識物質の相対遊出率の変化を表し
た特性図、第３図は、本発明の免疫分析方法において他
のリポソーム免疫分析用試薬を用いた場合の被検物質濃
度と標識物質の相対遊出率との関係を表した特性図であ
る。
Claims (6)
- 【請求項１】リン脂質及び糖脂質の少なくとも一方とコ
レステロールとからなるリポソーム上に、架橋法により
被検物質に対する抗体の少なくとも一部が固定され、さ
らに前記リポソーム内部には親水性の標識物質が封入さ
れているリポソーム免疫分析用試薬を、 前記被検物質を含有する試料にあらかじめ接触させて反
応させ、その後に被検物質に対する第２抗体及び補体を
作用させる免疫分析方法において、前記固定化される抗
体は酵素処理により補体結合部位が除去されたものであ
って、前記試薬を試料にあらかじめ接触反応させる時間
は一定時間以上であることを特徴とする免疫分析方法。 - 【請求項２】第２抗体としてウサギ抗体を用いることを
特徴とする特許請求の範囲第１項記載の免疫分析方法。 - 【請求項３】架橋法に使用する架橋剤を、Ｎ−サクシン
イミジル３−（２−ピトジルジチオ）プロピオネート
（SPDP）、Ｎ−サクシンイミジル４−（ｐ−マレイミド
フェニル）ブチレート（SMPB）、Ｎ−サクシンイミジル
４−（ｐ−マレイミドフェニル）アセテート（SMPA）、
Ｎ−サクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）
プロピオネート（SMPP）、Ｎ−（γ−マレイミドプチリ
ルオキシ）サクシンイミド（GMBS）、Ｎ−（ε−マレイ
ミドカプロイルオキシ）サクシンイミド（EMCS）の中よ
り選んだことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
免疫分析方法。 - 【請求項４】リポソームを構成するリン脂質及び糖脂質
に対して10〜500モル％のコレステロールを含むことを
特徴とする特許請求の範囲第１項記載の免疫分析方法。 - 【請求項５】分析時に用いられる補体の活性（補体価）
が0.1〜10CH50であることを特徴とする特許請求の範囲
第１項記載の免疫分析方法。 - 【請求項６】標識物質が螢光性化合物、発光性化合物、
吸光性化合物、糖類、イオン性化合物、酵素、補酵素類
又はラジカル化合物であることを特徴とする特許請求の
範囲第１項記載の免疫分析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60090938A JPH079428B2 (ja) | 1985-04-30 | 1985-04-30 | 免疫分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60090938A JPH079428B2 (ja) | 1985-04-30 | 1985-04-30 | 免疫分析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61250558A JPS61250558A (ja) | 1986-11-07 |
| JPH079428B2 true JPH079428B2 (ja) | 1995-02-01 |
Family
ID=14012390
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60090938A Expired - Lifetime JPH079428B2 (ja) | 1985-04-30 | 1985-04-30 | 免疫分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH079428B2 (ja) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0799374B2 (ja) * | 1987-02-06 | 1995-10-25 | 株式会社日立製作所 | 免疫分析用試薬およびこれを用いる免疫分析方法 |
| US5173406A (en) * | 1987-05-06 | 1992-12-22 | Teijin Limited | Liposome immunoassay method and kit therefor |
| US4971916A (en) * | 1987-07-29 | 1990-11-20 | Abbott Laboratories | Liposome based homogeneous immunoassay for diagnostic tests |
| JPH06103307B2 (ja) * | 1987-08-28 | 1994-12-14 | 株式会社東芝 | 免疫分析方法 |
| JPH01240860A (ja) * | 1988-03-23 | 1989-09-26 | Toshiba Corp | 免疫分析方法 |
| JPH01272974A (ja) * | 1988-04-25 | 1989-10-31 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | リポソームを用いた免疫測定法 |
| JPH04303770A (ja) * | 1991-03-30 | 1992-10-27 | Toyo Ink Mfg Co Ltd | 抗原の免疫分析法 |
| CN113406335A (zh) * | 2021-06-15 | 2021-09-17 | 安徽大千生物工程有限公司 | 一种补体价脂质体免疫测定试剂盒及其制备使用方法 |
| CN119395307B (zh) * | 2024-12-31 | 2025-07-25 | 北京万泰德瑞诊断技术有限公司 | 一种血清淀粉样蛋白a测定试剂盒及其制备和应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60138465A (ja) * | 1983-12-27 | 1985-07-23 | Denka Seiken Co Ltd | 新規な抗原定量法 |
-
1985
- 1985-04-30 JP JP60090938A patent/JPH079428B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61250558A (ja) | 1986-11-07 |
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