JPH0794418B2

JPH0794418B2 - 新規な製造方法

Info

Publication number: JPH0794418B2
Application number: JP62194134A
Authority: JP
Inventors: 巧田中; 武治正木; 正美副島; 進綱沢; 文夫崎山; 晴彦杉山
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 1987-08-03
Filing date: 1987-08-03
Publication date: 1995-10-11
Anticipated expiration: 2010-10-11
Also published as: JPS6438050A

Description

【発明の詳細な説明】［発明の利用分野］本発明は、消化、凝固線溶、受精或は蚕の繭の分解等の
重要な生理活性を有する各種リシン特異性酵素の阻害剤
として、或はこれらリシン特異性酵素をアフィニティク
ロマトグラフィにより精製する際の吸着体として等の用
途に用いられる、リシナールペプチド誘導体の新規な製
造方法に関する。

［発明の背景］蛋白質或はペプチド鎖内部の結合を加水分解するエンド
ペプチダーゼは、動物、植物、微生物等に広く分布し、
その種類は極めて多い。中でも、ペプチド鎖中のリシン
残基のＣ−末端側のペプチド結合を選択的に加水分解す
る酵素であるリシン特異性酵素として知られる、例えば
動物起源のトリブシン，プラスミン，アクロシン、コク
ナーゼ等や、微生物起源のリシルエンドペプチターゼ
等、或いは植物起源のフィシン，ブロメライン，ネペン
テスアスペルティックプロティナーゼ等は、消化、凝固
線溶、受精或は蚕の繭の分解等の重要な生理活性を有し
ており、例えばリシルエンドペプチダーセが豚インシュ
リンのからの人インシュリンの半合成に用いられるのを
初めとして、夫々医薬品、生化学用試薬などの分野に於
いて一般に広く用いられている。

これらリシン特異性酵素の阻害剤として、或はこれらリ
シン特異性をアフィニティクロマトグラフィにより精製
する際の吸着体としての用途に用いられるリシナールペ
プチド誘導体の製法としては、例えば特開昭47−30618
号公報に記載されている如く、先ず、アジド法，酸クロ
ライド法，酸無水物法，混合酸無水物法,DCC法，活性エ
ステル法（ｐ−ニトロフェニルエステル法,N−ヒドロキ
シコハク酸イミドエステル法等）,DCC−アディティブ
（HONB,HOBt,HOSn等）法等［The Peptides,Vol.1,Acade
mic Press,New York,1966;ペプチド合成，泉屋ら著，丸
善株式会社,1975等］のペプチド合成法の常法に従っ
て、リシンのα位のアミノ基に所望のアミノ酸若しくは
ペプチドが結合したペプチド（即ち、Ｃ−末端側のアミ
ノ酸がリシンであるペプチド）を合成し、次いで、リシ
ン残基のカルボキシル基を還元してアルコール（リシノ
ール誘導体）とし、更にこれを酸化することによりアル
デヒド基とした後、ε位のアミノ保護基を外して目的の
リシナールペプチド誘導体とする方法が挙げられる。

しかしながら、このような方法は、副反応が生じ易く、
最終反応液中には副生成物が多種共存する。その為、ペ
プチド合成後、目的のリシナールペプチド誘導体の精製
を行うに当たって、晶析法で収率よく行うのは極めて難
しく、また、ペプチド精製によく利用されるシリカゲル
カラム法により精製を行おうとした場合には、精製中に
リシナールのアルデヒド基が分解するので、いずれにし
ても目的の精製品を効率よく得ることができない等、工
業的に利用するには解決すべき様々な問題点を数多く有
していた。

一方、実験室スケール程度の規模であれば従来から知ら
れているペプチドアルデヒド類の製造方法、例えばアミ
ノ酸やペプチドの3,5−ジメチルピラゾリド誘導体やジ
イミダゾール誘導体を水素化アルミニウムリチウムで還
元する方法や、アミノ酸やペプチドのアルコール誘導体
を三酸化イオウ−ピリジン錯体−ジメチルスルホキシド
−トリエチルアミンの系で酸化する方法等によっても、
目的のリシナールペプチド誘導体を製造することができ
る。しかしながら、非常に発火性の強い水素化アルミニ
ウムリチウムによる還元を−20℃以下の低温で実施する
際の安全性及び装置的な問題、或は三酸化イオウの如き
毒性が強く、危険性も高い試薬を使用する際の安全衛生
上の問題等を考えるとき、工業的規模でこれらを行うに
は、あまりにもリスクが大きく、安易にこの方法を採用
するという訳にはいかなかった。

［発明の目的］本発明は上記した如き状況に鑑みなされたもので、各種
リシン特異性酵素の阻害剤として、或はこれらリシン特
異性酵素をアフィニティクロマトグラフィにより精製す
る際の吸着体として等の用途に用いられるリシナールペ
プチド誘導体の、新規で効率的、且つ工業的に利用可能
な製造方法を提供することを目的とする。

［発明の構成］上記した如き目的を達成するために、本発明は次の構成
よりなる。

「一般式［Ｉ］（式中、R¹はアミノ保護基若しくは水素原子を示し、R²
はアミノ保護基を示し、R³及びR⁴は炭素数１〜４のアル
キル基を示す。また、R³とR⁴とが結合して環を成してい
てもよい。）で表わされるリシナール誘導体（保護リシナール）にア
ミノ酸若しくはペプチドを反応させて、そのα位のアミ
ノ基にアミノ酸若しくはペプチドを導入し、然る後アミ
ノ保護基及びアルデヒド保護基を同時に又は別々の手段
により取り除くことを特徴とする一般式［II］（式中、Ａはアミノ酸残基若しくはペプチド残基を示
し、Ｒはアミノ保護基又は水素原子を示す。）で表わさ
れるリシナールペプチド誘導体の製造方法。」即ち、本発明者らは一般式［II］（式中、Ａ及びＲは前記に同じ。）で表わされるリシナ
ールペプチド誘導体の効率的で且つ作業性に優れた製造
方法を求めて鋭意研究を重ねた結果、一般式［Ｉ］（式中、R¹、R²、R³及びR⁴は前記に同じ。）で表わされ
る保護リシナールを出発原料として用い、これにアミノ
酸又はペプチドを反応させて目的のリシナールペプチド
誘導体のアセタール体を製造し、アセタール体の状態で
精製を行った後、脱アセタール化及び脱アミノ保護すれ
ば、副反応生成物を容易に分離することができ、目的の
リシナールペプチド誘導体を効率よく製造し得ることを
見出し、本発明を完成するに至った。

本発明の方法によりリシナール誘導体を製造するには、
一般式［Ｉ］（式中、R¹、R²、R³及びR⁴は前記に同じ。）で表わされ
る保護リシナールを出発原料とし、このα位のアミノ基
に所望のアミノ酸若しくはペプチドをアジド法，酸クロ
ライド法，酸無水物法，混合酸無水物法,DCC法，活性エ
ステル法（ｐ−ニトロフェニルエステル法,N−ヒドロキ
シコハク酸イミドエステル法等）,DCC−アディティブ
（HONB,HOBt,HOSn等）法等［The Peptides,Vol.1,Acade
mic Press,New York,1966;ペプチド合成，泉屋ら著，丸
善株式会社,1975等］のペプチド合成法の常法に従って
結合させた後、晶析法等の常法により精製を行い、更に
アミノ保護基及びアセタール型アルデヒド保護基を同時
に又は別々の手段により取り除くことによって合成する
ことができる。α位のアミノ基に結合させるアミノ酸の
種類或いはα位のアミノ基に結合させるペプチドを構成
するアミノ酸の種類及び数については特に制限はない
が、アミノ酸の種類としては、例えば、バリン、ロイシ
ン、プロリン、フェニルアラニン、イソロイシン、メチ
オニン、トリプトファン等疎水性のアミノ酸が通常好ま
しく用いられる。またペプチド残基を構成するアミノ酸
の数としては合成的な面から２〜４が好ましい。

一般式［Ｉ］で表わされる保護リシナールのR¹,R²で示
されるアミノ保護基としては、例えばカルボベンゾキシ
基,t−ブチルオキシカルボニル基,p−ニトロベンジルオ
キシカルボニル基,9−フルオレニルメチルオキシカルボ
ニル基等が挙げられるが、これらに限定されるものでは
なく通常のペプチド合成に用いられるものはいずれも用
いることができる。但し、R¹及びR²が共にアミノ保護基
である場合には、互いに異なるアミノ保護基であること
が望ましく、更には互いに異なる手段でなければ脱保護
されない保護基であることが好ましい。即ち、一般式
［II］で示されるリシナールペプチド誘導体を合成する
際には、一般式［Ｉ］のα位のアミノ基は遊離型となら
なければならないが、ε位のアミノ基は反応にあずから
ないように保護する必要がある。その為、R¹のアミノ保
護基としてはペプチド合成時の反応条件下で脱離するも
のを選択し、R²のアミノ保護基としては同条件下では脱
離しないものを選択することが好ましい。またR³及びR⁴
としては例えばメチル基，エチル基，プロピル基，ブチ
ル基等の炭素数１〜４のアルキル基が挙げられるが、ま
た、R³とR⁴とが結合して環状アセタールを形成していて
もよい。

アミノ保護基及び／又はアセタール型アルデヒド保護基
の脱保護は、希塩酸、酢酸、トリフルオロ酢酸などの鉱
酸、有機酸を用いる常法に従ってこれを行えば足りる。

一般式［Ｉ］で表わされる保護リシナールは、例えば、
下記の方法により容易に得ることができる。即ち、アミ
ノ基を保護したリシン（保護リシン）を原料とし、M.Ku
botaらの方法［Chem.Pharm.Bull.,29,1169,1981］に従
ってアミノ基を保護したままこれをアルコール体である
リシノール（保護リシノール）に還元した後、J.G.Moff
attらの方法［J.Org.Chem.,43,4178,1978］或はR.Ratcl
iffeらの方法［J.Org.Chem.,35,4000,1970］に従って、
アミノ基を保護したまま酸化反応を行うことにより一般
式［III］（式中、R¹¹,R¹²はアミノ保護基を表わす。）で表わさ
れるアミノ保護リシナールを得る。次いで、これを、例
えばｐ−トルエンスルホン酸等の酸触媒の存在下、オル
トギ酸メチル、オルトギ酸エチル等のアセタール化剤と
適当な溶媒（例えばメタノール、エタノール等）中で反
応させれば一般式［Ｉ］で表わされる保護リシナールと
なる。

本発明の方法によれば、高純度なリシナールペプチド誘
導体を高収率で合成することができるが、また、本発明
の方法は、一般式［Ｉ］で表わされる保護リシナールを
ペプチド合成の基幹物質として大量に合成しておいて、
それを出発物質とすることにより種々のリシナールペプ
チド誘導体を効率的に製造することができるので、目的
とするリシナールペプチド誘導体の製造コストを従来の
方法よりも安くすることができることも有利な点として
挙げられる。

以下に実施例、参考例を挙げて本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるもので
はない。

尚、以下の文中で使用される略号は、各々次の意味を表
わすものとする。

Lys:リシン残基。

Z:カルボベンゾキシ基（アミノ酸のアミノ基の保護基） Boc:第三ブチルオキシカルボニル基（アミノ酸のアミノ
基の保護基） Lys−ol:リシン残基の−CO基がアルコールの形に変わっ
たもの（リシノール残基） Lys−al:リシン残基の−CO基がアルデヒド基の形に変わ
ったもの（リシナール残基） Lys−SC:リシン残基の−COがセミカルバゾンの形に変わ
ったもの。

Lys（OMe）₂:リシン残基の−CO基がジメチルアセタール
に変わったもの DCC:N,N′−ジシクロヘキシルカルボジイミド HOSu:N−ヒドロキシコハク酸イミド Val:バリン残基 Pro:プロリン残基 Leu:ロイシン残基 Bz:ベンゾイル基 Tos:p−トルエンスルホニル基 Ac:アセチル基 pNA:p−ニトロアニリド基［実施例］参考例1.Z−Lys（Boc）−olの合成水酸化ホウ素ナトリウム7.57g（0.2モル）を、ドライア
イス−メタノールで−20℃に冷却した80％メタノール10
0mlに溶解し、この溶液にH.Otsukaら（Bull.Chem.Soc.J
pn.,39,882,1966）の方法に準じて合成したＺ−Lys（Bo
c）−OSu 19.0g（0.04モル）を含むテトラヒドロフラン
−メタノール混液（1:1v/v）200mlを撹拌下でゆっくり
滴下した。同温度で15分間撹拌した後、1N−塩酸を加え
てpHを７に調整し、減圧下で溶媒を留去した。残留物か
ら目的物を酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル層を1N−塩
酸、５％重曹水、水の順に洗浄した。酢酸エチル層を無
水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去し、残
留物をシリカゲルカラムに付し、酢酸エチル−クロロホ
ルム混液（1:1v/v）で溶出した。目的物の分画を集め減
圧濃縮しｎ−ヘキサンで固化させてＺ−Lys（Boc）−ol
12.1g（収率82.6％）を得た。

融点:49〜51℃。

▲［α］^20゜ _D▼：−12.4゜（Ｃ＝1.2,CH₃OH）。

元素分析値:C₁₉H₃₀N₂O₅として実測値（％）;C 62.27,H 8.25,N 7.64 計算値（％）;C 62.05,H 8.23,N 7.86。

参考例2,Z−Lys（Boc）（OMe）_２の合成参考例１で得たＺ−Lys（Boc）−ol 9.0g（24.6ミリモ
ル）をDMSO 100mlに溶解して調製した溶液に、室温で
１−エチル−３−（３′−ジメチルアミノプロピル）−
カルボジイミド塩酸塩15.5g（81.1ミリモル）とジクロ
ロ酢酸1.22mlを加え30時間撹拌した。反応液に酢酸エチ
ル200mlを加え、飽和食塩水で洗浄後、酢酸エチル層を
分取し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で溶
媒を留去した。残留物をメタノール100mlに溶解し、オ
ルトギ酸メチル5.8g（54.6ミリモル）とｐ−トルエンス
ルホン酸100mgを加え、室温で３時間撹拌反応させた。
反応液を減圧濃縮し、残留物を酢酸エチルに溶解した後
これを飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥
後、減圧下で溶媒を留去した。残留物をシリカゲルカラ
ムに付し、酢酸エチル−クロロホルム混液（1:1v/v）で
溶出後、目的物の分画を集めて減圧濃縮し、ｎ−ヘキサ
ンで固化させてＺ−Lys（Boc）（OMe）₂7.08g（収率70.
2％）を得た。

融点:54〜56℃。

▲［α］^20゜ _D▼：−17.3゜（Ｃ＝1.0,CH₃OH）。

元素分析値:C₂₁H₃₄N₂O₆として実測値（％）;C 61.44,H 8.35,N 6.82 計算値（％）;C 60.83,H 8.68,N 6.93。

実施例1.Z−Val−Lys−al・HClの合成（１）Ｚ−Val−Lys（Boc）（OMe）_２の合成参考例２で得たＺ−Lys（Boc）（OMe）₂ 821mg（２ミリ
モル）をメタノール30mlに溶解し、pd−黒を触媒として
水素ガスを６時間導入し接触還元した。メタノールを留
去後、得られた残留物とＺ−Val−OH 503mg（２ミリモ
ル）をジクロロメタン30mlに溶解し、これにDCC 412mg
（２ミリモル）を加えて20時間室温で撹拌反応させた。
析出した沈殿物を濾去後、溶媒を留去し、残留物に酢酸
エチルを加えて目的物を抽出し、酢酸エチル層を５％重
曹水、水の順に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し
た。減圧下で溶媒を留去し、残留物を酢酸エチル−ヘキ
サン混液で溶解して、目的物を再結晶させて、Ｚ−Val
−Lys（Boc）（OMe）₂ 621mg（収率60.0％）を得た。

融点:104〜106℃。

▲［α］^20゜ _D▼：−21.7゜（Ｃ＝1.1,CH₃OH）。

元素分析値:C₂₆H₄₃N₃O₇・1/2H₂Oとして実測値（％）;C 60.20,H 8.55,N 8.10 計算値（％）;C 60.90,H 8.47,N 8.15。

（２）Ｚ−Val−Lys−al・HClの合成（１）で得たＺ−Val−Lys（Boc）（OMe）₂ 473mg（0.9
3ミリモル）をトリフルオロ酢酸5mlに溶解し、１時間室
温で撹拌反応させた。溶媒を減圧下で留去後、得られた
残留物を6N−塩酸を加えて溶解したのち、減圧下で濃縮
し、残留物をエーテルで沈殿させ、濾取してＺ−Val−L
ys・−alHCl 161mg（（収率43.3％）を得た。

融点:180〜182℃。

元素分析値:C₁₉H₂₉N₃O₄・HClとして実測値（％）;C 57.06,H 7.56,N 10.51 計算値（％）;C 57.16,H 7.41,N 10.89。

実施例2.Z−Pro−Lys−al・HClの合成（１）Ｚ−Pro−Lys（Boc）（OMe）_２の合成参考例２で得たＺ−Lys（Boc）（OMe）₂ 821mg（２ミリ
モル）を実施例１の（１）と同様の方法で接触還元し、
得られた残留物とＺ−Pro−OH 499mg（２ミリモル）を
ジクロロメタン30mlに溶解し、これにDCC 412mg（２ミ
リモル）を加えて室温で20時間撹拌反応させた。実施例
１の（１）と同様の方法で後処理を行った後、酢酸エチ
ル−ヘキサン混液で目的物を再結晶させて、Ｚ−Pro−L
ys（Boc）（OMe）₂ 576mg（収率57.6％）を得た。

融点:86〜88℃。

▲［α］^20゜ _D▼：−41.2゜（Ｃ＝1.02,CH₃OH）。

元素分析値:C₂₆H₄₁N₃O₇として実測値（％）;C 61.52,H 8.14,N 8.28 計算値（％）;C 61.38,H 8.06,N 8.36。

（２）Ｚ−Pro−Lys−al・HClの合成（１）で得たＺ−Pro−Lys（Boc）（OMe）₂ 574mg（1.1
ミリモル）を実施例１の（２）と同様に処理してＺ−Pr
o−Lys−al・HClの非晶性粉末371mg（収率84.7％）を得
た。

▲［α］^20゜ _D▼：−47.9゜（Ｃ＝1.12,CH₃OH）。

元素分析値:C₁₉H₂₇N₃O₄・HCl・H₂Oとして実測値（％）;C 54.87,H 7.27,N 10.10 計算値（％）;C 54.73,H 7.08,N 9.88。

実施例3.Z−Leu−Lys（Boc）（OMe）_２の合成参考例２で得たＺ−Lys（Boc）（OMe）₂ 2.05g（５ミリ
モル）を実施例１の（１）と同様の方法で接触還元し、
得られた残留物とＺ−Leu−OH 1.33g（５ミリモル）を
ジクロロメタン50mlに溶解し、これにDCC 1.24g（６ミ
リモル）を加えて室温で20時間撹拌反応させた。実施例
１の（１）と同様の方法で後処理を行った後、残留物を
ｎ−ヘキサンで固化させて、Ｚ−Leu−Lys（Boc）（OM
e）₂ 1.53g（収率58.4％）を得た。

融点:77〜79℃。

▲［α］^20゜ _D▼：−23.04゜（Ｃ＝1.20,CH₃OH）。

元素分析値:C₂₇H₄₅N₃O₇として実測値（％）;C 61.92,H 8.66,N 8.02 計算値（％）;C 61.99,H 8.59,N 8.26。

実施例4.Z−Leu−Leu−Lys−al・HClの合成（１）Ｚ−Leu−Leu−Lys（Boc）（OMe）_２の合成実施例３で得たＺ−Leu−Lys（Boc）（OMe）₂ 1.05g
（２ミリモル）を実施例１の（１）と同様の方法で接触
還元し、得られた残留物とＺ−Leu−OH 531mg（２ミリ
モル）をジクロロメタン30mlに溶解し、これにDCC 412m
g（２ミリモル）を加えて室温で20時間撹拌反応させ
た。実施例１の（１）と同様の方法で後処理を行った
後、残留物を酢酸エチルで再結晶して、Ｚ−Leu−Leu−
Lys（Boc）（OMe）₂ 777mg（収率61.0％）を得た。

融点:150〜152。

▲［α］^20゜ _D▼：−42.8゜（Ｃ＝1.04,CH₃OH）。

元素分析値:C₃₃H₅₆N₄O₈として実測値（％）;C 62.24,H 8.86,N 8.90 計算値（％）;C 62.35,H 8.86,N 8.93。

（２）Ｚ−Leu−Leu−Lys−al・HClの合成（１）で得たＺ−Leu−Leu−Lys（Boc）（OMe）₂ 480mg
（0.8ミリモル）を実施例１の（２）と同様に処理して
Ｚ−Leu−Leu−Lys−al・HCl 316mg（収率74.9％）を得
た。

融点:141〜143。

▲［α］^20゜ _D▼：−47.0゜（Ｃ＝1.03,CH₃OH）。

元素分析値:C₂₆H₄₂N₄O₅・HCl・H₂Oとして実測値（％）;C 57.28,H 8.32,N 10.28 計算値（％）;C 54.35,H 8.13,N 10.65。

参考例3.抗リシルエンドペプチダーゼ活性の測定（基質溶液） Tos−Lys−OMe又はAc−Lys−pNAを80mM Tris−HCl緩衝
液（pH8.0）に所定濃度となるように溶解して基質溶液
とした。

（阻害剤溶液）本発明の方法により得られたリシナール、リシナールペ
プチド誘導体、これらの類似既知物質又は既知のリシン
特異性酵素阻害剤を所定濃度水溶液としたものを阻害剤
溶液とした。

（操作法） 30℃保温下で、基質溶液1.9mlと阻害剤溶液1.0mlをよく
混合した後、0.1mlのリシルエンドペプチダーゼ溶液
（0.25μg/ml）を加えよく混合し、Rate法により生成す
るメタノール量を吸光度（247nm）により測定し、Dixon
−plotによりKi値（μＭ）を求めた。

（結果）結果を表１に示す。

参考例4.抗トリプシン活性の測定（基質溶液） Tos−Lys−OMeを80mM Tris−HCl緩衝液（pH8.0、2.0mM
CaCl₂含有）に所定濃度となるように溶解して基質溶液
とした。

（操作法） 30℃保温下で、基質溶液1.9mlと阻害剤溶液1.0mlをよく
混合した後、0.1mlのトリプシン溶液（1.4μg/ml）を加
えよく混合し、Rate法により生成するメタノール量を吸
光度（247nm）により測定し、Dixon−plotによりKi値
（μＭ）を求めた。

（結果）結果を表２に示す。

表１及び２の結果から明らかな如く、リシナール及びリ
シナールペプチド誘導体は、これらの類似既知物質又は
既知のリシン特異性酵素阻害剤に比べて、リシン特異性
酵素に対して高い阻害作用を示すことがわかる。

［発明の効果］以上述べた如く、本発明は、各種リシン特異性酵素の阻
害剤として、或はこれらリシン特異性酵素をアフィニテ
ィクロマトグラフィにより精製する際の吸着体として等
の用途に用いられるリシナールペプチド誘導体の、新規
で効率的な製造方法を提供するものであり、該誘導体の
工業的規模での製造を可能ならしめた点に顕著な効果を
奏する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ０７Ｋ 14/435 (72)発明者杉山晴彦兵庫県尼崎市高田町６−１和光純薬工業株式会社大阪研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】一般式［Ｉ］（式中、R¹はアミノ保護基若しくは水素原子を示し、R²
はアミノ保護基を示し、R³及びR⁴は炭素数１〜４のアル
キル基を示す。また、R³とR⁴とが結合して環を成してい
てもよい。）で表わされるリシナール誘導体（保護リシナール）にア
ミノ酸若しくはペプチドを反応させて、そのα位のアミ
ノ基にアミノ酸若しくはペプチドを導入し、然る後アミ
ノ保護基及びアルデヒド保護基を同時に又は別々の手段
により取り除くことを特徴とする一般式［II］（式中、Ａはアミノ酸残基若しくはペプチド残基を示
し、Ｒはアミノ保護基又は水素原子を示す。）で表わさ
れるリシナールペプチド誘導体の製造方法。